KR20120103545A

KR20120103545A - 말토트리오실 전이효소, 그 제조 방법 및 용도

Info

Publication number: KR20120103545A
Application number: KR1020127002032A
Authority: KR
Inventors: 마사미치 오카다; 쇼타로 야마구치; 미호 나가야
Original assignee: 아마노 엔자임 가부시키가이샤
Priority date: 2009-07-01
Filing date: 2010-03-20
Publication date: 2012-09-19
Also published as: CN102510900B; US8546111B2; CA2766018A1; EP2450435B1; CN102510900A; WO2011001722A1; EP2450435A4; JPWO2011001722A1; EP2450435A1; JP5762958B2; JP6115921B2; US20120100253A1; JP2015156861A; BRPI1014606A2; US8765434B2; US20140011257A1; US20140004226A1; DK2450435T3

Abstract

식품 가공 등에 사용가능한 조건에서 말토트리오스 단위의 당전이 반응을 촉매하는 신규한 당 전이효소 및 그 용도를 제공하는 것을 과제로 한다. α-1,4 글루코시드 결합을 가진 다당류 및 올리고당류에 작용하여, 말토트리오스 단위를 상기 당류에 전이시키는 활성을 가지는 효소로서, 말토테트라오스를 기질로서 사용하였을 때, 기질 농도 0.67%(w/v) - 70%(w/v)의 전 범위에서 말토헵타오스 생성 속도와 말토트리오스 생성 속도의 비가 9:1 - 10:0인, 말토트리오실 전이효소를 제공한다.

Description

말토트리오실 전이효소, 그 제조 방법 및 용도{MALTOTRIOCIL TRANSFERASE, PROCESS FOR PRODUCTION THEREOF, AND USE THEREOF}

본 발명은 말토트리오실 전이효소 및 그 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 신규 말토트리오실 전이효소 및 그 제조 방법, 식품의 제조?가공에 있어서의 상기 효소의 용도, 상기 효소를 생산하는 미생물 등에 관한 것이다.

본 출원은, 2009년 7월 1일자에 출원된 일본국 특허 출원 제2009-156569호에 따른 우선권을 주장하는 것이며, 해당 특허 출원의 전체 내용은 참조에 의해 원용된다.

현재, 말토트리오스를 생성시키는 아밀라제로서는, 마이크로박테리움 임페리얼(Microbacterium imperiale) 유래 효소, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 유래 효소, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래 효소, 나트로노코커스 에스피(Natronococcus sp.) 유래 효소, 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis) 유래 효소가 알려져 있다(비특허문헌 1). 그러나, 이들 중 당전이 반응에 대해 보고되어 있는 것은 스트렙토마이세스 그리세우스 유래 효소뿐이다. 또한, 상기 효소는 기질의 고농도 조건하(공여체 기질과 수용체 기질의 합이 19%, 40%(w/v))에서만 당전이 반응을 촉매하고, 기질의 저농도(1%(w/v)에서는 가수분해 반응을 촉매할 뿐 당전이 반응은 촉매하지 않는다(비특허문헌 2, 3).

또한, 내열성도 낮아, 식품 가공용 효소로는 이용되지 않는다.

한편, 산업상 이용되고 있는 당전이 효소로서는, 예를 들면, 이소말토올리고당의 제조 또는 니게로올리고당 제조에 사용되고 있는 α-글루코시다제, 프럭토올리고당 제조 또는 락토슈크로스 제조에 사용되고 있는 β-프럭토퓨라노시다제, 갈락토올리고당 제조에 사용되고 있는 β-갈락토시다제, 파라티노스 제조에 사용되고 있는 α-글루코실트랜스퍼라제, 사이클로덱스트린 제조 또는 커플링 슈거 제조에 사용되고 있는 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제, 고분기 환상 덱스트린 제조에 사용되고 있는 블랜칭 효소(blanching enzyme)를 예로 들 수 있다. 특히,α-1,4 결합을 포함하는 다당류, 올리고당에 작용하여 당전이 반응을 촉매하는 효소로서는 α-글루코시다제, 블랜칭 효소를 들 수 있다. 그러나, α-글루코시다제는 단당류의 당전이 반응을, 블랜칭 효소는 4당류 이상의 올리고당 또는 다당류의 당전이 반응을 촉매하며, 3당류인 말토트리오스를 특이적으로 당전이하는 효소는 알려져 있지 않다.

전분을 포함한 가공 식품의 경우, 전분의 노화는 보존성 저하를 야기하는 등으로 큰 문제가 되고 있다. 그 원인은 대부분 전분에 포함된 아밀로스 분자의 노화, 즉 아밀로스 분자의 회합, 그로 인한 불용화에 기인한다(비특허문헌 4). 그래서, 전분을 저분자화함으로써 노화를 억제시키는 연구가 행해지고 있으며, 어느 정도 노화를 억제시킬 수 있게 되었다. 그러나, 저분자화로 인해 본래의 전분이 가지고 있는 성질이 상실되는 문제가 생긴다. 또한, 이러한 방법에서는, 분해에 의한 환원력 증가로 인해, 단백질이나 아미노산 등과 혼합하여 가열하였을 때 이들 물질과의 반응에 의해 전분이 착색되기 때문에, 그 용도가 제한적이다(특허문헌 1). 이로 인해, 이들 전분을 저분자화하지 않고도 노화를 억제하는 연구가 행해지고 있다. 예를 들면, 전분의 α-1,4 결합을 분해하여 α-1,6 결합을 전이 반응에 의해 합성하는 효소인 블랜칭 효소가 연구되어 있지만, 내열성이 낮은 등의 문제가 있어, 식품 가공용 효소로서 이용되진 못하고 있다.

일본 특허출원 공개번호 2001-294601호 공보

「전분 과학의 사전」, 아사쿠라 서점, p.279-80(2003) 와코 외, 전분 과학, 25(2), p.155-61(1978) Usui 외, Carbohydr.Res. 250,57-66(1993) 오카다 외, 전분 과학, 30(2), p.223-230(1983) Saito, and Miura. Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)

본 발명은 식품 가공 등에 적용가능한 조건에서 말토트리오스 단위의 당전이 반응을 촉매하는 신규한 당전이 효소 및 그 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 검토를 거듭하였다. 그 결과, 지오바실러스(Geobacillus) 속에 속하는 미생물이 원하는 작용을 가진 말토트리오실 전이효소를 생산한다는 것을 발견하게 되었다. 또한, 본 발명자들은 상기 말토트리오실 전이효소를 분리 및 정제하여, 효소 화학적 성질을 결정함과 동시에 상기 효소를 코딩하는 유전자(이하, 「본 유전자」라고 함)의 클로닝에도 성공하였다. 아울러, 본 유전자 및 본 유전자의 단편을 적합한 숙주에 도입함으로써, 말토트리오실 전이효소의 제조 방법도 확립하였다. 본 발명은 이러한 성과를 통해 완성된 것으로, 다음과 같다.

[1] α-1,4 글루코시드 결합을 가진 다당류 및 올리고당류에 작용하여 말토트리오스 단위를 상기 당류에 전이시키는 활성을 가진 효소로서, 말토테트라오스를 기질로서 작용시켰을 경우, 기질 농도 0.67%(w/v)?70%(w/v)의 전 범위에서 말토헵타오스 생성 속도와 말토트리오스 생성 속도의 비가 9 : 1 내지 10 : 0인, 말토트리오실 전이효소.

[2] 말토트리오실 전이효소가 미생물 유래의 효소인, [1]에 기재된 말토트리오실 전이효소.

[3] 말토트리오실 전이효소가 지오바실러스 속의 미생물로부터 유래된 효소인, [1]에 기재된 말토트리오실 전이효소.

[4] 지오바실러스 속의 미생물이 지오바실러스 에스피-APC9669(수탁 번호 NITEBP-770)인, [3]에 기재된 말토트리오실 전이효소.

[5] 하기의 효소 화학적 성질을 포함하는 말토트리오실 전이효소:

(1) 작용: 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 다당류 및 올리고당류에 작용하여 말토트리오스 단위를 상기 당류에 전이시킴;

(2) 기질 특이성: 가용성 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스에는 작용하지만, α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 말토트리오스, 말토오스에는 작용하지 않음;

(3) 분자량: 약 83,000(SDS-PAGE).

[6] [1]?[5] 중 어느 한 항에 기재된 말토트리오실 전이효소를 유효 성분으로 포함하는 효소제.

[7] 지오바실러스 에스피-APC9669(수탁 번호 NITEBP-770) 또는 그 변이균인, 말토트리오실 전이효소 생산 능력을 지닌 미생물.

[8] 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 말토트리오실 전이효소 활성을 나타내는 그것의 단편인, 말토트리오실 전이효소.

[9] 서열번호 6의 서열을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는, [8]에 기재된 말토트리오실 전이효소.

[10] 이하 (a)?(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 DNA로 이루어진 말토트리오실 전이효소:

(a) 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA;

(b) 서열번호 6의 서열을 포함하는 DNA;

(c) 서열번호 6의 서열에 상보적인 서열에 대하여 엄격 조건하에서 혼성화하는 DNA;

(d) 서열번호 6의 서열에 대한 DNA 서열 축중체(縮重體)인 DNA;

(e) 서열번호 6의 서열을 기준으로 하나 또는 복수개의 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 서열로 이루어지며, 말토트리오실 전이효소 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA.

[11] [10]에 기재된 말토트리오실 전이효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터.

[12] 발현 벡터인, [11]에 기재된 재조합 벡터.

[13] [10]에 기재된 말토트리오실 전이효소 유전자가 도입된 형질전환체.

[14] [11] 또는 [12]에 기재된 재조합 벡터가 도입된 형질전환체.

[15] 세균 세포, 효모 세포 또는 진균류 세포인, [13] 또는 [14]에 기재된 형질전환체.

[16] 아래 단계 (1) 및 (2), 또는 단계 (i) 및 (ii)을 포함하는, 말토트리오실 전이효소의 제조법:

(1) 말토트리오실 전이효소 생산 능력을 가진 지오바실러스 속의 미생물을 배양하는 단계;

(2) 배양한 이후의 배양액 및/또는 균체로부터 말토트리오실 전이효소를 회수하는 단계.

(i) [13]?[15] 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체를 상기 말토트리오실 전이효소 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 생산 조건하에서 배양하는 단계;

(ii) 생산된 상기 단백질을 회수하는 단계.

[17] 지오바실러스 속의 미생물이 지오바실러스 에스피-APC9669인, [16]에 기재된 제조법.

[18] α-1,4 글루코시드 결합을 가진 다당류 또는 올리고당류를 포함하는 식품을 제조 및 가공하기 위한, [1]?[5] 중 어느 한 항에 기재된 효소 또는 [6]에 기재된 효소제의 용도.

[19] [1]?[5] 중 어느 한 항에 기재된 효소 또는 [6]에 기재된 효소제의 사용에 의해 기능성이 개선된 식품 또는 식품 재료.

[도 1] 지오바실러스 에스피-APC9669 유래의 말토트리오실 전이효소의 지적(optimum) 온도를 나타낸 그래프이다.
[도 2] 지오바실러스 에스피-APC9669 유래의 말토트리오실 전이효소의 지적 pH를 나타낸 그래프이다.
[도 3] 지오바실러스 에스피-APC9669 유래의 말토트리오실 전이효소의 온도 안정성을 나타낸 그래프이다.
[도 4] 지오바실러스 에스피-APC9669 유래의 말토트리오실 전이효소의 pH 안정성을 나타낸 그래프이다.
[도 5] 말토트리오실 전이효소의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도면이다. 레인 1: 분자량 마커, 레인 2: 말토트리오실 전이효소.
[도 6] 빵의 부드러움(softness) 유지 효과에 대한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
[도 7] 대장균 형질전환체의 세포 파쇄물의 원심 분리에 의한 상청액의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도면이다. 레인 M: 분자량 마커, 레인 1: 대장균 벡터 형질전환체의 세포 파쇄물의 원심 분리에 의한 상청액, 레인 2: 말토트리오실 전이효소.

(용어)

본 발명에서 「단백질을 코딩하는 DNA」란, 그것을 발현시켰을 때 상기 단백질을 수득할 수 있게 하는 DNA, 즉 상기 단백질의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가진 DNA를 지칭한다. 따라서, 코돈의 축중도 고려된다.

