DE2535953C2 - Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Triglyceriden - Google Patents
Verfahren und Reagens zur Bestimmung von TriglyceridenInfo
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- DE2535953C2 DE2535953C2 DE19752535953 DE2535953A DE2535953C2 DE 2535953 C2 DE2535953 C2 DE 2535953C2 DE 19752535953 DE19752535953 DE 19752535953 DE 2535953 A DE2535953 A DE 2535953A DE 2535953 C2 DE2535953 C2 DE 2535953C2
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Description
RO(CH2CH2O)nH,
worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 14 bis 20 Kohlenstoffatomen und η eine Zahl von 7 %s
bis 20 bedeuten, zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der allgemeinen
Formel, in der η eine Zahl von 9 bis 15 bedeutet,
zugesetzt wird. ao
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der allgemeinen
Formel, in der η die Zahl 12 bedeutet, zugesetzt
wird,
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, as
dadurch gekennzeichnet, daß 0,005 bis 0,2 Gewichtsprozent der Verbindung der allgemeinen Formel
pro Volumen Puffer zugesetzt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß 0,01 bis 0,03 Gewichtsprozent der
Verbindung der allgemeinen Formel zugesetzt werden.
6. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 5, enthaltend Lipase, insbesondere
aus Rhizopus arrhizus, Carboxylesterase, ,Alkali- oder Erdalkalialkylsulfat mit IO bis 15
Kohlenstoffatomen im Alkylrest, Puffer und ein System zum Nachweis von Glycerin, gekennzeichnet
durch einen Gehalt an einer Verbindung der allgemeinen Formel RO(CH8CH2O)nH, worin R
eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 14 bis 20 Kohlenstoffatomen und η eine Zahl von 7 bis 20
bedeuten.
7. Reagens nach Anspruch 6, bestehend aus
0,1 bis 10,0 mg/ml Lipase aus Rhizopus '
arrhizus,
0,01 bis 20,0 mg/ml Carboxyiesterase aus
0,01 bis 20,0 mg/ml Carboxyiesterase aus
Mikroorganismen,
0.01 bis 0,2 mg/ml Natriumdodecylsulfat. Jo
0.01 bis 0,2 mg/ml Natriumdodecylsulfat. Jo
1 bis 20 mM Nicotinamid-adenin-dinucleotid in reduzierter Form,
10 bis 100 mM Adenosintriphosphat,
2 bis 20 m M Phosphor nolpyruvat, 0,5 bis 5 mg/ml Laciattiehydrogenase,
0,2 bis 5 mg/ml Phosphoenolkinase, 0,05 bis 10 mg Glyeerinkinase
0.1 bis 2,0 mg/ml Serumalbumin bis 30 mM 7Magnesiumionen und 0,0 i 2 bis 0,3 M Pufferlösung pH 6 bis 9,
gekennzeichnet durch einen Gehalt von 0,015 bis 0,3 mg/ml Cetyl-stearylpolyglycuiäther
mit 12 Mol Äthyienoxid.
8. Reagens nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer aus 0,05 M Na- 6S
Phosphatpuffer pH 6 5 bis 8,0 besteht.
55 Gegenstand de» Hnuptpolente» ist ein Verfahren zur
Bestimmung von Triglyceriden durch enzymatische
Verseifung mittel» Upase aus Rhlzopue arrhwu» untt
Messung des freigesetzten Glycerins, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Verseifung m Gegenwart
von Carbonylcsterase und einem Alkali- oder Erdalkalialkyisuifat
mit iO bis 15 Kohlenstoffatomen im Alkylrest vorgenommen wird.
