DE2229849C2 - Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Triglyceriden - Google Patents

Description

10. Reagens nach einem der Ansprüche 6 bis 9, bungen und damit Verfälschung der Meßergebnisse dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer aus führten, falls nicht zentrifugiert wird.

0,1 M Triäthanolaminpuffer pH 7 bis 8,5 besteht. Aufgabe der Erfindung ist daher die Beseitigung

60 dieser Nachteile und die Schaffung eines Verfahrens zur Bestimmung der Triglyceride mittels enzymatischer

Verseifung, bei welchem die erforderliche Lipase-

menge ebenso wie der erforderliche Zeitaufwand erheblich verringert wird und darüber hinaus auch

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren und ein 65 die Notwendigkeit einer Abtrennung der ausfallenden neues Reagens zur Bestimmung von Triglyceriden Seifen beseitigt wird.

durch Verseifung der Glyceride und Bestimmung des Gelöst wird diese Aufgabe bei einem Verfahren

dabei freigesetzten Glycerins. zur Bestimmung von Triglyceriden durch enzyma-

tische Verseifung mittels Lipase aus Rhizopus arrhizus und Messung des freigesetzten Glycerins, erfindungsgemäß dadurch, daß die Verseifung in Gegenwart von Carboxylesterase und einem Alkali- oder Erdalkalialkylsulfat mit 10 bis 15 Kohlenstoffatomen im Alkylrest vorgenommen wird. Vorzugsweise wird dabei in Gegenwart von Serumalbumin gearbeitet.

Überraschenderweise ermöglicht die erfindungsgemäß eingesetzte Reagenzienkombination für die Verseifung eine sehr starke Herabsetzung der erforderlichen Lipasemenge, und zwar von etwa 1 mg pro Test auf 20 μβ pro Test bei gleichzeitiger Verminderung der Reaktionstemperatur auf Zimmertemperatur und der Reaktionsdauer.

Als Carboxylesterase EC 3.1.1.1, Carboxyl-esterhydfolase wird bevorzugt ein Säugetierleberpräparat, insbesondere eine Schweineleberesterase verwendet. Es sind jedoch auch andere Carboxylesterasen brauchbar. Eine Menge von etwa 100 μg Esteras? pro Test erwies sich als voll ausreichend.

Unter den Alkylsulfaten werden die Alkalisalze bevorzugt, da sie keinen Anlaß zur Bildung von unlöslichen Seifen mit den freigesetzten Fettsäuren bilden. Bei der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung von Serumalbumin können jedoch auch Erdalkalialkylsulfaie verwendet werden. Bevorzugt wird Dodecylsulfat, da es die Verseifung der Triglyceride unter diesen Bedingungen am stärksten beschleunigt (Faktor 5). Das Alkylsulfat ist in einer Menge bis herab zu 0,001 °₀ Gewicht/Volumen im Testansatz wirksam. Mengen über 0,1 % führen zu einer störenden Schaumbildung und leichten Hemmung und sind daher im allgemeinen unzweckmäßig.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweckmäßig bei pH-Werten zwischen 6 und 9, vorzugsweise zwiscnen 7 und 8,5 durchgeführt. Dies hat den Vorteil, daß bei Nachweis des gebildeten Glycerins mit der bekannten Reaktion unter Verwendung von ATP, GK, PEP, PK, NADH und LDH keine Umpufferung erfolgen muß, sondern Verseifung und Messung des gebildeten Glycerins in einem einzigen Reaktionsansaiz durchgeführt werden können.

Bei der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Zusatz von Serumalbumin, vorzugsweise Rinder-Serumalbumin, wird eine Trübung du/ch ausfallende Seifen zuverlässig vermieden, so daß derartige Seifen nicht abgetrennt, beispielsweise abzentrifugiert werden müssen. Serumalbumin wird dabei zweckmäßig in einer Konzentration zwischen 0,1 und 2,0 mg/ml Testansatz eingesetzt.

Kobalt- oder/und Magnesiumionen besitzen einen gewissen aktivierenden Effekt auf die Lipase bzw. Esterase und können daher zur weiteren Reaktionsbeschleunigung ebenfalls zugesetzt werden.

