DK144643B - Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af triglycerider - Google Patents
Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af triglycerider Download PDFInfo
- Publication number
- DK144643B DK144643B DK245273AA DK245273A DK144643B DK 144643 B DK144643 B DK 144643B DK 245273A A DK245273A A DK 245273AA DK 245273 A DK245273 A DK 245273A DK 144643 B DK144643 B DK 144643B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- triglycerides
- lipase
- serum
- glycerol
- reagent
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 title claims description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims description 16
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims description 16
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims description 16
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 claims description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 7
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims description 4
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims 3
- CSMFSDCPJHNZRY-UHFFFAOYSA-M decyl sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O CSMFSDCPJHNZRY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 1
- CSMFSDCPJHNZRY-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid monodecyl ester Natural products CCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O CSMFSDCPJHNZRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 229940040461 lipase Drugs 0.000 description 13
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 9
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 8
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 7
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000057621 Glycerol kinases Human genes 0.000 description 6
- 108700016170 Glycerol kinases Proteins 0.000 description 6
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 6
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 5
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 4
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 4
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 2
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 alkaline earth metal alkyl sulfate Chemical class 0.000 description 2
- 150000008051 alkyl sulfates Chemical class 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- UXFQFBNBSPQBJW-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-methylpropane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(C)CO UXFQFBNBSPQBJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004308 Carboxylic Ester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000863 Carboxylic Ester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000006746 NADH Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010086428 NADH Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000019280 Pancreatic lipases Human genes 0.000 description 1
- 108050006759 Pancreatic lipases Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- HOPRXXXSABQWAV-UHFFFAOYSA-N anhydrous collidine Natural products CC1=CC=NC(C)=C1C HOPRXXXSABQWAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTBIMNXEDGNJFE-UHFFFAOYSA-N collidine Natural products CC1=CC=C(C)C(C)=N1 UTBIMNXEDGNJFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000004186 food analysis Methods 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N glycerol 1-phosphate Chemical compound OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229940116369 pancreatic lipase Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940072033 potash Drugs 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Substances [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N sym-collidine Natural products CC1=CN=C(C)C(C)=C1 GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
(19) DANMARK ( W) , \Ra/
W (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT <n> 14^643 B
DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET
(21) Ansøgning nr. 2452/73 (51) |ntC|3 ¢12 fll 1/44 (22) Indleveringsdag raaJ 1973 (24) Løbedag ^ · maJ 1 973 (41) Aim. tilgængelig 20. dec. 1973 (44) Fremlagt 26. apr. 1982 (86) International ansøgning nr. “ (86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag “ (62) Stamansøgning nr. ~
(30) Prioritet 19· jun. 1972, 2229849, DE
(71) Ansøger BOEHRINGER MANNHEIM GMBH., 68 Mannheim-Waldhof, DE.
(72) Opfinder August Wilhelm Wahlefeld, DE: Hans Moellering, DE: Wolf= gang Gruber, DE: Erich Bernt, DE: Peter Roeschlau, DE.
(74) Fuldmægtig Firmaet Chas. Hude.
(54) Fremgangsmåde og reagens til be= stemmelse af triglycerider.
Opfindelsen angår en fremgangsmåde og et reagens til bestemmelse af triglycerider ved forsæbning af glyceriderne og bestemmelse af den derved frigjorte glycerol.
Bestemmelsen af triglyceriderne får en stadig større betydning inden for såvel levnedsmiddelanalysen som inden for den medicinske diagno->Q stik, navnlig ved diagnose af hyperlipæmier inden for den kliniske Ύ) kemi.
tf Ώ * 3
Ifølge en kendt fremgangsmåde sker bestemmelsen på den måde, at man først forsæber triglyceriderne med alkoholisk alkalimetalhydroxid oq derpå 2 144643 bestemmer den dannede glycerol. Bestemmelsen sker hensigtsmæssigt ved hjælp af enzymatiske metoder. Herved bliver glycerolen phosphoryleret med adenosintriphosphat (ATP) i nærværelse af glycerolkinase (GK) til dannelse af glycerin-l-phosphat og adenosindiphosphat (ADP). Dannet ADP overføres atter ved hjælp af phosphoenolpyruvat (PEP) i nærværelse af pyruvatkinase til pyruvat og ATP. Herved dannet pyruvat hydreres med nikotinamidadenindinucleotid i hydreret form (NADH) i nærværelse af lactatdehydrogenase (LDH) til lactatet, hvorved NADH oxideres til nikotinamidadenindinucleotidet (NAD). Den ved reaktionen forbrugte NADH-mængde er ækvivalent med glycerolmængden. NADH kan let bestemmes kvantitativt på grund af dets absorption ved 366, 340 eller 334 nm.