Ein Nachteil dieses bekannten Verfahrens besteht darin daß in manchen Fällen, insbesondere bei stark
lipämischcn Seren, Trübungen auftreten, die auf freigesetzten
Fettsäuren beruhen und die optische Bestimmung stark stören. Prinzipiell ist es zwar möglich,
Fettsäuren durch Zusatz von Detergentien in Lösung zu halten, bei den hierfür erforderlichen Detergentienmengen
hemmen diese aber wiederum die Fnzyme. Die Untersuchungeiner sehr großen Anzahl von Substanzen
mit oberflächenaktiver Wirkung ergab, daß keine dieser Substanzen befriedigend in der Lage war, beide
Forderung, d. h. Verhinderung von Trübungen und keine Störung der Enzymaktivitäten, zu erfüllen.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren und ein Reagens zur Bestimmung von Triglyceriden
zu schaffen, welches die vollenzymatische Verseifung und Bestimmung ermögPcht, Trübungen, die durch
freigesetzte Fettsäuren hervorgerufen werden, vcrhinde
t und die Fnzymaktivitäten nicht nachteilig beein-
Gelöst wird diese Aufgabe erfindunesgemäß durch ein Verfahren der eingangs erwähnten Art, welches
dadurch gekennzeichnet ist, daß außerdem eine Ver bindung der allgemeinen Formel RO(CH2CH2O)nH,
worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 14 bis 20 Kohlenstoffatomen und η eine Zahl von 7 bis 20 bedeuten,
zugesetzt wird.
Aus der deutschen Offenlegungsschnft 23 27 894 ist
bereits ein Verfahren zur Verhinderung der Trübung in Bluiproben oder Serum, die durch Triglyceride,
also nicht durch deren Verseifungsprociukte, he. vorce-iifen
werden, bekannt. Nach diesem Verfahren wird der Probe eine polyoxyäthylierte Laurinsäureverbindung
mit 9 bis 20 Mol Äthylenoxid zugesetzt. Versuche ergaben, daß mit diesem Mittel dit bei der enzymatäscfofn
Spaltung der Triglyceride auftretenden Trübungen nicht verhindert werden können und außerdem
eine Hemmung der Lipolyse erfolgt. Die genannte Verbindung ist daher zur Lösung des der Erfindung
zugrunde liegenden Probtems ungeeignet.
Für das erfindungsgemäße Verfahren wird insbesondere eine Lipase aus Rhizopus arrhizus verwendet.
Es können jedoch auch andere Lipasen verwendet werden, ohne daß die Reaktionsdauer und Reaktionstemperatur rehöht werden müssen. Die Brauchbarkeit
einer Lipase im Rahmen des Verfahrens der Erfindung wird teilweise auch durch die Carboxyles'erase mitbestimmt.
Als Carboxylesterase wird hauptsächlich eine bekannte Esterase aus Mikroorganismen verwendet.
Die gemäö Hauptpaient erfolgende Aktivierung der
Lipase durch Alkylsulfat bleibt dabei nicht nur erhalten, sondern es gelingt sogar, Zeitdauer und Reaktionstemperatur gegenüber dem Verfahren des Hauptpatentes
noch weiter zu senken.
Bevorzugt werden erfindungsgemäß Verbindungen der allgemeinen Formel, in denen « eine Zahl von 9
bis 15 bedeutet. Besonders bevorzugt werden solche mit η = 12.
Die Verbnidungen der allgemeinen Formel werden zweckmäßig in Mengen von 0,005 bis 0,2 Gewichts-
25 36
prozent, bezogen auf das Volumen der Puffcrlöbnug,
eingesetzt. Besonder» bevorzugt sind Mengen von 0,01
bis 0,03 Gewichtsprozent,
Hinsichtlich der Verfuhrensbedingungen und sonstigen
Zusätze gelten d»e Ausführungen des Hiuiptpatenl3
im wesentlichen unverändert. ,' Zum Unterschied vom Hauptpatent ist beim vorliegenden
Verfahren auch Phosphetpuffer geeignet und
Wird sogar bevorzugt, Als besonders geeignet erwies '' sich 0,02 bis 0,1 M Phosphatpuffer pH 6,5 bis 8,0.