본 명세서에서 용어 「분리된」은 「정제된」과 상호 호환적으로 사용된다. 본 발명의 효소(말토트리오실 전이효소)와 관련하여 사용되는 경우, 「분리된」은, 본 발명의 효소가 천연 재료로부터 유래하는 경우, 상기 천연 재료에 상기 효소 이외의 성분을 실질적으로 포함하지 않는(특히 협잡 단백질을 실질적으로 포함하지 않음) 상태를 말한다. 구체적으로, 예를 들면, 본 발명의 분리된 효소내에, 협잡 단백질의 함유량은 중량 환산으로 전체의 약 20% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만, 또한 바람직하게는 약 5% 미만, 보다 더 바람직하게는 약 1% 미만이다. 한편, 본 발명의 효소가 유전공학적 방법에 따라 제조되는 경우, 용어 「분리된」은, 사용된 숙주 세포로부터 유래되는 다른 성분이나 배양액 등이 실질적으로 포함되어 있지 않은 상태를 말한다. 구체적으로, 예를 들면, 본 발명의 분리된 효소내 협잡 성분의 함유량은 중량 환산으로 전체의 약 20% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만, 또한 바람직하게는 약 5% 미만, 보다 더 바람직하게는 약 1% 미만이다. 그리고, 이와 다른 의미인 것이 명확하지 않은 한, 본 명세서에서 단순히 「말토트리오실 전이효소」로 기재한 경우에는, 「분리된 상태의 말토트리오실 전이효소」를 의미한다. 말토트리오실 전이효소 대신 사용되는 용어 「본 효소」에 대해서도 동일하게 적용된다.

DNA에 대해 사용되는 경우의 「분리된」은, 본래 천연에 존재하고 있는 DNA인 경우에는, 전형적으로는, 천연 상태에서 공존하는 그 외의 핵산으로부터 분리된 상태인 것을 말한다. 단, 천연 상태에서 인접한 핵산 서열(예, 프로모터 영역의 서열이나 터미네이터 서열 등) 등의 일부의 다른 핵산 성분을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 게놈 DNA의 경우, 「분리된」 상태에서는, 바람직하게는, 천연 상태에서 공존하는 다른 DNA 성분을 실질적으로 포함하지 않는다. 한편, cDNA 분자 등의 유전공학적 방법에 따라 제조되는 DNA의 경우, 「분리된」 상태는, 바람직하게는, 세포 성분이나 배양액 등을 실질적으로 포함하지 않는다. 마찬가지로, 화학 합성에 의해 제조되는 DNA의 경우, 「분리된」 상태에서는, 바람직하게는, dNTP 등의 전구체(원재료)나 합성 과정에 사용되는 화학물질 등을 실질적으로 포함하지 않는다. 그리고, 이와 다른 의미를 나타내는 것이 명확하지 않은 한, 본 명세서에서 단순히 「DNA」라고 기재한 경우에는 분리된 상태의 DNA를 의미한다.

(말토트리오실 전이효소 및 그 생산균)

본 발명의 제1 측면은 말토트리오실 전이효소(이하, 「본 효소」라고도 함) 및 그 생산균을 제공한다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 본 발명자들은 검토를 거듭한 결과, 지오바실러스 에스피-APC9669가 말토트리오실 전이효소를 생산한다는 것을 발견하였다. 또한, 상기 말토트리오실 전이효소의 분리 및 생산에 성공하였고, 아래 나타낸 바와 같이, 이의 효소 화학적 성질 결정에도 성공하였다.

(1) 작용

본 효소는 말토트리오실 전이효소이며, 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 다당류 및 올리고당류에 작용하여 말토트리오스 단위를 당류에 전이시킨다.

(2) 기질 특이성

본 효소는 가용성 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스에 양호하게 작용한다. 이에 비해, α-사이클로덱스트린, -사이클로덱스트린, -사이클로덱스트린, 말토트리오스, 말토오스에는 작용하지 않는다.

(3) 분자량

본 효소의 분자량은 약 83,000(SDS-PAGE에 의함)이다.

(4) 지적 온도

본 효소의 지적 온도는 약 50℃이다. 본 효소는 약 45℃ 내지 약 55℃에서 높은 활성을 나타낸다. 지적 온도는, 후술하는 말토트리오실 전이효소 활성 측정 방법(10 mmol/LMES 완충액(pH6.5)내)에 의한 측정으로 산출된 값이다.

(5) 지적 pH

본 효소의 지적 pH는 약 7.5이다. 본 효소는 pH 약 6.5 내지 약 8.0에서 높은 활성을 나타낸다. 지적 pH는, 예를 들면, 유니버설 완충액내에서 측정한 결과를 기초로 판단된다.

(6) 온도 안정성

본 효소는 65℃ 이하에서 안정된 활성을 나타낸다. 10 mmol/LMES 완충액(pH6.5) 중에서 65℃의 조건으로 30분간 처리하여도, 본 효소는 90% 이상의 활성을 유지한다.

(7) pH 안정성

본 효소는 pH 5.0 내지 10.0의 광범위한 pH 대역에서 안정된 활성을 나타낸다. 즉, 처리에 제공되는 효소 용액의 pH가 이러한 범위 내에 있으면, 40℃에서 30분간 처리 후에도, 85% 이상으로 활성이 유지된다.

(8) 등전점

본 효소의 등전점은 약 4.5(Ampholine 함유 전기 영동법에 따름)이다.

또한, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 지오바실러스 에스피-APC9669에 의해 생산되는 말토트리오실 전이효소는, 말토테트라오스를 기질로 적용시켰을 경우, 기질 농도 0.67%(w/v) 내지 70%(w/v)의 전체 범위에서, 당전이 생성물인 말토헵타오스의 생성 속도와 분해 생성물인 말토트리오스의 생성 속도의 비가 9:1 내지 10:0인 것으로 확인되었다. 즉, 광범위한 기질 농도 범위에서 당전이 반응의 비율이 현저하게 커지며, 말토헵타오스 생성율과 말토트리오스 생성율의 합을 100%로 하면, 전자가 90% 이상이다. 그리고, 생성물의 몰비를 기준으로 비율을 비교하였다.

이상과 같이, 성공적으로 입수한 본 효소의 성질과 상태에 대한 상세한 사항들이 명확해졌다. 그 결과, 본 효소가 내열성이 우수하고, 기질 특이성이 높다는 것이 확인되었다. 따라서, 본 효소는 식품 가공 용도에 적합하다.

본 효소는, 바람직하게는, 지오바실러스 에스피-APC9669(Geobacillus sp APC9669)로부터 유래되는 말토트리오실 전이효소이다. 여기서, 「지오바실러스 에스피-APC9669로부터 유래되는 말토트리오실 전이효소」는, 지오바실러스 에스피-APC9669(야생주 또는 변이주일 수 있음)에 의해 생산되는 말토트리오실 전이효소, 또는 지오바실러스 에스피-APC9669(야생주 또는 변이주일 수 있음)의 말토트리오실 전이효소 유전자를 이용하여 유전공학적 방법에 따라 수득되는 말토트리오실 전이효소를 의미한다. 따라서, 지오바실러스 에스피-APC9669로부터 수득한 말토트리오실 전이효소 유전자(또는 상기 유전자가 변형된 유전자)가 도입된 숙주 미생물에 의해 생산된 재조합체도, 「지오바실러스 에스피-APC9669로부터 유래되는 말토트리오실 전이효소」에 해당된다.

본 효소가 유래되는 지오바실러스 에스피-APC9669를, 설명의 편의상, 본 효소의 생산균으로 칭한다. APC9669 주는 하기와 같이 소정의 기탁 기관에 기탁되어 있으며, 용이하게 입수 가능하다.

기탁 기관: NITE 바이오 테크놀러지 본부 특허 미생물 기탁 센터(우편번호 292-0818 일본 지바현 기사라즈시 카즈사카마티리 2-5-8)

기탁일(수령일): 2009년 6월 2일

수탁 번호: NITE BP-770

본 발명의 말토트리오실 전이효소는, 일 태양에 있어서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 아미노산 서열은 서열번호 7의 아미노산 서열에서 시그널 펩티드 부분을 제외한 서열이다. 그리고, 서열번호 7의 아미노산 서열은, 지오바실러스 에스피-APC9669로부터 클로닝하여 수득한 유전자의 염기 서열(서열번호 6)로부터 추정한 아미노산 서열이다. 여기서, 일반적으로, 어느 단백질의 아미노산 서열의 일부에 변형을 가했을 경우, 변형 후의 단백질이 변형 전의 단백질과 동등한 기능을 가질 수 있다. 즉, 아미노산 서열의 변형이 단백질의 기능에 실질적인 영향을 주지 않으며, 단백질의 기능이 변형 전후에도 유지되는 경우도 있다. 이에, 본 발명은 다른 태양으로서 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열과 등가의 아미노산 서열로 구성되며, 말토트리오실 전이효소 활성을 가지는 단백질(이하, 「등가 단백질」이라고도 함)을 제공한다. 이때 「등가의 아미노산 서열」은, 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열과 일부 상이하지만, 이러한 상이가 단백질의 기능(여기서는 말토트리오실 전이효소 활성)에 실질적인 영향을 미치지 않는 아미노산 서열을 일컫는다. 「말토트리오실 전이효소 활성을 가진다」는, 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 다당류 및 올리고당류에 작용하여, 말토트리오스 단위를 당류에 전이시키는 활성을 의미하지만, 그 활성의 정도는 말토트리오실 전이효소로서의 기능을 발휘할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 단, 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 단백질과 동일한 수준 또는 그보다 높은 수준인 것이 바람직하다.

「아미노산 서열의 일부 상이」란, 전형적으로, 아미노산 서열을 구성하는 1 내지 수개(상한은, 예컨대, 3개, 5개, 7개, 10개)의 아미노산의 결실, 치환 또는 1 내지 수개(상한은, 예컨대, 3개, 5개, 7개, 10개)의 아미노산의 부가, 삽입 또는 이들 조합에 의해, 아미노산 서열에 변이(변화)가 생긴 것을 의미한다. 여기서, 아미노산 서열의 상이는 말토트리오실 전이효소 활성이 유지되는 한 허용된다(활성에 다소의 변동이 있을 수 있음). 이러한 조건을 만족시키는 한, 아미노산 서열이 상이한 위치는 특별히 한정되지 않으며, 또한 복수개의 위치에서 상이가 있을 수도 있다. 여기에서 복수개는, 예를 들면, 전체 아미노산의 약 30% 미만에 해당되는 수이며, 바람직하게는 약 20% 미만에 해당되는 수이며, 보다 바람직하게는 약 10% 미만에 해당되는 수이며, 보다 더 바람직하게는 약 5% 미만에 해당되는 수이며, 가장 바람직하게는 약 1% 미만에 해당되는 수이다. 즉, 등가 단백질은, 서열번호 8의 아미노산 서열과, 예컨대, 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상의 동일성을 가진다.

바람직하게는, 말토트리오실 전이효소 활성에 필수가 아닌 아미노산 잔기에 보존적인 아미노산 치환을 수행함으로써, 등가 단백질을 수득한다. 여기서, 「보존적인 아미노산 치환」은, 어떤 아미노산 잔기를 비슷한 성질의 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 아미노산 잔기는 측쇄에 따라 알칼리성 측쇄(예, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예, 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전된 극성 측쇄(예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β 분지 측쇄(예, 트레오닌, 발린, 이소루신), 방향족 측쇄(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)과 같이, 몇개의 패밀리로 분류되어 있다. 보존적인 아미노산 치환은, 바람직하게는, 동일한 패밀리에 속하는 아미노산 잔기간의 치환이다.

「등가 단백질」은 부가적인 성질을 가질 수도 있다. 그러한 성질로서, 예컨대, 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 단백질에 비해 안정성이 우수한 성질, 저온 및/또는 고온에서만 상이한 기능을 발휘하는 성질, 지적 pH가 상이한 성질 등을 들 수 있다.

여기서, 2개의 아미노산 서열의 동일성(%)은, 예를 들면, 이하의 단계에 의해 결정할 수 있다. 먼저, 최적 비교가 가능하도록 2개의 서열을 정렬시킨다(예, 제1 서열에 갭을 도입하여 제2 서열과의 정렬을 최적화할 수도 있음). 제1 서열의 특정 위치의 분자(아미노산 잔기)가, 제2 서열의 대응하는 위치의 분자와 동일하다면, 그 위치의 분자가 동일하다고 할 수 있다. 서열 동일성은, 2가지 서열에 공통되는 동일 위치의 수에 대한 함수이며(즉, 동일성(%) = 동일 위치의 수/위치의 총 수 x 100), 바람직하게는, 정렬의 최적화에 필요한 갭의 수와 크기도 고려된다. 2개의 서열 간의 비교와 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 실현 가능하다. 서열의 비교에 이용가능한 수학적 알고리즘의 구체예로서는 Karlin 및 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68에 기재된 것과, Karlin 및 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77에 기재된 변조된 알고리즘이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 알고리즘은, Altschul등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10에 기재된 NBLAST 프로그램 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 내장되어 있다. 예를 들면, XBLAST 프로그램으로 score = 50, word length = 3으로 BLAST 폴리펩티드 검색을 행하면, 동일성이 높은 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교를 위한 갭 정렬을 수득하기 위해서는, Altschul등 (1997) Amino Acids Research 25(17): 3389-3402에 기재된 Gapped BLAST를 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST를 이용하는 경우, 대응되는 프로그램(예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. 상세하게는, 예컨대, NCBI의 웹페이지를 참조할 수 있다. 서열의 비교를 위해 이용가능한 다른 수학적 알고리즘의 예로는, Myers 및 Miller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17에 기재된 알고리즘이 있다. 이와 같은 알고리즘은, 예컨대, GENESTREAM 네트워크 서버(IGH Montpellier, 프랑스) 또는 ISREC 서버에서 이용가능한 ALIGN 프로그램에 내장되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, 예컨대, PAM120 잔기 질량표를 사용하고, 갭 길이 패널티=12, 갭 패널티=4로 할 수 있다. 2개의 아미노산 서열 간의 동일성은, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 이용하고, 갭 가중 = 12, 10, 8, 6, 또는 4, 갭 길이 가중 = 2, 3, 또는 4에서 결정할 수 있다.