En væsentlig ulempe ved denne kendte fremgangsmåde består i forsæbningen med ethanolisk elkalimetalhydroxid. Dette forsæbningstrin gør den i øvrigt specifikke, nøjagtige og let gennemførlige metode omstændelig og tidsrøvende, da alene forsæbningen varer 20-30 minutter ved en temperatur på ca. 70°C. Derefter skal der neutraliseres og centrifugeres, før der kan begyndes med selve glycerolbestemmelsen.
Denne ulempe afhjælpes ifølge en kendt fremgangsmåde ved hjælp af den enzymatiske forsæbning af triglyceriderne, hvorved der anvendes en lipase fra Rhizopus arrhizus. Ved denne fremgangsmåde var det overraskende, at der kunne findes frem til en lipase, som i vandig puffer kan spalte triglyceriderne fuldstændigt til fedtsyre og glycerol på 5-10 minutter ved 35-37°C. Ved en anden kendt fremgangsmåde anvendes en lipase. sammen med en protease til forsæbningen, og med en lignende virkning. Andre lipaser, navnlig den kendte pankreaslipase, viste sig uegnet.
En ulempe ved den enzymatiske spaltning består imidlertid i, at forsæbningen kræver en væsentlig mængde af det meget kostbare enzym. For at opnå en brugbar reaktionstid er ca. 1 mg af enzymet for hver 0,1 ml serumprøve nødvendig. Endelig dannede de frigjorte fedtsyrer uopløse-lige sæber med eventuelt tilstedeværende calcium- og magnesiumioner, hvilket atter førte til uklarheder og dermed til forfalskning af måleresultaterne, hvis der ikke centrifugeres.
Opfindelsen tager derfor sigte på at afhjælpe disse ulemper og angive en fremgangsmåde til bestemmelse af triglycerider i en vandig væske ved hjælp af enzymatisk forsæbning, ved hvilken den nødvendige lipase-mængde samt den nødvendige besteirmelsestid formindskes væsentligt, og nødvendigheden af en fraskillelse af de eventuelt udfældede sæber endvidere fjernes.
U4643 3
Dette opnås ifølge opfindelsen ved hjælp af en fremgangsmåde til bestemmelse af triglycerider ved enzymatisk forsæbning ved hjælp af lipase og måling af den frigjorte glycerol, som er ejendommelig ved, at forsæbningen foretages i nærværelse af såvel lipase som carboxyl= ester ase og et alkalimetal- eller jordalkalimetalalkylsulfat med 10-15 carbon-atomer i alkylgruppen. Fortrinsvis arbejdes der herved i nærværelse af serumalbumin.
Den til forsæbningen ifølge opfindelsen benyttede reagenskombination muliggør overraskende en meget stor nedsættelse af den nødvendige li-pasemængde og tilmed fra ca. 1 mg pr. 0,1 ml serumprøve til 20 pg pr.0,1 ml serumprøve uden samtidig forøgelse af reaktionstemperaturen eller reaktionstiden.
Som lipase foretrækkes en lipase fra Rhizopus arrhizus. Som carboxyl= esterase EC 3.1.1.1, carboxylesterhydrolase, anvendes fortrinsvis et pattedyr-leverpræparat, navnlig en svineleveresterase. Der kan dog også anvendes andre carboxylesteraser. En mængde på ca. 100 pg este= rase pr. 0,1 ml serumprøve har vist sig at være fuldt tilstrækkelig.