Das erfindungsgemäße Reagens zur Durchführung ides Verfahrens der Erfindung, enthaltend Lipase, insbesondere
aus Rhizopus arrhizus, Carboxylestcrase,
•if Alkali- oder Erdalkalialkylsulfat mit 10 bis 15 Kohlenstoffatomen
im Alkylrest, Puffer und ein System zum Nachweis von Glycerin, ist gekennzeichnet durch
einen Gehalt an einer Verbindung der allgemeinen Formel RO(CH2CHjSO)nH, worin R eine Alkyl- oder
*Alkenylgruppe mit 14 bis 20 Kohlenstoffatomen und η
eine Zahl von 7 bis 20 bedeuten.
'Vie beim Hauptpatent kann jedes System zum N .nweis von Glycerin grundsätzlich verwendet wer-
,en, hauptsächlich wird jedoch ein Nachweissystem,
welches aus NADH, ATP, PEP, LDH, PK, GK sowie Magnesiumionen und Puffer besteht, verwendet,
im Rahmen der bevorzugten Reagentienkombination
besteht ein besonders geeignetes Reagens aus
0,1 bis 10,0 mg/ml Lipase aus Rhizopus arrhizus»
0,01 bis 20.0 mg/ml Carboxylesterase aus Mikroorganismen,
0,01 bis 0,2 mg/ml Natriumdodecylsulfat,
0,01 bis 0,2 mg/ml Natriumdodecylsulfat,
1 bis 20 mM Nicotinamid-adenin-dinucleotid in reduzierter Form (NADH),
10 bis 100 mM Adenosintriphosphat (ATP),
2 bis 20 mM Phosphoenolpyruvat (PEP), 0,5 bis 5 mg/ml Lactatdehydrogenase (LDH),
0,2 bis 5 mg/ml Phosphoenolkinase (PK), 0,05 bis 10 mg Glycerinkinase (GK),
0,1 bis 2,0 mg/ml Serumalbumin,
3 bis 10 mM Magnssiuroionen, und
0,012 bis 0,3 M Pufferlösung pH 6 bis 9,
welches gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an
3, Enzymgemisch:
400 U/ml Lipase (Rhizopiis nrrhiztis)
50 U/ml Carboxylesterase (Mikroorganismen) 50 U/ml PK (Kaninchcnmuskel)
300 U/ml LDH (Schweineherz)
nifj Suspension in Ammonsulfatlösung.
4, 150 U/ml Gfycerokinase, suspendiert in Ammon-
sulfatiösung.
IO We Mischungen I bis 4 sind bei -I-4T mindestens
1 J?hr haltbar, Gemi&ch 2 ist nach Auflösung bei dieser Temperatur etwa 2 Wochen haltbar.
Aus den Reagentien I bis 3 wird ein. Reaktions-
gemisch hergestellt, welches gekühlt etwa 2 Tage haltbar
ist. Gemisch 2 wird dazu vorher in destilliertem Wasser gelöst. Für das fertige Reaktionsgemisch werden
dann Lösungen 1 und 2 und Suspension 3 im Volumenverhältnis 50:1,0:1,0 gemischt,
ao Die Bestimmung kann mit oder ohne Probenleerwert
durchgeführt werden.
Durchführung der Bestimmung mit Probenleerwert: 5,0 ml Reaktionsgemisch aus I, 2, 3 werden mit
»5 0,1 ml Serum gemischt. Davon werden 2,0 bis 2,5 ml entnommen und mit 0,01 ml Suspension 4 gemischt
(Probe); der Resi dient als Probenleerwert. Beide Lösungen werden etwa 10 min bei 20 bis 25°C stehengelassen
und die Extinktion der Probe gegen den Probenleerwert gemessen. Der gefundene Wert wird
zur Berechnung eingesetzt.