Als Puffer sind alle im oben angegebenen pH-Wertbereich wirksamen Puffer, ausgenommen Phosphatpuffer, geeignet. Beispiele für geeignete Puffer sind Triäthanolaminpuffer, Trispuffer, Imidazolpuffcr, Veronalpuffer, Glycinpuffer sowie — weniger bevorzugt — Amedioipuffer, Boratpuffer und Collidinpuffer.

Das erfindungsgemäße Reagens zur Durchführung des Verfahrens ^r Erfindung enthallend Lipase aus Rhizopus arrhizus, Verseifungsmittcl, Puffer, und ein System zum Nachweis von Glycerin ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an Carboxylesterase und an Alkalioder Erdalkalialkylsuifat mit 10 bis 15 Kohlenstoffatomen im Alkylrest.

Als System zum Nachweis von Glycerin kann im erfindungsgemäßen Reagens grundsätzlich jedes der-

artige System verwendet werden. Bevorzugt wird ein Nachweissysten,, welches aus NADH, ATP, PEP, LDH, PK, GK sowie Magnesiumionen und Puffer besteht. Letzteres Nachweissystem läßt sich gut in Gegenwart der angegebenen Verseifungsvnittelkombi-

nation anwenden und hat außerdem den Vorteil, daß sich die Bestandteile gegenseitig nicht stören und alle Enzyme beim selben pH-Wert aktiv sind.

Im Rahmen der bevorzugten Reagenzienkombination besteht ein besonders geeignetes Reagens aus

0,1 bis 10,0 mg/ml Lipase aus Rhizopus arrhizus,.

0,5 bis 20,0 mg/ml Carboxylesterase,
0,01 bis 0,2 mg/ml Alk· 'sulfat,

1 bis 20 mM NADH,
^a° 10 bis 100 mM ATP,

2 bis 20 mM PEP,
0,5 bis 5 mg/ml LDH,
0,2 bis 5 mg/ml PK,
0,05 bis 10 mg/ml Gk,

0,1 bis 2,0 mg/ml Serumalbumin,

3 bis 30 mM Magnesiumionen,
gegebenenfalls 0,5 bis 1,OmM Kobaltionen und 0,03 bis 0,3 M Puffer pH 6,9.

Als Puffer wird 0,1 M Triäthanolaminpuffer pH 7 bis 8,5 im obigen Reagens bevorzugt.

Wie bereits erwähnt, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren und Reagens eine außerordentliche Beschleunigung und Vereinfachung der Triglyceridbestimmung. Gegenüber dem bekannten Verfahren unter Verseifung mit äthanolischer Kalilauge wird die Dauer der Bestimmung von mehr als 1 Stunde auf weniger als '/₂ Stunde verringert. Gleichzeitig werden zahlreiche Pipetticrschritte, Erhitzung des Verseifungsansatzes, Neutralisierung und Zentrifugierung des Niederschlags überflüssig gemacht.

Gegenüber dem Verfahren mit enzymatischer Verseifung wird eine erhebliche Beschleunigung erzielt, bei gleichzeitiger sehr erheblicher Verringerung der erforderlichen Enzymmenge.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

So B e i s ρ i e 1 1

Es wird ein lagerungsfähiges Reagei/s hergestellt, bestellend aus; fünf Komponenten, die vor Gebrauch gemischt und dann in gemischtem Zustand 1 bis 2 Tage V.iltbar sind.

Komponente Zusammensetzung

1 0,1 M Triäthanolaminpuffer pH 7,6, enthaltend 3 mM MgSO₁, 1,5 mg Rinder-Serumalbumin/ml und 0,1 mg Natriumdodecylsul-