Blandt alkylsulfaterne foretrækkes alkalirretalsaltene, da de ikke giver anledning til dannelse af uopløselige sæber med de frigjorte fedtsyrer. I den foretrukne udførelsesform for fremgangsmåden, hvor der anvendes serumalbumin, kan der imidlertid også anvendes jordal kalimet al -alkylsulfater. Dodecylsulfat foretrækkes, da det fremskynder forsæbningen af triglyceriderne kraftigst under disse betingelser. Alkyl= sulfatet er virksomt i en mængde ned til 0,001 vægt%/vol. i prøvematerialet. Mængder over 0,1% fører til en forstyrrende skumdannelse og en let hæmning og er derfor i almindelighed uhensigtsmæssige.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres hensigtsmæssigt ved pH-værdier mellem 6 og 9, fortrinsvis mellem 7 og 8,5. Dette har den fordel, at der ved påvisning af den dannede glycerol med den bekendte reaktion under anvendelse af ATP, GK, PEP, PK, NADH og LDH ikke behøver at foregå en pH-værdiændring, men at forsæbning og måling af den dannede glycerol kan gennemføres i et enkelt reaktionsmateriale.
I den foretrukne udførelsesform, hvor der tilsættes serumalbumin, fortrinsvis kvægserumalbumin, undgås en uklarhed som følge af udfældede sæber pålideligt, så at sådanne sæber ikke skal fraskilles, f.eks. ved centrifugering. Serumalbumin tilsættes herved hensigtsmæssigt i en koncentration mellem 0,1 og 2,0 mg/ml prøvemateriale.
U4643 4
Kobolt- og/eller magnesiumioner har en vis aktiverende virkning på lipasen eller esterasen og kan derfor ligeledes tilsættes til yderligere reaktionsfremskyndelse.
Som puffere er alle inden for ovennævnte pH-område virksomme puffere egnede med undtagelse af phosphatpuffere. Eksempler på egnede puffere er triethanolaminpuffer,trispuffer, imidazolpuffer, veronalpuffer, glycinpuffer samt, mindre foretrukket, amediolpuffer, boratpuffer og collidinpuffer.
Reagenset til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen indeholder enzy= matisk lipase son forskningsmiddel, puffer og et system til påvisning af glycerol og er ejendommeligt ved et indhold af såvel lipasen som carboxylesterase og et al= kalimetal- eller jordalkalimetalalkylsulfat med 10-15 carbonatomer i alkylgruppen.
Som system til påvisning af glycerol kan der i reagenset ifølge opfindelsen principielt anvendes ethvert sådant system. Et påvisningssystem, som består af NADH, ATP, PEP, LDH, PK,GK samt magnesiumioner og puffer, foretrækkes. Sidstnævnte påvisningssystem er velegnet i reagenset ifølge opfindelsen og har tillige den fordel, at bestanddelene ikke forstyrrer hinanden, og at alle enzymer er aktive ved samme pH-værdi.
Inden for rammerne af den foretrukne reagenskombination består et særlig egnet reagens af 0,1-10,0 mg lipase fra Rhizopus arrhizus 0,5-20,0 mg carboxylesterase 0,01-0,2 mg alkylsulfat
1- 20 mM NADH 10-100 mM ATP
2- 20 mM PEP 0,5-5 mg LDH 0,2-5 mg PK 0,05-10 mg GK 0,1-2,0 mg serumalbumin 3- 30 mM magnesiumioner eventuelt 0,5-1,0 mM koboltioner og 0,03-0,3 M puffer, pH = 6-9.
De ovenfor angivne mængder refererer til 1 ml pufferopløsning med den angivne koncentration. Som puffer foretrækkes 0,1 M triethanolaminpuf- 5 144643 fer med en pH-værdi fra 7 til 8,5 i det ovennævnte reagens.
Som allerede nævnt muliggør fremgangsmåden og reagenset ifølge opfindelsen en meget stor billiggørelse af triglyceridbestemmelsen. I forhold til den kendte fremgangsmåde, som anvender forsæbning med ethanolisk kalilud, forkortes varigheden af bestemmelsen fra mere end 1 time til mindre end 1/2 time. Samtidig bliver talrige pipetteringstrin, opvarmning af forsæbningsmaterialet, neutralisering og centrifugering af bundfaldet overflødig.
Sammenlignet med den kendte teknik, der anvender enzymatisk forsæbning, opnås en meget betydelig formindskelse af den nødvendige enzymmængde.
De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere.
Eksempel 1
Man fremstillede et lagringsbestandigt reagens bestående af fem komponenter, som blandes før brugen og derpå er holdbare i blandet tilstand i 1-2 dage.