Besti mmung ohne Probenleerwert:
2,5 ml des Reaktionsgemisches aus 1,2 und 3 werden 3S mit 0,05 ml Serum gemischt, etwa 10 min bei 20 bis
25° C stehengelassen und dann die Extinktion dieser Lösung abgelesen. Dann werden 0,01 ml Suspension 4
zugemischt und nach 10 min wiederum die Extinktion abgelesen. Die Differenz beider Messungen wird zur
Berechnung eingesetzt. Die Messung erfolgt im Photometer bei 365 nm, 340 nm oder 334 nm.
Die Berechnung erfolgt je nach Meßwellenlänge durch Multiplikation der Extinktionsdifferenz mit
15,5 (365 nm) bzw. 8,23 (340 nm) bzw. 8,53 (334 nm),
"1 rnMol Triglyceride pro Liter
Das erHndungsgemäße Verfahren erhöht die Präzien
der Bestimmung weiter. Außredem ist es möglich, die Verfahrensdauer bis auf 10 min zu verringern und
dabei bei Zimmertemperatur zu arbeiten.
Beispiel 1 Em erfindungsgemäßes Reagens wird hergestellt aus
,. Wiederholung der Bestimmung mit unterschied^chen,
M«·.*» an τ"^«"ί im Serum ergibt eine
9eradel Die Proportionalität r (Korrelat.onskoeffizient)
~ 0,997.
Zum Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. Reagens mit dem Verfahren bzw. Reagens des
Hauptpatentes wurden folgende Versuche durchgefülirj. v
t. Pufferlösung:
0,05 M Natr.'umphosphatpuffer pH 7.0 enthaltend
4 mM Magnesiumsulfat
0,01 % Natriumdodecylsulfat 0,015% Cetylstearyialkoholpolyglycoläther mit
12 M Äthylenoxid.
2. Coenzymgemisch: $ά
10 mM NADH
22 mM ATP-Natriumsalz
18 mM PEP-CHA-SaIz.
Versuche 1 und 2 4,9 rn! Komponente ! von Beispiel 1 des Haupt-
patentes
0,2 ml Komponente 2 gemäß Beispiel 1 des
0,2 ml Komponente 2 gemäß Beispiel 1 des
Hauptpatentes
0,1 ml Komponente 3 + 4 gemäß Beispiel 1 des
0,1 ml Komponente 3 + 4 gemäß Beispiel 1 des
Hauptpatentes
0,1 ml Serum (ungefähr 500 mp"£ Triglyceride)
0,1 ml Serum (ungefähr 500 mp"£ Triglyceride)
wurden gemischt. Von dieser Lösung wurden 2,5 ml in Küvette 1, der Rest in Küvette 2 gegeben.
"i·
Afc
Afc
Wiederfindung nach Auswertung ohne Proben-Versuche 3 und 4 leerwert:
5 ml Komponente I gemilß Beispiel I Küvette I 477 mg TrWywlde/
0,1 ml Komponente 2 gemUß Beispiel I W mlI Serum „ .. „.. .nacn
0,1 ml Komponente 3 gcmöß Beispiel I 5 Küvette 3 jI3 Jf Wcende/
0,1 ml Serum (wie bei Versuch I und 2) l°° ml Serum niU" ' mm
0,1 ml Komponente 2 gemUß Beispiel I W mlI Serum „ .. „.. .nacn
0,1 ml Komponente 3 gcmöß Beispiel I 5 Küvette 3 jI3 Jf Wcende/
0,1 ml Serum (wie bei Versuch I und 2) l°° ml Serum niU" ' mm
Mit dem erfiruiungsgemäßen Reagens werden prak-
wurden gemischt, Von der erhaltenen Lösung wurden ... -^^^e Werte gemessen ohne und mit Berück-2,5
ml in Küvette 3, der Rest in Küvette 4 gegeben, Jo .(cht|gling cines Probcnleerwerts. Mit dem Reagens
Nach ungefähr 20 min wurden in die Küvctten I d Hauptanmeldung werden abweichende Ergeb-
und 3 je 0,01 ml GK-Suspension einpipetticrt, Dir nig&e (ver'ursacht durch auftretende Trübungen) crnal-Küvetten
2 und 4 Hefen als Probenlcerwert mit. ten, dcr ynterschied beträgt im vorliegenden Beispiel
etwa 8%.
