JPH0227998A - 透明なコリパーゼ測定用トリグリセライド基質溶液とこれを用いたコリパーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 この発明は生体液中の微量のコリパーゼ、特にヒトの膵
液、血清等のコリパーゼを高感度に効率よく測定するた
めの透明なコリパーゼ測定用トリグリセライド基質溶液
とこれを用いたコリパーゼ活性の測定方法に闇するもの
である。

〈従来の技術と発明が解決しようとする問題点〉コリパ
ーゼは、リパーゼ活性の発現の必須物質（補酵素）で、
リパーゼはコリパーゼ量により比例的に活性化される性
質を有する。

コリパーゼを測定する必要性を、ヒトの膵より分泌され
るコリパーゼを例にしで、コリバー　セの性質と共に述
べると次の通りである。

（イ）分子量が約１１．０００の蛋白質性因子で、生体
内では単独、またはカルシウムイオン、胆汁酸等ともＩ
Ｂ同してリパーゼ活性の発現、増強に寄与しでいる。コ
リパーゼの欠損は消化不良、吸収不全の原因となる。

（ロ）急性膵炎、膵蔵癌等の膵疾患の指標としては、ア
ミラーゼ、リパーゼを測定する手段が既に採用されでい
るが、コリパーゼは篩分分泌機能の一指標としで、また
軽度膵機能障害発見の為の指標として有用である（古川
等二日清誌、８３゜（７）１３６７〜１３７５．１９８
６）。

（ハ）膵Ｒ疾患の患者尿、血清中のコリパーゼ／リパー
ゼ量の比率を求め、これを診断へ応用する検討がなされ
ている（ユング等：　Ｃ１１ｎｉｃａ、　Ｃｈｉｍｉｃ
ａ、　Ａｃｔａ、　１２３　（１９８２）　２９３〜３
０２）。

以上のように、コリパーゼの測定は臨床学的見地から有
用であるにもかかわらず、現状では積極的にコリパーゼ
を膵疾患の指標としで用いる動きはない、その理由は、
従来のコリパーゼの測定法が次の（１）〜（３）に述べ
るように、煩雑であり、精度的にも満足のいくものでは
なかったからである。

（１）滴定法 トリグリセライド、主としてオリーブ油、または高級胞
肪酸のグリセロールエステルの懸濁液を基質としで、下
記の酵素反応により遊離する脂肪酸をアルカリで滴定す
るものである。

基質（可溶化トリグリセリド）十膵リパーゼコリパーゼ 脂肪酸＋グリセロール しかし、この方法は反応時間が長く、多量の試料を要し
精度も良好とはいえない、このため、遊離脂肪ＳＩをｐ
Ｈスタットを用いたり、銅塩としで定量する等の改良が
なされたが、相当の時間と労力が必要である。

（２）比濁法 （１）の酵素反応による基質の濁りの減少を吸光度で測
定する方法である。

この方法は簡便ではあるが、■濁りの減少とコリパーゼ
活性が必すしも１敗せず乳化検体では吸光度が逆に上昇
する試料があったりすること、■濁りの減少を測定して
コリパーゼ活性を算出するのはコリパーゼの間接的測定
方法であること、■コリパーゼ活性か低い場合は感度が
悪く、また再現性も良くないこと等の欠点がある。

（３）トリグリセライド以外の人工（合成）基質を使用
して発色剤を用い比色定置するする方法例えば、ＢＡＬ
Ｂ　（２，３−ジメルカプトプロパン−１−オールトリ
ブチレート）、α−ナフチルパルミテート、モノグリセ
ライド、１，２−ジグリセライド、ｐ−ニトロフェノー
ルラウリン酸エステル、三酪酸ジメチルカブロール等の
詣肪酸誘導体、あるいはアルコール誘導体とのエステル
を基質として使用するものである。

しかし、これらの人工（合成）基質中、非水溶゛ｉの物
質には前記（１）、（２）の欠点の他に、これらの人工
基質はリパーゼ−コリパーゼ系以外のエステラーゼによ
っても加水分解されてしまうという基質特異性に問題が
あり、このため阻害剤の添加等が必要となり、また水溶
性の物質にも、前記（２）の欠点は解消されでいるもの
の、依然としてリパーゼ−コリパーゼ系以外のエステラ
ーゼによっても加水分解されてしまうという基質特異性
の問題は残っている。

そこで発明者等は、■リバーゼーコリバーセ系の定義が
第一に長鎖のトリグリセライドを加水分解するものであ
ることを重視して、基質としではトリグリセライドを使
用すること、■濁り（基質）の減少を測定するのではな
く、トリグリセライドがリパーゼ−コリパーゼ系により
加水分解して生成した脂肪酸またはグリセロールを直接
測定すること、■臨床検査に使用できる簡便な測定方法
であること等を考慮して鋭意研究した結果本発明を完成
した。

〈問題を解決するための手段〉 本願は次のＣＩ）〜（ＶＩＩＩ）の請求項から構成され
ている。

（１）トリグリセライドの均一かつ可溶（透明）化水溶
液にリパーゼ（必要に応じてモノグリセライドリパーゼ
を含む）を含有させると共に、更に必要に応じてこれに
胆汁酸、塩化カルシウム等のリパーゼ機能促進物質を含
有させたことを特徴とする透明なコリパーゼ測定用トリ
グリセライド基質溶液。

（■）トリグリセライドの均一かつ可溶（透明）化水溶
液を調製するために使用した界面活性剤が、非イオン界
面活性剤である特許請求の範囲第１項記載の透明なコリ
パーゼ測定用トリグリセライド基質溶液。

（ＩＩＩ）非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン
誘導体である特許請求の範囲第２項記載の透明なコリパ
ーゼ測定用トリグリセライド基質溶液。

（ｒＶ）非イオン界面活性剤が、ＨＬＢ１０〜１６であ
る特許請求の範囲第２項記載の透明なコリパーゼ測定用
トリグリセライド基質溶液。

（Ｖ）トリグリセライドを構成する脂肪酸の炭素原子数
が、１２〜２２個である特許請求の範囲第１項記載の透
明なコリパーゼ測定用トリグリセライド基質溶液。

（ＶＩ）トリグリセライドの均一かつ可溶（透明）化水
溶液のリパーゼの含有量が、測定対象である生体試料の
リバーぜ含有量より多量である特許請求の範囲第１〜５
項記載の透明なコリパーゼ測定用トリグリセライド基質
溶液。

（ＶＩＩ）リパーゼ（必要に応じてモノグリセライドリ
パーゼを含む）を含有する透明なコリパーゼ測定用トリ
グリセライド基質溶液に、コリパーゼ活性未知のコリパ
ーゼを含有する試料を作用させて遊贋する脂肪酸または
グリセロールを、従来公知の吸光度測定法により定量し
、この定ｌ値からコリパーゼ活性を測定することを特徴
とする透明なコリパーゼ測定用トリグリセライド基質溶
液を用いたコリパーゼ活性の測定方法。

（Ｖｌ）遊離する脂肪酸に対し、アデノシン３リン酸（
ＡＴＰ）、及びコエシザイムＡ　（ＣｏＡ）の存在下に
アルシコエンザイムへシシセターゼ（ＡＣＳ）を反応さ
せて生成する、（１）アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）、
（２）アシルＣｏＡ、または（３）前記反応において残
存するＣｏＡのうちの一成分を、従来公知の吸光度測定
法により定量し、この定量値からコリパーゼ活性を測定
する特許請求の範囲第（ＶＩＩＩ）項記載の透明なコリ
パーゼ測定用トリグリセライド基質溶液を用いたコリパ
ーゼ活性の測定方法。

前記した本願の透明なコリパーゼ測定用トリグリセライ
ド基質溶液は、比色定置する際に障害とならない程度の
、トリグリセライドの均一かつ可溶（透明）化水溶液で
あって、この溶液にリバセ（必要に応じてモノグリセラ
イドリパーゼを含む）を予しめ添加したものである。

また、この溶液を用いたコリパーゼ活性の測定方法は、
これに濃度未知のコリパーゼを添加しで、コリパーゼの
含有量に比例しで、トリグリセライドがリバーぜ−コリ
パーゼ系によって加水分解しで生ずる遊Ｎ脂肪酸、また
はグリセロールを測定するものである。

従来、トリグリセライドを均一かつ可溶（透明）化水溶
液とする方法は、［非水溶性物質の可溶化水溶液の製造
方法］として特公昭５９−３９１６８号公報（特許！１
２７７６０号）、特開昭６３−９１１３６が公表されて
いるが、この方法により得られたトリグリセライドの透
明水溶液を、前記した欠点を全て解消したコリパーゼ測
定用の基質として利用するのは本願が最初であり、また
この透明水溶液のトリグリセライドからリバーゼーコリ
パーセ系により遊離する脂肪酸、またはグリセロールを
直接定量してコリパーゼ活性を測定するのは本発明が最
初である。

前記した本願の透明なコリパーゼ測定用トリグリセライ
ド基質溶液は、比色定量する際に障害とならない程度の
、トリグリセライドの均一かつ可溶（透明）化水溶液（
５ｍＭ　〜ＩＭ　　ｐＨ６，０〜９．０）であって、こ
の溶液にリパーゼ（過剰量）、及び必要に応じて胆汁酸
（コール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、グソコ
コール酸、タウロコール酸等の塩　１ｍＭ〜１００ｍＭ
）、塩化カルシウム（１ｍＭ〜１５０ｍＭ）等を予しめ
添加したものである。

また、この溶液を用いたコリパーゼ活性−の測定方法は
、これにＪ度未知のコリパーゼを添加して、コリパーゼ
の含有量に比例しで、トリグリセライドかりパーセーコ
リパーゼ系によって加水分解して生ずる透照脂肪酸、ま
たはグリセロールを測定するものである。

本発明に使用される脂肪酸は、炭素原子数が１２〜２２
個の次に示す脂肪酸が適しでいる。

（１）飽和脂肪酸 ラウリン酸、ミリスチン酸、バルミチン酸、ステアリン
酸、アラ主ン酸、へヘン酸 （２）不飽和脂肪酸 リンデル酸、ラウロレイン酸、ツヅ酸、フィセトレイン
酸、ミリストレイン酸、パルミトオレイン酸、ペトロセ
リン酸、オレイン酸、エライジシ酸バクセシ酸、す、／
−ル酸、リルン酸、α−エレオステアリン酸、β−エレ
オステアリン酸、プ二力酸、バリナリン酸、カドレイン
酸、セトレイン酸、エルカ酸、アラキドン酸等が挙げら
れる。

トリグリセライドのＲ，Ｒ’　、日”がこれら脂肪酸に
よりエステル化されたトリグリセライドとしでは次のも
のが例としてあげられる。トリオレイン（結合脂肪酸の
炭素数１２．１２．１２）　、　トリデカツイン（１３
，１３，１３）　、　トリミリスチン、　　（＋４．１
４．１４）　、　　）−リベシタデカノイン（＋５．１
５．１５）　、　　トリバルミチン（＋６．１６．１６
）　、　　ｔ−リマーガリン（１７，１７，１７）　、
　　トリステアリン（＋８．１８．１８）　、　　トリ
ノオナデカノイン（＋９．１９．１９）　、　　トリオ
レイン（１８，１８，１８）　、　　トリライデン（１
８，１８，１８）　、　　トリエルシン（１８，１８，
１８）　、　　トリエルシン（＋８．１８．１８）、ト
リエルシン（２２，２２，２２）　、　　ｌ−リブラシ
ジン（２２，２２，２２）　、　　１〜ラウロデイミリ
スチシ（＋２．１４．１４）　、　　１−ミリストデイ
バルミチン（＋４．１６．１６）　、　　１−パルミト
デイステアリン（１６，１８，１８）　、　　１−ステ
アロデイバルミチン（＋６．１６．１８）　、　２−ス
テアロデイバルミチン（＋６．＋８．＋６）　、　２−
パルミトデイステア１ノン（＋８．１６．１８）　、　
　１−オレオデイステアリン（１８，１８，１８）、？
−リルオディステアリン（＋８．１８゜１８）　、　２
−オレオデイステアリン（１８，１８，１８）　。

１−ステアロデイオレイン（＋８．１８．１８）　、　
　１−ステアロデイオレイン（１８，１８，１８）　、
　　１−ステアロ−２ミリスト−３パルミチン（１８，
１４，１６）　、　　１−ステアロ−２パルミト−３ミ
リスチシ（＋８．１６゜１４）、１ラウロ−２ミリスト
−３バルミチ（１２，１４、１６） このうちヒトのリバーセーコリバーゼ系を測定しようと
する場合その基質としては、生体中に多く含まれる脂肪
酸を含むトリグリセライドが望ましく、その例としでは
ミリスチン酸、バルミチン酸、ステアリン酸、パルミト
オレイン酸、オレイン酸、リノール酸等であり、中でも
天然に最も広く最も大量に存在する脂肪酸であり、ヒト
生体内でも一番多いとされでいるオレイン酸を含むトリ
グリセライドは好ましい基質である。

また、本発明のトリグリセライドの透明な基質溶液を得
るために使用される界面活性剤は、非イオン界面活性剤
であり、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオ
キシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステ
アリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル
、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリ
オキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエ
チレンポリオキシプロピレンブロックポリマーポリオキ
シエチレン高級アルコール等のポリオキシエチレンの誘
導体が挙げられ、そのＨＬＢは１０〜１６の間のものか
適当である。中でもポリオキシエチレン高級アルコール
（ＨＬＢ１０−・１６）のものはリパーゼ反応に最適な
ものとして選ばれる。

本発明において、トリグリセライドの透明な基質溶液を
得るには、まず非イオン界面活性剤を蒸溜水あるいは緩
衝液に溶解し非イオン界面活性剤の二点以上に加熱しト
リグリセライドを加え攪拌を続けながら溶解するという
方法をとる。

また場合により非イオン界面活性剤を蒸溜水、あるいは
緩衝液に溶解し　更にリバーゼーコリバーセ系反応に影
響の無いビルグーを添加しトリグリセライドを加え、室
温にて攪拌を続は最後に蒸溜水あるいは緩衝液で希釈し
て透明な液を得ることもできる。

この際、過剰の非イオン界面活性剤はリパーゼ−コリパ
ーゼ系反応を阻害する場合もあるので、蒸溜水１００重
量％に対し、非イオン界面活性相５〜２０重量％、トリ
オレイン０．０５〜０．５重量％の割合で使用すること
が望ましい。

本発明の可溶化したトリグリセライドのりバセーコリパ
ーセ系反応はｐＨ６，５〜９．０の姥囲で反応させるこ
とが好ましく、緩衝液として例えばクエン酸−リン酸ナ
トリウム緩衝液、イミダゾール塩酸緩衝液、トリエタノ
ールアミン塩酸水酸化ナトリウム緩衝液、トリス緩衝液
、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ジェタ
ノールアミン−塩Ｍ緩衝液、ホウ酸緩衝液、２゜４．６
−ドリメチルビリジンー塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、グ
・ントの緩衝液等を５ｍＭから３００ｍＭぐらいの濃度
で使用するのが好ましい。

更に本発明では胆汁酸が必須であり、胆汁酸塩としてコ
ール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、グリココー
ルレ酸、タウロコール酸等の塩を基質液中に１ｍＭ〜１
００ｍＭの範囲で添加すると効果的である。　また必要
に応じ塩化カルシウムｔ１ｍＭ〜８０ｍＭおよび塩化ナ
トリウムを５ｍＭ・〜５００ｍＭの割合で基質反応液中
に添加すると一層効果的である。

このようにしで得られた本発明に係るコリパーゼ測定用
試薬は、コリパーゼ活性を測定する試薬として非常に有
効で安定な組成物である。

本発明によれば、トリグリセライドの均一かつ可溶（透
明）化水溶液にリパーゼを添加して（含有させて）製造
した透明なコリパーゼ測定用トリグリセライド基質溶液
に、活性が未知のコリパゼを添加しで、リバーセーコリ
パーゼ系反、応によつ加水分解されて生成する脂肪酸を
、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）コエンザイムＡ　（Ｃ
ｏＡ）存在下で脂肪酸にアシルＣｏＡシンセターゼ（Ａ
Ｃ８）を作用させる反応を基本としその後、１）生成し
たアデノシン１リン酸（ＡＭＰ）！測定する。２）生成
したアシルＣｏＡを測定する。３）残存　ＣｏＡを測定
する方法をとることができる。

これらの測定法の例をあげると、１）ではアデノシン１
リン酸（ＡＭＰ）！アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）　、
ホスフォエノールどルピン酸（ＰＥＰ）の共存下でミオ
キナーセ（ＭＫ）、ピルビン酸キナーセ（ＰＫ）を作用
させてピルビン酸を生成させ、生じたピルビン酸を乳酸
脱水素酵素（ＬＤＨ）を用いニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド−還元型（ＮＡＤＨ）の減少を測定する。

あるいはピルビン酸酸化酵素（ＰＯＰ）！用いた比色法
で測定する。

日Ｃ８ １）　■ＲＣ○ＯＨ＋ＡＴＰ＋ＣｏＡ　−−→ＲＣＯ−
ＣｏＡ＋ＡＭＰ＋ビロリン酸 ＭＫ ■ＡＭＰ＋ＡＴＰ→２ＡＤＰ Ｋ ■２ＡＤＰ＋２ＰＥＰ→ ２ピルビン酸＋２ＡＴＰ ＤＨ ■２ピルビン酸＋２ＮＡＤＨ−−→ ２乳酸＋２ＮＡＤ あるいは ＯＰ ２ビルビシ酸＋２０２−−→ ２７セチル’ＪンＭ＋２Ｈ２０２＋２ＧＯ２１）ではＡ
ＤＰデアミナーゼを使用してアンモニアを測定する方法
、あるいはＡＭＰデアミナーゼを使用してアンモニアを
測定する方法、あるいはＡＭＰ又クレりチダーゼ、アデ
ニンデアミナーゼを作用させてアンモニアを測定する方
法、更にはＡＭＰピロホスホリラーゼ、アデニンデアミ
ナーゼを作用させアンモニアを測定する方法等も例とし
てあげられる。

２）アシルＣｏＡＭ測定する方法としてはアシルＣｏＡ
にアシルＣｏＡオキシダーセ（ＡＣ○）を作用させ生成
した過酸化水素をペルオキシダーゼあるいはカタラーゼ
の系にもつでいき測定する等の例があげられる。

Ｃ３ ２）■ＲＣ○ＯＨ＋ＡＴＰ＋ＣｏＡ−−→アシル−Ｃｏ
Ａ＋ＡＭＰ＋どロリ゛ン酸ＣＯ ■アシルーＣｏＡ＋Ｏ□−−→ ２−３・トランス−エノイルＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ２生成した
過酸化水素泡カタラーゼ、ペルオキシダーゼ等を用いて
測定する生成した過酸化水素を４−アミノアンチどリン
と各種のカプラーと酸化縮合きせる。カプラーの例とし
てはフェノールの他アニリン系あるいはトルイジン系等
があり例えばＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−ト
ルイジン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、３−メ
チル−Ｎ＝エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ア
ニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−ｍ−トルイジン、３．５−ジメトキシ−
Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン等がありその他４
−アミノアンチピリンの代わりに３−メチル−２−ヘン
ゾチアゾリノンヒドラゾンを用いる、あるいは４−アミ
ノアンチどリンを使用しない１Ｏ−（３−メトキシカル
ホキシル−アミノメチル−ベンゾイル−力ルバモイ、Ｉ
ｔ、）−３，７−ビス（ジメチル−３ｎｋ）−１０Ｈ−
フェノチアジン、３−ビス（４−クロロフェニル）メチ
ル−４−ジメチル−アミノフェニルアミン等のカプラー
を用いでもよい。又直接アシルＣｏＡを脂肪酸代謝の主
経路であるβ酸化系すなわち、アシルＣｏＡ７ａアシル
ＣｏＡオキシダーセにて２−３トランス−エノイルＣｏ
Ａにした後、エノイルＣｏＡヒトラターセ、３−ヒドロ
キシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ケトアシルＣ
ｏＡチオラーゼを作用させＮＡＤＨの増加を測定しでも
良い。

３）の残存するＣｏＡｕ測定する方法としでは残存する
ＣｏＡをＳＨ基定盪試薬である５、５′ジチオビス−２
−二トロ安息香酸（ＤＴＮＢ）等で測定することができ
る。

Ｃ３ ３）■ＲＣＯＯＨ＋ＡＴＰ＋ＣｏＡ　−ＲＣ○−ＣｏＡ
＋ＡＭＰ＋ビロリン酸 ■ＣｏＡ−ＤＴＮＢ　−一→ これら脂肪Ｍを測定する系の他、リパーゼ反応により生
したグリセロールを測定してもよく、この場合はトリグ
リセライドのリパーゼ反応は１または３位で行なわれ、
１，２−ジグリセライドとなり、更にこれが２−モノグ
リセライドとなり最少にグリセロールとなるが、２−モ
ノグリセライドからグリセロールの反応は起こり難いた
め、モノグリセライトリパーセを併用すると効果的であ
る。

次に本発明を実施例をもって説明する。

〈実施例　１〉 （ハ）試薬の調整 試薬（１） 蒸留水９０ｍ１に非イオン界面活性剤としてエマルゲン
７０９（ポリオキシエチレン高級アルコール８点５６°
Ｃ）１０９を溶解し、５６℃以上に加熱すると液は二点
に達し白濁する。そこへトリオレイン２９を添加し５６
℃以上を保ちながら約３０分間攪拌し、その後加熱をや
め攪拌を続けながら故コする。液は室温に近づくと透明
となるので、この透明となった時点で蒸留水にて１０倍
希釈し透明な水溶液を得る（トリオレイン可溶化基質溶
液）、これに豚由来のリパーゼ精製品４．４００Ｕ、塩
化カルシウム７００ｍｑを添加する（透明なコリパーゼ
測定用トリグリセライド基質溶液）。

試薬（２） 下記の物質を５０Ｍ　　ｐＨ７，９トリス塩酸緩衝液に
で１００ｒｎβとする。

前記トリオレイン可溶化基質溶液 ０ｍｌ アデノシン−５′−三リン酸（ＡＴＰ）８、６ｍρ ホスホエノールピルビン酸 （ＰＥＰ）　　　　　　　　　　　　２００ｍｑ還元型
ニコチンアデニンヌクレオチド （ＮＡＤＨ）　　　　　　　　　　　４５０ｍｑミオキ
ナーゼ（ＭＫ）　　　　　　２１４ｍｑピルビン酸キナ
ーセ（ＰＫ）　　１５００．、ＯＵ乳酸脱水素酵素（Ｌ
ＤＨ）　　　２００００ＵコエンザイムＡ　（ＣｏＡ）
　　　　１９００ｍｑデオキシコール酸Ｎａ　（ＳＤＣ
） ２０００１Ｔ１９ アシルコエンザイムＡシンセターセ（ＡＣＳ）　６０Ｕ 塩化マグネシウム　　　　　　　１００ｍ９試　薬（３
）（コリパーゼ標準溶液） ３００００　Ｕ　／　ｍ　９のコリパーゼを生理食塩水
稀釈し、５．ｔｏ、１５．２０．２５．３０．３５．４
０ｎｑ／ｍＩ２となるように稀釈した。

（８）測定方法 前項で調製した試薬（１）を１．１ｒｙ＋Ｉ！試験管に
３５０ｕｕ、試薬（３）または精製水を２０μβ採取し
、３７℃で５分間加温する０次に試薬（２）を５０ｕｕ
加え、３分〜５分目の吸光度の減少をλ＝５５０ｎｍに
で試薬ブランク（前記蒸留水）を対照に測定する。

１分間当つの吸光度を縦軸に取り検量線を作製したとこ
ろ良好な直線性を示すグラフが得られた（図面参照）。

次に試薬（１）に代えて、血清（そのまま）及び膵液（
１００倍稀釈液）を同様に処理し、前記検量線によつコ
リパーゼを測定した。その結果を次に示す。

＊血清 試料Ａ：　　３．１ｎｇ／ｒｎＡ 試料Ｂ：　　８．５ｒ＋ｃ＋／ｍβ 試料Ｃ：２３．２ｎ９／ｍβ 試料Ｄ　：　１０．４ｎｑ／ｍβ 試料Ｅ：　　０．５ｒ＋ｑ／ｍｎ　（健常者）＊膵液 ｊＣ料Ａ：　　１　８．３ｎ９／ｍＩ２試料８：３２．
７ｎｑ／ｍβ 試料Ｃ：２９．７ｎ９／ｍβ 試料Ｄ　：　　１．８ｎ９／ｍｕ　（健常者）試料Ｅ　
：　　０．４ｎｑ／ｍｆｆ　（健常者）〈実施例　２〉 （Ａ）試薬 試薬（１） 蒸留水９０ｍβに非イオン界面活性剤としてエマルゲシ
７０７（ポリオキシエチレン高級アルコール）１０ｑ７
ｉ溶解し、ビルダーとして塩化ナトリウム５９を加え室
温（２５°Ｃ）にて攪拌する。この液は濁った状態とな
るが、そのままトリオレイン２９を添加し約２時間激し
く攪拌する（トリルイン可溶化基質溶液）、この液を１
０ｍＭ　　ｐＨ７，９トリス塩酸緩衝液にて１００倍希
釈して透明な水溶液を得た。これに豚由来のリパーゼ精
製品５０００　Ｕ／ｄ　ｆｆ、１０ｍＭデオキシコール
酸ナトリウム、７００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化
塩化カルシウム用添加（透明なコリバーセ測定用トリグ
リセライド基質溶液）。

３００００　Ｕ／ｄβを添加し試薬（１）とする。

試　薬（２） アシルＣｏＡシンセターゼ ５、ＯＵ１５ｍｌ アデノシン−５°−三リン酸 ３３、Ｏｕｍｏｕ ＣｏＡリチウム塩　　７．８ｕｍＯＩ２上記試薬を０．
０５Ｍ、ｐＨ７，８５トリスヒドロキシメチルアミノメ
タン、塩化マグネシウム６水塩５ｍＭ溶液に溶解し試薬
（２）とする。

試薬（３） アシルＣｏＡオキシダーゼ １０、Ｏｕ／２０ｍβ ペルオキシダーゼ ２０．０ＯＯＵ／２０ｍｕ ４−アミノアンチピリン　　　２４μｍＯβＮ、Ｎ−ビ
ス（２ヒドロキシエチル）２−アミノエタンスルホン酸
２０ｍＭ、ｐＨ７，３ＯＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピ
ル−ｍ−トルイジン０．７５ｍＭ溶液に溶解し試薬を（
３）とする。

試薬（４） Ｎ−エチルマレイミド１０ｍＭを塩酸溶液に溶解しｐＨ
３，０としたものを試薬（４）とする。

（Ｂ）測定結果 本測定法の同時再現性を調べるために、前項で調製した
試薬（１）を１．１ｍｌ試験管に採取し、試薬ブランク
として精製水５０ｕβ、検体としてコリパーゼ溶液１０
ｎｑ／ｍｕと２０ｎ９／ｍ１１を夫々５０ｕｎ加え３７
℃１０分間加温する０次に試薬（２）を１ｍＩ２加え、
３０分間反応させた後、試薬（４）を１ｍｌ加え、２分
後試薬（３）を加え、室温に放＝後λ５５０ｎｍにで試
薬ブランクを対照に吸光度を測定した。また、同様に血
清試料の測定をした。

その結果は次の通りであった。

＊同時再現性 １０ｎｑ／ｒｒｌ　　　２０ｎｑ／ｍｕ（Ｉ）　　　１
０．１　　　　　２０．１（ＩＩ）　　　　　　９．９
　　　　　　　　２０．２（ＩＩＩ）　　　　　　９．
９　　　　　　　　２０．２（■）　　　　１０．　０
　　　　　　　　２０．０（Ｖ）　　　　　１０．　２
　　　　　　　　１９．８（ＶＩ）　　　　　　９．９
　　　　　　　　２０．１（ＶＩＩＩ）　　　　　　９
．７　　　　　　　　２０．０（ＶＩ［）　　　　　１
０．０　　　　　　　　２０．　１（ＩＸ）　　　　　
１０．１　　　　　　　　１９．９（Ｘ）　　　　　１
０．　１　　　　　　　　１９．９＊血清 試料Ａ：　１８．９ｎｇ／’ｍｆｆ 試料Ｂ　：　３１．３ｒ＋ｑ／ｍＩ２ 試料Ｃ：　　９．９ｎ９／ｍｕ 試料Ｄ　：　２４．８ｎ９／ｍｕ 試料Ｅ：　　０．２ｎｑ／ｍβ（健常者）〈実施例　３
〉 （Ａ）試薬 試薬（１） 蒸留水９０ｍ１（こ非イオン界面活性剤として工マルゲ
ン７０９（ポリオキシエチレン高級アルコール二点５６
℃）１ｏ９を溶解し、５６℃以上に加熱すると液は二点
に達し白濁する。そこへトリオレイン２９を添加し５６
℃以上を保ちながら約３０分間攪拌し、その後加熱をや
め攪拌を続けながら放宜する。液は室温に近づくと透明
となるので、この透明となった時点で１０ｍＭｐＨ７，
９トリス緩衡液にて２００倍希釈し、２．５ｍＭデオキ
シコール酸ナトリウム、３５ｍＭ塩化ナトリウム、豚由
来膵リパーゼ精製品４０００１Ｊ／ｄβ、３．５ｍＭ塩
化カルシウムを添加し試薬（１）とする。

試　薬（２） アシル−ＣｏＡシンセターゼ ６６　Ｕ／ｄβ アシル−ＣｏＡオキシダーセ ９０　Ｕ／ｄβ ペルオキシダーゼ １６０００　Ｕ／ｄβ ＴＰ １　４０ｕｍｏｕ コエンザイムＡ　　　１６ｕｍｏｆｆ １０−（３−メトキシカルボキシル・アミノメチル・ベ
ンゾイル・カルバモイル）−３，７−ビス（ジメチル−
アミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン）　　　　　　　　
　　　　　２．２Ｕｍｏｕ上記試薬！２５ｍＭ、ｐＨ６
，７５グツド緩衝液で溶解する。

試薬（３） 検体ブランク用試薬として試薬（１）よりトレオレイン
、豚由来膵リパーゼ精製品、塩化カルシウムを抜いたも
のを試薬（３）とする。

（８）測定結果 実施例で調製した試薬（１）および（３）を各々１ｍｌ
試験管に採取し、人血清２０μβを（１）、（３）に入
れ３７℃にて２００分間反応せた後試薬（２）を１．５
ｍｆを各々分注し３７℃５分後波長６６６ｍｍにて測定
し、試Ｊｉ（１）を分注した検体の吸光度を差し引いた
リパーゼ活性の吸光度、及び標準液としで２０　ｎ　９
／ｍｌｌのコリパーゼ標準液を調製しで求めた人血清コ
リパーゼの活性は次の通りであった。

＊血清 試料Ａ：　　２．２ｎ９／ｍβ 試料Ｂ：　１２．２ｎ９／ｍｆ 試料Ｃ：２０．ｌｎｑ／ｍＩ！ 試料Ｄ：　１３．ｌｎｇ／ｍｕ 試料Ｅ　：　　０．６ｎ９／ｒｒｌ　（健常者）〈実施
例　４〉 （Ａ）試薬 試薬（１） 次の試薬をＯ，ＩＭ　　ｐｕｓ、３のトリスヒドロキシ
メチルアミノメタシ溶液１５ｍ１に溶解したもの。

４−アミノアンチピリン　　　　５．７ｍｇモノグリセ
ライドリパーゼ　　　１０００Ｕトリオレイン可溶化基
質（実施例３） １．７ｍβ 塩化カルシウム　　　　　　　　１００ｒｒｚ；＋塩化
マグネシウム　　　　　　　　　８ｍ９試薬（２） 次の（ａ）群の試薬を、（１））群で調製した試薬３６
ｍβに溶解したもの。

（ａ）群： グリセロキナーゼ　　　　　　　５．３８ＬＩペルオキ
シダーゼ　　　　　１３５０００Ｕアデノシン三リン酸
　　　　　４２．４ｍ９Ｌ−αグリセロリン酸オキシダ
ーゼ １６１　Ｕ アスコルビン酸オキシダーゼ　　５３．８Ｕ（ｂ）群：
下記の試薬を蒸留水にて１００ｍβとしｐＨ８，６５に
調製したもの。

Ｎ、Ｎビス（２−ヒドロキシエチル）２−アミノエタン
スルフオニツクアシッド４．２７９Ｎ−王手ル−Ｎ−ス
ルフオブロと）レーｍ−トルイジン　　　　　　　　　
　　　　０．１４９塩化マグネシウム　　　　　　　３
．０５９ドライド：／Ｘ−１０００，１９ （Ｂ）測定結果 実施例１で調製したコリパーゼ標準液（２０ｎ９／ｍｌ
２）、または血清サンプルの５０ＬＩｌと、試薬（２）
１．５ｒｒｌ！３７℃、５分間反応させ、検体中のグリ
セロールを消失させる。

次の試薬（１）を１．５ｍ１分注し、３７℃、５分間反
応させ、１５分後、試薬ブランクを対照に、波長５５０
ｎｍにて吸光度を測定し、ΔＥＡｂｓよりコリパーゼの
傭を求めた結果は次の通りであった。

＊血清 試料Ａ：　　８．８ｎｑ／ｍｆｆ 試料Ｂ：　　９．８ｎｇ／ｍｎ 試料Ｃ：　１９．６ｎ９／ｍｕ 試料Ｄ：　１４．９ｎ９／ｍｕ 試料Ｅ：　　０．３ｎ９／ｍβ（健常者）〈発明の効果
〉 この出願に係る透明なコリパーゼ測定用トリグリセライ
ド基質溶液とこれを用いるコリパーゼ活性の測定方法は
以上のように構成したから、従来測定が困難であったヒ
トの膵液、血清等の微量のコリパーゼを高感度に効率よ
く測定することができ、膵疾患の早期発見等に貢献する
ことができるという効果を有する。

【図面の簡単な説明】

図面は、コリパーゼ活性の検量線を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ I ）トリグリセライドの均一かつ可溶（透明）化水
   溶液にリパーゼ（必要に応じてモノグリセラードリパー
   ゼを含む）を含有させると共に、更に必要に応じてこれ
   に胆汁酸、塩化カルシウム等のリパーゼ機能促進物質を
   含有させたことを特徴とする透明なコリパーゼ測定用ト
   リグリセライド基質溶液。 （II）トリグリセライドの均一かつ可溶（透明）化水溶
   液を調製するために使用した界面活性剤が、非イオン界
   面活性剤である特許請求の範囲第１項記載の透明なコリ
   パーゼ測定用トリグリセライド基質溶液。 （III）非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘
   導体である特許請求の範囲第２項記載の透明なコリパー
   ゼ測定用トリグリセライド基質溶液。 （IV）非イオン界面活性剤が、ＨＬＢ１０〜１６である
   特許請求の範囲第２項記載の透明なコリパーゼ測定用ト
   リグリセライド基質溶液。 （Ｖ）トリグリセライドを構成する脂肪酸の炭素原子数
   が、１２〜２２個である特許請求の範囲第１項記載の透
   明なコリパーゼ測定用トリグリセライド基質溶液。 （VI）トリグリセライドの均一かつ可溶（透明）化水溶
   液のリパーゼの含有量が、測定対象である生体試料のリ
   パーゼ含有量より多量である特許請求の範囲第１〜５項
   記載の透明なコリパーゼ測定用トリグリセライド基質溶
   液。 （VII）リパーゼ（必要に応じてモノグリセライドリパ
   ーゼを含む）を含有する透明なコリパーゼ測定用トリグ
   リセライド基質溶液に、コリパーゼ活性未知のコリパー
   ゼを含有する試料を作用させて遊離する脂肪酸またはグ
   リセロールを、従来公知の吸光度測定法により定量し、
   この定量値からコリパーゼ活性を測定することを特徴と
   する透明なコリパーゼ測定用トリグリセライド基質溶液
   を用いたコリパーゼ活性の測定方法。 （VIII）遊離する脂肪酸に対し、アデノシン３リン酸（
   ＡＴＰ）、及びコエンザイムＡ（ＣｏＡ）の存在下にア
   ルシコエンザイムＡシンセターゼ（ＡＣＳ）を反応させ
   て生成する、（１）アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）、（
   ２）アシルＣｏＡ、または（３）前記反応において残存
   するＣｏＡのうちの一成分を、従来公知の吸光度測定法
   により定量し、この定量値からコリパーゼ活性を測定す
   る特許請求の範囲第（VII）項記載の透明なコリパーゼ
   測定用トリグリセライド基質溶液を用いたコリパーゼ活
   性の測定方法。