fai/ml

2 Lösung von 6 mM NADH, 33 mM ATP und 11 mM PEP in destilliertem Wasser

3 Kristallsuspension von 2 mg LDH/ml und 1 mg PK/ml (handelsüblich)

4 Lösung von 0,2 mg Lipase aus Rhizopus arrhizus/ml und 4,0 mg Carboxylesterase/ml

5 Kristallsuspension von 2 mg GK/ml

2,9 ml Komponente 1, 0,1ml Komponente 2 und 0,02 ml Komponente 3 werden gemischt und auf 25°C temperiert. Dann werden 0,1 ml Serum, welches die zu bestimmenden Triglyceridc enthält, zugemischt und 5 Minuten bei der angegebenen Temperatur inkubiert. Dann werden 0,1 ml Komponente 4 zugemischt, die Mischung 15 bis 20 Minuten bei der angegebenen Temperatur gehalten und anschließend im Photometer die Extinktion bei 366 rim oder 340 nm abgelesen. Der Ablesungswert wird mit E₁ bezeichnet. Anschließend werden der Probe 0,02 ml Komponente 5 zugesetzt und nach 10 Minuten erneut die Extinktion abgelesen. Der Meßwert wird als E₁ bezeichnet. Nach weiteren 10 Minuten wird erneut abgelesen und Meßwert E₃ aufgezeichnet.

Auswertung: AE = [E₁ — E₂) — (£₈ — E₃)

mg Gesamtglycerin aus Triglyceriden/ 100 ml = /IE-89,1.

Die obige Bestimmung wurde neunmal wiederholt, ao wobei die zugesetzte Serummenge jeweils um 0,01 ml verringert wurde. Bei graphischem Auftrag der so erhaltenen /1£-Werte gegen die eingesetzte Serummenge ergibt sich die in der Figur der Zeichnung wiedergegebene Gerade. »5

Aus den gefundenen Werten errechnet sich eine Proportionalität mit r = 0,9986. Vergleich mit r (ideal) -■·= 1,000 zeigt die sehr gute Genauigkeit des Verfahrens.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt unter Verwendung einer Triglyceridstandardlösung. Im Versuch 1 wurde Carboxylesterase und Dodecylsulfat weggelassen. In Versuch 2 und 3 wurden Dodecylsulfat bzw. Carboxylesterase weggelassen. In Versuch 4 wurde das vollständige Reagens eingesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse, ausgedrückt als Wiederfindung der eingesetzten Triglyceride in Prozent während der oben beschriebenen festgelegten Reaktionsdauer, zeigl die nachstehende Tabelle.

Versuch	Esterase	Dodecylsulfat	/ο Wiederfindung
ι 2 3 4	i	ΐ	16 24 78 101

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß unter den angewandten Bedingungen hinsichtlich Lipasekonzentration nur die erfindungsgemäß verwendete Kombination für eine quantitative Bestimmung geeignet ist.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (10)

1 2 Die Bestimmung der Triglyceride spielt sowohl in Patentansprüche: der Lebensmittelanalytik als auch bei der medi zinischen Diagnostik, insbesondere bei der Diagnose

1. Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden von Hyperlipaemien in der klinischen Chemie, eine durch enzymatische Verseifung mittels Lipase 5 immer bedeutendere Rolle.

aus Rhizopus arrhizus und Messung des frei- Nach einem bekannten Verfahren erfolgt die Begesetzten Glycerins, dadurch gekenn- Stimmung in der Weise, daß zuerst mit alkoholischer zeichnet, daß die Verseifung in Gegenwart Lauge die Triglyceride verseift werden und das gevon Carboxylesterase und einem Alkali- oder bildete Glycerin dann bestimmt wird. Die Bestim-Erdalkalialkylsulfat mit 10 bis 15 Kohlenstoff- io mung erfolgt zweckmäßig nach enzymatischen Meatomen im Alkylrest vorgenommen wird. thoden. Hierbei wird das Glycerin mit Adenosintri-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- phosphat (ATP) in Gegenwart von Glycerinkinase kennzeichnet, daß in Gegenwart von Serum- (GK) zu Glycerin-1-phosphat und Adenosindiphosalbumin verseift wird. phat (ADP) phosphoryliert. Gebildetes ADP wird

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch 15 durch Phosphocnolpyruvat (PEP) in Gegenwart von gekennzeichnet, daß das Verfahren bei einem Pyruvatkinase wiederum in Pyruvat und ATP überpH-Wert zwischen 6 und 9 durchgeführt wird. führt. Hierbei gebildetes Pyruvat wird durch Nikotin-

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden amid-adenindinucleotid in hydrierter Form (NADH) Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß 0,001 in Gegenwart von Lactatdehydrogenase (LDH) zum bis 0,1% G/V Alkylsulfat eingesetzt wird. ao Lactat hydriert, wobei NADH zum Nikotinamid-

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, adenindinucleotid (NAD) oxydiert wird. Die bei der dadurch gekennzeichnet, daß 0,1 bis 2,0 mg Reaktion verbrauchte NADH-Menge ist der Glycerin-Serumalbumin/ml eingesetzt werden. menge äquivalent. NADH kann leicht quantitativ

6. Reagens zur Durchführung des Verfahrens bestimmt werden auf Grund seiner Absorption bei nach Anspruch 1 bis 5, enthaltend Lipase aus 35 366, 340 oder 334 nm.

Rhizopus arrhizus, Verseifungsmittel, Puffer und Ein wesentlicher Nachteil dieses bekannten Verein System zum Nachweis von Glycerin, gekenn- fahrens besteht in der Verseifung mit äthanolischer zeichnet durch einen Gehalt an Carboxylesterase Alkalilauge. Dieser Verseifungsschritt macht die und an Alkali- oder Erdalkalialkylsulfat mit 10 ansonsten spezifische, präzise und leicht auszubis 15 Kohlenstoffatomen im Aikytrest. 30 führende Methode umständlich und zeitraubend, da

7. Reagens nach Anspruch 6 dadurch gekenn- allein die Verseifung 20 bis 30 Minuten bei einer zeichnet, daß das System zum Nachweis von Temperatur von etwa 70⁰C benötigt. Anschließend Glycerin aus Nikotinamid-adenin-dinucleotid in muß neutralisiert und zentrifugiert werden, ehe mit reduzierter Form, Adenosintriphosphat, Phospho- der Glycerinbestimmung selbst begonnen werden enolpyruvat, Lactatdehydrogenase, Pyruvatkinase, 35 kann.

Glycerinkinase, Magnesiumionen und Puffer be- Dieser Nachteil wird nach einem bekannten Versteht, fahren der Anmelderin durch die enzymatische Ver-

8. Reagens nach Anspruch 6 oder 7, gekenn- seifung der Triglyceride beseitigt, wobei eine Lipase zeichnet durch einen Gehalt an Serumalbumin. aus Rhizopus arrhizus verwendet wurde. An dieser

9. Reagens nach Anspruch 7 und 8, bestehend 40 Methode war überraschend, daß eine Lipase gefunden aus werden konnte, welche in wäßrigem Puffer die Tri-

0,1 bis 10,0 mg/ml Lipase aus Rhizopus glyceride innerhalb annehmbarer Zeiten vollständig

arrhizus ^m Fettsäuren und Glycerin spalten kann. Andere

0,5 bis 2o!o mg/ml Carboxylesterase, Lipasen, insbesondere die bekannte Pankreas-Lipase,

0,01 bis 0,2 mg/ml Natriumdodecylsulfat, « ^{erwles slch als} ungeeignet.

1 bis 20 raM Nikotinamid-adenin-dinucleotid . ^Em Nachteil der enzymatischen Spaltung besteht in reduzierter Form jedoch dann, daß die Verseifung immer noch ziemlich

10 bis 100 raM Adenosintriphosphat, ^lan8^{e dauert und} außerdem eine erhebliche Menge des

2 bis 2OmM Phosphoenolpyruvat, sehr teueren Enzyms erfordert. Um eine brauchbare 0,5 bis 5 mg/ml Lactatdehydrogenase, 5° Reaktionszeit zu erzielen, ist etwa 1 mg des Enzyms 0,2 bis 5 mg/ml Phosphoenolpyruvatkinase, P^{ro Test} erforderlich. Außerdem hegt die Reaktions-0,05 bis 10 mg Glycerinkinase, ^dau _n ^{er üb}« ^{30 Mmute}" ^{und ist damit} .^fur .^ro.^ut'?^e-0,1 bis 2,0 mg/ml Serumalbumin, ^mäßie5_ Laboruntersuchungen, insbesondere bei hau-

3 bis 3OmM Magnesiumionen und ^fi8^e" ^Tests' ^{nur wer}"S geeignet. Schließlich bildeten 0,03 bis 0,3 M Pufferlösung pH 6 bis 9. 55 die freigesetzten Fettsäuren mit Calcium- und Magne-

siumionen unlösliche Seifen, die wiederum zu Tru-