Ergebnisse: ,5 2>T(,lbuRg
Ergebnisse: ,5 2>T(,lbuRg
I, Wiederfindung nach Auswertung mit Probenleer- Unmittelbar nach der Probenzugabe waren aile Verwert:
suchsansätze fast klar. In Küvette I und 2 setzt nach
Küvette 1/2517 mg Triglyceride/ 5 min eine deutliche Trübung ein. Ir.Küvette,3.und 4
100 ml Serum nach 10 min »o setzt nach 1U min cmc Aufhebung cm. NJ»m
Küvette 3/4 508 mg Triglyceride/ v/ar die Lösung m Küvette 4 immer noch klar, in
100 mi Serum nach 10 min Küvette 2 sehr trübe.
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Claims (1)
1. Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden
durch enzymatisch^ Verseifung mit Lipase, insbesondere
aus Rhizopus arrhizus, in Gegenwart einer Carboxylesterase und eines Alkali* oder Erdalkalialkylsulfats
mit IO bis 15 Kohlenstoffatomen im Alkylrcst nach Patentschrift 22 29 849, dadurch
gekennzeichnet, daß außerdem eine Vcr- »o
bindung der allgemeinen Formel
Priority Applications (19)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2229849A DE2229849C2 (de) | 1972-06-19 | 1972-06-19 | Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Triglyceriden |
| DE19752535953 DE2535953C2 (de) | 1975-08-12 | Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Triglyceriden | |
| AT416376A AT354406B (de) | 1975-08-12 | 1976-06-08 | Verfahren und reagens zur bestimmung von triglyceriden |
| GB24061/76A GB1502204A (en) | 1975-08-12 | 1976-06-10 | Process and reagent for the determination of triglyceride |
| CS764473A CS219874B2 (en) | 1975-08-12 | 1976-07-06 | Agent for fixing the triglycerine |
| CS766611A CS219875B2 (en) | 1975-08-12 | 1976-07-06 | Method of fixing the triglycerine |
| CA256,485A CA1057179A (en) | 1975-08-12 | 1976-07-07 | Process and reagent for the determination of triglycerides |
| US05/707,455 US4066508A (en) | 1975-08-12 | 1976-07-21 | Process and reagent for determining triglycerides |
| DK331776A DK144856C (da) | 1975-08-12 | 1976-07-22 | Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af triglycerider |
| IT25712/76A IT1065064B (it) | 1975-08-12 | 1976-07-26 | Processo per reagente per la determinazione di trigliceridi |
| SU762386217A SU641884A3 (ru) | 1975-08-12 | 1976-07-30 | Реактив дл определени тригицеридов |
| FR7624214A FR2321126A2 (fr) | 1975-08-12 | 1976-08-06 | Procede et reactif pour le dosage des triglycerides |
| NL7608735A NL7608735A (nl) | 1975-08-12 | 1976-08-06 | Werkwijze en reagens voor de bepaling van triglyceriden. |
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| BE169690A BE845042R (fr) | 1975-08-12 | 1976-08-10 | Procede et reactif pour le dosage de triglycerides |
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| SE7608919A SE420216B (sv) | 1975-08-12 | 1976-08-10 | Forfarande och reagens for bestemmning av triglycerider |
| HU76BO1627A HU175208B (hu) | 1975-08-12 | 1976-08-11 | Sposob i reagent dlja opredelenija trigliceridov |
| JP51096608A JPS5223110A (en) | 1975-08-12 | 1976-08-12 | Measuring method of triglyceride |
Applications Claiming Priority (2)
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| DE2229849A DE2229849C2 (de) | 1972-06-19 | 1972-06-19 | Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Triglyceriden |
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|---|---|
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Family
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