본 효소는 보다 큰 단백질(예, 융합 단백질)의 일부일 수도 있다. 융합 단백질에 부가되는 서열로는, 예컨대, 다중 히스티딘 잔기와 같이 정제에 유용한 서열, 재조합 생산시 안정성을 확보하기 위한 부가 서열 등을 들 수 있다.

상기 아미노산 서열을 포함하는 본 효소는 유전공학적 방법에 따라 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 본 효소를 코딩하는 DNA로 적정 숙주 세포(예, 대장균)를 형질전환시키고, 형질전환 체내에서 발현된 단백질을 회수함으로써, 제조할 수 있다. 회수된 단백질은 목적에 따라 적절하게 제조된다. 이와 같이 재조합 단백질로서 본 효소를 수득한다면, 여러가지 수식(裝飾, modification)도 가능하다. 예를 들면, 본 효소를 코딩하는 DNA와 다른 적합한 DNA를 동일한 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 이용하여 재조합 단백질을 생산시킴으로써, 임의의 펩티드 내지 단백질이 연결된 재조합 단백질로 구성된 본 효소를 수득할 수 있다. 또한, 당쇄 및/또는 지방질의 부가, 또는 N 말단 또는 C 말단의 프로세싱이 이루어지는 등의 수식이 행해질 수도 있다. 이상과 같은 수식에 의해, 재조합 단백질의 추출, 정제의 간편화 또는 생물학적 기능의 부가 등이 가능하다.

(말토트리오실 전이효소 유전자)

본 발명의 제2 측면은 말토트리오실 전이효소 유전자에 관한 것이다. 일 태양에 있어, 본 발명의 유전자는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 포함한다. 상기 태양의 구체예는 서열번호 6의 염기 서열로 구성된 DNA이다.

그러나, 일반적으로, 임의 단백질을 코딩하는 DNA의 일부에 변형이 가해지는 경우, 변형된 DNA에 의해 코딩되는 단백질은, 변형되기 전의 DNA에 의해 코딩되는 단백질과 동등한 기능을 가질 수 있다. 즉, DNA 서열의 변형은, 코딩되는 단백질의 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않으며, 코딩되는 단백질의 기능은 변형 전후에 유지될 수 있다. 이에, 본 발명은, 다른 태양으로서, 서열번호 6의 염기 서열과 등가의 염기 서열을 가지며, 말토트리오실 전이효소 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA(이하, 「등가 DNA」라고도 함)를 제공한다. 여기에서 「등가의 염기서열」은, 서열번호 6에 나타내는 핵산과 일부 상이하지만, 이러한 상이가 그로부터 코딩되는 단백질의 기능(여기에서는 말토트리오실 전이효소 활성)에 실질적인 영향을 미치지 않는 염기 서열을 말한다.

등가 DNA에 대한 구체예는, 서열번호 6의 염기서열에 상보적인 염기 서열에 대해 엄격 조건하에서 혼성화하는 DNA이다. 여기서 「엄격 조건」은, 이른바 특이적인 하이브리드는 형성되고, 비특이적인 하이브리드는 형성되지 않는 조건을 말한다. 이와 같은 엄격 조건은, 당업자에게 공지된 것으로서, 예를 들면, Molecular Cloning(Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)나 Current protocols in molecular biology(edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987)을 참조하여 설정할 수 있다. 엄격 조건으로는, 예컨대, 혼성화 용액(50% 포름아미드, 10x SSC(0.15 M NaCl, 15 mM 소듐 사이트레이트, pH 7.0), 5x 덴하트(Denhardt) 용액, 1% SDS, 10% 덱스트란 황산, 10 ㎍/ml의 변성된 연어 정자 DNA, 50 mM 인산 버퍼(pH7.5)를 사용하여, 약 42℃ 내지 약 50℃에서 인큐베이션한 다음, 0.1x SSC, 0.1% SDS를 사용하여 약 65℃ 내지 약 70℃에서 세정하는 조건을 들 수 있다. 또한, 바람직한 엄격 조건으로는, 예를 들면, 혼성화 용액으로서 50% 포름아미드, 5x SSC(0.15 M NaCl, 15 mM 소듐 사이트레이트, pH 7.0), 1x 덴하트 용액, 1% SDS, 10% 덱스트란 황산, 10 ㎍/ml의 변성된 연어 정자 DNA, 50 mM 인산 버퍼(pH7.5)를 사용하는 조건을 들 수 있다.

등가 DNA에 대한 다른 구체예로서, 서열번호 6에 나타낸 염기 서열을 기준으로 1 또는 복수개(바람직하게는 하나 내지 수개)의 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 염기 서열로 구성되며, 말토트리오실 전이효소 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA를 들 수 있다. 염기의 치환이나 결실 등은 복수의 부위에서 이루어질 수도 있다. 여기에서 「복수」는, 상기 DNA에 의해 코딩되는 단백질의 입체 구조에서의 아미노산 잔기의 위치나 종류에 따라 상이하지만, 예를 들면, 2 내지 40개의 염기, 바람직하게는 2 내지 20개의 염기, 보다 바람직하게는 2 내지 10개의 염기이다. 이상과 같은 등가 DNA는, 예컨대, 제한 효소 처리, 엑소뉴클레아제나 DNA 리가제 등에 의한 처리, 위치 지정 돌연변이 도입법(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), 또는 랜덤 돌연변이 도입법(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)에 따른 변이 도입 등을 이용하여, 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하도록, 서열번호 6의 염기 서열을 포함하는 DNA를 변형시킴으로써, 수득할 수 있다. 또한, 자외선 조사 등 다른 방법에 의해서도 등가 DNA를 수득할 수 있다.

등가 DNA의 또다른 예로서, SNP(1 염기다형)로 대표되는 다형에 기인하여 상기와 같은 염기의 상이가 인정되는 DNA를 들 수 있다.

본 발명의 유전자는, 본 명세서 또는 첨부된 서열목록에 개시된 서열 정보를 참고하여, 표준적인 유전공학적 방법, 분자 생물학적 방법, 생화학적 방법 등을 사용함으로써 분리된 상태로 제조할 수 있다. 구체적으로, 지오바실러스 에스피-APC9669의 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리, 또는 지오바실러스 에스피-APC9669의 균체내 추출액으로부터, 본 발명의 유전자에 특이적으로 혼성화가능한 올리고 뉴클레오티드 프로브 및 프라이머를 적절히 이용하여 제조할 수 있다. 올리고 뉴클레오티드 프로브 및 프라이머는, 시판 중인 자동화 DNA 합성 장치 등을 사용하여 용이하게 합성할 수 있다. 그리고, 본 발명의 유전자를 제조하기 위해 사용되는 라이브러리의 제작 방법에 대해서는, 예를 들면, Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York를 참조할 수 있다.

예를 들면, 서열번호 6의 염기 서열을 포함하는 유전자는, 상기 염기 서열 또는 그 상보 서열의 전체 또는 일부를 프로브로 한 혼성화 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 일부에 특이적으로 혼성화하도록 디자인된 합성 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 사용한 핵산 증폭 반응(예, PCR)을 이용하여 증폭 및 분리할 수 있다. 또한, 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열이나 서열번호 6의 염기 서열의 정보를 토대로 하여, 화학 합성에 의해 목적 유전자를 수득할 수도 있다(참고 문헌: Gene, 60(1), 115-127 (1987)).

이하, 본 발명의 유전자의 취득 방법에 대한 구체예를 나타낸다. 먼저, 지오바실러스 에스피-APC9669로부터 본 효소(말토트리오실 전이효소)를 분리 및 정제하고, 이의 부분 아미노산 서열 정보를 수득한다. 부분 아미노산 서열의 결정 방법으로, 예를 들면, 정제된 말토트리오실 전이효소를 직접 통상적인 방법에 따른 에드만 분해법[저널 오브 바이오로지칼 케미스트리, 제256권, 제7990?7997 페이지(1981)]에 의해 아미노산 서열 분석[단백질 서열분석기-476A, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 사제 등]에 제공한다. 단백질 가수분해 효소의 작용에 의해 제한적인 가수분해를 수행하여, 얻어진 펩티드 단편을 분리 및 정제하고, 얻어진 정제 펩티드 단편에 대해 아미노산 서열 분석을 행하는 것이 유효하다.

이렇게 수득한 부분 아미노산 서열 정보를 기초로 말토트리오실 전이효소 유전자를 클로닝한다. 예를 들어, 혼성화 방법 또는 PCR을 이용하여 클로닝을 행할 수 있다. 혼성화 방법을 이용하는 경우, 예를 들면, Molecular Cloning(Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)에 기재된 방법을 이용할 수 있다.

PCR 방법을 이용하는 경우, 이하의 방법을 이용할 수 있다. 먼저, 말토트리오실 전이효소를 생산하는 미생물의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 부분 아미노산 서열의 정보를 기초로 디자인한 합성 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 행하여, 목적 유전자 단편을 수득한다. PCR 방법은, PCR 테크놀로지[PCR Technology, 에르리히(Erlich) HA 편집, 스톡톤프레스사(Stocktonpress), 1989년 발행]에 기재된 방법에 준하여 행한다. 또한, 이 증폭 DNA 단편에 대하여 통상적으로 사용되는 방법, 예컨대, 다이데옥시 체인 터미네이터 방법으로 염기 서열을 결정하면, 결정된 서열에서 합성 올리고 뉴클레오티드 프라이머의 서열 이외의 말토트리오실 전이효소의 부분 아미노산 서열에 대응되는 서열이 확인되므로, 목적한 말토트리오실 전이효소 유전자의 일부를 입수할 수 있다. 수득된 유전자 단편을 프로브로 하여, 또한, 혼성화 방법 등을 행함으로써, 말토트리오실 전이효소의 전체 길이를 코딩하는 유전자를 클로닝할 수 있다.

후술하는 실시예에서는, 지오바실러스 에스피-APC9669에 의해 생산되는 말토트리오실 전이효소를 코딩하는 유전자의 서열을 PCR 방법을 이용하여 결정하였다. 지오바실러스 에스피-APC9669 유래의 말토트리오실 전이효소를 코딩하는 유전자의 전체 염기 서열은 서열번호 6에 나타낸다. 또한, 상기 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 결정하였다(서열번호 7). 그리고, 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열에 대응되는 염기 서열은 서열번호 6에 기재된 서열 외에도 여러가지가 존재한다.

전체 염기 서열이 밝혀진 말토트리오실 전이효소 유전자(서열번호 6)의 전체 또는 일부분을 혼성화용 프로브로서 사용함으로써, 다른 말토트리오실 전이효소를 생산하는 미생물의 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터, 서열번호 6의 말토트리오실 전이효소 유전자와 상동성이 높은 DNA를 선별할 수 있다.

마찬가지로, PCR용 프라이머를 디자인할 수 있다. 이러한 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 행함으로써, 상기 말토트리오실 전이효소 유전자와 상동성이 높은 유전자 단편을 검출하고, 또한 그 유전자 전체를 수득할 수도 있다.

수득되는 유전자의 단백질을 제조하고, 이의 말토트리오실 전이효소 활성을 측정함으로써, 말토트리오실 전이효소 활성을 가진 단백질을 코딩하는 유전자인지 여부를 확인할 수 있다. 또한, 수득되는 유전자의 염기 서열(또는 이로부터 코딩되는 아미노산 서열)을 상기 말토트리오실 전이효소 유전자의 염기 서열(또는 이로부터 코딩되는 아미노산 서열)과 비교하여 유전자 구조나 상동성을 조사함으로써, 말토트리오실 전이효소 활성을 가진 단백질을 코딩하는지의 여부를 판정하는 것도 가능하다.

1차 구조와 유전자 구조가 명확해졌으므로, 랜덤 변이 또는 부위 특이적 변이의 도입에 의해, 변형형 말토트리오실 전이효소(1개 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 부가, 삽입 또는 치환 중 적어도 1개가 행해진 유전자)를 수득하는 것이 가능하다. 이로써, 말토트리오실 전이효소 활성을 가지지만, 지적 온도, 안정 온도, 지적 pH, 안정 pH, 기질 특이성 등의 성질이 상이한, 말토트리오실 전이효소를 코딩하는 유전자를 수득할 수 있다. 또한, 유전공학적인 방법으로 변형된 말토트리오실 전이효소를 제조할 수도 있다.

여기서, 변이 도입시, 계획은, 예를 들면, 유전자 서열 상의 특징적인 서열을 참작하여 행해진다. 특징적인 서열의 참작은, 예를 들면, 그 단백질의 입체 구조 예측, 기존의 단백질과의 상동성을 고려함으로써 행할 수 있다.

랜덤 변이의 도입 방법의 예로, DNA를 화학적으로 처리하는 방법으로서 아황산 수소 나트륨을 작용시켜 시토신 염기를 우라실 염기로 변환시키는 트랜지션 변이 유발법[프로시딩 오브 드 내셔널 아카데미 오브 사이언시즈 오브 드 USA, 제79권, 제1408?1412페이지(1982)], 생화학적 방법으로서, [α-S] dNTP의 존재 하에 이중 가닥을 합성하는 과정에 염기 치환이 이루어지게 하는 방법[진(Gene), 제64권, 제313?319페이지(1988)], PCR를 사용하는 방법으로서, 반응계에 망간을 가하여 PCR를 행하여 뉴클레오티드의 합성 정확함을 낮추는 방법[애널라이티컬 바이오케미스트리(Analytical Biochemistry), 제224권, 제347?353페이지(1995)] 등이 있다.

부위 특이적인 변이를 도입하는 방법의 예로는, 앰버 변이를 이용하는 방법[갭이 삽입된 듀플렉스(gapped duplex) 방법, 핵산 리서치(Nucleic Acids Research), 제12권, 제24호, 제9441?9456페이지(1984)], 제한 효소의 인지 부위를 이용하는 방법[Analytical Biochemistry, 제200권, 제81?88 페이지(1992), Gene, 제102권, 제67?70 페이지(1991)], dut(dUTPase)와 ung(우라실 DNA 글리코실라제) 변이를 이용하는 방법[쿠켈(Kunkel) 방법, Kunkel method, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 제82권, 제488?492페이지(1985)], DNA 폴리머라제 및 DNA 리가제를 이용한 앰버 변이를 이용하는 방법[올리고뉴클레오티드 다이렉티드 듀얼 앰버(Oligonucleotide-directed Dual Amber: ODA) 방법, Gene, 제152권, 제271?275 페이지(1995), 일본 특허출원 공개번호 평7-289262호 공보], DNA의 수복계(修復系)를 유발하는 숙주를 이용하는 방법(일본 특허출원 공개번호 평8-70874호 공보), DNA 사슬 교환 반응을 촉매하는 단백질을 이용하는 방법(일본 특허출원 공개번호 평8-140685호 공보), 제한 효소의 인지 부위가 부가된 2종의 변이 도입용 프라이머를 사용한 PCR에 의한 방법(미국 특허 제5,512,463호), 불활화 약제 내성 유전자를 포함하는 이중가닥 DNA 벡터와 2종의 프라이머를 이용한 PCR에 의한 방법[Gene, 제103권, 제73?77 페이지(1991)], 앰버 변이를 이용한 PCR에 의한 방법[국제 공개 WO98/02535호 공보] 등이 있다.

시판 키트를 사용하여, 부위 특이적인 변이를 용이하게 도입할 수도 있다. 시판 중인 키트로서, 예를 들면, 갭드 듀프렉스 방법을 이용한 Mutan(등록상표)-G(타카라주조 사제), 쿠켈법을 이용한 Mutan(등록상표)-K(타카라주조 사제), ODA법을 이용한 Mutan(등록상표)-ExpressKm(타카라주조 사제), 변이 도입용 프라이머와 피로코커스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus) 유래 DNA 폴리머라제를 이용한 QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit[스트라타진(STRATAGENE) 사제] 등을 사용할 수 있으며, 또한, PCR 방법을 이용하는 키트로서 TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit(타카라주조 사제), Mutan(등록상표)-Super Express Km(타카라주조 사제) 등을 사용할 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 따라 말토트리오실 전이효소의 1차 구조 및 유전자 구조가 제공됨으로써, 말토트리오실 전이효소 활성을 가진 단백질을 저렴한 비용으로 고순도로 유전공학적으로 제조 가능해진다.

(재조합 벡터)

본 발명의 새로운 측면은 본 발명의 말토트리오실 전이효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 명세서에서, 용어 「벡터」는 여기에 삽입된 핵산 분자를 세포 등의 타겟 내로 수송할 수 있는 핵산성 분자를 지칭하며, 그 종류나 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노수반 바이러스 벡터, RNA 종양 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 등)의 형태를 취할 수 있다.

사용 목적(클로닝, 단백질의 발현)에 따라, 또한, 숙주 세포의 종류를 고려하여, 적절한 벡터가 선택된다. 벡터에 대한 구체적인 예로는, 대장균을 숙주로 하는 벡터(M13 파지 또는 이의 변형체, λ 파지 또는 이의 변형체, pBR322 또는 이의 변형체(pB325, pAT153, pUC8 등) 등), 효모를 숙주로 하는 벡터(pYepSec1, pMFa, pYES2 등), 곤충 세포를 숙주로 하는 벡터(pAc, pVL 등), 포유류 세포를 숙주로 하는 벡터(pCDM8, pMT2PC 등) 등이 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이다. 「발현 벡터」란, 이에 삽입된 핵산을 목적 세포(숙주 세포) 내에 도입할 수 있고, 또한 상기 세포내에서 발현시킬 수 있는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 통상적으로 삽입된 핵산의 발현에 필요한 프로모터 서열이나 발현을 촉진시키는 인핸서 서열 등을 포함한다. 선택 마커를 포함하는 발현 벡터를 사용할 수도 있다. 이러한 발현 벡터를 사용한 경우, 선택 마커를 이용하여 발현 벡터의 도입의 유무(및 그 정도)를 확인할 수 있다.

본 발명의 유전자의 벡터에의 삽입, 선택 마커 유전자의 삽입(필요에 따라), 프로모터의 삽입(필요에 따라) 등은 표준적인 재조합 DNA 기술(예, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York를 참조할 수 있는, 제한 효소 및 DNA 리가제를 사용한 주지의 방법)을 사용하여 행할 수 있다.

(형질전환체)

또한, 본 발명은 본 발명의 유전자가 도입된 숙주 세포(형질전환체)에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환체에는 본 발명의 유전자가 외래성 분자로서 존재하게 된다. 본 발명의 형질전환체는, 바람직하게는, 상기 본 발명의 벡터를 이용한 형질감염 또는 형질전환에 의해 제조된다. 형질감염 또는 형질전환은 인산 칼슘 공침강법, 전기충격(Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984)), 리포펙션(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 7413-7417(1984)), 마이크로인젝션(Graessmann, M. & Graessmann, A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 366-370(1976)), Hanahan의 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983)), 아세트산 리튬 법(Schiestl, R.H. et al., Curr. Genet. 16, 339-346(1989)), 프로토플라스트-폴리에틸렌 글리콜법(Yelton, M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474(1984)) 등에 의해 실시할 수 있다.

숙주 세포는, 본 발명의 말토트리오실 전이효소가 발현되는 한 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtillus), 바실러스 라이케미포르미스(Bacillus likemiformis), 바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans) 등의 바실러스 속 세균, 락토코커스(Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 루코노스톡(Leuconostoc), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 등의 유산균, 에스케리치아(Escherichia), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 등의 그 외의 세균, 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 토룰라(Torula), 토룰롭시스(Torulopsis) 등의 효모, 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 트리코더마(Trichoderma) 속, 푸사리움(Fusarium) 속 등의 사상균(진균류) 등로부터 선택된다.

(말토트리오실 전이효소의 제조법)

본 발명의 추가적인 측면은 말토트리오실 전이효소의 제조법을 제공한다. 본 발명의 제조법의 일 태양에서는, 본 효소(말토트리오실 전이효소)의 생산능력을 가진 지오바실러스 속의 미생물을 배양하는 단계(단계 (1)) 및 배양 후의 배양액 및/또는 균체로부터 말토트리오실 전이효소를 회수하는 단계(단계 (2))가 수행된다.

단계 (1)에서, 지오바실러스 속 미생물은 본 효소의 생산능력을 가지고 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기의 지오바실러스 에스피-APC9669를 사용할 수 있다. 배양법과 배양 조건은 목적 효소가 생산되는 한 특별히 한정되지 않는다. 즉, 본 효소가 생산되는 것을 조건으로서, 사용하는 미생물의 배양에 적합한 방법이나 배양 조건을 적절하게 설정할 수 있다. 배양법은 액체 배양, 고체 배양 중 어느 한가지일 수 있지만, 바람직하게는 액체 배양이 이용된다. 액체 배양을 예를 들어 그 배양 조건을 설명한다.

배양 배지는 사용 미생물이 생육가능한 배양 배지라면, 임의의 배지를 사용할 수 있다. 예를 들면, 글루코스, 슈크로스, 겐티노오비오스, 가용성 전분, 글리세린, 덱스트린, 당밀, 유기산 등의 탄소원, 추가로, 황산 암모늄, 탄산 암모늄, 인산 암모늄, 아세트산 암모늄, 또는 펩톤, 효모 엑기스, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 밀기울(wheat bran), 육류 엑기스 등의 질소원, 추가로, 칼륨염, 마그네슘염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 철염, 아연 염 등의 무기염이 첨가된 것을 사용할 수 있다. 사용 미생물의 생육을 촉진하기 위해, 비타민, 아미노산 등을 배양 배지에 첨가할 수도 있다. 배양 배지의 pH는 예를 들면, 약 3?10, 바람직하게는 약 7?8 정도로 조정하고, 배양 온도는 통상 약 10?80℃, 바람직하게는 약 30?65℃ 정도로, 1?7일간, 바람직하게는 2?4일간, 호기 조건하에서 배양한다. 배양법은, 예컨대, 진탕 배양법, 용기-발효기(jar fermenter)에 의한 호기성 심부 배양법을 이용할 수 있다.

이상의 조건에서 배양한 후, 배양액 또는 균체로부터 말토트리오실 전이효소를 회수한다(단계 (2)). 배양액으로부터 회수하는 경우, 예를 들면, 배양상청을 여과, 원심 처리 등을 수행함으로써 불용물을 제거한 다음, 한외 여과막에 의한 농축, 황산 암모늄 침전 등의 염석, 투석, 이온 교환 수지 등의 각종 크로마토그래피 등을 적절하게 조합하여 분리 및 정제함으로써, 본 효소를 수득할 수 있다.

한편, 균체내에서 회수하는 경우, 예를 들면, 균체를 가압 처리, 초음파 처리 등에 의해 파쇄한 후, 상기와 동일하게 분리 및 정제함으로써, 본 효소를 수득할 수 있다. 그리고, 여과 및 원심 처리 등에 의해 미리 배양액으로부터 균체를 회수한 후, 상기 일련의 공정(균체의 파쇄, 분리, 정제)을 행할 수도 있다.

아울러, 발현의 확인이나 발현 산물의 확인은 말토트리오실 전이효소에 대한 항체를 사용하여 행하는 것이 편리하지만, 말토트리오실 전이효소 활성을 측정함으로써 발현의 확인을 행할 수도 있다.

본 발명의 다른 태양에서는, 상기의 형질전환체를 사용하여 말토트리오실 전이효소를 제조한다. 이러한 태양의 제조법에서는, 먼저, 여기에 도입된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 생산되는 조건하에서 상기의 형질전환체를 배양한다(단계 (i)). 다양한 벡터 숙주계에 대한 형질전환체의 배양 조건은 공지되어 있으며, 당업자이면 적절한 배양 조건을 용이하게 설정할 수 있다. 배양 단계에 이어, 생산된 단백질(즉, 말토트리오실 전이효소)을 회수한다(단계 (ii)). 회수 및 그 후의 정제는, 상기 태양의 경우와 동일하게 수행할 수 있다.

본 효소의 정제도는 특별히 한정되지 않는다. 또한, 최종 형태는 액체상 또는 고체상(분체상이 포함됨)일 수 있다.

(효소제)

본 발명의 효소는, 예컨대 효소제의 형태로 제공된다. 효소제는, 유효 성분(본 발명의 효소) 외에도, 부형제, 완충제, 현탁제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리 식염수 등을 포함할 수 있다. 부형제로서는 전분, 덱스트린, 말토오스, 트레할로스, 유당, D-글루코오스, 소르비톨, D-만니톨, 백당, 글리세롤 등을 사용할 수 있다. 완충제로서는 인산염, 구연산염, 아세트산염 등을 사용할 수 있다. 안정제로서는 프로필렌글리콜, 아스코르빈산 등을 사용할 수 있다. 보존제로서는 페놀, 염화 벤즈알코늄, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸파라벤 등을 사용할 수 있다. 방부제로서는 에탄올, 염화 벤즈알코늄, 파라옥시 벤조산, 클로로부탄올 등을 사용할 수 있다.

(말토트리오실 전이효소의 용도)

본 발명의 추가적인 측면은 말토트리오실 전이효소(본 효소)의 용도로서 식품의 제조 및 가공 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 및 가공 방법에서는 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 다당류 및/또는 올리고당류를 포함하는 식품 또는 식품 원료에, 본 효소를 적용시켜, 상기 식품의 기능성을 개선시킨다. 식품의 예로서는 빵, 쌀밥, 떡을 들 수 있다. 식품 원료의 예로서는 각종 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴, 말토올리고당을 포함하는 원료를 들 수가 있다. 원료의 순도는 특별히 한정되지 않으며, 다른 물질과 혼재된 상태의 원료에도 본 효소를 작용시킬 수 있다. 또한, 2종 이상의 원료에 대해서도 동시에 본 효소를 작용시킬 수 있다.

실시예

<말토트리오실 전이효소의 활성 측정 방법>

말토트리오실 전이효소의 활성은 하기와 같이 측정하였다.

즉, 1% 말토테트라오스(하야시바라 생물화학연구소 제품)를 포함하는 10 mmol/LMES 완충액(pH6.5) 2 mL에 효소 용액 0.5 mL을 첨가하여, 40℃에서 60분간 방치하였다. 방치 후, 비등수욕 중에서 5분간 가열한 후, 유수 중에 냉각하였다. 생성된 글루코오스를 글루코오스 CII-테스트 와코(와코순약제)로 정량하였다. 본 조건에서, 1분간 반응액 2.5 mL 중에 1 μmol의 글루코오스를 생성하는 효소량을 1단위로 하였다.

<말토트리오실 전이효소의 활성 확인 방법>

말토트리오실 전이효소의 활성은, 상기 <말토트리오실 전이효소의 활성 측정 방법>와 더불어, 하기와 같이 확인하였다. 즉, 10.3 mmol/L 말토테트라오스(하야시바라 생물화학연구소 제품)를 포함하는 5 mmol/L 아세트산 완충액(pH6.0) 985 ㎕에 1.0 u/mL 효소 용액 15 ㎕를 첨가하여, 50℃에서 1, 2, 3시간 방치하였다. 방치 후, 비등 수욕 중에서 5분간 가열한 후, 유수 중에 냉각하였다. 냉각한 반응액을 양이온 수지, 음이온 수지를 사용하여 적절히 탈염한 다음, HPLC에 의해 반응액을 분석하였다. HPLC 장치는 시마즈 제작소의 「Prominence UFLC」, 컬럼은 미쓰비시 화학의 「MCI GEL CK04S」, 용리액은 물을 유속 0.4 mL/분으로, 검출은 시차굴절계로 분석하였다. 수득되는 기질 및 생성물의 면적%를 몰량으로 환산하여, 소비 속도 및 생성 속도를 계산하였다. 정제된 말토트리오실 전이 효소의 경우, 예를 들면, 생성 속도 비가 7당:3당 = 약 92:약 8이 되었다.

1. 지오바실러스 에스피-APC9669 유래 말토트리오실 전이효소의 생산 및 정제

지오바실러스 에스피-APC9669를 표 1에 나타낸 조성의 액체 배양 배지를 사용하여 45℃에서 2일간 진탕 배양하였다. 얻어진 배양 상청액을 UF막(AIP-1013 D, 아사히화성 제품)에 의해 5배로 농축한 후, 50% 포화 농도가 되도록 황산 암모늄을 첨가하였다.

침전 분획을 5 mmol/L 염화 칼슘이 포함된 20 mmol/L 트리스 염산 완충액(pH8.0)에 다시 용해시킨 다음, 황산 암모늄을 최종 농도 0.5 mol/L로 첨가하였다. 생성된 침전을 원심분리에 의해 제거한 후, 0.5 mol/L 황산 암모늄 및 5 mmol/L 염화 칼슘이 포함된 20 mmol/L 트리스 염산 완충액(pH8.0)으로 평형화시킨 HiLoad 26/10 Phenyl Sepharose HP 컬럼(GE 헬스케어 제품)에 주입하여, 0.5 mol/L에서 0 mol/L의 황산 암모늄 직선 농도 구배에 의해, 흡착된 말토트리오실 전이효소 단백질을 용리시켰다.

	(w/v)
효모 엑기스	1.5%
대두 펩톤	0.5%
염화 나트륨	0.5%
가용성 전분	0.4%

모은 말토트리오실 전이효소 활성 분획을 UF 막으로 농축시킨 후, 5 mmol/L 염화 칼슘이 포함된 20 mmol/L 트리스 염산 완충액(pH8.0)으로 버퍼를 교환하였다. 버퍼 교환 샘플을 5 mmol/L 염화 칼슘이 포함된 20 mmol/L 트리스 염산 완충액(pH8.0)으로 평형화한 HiLoad 26/10 Q Sepharose HP 컬럼(GE 헬스케어 제품)에 제공하여, 0 mol/L -> 1 mol/L의 NaCl 직선 농도 구배에 의해, 흡착된 말토트리오실 전이효소 단백질을 용리시켰다.

또한, 모은 말토트리오실 전이효소 활성 분획을 UF 막에 의해 농축시킨 후, 0.15 M의 NaCl이 포함된 50 mM 인산 완충액(pH7.2)으로 버퍼를 교환하고, 0.15 M의 NaCl이 포함된 50 mM 인산 완충액(pH7.2)로 평형화한 HiLoad 26/60 Superdex 200 pg 컬럼(GE 헬스케어 제품)에 제공하여, 동일 완충액으로 용리시켰다. 말토트리오실 전이효소 활성 분획을 모아 한외 여과막으로 탈염 농축시켜, 정제 효소 샘플(標品)을 수득하였다. 수득한 본 정제 효소에 대해 다음과 같은 여러가지 성질을 검토하였다.

각 단계에서의 정제 결과를 표 2에 나타낸다. 최종 단계에서의 비활성(比活性)은 미정제 효소(粗酵素)에 비해 약 41배였다. 도 5에, 정제 공정의 각 단계 샘플을 10-20%의 농도 구배 겔에 의해 SDS-PAGE(CBB 염색)한 결과를 나타낸다. 본 정제 효소 샘플(레인 2)은 SDS-PAGE에서 단일한 단백질인 것으로 확인되었다.

	총 단백질량 (mg)	총 활성 (U)	비활성(u/mg)	회수율 (%)
농축액	42	300	3.9	100
황산 암모늄	8.5	220	22.9	73
페닐 HP	0.50	58	100	19
Q HP	0.37	53	139	18
Superdex 200	0.12	19	158	6.3

2. 말토트리오실 전이효소의 여러가지 성질

(1) 지적 반응 온도

상기 말토트리오실 전이효소의 활성 측정법에 준하여 반응 온도 30℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃ 및 75℃에서 반응시켰다. 최고 활성을 나타낸 온도에서의 값을 100%으로 두고, 상대 활성으로 표시한다. 지적 반응 온도는 50℃ 부근이었다(도 1).

(2) 지적 반응 pH

상기 말토트리오실 전이효소의 활성 측정법에 준하여, 각 완충액(유니버설 완충액 pH4.0, pH4.5, pH5.0, pH5.5, pH6.0, pH6.5, pH7.0, pH7.5, pH8.0, pH9.0, pH10.0, pH11.0) 중에서, 40℃, 60분간의 반응 조건하에서 측정하였다. 최대 활성 값을 나타낸 pH에서의 값을 100%으로 하여, 상대 활성을 표시한다. 지적 반응 pH는 약 7.5 부근이었다(도 2).

(3) 온도 안정성

6 u/mL의 효소액을 30℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃ 및 75℃의 각 온도 하에, 10 mmol/LMES 완충액(pH6.5) 중에서 30분간 열처리한 후, 잔존 활성을 상기 말토트리오실 전이효소의 활성 측정법에 의해 측정하였다. 열 처리되지 않은 경우의 활성을 100%으로 하여, 잔존 활성을 표시한다. 65℃에서 30분간의 열처리시 90% 이상의 잔존 활성을 가지고 있었으며, 65℃까지 안정적이었다(도 3).

(4) pH 안정성

6 u/mL의 효소액을, 각 완충액(유니버설 완충액 pH3.0, pH4.0, pH4.5, pH5.0, pH5.5, pH6.0, pH6.5, pH7.0, pH7.5, pH8.0, pH9.0, pH10.0, pH11.0) 중에서 40℃에서 30분간 처리한 후, 상기 말토트리오실 전이효소의 활성 측정법에 의해 활성을 측정하였다. pH5.0 - pH10.0의 범위에서, 85% 이상의 잔존 활성을 가지고 있었으며, pH5.0 - pH10.0의 범위에서 안정적이었다(도 4).

(5) SDS-PAGE에 의한 분자량 측정

SDS-PAGE는 Laemmli 등의 방법에 따라 행하였다. 그리고, 사용한 분자량 마커는, 전기영동용 저분자량 캘리브레이션 키트(GE 헬스케어 제품)이며, 표준 단백질로서 포스포릴라제 b(97,000 Da), 알부민(66,000 Da), 오발부민(45,000 Da), 카본 안하이드라제(30,000 Da), 트립신 저해제(20,100 Da), α-락트알부민(14,400 Da)이 포함되어 있었다. 겔 농도 10-20%의 농도구배 겔(와코순약 제품)을 사용하여, 20 mA/겔로 약 80분간 전기영동하였고, 분자량을 측정한 결과 분자량은 약 83 kDa이었다(도 5).

(6) 등전점

암포라인을 이용한 등전점 포커싱(600 V, 4℃, 48시간동안 전류를 흘려줌)에 의해 측정한 결과, 본 효소의 등전점은 약 4.5이었다.

(7) 기질 특이성

각 기질에 대한 말토트리오실 전이효소 활성을 조사하였다.

a) 말토올리고당에 대한 기질 특이성

말토올리고당류에 대해 이하의 방법으로 기질 특이성을 조사하였다. 10 mmol/L의 각 말토올리고당에 대해 0.002 u/mL이 되도록 효소를 첨가하여, 50℃에서 1, 2, 3시간 방치하였다. 방치 후, 비등 수욕 중에서 5분간 가열한 후, 유수 중에서 냉각시켰다. 냉각시킨 반응액을 양이온 수지, 음이온 수지를 사용하여 적절히 탈염하고, HPLC에 의해 반응액을 분석하였다. HPLC 장치는 시마즈 제작소 제품 「Prominence UFLC」을 사용하고, 컬럼은 미쓰비시화학 제품 「MCI GEL CK04S」을 사용하고, 용리액은 물을 유속 0.4 mL/분으로 수행하고, 검출은 시차굴절계로 분석하였다. 수득되는 기질 및 생성물의 면적%를 몰량으로 환산하여, 소비 속도 및 생성 속도를 산출하였다. 각 말토올리고당에 대한 반응 속도는 다음과 같이 산출하였다. 말토테트라오스에 대한 속도는, 7당 생성 속도와 3당 생성 속도의 합으로 하였다. 말토펜타오스에 대한 속도는, 8당 생성 속도와 3당 생성 속도의 합으로 하였다. 말토헥사오스에 대한 속도는, 3당 생성 속도와 9당 생성 속도의 차이의 1/2로 구한 다음 그 값과 9당 생성 속도의 합으로 하였다.

기질	상대 속도 (%)
말토스	0
말토올리고당	0
말토테트라오스	83
말토펜타오스	100
말토헥사오스	89

말토오스, 말토트리오스에 대해서는 반응 생성물이 확인되지 않았다. 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스에 대해서는 잘 작용하였다.

b) 다당류에 대한 기질 특이성

사이클로덱스트린, 가용성 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴에 대해, 하기 방법으로 기질 특이성을 조사하였다. 10 mmol/L의 각 말토올리고당에 대해 효소를 0.002 u/mL이 되도록 첨가하고, 0.1 u/mL의 효소를 50℃에서 0, 1, 2, 3시간 방치하였다. 방치 후, 비등 수욕 중에서 5분간 가열한 후, 유수 중에서 냉각시켰다. 이 용액 200 ㎕에, 리조푸스 유래 글루코아밀라제(와코순약)를 1.0단위 0.03 mg이 되도록 첨가하여, 50℃에서 하룻밤 정치하였다. 정치 후, 비등 수욕 중에서 5분간 가열한 후, 유수 중에서 냉각시켰다. 냉각된 반응액을 양이온 수지, 음이온 수지를 사용하여 적절히 탈염시키고, HPLC에 의해 반응액을 분석하였다. HPLC 장치 시마즈 제작소 제품 「Prominence UFLC」, 컬럼 미쓰비시 화학 제품 「MCI GEL CK04S」을 사용하고, 용리액으로 물을 유속 0.4 mL/분으로 사용하여, 검출을 시차굴절계로 분석하였다. 효소(말토트리오실 전이효소) 처리군을 무처리군과 비교하면, 3당 이상의 피크에서 경시적인 증가가 인정되는 경우에는 생성물 있음(＋), 증가가 인정되지 않는 경우에는 생성물 없음(-)으로 판정하였다.

기질	생성물의 유무
α-사이클로덱스트린	-
β-사이클로덱스트린	-
γ-사이클로덱스트린	-
아밀로스	+
아밀로펙틴	+
가용성 전분	+

사이클로덱스트린에 대해서는 반응 생성물이 인정되지 않았다. 가용성 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴에 대해서는 3당 이상의 피크로 경시적인 증가가 인정되었다. 이들 다당류가 기질로 작용한다는 것이 확인되었다. 글루코아밀라제는 α-1,4 결합, α-1,6 결합을 가수분해할 뿐만 아니라, 이러한 결합 양식 이외에도 당전이 생성물을 생성시키는 것으로 확인되었다.

(8) 기질 농도가 효소 반응 생성물에 미치는 영향

기질 농도가 효소 반응 생성물에 미치는 영향에 대해, 말토테트라오스를 기질로 사용하여 조사하였다. 0.67, 1.0, 3.0, 10, 30, 70%(w/v)의 말토테트라오스에, 3시간 반응 이후의 말토테트라오스 잔존량이 85% 이상으로 되도록 효소를 첨가하여, 50℃에서 1, 2, 3시간 방치하였다. 방치 후, 비등 수욕 중에서 5분간 가열한 후, 유수 중에서 냉각시켰다. 냉각된 반응액을 양이온 수지, 음이온 수지를 사용하여 적절히 탈염화한 다음, HPLC에 의해 반응액을 분석하였다. HPLC 장치는 시마즈 제작소 제품 「Prominence UFLC」을, 컬럼은 미쓰비시 화학 제품 「MCI GEL CK04S」을 사용하고, 용리액으로 물을 유속 0.4 mL/분으로 사용하고, 검출은 시차굴절계로 분석하였다. 수득되는 기질 및 생성물의 면적%를 몰량으로 환산하여, 생성 속도를 산출하였다. 그 결과, 모든 기질 농도 조건에서(0.67?70%(w/v))의 당전이 반응성은 90% 이상이었다.

기질 농도 (% w/v)	반응 생성 속도(몰비)
기질 농도 (% w/v)	전이 생성물(7당류)	분해 생성물(3당류)
0.67	92%	8%
1.0	96%	4%
3.0	100%	0%
10	100%	0%
30	100%	0%
70	100%	0%

3. 빵의 제조

말토트리오실 전이효소를 빵 반죽에 첨가하여 빵을 제조하였다. 야마가타(山形) 빵용 기본 재료(강력분 260 g; 설탕 13 g; 식염 5.2 g; 쇼트닝 10.4 g; L-아스코르빈산 0.013 g; 냉수 192 g; 드라이 이스트 3.1 g) 또는 이 재료에 말토트리오실 전이효소 120 U를 첨가한 것을, 내셔널 자동홈베이커리 SD-BT150(마쓰시타 산업 주식회사 파나소닉제)에 넣었다. 소성 후, 빵을 26℃에서 1시간 방랭시킨 다음, 수분 증발 방지를 위해 비닐 봉투에 넣어 26℃에서 보존하였다. 1 또는 5일간 보존한 후, 빵을 2 cm의 두께로 자르고, 빵의 중앙부를 직경 47 mm의 원기둥형으로 잘랐다. 빵의 경도를, FUDOH rheometer NRM-2002 J(선과학레오텍 제품)를 사용하여, 압축 스피드 2 mm/분으로 1.5 cm 압축한 경우의 최대 하중을 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다. 효소 무첨가군과 효소 첨가군에 대해, 각각 1일 저장시의 빵의 경도를 100%으로 설정하여, 5일 저장시의 빵의 경도를 비교하였다. 그 결과, 효소 첨가군은 125%로, 무첨가군(207%)에 비해 빵의 경화가 억제되어 부드러움이 유지되고 있었다.

4. 취사

쌀 75 g을 수세한 후 물 150 mL을 첨가한 것 또는 재료에 말토트리오실 전이효소 40 U를 첨가한 것을 2시간 실온에서 정치한 후, 통상 정해진 방법으로 취사하여 밥을 지었다. 취사한 밥을 4℃에서 7일간 보존하였다. 보존 전후의 호화도를 BAP 방법으로 측정하였다. BAP 방법에 따른 호화도는, 효소 첨가군의 경우 취사 직후 96.6%였고, 7일 후에는 69.5%였다(표 6). 그에 비해, 무첨가군은 취사 직후 95.3%였고, 7일 후에는 59.7%였다. 효소 첨가군의 경우에는 호화도의 저하가 억제되어, 즉 전분의 노화 진행이 억제되었다.

	호화도
	1일 후	7일 후
효소 첨가군	96.6%	69.5%
무첨가군	95.3%	59.7%

5. 떡의 제조

멥쌀가루 200 g에 물 165 g을 가하여 혼합하고, 수증기로 15분간 쪘다. 이어서, 찐 것을 믹서(키친에이드 KSM5(에프?엠?아이 제품))에 넣어 교반하면서 반죽이 약 65℃가 되었을 때, 효소 첨가군에는 말토트리오실 전이효소 30 u를 첨가 및 혼합한 후, 플라스틱으로 제조된 샬레에 충전하여 성형한 다음, 방랭하에 15℃에서 보존하였다. 24시간 보존한 후, 떡을 10 mm의 두께로 자르고, 떡의 중앙부를 직경 25 mm의 원기둥형으로 틀에서 잘라내었다. 떡의 경도는, FUDOH 레오 미터 NRM-2002 J(레오텍 제품)를 사용하여, 압축 스피드 2 mm/분으로 5 mm 압축한 경우의 최대 하중을 측정하였다. 효소 무첨가군을 24시간 보존하였을 때의 떡의 경도를 100%로 두고, 떡의 경도를 비교하였다. 또한, 떡의 끈적거림도 확인하였다. 그 결과, 효소 첨가군은 35%로, 떡의 경화가 억제되었고, 부드러움이 유지되었다(표 7). 또한, 떡의 끈적거림도 없었다.

	경도	끈적거림
효소 첨가군	35%	없음
무첨가군	100%	없음

6. 지오바실러스 에스피-APC9669 유래의 말토트리오실 전이효소를 코딩하는 유전자 단편의 취득

(a) 염색체 DNA의 분리

지오바실러스 에스피-APC9669의 균체로부터 사이토?미우라의 방법(비특허문헌 5)에 따라 염색체 DNA를 준비하였다.

(b) 부분 아미노산 서열의 결정

1.에서 수득한 말토트리오실 전이효소의 정제표품을 아미노산 서열 분석하여, 10개의 잔기의 N 말단 아미노산 서열(서열번호 1) 및 내부 펩티드 아미노산 서열(서열번호 2, 3)을 결정하였다.

(c) PCR에 의한 DNA 프로브의 제작

N 말단 아미노산 서열 및 내부 아미노산 서열을 기초로 2종의 혼합 올리고 뉴클레오티드(서열번호 4, 5)를 합성하고, PCR 프라이머로 사용하였다. 이들 프라이머를 사용하여, 지오바실러스 에스피-APC9669의 염색체 DNA를 주형으로, 이하의 조건에 의해 PCR 반응을 행하였다.

10x PCR 반응 완충액(TaKaRa) 5.0 ㎕

dNTP 혼합액(각각 2.5 mM, TaKaRa) 8.0 ㎕

25 mM MgCl₂ 5.0 ㎕

50 μM 센스 프라이머 0.5 ㎕

50 μM 안티센스 프라이머 0.5 ㎕

증류수 29.5 ㎕

염색체 DNA 용액(100 ㎍/ml) 1.0 ㎕

LA Taq DNA 폴리머라제(TaKaRa) 0.5 ㎕

스테이지 1: 변성(95℃, 5분) 1 사이클

스테이지 2: 변성(95℃, 1분) 30 사이클

어닐링(50℃, 1분)

신장(72℃, 1분)

스테이지 3: 신장(72℃, 10분) 1 사이클

얻어진 약 1.1 kb의 DNA 단편을 pGEM-Teasy(Promega)에 클로닝한 후, 염기 서열을 확인한 바, 센스 프라이머의 바로 뒤와 안티센스 프라이머의 바로 앞부분에서, 상기의 부분 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 확인하였다. 본 DNA 단편을 전체 길이 유전자 클로닝을 위한 DNA 프로브로 사용하였다.

(d) 유전자 라이브러리의 제작

지오바실러스 에스피-APC9669의 염색체 DNA의 서든 혼성화 분석을 실시한 결과, EcoRI 분해물에서 프로브 DNA와 혼성화하는 약 5.2 kb의 싱글 밴드가 확인되었다. 약 5.2 kb의 EcoRI DNA 단편을 클로닝하기 위해, 하기와 같이 유전자 라이브러리를 제작하였다. 상기 (a)에서 준비한 염색체 DNA에 EcoRI 처리를 실시하였다. 염색체 DNA 50 ㎍, 10x H 완충액 40 ㎕, 증류수 342.0 ㎕ 및 EcoRI 8.0 ㎕를 혼합하여, 37℃에서 15시간동안 처리하였다. 얻어진 분해물을 EcoRI으로 처리된 pBluescript II KS+벡터(Stratagene)에 라이게이션하여, 유전자 라이브러리를 제작하였다.

(e) 유전자 라이브러리의 스크리닝

상기 (c)에서 수득한 1.1 kb의 DNA 단편을 DIG-High Prime(Roche)을 사용하여 표지하였다. 이를 DNA 프로브로 사용하여, (d)에서 제작한 유전자 라이브러리에서 콜로니 혼성화에 의해 스크리닝을 수행하였다. 수득한 포지티브 콜로니로부터 플라스미드 pBlue-SAS를 입수하였다.

(f) 염기 서열의 결정

플라스미드 pBlue-SAS의 염기 서열을 통상의 정해진 방법에 따라 결정하였다. 지오바실러스 에스피-APC9669 유래 말토트리오실 전이효소를 코딩하는 염기 서열(2304 bp)을 서열번호 6에 나타낸다. 또한, 서열번호 6에 의해 코딩되는 아미노산 서열(767 아미노산)을 서열번호 7에 나타낸다. 이 아미노산 서열에서, (b)에서 결정된 N 말단 영역 아미노산 서열(서열번호 1)과 내부 아미노산 서열(서열번호 2, 3)이 발견되었다. 그리고, 서열번호 7의 아미노산 서열에서 시그널 펩티드를 제외시킨 아미노산 서열을 서열번호 8에 나타낸다.

7. 지오바실러스 에스피-APC9669 유래의 말토트리오실 전이효소의 대장균에서의 발현

(a) 말토트리오실 전이효소의 대장균 발현용 플라스미드의 구축

N 말단 영역 아미노산 서열 및 C 말단 영역 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 기초로, 2종의 올리고 뉴클레오티드(서열번호 9, 10)를 합성하여, PCR 프라이머로 사용하였다. 센스 프라이머에는 SacI 제한 효소 인지 부위를, 안티센스 프라이머에는 XbaI 제한 효소 인지 부위를 첨가하였다. 이들 프라이머와 말토트리오실 전이효소 유전자를 포함한 염색체 DNA를 주형으로 사용하여, 이하의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다.

10x PCR 반응 완충액(TOYOBO) 5.0 ㎕

dNTP 혼합액(각각 2.5 mM, TOYOBO) 5.0 ㎕

10 μM 센스 프라이머 1.5 ㎕

10 μM 안티센스 프라이머 1.5 ㎕

25 mM MgSO₄ 2.0 ㎕

증류수 33.0 ㎕

염색체 DNA 용액(200 ㎍/ml) 1.0 ㎕

KOD-Plus-DNA 폴리머라제(TOYOBO) 1.0 ㎕

스테이지 1: 변성(94℃, 2분) 1 사이클

스테이지 2: 변성(94℃, 15초) 30 사이클

어닐링(50℃, 30초)

신장(68℃, 2분 30초)

얻어진 PCR 산물을 전기 영동으로 확인한 후, 에탄올 침전에 의해 탈염(84 ㎕)시켰다. 이어, 10 ㎕의 10x M 완충액, SacI 3 ㎕ 및 XbaI 3 ㎕를 가하여, 37℃에서 15시간동안 효소 처리하였다. 제한 효소 처리액을 전기 영동으로 확인한 다음, Nucleo Spin ExtractII(일본 유전학사)로 정제하여, 미리 SacI와 XbaI로 처리한 벡터 pColdII DNA(다카라 바이오사)에 라이게이션하여, 발현 플라스미드 pColdII-SAS를 제작하였다.

(b) 말토트리오실 전이효소의 대장균에서의 발현

발현 플라스미드 pColdII-SAS를 대장균 JM109 컴피턴트 세포(다카라 바이오사)에 도입하였다. 암피실린 내성주로서 선별된 형질전환체들 중에서, 콜로니 PCR에 의해 목적한 말토트리오실 전이효소 유전자가 삽입된 pColdII-SAS를 가지고 있는 균주를 선별하였다. 또한, 대조군으로서 발현 벡터 pColdII DNA를 가지는 대장균 JM109의 형질전환체도 입수하였다. 이들 형질전환체를 100 ㎍/ml의 암피실린이 함유된 LB 배양 배지 1 ml에 접종하여, 37℃에서 170 rpm으로 O.D600 = 0.4-1.0에 도달할 때까지 배양하였다(전 배양). 이어, 전 배양액 300 ㎕를 100 ㎍/ml의 암피실린이 함유된 LB 배양 배지 9 ml에 접종하여, 37℃에서 170 rpm으로 O.D600 = 0.4-1.0에 도달할 때까지 배양하였다. 이를 15℃에서 30분간 방치한 후, 0.1 M IPTG 9 ㎕를 첨가하여 15℃에서 160 rpm으로 24시간 배양(본 배양)하여, 집균하였다. 균체를 1.0 ml의 100 mM 트리스 염산 완충액(pH 6.5)에 현탁하고, Ø0.1 mm의 유리 비즈 0.50 g을 첨가하여, 멀티비즈쇼커(야스이기계)를 이용하여 균체를 파쇄하였다. 파쇄 조건은, ON 120초, OFF 60초를 3.75회 사이클 반복하는 것이다. 수득한 무세포-추출물(Cell free-extract)을 원심분리하여, 가용성 성분을 수득하였다.

(c) 말토트리오실 전이효소의 발현 확인

취득한 가용성 성분을 SDS-PAGE를 실시하였다. 전기 영동 장치로서 Phast System(GE Healthcare)를, 분리 겔로서 Phast Gel Homogeneous 7.5(GE Healthcare)를 사용하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, pColdII-SAS에서는 83 kDa 부근에 말토트리오실 전이효소로 여겨지는 유의한 단백질의 생산이 확인되었다. 대조군인 pColdII DNA에서는, 동일한 단백질의 생산은 확인되지 않았으므로, 본 단백질은 말토트리오실 전이효소 유전자의 도입에 인한 것으로 생각되었다(도 7).

또한, 동일 샘플에 대하여 상기 말토트리오실 전이효소의 활성 측정법에 준하여 활성을 측정한 결과를 아래 표 8에 나타낸다.

	활성(U/ml)	단백질량(mg/ml)	비활성(U/mg)
pColdII-SAS	44.36	0.515	86.1
pColdII	0.02	0.875	0.02

대조군과 비교하여, 명확한 말토트리오실 전이효소 활성이 검출되었고, 목적한 말토트리오실 전이효소의 발현이 확인되었다.

본 발명의 말토트리오실 전이효소는 내열성이 우수하여, 고온에서의 반응이 요구되는 용도에 매우 적합하다. 본 발명의 말토트리오실 전이효소를 이용하면, 잡균 오염될 우려가 낮은 고온에서 효소 반응을 실시할 수 있다. 또한, 전분 함유 식품에 작용시켰을 경우, 전분의 노화를 억제하는 효과가 인정되었다. 따라서, 본 발명의 말토트리오실 전이효소는 식품 가공 등의 용도에 특히 유용하다.

본 발명은, 상기 발명의 실시형태 및 실시예의 설명에 전혀 한정되지 않는다. 특허청구범위의 내용으로부터 벗어나지 않으면서, 당업자가 용이하게 도달할 수 있는 범위내에서의 여러가지 변형 태양도 본 발명에 포함된다. 본 명세서에 명시된 논문, 공개 특허 공보 및 특허 공보 등의 내용은, 그 전체 내용이 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

독립 행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터(NPMD)

NITEBP770

20090602

SEQUENCE LISTING <110> AMANO ENZYME INC. OKADA, Masamichi YAMAGUCHI, Shotaro NAGAYA, Miho <120> MALTOTRIOSYL TRANSFERASE DERIVED FROM GEOBACILLUS SP. APC9669 <130> AE09006P <150> JP P2009-156569 <151> 2009-07-01 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Geobacillus sp. <400> 1 Thr Thr Ser Thr Gly Ala Leu Gly Pro Val 1 5 10 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Geobacillus sp. <400> 2 His Phe Gly Thr Met Lys 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Geobacillus sp. <400> 3 Arg Gln Phe Tyr Asp Lys 1 5 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> y is c or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> y is c or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> r is a or g <400> 4 cayttyggna cnatgaar 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> y is c or t <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> r is a or g <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> r is a or g <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> r is a or g <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> y is c or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> y is c or t <400> 5 yttrtcrtar aaytgyct 18 <210> 6 <211> 2304 <212> DNA <213> Geobacillus sp. <400> 6 atgtggaagg ttccaaaatt cattaaacaa tcatatctcg tttttcttct tgctctattg 60 ctctattctt catttggttt ttcgttttcc aggactgagg cgactacatc tacaggagct 120 ttaggaccag ttaccccgaa agacacaata tatcagatcg tgacggaccg tttttttgat 180 ggcgacccat caaataacaa gcctcctggt tttgatccta ccctgtttga tgatccggac 240 ggcaataacc aggggaacgg aaaagattta aagttgtatc aaggcggtga tttccaagga 300 atcatagata aaattcctta tttaaaaaat atggggataa ctgccgtttg gatttccgct 360 ccttatgaaa atagggacac tgtgatagaa gattatcaat cagatggaag tattaatcgt 420 tggaccagtt tccacggtta ccatgcaaga aattattttg caactaacaa acattttggt 480 actatgaaag attttattag actacgcgat gctttgcatc aaaatggaat taaactagtg 540 atagattttg tatccaatca ttcgagtcgt tggcaaaacc cgacattgaa ttttgcgcct 600 gaagatggta aattatatga acctgacaag gatgcgaatg gcaattacgt atttgatgct 660 aatggagagc ctgcggatta caacggtgat ggaaaagttg agaatctcct ggcggatcca 720 cataacgacg tgaatggttt tttccatggt ctgggtgacc ggggcaacga tacttctcgt 780 tttggctacc gttacaaaga tctaggttct ttggctgatt attctcagga aaatgcacta 840 gtggttgaac atttggagaa agcagctaaa ttttggaaat caaaagggat cgatggtttt 900 cgacatgatg ccactttgca tatgaatcct gcatttgtga agggatttaa agatgcaatt 960 gattcagatg caggtggccc ggttacccat tttggtgaat ttttcattgg aagaccggat 1020 cccaagtatg atgagtaccg gacatttcct gaacgaacag gagtcaacaa cttggatttt 1080 gaatatttcc gtgcggccac aaacgcattt gggaactttt ctgaaacgat gagttccttt 1140 ggtgatatga tgatcaagac aagtaatgat tacatttatg aaaatcaaac agttactttc 1200 ttggataatc atgatgtaac aagatttcgc tatattcaac caaacgataa accttatcat 1260 gcagctctcg ctgtcttgat gacatcacgt gggattccta acatttatta cggaacagag 1320 caatatctga tgccgtcaga ctcaagtgac attgcgggtc ggatgtttat gcagacttct 1380 actaacttcg atgaaaatac cactgcatat aaagtcattc aaaagctttc aaacttaaga 1440 aaaaataatg aagctattgc ctatggaacc acagaaattt tatacagcac aaatgatgta 1500 ctggtcttta aaagacagtt ctatgataaa caagtaattg tagcggtaaa ccgacaaccg 1560 gatcaaacgt ttaccattcc ggagttagat acgactcttc cagtaggaac ctatagtgat 1620 gtactgggtg gactgttata tgggagttca atgagcgtaa ataatgtcaa cggtcaaaac 1680 aaaatttcta gctttacctt gtctggagga gaggtcaatg tctggtcgta taacccatca 1740 ttggggactt taactccaag gattggcgac gttatttcca ccatgggacg tcccggtaat 1800 accgtttaca tttacggtac tggattagga ggaagcgtaa cagtcaaatt cggttctact 1860 gttgctactg tggtgtcaaa cagcgatcaa atgattgagg ctatagttcc aaacactaat 1920 cctggaattc aaaatattac agttacaaaa ggatctgtaa ccagtgatcc tttccgatat 1980 gaggtcctat ccggcgatca ggtgcaagta atttttcatg tgaatgccac aacgaattgg 2040 ggggaaaaca tttatgttgt cggaaacatt ccagagttgg gaagctggga tccgaaccaa 2100 tcgtctgagg cgatgttaaa tccgaactat ccagaatggt tcttgccagt gagtgtgccc 2160 aagggagcta cttttgaatt caagtttatc aaaaaagata acaatggaaa tgtcatttgg 2220 gaaagcagga gcaacagagt atttaccgca ccgaacagtt cgaccggtac tattgacacc 2280 cctttatatt tttgggataa ctaa 2304 <210> 7 <211> 767 <212> PRT <213> Geobacillus sp. <400> 7 Met Trp Lys Val Pro Lys Phe Ile Lys Gln Ser Tyr Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Leu Tyr Ser Ser Phe Gly Phe Ser Phe Ser Arg Thr 20 25 30 Glu Ala Thr Thr Ser Thr Gly Ala Leu Gly Pro Val Thr Pro Lys Asp 35 40 45 Thr Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Phe Asp Gly Asp Pro Ser 50 55 60 Asn Asn Lys Pro Pro Gly Phe Asp Pro Thr Leu Phe Asp Asp Pro Asp 65 70 75 80 Gly Asn Asn Gln Gly Asn Gly Lys Asp Leu Lys Leu Tyr Gln Gly Gly 85 90 95 Asp Phe Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Pro Tyr Leu Lys Asn Met Gly 100 105 110 Ile Thr Ala Val Trp Ile Ser Ala Pro Tyr Glu Asn Arg Asp Thr Val 115 120 125 Ile Glu Asp Tyr Gln Ser Asp Gly Ser Ile Asn Arg Trp Thr Ser Phe 130 135 140 His Gly Tyr His Ala Arg Asn Tyr Phe Ala Thr Asn Lys His Phe Gly 145 150 155 160 Thr Met Lys Asp Phe Ile Arg Leu Arg Asp Ala Leu His Gln Asn Gly 165 170 175 Ile Lys Leu Val Ile Asp Phe Val Ser Asn His Ser Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Asn Pro Thr Leu Asn Phe Ala Pro Glu Asp Gly Lys Leu Tyr Glu Pro 195 200 205 Asp Lys Asp Ala Asn Gly Asn Tyr Val Phe Asp Ala Asn Gly Glu Pro 210 215 220 Ala Asp Tyr Asn Gly Asp Gly Lys Val Glu Asn Leu Leu Ala Asp Pro 225 230 235 240 His Asn Asp Val Asn Gly Phe Phe His Gly Leu Gly Asp Arg Gly Asn 245 250 255 Asp Thr Ser Arg Phe Gly Tyr Arg Tyr Lys Asp Leu Gly Ser Leu Ala 260 265 270 Asp Tyr Ser Gln Glu Asn Ala Leu Val Val Glu His Leu Glu Lys Ala 275 280 285 Ala Lys Phe Trp Lys Ser Lys Gly Ile Asp Gly Phe Arg His Asp Ala 290 295 300 Thr Leu His Met Asn Pro Ala Phe Val Lys Gly Phe Lys Asp Ala Ile 305 310 315 320 Asp Ser Asp Ala Gly Gly Pro Val Thr His Phe Gly Glu Phe Phe Ile 325 330 335 Gly Arg Pro Asp Pro Lys Tyr Asp Glu Tyr Arg Thr Phe Pro Glu Arg 340 345 350 Thr Gly Val Asn Asn Leu Asp Phe Glu Tyr Phe Arg Ala Ala Thr Asn 355 360 365 Ala Phe Gly Asn Phe Ser Glu Thr Met Ser Ser Phe Gly Asp Met Met 370 375 380 Ile Lys Thr Ser Asn Asp Tyr Ile Tyr Glu Asn Gln Thr Val Thr Phe 385 390 395 400 Leu Asp Asn His Asp Val Thr Arg Phe Arg Tyr Ile Gln Pro Asn Asp 405 410 415 Lys Pro Tyr His Ala Ala Leu Ala Val Leu Met Thr Ser Arg Gly Ile 420 425 430 Pro Asn Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Leu Met Pro Ser Asp Ser 435 440 445 Ser Asp Ile Ala Gly Arg Met Phe Met Gln Thr Ser Thr Asn Phe Asp 450 455 460 Glu Asn Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Lys Leu Ser Asn Leu Arg 465 470 475 480 Lys Asn Asn Glu Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Glu Ile Leu Tyr Ser 485 490 495 Thr Asn Asp Val Leu Val Phe Lys Arg Gln Phe Tyr Asp Lys Gln Val 500 505 510 Ile Val Ala Val Asn Arg Gln Pro Asp Gln Thr Phe Thr Ile Pro Glu 515 520 525 Leu Asp Thr Thr Leu Pro Val Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Gly Gly 530 535 540 Leu Leu Tyr Gly Ser Ser Met Ser Val Asn Asn Val Asn Gly Gln Asn 545 550 555 560 Lys Ile Ser Ser Phe Thr Leu Ser Gly Gly Glu Val Asn Val Trp Ser 565 570 575 Tyr Asn Pro Ser Leu Gly Thr Leu Thr Pro Arg Ile Gly Asp Val Ile 580 585 590 Ser Thr Met Gly Arg Pro Gly Asn Thr Val Tyr Ile Tyr Gly Thr Gly 595 600 605 Leu Gly Gly Ser Val Thr Val Lys Phe Gly Ser Thr Val Ala Thr Val 610 615 620 Val Ser Asn Ser Asp Gln Met Ile Glu Ala Ile Val Pro Asn Thr Asn 625 630 635 640 Pro Gly Ile Gln Asn Ile Thr Val Thr Lys Gly Ser Val Thr Ser Asp 645 650 655 Pro Phe Arg Tyr Glu Val Leu Ser Gly Asp Gln Val Gln Val Ile Phe 660 665 670 His Val Asn Ala Thr Thr Asn Trp Gly Glu Asn Ile Tyr Val Val Gly 675 680 685 Asn Ile Pro Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Gln Ser Ser Glu Ala 690 695 700 Met Leu Asn Pro Asn Tyr Pro Glu Trp Phe Leu Pro Val Ser Val Pro 705 710 715 720 Lys Gly Ala Thr Phe Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Asn Asn Gly 725 730 735 Asn Val Ile Trp Glu Ser Arg Ser Asn Arg Val Phe Thr Ala Pro Asn 740 745 750 Ser Ser Thr Gly Thr Ile Asp Thr Pro Leu Tyr Phe Trp Asp Asn 755 760 765 <210> 8 <211> 733 <212> PRT <213> Geobacillus sp. <400> 8 Thr Thr Ser Thr Gly Ala Leu Gly Pro Val Thr Pro Lys Asp Thr Ile 1 5 10 15 Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Phe Asp Gly Asp Pro Ser Asn Asn 20 25 30 Lys Pro Pro Gly Phe Asp Pro Thr Leu Phe Asp Asp Pro Asp Gly Asn 35 40 45 Asn Gln Gly Asn Gly Lys Asp Leu Lys Leu Tyr Gln Gly Gly Asp Phe 50 55 60 Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Pro Tyr Leu Lys Asn Met Gly Ile Thr 65 70 75 80 Ala Val Trp Ile Ser Ala Pro Tyr Glu Asn Arg Asp Thr Val Ile Glu 85 90 95 Asp Tyr Gln Ser Asp Gly Ser Ile Asn Arg Trp Thr Ser Phe His Gly 100 105 110 Tyr His Ala Arg Asn Tyr Phe Ala Thr Asn Lys His Phe Gly Thr Met 115 120 125 Lys Asp Phe Ile Arg Leu Arg Asp Ala Leu His Gln Asn Gly Ile Lys 130 135 140 Leu Val Ile Asp Phe Val Ser Asn His Ser Ser Arg Trp Gln Asn Pro 145 150 155 160 Thr Leu Asn Phe Ala Pro Glu Asp Gly Lys Leu Tyr Glu Pro Asp Lys 165 170 175 Asp Ala Asn Gly Asn Tyr Val Phe Asp Ala Asn Gly Glu Pro Ala Asp 180 185 190 Tyr Asn Gly Asp Gly Lys Val Glu Asn Leu Leu Ala Asp Pro His Asn 195 200 205 Asp Val Asn Gly Phe Phe His Gly Leu Gly Asp Arg Gly Asn Asp Thr 210 215 220 Ser Arg Phe Gly Tyr Arg Tyr Lys Asp Leu Gly Ser Leu Ala Asp Tyr 225 230 235 240 Ser Gln Glu Asn Ala Leu Val Val Glu His Leu Glu Lys Ala Ala Lys 245 250 255 Phe Trp Lys Ser Lys Gly Ile Asp Gly Phe Arg His Asp Ala Thr Leu 260 265 270 His Met Asn Pro Ala Phe Val Lys Gly Phe Lys Asp Ala Ile Asp Ser 275 280 285 Asp Ala Gly Gly Pro Val Thr His Phe Gly Glu Phe Phe Ile Gly Arg 290 295 300 Pro Asp Pro Lys Tyr Asp Glu Tyr Arg Thr Phe Pro Glu Arg Thr Gly 305 310 315 320 Val Asn Asn Leu Asp Phe Glu Tyr Phe Arg Ala Ala Thr Asn Ala Phe 325 330 335 Gly Asn Phe Ser Glu Thr Met Ser Ser Phe Gly Asp Met Met Ile Lys 340 345 350 Thr Ser Asn Asp Tyr Ile Tyr Glu Asn Gln Thr Val Thr Phe Leu Asp 355 360 365 Asn His Asp Val Thr Arg Phe Arg Tyr Ile Gln Pro Asn Asp Lys Pro 370 375 380 Tyr His Ala Ala Leu Ala Val Leu Met Thr Ser Arg Gly Ile Pro Asn 385 390 395 400 Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Leu Met Pro Ser Asp Ser Ser Asp 405 410 415 Ile Ala Gly Arg Met Phe Met Gln Thr Ser Thr Asn Phe Asp Glu Asn 420 425 430 Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Lys Leu Ser Asn Leu Arg Lys Asn 435 440 445 Asn Glu Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Glu Ile Leu Tyr Ser Thr Asn 450 455 460 Asp Val Leu Val Phe Lys Arg Gln Phe Tyr Asp Lys Gln Val Ile Val 465 470 475 480 Ala Val Asn Arg Gln Pro Asp Gln Thr Phe Thr Ile Pro Glu Leu Asp 485 490 495 Thr Thr Leu Pro Val Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Gly Gly Leu Leu 500 505 510 Tyr Gly Ser Ser Met Ser Val Asn Asn Val Asn Gly Gln Asn Lys Ile 515 520 525 Ser Ser Phe Thr Leu Ser Gly Gly Glu Val Asn Val Trp Ser Tyr Asn 530 535 540 Pro Ser Leu Gly Thr Leu Thr Pro Arg Ile Gly Asp Val Ile Ser Thr 545 550 555 560 Met Gly Arg Pro Gly Asn Thr Val Tyr Ile Tyr Gly Thr Gly Leu Gly 565 570 575 Gly Ser Val Thr Val Lys Phe Gly Ser Thr Val Ala Thr Val Val Ser 580 585 590 Asn Ser Asp Gln Met Ile Glu Ala Ile Val Pro Asn Thr Asn Pro Gly 595 600 605 Ile Gln Asn Ile Thr Val Thr Lys Gly Ser Val Thr Ser Asp Pro Phe 610 615 620 Arg Tyr Glu Val Leu Ser Gly Asp Gln Val Gln Val Ile Phe His Val 625 630 635 640 Asn Ala Thr Thr Asn Trp Gly Glu Asn Ile Tyr Val Val Gly Asn Ile 645 650 655 Pro Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Gln Ser Ser Glu Ala Met Leu 660 665 670 Asn Pro Asn Tyr Pro Glu Trp Phe Leu Pro Val Ser Val Pro Lys Gly 675 680 685 Ala Thr Phe Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Asn Asn Gly Asn Val 690 695 700 Ile Trp Glu Ser Arg Ser Asn Arg Val Phe Thr Ala Pro Asn Ser Ser 705 710 715 720 Thr Gly Thr Ile Asp Thr Pro Leu Tyr Phe Trp Asp Asn 725 730 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gccggagctc atgactacat ctacaggagc tttag 35 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 gccgtctaga ttagttatcc caaaaatata aag 33

Claims

α-1,4 글루코시드 결합을 가진 다당류 및 올리고당류에 작용하여, 말토트리오스 단위를 상기 당류에 전이시키는 활성을 가진 효소로서,
말토테트라오스를 기질로 사용하였을 때, 기질 농도 0.67%(w/v) 내지 70%(w/v)의 전 범위에서, 말토헵타오스 생성 속도와 말토트리오스 생성 속도의 비가 9:1 - 10:0인 것을 특징으로 하는, 말토트리오실 전이효소.
제1항에 있어서, 상기 말토트리오실 전이효소가 미생물 유래의 효소인 것을 특징으로 하는 말토트리오실 전이효소.
제1항에 있어서, 상기 말토트리오실 전이효소가 지오바실러스 속 미생물로부터 유래된 효소인 것을 특징으로 하는 말토트리오실 전이효소.
제3항에 있어서, 상기 지오바실러스 속 미생물이 지오바실러스 에스피-APC9669(수탁번호 NITE BP-770)인 것을 특징으로 하는 말토트리오실 전이효소.
아래 효소 화학적 성질을 구비한 말토트리오실 전이효소:
(1) 작용: 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 다당류 및 올리고당류에 작용하여, 말토트리오스 단위를 상기 당류에 전이시킴;
(2) 기질 특이성: 가용성 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스에는 작용하지만, α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 말토트리오스, 말토오스에는 작용하지 않음;
(3) 분자량: 약 83,000(SDS-PAGE)임.
제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 따른 말토트리오실 전이효소를 유효 성분으로 포함하는 효소제.
지오바실러스 에스피-APC9669(수탁번호 NITE BP-770) 또는 이의 변이주인, 말토트리오실 전이효소 생산능을 가진 미생물.
서열번호 8의 아미노산 서열 또는 말토트리오실 전이 활성을 나타내는 그것의 단편으로 이루어진, 말토트리오실 전이효소.
제8항에 있어서, 서열번호 6의 서열을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 말토트리오실 전이효소.
이하의 (a)?(e)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 DNA로 이루어진 말토트리오실 전이효소:
(a) 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA;
(b) 서열번호 6의 서열을 포함하는 DNA;
(c) 서열번호 6의 서열에 상보적인 서열에 대해 엄격 조건하에서 혼성화하는 DNA;
(d) 서열번호 6의 서열의 DNA 서열 축중체인 DNA;
(e) 서열번호 6의 서열을 기준으로 1 또는 복수개의 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 서열로 이루어지며, 말토트리오실 전이효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
제10항에 따른 말토트리오실 전이효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제11항에 있어서, 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제10항에 따른 말토트리오실 전이효소 유전자가 도입된 형질전환체.
제11항 또는 제12항에 따른 재조합 벡터가 도입된 형질전환체.
제13항 또는 제14항에 있어서, 세균 세포, 효모 세포 또는 진균류 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
이하의 단계 (1) 및 (2), 또는 단계 (i) 및 (ii)을 포함하는, 말토트리오실 전이효소의 제조 방법:
(1) 말토트리오실 전이효소 생산 능력을 가진 지오바실러스 속 미생물을 배양하는 단계;
(2) 배양한 이후의 배양액 및/또는 균체로부터 말토트리오실 전이효소를 회수하는 단계,
(i) 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체를 상기 말토트리오실 전이효소 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 생산되는 조건하에 배양하는 단계;
(ii) 생산된 상기 단백질을 회수하는 단계.
제16항에 있어서, 상기 지오바실러스 속 미생물이 지오바실러스 에스피-APC9669인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
α-1,4 글루코시드 결합을 가진 다당류 또는 올리고당류를 포함하는 식품을 제조?가공하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 효소 또는 제6항에 기재된 효소제의 용도.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 효소 또는 제6항에 기재된 효소제의 사용에 의해 기능성이 개선된 식품 또는 식품 재료.