Komponenter Sammensætning 1 0,1 M triethanolaminpuffer pH 7,6 indeholdende 3 mM MgSO^, 1,5 mg kvægserumalbumin/ml og 0,1 mg natrium= dodecylsulfat/ml.
2 Opløsning af 6 mM NADH, 33 mM ATP og 11 mM PEP i destilleret vand.
3 Krystalsuspension af 2 mg LDH/ml og 1 mg PK/ml (fås i handelen).
4 Opløsning af 0,2 mg lipase fra Rhizopus arrhizus/ml og 4,0 mg carboxylesterase/ml.
5 Krystalsuspension af 2 mg GK/ml.
2,9 ml komponent 1, 0,1 ml komponent 2 og 0,02 ml komponent 3 blandes og indstilles på 25°C. Derpå iblandes 0,1 ml serum, som indeholder de triglycerider, der skal bestemmes, og der inkuberes i 5 minutter ved den angivne temperatur. Derpå iblandes 0,1 ml komponent 4, og blandingen holdes i 15-20 minutter ved den angivne temperatur, og ekstinktionen ved 366 nm eller 340 nm aflæses derpå i et fotometer. Den aflæste værdi betegnes med E^. Prøven tilsættes derpå 0,02 ml komponent 5, og
Claims (2)
- 6 144643 efter 10 minutter aflæses ekstinktionen påny. Denne måleværdi betegnes med E2· Efter yderligere 10 minutter aflæses atter, og måleværdien E^ noteres· Beregning: ΔΕ = (E1 - E^) — (E2 - E^) mg totalglycerol fra triglycerider/100 ml = ΔΕ x 89,1. Ovennævnte bestemmelse blev gentaget 9 gange, idet den tilsatte serummængde hver gang blev formindsket med 0,01 ml. Ved grafisk optegning af de således opnåede ΔΕ-værdier som funktion af den benyttede serummængde opnås den på tegningen viste rette linie. Ud fra de fundne værdier beregnes en proportionalitet med r = 0,9986. En sammenligning med r (ideal) =1,000 viser fremgangsmådens meget store nøjagtighed. Eksempel 2 Fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev gentaget under anvendelse af en triglyceridstandardopløsning. I forsøg 1 blev carboxylesterase og do= decylsulfat udeladt. I forsøg 2 og 3 blev henholdsvis dodecylsulfat og carboxylesterase udeladt. I forsøg 4 blev det fuldstændige reagens benyttet. De opnåede resultater udtrykt som genfindelse af de anvendte triglycerider i % i løbet af den ovenfor beskrevne, fastlagte reaktionstid, er angivet i følgende tabel. Forsøg Esterase Dodecylsulfat % genfindelse 1 16 2 + 24 3 - + 78 4 + + 101 De ovennævnte resultater viser, at under de anvendte betingelser med hensyn til lipasekoncentration er den anvendte kombination egnet til en kvantitativ bestemmelse. Patentkrav.
- 1. Fremgangsmåde til bestemmelse af triglycerider i en vandholdig væske, såsom serum, ved enzymatisk forsæbning ved hjælp af lipase og måling af den frigjorte glycerol/ kendetegnet ved, at forsæbnin-
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2229849 | 1972-06-19 | ||
| DE2229849A DE2229849C2 (de) | 1972-06-19 | 1972-06-19 | Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Triglyceriden |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK144643B true DK144643B (da) | 1982-04-26 |
| DK144643C DK144643C (da) | 1982-09-27 |
Family
ID=5848134
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK245273A DK144643C (da) | 1972-06-19 | 1973-05-04 | Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af triglycerider |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US3862009A (da) |
| JP (1) | JPS4964495A (da) |
| AR (1) | AR195328A1 (da) |
| AT (1) | AT324282B (da) |
| BE (1) | BE801106A (da) |
| CA (1) | CA994658A (da) |
| CH (1) | CH573117A5 (da) |
| CS (1) | CS166842B2 (da) |
| DD (1) | DD104367A5 (da) |
| DK (1) | DK144643C (da) |
| FR (1) | FR2190277A5 (da) |
| GB (1) | GB1395126A (da) |
| HU (1) | HU167097B (da) |
| IT (1) | IT990535B (da) |
| NL (1) | NL165845C (da) |
| SE (1) | SE413326B (da) |
| SU (1) | SU639487A3 (da) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT339505B (de) * | 1974-03-14 | 1977-10-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Enzymatisches analysenverfahren |
| JPS50142090A (da) * | 1974-04-30 | 1975-11-15 | ||
| US4014744A (en) * | 1975-01-30 | 1977-03-29 | Miles Laboratories Inc. | Processes for measuring tri-, di- and monoglycerides |
| AT354406B (de) * | 1975-08-12 | 1979-01-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagens zur bestimmung von triglyceriden |
| US4012287A (en) * | 1975-11-18 | 1977-03-15 | Dr. Bruno Lange Gmbh | Method and reagent for the quantitative analysis of triglycerides |
| US4045297A (en) * | 1975-12-15 | 1977-08-30 | Monsanto Company | Triglycerides determination method |
| DE2558536B2 (de) * | 1975-12-24 | 1979-07-12 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur kinetischen Substratbestimmung und Reagens zu seiner Durchführung |
| US4056442A (en) * | 1976-06-01 | 1977-11-01 | The Dow Chemical Company | Lipase composition for glycerol ester determination |
| US4179334A (en) * | 1976-08-19 | 1979-12-18 | Eastman Kodak Company | Hydrolysis of protein-bound triglycerides |
| US4275152A (en) | 1977-02-03 | 1981-06-23 | Eastman Kodak Company | Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters |
| US4275151A (en) | 1977-02-03 | 1981-06-23 | Eastman Kodak Company | Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters |
| US4241178A (en) * | 1978-01-06 | 1980-12-23 | Eastman Kodak Company | Process and composition for the quantification of glycerol ATP and triglycerides |
| DE2831580C2 (de) * | 1978-07-18 | 1980-09-18 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Glycerin |
| US4264589A (en) * | 1978-12-20 | 1981-04-28 | Felts James M | Separation of active α1 -acid glycoprotein and utilization in the lipoprotein lipase enzyme system |
| US4178285A (en) * | 1978-12-20 | 1979-12-11 | Felts James M | Separation of active α1 -acid glycoprotein and utilization in the lipoprotein lipase enzyme system |
| FR2449726A1 (fr) * | 1979-02-22 | 1980-09-19 | Millipore Corp | Composition a base de lipases bacteriennes et son application a l'hydrolyse et au dosage d'un ester de glycerol |
| US4394445A (en) * | 1979-02-22 | 1983-07-19 | Nix Paul T | Enzymatic glyceride hydrolysis |
| US4259440A (en) * | 1979-05-21 | 1981-03-31 | Miles Laboratories, Inc. | Hydrolysis and assay of triglycerides |
| JPS55156598A (en) * | 1979-05-25 | 1980-12-05 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Enzymatic determination of monobasic fatty acid |
| JPS561895A (en) * | 1979-06-20 | 1981-01-10 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Enzymic determination of monofunctional fatty acid |
| DE2950381A1 (de) * | 1979-12-14 | 1981-06-19 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagens zur bestimmulng von triglyceriden |
| US4425427A (en) | 1980-03-13 | 1984-01-10 | Vitafin N.V. | Simultaneous, kinetic, spectrophotometric analysis of blood serum for multiple components |
| US4322496A (en) * | 1980-04-17 | 1982-03-30 | Eastman Kodak Company | Inhibition of lactate oxidase |
| US4309502A (en) * | 1980-06-30 | 1982-01-05 | Beckman Instruments, Inc. | Enzymatic assay for glycerol and triglycerides and a reagent for use therein |
| JPS5754599A (en) * | 1980-07-22 | 1982-04-01 | Baker Instr Corp | Improved glycerol detecting reagent |
| DE3413118A1 (de) * | 1984-04-06 | 1985-10-24 | Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. | Analysenverfahren und mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2000127C3 (de) * | 1970-01-02 | 1974-12-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur quantitativen Spaltung und zum quantitativen Nachweis von Tri-, Di- und Monoglyceriden |
| US3703591A (en) * | 1970-12-16 | 1972-11-21 | Calbiochem | Triglyceride hydrolysis and assay |
-
1973
- 1973-03-12 AT AT216473A patent/AT324282B/de active
- 1973-04-10 IT IT22837/73A patent/IT990535B/it active
- 1973-04-11 HU HUBO1423A patent/HU167097B/hu unknown
- 1973-04-16 AR AR247572A patent/AR195328A1/es active
- 1973-04-17 NL NL7305350.A patent/NL165845C/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-04-25 DD DD170421A patent/DD104367A5/xx unknown
- 1973-05-04 DK DK245273A patent/DK144643C/da not_active IP Right Cessation
- 1973-05-08 CS CS3274*BA patent/CS166842B2/cs unknown
- 1973-05-30 US US365355A patent/US3862009A/en not_active Expired - Lifetime
- 1973-06-11 GB GB2769573A patent/GB1395126A/en not_active Expired
- 1973-06-13 CA CA174,004A patent/CA994658A/en not_active Expired
- 1973-06-14 SE SE7308385A patent/SE413326B/xx unknown
- 1973-06-14 CH CH864573A patent/CH573117A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-06-14 FR FR7321759A patent/FR2190277A5/fr not_active Expired
- 1973-06-19 JP JP48069109A patent/JPS4964495A/ja active Pending
- 1973-06-19 BE BE132423A patent/BE801106A/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-12-13 SU SU731975398A patent/SU639487A3/ru active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE413326B (sv) | 1980-05-19 |
| NL165845B (nl) | 1980-12-15 |
| HU167097B (da) | 1975-08-28 |
| JPS4964495A (da) | 1974-06-21 |
| IT990535B (it) | 1975-07-10 |
| CH573117A5 (da) | 1976-02-27 |
| AT324282B (de) | 1975-08-25 |
| US3862009A (en) | 1975-01-21 |
| NL165845C (nl) | 1981-05-15 |
| DD104367A5 (da) | 1974-03-05 |
| SU639487A3 (ru) | 1978-12-25 |
| BE801106A (fr) | 1973-12-19 |
| DK144643C (da) | 1982-09-27 |
| NL7305350A (da) | 1973-12-21 |
| CS166842B2 (da) | 1976-03-29 |
| FR2190277A5 (da) | 1974-01-25 |
| GB1395126A (en) | 1975-05-21 |
| CA994658A (en) | 1976-08-10 |
| AR195328A1 (es) | 1973-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK144643B (da) | Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af triglycerider | |
| Wahlefeld | Triglycerides determination after enzymatic hydrolysis | |
| US4259440A (en) | Hydrolysis and assay of triglycerides | |
| Shimizu et al. | Enzymatic microdetermination of serum free fatty acids | |
| Sinensky | Temperature control of phospholipid biosynthesis in Escherichia coli | |
| US3759793A (en) | Process for the quantitative determination of tri di and monoglycerides | |
| Lehninger | Esterification of inorganic phosphate coupled to electron transport between dihydrodiphosphopyridine nucleotide and oxygen. II | |
| CS212729B2 (en) | Method of determining glycerol ester and fatty acid contents in aqueous media,and an enzymatic agent for carrying out the method | |
| US4543326A (en) | Stabilization of oxidase | |
| US3898130A (en) | Rapid enzymatic hydrolysis of triglycerides | |
| CA1066210A (en) | Synergistic effect of microbial lipases for the hydrolysis of glycerol esters | |
| DK151396B (da) | Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af cholesterin | |
| Meijer | Histochemical method for the demonstration of myosin adenosine triphosphatase in muscle tissues | |
| US4394445A (en) | Enzymatic glyceride hydrolysis | |
| US4338395A (en) | Method for the analysis of triglycerides | |
| US4223090A (en) | Reagents for the enzymatic determination of triglycerides | |
| CS219875B2 (en) | Method of fixing the triglycerine | |
| US4309502A (en) | Enzymatic assay for glycerol and triglycerides and a reagent for use therein | |
| JPS5948098A (ja) | リパ−ゼの測定方法 | |
| US4045297A (en) | Triglycerides determination method | |
| US4476223A (en) | Process for the stabilization of aqueous solutions of cholesterol esterase from pseudomonas | |
| JPH0474000B2 (da) | ||
| Volkin | [82] Phosphomonoesterase of bone | |
| EP0045032B1 (en) | A triglyceride analysis composition and a method for triglyceride determination | |
| Ochs et al. | Glucagon and N6, O2′-dibutyryl adenosine 3′∶ 5′-monophosphate inhibition of lipogenesis and phosphofructokinase activity of hepatocytes from meal-fed rats |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |