JP2002518004A - エポチロン生合成用遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
発明は Sorangium cellulosum から得られ、エポチロン A および B の生合成に
必要な新規ポリケチドシンターゼおよび非リボソーム性ペプチドシンターゼ遺伝
子の分離および確認に関する。
β−炭素は常にケト基を持つのでポリケチドと名付けられている。これらの化合
物には多数の重要な抗生物質、免疫抑制剤、癌化学療法剤、その他の広範囲な生
物学的特性を持つ化合物を含む。無数の構造的多様性はポリケチド鎖長の多様性
、導入される側鎖の多様性(2炭素ビルディングブロックの部分として、または
ポリケチド骨格形成後のいずれかについて)、および該基の立体化学からから誘
導される。ケト基はまた還元されてヒドロキシル、エノイルを与えるか、または
完全に除去されることもある。2炭素付加の各段階は脂肪酸生合成と同様にポリ
ケチドシンターゼ(PKS)と呼ばれる酵素複合体によって行われる。
いる。例えばここに参考のために引用するソラフェン(soraphen)生合成用遺伝
子を記載する米国特許第5,639,949号、第5,693,774号および第5,716,849号を参
照。また、ここに参考のために引用するリファマイシン(rifamycin)生合成用
遺伝子を記載するSchuppほか著、FEMS Microbiology Letters、159巻:201-207
(1998年) およびWO 98/07868、およびティラクトン(tylactone)の生合成用遺
伝子を記載する米国特許第5,876,991号も参照。これらにコードされる蛋白質は
一般にI型とII型の二型に分類される。I型蛋白質は多機能性であって、数個
の触媒ドメインを持ち、相互に共有結合的に結合して種々の酵素的過程を実行す
るが(たとえば、エリスロマイシン、ソラフェン、リファマイシンおよびアベル
メクチン(avermectin)のためのPKS(MacNeilほか著、Industrial Microorganism
s: Basic and Applied Molecular Genetics (Baltzほか編)中、米国微生物学会
、ワシントン D. C. pp. 245-256 (1993年))、一方、II型蛋白質は単機能性
である(Hutchinsonほか著、Industrial Micro-organisms : Basic and Applied
Molecular Genetics、(Baltz ほか編)、米国微生物学会、ワシントンD. C. p
p. 203-216 (1993年))。
単なポリケチドでは PKS 遺伝子の1組がコードする PKS 酵素群により数回反復
して2炭素付加が行われる。これとは対照的に、たとえばエリスロマイシンおよ
びソラフェンのようにさらに複雑な化合物の合成では各モジュールが2炭素付加
の1段階を行うように組織化されているモジュールとして PKS 酵素群が関与す
る(総説としては、Hopwood ほか著、Industrial Microorganisms : Basic and
Applied Molecular Genetics、(Baltz ほか編)中、米国微生物学会、ワシントン
D.C.、pp. 267-275 (1993年)を参照)。
アミノ酸から誘導される副次構造が含まれる。これらのビルディングブロックの
導入は非リボソーム性ポリペプチド合成酵素(NRPS)によって行われる。NRPSは
モジュールとして組織化された多重な酵素である。各モジュールはアミノ酸ビル
ディングブロック1個の付加反応(および、必要ならば付加のプロセッシングも
)を行う。NRPSはアミノアシルアデニレートを形成してアミノ酸を活性化し、ペ
プチジルキャリアー蛋白質ドメイン上のホスホパントテン酸接合団のチオール基
にある活性化されたアミノ酸を捕捉する。さらに、NRPS はアミノ酸をエピマー
化、N−メチル化、または要すれば環化を行い、および酵素結合したアミノ酸の
間のペプチド結合形成を触媒することによって修飾する。NRPSはサイクロスポリ
ン(cyclosporin)のようなペプチドの二次的代謝物の生合成を行い、ラパマイ
シン(rapamycin)でのようにポリケチド鎖終結ユニットを提供し、また、イェ
ルシニアバクチン(yersiniabactin)生合成でのようにPKSと混合系を形成して
いるかもしれない。
イン誘導開始ユニットを持ち、細菌Sorangium cellulosum So ce90株によって産
生される(ここに参考のために引用するGerthほか著、J. Antibiotics、49巻:5
60-563、(1996年))。エポチロンAおよびBの構造は次式で示される:
害性を示す(ここに参考のために引用するHoefleほか著、ドイツ特許DE4138042
(1993年)参照)。特に重要なことには、エポチロンは生体内および培養細胞中の
両方でタキソールと生物学的効果が類似している(ここに参考のために引用する
Bollagほか著、Cancer Research 55巻:2325〜2333 (1995年))。細胞の微小管
を安定化するタキソール(taxol)とタキソテール(taxotere)は様々なヒト固
形癌に対して顕著な活性を持つ癌化学療法剤である(Rowinsky ほか著、J. Natl
. Cancer Inst.、83巻:1778-1781 (1991年))。競合性研究から、エポチロンは
タキソールと微小管結合部位を共有し、タキソールと同様な微小管親和性を持つ
との解釈と符合して、微小管へのタキソール結合に対する競合的阻害剤として作
用することが判明した。しかしながら、エポチロンはタキソールよりも多剤耐性
細胞系統に対する力価低下がはるかに低い点でタキソールよりも著しく優れてい
る(Bollagほか著、(1995年))。さらにその上、エポチロンはタキソールよりも
P-グリコ蛋白質による細胞からの排出がかなり低効率である(Gerthほか著、(19
96年))。これに加え、エポチロンAまたはエポチロンBよりも強く微小管のポリ
マー化と安定性を誘導する性能によって示される細胞傷害性に優れた数種のエポ
チロン同族体が合成されている(ここに参考のために引用するWO 98/25929)。
問題点が商業的潜在能力を減殺している。これらの化合物は工業的規模で化学合
成をするには複雑過ぎるので、醗酵によって生産しなければならない。たとえば
Sorangium cellulosum のようなミクソバクテリアの遺伝子操作についての技術
はここに参考のために引用する米国特許第5,686,295号に記載されている。しか
しながら、Sorangium cellulosum の発酵は著しく困難なので、エポチロンの産
生レベルは低い。もっと醗酵に適する異種宿主でのエポチロンの組換え生産が現
存する生産上の問題点を解決できると推測した。しかしながら、エポロチン生合
成を行うポリペプチドをコードする遺伝子はまだ分離されていなかった。さらに
、エポチロンを産生する株、すなわち So ce90 株、は別のポリケチド少なくと
も一種、スピランギエン、も産生し、これがエポチロンの生合成に特異的な遺伝
子の分離を大いに複雑化するものと思われた。
遺伝子、特にすなわち、Sorangium cellulosum の So ce90株など、Sorangium/
Polyangium属のミクソバクテリアでエポチロンAおよびBの合成に関与する遺伝子
を分離することにある。本発明の別な目的の一つは、抗癌剤としての利用のため
にエポチロンを組換え生産する方法を提供することにある。
に関与するポリペプチドの少なくとも一種をコードするヌクレオチド配列を含む
核酸分子を初めて提供することによって前記困難性を克服する。好適な態様にお
いては、そのヌクレオチド配列はミクソバクテリア、最も好ましくは Sorangium
cellulosumに属する種から分離される。
少なくとも1種コードするヌクレオチド配列を包含する、分離された核酸分子を
提供する。ここに該ポリペプチドは:配列番号2、配列番号2のアミノ酸11-437
、配列番号2のアミノ酸543-864、配列番号2のアミノ酸974-1273、配列番号2
のアミノ酸1314-1385、配列番号3、配列番号3のアミノ酸72-81、配列番号3の
アミノ酸118-125、配列番号3のアミノ酸199-212、配列番号3のアミノ酸353-36
3、配列番号3のアミノ酸549-565、配列番号3のアミノ酸588-603、配列番号3
のアミノ酸669-684、配列番号3のアミノ酸815-821、配列番号3のアミノ酸868-
892、配列番号3のアミノ酸903-912、配列番号3のアミノ酸 918-940、配列番号
3のアミノ酸1268-1274、配列番号3のアミノ酸1285-1297、配列番号3のアミノ
酸 973-1256、配列番号3のアミノ酸1344-1351、配列番号4、配列番号4のアミ
ノ酸 7-432、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号4のアミノ酸869-1037、
配列番号4のアミノ酸1439-1684、配列番号4のアミノ酸1722-1792、配列番号5
、配列番号5のアミノ酸39-457、配列番号5のアミノ酸563-884、配列番号5の
アミノ酸1147-1399、配列番号5のアミノ酸1434-1506、配列番号5のアミノ酸 1
524-1950、配列番号5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸2645-2895、
配列番号5のアミノ酸2932-3005、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号5
のアミノ酸3555-3876、配列番号5のアミノ酸3886-4048、配列番号5のアミノ酸
4433-4719、配列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸5010-5082
、配列番号5のアミノ酸5103-5525、配列番号5のアミノ酸5631-5951、配列番号
5のアミノ酸5964-6132、配列番号5のアミノ酸6542-6837、配列番号5のアミノ
酸 6857-7101、配列番号5のアミノ酸7140-7211、配列番号6、配列番号6のア
ミノ酸35-454、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸1143-1393
、配列番号6のアミノ酸1430-1503、配列番号6のアミノ酸1522-1946、配列番号
6のアミノ酸2053-2373、配列番号6のアミノ酸2383-2551、配列番号6のアミノ
酸 2671-3045、配列番号6のアミノ酸3392-3636、配列番号6のアミノ酸3673-37
45、配列番号7、配列番号7のアミノ酸32-450、配列番号7のアミノ酸556-877
、配列番号7のアミノ酸887-1051、配列番号7のアミノ酸1478-1790、配列番号
7のアミノ酸1810-2055、配列番号7のアミノ酸2093-2164、配列番号7のアミノ
酸 2165-2439、配列番号8、配列番号10、配列番号11、および配列番号22
からなる群から選択されたアミノ酸配列に実質的に類似のアミノ酸配列を含む。
なくとも1種をコードするヌクレオチド配列を含む分離された核酸分子を提供す
るが、そのポリペプチドは:配列番号2、配列番号2のアミノ酸11-437、配列番
号2のアミノ酸543-864、配列番号2のアミノ酸974-1273、配列番号2のアミノ
酸1314-1385、配列番号3、配列番号3のアミノ酸72-81、配列番号3のアミノ酸
118-125、配列番号3のアミノ酸199-212、配列番号3のアミノ酸353-363、配列
番号3のアミノ酸549-565、配列番号3のアミノ酸588-603、配列番号3のアミノ
酸669-684、配列番号3のアミノ酸815-821、配列番号3のアミノ酸868-892、配
列番号3のアミノ酸903-912、配列番号3のアミノ酸918-940、配列番号3のアミ
ノ酸1268-1274、配列番号3のアミノ酸1285-1297、配列番号3のアミノ酸 973-
1256、配列番号3のアミノ酸1344-1351、配列番号4、配列番号4のアミノ酸 7-
432、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号4のアミノ酸869-1037、配列番号
4のアミノ酸1439-1684、配列番号4のアミノ酸1722-1792、配列番号5、配列番
号5のアミノ酸39-457、配列番号5のアミノ酸563-884、配列番号5のアミノ酸1
147-1399、配列番号5のアミノ酸1434-1506、配列番号5のアミノ酸 1524- 195
0、配列番号5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸2645-2895、配列番
号5のアミノ酸2932-3005、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号5のアミ
ノ酸3555-3876、配列番号5のアミノ酸3886-4048、配列番号5のアミノ酸 4433-
4719、配列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸5010-5082、配列
番号5のアミノ酸5103-5525、配列番号5のアミノ酸5631-5951、配列番号5のア
ミノ酸5964-6132、配列番号5のアミノ酸6542-6837、配列番号5のアミノ酸 685
7-7101、配列番号5のアミノ酸7140-7211、配列番号6、配列番号6のアミノ酸3
5-454、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸1143-1393、配列
番号6のアミノ酸1430-1503、配列番号6のアミノ酸1522-1946、配列番号6のア
ミノ酸2053-2373、配列番号6のアミノ酸2383-2551、配列番号6のアミノ酸 267
1-3045、配列番号6のアミノ酸3392-3636、配列番号6のアミノ酸3673-3745、配
列番号7、配列番号7のアミノ酸32-450、配列番号7のアミノ酸556-877、配列
番号7のアミノ酸887-1051、配列番号7のアミノ酸1478-1790、配列番号7のア
ミノ酸1810-2055、配列番号7のアミノ酸2093-2164、配列番号7のアミノ酸 216
5-2439、配列番号8、配列番号10、配列番号11および配列番号22からなる
群から選択されたアミノ酸配列を含む。
も1種のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む分離された核酸分子
を提供する。そのヌクレオチド配列は:配列番号1のヌクレオチド1900-3171、
配列番号1のヌクレオチド3415-5556、配列番号1のヌクレオチド7610-11875、
配列番号1のヌクレオチド7643-8920、配列番号1のヌクレオチド9236-10201、
配列番号1のヌクレオチド10529-11428、配列番号1のヌクレオチド11549-11764
、配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド12085-121
14、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド12466-
2507、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13516
-13566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド138
76-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチド1
4473-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオチ
ド14623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレオ
チド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639、配列番号1のヌクレ
オチド15901-15924、配列番号1のヌクレオチド16251-21749、配列番号1のヌク
レオチド16269-17546、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号1のヌ
クレオチド18855-19361、配列番号1のヌクレオチド20565-21302、配列番号1の
ヌクレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド21746-43519、配列番号1
のヌクレオチド21860-23116、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号
1のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド26045-26263、配列番
号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド27911-28876、配列
番号1のヌクレオチド29678-30429、配列番号1のヌクレオチド30539-30759、配
列番号1のヌクレオチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド32408-33373、
配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド35042-35902
、配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド36773-369
91、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド38636-3
9598、配列番号1のヌクレオチド39635-40141、配列番号1のヌクレオチド41369
-42256、配列番号1のヌクレオチド42314-43048、配列番号1のヌクレオチド431
63-43378、配列番号1のヌクレオチド43524-54920、配列番号1のヌクレオチド4
3626-44885、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオチ
ド46950-47702、配列番号1のヌクレオチド47811-48032、配列番号1のヌクレオ
チド48087-49361、配列番号1のヌクレオチド49680-50642、配列番号1のヌクレ
オチド50670-51176、配列番号1のヌクレオチド51534-52657、配列番号1のヌク
レオチド53697-54431、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、配列番号1のヌ
クレオチド54935-62254、配列番号1のヌクレオチド55028-56284、配列番号1の
ヌクレオチド56600-57565、配列番号1のヌクレオチド57593-58087、配列番号1
のヌクレオチド59366-60304、配列番号1のヌクレオチド60362-61099、配列番号
1のヌクレオチド61211-61426、配列番号1のヌクレオチド61427-62254、配列番
号1のヌクレオチド62369-63628、配列番号1のヌクレオチド67334-68251、配列
番号1のヌクレオチド1-68750:の相補鎖:と実質的に類似のヌクレオチド配列
からなる群から選択される。
少なくとも一種をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。この
ヌクレオチド配列は:配列番号1のヌクレオチド1900-3171、配列番号1のヌク
レオチド3415-5556、配列番号1のヌクレオチド7610-11875、配列番号1のヌク
レオチド7643-8920、配列番号1のヌクレオチド9236-10201、配列番号1のヌク
レオチド10529-11428、配列番号1のヌクレオチド11549-11764、配列番号1のヌ
クレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド12085-12114、配列番号1の
ヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド12466-12507、配列番号1
のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13516-13566、配列番号
1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド13876-13923、配列番
号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチド14473-14547、配列
番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオチド14623-14692、配
列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレオチド15724-15762、
配列番号1のヌクレオチド14788-15639、配列番号1のヌクレオチド15901-15924
、配列番号1のヌクレオチド16251-21749、配列番号1のヌクレオチド16269-175
46、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号1のヌクレオチド18855-1
9361、配列番号1のヌクレオチド20565-21302、配列番号1のヌクレオチド21414
-21626、配列番号1のヌクレオチド21746-43519、配列番号1のヌクレオチド218
60-23116、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号1のヌクレオチド2
5184-25942、配列番号1のヌクレオチド26045-26263、配列番号1のヌクレオチ
ド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド27911-28876、配列番号1のヌクレオ
チド29678-30429、配列番号1のヌクレオチド30539-30759、配列番号1のヌクレ
オチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド32408-33373、配列番号1のヌク
レオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド35042-35902、配列番号1のヌ
クレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド36773-36991、配列番号1の
ヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド38636-39598、配列番号1
のヌクレオチド39635-40141、配列番号1のヌクレオチド41369-42256、配列番号
1のヌクレオチド42314-43048、配列番号1のヌクレオチド43163-43378、配列番
号1のヌクレオチド43524-54920、配列番号1のヌクレオチド43626-44885、配列
番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオチド46950-47702、配
列番号1のヌクレオチド47811-48032、配列番号1のヌクレオチド48087-49361、
配列番号1のヌクレオチド49680-50642、配列番号1のヌクレオチド50670-51176
、配列番号1のヌクレオチド51534-52657、配列番号1のヌクレオチド53697-544
31、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、配列番号1のヌクレオチド54935-6
2254、配列番号1のヌクレオチド55028-56284、配列番号1のヌクレオチド56600
-57565、配列番号1のヌクレオチド57593-58087、配列番号1のヌクレオチド593
66-60304、配列番号1のヌクレオチド60362-61099、配列番号1のヌクレオチド6
1211-61426、配列番号1のヌクレオチド61427-62254、配列番号1のヌクレオチ
ド62369-63628、配列番号1のヌクレオチド 67334- 68251、配列番号1のヌクレ
オチド 1-68750:の相補鎖からなる群から選択される。
チドを少なくとも1種コードするヌクレオチド配列を含む分離された核酸分子を
提供する。そのヌクレオチド配列は:配列番号1のヌクレオチド1900-3171、配
列番号1のヌクレオチド3415-5556、配列番号1のヌクレオチド7610-11875、配
列番号1のヌクレオチド7643-8920、配列番号1のヌクレオチド9236-10201、配
列番号1のヌクレオチド10529-11428、配列番号1のヌクレオチド11549-11764、
配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド12085-12114
、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド12466-125
07、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13516-1
3566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド13876
-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチド144
73-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオチド1
4623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレオチ
ド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639、配列番号1のヌクレオ
チド15901-15924、配列番号1のヌクレオチド16251-21749、配列番号1のヌクレ
オチド16269-17546、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号1のヌク
レオチド18855-19361、配列番号1のヌクレオチド20565-21302、配列番号1のヌ
クレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド21746-43519、配列番号1の
ヌクレオチド21860-23116、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号1
のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド26045-26263、配列番号
1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド27911-28876、配列番
号1のヌクレオチド29678-30429、配列番号1のヌクレオチド30539-30759、配列
番号1のヌクレオチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド32408-33373、配
列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド35042-35902、
配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド36773-36991
、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド38636-395
98、配列番号1のヌクレオチド39635-40141、配列番号1のヌクレオチド41369-4
2256、配列番号1のヌクレオチド42314-43048、配列番号1のヌクレオチド43163
-43378、配列番号1のヌクレオチド43524-54920、配列番号1のヌクレオチド436
26-44885、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオチド4
6950-47702、配列番号1のヌクレオチド47811-48032、配列番号1のヌクレオチ
ド48087-49361、配列番号1のヌクレオチド49680-50642、配列番号1のヌクレオ
チド50670-51176、配列番号1のヌクレオチド51534-52657、配列番号1のヌクレ
オチド53697-54431、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、配列番号1のヌク
レオチド54935-62254、配列番号1のヌクレオチド55028-56284、配列番号1のヌ
クレオチド56600-57565、配列番号1のヌクレオチド57593-58087、配列番号1の
ヌクレオチド59366-60304、配列番号1のヌクレオチド60362-61099、配列番号1
のヌクレオチド61211-61426、配列番号1のヌクレオチド61427-62254、配列番号
1のヌクレオチド62369-63628、配列番号1のヌクレオチド67334-68251、および
配列番号1のヌクレオチド1-68750:の相補鎖:からなる群から選択されたヌク
レオチド配列の対応する連続する20、25、30、35、40、45または5
0(好ましくは20)塩基対部分と配列が同一な連続する20、25、30、3
5、40、45または50(好ましくは20)塩基対のヌクレオチド部分を含む
。
含むキメラ遺伝子を提供する。さらに、本発明はこのキメラ遺伝子を含む組換え
ベクターを提供するが、そのベクターは宿主細胞を安定に形質転換することが可
能なものである。なお、さらに本発明はそのキメラ遺伝子を含む組換え宿主細胞
を提供するが、その宿主細胞はエポチロンの生合成に必要なポリペプチドを少な
くとも1種コードするヌクレオチド配列を発現することができるものである。
らに好適な態様ではその組換え宿主細胞はストレプトマイセス属の株である。他
の態様では、その組換え宿主細胞はたとえば緑膿菌または大腸菌のように醗酵が
容易な他種バクテリアのいずれでもよい。なおその上に、本発明は本発明の核酸
分子を含む Bacクローン、好ましくは BacクローンpEPO15を提供する。
チド配列を含む分離された核酸分子を提供する。
ーゼ(KS)ドメインであって、そのアミノ酸配列は:配列番号2のアミノ酸11-4
37、配列番号4のアミノ酸7-432、配列番号5のアミノ酸39-457、配列番号5の
アミノ酸1524-1950、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号5のアミノ酸51
03-5525、配列番号6のアミノ酸35-454、配列番号6のアミノ酸1522-1946 およ
び配列番号7のアミノ酸32-450:からなる群から選択されるアミノ酸配列と実質
的に類似なアミノ酸配列を含む。この態様によれば、該KSドメインは好ましくは
:配列番号2のアミノ酸11-437、配列番号4のアミノ酸7-432、配列番号5のア
ミノ酸39-457、配列番号5のアミノ酸1524-1950、配列番号5のアミノ酸3024-34
49、配列番号5のアミノ酸5103-5525、配列番号6のアミノ酸35-454、配列番号
6のアミノ酸1522-1946および配列番号7のアミノ酸32-450:からなる群から選
択されたアミノ酸配列を含む。また、この態様によれば、該ヌクレオチド配列は
:配列番号1のヌクレオチド 7643-8920、配列番号1のヌクレオチド16269-1754
6、配列番号1のヌクレオチド21860-23116、配列番号1のヌクレオチド26318-27
595、配列番号1のヌクレオチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド37052-
38320、配列番号1のヌクレオチド43626-44885、配列番号1のヌクレオチド4808
7-49361、および配列番号1のヌクレオチド55028-56284:からなる群から選択さ
れたヌクレオチド配列と実質的に類似であるのが好ましい。この態様によれば該
ヌクレオチド配列はより好ましくは:配列番号1のヌクレオチド7643-8920、配
列番号1のヌクレオチド 16269-17546、配列番号1のヌクレオチド21860-23116
、配列番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド30815-320
92、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド43626-4
4885、配列番号1のヌクレオチド48087-49361および配列番号1のヌクレオチド
55028-56284:からなる群から選択されたヌクレオチド配列の対応する連続する
20、25、30、35、40、45または50(好ましくは20)塩基対部分
と配列が同一な連続する20、25、30、35、40、45または50(好ま
しくは20)塩基対のヌクレオチド部分を含む。加えるに、この態様によれば、
該ヌクレオチド配列は最も好ましくは:配列番号1のヌクレオチド 7643-8920、
配列番号1のヌクレオチド 16269-17546、配列番号1のヌクレオチド21860-2311
6、配列番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド30815-32
092、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド43626-
44885、配列番号1のヌクレオチド48087-49361、および配列番号1のヌクレオチ
ド55028-56284:からなる群から選択される。
酸543-864、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号5のアミノ酸563-884、配
列番号5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸3555-3876、配列番号5の
アミノ酸5631-5951、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸2053
-2373および配列番号7のアミノ酸556-877:からなる群から選択されたアミノ酸
配列と実質的に類似なアミノ酸配列を含むアシル転移酵素(AT)ドメインである
。この態様に従えば、該ATドメインは好ましくは:配列番号2のアミノ酸543-86
4、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号5のアミノ酸563-884、配列番号5
のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸3555-3876、配列番号5のアミノ酸
5631-5951、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸2053-2373お
よび配列番号7のアミノ酸556-877:からなる群から選択されたアミノ酸配列を
含む。また、この態様によれば、このヌクレオチド配列は好ましくは:配列番号
1のヌクレオチド9236-10201、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番
号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号1のヌクレオチド27911-28876、配列
番号1のヌクレオチド32408-33373、配列番号1のヌクレオチド38636-39598、配
列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオチド49680-50642
および配列番号1のヌクレオチド56600-57565:からなる群から選択されたヌク
レオチド配列と実質的に類似である。この態様によれば、このヌクレオチド配列
はより好ましくは:配列番号1のヌクレオチド9236-10201、配列番号1のヌクレ
オチド17865-18827、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号1のヌク
レオチド27911-28876、配列番号1のヌクレオチド32408-33373、配列番号1のヌ
クレオチド38636-39598、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1の
ヌクレオチド49680-50642、および配列番号1のヌクレオチド56600-57565:から
なる群から選択されたヌクレオチド配列の対応する連続する20、25、30、
35、40、45または50(好ましくは20)塩基対部分と配列が同一な連続
する20、25、30、35、40、45または50(好ましくは20)塩基対
のヌクレオチド部分を含む。これに加え、この態様によれば、該ヌクレオチド配
列は最も好ましくは:配列番号1のヌクレオチド9236-10201、配列番号1のヌク
レオチド 17865-18827、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号1の
ヌクレオチド27911-28876、配列番号1のヌクレオチド32408-33373、配列番号1
のヌクレオチド38636-39598、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号
1のヌクレオチド49680-50642および配列番号1のヌクレオチド56600-57565:か
らなる群から選択される。
ノ酸 974-1273、配列番号5のアミノ酸 4433-4719配列番号5のアミノ酸 6542-
6837および配列番号7のアミノ酸 1478-1790:からなる群から選択されたアミノ
酸配列と実質的に類似なアミノ酸配列を含むエノイル還元酵素(ER)ドメインで
ある。この態様によれば、該 ER ドメインは好ましくは:配列番号2のアミノ酸
974-1273、配列番号5のアミノ酸 4433-4719、配列番号5のアミノ酸 6542-683
7 および配列番号7のアミノ酸 1478-1790:からなる群から選択されたアミノ酸
配列を含む。また、この態様によれば、該ヌクレオチド配列は好ましくは:配列
番号1のヌクレオチド 10529-11428、配列番号1のヌクレオチド 35042-35902、
配列番号1のヌクレオチド 41369-42256および配列番号1のヌクレオチド 59366
-60304:からなる群から選択されたヌクレオチド配列と実質的に類似である。こ
の態様によれば、該ヌクレオチド配列はより好ましくは:配列番号1のヌクレオ
チド 10529-11428、配列番号1のヌクレオチド 35042-35902、配列番号1のヌク
レオチド 41369-42256および配列番号1のヌクレオチド 59366-60304:からなる
群から選択されたヌクレオチド配列の対応する連続する20、25、30、35
、40、45、または50(好ましくは20)塩基対部分と配列が同一な連続す
る20、25、30、35、40、45、または50(好ましくは20)塩基対
のヌクレオチド部分を含む。これに加え、この態様によれば、該ヌクレオチド配
列は最も好ましくは:配列番号1のヌクレオチド 10529-11428、配列番号1のヌ
クレオチド 35042-35902、配列番号1のヌクレオチド 41369-42256 および配列
番号1のヌクレオチド 59366-60304:からなる群から選択される。
白質(ACP)ドメインであるが、このポリペプチドは:配列番号2のアミノ酸 13
14-1385、配列番号4のアミノ酸 1722-1792、配列番号5のアミノ酸 1434-1506
、配列番号5のアミノ酸 2932-3005、配列番号5のアミノ酸 5010-5082、配列番
号5のアミノ酸 7140-7211、配列番号6のアミノ酸 1430-1503、配列番号6のア
ミノ酸 3673-3745 および配列番号7のアミノ酸 2093-2164:からなる群から選
択されたアミノ酸配列と実質的に類似なアミノ酸配列を含む。この態様では、該
ACP ドメインは好ましくは:配列番号2のアミノ酸 1314-1385、配列番号4の
アミノ酸 1722-1792、配列番号5のアミノ酸 1434-1506、配列番号5のアミノ酸
2932-3005、配列番号5のアミノ酸 5010-5082、配列番号5のアミノ酸 7140- 7
211、配列番号6のアミノ酸 1430-1503、配列番号6のアミノ酸 3673-3745およ
び配列番号7のアミノ酸 2093-2164:からなる群から選択されたアミノ酸配列を
含む。また、この態様によれば、該ヌクレオチド配列は好ましくは:配列番号1
のヌクレオチド 11549-11764、配列番号1のヌクレオチド 21414-21626、配列番
号1のヌクレオチド 26045-26263、配列番号1のヌクレオチド 30539-30759、配
列番号1のヌクレオチド 36773-36991、配列番号1のヌクレオチド 43163-43378
、配列番号1のヌクレオチド 47811-48032、配列番号1のヌクレオチド 54540-
54758 および配列番号1のヌクレオチド 61211-61426:からなる群から選択され
たヌクレオチド配列と実質的に類似である。この態様によれば、該ヌクレオチド
配列はより好ましくは:配列番号1のヌクレオチド 11549-11764、配列番号1の
ヌクレオチド 21414-21626、配列番号1のヌクレオチド 26045-26263、配列番号
1のヌクレオチド 30539-30759、配列番号1のヌクレオチド 36773-36991、配列
番号1のヌクレオチド 43163-43378、配列番号1のヌクレオチド 47811-48032、
配列番号1のヌクレオチド 54540-54758 および配列番号1のヌクレオチド 6121
1- 61426:からなる群から選択されたヌクレオチド配列の対応する連続する20
、25、30、35、40、45または50(好ましくは20)塩基対部分と配
列が同一な連続する35、40、45または50(好ましくは20)塩基対ヌク
レオチド部分を含む。これに加え、この態様によれば、該ヌクレオチド配列は最
も好ましくは:配列番号1のヌクレオチド 11549-11764、配列番号1のヌクレオ
チド 21414-21626、配列番号1のヌクレオチド 26045-26263、配列番号1のヌク
レオチド 30539-30759、配列番号1のヌクレオチド 36773-36991、配列番号1の
ヌクレオチド 43163-43378、配列番号1のヌクレオチド 47811-48032、配列番号
1のヌクレオチド 54540-54758 および配列番号1のヌクレオチド 61211-61426
:からなる群から選択される。
ノ酸 869-1037、4,配列番号5のアミノ酸 3886-4048、配列番号5のアミノ酸 59
64-6132、配列番号6のアミノ酸 2383-2551 および配列番号7のアミノ酸 887-
1051:からなる群から選択されたアミノ酸配列と実質的に類似なアミノ酸配列を
含むデヒドラターゼ(DH)ドメインである。この態様によれば、該 DH ドメイン
は好ましくは:配列番号4のアミノ酸 869-1037、配列番号5のアミノ酸 3886-
4048、配列番号5のアミノ酸 5964-6132、配列番号6のアミノ酸 2383-2551 お
よび配列番号7のアミノ酸 887-1051:からなる群から選択されたアミノ酸配列
を含む。またこの態様によれば、該ヌクレオチド配列は好ましくは:配列番号1
のヌクレオチド 18855-19361、配列番号1のヌクレオチド 33401-33889、配列番
号1のヌクレオチド 39635-40141、配列番号1のヌクレオチド 50670-51176 お
よび配列番号1のヌクレオチド 57593-58087:からなる群から選択されたヌクレ
オチド配列と実質的に類似である。この態様によれば、該ヌクレオチド配列はよ
り好ましくは:配列番号1のヌクレオチド 18855-19361、配列番号1のヌクレオ
チド 33401-33889、配列番号1のヌクレオチド 39635-40141、配列番号1のヌク
レオチド 50670-51176 および配列番号1のヌクレオチド 57593-58087:からな
る群から選択されたヌクレオチド配列の対応する連続する20、25、30、3
5、40、45または50(好ましくは20)塩基対部分と配列が同一な連続す
る20、25、30、35、40、45または50(好ましくは20)塩基対ヌ
クレオチド部分を含む。加えて、この態様によれば、該ヌクレオチド配列は最も
好ましくは:配列番号1のヌクレオチド 18855-19361、配列番号1のヌクレオチ
ド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド 39635-40141、配列番号1のヌクレ
オチド 50670-51176 および配列番号1のヌクレオチド 57593-58087:からなる
群から選択される。
ミノ酸 1439-1684、配列番号5のアミノ酸 1147-1399、配列番号5のアミノ酸 2
645-2895、配列番号5のアミノ酸 4729-4974、配列番号5のアミノ酸 6857-7101
、配列番号6のアミノ酸 1143-1393、配列番号6のアミノ酸 3392-3636 および
配列番号7のアミノ酸 1810-2055:からなる群から選択されたアミノ酸配列と実
質的に類似なアミノ酸配列を含むβ-ケトリダクターゼ(KR)ドメインである。
この態様によれば、該 KR ドメイン は好ましくは:配列番号4のアミノ酸 1439
-1684、配列番号5のアミノ酸 1147-1399、配列番号5のアミノ酸 2645-2895、
配列番号5のアミノ酸 4729-4974、配列番号5のアミノ酸 6857-7101、配列番号
6のアミノ酸 1143-1393、配列番号6のアミノ酸 3392-3636、および配列番号7
のアミノ酸 1810-2055:からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。また、
この態様によれば、該ヌクレオチド配列は好ましくは:配列番号1のヌクレオチ
ド 20565-21302、配列番号1のヌクレオチド 25184-25942、配列番号1のヌクレ
オチド 29678-30429、配列番号1のヌクレオチド 35930-36667、配列番号1のヌ
クレオチド 42314-43048、配列番号1のヌクレオチド 46950-47702、配列番号1
のヌクレオチド 53697-54431、および配列番号1のヌクレオチド 60362-61099:
からなる群から選択されたヌクレオチド配列と実質的に類似である。この態様に
よれば、該ヌクレオチド配列はより好ましくは連続する20、25、30、35
、40、45、または50(好ましくは20)塩基対ヌクレオチド部分を含むが
、これは:配列番号1のヌクレオチド 20565-21302、配列番号1のヌクレオチド
25184-25942、配列番号1のヌクレオチド 29678-30429、配列番号1のヌクレオ
チド 35930-36667、配列番号1のヌクレオチド 42314-43048、配列番号1のヌク
レオチド 46950-47702、配列番号1のヌクレオチド 53697-54431、および配列番
号1のヌクレオチド 60362-61099:からなる群から選択されたヌクレオチド配列
の対応する連続する20、25、30、35、40、45、または50(好まし
くは20)塩基対部分と配列が同一である。これに加えて、この態様によれば、
該ヌクレオチド配列は最も好ましくは:配列番号1のヌクレオチド 20565-21302
、配列番号1のヌクレオチド 25184-25942、配列番号1のヌクレオチド 29678-3
0429、配列番号1のヌクレオチド 35930-36667、配列番号1のヌクレオチド 423
14-43048、配列番号1のヌクレオチド 46950-47702、配列番号1のヌクレオチド
53697-54431、および配列番号1のヌクレオチド 60362-61099:からなる群から
選択される。
671-3045 と実質的に類似なアミノ酸配列を含むメチル転移酵素 (MT) ドメイン
である。この態様によれば、該 MT ドメインは好ましくは配列番号6のアミノ酸
2671-3045 を含む。また、この態様によれば、該ヌクレオチド配列は好ましく
は配列番号1のヌクレオチド 51534-52657 と実質的に類似している。この態様
によれば、該ヌクレオチド配列はより好ましくは連続的な20、25、30、3
5、40、45、または50(好ましくは20)塩基対ヌクレオチド部分を含む
が、この配列は配列番号1のヌクレオチド 51534-52657 にある対応する連続的
な20、25、30、35、40、45、または50(好ましくは20)塩基対
部分と同一である。これに加え、この態様によれば、該ヌクレオチド配列は最も
好ましくは配列番号1のヌクレオチド 51534-52657 である。
酸 2165-2439 と実質的に類似なアミノ酸配列を含むチオエステラーゼ(TE)ド
メインである。この態様によれば、該 TE ドメインは好ましくは配列番号7のア
ミノ酸 2165-2439 を含む。またこの態様によれば、該ヌクレオチド配列は好ま
しくは配列番号1のヌクレオチド 61427-62254 と実質的に類似である。この態
様によれば、該ヌクレオチド配列はより好ましくは連続的な20、25、30、
35、40、45、または50(好ましくは20)塩基対ヌクレオチド部分を含
むが、この配列は配列番号1のヌクレオチド 61427-62254 での対応する連続す
る20、25、30、35、40、45、または50(好ましくは20)塩基対
部分と同一である。加えて、この態様によれば、該ヌクレオチド配列は最も好ま
しくは配列番号1のヌクレオチド 61427-62254 である。
ヌクレオチド配列を含む分離された核酸分子を提供するが、その非リボソーム性
ペプチド合成酵素は:配列番号3、配列番号3のアミノ酸72-81、配列番号3の
アミノ酸118-125、配列番号3のアミノ酸199-212、配列番号3のアミノ酸353-36
3、配列番号3のアミノ酸549-565、配列番号3のアミノ酸588-603、配列番号3
のアミノ酸669-684、配列番号3のアミノ酸815-821、配列番号3のアミノ酸868-
892、配列番号3のアミノ酸903-912、配列番号3のアミノ酸918-940、配列番号
3のアミノ酸1268-1274、配列番号3のアミノ酸1285-1297、配列番号3のアミノ
酸973-1256、および配列番号3のアミノ酸1344-1351:からなる群から選択され
たアミノ酸配列と実質的に類似なアミノ酸配列を含む。この態様によれば、該非
リボソーム性ペプチド合成酵素は好ましくは:配列番号3、配列番号3のアミノ
酸72-81、配列番号3のアミノ酸118-125、配列番号3のアミノ酸199-212、配列
番号3のアミノ酸353-363、配列番号3のアミノ酸549-565、配列番号3のアミノ
酸588-603、配列番号3のアミノ酸669-684、配列番号3のアミノ酸815-821、配
列番号3のアミノ酸868-892、配列番号3のアミノ酸903-912、配列番号3のアミ
ノ酸918-940、配列番号3のアミノ酸1268-1274、配列番号3のアミノ酸1285-129
7、配列番号3のアミノ酸973-1256、および配列番号3のアミノ酸1344-1351:か
らなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。また、この態様によれば、該ヌク
レオチド配列は好ましくは:配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号
1のヌクレオチド12085-12114、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番
号1のヌクレオチド12466-12507、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列
番号1のヌクレオチド13516-13566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配
列番号1のヌクレオチド13876-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、
配列番号1のヌクレオチド14473-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607
、配列番号1のヌクレオチド14623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-156
93、配列番号1のヌクレオチド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-1
5639、および配列番号1のヌクレオチド15901-15924:からなる群から選択され
たヌクレオチド配列と実質的に類似である。この態様によれば、該ヌクレオチド
配列はより好ましくは連続する20、25、30、35、40、45、または5
0(好ましくは20)塩基対ヌクレオチド部分を含むが、この部分の配列は:配
列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド12085-12114、
配列番号1のヌクレオチド12223 -12246、配列番号1のヌクレオチド12466-1250
7、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13516-13
566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド13876-
13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチド1447
3-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオチド14
623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレオチド
15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639、および配列番号1のヌク
レオチド15901- 15924:からなる群から選択されたヌクレオチド配列の対応する
連続する20、25、30、35、40、45、または50(好ましくは20)
塩基対部分の配列と同一である。加えて、この態様によれば、該ヌクレオチド配
列は最も好ましくは:配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌ
クレオチド12085-12114、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1の
ヌクレオチド12466-12507、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1
のヌクレオチド13516-13566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号
1のヌクレオチド13876-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番
号1のヌクレオチド14473-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列
番号1のヌクレオチド14623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配
列番号1のヌクレオチド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639、
および配列番号1のヌクレオチド15901-15924:からなる群から選択される。
含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む分離された核酸分子を提
供する。
ために精製および使用を可能にするに十分な多量さで、たとえばエポチロンのよ
うなポリケチドを組換え生産する方法も提供する。この生産法の特異的な利点は
製造される分子のキラリティである;いくつかのエナンチオマーは活性が低いこ
とがありうるラセミ混合物集団の作製をトランスジェニック生物での生産で回避
する。殊に、本発明は組換え宿主中でエポチロンを異種発現させる方法を提供す
るが、その方法は (a)エポチロンの生合成に関与するポリペプチドを少なくとも
1種コードするヌクレオチド配列を含み、本発明の核酸分子に作動可能に結合す
る異種プロモーター配列を含むキメラ遺伝子を宿主に導入すること;および(b
)宿主中でエポチロンの生合成を行わせる条件下に宿主を増殖させること;を含
む。本発明はまたエポチロンの生産法も提供するが、その生産法は(a)前記方
法により組換え宿主中にエポチロンを発現させること;および(b)該組換え宿
主からエポチロンを抽出すること;を含む。
配列を含む分離されたポリペプチドを提供する。
(KS)ドメインであって、そのドメインは:配列番号2のアミノ酸11-437、配列
番号4のアミノ酸7-432、配列番号5のアミノ酸39-457、配列番号5のアミノ酸1
524-1950、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号5のアミノ酸5103-5525、
配列番号6のアミノ酸35-454、配列番号6のアミノ酸1522-1946および配列番号
7のアミノ酸32-450:からなる群から選択されたアミノ酸配列と実質的に類似な
アミノ酸配列を含む。この態様によれば、該KSドメインは好ましくは:配列番号
2のアミノ酸11-437、配列番号4のアミノ酸7-432、配列番号5のアミノ酸39-45
7、配列番号5のアミノ酸1524-1950、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番
号5のアミノ酸5103-5525、配列番号6のアミノ酸35-454、配列番号6のアミノ
酸1522-1946および配列番号7のアミノ酸32-450:からなる群から選択されたア
ミノ酸配列を含む。
)ドメインであって、そのドメインは:配列番号2のアミノ酸543-864、配列番
号4のアミノ酸539-859、配列番号5のアミノ酸563-884、配列番号5のアミノ酸
2056-2377、配列番号5のアミノ酸3555-3876、配列番号5のアミノ酸5631-5951
、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸2053-2373および配列番
号7のアミノ酸556-877:からなる群から選択されたアミノ酸配列と実質的に類
似なアミノ酸配列を含む。この態様によれば、該ATドメインは好ましくは:配列
番号2のアミノ酸543-864、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号5のアミノ
酸563 -884、配列番号5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸3555-3876
、配列番号5のアミノ酸5631-5951、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6
のアミノ酸2053-2373および配列番号7のアミノ酸556-877:からなる群から選択
されたアミノ酸配列を含む。
クターゼ(ER)ドメインであって、そのドメインは:配列番号2のアミノ酸974-
1273、配列番号5のアミノ酸4433-4719、配列番号5のアミノ酸6542-6837および
配列番号7のアミノ酸1478-1790:からなる群から選択されたアミノ酸配列と実
質的に類似なアミノ酸配列を含む。この態様によれば、該 ER ドメインは好まし
くは:配列番号2のアミノ酸974-1273、配列番号5のアミノ酸4433-4719、配列
番号5のアミノ酸6542-6837および配列番号7のアミノ酸1478-1790:からなる群
から選択されたアミノ酸配列を含む。
白質(ACP)ドメインであって、該ポリペプチドは:配列番号2のアミノ酸1314-
1385、配列番号4のアミノ酸1722-1792、配列番号5のアミノ酸1434-1506、配列
番号5のアミノ酸2932-3005、配列番号5のアミノ酸5010-5082、配列番号5のア
ミノ酸7140-7211、配列番号6のアミノ酸1430-1503、配列番号6のアミノ酸3673
-3745および配列番号7のアミノ酸2093-2164:からなる群から選択されたアミノ
酸配列と実質的に類似なアミノ酸配列を含む。この態様によれば、該ACPドメイ
ンは好ましくは:配列番号2のアミノ酸1314-1385、配列番号4のアミノ酸1722-
1792、配列番号5のアミノ酸1434-1506、配列番号5のアミノ酸2932-3005、配列
番号5のアミノ酸5010-5082、配列番号5のアミノ酸7140- 7211、配列番号6の
アミノ酸1430-1503、配列番号6のアミノ酸3673-3745および配列番号7のアミノ
酸2093-2164:からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。
)ドメインであって、このドメインは:配列番号4のアミノ酸869-1037、配列番
号5のアミノ酸3886-4048、配列番号5のアミノ酸5964-6132、配列番号6のアミ
ノ酸2383-2551および配列番号7のアミノ酸887-1051:からなる群から選択され
たアミノ酸配列と実質的に類似なアミノ酸配列を含む。この態様によれば、該DH
ドメインは好ましくは:配列番号4のアミノ酸869-1037、配列番号5のアミノ酸
3886-4048、配列番号5のアミノ酸5964-6132、配列番号6のアミノ酸2383-2551
および配列番号7のアミノ酸887-1051:からなる群から選択されたアミノ酸配列
を含む。
クターゼ(KR)ドメインであって、このドメインは:配列番号4のアミノ酸1439
-1684、配列番号5のアミノ酸1147-1399、配列番号5のアミノ酸2645-2895、配
列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸6857-7101、配列番号6の
アミノ酸1143-1393、配列番号6のアミノ酸3392-3636および配列番号7のアミノ
酸1810-2055:からなる群から選択されたアミノ酸配列と実質的に類似なアミノ
酸配列を含む。この態様によれば、該KRドメインは好ましくは:配列番号4のア
ミノ酸1439-1684、配列番号5のアミノ酸1147-1399、配列番号5のアミノ酸2645
-2895、配列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸6857-7101、配
列番号6のアミノ酸1143-1393、配列番号6のアミノ酸3392-3636および配列番号
7のアミノ酸1810-2055:からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。
ノ酸2671-3045と実質的に類似なアミノ酸配列を含むメチル転移酵素(MT)ドメ
インである。この態様によれば、該MTドメインは好ましくは配列番号6のアミノ
酸2671-3045を含む。
酸2165-2439と実質的に類似なアミノ酸配列を含むチオエステラーゼ(TE)ドメ
インである。この態様によれば、該TEドメインは好ましくは配列番号7のアミノ
酸2165-2439を含む。
ば当技術分野における熟練者には明らかになる。
す。例えば、その2個の配列が作動可能に結合しているか、またはコードDNA配
列または構造DNA配列の発現レベルに影響を与えるように位置しているならプロ
モーターまたは調節DNA配列はRNAまたは蛋白質をコードするDNA 配列と「連携」
している。
はそれが連携するmRNA をコードするかまたは蛋白質として発現されるDNA配列の
転写または発現を調節できるように作動可能に結合するか、連携している。キメ
ラ遺伝子の調節DNA配列は天然に見出されるものでは通常は連携するDNAと作動可
能に結合していない。 コードDNA配列:生物中で翻訳されて蛋白質を産生するDNA配列。
はアシルキャリアー蛋白質(ACP)、p-ケトシンターゼ(KS)、アシル転移酵素
(AT)、β-ケトレダクターゼ(KR)、デヒドラターゼ(DH)、エノイルレダク
ターゼ(ER)、およびチオエステラーゼ(TE)の各ドメインがある。 エポチロン:16員環のマクロ環ポリケチド。天然にはバクテリアである Sor
angium cellulosum の Soce 90 株が産生する。この物質はタキソールの生物学
的効果と似た効果を示す。本明細書では「エポチロン」は一群のポリケチドを示
し、エポチロンAおよびエポチロンBならびにたとえばWO 98/25929に記載のよう
なその誘導体が含まれる。
かに主として発現の調節すなわちコード部分の転写および翻訳の制御を行うDNA
配列も含む。
起源DNA配列の非天然起源多重コピーを含む。 同種DNA配列:導入される宿主細胞にとって天然に関連のあるDNA配列。 同種組換え:同種DNA分子間で行われるDNA断片の相互の交換。 分離された:本発明の文脈では、分離された核酸分子または分離された酵素は
核酸分子または酵素であって、人の手でその在来の環境から離れて存在する。そ
れ故、天然産物ではない。分離された核酸分子または酵素は精製された形で存在
しても、例えば組換え宿主細胞のような非在来の環境内に存在してもよい。
な活性のすべて、すなわち縮合過程およびそれに関連する全てのβ−カルボニル
プロセッシング過程をコードする。各モジュールは生合成の縮合過程とβ-カル
ボニルプロセッシングを行うための、選択された縮合後作用とを達成するために
ACP、KSおよびAT活性をコードする。
デニル化、エピマー化、N−メチル化、環化、ペプチジルキャリアー蛋白質およ
び縮合のドメインなど、二次代謝産物へのアミノ酸導入を行う酵素活性の複合体
である。機能的な NRPS は二次代謝産物へのアミノ酸の導入を触媒する。
エポチロンAおよびBのような機能的二次代謝産物を生産するためのNRPSをコード
する1種またはそれ以上の遺伝子。 核酸分子:いずれかの起源から分離できる単鎖または二重鎖DNAまたはRNAの線
状セグメント。本発明では核酸分子は好ましくはDNAのセグメントである。
シルキャリアー蛋白質、エノイルレダクターゼ、ケトアシルACPシンターゼおよ
びアシル転移酵素などを含む、ポリケチドの生合成を行う酵素活性複合体(ドメ
イン)。機能性 PKS はポリケチドの合成を触媒する。
チロンAおよびBなど機能的なポリケチドの生産に必要な種々のポリペプチドをコ
ードする1種またはそれ以上の遺伝子。
性を有する核酸分子。好適な態様では、実質的に類似なDNA配列は対象とするDNA
配列と少なくとも80%同一である。より好適な態様では、実質的に類似なDNA
配列は対象とするDNA配列と少なくとも90%同一である。最も好適な態様では
実質的に類似なDNA配列は対象とするDNA配列と少なくとも95%同一である。実
質的に類似なDNA配列は好ましくは対象とするDNA配列がコードする蛋白質または
ペプチドと実質的に同じ活性を有する蛋白質またはペプチドをコードする。実質
的に類似のヌクレオチド配列は典型的には次の条件下に対象とする核酸分子また
はその断片にハイブリダイズする:50℃で7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS
)、0.5M-燐酸ナトリウムpH7.0、1mM-EDTAでハイブリッド化;50℃で2×SSC、
1%SDSで洗浄。蛋白質またはペプチドに関しては、実質的に類似なアミノ酸配列
は対象とする蛋白質またはペプチドのアミノ酸配列と少なくとも90%同一なア
ミノ酸配列であって、対象とする蛋白質またはペプチドと実質的に同じ活性を持
つ。
クテリアのような宿主生物を示す。核酸分子は宿主のゲノムまたは核酸分子に安
定に組込むことができ、またはその核酸分子を染色体外に存在させることもでき
る。この染色体外分子は自己複製が可能である。形質転換した細胞、組織または
植物は形質転換過程の最終目的物ばかりでなく、トランスジェニックな子孫をも
含むものと理解される。「非形質転換」、「非トランスジェニック」または「非
組換え」宿主は異種核酸分子を含まないバクテリアのような野生型生物を示す。
よびグアニン(G)に従って塩基によって示される。同様にして、アミノ酸は標
準的略号に従って示される:アラニン(Ala;A)、アルギニン(Arg;R)、アル
パラギン(Asn;N)、アスパラギン酸(Asp;D)、システイン(Cys;C)、グル
タミン(Gln;Q)、グルタミン酸(Glu;E)、グリシン(Gly;G)、ヒスチジン
(His;H)、イソロイシン(Ile;I)、ロイシン(Leu;L)、リジン(Lys;K)
、メチオニン(Met;M)、フェニルアラニン(Phe;F)、プロリン(Pro;P)、
セリン(Ser;S)、トレオニン(Thr;T)、トリプトファン(Trp;W)、チロジ
ン(Tyr;Y)およびバリン(Val;V)。さらに(Xaa;X)はいずれかのアミノ酸
を示す。
含む 68750 bpのコンティグのヌクレオチド配列である。 配列番号2はepoA(配列番号1のヌクレオチド7610-11875)がコードするI型
ポリケチドシンターゼ(EPOS A)の蛋白質配列である。 配列番号3はepoP(配列番号1のヌクレオチド11872-16104)がコードする非
リボソーム性ペプチド合成酵素(EPOS P)の蛋白質配列である。 配列番号4はepoB(配列番号1のヌクレオチド16251-21749)がコードするI
型ポリケチドシンターゼ(EPOS B)の蛋白質配列である。 配列番号5はepoC (配列番号1のヌクレオチド21746-43519)がコードするI
型ポリケチドシンターゼ(EPOS C)の蛋白質配列である。 配列番号6はepoD (配列番号1のヌクレオチド43524-54920)がコードするI
型ポリケチドシンターゼ (EPOS D)の蛋白質配列である。 配列番号7はepoE (配列番号1のヌクレオチド54935-62254)がコードするI
型ポリケチドシンターゼ(EPOS E)の蛋白質配列である。 配列番号8はepoF(配列番号1のヌクレオチド62369-63628)がコードするチ
トクローム P450 酸化酵素ホモローグ(EPOS F)の蛋白質配列である。 配列番号9はorf1(配列番号1のヌクレオチド1-1826)がコードする部分的な
蛋白質配列(部分Orf1)である。
)がコードする蛋白質配列(Orf2)である。 配列番号11はorf3(配列番号1のヌクレオチド3415-5556)がコードする蛋
白質配列(Orf3)である。 配列番号12はorf4(配列番号1の逆方向相補鎖上のヌクレオチド5992-5612
)がコードする蛋白質配列(Orf4)である。 配列番号13はorf5(配列番号1のヌクレオチド6226-6675)がコードする蛋
白質配列(Orf5)である。 配列番号14はorf6(配列番号1のヌクレオチド63779-64333)がコードする
蛋白質配列(Orf6)である。 配列番号15はorf7(配列番号1の逆方向相補鎖上のヌクレオチド64290- 63
853)がコードする蛋白質配列(Orf7)である。
蛋白質配列(Orf8)である。 配列番号17はorf9(配列番号1の逆方向相補鎖上のヌクレオチド64727- 642
87)がコードする蛋白質配列(Orf9)である。 配列番号18はorf10(配列番号1のヌクレオチド65063-65767)がコードする
蛋白質配列(Orf10)である。 配列番号19はorf11(配列番号1の逆方向相補鎖上のヌクレオチド65874- 65
008)がコードする蛋白質配列(Orf11)である。 配列番号20はorfl2(配列番号1の逆方向相補鎖上のヌクレオチド66338- 65
871)がコードする蛋白質配列(Orf12)である。 配列番号21はorf13(配列番号1のヌクレオチド66667-67137)がコードする
蛋白質配列(Orf13)である。
蛋白質配列(Orf14)である。 配列番号23はorf15(配列番号1のヌクレオチド68346-68750)がコードする
部分的蛋白質配列(partial Orf15)である。 配列番号24はユニバーサル逆方向PCRプライマー配列である。 配列番号25はユニバーサル正方向PCRプライマー配列である。 配列番号26はNH24端末 "B" PCRプライマー配列である。 配列番号27はNH2端末 "A" PCRプライマー配列である。 配列番号28はNH2端末 "B" PCRプライマー配列である。 配列番号29はpEPO15-NH6端末 "B" PCRプライマー配列である。 配列番号30はpEPO15-H2.7端末 "A" PCRプライマー配列である。
ト1815所在のAgricultural Research Service 特許培養物コレクション(NRRL)
に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定の下に
寄託した。寄託物の入手に関する全制限は特許付与時に取消不能に解除される。 寄託材料 受託番号 寄託日 pEP015 NRRL B-30033 1998年6月11日 pEP032 NRRL B-30119 1999年4月16日
エポチロン生合成遺伝子の分離のための好ましい操作はエポチロンAおよびBを産
生することが確認されている生物からのゲノムDNAの分離、および分離したDNAを
適当なプラスミドまたはベクターに入れて正常にはポリケチドを産生しない宿主
生物に移すことが必要であり、続いて形質転換されてエポチロン産生能が与えら
れた宿主コロニーを確認することが必要である。たとえばλ::Tn5トランスポゾ
ン突然変異誘発(de Bruijn & Lupski, 著、Gene、27巻:131-149 (1984年))の
ような技術を用いることによってエポチロンを与えるDNAで形質転換された正確
な領域をより精密に決定できる。別法としてまたは付加的に、形質転換されたエ
ポチロンを与えるDNAをより小さい断片に切断し、エポチロンを与える性能を持
つ最小のものをさらに確認できる。エポチロンを産生する性能を持たない宿主生
物は、一方ではポリケチドを誘導する生物とは異なる種であるが、この技術の変
型には突然変異誘発によってエポチロン産生性能を破壊された同種の宿主におけ
る宿主DNAの形質転換も含む。この方法では、エポチロンを産生する生物を突然
変異誘発させてエポチロン非産生突然変異体を分離する。次にこれをエポチロン
産生親株から分離したゲノムDNAで補完する。
突然変異誘発後にポリケチドを産生できなくなるようなエポチロン産生生物の突
然変異体を作製するためのトランスポゾン突然変異誘発の使用である。そこで、
エポチロン産生を行う宿主ゲノムの領域をトランスポゾンで標識して、親株から
在来の遺伝子を回収し、分離するためのプローブとして使用できる。ポリケチド
の合成に必要であって、既知のPKS遺伝子と類似であるPKS遺伝子を、たとえばリ
ファマイシンまたはソラフェンの生合成に使うもののような配列が知られている
生合成遺伝子に対する配列相同性によって分離してもよい。相同性による分離に
適する技術にはDNAハイブリッド化による標準的ライブラリースクリーニングが
含まれる。
の役割を演じている遺伝子または別のDNA配列から得られるDNA断片である。 好適なプローブ分子はソラフェンPKS(米国特許第5,716,849号)の第4モジュ
ールにあるケトシンターゼドメインをコードする 1.2 kb SmaI DNA 断片を含む
。さらに、より好適なプローブ分子はリファマイシンPKSの第一および第二モジ
ュール(Schupp など著、FEMS Microbiology Letters 159: 201-207 (1998))か
ら得られるβ-ケトアシルシンターゼドメインを含む。これらはエポチロンの生
合成を行うPKS遺伝子を分離するためのエポチロン産生微生物の遺伝子ライブラ
リーをプローブするために使用できる。
チロン生合成遺伝子の分離で遭遇すると思われる困難さにも拘らず、本明細書に
記載する方法を用いれば、エポチロンAおよびBの生合成遺伝子をポリケチドを産
生する微生物から驚くべきことにクローニングできる。この明細書に記載する遺
伝子操作および組換え生産の方法を使用して、クローニングしたPKS遺伝子を修
飾し、トランスジェニック宿主生物で発現できる。
異種宿主中でのポリケチド産生を可能にする発現ができる。これらの遺伝子操作
技術は入手可能な種々な宿主毎に特異的であって、当技術分野では公知である。
例えば、異種遺伝子はたとえばここに参考のために引用する、McDaniel ほか著
、Science、262巻:1546-1550(1993年)および Kaoほか著、Science、265巻:5
09-512 (1994年)に記載されている技術を用いてストレプトマイセス属およびそ
の他の放線菌に発現させることができる。またここに参考のために引用する Row
eほか著、Gene、216巻:215-223(1998年);Holmes ほか著、EMBO Journal、12
(8)巻:3183-3191(1993年);および Bibbほか著、Gene、38巻:215-226(19
85年)も参照。
子はたとえばシュードモナス属菌および大腸菌のような他の宿主生物中でも発現
できる。これらの遺伝子操作技術は種々の入手可能な宿主毎に特異的であって、
当技術分野で知られている。例えば、PKS遺伝子はT7プロモーターを使用する pT
7-7 ベクターを用いて大腸菌で発現に成功している。ここに参考のために引用す
るTaborほか著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82巻:1074-1078(1985年)を参
照。これに加え、発現ベクター pKK223-3およびpKK223-2は大腸菌でtacまたはtr
cプロモーターによる転写または翻訳融合のいずれかで異種遺伝子を発現するた
めに使用できる。多重ORFをコードするオペロンを発現するために最も簡単な操
作はオペロンを転写融合によって、たとえばpKK223-3のようなベクターに挿入し
て、異種遺伝子の同系リボソーム結合部位を使用することを可能にするものであ
る。たとえばBacillusのようなグラム陽性種における過剰発現技術も当技術分野
で知られており、この発明でも使用できる(Quaxほか著、Basic and Applied Mo
lecular Genetics, Baltz ほか編、American Society for Microbiology, ワシ
ントン(1993))。
キュロウイルス発現系が含まれる。例えば、「The Expression of Recombinant
Proteins in Yeasts」、Sudbery, P. E.著、Curr. Opin. Biotechnol.、7(5)
巻:517-524(1996年);「Methods for Expressing Recombinant Proteins In
Yeasts」、Mackay ほか著、Carey, Paul R.編、Protein Eng. Des.、105-153、A
cademic 刊、San Diego, Calif.(1996年);「Expression of heterologous ge
ne products in yeast」、Pichuantes ほか著、Cleland, J. L., Craik, C. S.
編、Protein Eng.、129-161、Wiley-Liss 刊、ニューヨーク、N. Y.(1996年)
;WO98/27203;Kealeyほか著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95巻:505-509(1
998年);「Insect Cell Culture; Recent Advances, Bioengineering Challeng
es And Implications In Protein Production」、Palomares ほか著、Galindo,
Enrique; Ramirez, Octavio T. 編、Adv. Bioprocess Eng.、II巻:Invited Pap
. Int. Symp.、2nd(1998年)25-52、Kluwer刊、Dordrecht、オランダ;「Bacul
ovirus Expression Vectors」、Jarvis, Donald L.著、Miller, Lois K. 編、Ba
culoviruses、389-431、Plenum 刊、ニューヨーク、N. Y.(1997年);「Produc
tion Of Heterologous Proteins Using The Baculovirus/Insect Expression Sy
stem」、Grittiths ほか著、Methods Mol. Biol. (Totowa, N. J )、75 (Basic
Cell Culture Protocols (2版))、427-440、(1997年);「Insect Cell Express
ion Technology」、Luckow, Verne A. 著、Protein Eng.、183-218、Wiley-Liss
刊、ニューヨーク、N. Y.(1996年)参照。これらの文献は全て参考のためにこ
こに引用するものである。
成できるようになる前にホスホパントテン酸化を行う翻訳後修飾酵素が必要なこ
とである。しかし、このI型PKS酵素の修飾を起す酵素、ホスホパントテン酸(P
-pant)転移酵素は、たとえば大腸菌のような多くの宿主では正常には存在しな
い。この課題は異種宿主でのP-pant転移酵素とPKS遺伝子との共発現によって解
決できるが、これはここに参考のために引用するKealey ほか著、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA、95巻:505-509(1998年)に記載されている。
容易さ、増殖(すなわち発酵)の速度、たとえば翻訳後修飾のような過程のため
に固有な分子機構の存在および過剰産生されるポリケチドに対する感受性の欠如
である。最も好適な宿主生物はストレプトマイセス株のような放線菌である。他
の好適な宿主生物は緑膿菌および大腸菌である。前記のポリケチド生産法は本化
合物の現行製造技術よりも明らかな利点を有する。これらの利点には安価な製造
価格、より多量な化合物の生産能および有機合成では不可避的に副生するラセミ
混合物と比べて生物学的に好適なエナンチオマー化合物を製造する能力などが含
まれる。異種宿主が産生する化合物は医学的(たとえばエポチロンの場合には癌
の処置)ならびに農業的応用に使用できる。
示目的のためにのみ提供するものであって、特に指定しない限り限定を意図した
ものではない。ここに使用する標準的な組換えDNA技術および分子クローニング
技術は当技術分野でよく知られており、Ausubel(編)、Current Protocols in
Molecular Biology、John Wiley & Sons刊(1994年);T. Maniatis, E. F. Fri
tsch, J. Sambrook著、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, Cold Sp
ring Harbor laboratory刊、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989年)およびT. J.
Silhavy, M. L. Berman, L. W. Enquist著、「Experiments with Gene Fusions
」、Cold Spring Harbor Laboratory刊、Cold Spring Harbor, N.Y.(1984年)
に記載されている。
en und Zellkulturen、Braunschweig)をSolE培地(0.35%グルコース、0.05%ト
リプトン、0.15% MgS04・7H20、0.05% 硫酸アンモニウム、0.1% CaCl2、0.006% K 2 HP04、0.01% ジチオン酸ナトリウム、0.0008% Fe-EDTA、1.2% HEPES、S. cellu
losum滅菌静置培養物の3.5%(v/v)上清液)pH ad. 7.4の寒天プレートに塗布し
、増殖(30℃)させる。1cm2 から得た細胞を釣り上げ、G51t 液体培地(0.2
% グルコース、0.5%澱粉、0.2% トリプトン、0.1% プロビンS、0.05% CaCl2・2H 2 0、0.05% MgS04・7H20、1.2% HEPES、pH ad. 7.4)5 mLに接種し、225 rpm で振
盪しながら30℃でインキュベーションする。4日後に培養物をG51t 50 mL に
移し、前記の通り5日間インキュベーションする。この培養物を用いてG51t 500
mLに接種し、前記のように6日間インキュベーションする。この培養物を4000
rpmで10 分間遠心分離し、細胞ペレットをG51t 50 mLに再懸濁する。
S. cellulosum細胞をアガロースブロックに置き、溶菌し、分離されたゲノムDN
A を制限酵素HindIIIで部分的に消化する。消化したDNAをアガロースゲル上のパ
ルス電界電気泳動によって分離する。大きな(約90-150 kb)DNA断片をアガロー
スゲルから分離し、ベクターpBelobacIIに連結する。pBelobacIIはクロラムフェ
ニコール耐性をコードする遺伝子、適当な培地上で青色/白色選択を提供するla
cZ遺伝子の多重クローニング部位、ならびに複製および1細胞当り1コピーまた
は2コピーのプラスミドの維持に必要な遺伝子を含む。連結混合物を使用して電
気応答能のあるEscherichia coli DH10B細胞を標準的な電気穿穴技術によって形
質転換する。クロラムフェニコール耐性組換えコロニー(白色、lacZ突然変異体
)をプラス荷電ナイロン膜フィルター384 3X3のグリッドフォーマットに移す。
クローンを溶菌し、DNAをフィルターに交差結合する。同じクローンを液体培養
物として−80℃で保存する。
ulosum 90 の Bac ライブラリースクリーニング Bacライブラリーフィルターを標準的サザンハイブリッド形成法によって精査
する。使用したDNAプローブはリファマイシンポリケチドシンターゼの第一およ
び第二モジュールからのβ-ケトアシルシンターゼドメイン(Schuppほか著、FEM
S Microbiology Letters、159巻:201-207 (1998年))をコードする。プローブ
のDNAは各ケトシンターゼドメインに隣接するプライマーで鋳型にプラスミドpNE
95(pNE95はSchupp et al. (1998年)が記載したコスミド2に等しい)を用いるP
CRによって作製する。PCR-増幅された DNA 25 ngを0.5% アガロースゲルから分
離し、ランダムプライマー標識キット(Gibco-BRL、Bethesda、MD、米国)を製
造社の仕様に従って、32P-dCTPで標識する。ハイブリッド形成は65℃で36時
間行い、膜は高ストリンジェンシーで洗浄する(0.1xSSCおよび0.5%SDS、20 分
間、65℃、3回)。標識したブロットは螢光スクリーンに暴露し、シグナルを Ph
ospholmager 445SI(Molecular Dynamics 社製スクリーンおよび445SI)で検出
する。これである種のBacクローンが本プローブに強いハイブリッド形成を起す
。このクローンを選択し、Luria培地(LB)5 mL中、37℃で一夜培養する。目的
とするBacクローンから得たBac DNAを典型的な微量製造操作によって分離する。
細胞をリゾチーム溶液(50mM-グルコース、10mM-EDTA、25mM-Tris-HCl、5mg/mL
リゾチーム)200μLに再懸濁し、溶菌液 (0.2N-NaOHと2% SDS)400μLで溶菌し、
蛋白質を(3.0 M-酢酸カリウム、酢酸でpH5.2に調節)で沈殿させ、Bac DNAをイ
ソプロパノールで沈殿させる。DNAをヌクレアーゼ不含蒸留水20μLに再懸濁し、
BamHI(New England Biolabs 社)で制限し、0.7%アガロースゲルで分離する。
ゲルを前記のようにサザンハイブリッド形成でブロットし、ソラフェンポリケチ
ドシンターゼの第4モジュールにあるケトシンターゼドメイン(米国特許第5,71
6,849号参照)をコードする 1.2 kb SmaI DNA断片をプローブとして前記条件下
に精査する。異なるハイブリッド形成パターン5種が見出される。5種のパター
ンを表すクローン各1種を選択して、各々 pEP015、pEP020、pEP030、pEP031、
および pEP033と命名した。
サブクローニング 選択したBacクローン5種のDNAをBamHIで消化し、ランダム断片をBamHI部位で
pBluescript II SK+ (Stratagene 社) にサブクローニングする。大きさが 2 kb
と10 kbとの間の挿入物を持つサブクローンを選択して挿入体の結合端末を配列
決定し、また、1.2 SmaIプローブで前記の通りに精査する。既知のポリケチドシ
ンターゼーゼに高度な配列相同性を示すか、および/またはソラフェンのケトシ
ンターゼドメインと強いハイブリッドを形成するサブクローンを遺伝子破壊実験
に使用する。
異体の調製 液体培地 G52-H(0.2% 酵母エキス、0.2% 脱脂ソヤミール、0.8% バレイショ
澱粉、0.2% グルコース、0.1% MgSO4・7H2O、0.1% CaCl2x2H20、0.008% Fe-EDTA
、KOHでpH ad 7.4)で作成した Sorangium cellulosum So ce90株の3日培養物0
.1 mL をストレプトマイシン100μg/mL添加SolE培地を含む寒天プレート上に塗
布する。プレートを30℃で2週間インキュベーションする。この培地で増殖す
るコロニーはストレプトマイシン耐性突然変異体であって、これを再度精製のた
めに同じストレプトマイシン含有寒天培地に塗布し、培養する。これらのストレ
プトマイシン耐性突然変異体の1種を選択してBCE28/2と命名した。
E28/2の遺伝子破壊 前記の選択したBacクローン5種から作製したサブクローンの BamHI 挿入体を
分離し、プラスミドpCIB132(米国特許第5,716,849号参照)の独特なBamHI部位
に連結する。挿入体を有するこのpCIB132誘導体でヘルパープラスミドpUZ8(Hed
ges and Matthew 著、Plasmid、2巻:269-278(1979年)を含むEscherichia col
i ED8767を形質転換する。この形質転換体をSorangium cellulosum BCE28/2をレ
シピエントとする接合実験のドナーに用いる。接合には液体培地G51b(G51b は
トリプトン置換ペプトンG51t培地)中、30℃の早期定常期静置培養物(約5x108
細胞/mLまで)からの Sorangium cellulosum BCE28/2の5-10x109 細胞とサブク
ローニングしたBamHI断片およびヘルパープラスミドpUZ8を有するpCIB132誘導体
を含むE. coli ED8767の後期対数期培養物(LB液体培地中)とを細胞比1:1で
混合する。細胞の混合物を次に4000 rpmで10分間遠心分離し、G51b培地0.5 mLに
再懸濁する。この細胞懸濁液の1滴を次にカナマイシン 50 mg/L を含むSolE寒
天プレートの中央に塗布する。30℃で24時間インキュベーション後に得られた細
胞を収集し、G51b培地0.8 mLに再懸濁し、この懸濁液0.1から0.3 mLをフレオマ
イシン(30 mg/L)、ストレプトマイシン(300 mg/L)およびカナマイシン(50
mg/L)を含む選択SolE固形培地に塗布する。ストレプトマイシンによってドナー
大腸菌株の逆選択が起きる。この選択培地上、温度30℃で8-12日インキュベーシ
ョン後に増殖したコロニーをプラスチックループで分離し、同じ寒天培地上に塗
布し、培養して2回目の選択と精製を行う。この選択寒天培地に温度30℃で7
日後に増殖していたコロニー由来培養物は、サブクローニングされたBamHI断片
を持つpCIB132誘導体の接合伝達によってフレオマイシン耐性を獲得したSorangi
um cellulosum BCE28/2のトランス接合体である。
体へのこの組込みはサザンハイブリッド形成によって検証される。この実験には
、伝達されたBamHI断片当り5-10個のトランス接合体からの完全DNA(G52-H培地
で3日間増殖させた培養物10 mLから)をPospiech and Neumann著、Trends Gene
t.、11巻:217 (1995年)記載の方法を適用して分離する。サザンプロッティン
グには前記のように分離したDNAを制限酵素 Bg/II、ClaIまたはNotIで切断して
、各 BamHI 挿入体またはpCIB132を32P標識プローブとして使用する。
よるエポチロン生産に及ぼす影響の分析 2回目の選択(実施例6参照)に用いた選択So 1E プレート表面約1 cm2 にト
ランス接合体細胞を増殖させ、滅菌プラスチックループを用いて50 mLエルレン
マイヤーフラスコ中のG52-H培地10 mLに移植する。30℃、180 rpmで3日間イン
キュベーションした後、培養物を200 mLエルレンマイヤーフラスコ中のG52-H 培
地50 mLに移植する。30℃、180 rpmで4-5日間インキュベーション後、この培養
物10 mLを200 mLエルレンマイヤーフラスコ中の23B3培地(0.2 % グルコース、2
% ポテトスターチ、1.6 % 脱脂ソヤミール、0.0008 % Fe-EDTA ナトリウム塩、
0.5 % HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸)、2 %
v/vポリスチロール樹脂XAD16(Rohm & Haas社)、pHはNaOHで7.8に調整)50 mL
に移植する。
150μmナイロンフィルターを通して全培養ブロスを吸引濾過する。次にフィルタ
ー上に残った樹脂をイソプロパノール10 mLに再懸濁し、懸濁液を180 rpmで1 時
間振盪して抽出する。この懸濁液から1 mLを採取し、Eppendorff Microfugeによ
り12,000 rpmで遠心分離する。試料中のエポチロンA、Bの量を250 nm、UV_DAD
検出器、HPLC検出(HPLC、ウォータース-シンメトリーC18カラム、0.02% 燐酸 6
0%-0% / アセトニトリル40%-100%勾配)で測定する。
接合体3種、すなわち、プラスミドpEP015-2-1のBamHI断片を持つトランス接合
体、プラスミドpEP015-4-5のBamHI 断片を持つトランス接合体およびプラスミド
pEP015-4-1のBamHI 断片を持つトランス接合体、を前記のように試験する。HPL
C分析は全トランス接合体がエポチロンAもBも産生しなくなったことを示す。こ
れに対して、pEP020、pEP030、pEP031、pEP033 に由来するBamHI断片が組込まれ
たトランス接合体および親株BCE28/2では、エポチロンAおよびBが 2-4 mg/L の
濃度で検出される。
構築 A.プラスミド pEP015-21 の BamHI 挿入体 Escherichia coli DH10B [pEP015-21] 株からプラスミドDNAを分離し、pEP0 1
5-21の2.3-kb BamHI挿入体のヌクレオチド配列を決定する。自動化DNA配列決定
は二重鎖DNA鋳型上でのジデオキシヌクレオチド鎖終結法によってApplied Biosy
stems 社の377型配列決定装置を用いて行う。使用したプライマーはユニバーサ
ル逆方向プライマー(5'GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3'(配列番号24))およ
びユニバーサル正方向プライマー(5'GTA AAA CGA CGG CCA GT 3'(配列番号: 2
5))である。次回の配列決定反応では前回に決定した配列の3'末端用に設計して
注文合成したオリゴヌクレオチドを用いてコンティグを伸長し、結合する。両鎖
を完全に配列決定し、各ヌクレオチドは少なくとも2回配列決定する。ヌクレオ
チド配列をプログラムSequencher 3.0 版(Gene Codes 社)に集積し、ウィスコ
ンシン大学遺伝子学電算機グループのプログラムを用いて解析する。2213-bp挿
入体のヌクレオチド配列は配列番号1のヌクレオチド20779-22991に対応する。
015-4-1中の3.9-kb BamHI挿入体のヌクレオチド配列を前項のAに記載のように
して決定する。3909-bp挿入体のヌクレオチド配列は配列番号1のヌクレオチド1
6876-20784に対応する。
015-4-5中の2.3-kb BamHI挿入体のヌクレオチド配列を前項Aに記載のようにし
て決定する。2233-bp挿入体のヌクレオチド配列は配列番号1のヌクレオチド425
28-44760に対応する。
ーニングおよび配向 pEP015を制限酵素HindIIIで完全に消化し、得られた断片をHindIIIで切断して
おいたpBluescript II SK- または予めHindIIIで切断し、ウシ小腸アルカリホス
ファターゼで脱ホスホリル化しておいたpNEB193(New England Biolabs 社)に
サブクローニングする。クローン6種の異なるを作製して、pEP015-NH1、 pEP0
15-NH2、pEP015-NH6およびpEP015-NH24(全てpNEB193由来)、ならびにpEP015-H
2.7およびpEP015-H3.0 と命名した(共にpBluescript II SK-由来)。
hringer Mannheim社)し、pEP015-NH1、pEP015-NH2、pEP015-NH6、pEP015-NH24
、pEP015-H2.7およびpEP015-H3.0に対して高ストリンジェンシーなDNAハイブリ
ッド形成実験のプローブに用いる。pEP015-NH24については強いハイブリッド形
成シグナルが検出され、pEPO15-21がpEP015-NH24に含まれていることを示す。
EP015-NH2、pEP015-NH6、pEP015-NH24、pEP015-H2.7 および pEP015-H3.0に対す
る高ストリンジェンシーなDNAハイブリッド形成実験でのプローブとして使用す
る。pEP015-NH24およびpEP015-H2.7について強いハイブリッド形成シグナルが検
出される。pEP015-NH24およびpEP015-H2.7の各一端末から作製されたヌクレオチ
ド配列データはpEP015-4-1のBamHI挿入体について以前に決定した配列と完全に
一致する。この実験はpEPO-15-4-1(内部HindIII部位1個を含む)は pEP015-H2
.7およびpEP015-NH24と重複すること、およびpEP015-H2.7および pEP015-NH24は
この順序で連続していることを証明する。
EP015-NH2、pEP015-NH6、pEP015-NH24、pEP015-H2.7、およびpEP015-H3.0.に対
して高ストリンジェンシーなDNAハイブリッド形成実験でのプローブとして使用
する。pEP015-NH2については強いハイブリッド形成シグナルが検出され、pEP015
-21がpEP015-NH2に含まれることを示す。
クレオチド配列データを作製する。HindIII部位に指向するPCRプライマー:NH24
末端 "B":GTGACTGGCGCCTGGAATCTGCATGAGC(配列番号26)、 NH2 末端 "A": AGCGGGAGCTTGCTAGACATTCTGTTTC(配列番号27)および NH2 末端 "B":GACGCGCCTCGGGCAGCGCCCCAA(配列番号28) はこれらの配列に基づいて設計し、pEP015 での増幅反応および別の実験で、Sor
angium cellulosum So ce90のゲノムDNAを鋳型とする増幅反応に使用する。両鋳
型についてNH24末端"B"とNH2末端 "A"とのプライマー対で特異的な増幅が見出さ
れた。増幅体をpBluescript II SK- にクローニングし、完全な配列決定を行っ
た。増幅体の配列は同一であり、HindIII部位で融合したpEP015-NH24およびpEP0
15-NH21の末端配列とも全く一致し、pEP015-NH2およびpEP015-NH24の HindIII 断片はこの順序で連続的であることが確認される。
EP015に対する高ストリンジェンシーでのDNAハイブリッド形成実験でのプローブ
として使用する。大きさ約9 kbのNotI 断片は強いハイブリッド形成を示し、こ
れをさらにNotI消化し、ウシ小腸アルカリホスファターゼで脱ホスホリル化して
おいた pBluescript II SK- にサブクローニングして pEP015-N9-16 を得る。pE
P015-N9-16のNotI挿入物を分離して、前記の通りDIG-標識し、pEP015-NH1、pEP0
15-NH2、pEP015 NH6、pEP015-NH24、pEP015-H2.7、およびpEP015-H3.0 に対する
高ストリンジェンシーでのDNAハイブリッド形成実験でのプローブに用いる。pEP
015-NH6および予期されるクローンpEP015-H2.7およびpEP015-NH24について強い
ハイブリッド形成シグナルが検出される。pEP015-NH6の両端からおよび pEP015-
4-1とは重複しないpEP015-H2.7の末端からヌクレオチド配列データを作製する。
HindIII部位に向けたPCRプライマーを設計し、pEP015との増幅反応に用い、別の
実験では鋳型としてSorangium cellulosum So ce90のゲノムDNAを使用する増幅
反応に使用する。両鋳型についてプライマー対: pEP015-NH6 末端"B":CACCGAAGCGTCGATCTGGTCCATC (配列番号29)および pEP01
5-H2.7 末端 "A":CGGTCAGATCGACGACGGGCTTTCC(配列番号30) で特異的増殖が見出される。増幅体をpBluescript II SK- にクローニングし、
完全な配列決定を行う。増幅体の配列は同一で、pEP015-NH6およびpEP015-H2.7
の末端配列と完全に一致し、HindIII部位で融合させてpEP015-NH6および pEP015
-H2.7の断片がこの順序で連続的であることを確認する。
ーすることおよびpEP015-NH6、pEP015-H2.7、pEP015-NH24およびpEP015-NH2のHi
ndIII挿入物がこの順序で構成していることが確認される。 残りのHindIIIサブ
クローン2種、すなわちpEP015-NH1およびpEP015-H3.0の挿入物はこのコンティ
グの一部ではないことが見出される。
さらなる展開 pEP015-NH2 の挿入物の下流末端に由来し、実施例9に記載したサブクローン
コンティグの下流末端を示す約2.2 kbのBamHI-HindIII断片を分離し、DIG-標識
し、数種の酵素で消化したpEP015およびpEP015-NH2 DNAに対するサザンハイブリ
ッド形成実験に用いる。強いハイブリッド形成バンドが常に同じ大きさで標的DN
A2個の間に見出されるが、これはSorangium cellulosum So ce90のゲノムDNA断
片がpEP015-NH2の下流末端にあるHindIII部位でpEP015末端にクローニングされ
ていることを示す。
法(Ji ほか著、 Genomics、31巻:185-192 (1996年))を用いてpScosTriplex-I
Iで作製されている。要約すれば、Sorangium cellulosum So ce90の高分子量ゲ
ノムDNAを制限酵素Sau3AIで部分的に消化して平均サイズ約40 kbの断片を提供し
、BamHIおよびpScosTriplex-II消化Xbalに連結する。連結混合物をGigapack III
XL(Stratagene 社)に入れ、E.coli XL1 Blue MR細胞に遺伝子移入する。
のBamHI-HindIII断片でスクリーニングし、コロニーハイブリッド形成のプロー
ブとして使用する。pEP04E7と命名した強くハイブリッド形成の強いクローンを
選択する。
HI-HindIII断片を用いるサザンハイブリッド形成実験で精査する。強くハイブリ
ッド形成する大きさ約9 kb NotI断片を選択し、pBluescript II SK-にサブクロ
ーニングしてpEP04E7-N9-8を得る。さらなるサザンハイブリッド形成実験は pEP
04E7-N9-8の約9 kb NotI挿入物がNotI-HindIII断片の6 kbにわたって pEP015-NH
2と重複することを示すが、一方、残りの約3 kb HindIII-NotI断片は実施例9に
記載したサブクローンコンティグを拡張するものであろう。末端配列決定は、し
かしながら、pEP04E7-N9-8の挿入物の下流がpScosTriplex-IIのBamHI-NotIポリ
リンカーを含み、そこで、伸長しつつあるHindIII-NotI 断片内のSau3AI部位でp
EP04E7のゲノムDNA挿入物が終わること、およびNotI部位が pScosTriplex-II に
由来することを示す。
の約3kbの伸長するHindIII-NotIサブ断片に由来する約1.6 kbのPstI-SalI断片
を実施例2に記載した細菌の人工染色体ライブラリーに対するプローブとして使
用する。以前に分離したEPO15の他に、EPO32と命名したBacクローンがブローブ
と強くハイブリッドを形成することが判明した。EPO32を分離し、数種の制限エ
ンドヌクレアーゼで消化し、約1.6 kbのPstI-SalI プローブにハイブリッド化さ
せた。約13 kbのHindIII-EcoRV断片がこのプローブと強くハイブリッドを形成す
ることが判明し、pBluescript II SK- にサブクローニングし、HindIIIおよびHi
ncIIで消化してpEPO32-HEV15 を得た。
V15に由来する上流(HindIII)末端配列に基づいて設計する。これらの配列は標
準的な制限分析では検出できない24 bpの小さなHindIII断片(EP04E7-H0.02)の
存在を示し、これがpEP015 NH2の下流末端にあるHindIII部位をpEP032-HEV15 の
上流末端にあるHindIII部位から隔てていることが判明した。
02 断片およびpEP032-HEV15の挿入体まで拡張されて、pEP015-NH6、pEP015-H2.7
, pEP015-NH24、pEP015-NH2、EP04E7-H0.02 および pEP032 HEV15 の挿入物をこ
の順序で構成する。
ヌクレオチド配列決定 実施例10に記載のヌクレオチド配列サブクローンコンティグは次のようにし
て決定される。
から分離し、pEP015-H2.7中の2.7-kb BamHI挿入体のヌクレオチド配列を決定す
る。自動DNA配列決定は二重鎖DNA鋳型上でジデオキシヌクレオチド鎖終結法によ
って、Applied Biosystems 社 377 型配列決定機を用いて行う。使用するプライ
マーはユニバーサル逆方向プライマー(5'GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3'(配列
番号24))、およびユニバーサル正方向プライマー(5'GTA AAA CGA CGG CCA G
T 3'(配列番号25))である。後続する回の配列決定反応では前回に決定した
配列の 3' 末端について設計して注文合成したオリゴヌクレオチドを用いて伸長
およびコンティグを行った。
挿入体を分離し、Hydroshear装置(Genomic Instrumentation Services 社)を
用いてランダム断片化に付し、平均断片サイズ1-2 kbを得た。デゾキシヌクレオ
チドトリホスファターゼ存在下にT4 DNAポリメラーゼおよびKlenow DNAポリメラ
ーゼ酵素を使用して断片の末端を修復し、ribo-ATの存在下、T4 DNAキナーゼで
燐酸化する。アガロースゲルからサイズ範囲1.5-2.2 kbの断片を分離し、EcoRV
で切断し、脱ホスホリル化しておいたpBluescript II SK- に連結する。ランダ
ムサブクローンをユニバーサル逆方向プライマーおよびユニバーサル正方向プラ
イマーを用いて配列決定する。
ce90からの -13 kb HindIII-EcoRV挿入物およびpBluescript II SK- からの 0.
3 kb Hincll-Sspl断片を含む約13.3 kb断片を分離し、HaeIIIで部分的に消化し
て平均サイズ1-2 kb.の断片を得る。アガロースゲルからサイズ範囲1.5-2.2 kb
の断片を分離し、EcoRVで切断し、脱燐酸化しておいたpBluescript II SK- に連
結する。ランダムサブクローンをユニバーサル逆方向プライマーおよびユニバー
サル正方向プライマーを用いて配列決定する。
著、Genome Res.、8(3)巻:175-185(1998年);Ewingほか著、Genome Res.、
8(3)巻:186-194 (1998年);Gordonほか著、Genome Res.、8(3)巻:195-202
(1998年))で集めてコンティグする。コンティグの間隙を埋め、配列の違いを解
析し、低質な領域を注文設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて原サブ
クローンまたはランダムサブクローンライブラリーから選択したクローンのいず
れかを配列決定して再配列する。両鎖を完全に配列決定し、少なくとも集合最小
Phred スコア40(信頼水準:99.99%)で各塩基対をカバーする。
型ポリケチドシンターゼ、EPOS A(配列番号2)をコードする。これは次のドメ
インを結合する: β-ケトアシルシンターゼ(KS)(配列番号1のヌクレオチド7643-8920、配列番号
2のアミノ酸 11437); アシル転移酵素 (AT)(配列番号1のヌクレオチド9236-10201、配列番号2のア
ミノ酸 543-864); エノイルレダクターゼ(ER)(配列番号1のヌクレオチド 10529-11428、配列番号
2のアミノ酸 974-1273); および アシルキャリアー蛋白質相同ドメイン (ACP) (配列番号1のヌクレオチド 11549
-11764、配列番号2のアミノ酸 1314-1385)。
年);Tang ほか著、Gene、216巻:255-265 (1998年))は EPOS A がコードする
AT はマロニル-CoAに特異的であることを示す。EPOS Aは多酵素複合体に最後に
は2-メチルチアゾール環の部分となる(C26およびC20)酢酸ユニットを負荷する
ことによってエポチロン生合成の開始に関与すると推測する。
ボソーム性ペプチド合成酵素EPOS P(配列番号3)をコードする。EPOS Pは次の
ドメインを結合する: ペプチド結合形成ドメインであって、モチーフK(配列番号3のアミノ酸72-81 [FPLTDIQESY]、配列番号1のヌクレオチド位置12085-12114に対応);モチーフ
L(配列番号3のアミノ酸118-125 [VVARHDML]、配列番号1のヌクレオチド位置1
2223-12246に対応);モチーフM(配列番号3のアミノ酸199-212 [SIDLINVDLG-
SLSI]、配列番号1のヌクレオチド位置12466-12507に対応);およびモチーフO
(配列番号3のアミノ酸353-363 [GDFTSMVLLDI]、配列番号1のヌクレオチド位
置12928-12960に対応);で代表されるもの。
アミノ酸549-565 [LTYEELSRRSRRLGARL]、配列番号1のヌクレオチド位置13516 -
13566に対応);モチーフB(配列番号3のアミノ酸588-603 [VAVLAVLES GAAYVPI
] 、配列番号1のヌクレオチド位置13633-13680に対応);モチーフC(配列番号
3のアミノ酸669-684 [AYVIYTSGSTGLPKGV]、配列番号1のヌクレオチド位置1387
6-13923に対応);モチーフD(配列番号3のアミノ酸815-821 [SLGGATE] 、配列
番号1のヌクレオチド位置14313-14334に対応);モチーフE(配列番号3のアミ
ノ酸868-892 [GQLYIGGVGLALGYWRDEEKTRKSF]、配列番号1のヌクレオチド位置144
73-14547に対応);モチーフF(配列番号3のアミノ酸903-912 [YKTGDLGRYL]、
配列番号1のヌクレオチド位置14578-14607に対応);モチーフG(配列番号3の
アミノ酸918-940 [EFMGREDNQIKLRGYRVELGEIE]、配列番号1のヌクレオチド位置1
4623-14692に対応);モチーフH (配列番号3のアミノ酸1268-1274 [LPEYMVP]、
配列番号1のヌクレオチド位置15673-15693に対応);およびモチーフI (配列番
号3のアミノ酸1285-1297 [LTSNGKVDRKALR]、配列番号1のヌクレオチド位置157
24-15762に対応);で代表されるもの。
た未知ドメイン(配列番号3のアミノ酸973-1256、配列番号1のヌクレオチド位
置14788-15639に対応);および ペプチジルキャリアー蛋白質相同的ドメイン(PCP)であって、モチーフJ(配列
番号3のアミノ酸1344-1351 [GATSIHIV] 、配列番号1のヌクレオチド位置15901
-15924に対応)で代表されるもの。
する。活性化システインをアミノアシル-S-PCPとして結合し、酵素結合したシス
テインとEPOS Aが供給するアセチル-S-ACPとの間のペプチド結合を形成し、分子
内ヘテロ環形成によって最初にチアゾリン環を形成する。EPOS Pの未知のドメイ
ンはNAD(P)Hオキシダーゼおよびバチルス種の還元酵素に非常に弱い相同性を示
す。そこでこの未知のドメインおよび/またはEPOS AのERドメインは初期の2-メ
チルチアゾリン環から 2-メチルチアゾールへの酸化に関与しているのかもしれ
ない。
ポリケチドシンターゼである EPOS B(配列番号4)をコードし、次のドメイン
を結合する:KS(配列番号1のヌクレオチド16269-17546、配列番号4のアミノ
酸7-432);AT(配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号4のアミノ酸
539-859);デヒドラターゼ(DH)(配列番号1のヌクレオチド18855-19361、配
列番号4のアミノ酸869-1037);β-ケトレダクターゼ(KR)(配列番号1のヌク
レオチド20565-21302、配列番号4のアミノ酸1439-1684);および ACP(配列番
号1のヌクレオチド21414-21626、配列番号4のアミノ酸1722-1792)の各ドメイ
ン。配列比較とモチーフの分析でEPOS BがコードするATはメチルマロニル-CoAに
特異的であることを示す。EPOS Aはメチルマロニル-S-ACPによる 2-メチル-4-チ
アゾールカルボキシ-S-PCP 出発基のClaisen-様縮合反応を触媒すると同時にC17
位のb-ケト基をエノイルに還元して、最初のポリケチド鎖伸長反応に関与するも
のと思われる。
ポリケチドシンターゼであるEPOS C(配列番号5)をコードする。EPOS Cの第1
モジュールはKS(配列番号1のヌクレオチド21860-23116、配列番号5のアミノ
酸39-457);マロニルCoA 特異的AT(配列番号1のヌクレオチド23431-24397、
配列番号5のアミノ酸563-884);KR(配列番号1のヌクレオチド25184-25942、
配列番号5のアミノ酸1147-1399);およびACP(配列番号1のヌクレオチド2604
5-26263、配列番号5のアミノ酸434-1506);を結合する。このモジュールはア
セテート伸長ユニット(C14-C13)を導入し、C15位にあるβ-ケト基をヒドロキ
シル基に還元するが、これはエポチロンマクロラクトン環の最終的なラクトン形
成に寄与する。EPOS Cの第2モジュールはKS(配列番号1のヌクレオチド26318-
27595、配列番号5のアミノ酸1524-1950);マロニル CoA 特異的AT(配列番号
1のヌクレオチド27911-28876、配列番号5のアミノ酸2056-2377);KR(配列番
号1のヌクレオチド29678-30429、配列番号5のアミノ酸2645-2895);およびAC
P(配列番号1のヌクレオチド30539-30759、配列番号5のアミノ酸2932-3005)
;を結合する。このモジュールはアセテート伸長ユニット(C12-C11)を取込ん
でおり、C13位のβ-ケト基をヒドロキシル基に還元する。そこでエポチロンの発
生期のポリケチド鎖はエポチロンAに対応し、エポチロンBのC12 位メチル側鎖の
導入にはPKS後にC-メチル転移酵素の活性が必要であると思われる。C13-C12 位
でのエポキシ環形成もPKS後酸化工程が必要であろう。EPOS Cの第3モジュール
はKS(配列番号1のヌクレオチド30815-32092、配列番号5のアミノ酸3024-3449
);マロニル CoA-特異的AT(配列番号1のヌクレオチド32408-33373、配列番号
5のアミノ酸3555-3876);DH(配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番
号5のアミノ酸3886-4048);ER(配列番号1のヌクレオチド35042-35902、配列
番号5のアミノ酸4433-4719);KR(配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配
列番号5のアミノ酸4729-4974);および ACP(配列番号1のヌクレオチド36773
-36991、配列番号5のアミノ酸5010-5082)を結合する。このモジュールはアセ
テート伸長単位(C10-C9)を導入し、C11位のβ-ケト基を完全に還元する。EPOS
C の第4モジュールはKS(配列番号1のヌクレオチド 37052-38320、配列番号
5のアミノ酸 51035525);メチルマロニル CoA-特異的AT(配列番号1のヌクレ
オチド38636-39598、配列番号5のアミノ酸5631-5951);DH(配列番号1のヌク
レオチド39635-40141、配列番号5のアミノ酸5964-6132);ER(配列番号1のヌ
クレオチド41369-42256、配列番号5のアミノ酸6542-6837);KR(配列番号1の
ヌクレオチド42314-43048、配列番号5のアミノ酸6857-7101);およびACP(配
列番号1のヌクレオチド43163-43378、配列番号5のアミノ酸 7140-7211);を結
合する。このモジュールはプロピオネート伸長ユニット(C24およびC8-C7)を導
入し、C9のβ-ケト基を完全に還元する。
リケチドシンターゼ EPOS D(配列番号6)をコードする。第1モジュールはKS
(配列番号1のヌクレオチド43626-44885、配列番号6のアミノ酸35-454);メ
チルマロニル CoA-特異的AT(配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号
6のアミノ酸561-881);KR(配列番号1のヌクレオチド46950-47702、配列番号
6のアミノ酸1143-1393);およびACP(配列番号1のヌクレオチド7811-48032、
配列番号6のアミノ酸1430-1503)を結合している。このモジュールはプロピオ
ネート伸長ユニット(C23およびC6-C5)を導入し、ヒドロキシ基のC7にあるβ-
ケト基を還元する。第2モジュールはKS(配列番号1のヌクレオチド48087-4936
1、配列番号6のアミノ酸1522-1946);メチルマロニルCoA-特異的AT(配列番号
1のヌクレオチド49680-50642、配列番号6のアミノ酸2053-2373);DH(配列番
号1のヌクレオチド50670-51176、配列番号6のアミノ酸2383-2551);メチル転
移酵素(MT)(配列番号1のヌクレオチド51534-52657、配列番号6のアミノ酸2
671-3045);KR(配列番号1のヌクレオチド53697-54431、配列番号6のアミノ
酸3392-3636);およびACP(配列番号1のヌクレオチド54540-54758、配列番号
6のアミノ酸3673-3745)を結合する。このモジュールはプロピオネート伸長ユ
ニット(C21またはC22およびC4-C3)を導入し、ヒドロキシ基のC5にあるβ-ケト
基を還元する。エポチロンはC5 にケト基を持つのでこの還元は少し予想外であ
った。この種のPKSモジュールに推測される還元能力とポリケチド最終産物の対
応する位置での酸化還元状態との間の差異については文献報告がある(例えば,
Schweckeほか著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、92巻:7839-7843 (1995年);Sc
huppほか著、FEMS Microbiology Letters、159巻:201-207 (1998年)参照)。エ
ポチロンの重要な特徴はC4(C21およびC22)gem-メチル側鎖の存在である。EPOS
D の第2モジュールは伸長しつつあるポリケチド鎖のC4にプロピオネートユニ
ットを導入して、メチル側鎖1個を提供すると予想される。このモジュールはま
たPKS のDHドメインとKRドメインとの間にHMWP1のイェルシニアバクチンシンタ
ーゼに見られるものと類似の配列で導入されたメチル転移酵素ドメインを含む(
Gehring, A. M., DeMoll, E., Fetherston, J. D., Mori, I., Mayhew, G. F.,
Blattner, F. R., Walsh, C. T., and Perry, R. D.著、Iron acquisition in p
lague: modular logic in enzymatic biogenesis of yersiniabactin by Yersin
ia pestis、Chem. Biol.、5巻:573-586、1998年)。EPOS DにあるこのMTドメイ
ンはC4に第2のメチル側鎖基(C21またはC22)を導入すると提唱される。
型ポリケチドシンターゼEPOS E(配列番号7)をコードし、KS(配列番号1のヌ
クレオチド55028-56284、配列番号7のアミノ酸32-450);マロニル CoA-特異的
AT(配列番号1のヌクレオチド56600-57565、配列番号7のアミノ酸556-877);
DH(配列番号1のヌクレオチド57593-58087、配列番号7のアミノ酸887-1051)
;おそらく非機能的ER(配列番号1のヌクレオチド59366-60304、配列番号7の
アミノ酸1478-1790);KR(配列番号1のヌクレオチド60362-61099、配列番号7
のアミノ酸1810-2055);ACP(配列番号1のヌクレオチド61211-61426、配列番
号7のアミノ酸2093-2164)およびチオエステラーゼ(TE)(配列番号1のヌクレ
オチド61427-62254、配列番号7のアミノ酸2165-2439);を結合する。このモジ
ュールにあるERドメインはいくつかの高度に非正常なアミノ酸置換を持つ活性部
位モチーフを結合しており、おそらくこれがこのドメインを不活性にしている。
このモジュールはアセテート伸長ユニット(C2-C1)を導入し、C3にあるP-ケト
をエノイル基に変換する。エポチロンはC3にヒドロキシ基を持つので、この還元
はまたEPOS Dの第2モジュールについて報告したように余剰であるとも思われる
。EPOS EのTEドメインはC1カルボキシ基とC15ヒドロキシ基の間のラクトン化に
よる伸長したポリケチド鎖の放出と環化に寄与している。
決定されたorf1は配列データバンクには相同体を持たなかった。orf2(配列番号
1逆方向相補鎖のヌクレオチド3171-1900)に推測される蛋白質産物(Orf2, 配
列番号10)はMycobacteriumおよびStreptomyces coelicolorから得られる仮想
的ORFに強い類似性を示し、また別の細菌からのカルボキシぺプチダ-ゼおよび D
Dぺプチダ-ゼにはより遠縁の類似性を示す。orf3(配列番号1のヌクレオチド34
15-5556)の推測上の蛋白質産物であるOrf3 (配列番号11)は別の細菌のNa/H
アンチポーターに相同性を示す。Orf3は産生株からのエポチロン放出に寄与して
いるであろう。orf4およびorf5は配列データバンクに相同体を持っていない。
配列番号1のヌクレオチド62369-63628)はチトクロームP450オキシゲナーゼに
強い配列類似性を持つ推測上の蛋白質EPOS F(配列番号8)をコードする。EPOS
FはC12, C5 および/またはC3炭素の酸化還元状態の調整に寄与しているであろ
う。orf14(配列番号1のヌクレオチド67334-68251)の推測上の蛋白質産物、Or
f 14(配列番号22)はStreptomyces coelicolorから得られ、機能が提唱され
ていない仮想上の蛋白質であるGI:3293544に強い類似性を示し、またヒト胎児肺
蛋白質であるGI:2654559に強い類似性を示す。これはまた、Methanobacterium
thermoautotrophicum からの GI:2623026 のようなカチオン排出系蛋白質には
より遠い関連性があるので、産生細胞からのエポチロンの放出にも寄与している
かも知れない。残りのORF(orf6-orfl3 および orf15)については配列データバ
ンクの資料に相同性を示すものがない。
する目的で本発明のエポチロンシンターゼ遺伝子を異種生物中で発現した。異種
発現に好適な宿主は元来ポリケチド、アクチノロジンを産生する、たとえば Str
eptomyces coelicolorのような放線菌である。この宿主での組換えPKS遺伝子発
現技術はここに参考のために引用するMcDaniel ほか著、Science、262巻:1546-
1550 (1993年);Kaoほか著、Science、265巻:509-512 (1994年);また、Holmes
ほか著、EMBO Journal、12 (8)巻:3183-3191(1993年);Bibbほか著、Gene、38
巻:215-226(1985年);ならびに米国特許第5,521,077号;米国特許第5,672,49
1号;米国特許第5,712,146号には記載がある。
スター(act)の欠失を導入する。本発明のエポチロンシンターゼ遺伝子を含む発
現プラスミドを同種組換えによってシンターゼ遺伝子がベクター内に組立てられ
るように温度感受性ドナープラスミドからDNAをE. coli(McDanielほか著、(199
3年)およびKaoほか著 (1994年))のレシピエントシャトルベクターに伝達するこ
とによって構築する。別法では、エポチロンシンターゼ遺伝子クラスターを制限
断片連結によってベクターに導入する。たとえば Kaoほか著 (1994年)に記載の
ような選択の後、Hopwoodほか著、Genetic Manipulation of Streptomycesに記
載のプロトコルに従ってベクターからのDNAをact-マイナスStreptomyces coelic
olor株に導入する。Laboratory Manual(John Innes Foundation、Norwich、英
国、1985年)を参考のためにここに引用する。この組換えストレプトマイセス株
を R2YE培地(Hopwoodほか著、(1985年))で増殖させてエポチロンを得る。別法
では本発明のエポチロンシンターゼ遺伝子をたとえば緑膿菌、バチルス、酵母、
昆虫細胞および/または大腸菌のような他の宿主生物体で発現させる。PKSおよ
び NRPS遺伝子はT7プロモーターを用いるpT7-7ベクターを使って大腸菌中に発現
させるのが好ましい。Tabor ほか著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82巻:1074
- 1078(1985年)参照。別の態様では、PKおよびNRPS遺伝子は発現ベクターpKK2
23-3およびpKK223-2を使って大腸菌中でtacまたはtrcプロモーターによる転写ま
たは翻訳融合のいずれかにより発現させる。天然にはPKS酵素の翻訳後修飾に必
要なホスホパントテン酸(P-pant)トランスフェラーゼを持たない異種宿主中で
の PKSおよびNRPS遺伝子の発現にはP-pantトランスフェラーゼとの宿主中での共
発現(Kealeyほか著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95巻:505-509 (1998年)
が必要である。
ポリケチド単離のための培養、醗酵および抽出操作法の例はここに参考のために
引用するWO 93/10121;米国特許第 5,639,949号の実施例57;Gerthほか著、J. A
ntibiotics、49巻:560-563 (1996年);1998年2月19日出願のスイス特許出願第3
96/98号;および米国特許出願第09/248,910号(Sorangium cellulosumの好適な
突然変異株も開示)に記載されている。 以下は培養された、たとえばSo ce90株のようなSorangium cellulosumからエ
ポチロンを単離するために有用な操作法であって、組換え宿主からエポチロンを
単離するためにも使用できよう。
Chemie社、Munich、ドイツ)を個別に滅菌し、接種前に 1B12 培地に添加する。
52培地(50 mLエルレンマイヤーフラスコ中)10 mLに移し、3日間、180 rpmでの
撹拌下、30℃で 25 mm 置換下にインキュベーションする。この培養物5 mLをG52
培地(200 mL エルレンマイヤーフラスコ中)45 mLに加え、3日間、180 rpmで撹
拌下、30℃で25 mm置換下にインキュベーションする。この培養物50mLをG52培地
(2 Lエルレンマイヤーフラスコ中)450 mLに加え、3日間、180 rpmで撹拌下、3
0℃で50 mm置換下にインキュベーションする。
ーフラスコ中)450 mLを加えて、オーバーシードする。 実験および発酵はすべてこの維持培養から出発して行う。
4日間、180 rpmで撹拌下、30℃で50 mm置換下にインキュベーションする。 (ii) 振盪フラスコ中での主培養: 1B12 培地プラス5 g/L 4-モルホリン-プロパンスルホン酸(MOPS)粉末(200
mL エルレンマイヤーフラスコ中)40 mLに10x濃サイクロデキストリン溶液5mLを
混合し、前培養物10 mL を接種し、5日間、180 rpmで撹拌下、30℃で50 mm置換
下にインキュベーションする。
100 L発酵も行う。前培養および中間培養物では維持培養物10% (v/v)を接種する
が、主培養物には20% (v/v) 中間培養物を接種する。重要事項:振盪培養とは対
照的に、発酵培地の成分は植菌液の容積を含む最終培養液の容積から算出する。
例えば、培地18 L + 種菌液2 Lを混合するなら20 L用の材料を秤量するが、混合
される液は 18 L である。
50 mLにそれぞれ維持培養液50 mLを接種し、4日間、180 rpmで撹拌下、30℃で 5
0 mm 置換下にインキュベーションする。
養は3-4日間継続する。条件:30℃、250 rpm、空気0.5 L/液体L/分、加圧0.5 バ
ール、pH 無調節。 100 L:G52培地90 Lを全容積150 Lの発酵機に入れ、20 L中間培養物10 Lを接
種する。培養は3-4日間継続する。条件:30℃、150 rpm、空気0.5 L/液体L/分、
加圧0.5 バール、pH 無調節。
ドロキシプロピル)-β-サイクロデキストリン溶液1 Lを添加し、20 L中間培養液
2 Lを接種する。主培養時間は6-7日で、条件は30℃、250 rpm、空気 0.5 L/液体
L/分、加圧0.5バール、pH調節H2SO4/KOHでpH 7.6 +/-0.5(すなわちpH 7.1と8.1
の間では無調節)。
2-(ヒドロキシプロピル)-β-サイクロデキストリン溶液10 Lを添加し、20L中間
培養液20 Lを接種する。主培養時間は6-7日で、条件は30℃、200 rpm、空気 0.5 L/液体L/分、加圧0.5バール、pH 調節H2SO4/KOHでpH 7.6 +/-0.5。 次に100 L醗酵での一連の接種を図式的に示す:
ドロキシプロピル)-β-サイクロデキストリン溶液50 Lを添加し、100 L中間培養
液100 Lを接種する。主培養期間は6-7日、条件:30℃、120 rpm、空気0.5 L/液
体L/分、加圧0.5 バール、pH制御H2SO4/KOHで pH 7.6+/-0.5。
as社、Frankfurt、ドイツ)2 mLと混合し、180 rpmで1時間30℃で振盪する。次
に樹脂を150 μmナイロン篩で濾過し、少量の水で洗い、フィルターとともに15
mL Nunc管に加える。 樹脂から産物の溶離:イソプロパノール(> 99%)10 mLをフィルターおよび樹
脂と共にこのチューブに加える。その後、封鎖した管を室温で30分間、Rota- Mi
xer (Labinco 社、オランダ)で振盪する。次に2 mLの液体を遠心分離し、上清
液をピペットでHPLC管に注入する。
エポチロン濃度に及ぼす影響 : サイクロデキストリンはα-D-グルコピルラノースが環状に(α-1,4)-結合し
たオリゴサッカライドで、比較的に疎水性の中心空間と親水性外部表面を持つ。 特に代表的なものを以下に記載する(括弧内の数字は分子当りグルコースユニ
ットの数を示す):α-サイクロデキストリン (6)、β-サイクロデキストリン (
7)、γ-サイクロデキストリ ン (8)、δ-サイクロデキストリン (9)、ε-サイク
ロデキストリン (10)、ζ-サイクロデキストリン (11)、η-サイクロデキストリ
ン(12)、およびθ-サイクロデキストリン (13)。δ-サイクロデキストリンおよ
び特にα-サイクロデキストリン、β-サイクロデキストリンまたはγ-サイクロ
デキストリンまたはその混合物は好適である。
、特にα-サイクロデキストリン、β-サイクロデキストリン、またはγ-サイク
ロデキストリンの誘導体であって、基本的にはヒドロキシ基1個から全部まで(
グルコース残基当り3個)がエーテル化またはエステル化されているものである
。エーテルは基本的にはアルキルエーテル、特にたとえばメチルまたはエチルエ
ーテル、またプロピルまたはブチルエーテルのような低級アルキルエーテル;た
とえばフェニルヒドロキシ低級アルキル、特にフェニルヒドロキシエチルエーテ
ルのようなアリールヒドロキシアルキルエーテル;ヒドロキシアルキルエーテル
、特にヒドロキシ低級アルキルエーテル、特に2-ヒドロキシエチル、たとえば2-
ヒドロキシプロピルのようなヒドロキシプロピル、またはたとえば2-ヒドロキシ
ブチルのようなヒドロキシブチルエーテル;カルボキシアルキルエーテル、特に
カルボキシ低級アルキルエーテル、特にカルボキシメチルまたはカルボキシエチ
ルエーテル;誘導体化カルボキシアルキルエーテル、特に誘導体化カルボキシ低
級アルキルエーテルであって、ここに誘導体化カルボキシはエーテル化またはア
ミド化カルボキシ(基本的にアミノカルボニル、モノまたはジ低級アルキルアミ
ノカルボニル、モルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノまたはピペラジノカルボニ
ルまたはアルキルオキシカルボニルである)特に低級アルコキシカルボニル低級
アルキルエーテル、例えばメチルオキシカルボニルプロピルエーテルまたはエチ
ルオキシカルボニルプロピルエーテル;スルホアルキルエーテル、特にスルホ低
級アルキルエーテル、特にスルホブチルエーテル;OH 基1個またはそれ以上が
式: -O-[alk-O-] n-H [式中、alk はアルキル、特に低級アルキルであり; n は 2 から 12、特に 2から 5、殊に 2から 3 までの全数字である] で示される基でエーテル化されたサイクロデキストリン、OH 基1個またはそれ
以上が式:
O-(alk(-R)-O-)q-alk-CO-Y であり; alk は常にアルキル、特に低級アルキルである; m、n、p、q および z は 1から 12までの全数字、好ましくは1から5まで、特
に1から3までであり;および Y は OR または NR2R3 である;ここに R1、R2 および R3 は独立にまたは各個に水素であるかまたは低級アルキルで
あるか、または R2 および R3 は結合して結合する窒素とともにモルホリノ、ピ
ペリジノ、ピロリジノまたはピペラジノを形成するか;または 他の糖分子、特にグルコシル-、ジグルコシル-(G2-β-サイクロデキストリン
)、マルトシル-またはジマルトシル-サイクロデキストリン、またはN-アセチル
グルコサミニル-} グルコサミニル、N-アセチルガラクトサミニル-またはガラク
トサミニル-とのエーテル化またはアセタールが存在して分枝サイクロデキスト
リンを形成する] で示される基でエーテル化されたサイクロデキストリンである。
たとえばアセチルエステルのような低級アルカノイルエステルである。 異なる前記のエーテルおよびエステル基が同時に2種またはそれ以上存在する
サイクロデキストリンも可能である。 サイクロデキストリンおよび/またはサイクロデキストリン誘導体の2種また
はそれ以上の混合物も存在しうる。
β-サイクロデキストリンのような、α-、β-またはγ-サイクロデキストリンま
たはその低級アルキルエーテル、または特に、たとえば2-ヒドロキシプロピル-
α-、2-ヒドロキシプロピル-β-または-2-ヒドロキシプロピル-γ-サイクロデキ
ストリンのような、そのヒドロキシ低級アルキルエーテルが注目される。
培養培地に0.02から10、より好ましくは0.05から5、特に0.1から4、例えば0.1
から2 %(w/v)の濃度で加える。
は既知の好適で製造しうる(例えば、US 3,459,731;US 4,383,992;US 4,535,1
52;US 4,659,696;EP 0 094 157;EP 0 149 197;EP 0 197 571;EP 0 300 526
;EP 0 320 032;EP 0 499 322;EP 0 503 710;EP 0 818 469;WO 90/12035;W
O 91/11200;WO 93/19061;WO 95/08993;WO 96/14090;GB 2,189,245;DE 3,11
8,218;DE 3,317,064 およびその引用文献参照。これらはサイクロデキストリン
またはサイクロデキストリン誘導体の合成も示し、またT. LoftssonとM. E. Bre
wster著、(1996年)、Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: Drug So
lubilization and Stabilisation:Journal of Pharmaceutical Science、85 (1
0)巻:1017-1025;R. A. RajewskiとV. J. Stella著、(1996年)、Pharmaceutica
l Applications of Cyclodextrins: In Vivo Drug Delivery:Journal of Pharm
aceutical Science、85 (11)巻:1142-1169;も引用する。
から購入できる。試験は200 mL振盪フラスコ中、培養容積50 mLで行った。対照
として吸着剤樹脂アンバーライト XAD-16(Rohm & Haas社、Frankfurt、ドイツ
)を入れた他は吸着剤を添加しないフラスコを用いた。5日間インキュベーショ
ンした後、HPLCによって次に表示するエポチロン力価が検出される。
キストリン、メチル-β-サイクロデキストリン)は、使用した濃度ではエポチロ
ン産生に影響がなかったか、マイナスの効果を示した。1-2%の2-ヒドロキシ-プ
ロピル-β-サイクロデキストリンおよびβ-サイクロデキストリンはサイクロデ
キストリンを使用しない例と比較して実例では6倍から8倍もエポチロンの産生を
増加する。
クロデキストリン(Wacker Chemie社、Munich、ドイツ)10 g/Lを加えた。醗酵
の進行状況を表3に示す。醗酵は6日後に終了し、後処理を行った。
サイクロデキストリン10 g/Lを加えた。発酵の進行状況を表4に示す。醗酵産物
は7日後に収集し、後処理した。
デキストリン10 g/Lを加えた。発酵の進行状況を表5に示す。醗酵産物は7日後
に収集し、後処理した。
も、その他の吸着剤も加えなかった。発酵の進行状況を表6に示す。醗酵産物は
収集も後処理も行わなかった。
離器SA-20-06型(rpm=6500)を用いて液相(遠心分離液+洗浄水=650 L)と固相
(細胞=約 15 kg)とに分離する。エポチロンの主な部分は遠心分離液に見出さ
れた。遠心分離した細胞のケーキには測定されたエポチロンの<15%を含んでお
り、それ以上の処理はしなかった。650 Lの遠心分離液を4000 L撹拌槽に入れ、1
0 LアンバーライトXAD-16(遠心液:樹脂容積比=65:1)と混合し、撹拌した。
約2時間接触の後、樹脂をHeineオーバーフロー遠心分離(バスケット容積=40 L;
rpm= 2800)で遠心分離した。樹脂を遠心分離機から出し、10-15 Lの脱イオン
水で洗浄した。脱着は樹脂を30 L ガラス撹拌器中で30 Lのイソプロパノールと3
0分間づつ2回撹拌して行った。樹脂からのイソプロパノール相の分離は吸引濾
過で行った。次に集めたイソプロパノール相に15-20 Lの水を添加してイソプロ
パノールを除去した。真空で操作する循環蒸発器(Schmid-Verdampfer社)で処
理して約10 Lの水層を得た。これを毎回10 Lの酢酸エチルで3回抽出した。抽出
は30 Lのガラス撹拌容器で行った。酢酸エチル抽出物を3-5 Lまで真空循環蒸発
器(Schmid-Verdampfer社)まで濃縮した後、ロータリーエバポレータ(Buchi
型)で真空下に濃縮乾固した。酢酸エチル抽出物50.2 gを得た。酢酸エチル抽出
物をメタノール500 mLに溶かし、折り畳みフィルターで不溶部を濾去した。溶液
を10 kg Sephadex LH 20カラム(Pharmacia社、Uppsala、スウェーデン)(カラ
ム直径20 cm、注入レベル約 1.2 m)に加えた。メタノールを溶離液として溶離
した。エポチロンAおよびエポチロンBは主に画分21-23(画分サイズ1 L)に存在
した。各画分を真空下にロータリーエバポレータ濃縮乾固した(総量9.0 g)。
これらのSephadexピーク画分(9.0 g)を次に92 mLのアセトニトリル:水;塩化
メチレン=50:40:2 に溶解し、溶液を折り畳みフィルターで濾過し、RPカラム(
装置Prepbar 200、Merck、2.0 kg LiChrospher RP-18 Merck、粒サイズ12μm、
カラム径10 cm、充填レベル42 cm、Merck社、Darmstadt、ドイツ)に加え、アセ
トニトリル:水=3:7(流速= 500 mL/分;保持時間:エポチロンA = 約 51-59
分;エポチロンB = 約60-69分)で溶離した。分別の進行は250 nmのUV検出器で
で監視した。各画分はBuchi-Rotavaporロータリーエバポレータで真空下に濃縮
乾固した。エポチロンAのピーク画分重量は700 mgで、HPLC(外部標準)による
含量は75.1 %であった。エポチロンBのピーク画分重量は1980 mgで、HPLC(外部
基準)による含量は86.6%であった。最後にエポチロンA画分(700 mg)を5 mLの
酢酸エチル:トルエン= 2:3から結晶化して170 mgのエポチロンA純結晶[HLPC
純度(面積%)=94.3%]を得た。エポチロンB画分(1980 mg)の結晶化はメタノー
ル18 mLから行い、1440 mgのエポチロンB純結晶[HPLC純度(面積%)=99.2%]を得
た。m.p. (エポチロンB):124-125 ℃; 1H-NMR(エポチロン B)500 MHz-NMR、溶媒:DMSO-d6。ピークは対 TMS 化学
シフト(多重度:s = シングレット;d = ダブレット;m = マルチプレット)、
積分値(H 数)で示す。δ ppm:7.34 (s) 1H,6.50 (s) 1H,5.28 (d) 1H,5.0
8 (d) 1H,4.46 (d) 1H,4.08 (m) 1H,3.47 (m) 1H,3.11 (m) 1H,2.83 (dd)
1H,2.64 (s) 3H,2.36 (m) 2H,2.09 (s) 3H,2.04 (m) 1H,1.83 (m) 1H,1.6
1 (m) 1H,1.47-1.24 (m) 4H,1.18 (s) 6H,1.13 (m) 2H,1.06 (d) 3H,0.89
(d + s, 重複) 6 H。H数計 = 41。
のような癌性疾患の処置に使用される。そのような抗癌製剤は例えば有効量のエ
ポチロンとともに有機または無機の、液体または固体の医薬的に適当な担体材料
1種またはそれ以上を含有する。そのような製剤は例えば経腸的に、経鼻的、経
直腸的に、経口的に、または非経口的に、殊に筋肉内または静脈内などに送達さ
れる。活性成分の用量は患者の体重、年齢、および身体的および薬力学的条件に
依存し、さらに送達法にも依存する。エポチロンは生物学的効果がタキソールと
類似しているので、癌の処置でタキソールを用いる組成物および方法でのタキソ
ールにエポチロンは替わり得るかもしれない。例えば、参考のためにここに引用
する米国特許第5,496,804号;第5,565,478号;および第5,641,803号参照。
透明な静脈内投与用濃縮物として製剤化されて供給される。この物質はポリエチ
レングリコール300(PEG300)中に製剤化され、0.9%米局方塩化ナトリウム注射
液50 mLまたは100 mLで希釈して所望薬剤の点滴用所定濃度とする。これは30 分
間単回静脈内点滴によって21日毎に(3週毎処置)6サイクルにわたって投与す
るか、または30分間単回静脈内点滴によって7日毎に(毎週処置)投与する。
g/m2、より好ましくは約0.1と約3 mg/m2、よりさらに好ましくは約0.1と約1.7 m
g/m2、最も好ましくは約0.3と約1 mg/m2の間、3週処置(3週置きまたは3週毎
投与)では用量は約0.3と約18 mg/m2、好ましくは約0.3と約15 mg/m2、より好ま
しくは約0.3と約12 mg/m2、よりさらに好ましくは約0.3と約7.5 mg/m2、なおさ
らに好ましくは約0.3と約5 mg/m2、最も好ましくは約1.0と約3.0 mg/m2の間であ
る。この用量はヒトには好ましくは2分から180分、好ましくは2分から120分、よ
り好ましくは約5分から約30分、最も好ましくは約10分から約30分、例えば30分
間にわたって静脈内投与によって投与する。
態様が可能であること、従ってそのような変化、修正および態様は本発明の実体
および範囲の中にあると見做されるべきであることは認識されるものである。
も1種のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む分離された核酸分子
を提供する。そのヌクレオチド配列は:配列番号1のヌクレオチド1900-3171の
相補鎖、配列番号1のヌクレオチド3415-5556、配列番号1のヌクレオチド7610-
11875、配列番号1のヌクレオチド7643-8920、配列番号1のヌクレオチド9236-1
0201、配列番号1のヌクレオチド10529-11428、配列番号1のヌクレオチド11549
-11764、配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド120
85-12114、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド1
2466- 2507、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチ
ド13516-13566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオ
チド13876-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレ
オチド14473-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌク
レオチド14623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌ
クレオチド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639、配列番号1の
ヌクレオチド15901-15924、配列番号1のヌクレオチド16251-21749、配列番号1
のヌクレオチド16269-17546、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号
1のヌクレオチド18855-19361、配列番号1のヌクレオチド20565-21302、配列番
号1のヌクレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド21746-43519、配列
番号1のヌクレオチド21860-23116、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配
列番号1のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド26045-26263、
配列番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド27911-28876
、配列番号1のヌクレオチド29678-30429、配列番号1のヌクレオチド30539-307
59、配列番号1のヌクレオチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド32408-3
3373、配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド35042
-35902、配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド367
73-36991、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド3
8636-39598、配列番号1のヌクレオチド39635-40141、配列番号1のヌクレオチ
ド41369-42256、配列番号1のヌクレオチド42314-43048、配列番号1のヌクレオ
チド43163-43378、配列番号1のヌクレオチド43524-54920、配列番号1のヌクレ
オチド43626-44885、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌク
レオチド46950-47702、配列番号1のヌクレオチド47811-48032、配列番号1のヌ
クレオチド48087-49361、配列番号1のヌクレオチド49680-50642、配列番号1の
ヌクレオチド50670-51176、配列番号1のヌクレオチド51534-52657、配列番号1
のヌクレオチド53697-54431、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、配列番号
1のヌクレオチド54935-62254、配列番号1のヌクレオチド55028-56284、配列番
号1のヌクレオチド56600-57565、配列番号1のヌクレオチド57593-58087、配列
番号1のヌクレオチド59366-60304、配列番号1のヌクレオチド60362-61099、配
列番号1のヌクレオチド61211-61426、配列番号1のヌクレオチド61427-62254、
配列番号1のヌクレオチド62369-63628、配列番号1のヌクレオチド67334-68251
、配列番号1のヌクレオチド1-68750:と実質的に類似のヌクレオチド配列から
なる群から選択される。
少なくとも一種をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。この
ヌクレオチド配列は:配列番号1のヌクレオチド1900-3171の相補鎖、配列番号
1のヌクレオチド3415-5556、配列番号1のヌクレオチド7610-11875、配列番号
1のヌクレオチド7643-8920、配列番号1のヌクレオチド9236-10201、配列番号
1のヌクレオチド10529-11428、配列番号1のヌクレオチド11549-11764、配列番
号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド12085-12114、配列
番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド12466-12507、配
列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13516-13566、
配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド13876-13923
、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチド14473-145
47、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオチド14623-1
4692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレオチド15724
-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639、配列番号1のヌクレオチド159
01-15924、配列番号1のヌクレオチド16251-21749、配列番号1のヌクレオチド1
6269-17546、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号1のヌクレオチ
ド18855-19361、配列番号1のヌクレオチド20565-21302、配列番号1のヌクレオ
チド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド21746-43519、配列番号1のヌクレ
オチド21860-23116、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号1のヌク
レオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド26045-26263、配列番号1のヌ
クレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド27911-28876、配列番号1の
ヌクレオチド29678-30429、配列番号1のヌクレオチド30539-30759、配列番号1
のヌクレオチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド32408-33373、配列番号
1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド35042-35902、配列番
号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド36773-36991、配列
番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド38636-39598、配
列番号1のヌクレオチド39635-40141、配列番号1のヌクレオチド41369-42256、
配列番号1のヌクレオチド42314-43048、配列番号1のヌクレオチド43163-43378
、配列番号1のヌクレオチド43524-54920、配列番号1のヌクレオチド43626-448
85、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオチド46950-4
7702、配列番号1のヌクレオチド47811-48032、配列番号1のヌクレオチド48087
-49361、配列番号1のヌクレオチド49680-50642、配列番号1のヌクレオチド506
70-51176、配列番号1のヌクレオチド51534-52657、配列番号1のヌクレオチド5
3697-54431、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、配列番号1のヌクレオチ
ド54935-62254、配列番号1のヌクレオチド55028-56284、配列番号1のヌクレオ
チド56600-57565、配列番号1のヌクレオチド57593-58087、配列番号1のヌクレ
オチド59366-60304、配列番号1のヌクレオチド60362-61099、配列番号1のヌク
レオチド61211-61426、配列番号1のヌクレオチド61427-62254、配列番号1のヌ
クレオチド62369-63628、配列番号1のヌクレオチド 67334- 68251、配列番号1
のヌクレオチド 1-68750:からなる群から選択される。
チドを少なくとも1種コードするヌクレオチド配列を含む分離された核酸分子を
提供する。そのヌクレオチド配列は:配列番号1のヌクレオチド1900-3171の相
補鎖、配列番号1のヌクレオチド3415-5556、配列番号1のヌクレオチド7610-11
875、配列番号1のヌクレオチド7643-8920、配列番号1のヌクレオチド9236-102
01、配列番号1のヌクレオチド10529-11428、配列番号1のヌクレオチド11549-1
1764、配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド12085
-12114、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド124
66-12507、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド1
3516-13566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチ
ド13876-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオ
チド14473-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレ
オチド14623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌク
レオチド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639、配列番号1のヌ
クレオチド15901-15924、配列番号1のヌクレオチド16251-21749、配列番号1の
ヌクレオチド16269-17546、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号1
のヌクレオチド18855-19361、配列番号1のヌクレオチド20565-21302、配列番号
1のヌクレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド21746-43519、配列番
号1のヌクレオチド21860-23116、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列
番号1のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド26045-26263、配
列番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド27911-28876、
配列番号1のヌクレオチド29678-30429、配列番号1のヌクレオチド30539-30759
、配列番号1のヌクレオチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド32408-333
73、配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド35042-3
5902、配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド36773
-36991、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド386
36-39598、配列番号1のヌクレオチド39635-40141、配列番号1のヌクレオチド4
1369-42256、配列番号1のヌクレオチド42314-43048、配列番号1のヌクレオチ
ド43163-43378、配列番号1のヌクレオチド43524-54920、配列番号1のヌクレオ
チド43626-44885、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレ
オチド46950-47702、配列番号1のヌクレオチド47811-48032、配列番号1のヌク
レオチド48087-49361、配列番号1のヌクレオチド49680-50642、配列番号1のヌ
クレオチド50670-51176、配列番号1のヌクレオチド51534-52657、配列番号1の
ヌクレオチド53697-54431、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、配列番号1
のヌクレオチド54935-62254、配列番号1のヌクレオチド55028-56284、配列番号
1のヌクレオチド56600-57565、配列番号1のヌクレオチド57593-58087、配列番
号1のヌクレオチド59366-60304、配列番号1のヌクレオチド60362-61099、配列
番号1のヌクレオチド61211-61426、配列番号1のヌクレオチド61427-62254、配
列番号1のヌクレオチド62369-63628、配列番号1のヌクレオチド67334-68251、
および配列番号1のヌクレオチド1-68750:からなる群から選択されたヌクレオ
チド配列の対応する連続する20、25、30、35、40、45または50(
好ましくは20)塩基対部分と配列が同一な連続する20、25、30、35、
40、45または50(好ましくは20)塩基対のヌクレオチド部分を含む。
Claims (93)
- 【請求項1】 エポチロンの生合成に関与するポリペプチド少なくとも1種
をコードするヌクレオチド配列を含む分離された核酸分子。 - 【請求項2】 該ヌクレオチド配列がミクソバクテリウムから分離される請
求項1の分離された核酸分子。 - 【請求項3】 該ミクソバクテリウムが Sorangium cellulosum である請求
項2の分離された核酸分子。 - 【請求項4】 請求項1の核酸分子と作動可能に結合する異種プロモーター
配列を含むキメラ遺伝子。 - 【請求項5】 請求項4のキメラ遺伝子を含む組換えベクター。
- 【請求項6】 請求項4のキメラ遺伝子を含む組換え宿主細胞。
- 【請求項7】 バクテリアである請求項6の組換え宿主細胞。
- 【請求項8】 放線菌である請求項7の組換え宿主細胞。
- 【請求項9】 ストレプトマイセスである請求項8の組換え宿主細胞。
- 【請求項10】 請求項1の核酸分子を含む Bac クローン。
- 【請求項11】 pEP015 である請求項10の Bac クローン。
- 【請求項12】 該ポリペプチドが:配列番号2、配列番号2のアミノ酸11
-437、配列番号2のアミノ酸543-864、配列番号2のアミノ酸974-1273、配列番
号2のアミノ酸1314-1385、配列番号3、配列番号3のアミノ酸72-81、配列番号
3のアミノ酸118-125、配列番号3のアミノ酸199-212、配列番号3のアミノ酸35
3-363、配列番号3のアミノ酸549-565、配列番号3のアミノ酸588-603、配列番
号3のアミノ酸669-684、配列番号3のアミノ酸815-821、配列番号3のアミノ酸
868-892、配列番号3のアミノ酸903-912、配列番号3のアミノ酸918-940、配列
番号3のアミノ酸1268-1274、配列番号3のアミノ酸1285-1297、配列番号3のア
ミノ酸973-1256、配列番号3のアミノ酸1344-1351、配列番号4、配列番号4の
アミノ酸7-432、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号4のアミノ酸869-1037
、配列番号4のアミノ酸1439-1684、配列番号4のアミノ酸1722-1792、配列番号
5、配列番号5のアミノ酸39-457、配列番号5のアミノ酸563-884、配列番号5
のアミノ酸1147-1399、配列番号5のアミノ酸1434-1506、配列番号5のアミノ酸
1524-1950、配列番号5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸2645-2895
、配列番号5のアミノ酸2932-3005、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号
5のアミノ酸3555-3876、配列番号5のアミノ酸3886-4048、配列番号5のアミノ
酸4433-4719、配列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸5010-508
2、配列番号5のアミノ酸5103-5525、配列番号5のアミノ酸5631-5951、配列番
号5のアミノ酸5964-6132、配列番号5のアミノ酸6542-6837、配列番号5のアミ
ノ酸6857-7101、配列番号5のアミノ酸7140-7211、配列番号6、配列番号6のア
ミノ酸35-454、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸1143-1393
、配列番号6のアミノ酸1430-1503、配列番号6のアミノ酸1522-1946、配列番号
6のアミノ酸2053-2373、配列番号6のアミノ酸2383-2551、配列番号6のアミノ
酸2671-3045、配列番号6のアミノ酸3392-3636、配列番号6のアミノ酸3673-374
5、配列番号7、配列番号7のアミノ酸32-450、配列番号7のアミノ酸556-877、
配列番号7のアミノ酸887-1051、配列番号7のアミノ酸1478-1790、配列番号7
のアミノ酸1810-2055、配列番号7のアミノ酸2093-2164、配列番号7のアミノ酸
2165-2439、配列番号8、配列番号10、配列番号11および配列番号22:か
らなる群から選択されたアミノ酸配列と実質的に類似なアミノ酸配列を含む請求
項1の分離された核酸分子。 - 【請求項13】 該ポリペプチドが:配列番号2、配列番号2のアミノ酸11
-437、配列番号2のアミノ酸543-864、配列番号2のアミノ酸974-1273、配列番
号2のアミノ酸1314-1385、配列番号3、配列番号3のアミノ酸72-81、配列番号
3のアミノ酸118-125、配列番号3のアミノ酸199-212、配列番号3のアミノ酸35
3-363、配列番号3のアミノ酸549-565、配列番号3のアミノ酸588-603、配列番
号3のアミノ酸669-684、配列番号3のアミノ酸815-821、配列番号3のアミノ酸
868-892、配列番号3のアミノ酸903-912、配列番号3のアミノ酸918-940、配列
番号3のアミノ酸1268-1274、配列番号3のアミノ酸1285-1297、配列番号3のア
ミノ酸973-1256、配列番号3のアミノ酸1344-1351、配列番号4、配列番号4の
アミノ酸7-432、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号4のアミノ酸869-1037
、配列番号4のアミノ酸1439-1684、配列番号4のアミノ酸1722-1792、配列番号
5、配列番号5のアミノ酸39-457、配列番号5のアミノ酸563-884、配列番号5
のアミノ酸1147-1399、配列番号5のアミノ酸1434-1506、配列番号5のアミノ酸
1524-1950、配列番号5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸2645-2895
、配列番号5のアミノ酸2932-3005、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号
5のアミノ酸3555-3876、配列番号5のアミノ酸3886-4048、配列番号5のアミノ
酸4433-4719、配列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸5010-508
2、配列番号5のアミノ酸5103-5525、配列番号5のアミノ酸5631-5951、配列番
号5のアミノ酸5964-6132、配列番号5のアミノ酸6542-6837、配列番号5のアミ
ノ酸6857-7101、配列番号5のアミノ酸7140-7211、配列番号6、配列番号6のア
ミノ酸35-454、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸1143-1393
、配列番号6のアミノ酸1430-1503、配列番号6のアミノ酸1522-1946、配列番号
6のアミノ酸2053-2373、配列番号6のアミノ酸2383-2551、配列番号6のアミノ
酸2671-3045、配列番号6のアミノ酸3392-3636、配列番号6のアミノ酸3673-374
5、配列番号7、配列番号7のアミノ酸32-450、配列番号7のアミノ酸556-877、
配列番号7のアミノ酸887-1051、配列番号7のアミノ酸1478-1790、配列番号7
のアミノ酸1810-2055、配列番号7のアミノ酸2093-2164、配列番号7のアミノ酸
2165-2439、配列番号8、配列番号10、配列番号11および配列番号22:か
らなる群から選択されたアミノ酸配列を含む請求項12の分離された核酸分子。 - 【請求項14】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド1900-3
171、配列番号1のヌクレオチド3415-5556、配列番号1のヌクレオチド7610-118
75、配列番号1のヌクレオチド7643-8920、配列番号1のヌクレオチド9236-1020
1、配列番号1のヌクレオチド10529-11428、配列番号1のヌクレオチド11549-11
764、配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド12085-
12114、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド1246
6-12507、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13
516-13566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド
13876-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチ
ド14473-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオ
チド14623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレ
オチド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639、配列番号1のヌク
レオチド15901-15924、配列番号1のヌクレオチド16251-21749、配列番号1のヌ
クレオチド16269-17546、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号1の
ヌクレオチド18855-19361、配列番号1のヌクレオチド20565-21302、配列番号1
のヌクレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド21746-43519、配列番号
1のヌクレオチド21860-23116、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番
号1のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド26045-26263、配列
番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド27911-28876、配
列番号1のヌクレオチド29678-30429、配列番号1のヌクレオチド30539-30759、
配列番号1のヌクレオチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド32408-33373
、配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド35042-359
02、配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド36773-3
6991、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド38636
-39598、配列番号1のヌクレオチド39635-40141、配列番号1のヌクレオチド413
69-42256、配列番号1のヌクレオチド42314-43048、配列番号1のヌクレオチド4
3163-43378、配列番号1のヌクレオチド43524-54920、配列番号1のヌクレオチ
ド43626-44885、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオ
チド46950-47702、配列番号1のヌクレオチド47811-48032、配列番号1のヌクレ
オチド48087-49361、配列番号1のヌクレオチド49680-50642、配列番号1のヌク
レオチド50670-51176、配列番号1のヌクレオチド51534-52657、配列番号1のヌ
クレオチド53697-54431、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、配列番号1の
ヌクレオチド54935-62254、配列番号1のヌクレオチド55028-56284、配列番号1
のヌクレオチド56600-57565、配列番号1のヌクレオチド57593-58087、配列番号
1のヌクレオチド59366-60304、配列番号1のヌクレオチド60362-61099、配列番
号1のヌクレオチド61211-61426、配列番号1のヌクレオチド61427-62254、配列
番号1のヌクレオチド62369-63628、配列番号1のヌクレオチド67334-68251およ
び配列番号1のヌクレオチド1-68750:の相補鎖:からなる群から選択されたヌ
クレオチド配列と実質的に類似な請求項12の分離された核酸分子。 - 【請求項15】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド1900-3
171、配列番号1のヌクレオチド 3415-5556、配列番号1のヌクレオチド7610-11
875、配列番号1のヌクレオチド 7643-8920、配列番号1のヌクレオチド 9236-1
0201、配列番号1のヌクレオチド10529-11428、配列番号1のヌクレオチド11549
-11764、配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド120
85-12114、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド1
2466-12507、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチ
ド13516-13566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオ
チド13876-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレ
オチド14473-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌク
レオチド14623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌ
クレオチド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639、配列番号1の
ヌクレオチド15901-15924、配列番号1のヌクレオチド16251-21749、配列番号1
のヌクレオチド16269-17546、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号
1のヌクレオチド18855-19361、配列番号1のヌクレオチド20565-21302、配列番
号1のヌクレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド21746-43519、配列
番号1のヌクレオチド21860-23116、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配
列番号1のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド26045-26263、
配列番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド27911-28876
、配列番号1のヌクレオチド29678-30429、配列番号1のヌクレオチド30539-307
59、配列番号1のヌクレオチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド32408-3
3373、配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド35042
-35902、配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド367
73-36991、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド3
8636-39598、配列番号1のヌクレオチド39635-40141、配列番号1のヌクレオチ
ド41369-42256、配列番号1のヌクレオチド42314-43048、配列番号1のヌクレオ
チド43163-43378、配列番号1のヌクレオチド43524-54920、配列番号1のヌクレ
オチド43626-44885、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌク
レオチド46950-47702、配列番号1のヌクレオチド47811-48032、配列番号1のヌ
クレオチド48087-49361、配列番号1のヌクレオチド49680-50642、配列番号1の
ヌクレオチド50670-51176、配列番号1のヌクレオチド51534-52657、配列番号1
のヌクレオチド53697-54431、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、配列番号
1のヌクレオチド54935-62254、配列番号1のヌクレオチド55028-56284、配列番
号1のヌクレオチド56600-57565、配列番号1のヌクレオチド57593-58087、配列
番号1のヌクレオチド59366-60304、配列番号1のヌクレオチド60362-61099、配
列番号1のヌクレオチド61211-61426、配列番号1のヌクレオチド61427-62254、
配列番号1のヌクレオチド62369-63628、配列番号1のヌクレオチド67334-68251
および配列番号1のヌクレオチド1-68750:の相補鎖:からなる群から選択され
た請求項12の核酸分子。 - 【請求項16】 請求項12の核酸分子に作動可能に結合する異種プロモー
ター配列を含むキメラ遺伝子。 - 【請求項17】 請求項16のキメラ遺伝子を含む組換えベクター。
- 【請求項18】 請求項16のキメラ遺伝子を含む組換え宿主細胞。
- 【請求項19】 バクテリアである請求項18の組換え宿主細胞。
- 【請求項20】 放線菌である請求項19の組換え宿主細胞。
- 【請求項21】 ストレプトマイセスである請求項20の組換え宿主細胞。
- 【請求項22】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド1900-3
171、配列番号1のヌクレオチド3415-5556、配列番号1のヌクレオチド7610-118
75、配列番号1のヌクレオチド7643-8920、配列番号1のヌクレオチド9236-1020
1、配列番号1のヌクレオチド10529-11428、配列番号1のヌクレオチド11549-11
764、配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド12085-
12114、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド1246
6-12507、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13
516-13566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド
13876-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチ
ド14473-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオ
チド14623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレ
オチド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639、配列番号1のヌク
レオチド15901-15924、配列番号1のヌクレオチド16251-21749、配列番号1のヌ
クレオチド16269-17546、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号1の
ヌクレオチド18855-19361、配列番号1のヌクレオチド20565-21302、配列番号1
のヌクレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド21746-43519、配列番号
1のヌクレオチド21860-23116、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番
号1のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド26045-26263、配列
番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド27911-28876、配
列番号1のヌクレオチド29678-30429、配列番号1のヌクレオチド30539-30759、
配列番号1のヌクレオチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド32408-33373
、配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド35042-359
02、配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド36773-3
6991、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド38636
-39598、配列番号1のヌクレオチド39635-40141、配列番号1のヌクレオチド413
69-42256、配列番号1のヌクレオチド42314-43048、配列番号1のヌクレオチド4
3163-43378、配列番号1のヌクレオチド43524-54920、配列番号1のヌクレオチ
ド43626-44885、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオ
チド46950-47702、配列番号1のヌクレオチド47811-48032、配列番号1のヌクレ
オチド48087-49361、配列番号1のヌクレオチド49680-50642、配列番号1のヌク
レオチド50670-51176、配列番号1のヌクレオチド51534-52657、配列番号1のヌ
クレオチド53697-54431、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、配列番号1の
ヌクレオチド54935-62254、配列番号1のヌクレオチド55028-56284、配列番号1
のヌクレオチド56600-57565、配列番号1のヌクレオチド57593-58087、配列番号
1のヌクレオチド59366-60304、配列番号1のヌクレオチド60362-61099、配列番
号1のヌクレオチド61211-61426、配列番号1のヌクレオチド61427-62254、配列
番号1のヌクレオチド62369-63628、配列番号1のヌクレオチド67334-68251およ
び配列番号1のヌクレオチド1-68750:の相補鎖:からなる群から選択されたヌ
クレオチド配列の連続する 20 塩基対部分と配列が同一な連続する20塩基対ヌク
レオチド部分を含む請求項1の分離された核酸分子。 - 【請求項23】 請求項22の核酸分子に作動可能に結合する異種プロモー
ター配列を含むキメラ遺伝子。 - 【請求項24】 請求項23のキメラ遺伝子を含む組換えベクター。
- 【請求項25】 請求項23のキメラ遺伝子を含む組換え宿主細胞。
- 【請求項26】 バクテリアである請求項25の組換え宿主細胞。
- 【請求項27】 放線菌である請求項26の組換え宿主細胞。
- 【請求項28】 ストレプトマイセスである請求項27の組換え宿主細胞。
- 【請求項29】 エポチロンシンターゼドメイン少なくとも1種をコードす
るヌクレオチド配列を含む分離された核酸分子。 - 【請求項30】 該エポチロンシンターゼドメインが:配列番号2のアミノ
酸11-437、配列番号4のアミノ酸7-432、配列番号5のアミノ酸39-457、配列番
号5のアミノ酸1524-1950、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号5のアミ
ノ酸5103-5525、配列番号6のアミノ酸35-454、配列番号6のアミノ酸1522-1946
および配列番号7のアミノ酸32-450:からなる群から選択されたアミノ酸配列に
実質的に類似なアミノ酸配列を含むβ-ケトアシルシンターゼドメインである請
求項29の分離された核酸分子。 - 【請求項31】 該β-ケトアシル-シンターゼドメインが:配列番号2のア
ミノ酸11-437、配列番号4のアミノ酸7-432、配列番号5のアミノ酸39-457、配
列番号5のアミノ酸1524-1950、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号5の
アミノ酸5103-5525、配列番号6のアミノ酸35-454、配列番号6のアミノ酸1522-
1946および配列番号7のアミノ酸32-450:からなる群から選択されたアミノ酸配
列を含む請求項30の分離された核酸分子。 - 【請求項32】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド7643-8
920、配列番号1のヌクレオチド16269-17546、配列番号1のヌクレオチド21860-
23116、配列番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド3081
5-32092、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド43
626-44885、配列番号1のヌクレオチド48087-49361、および配列番号1のヌクレ
オチド55028-56284:からなる群から選択されたヌクレオチド配列に実質的に類
似な請求項30の分離された核酸分子。 - 【請求項33】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド7643-8
920、配列番号1のヌクレオチド16269-17546、配列番号1のヌクレオチド21860-
23116、配列番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド3081
5-32092、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド43
626-44885、配列番号1のヌクレオチド48087-49361、および配列番号1のヌクレ
オチド55028-56284:からなる群から選択されたヌクレオチド配列の連続する 20
塩基対部分と配列が同一な連続する20塩基対ヌクレオチド部分を含む請求項3
0の分離された核酸分子。 - 【請求項34】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド7643-8
920、配列番号1のヌクレオチド 16269-17546、配列番号1のヌクレオチド21860
-23116、配列番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド308
15-32092、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド4
3626-44885、配列番号1のヌクレオチド48087-49361、および配列番号1のヌク
レオチド55028-56284:からなる群から選択された請求項30の分離された核酸
分子。 - 【請求項35】 該エポチロンシンターゼドメインが:配列番号2のアミノ
酸543-864、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号5のアミノ酸563-884、配
列番号5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸3555-3876、配列番号5の
アミノ酸5631-5951、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸2053
-2373および配列番号7のアミノ酸556-877:からなる群から選択されたアミノ酸
配列に実質的に類似なアミノ酸配列を含むアシル転移酵素ドメインである請求項
29の分離された核酸分子。 - 【請求項36】 該アシル転移酵素ドメインが:配列番号2のアミノ酸543-
864、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号5のアミノ酸563-884、配列番号
5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸3555-3876、配列番号5のアミノ
酸5631-5951、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸2053-2373
および配列番号7のアミノ酸556-877:からなる群から選択されたアミノ酸配列
を含む請求項35の分離された核酸分子。 - 【請求項37】 該ヌクレオチド配列が: 配列番号1のヌクレオチド 9236-10201、配列番号1のヌクレオチド17865-18827
、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号1のヌクレオチド27911-288
76、配列番号1のヌクレオチド32408-33373、配列番号1のヌクレオチド38636-3
9598、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオチド49680
-50642および配列番号1のヌクレオチド56600-57565:からなる群から選択され
たヌクレオチド配列に実質的に類似な請求項35の分離された核酸分子。 - 【請求項38】 該ヌクレオチド配列が: 配列番号1のヌクレオチド9236-10201、配列番号1のヌクレオチド17865-18827
、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号1のヌクレオチド27911-288
76、配列番号1のヌクレオチド32408-33373、配列番号1のヌクレオチド38636-3
9598、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオチド49680
-50642および配列番号1のヌクレオチド56600-57565:からなる群から選択され
たヌクレオチド配列の連続する 20 塩基対部分と配列が同一な連続的20塩基対ヌ
クレオチド部分を含む請求項35の分離された核酸分子。 - 【請求項39】 該ヌクレオチド配列が: 配列番号1の ヌクレオチド9236-10201、配列番号1のヌクレオチド17865-18827
、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号1のヌクレオチド27911-288
76、配列番号1のヌクレオチド32408-33373、配列番号1のヌクレオチド38636-3
9598、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオチド49680
-50642および配列番号1のヌクレオチド56600-57565:からなる群から選択され
た請求項35の分離された核酸分子。 - 【請求項40】 該エポチロンシンターゼドメインが:配列番号2のアミノ
酸974-1273、配列番号5のアミノ酸4433-4719、配列番号5のアミノ酸6542-6837
および配列番号7のアミノ酸1478-1790:からなる群から選択されたアミノ酸配
列に実質的に類似なアミノ酸配列を含むエノイルレダクターゼドメインである請
求項29の分離された核酸分子。 - 【請求項41】 該エノイルレダクターゼドメインが:配列番号2のアミノ
酸974-1273、配列番号5のアミノ酸4433-4719、配列番号5のアミノ酸6542-6837
および配列番号7のアミノ酸 1478-1790:からなる群から選択されたアミノ酸配
列を含む請求項40の分離された核酸分子。 - 【請求項42】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド10529-
11428、配列番号1のヌクレオチド35042-35902、配列番号1のヌクレオチド4136
9-42256および配列番号1のヌクレオチド59366-60304:からなる群から選択され
たヌクレオチド配列に実質的に類似な請求項40の分離された核酸分子。 - 【請求項43】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド10529-
11428、配列番号1のヌクレオチド35042-35902、配列番号1のヌクレオチド4136
9-42256および配列番号1のヌクレオチド59366-60304:からなる群から選択され
たヌクレオチド配列の連続する 20 塩基対部分と配列が同一な連続する 20塩基
対ヌクレオチド部分を含む請求項40の分離された核酸分子。 - 【請求項44】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド10529-
11428、配列番号1のヌクレオチド35042-35902、配列番号1のヌクレオチド4136
9-42256および配列番号1のヌクレオチド59366-60304:からなる群から選択され
た請求項40の分離された核酸分子。 - 【請求項45】 該エポチロンシンターゼドメインが:配列番号2のアミノ
酸1314-1385、配列番号4のアミノ酸1722-1792、配列番号5のアミノ酸1434-150
6、配列番号5のアミノ酸2932-3005、配列番号5のアミノ酸5010-5082、配列番
号5のアミノ酸7140-7211、配列番号6のアミノ酸1430-1503、配列番号6のアミ
ノ酸3673-3745および配列番号7のアミノ酸2093-2164:からなる群から選択され
たアミノ酸配列と実質的に類似なアミノ酸配列を含むアシルキャリアー蛋白質ド
メインである請求項29の分離された核酸分子。 - 【請求項46】 該アシルキャリアー蛋白質ドメインが:配列番号2のアミ
ノ酸1314-1385、配列番号4のアミノ酸1722-1792、配列番号5のアミノ酸1434-1
506、配列番号5のアミノ酸2932-3005、配列番号5のアミノ酸5010-5082、配列
番号5のアミノ酸7140-7211、配列番号6のアミノ酸1430-1503、配列番号6のア
ミノ酸3673-3745および配列番号7のアミノ酸2093-2164:からなる群から選択さ
れたアミノ酸配列を含む請求項45の分離された核酸分子。 - 【請求項47】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド11549-
11764、配列番号1のヌクレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド2604
5-26263、配列番号1のヌクレオチド30539-30759、配列番号1のヌクレオチド36
773-36991、配列番号1のヌクレオチド43163-43378、配列番号1のヌクレオチド
47811-48032、配列番号1のヌクレオチド54540-54758および配列番号1のヌクレ
オチド61211-61426:からなる群から選択されたヌクレオチド配列と実質的に類
似な請求項45の分離された核酸分子。 - 【請求項48】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド11549-
11764、配列番号1のヌクレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド2604
5-26263、配列番号1のヌクレオチド30539-30759、配列番号1のヌクレオチド36
773-36991、配列番号1のヌクレオチド43163-43378、配列番号1のヌクレオチド
47811-48032、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、および配列番号1のヌク
レオチド61211-61426:からなる群から選択されたヌクレオチド配列の連続する
20 塩基対部分と配列が同一な連続する20塩基対ヌクレオチド部分を含む請求項
45の分離された核酸分子。 - 【請求項49】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド11549-
11764、配列番号1のヌクレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド2604
5-26263、配列番号1のヌクレオチド30539-30759、配列番号1のヌクレオチド36
773-36991、配列番号1のヌクレオチド43163-43378、配列番号1のヌクレオチド
47811-48032、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、および配列番号1のヌク
レオチド61211-61426:からなる群から選択された請求項45の分離された核酸
分子。 - 【請求項50】 該エポチロンシンターゼドメインが:配列番号4のアミノ
酸869-1037、配列番号5のアミノ酸3886-4048、配列番号5のアミノ酸5964-6132
、配列番号6のアミノ酸2383-2551および 配列番号7のアミノ酸887-1051:から
なる群から選択されたアミノ酸配列と実質的に類似なアミノ酸配列を含むデヒド
ラターゼドメインである請求項29の分離された核酸分子。 - 【請求項51】 該デヒドラターゼドメインが:配列番号4のアミノ酸869-
1037、配列番号5のアミノ酸3886-4048、配列番号5のアミノ酸5964-6132、配列
番号6のアミノ酸2383-2551および配列番号7のアミノ酸887-1051:からなる群
から選択されたアミノ酸配列を含む請求項50の分離された核酸分子。 - 【請求項52】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド18855-
19361、配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド3963
5-40141、配列番号1のヌクレオチド50670-51176、および配列番号1のヌクレオ
チド57593-58087:からなる群から選択されたヌクレオチド配列と実質的に類似
な請求項50の分離された核酸分子。 - 【請求項53】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド18855-
19361、配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド3963
5-40141、配列番号1のヌクレオチド50670-51176、および配列番号1のヌクレオ
チド57593-58087:からなる群から選択されたヌクレオチド配列の連続する 20
塩基対部分と配列が同一な連続する20塩基対ヌクレオチド部分を含む請求項50
の分離された核酸分子。 - 【請求項54】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド18855-
19361、配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド3963
5-40141、配列番号1のヌクレオチド50670-51176、および配列番号1のヌクレオ
チド57593-58087:からなる群から選択された請求項50の分離された核酸分子
。 - 【請求項55】 該エポチロンシンターゼドメインが:配列番号4のアミノ
酸1439-1684、配列番号5のアミノ酸1147-1399、配列番号5のアミノ酸2645-289
5、配列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸6857-7101、配列番
号6のアミノ酸1143-1393、配列番号6のアミノ酸3392-3636および配列番号7の
アミノ酸1810-2055:からなる群から選択されたアミノ酸配列と実質的に類似な
アミノ酸配列を含むβ-ケトレダクターゼドメインである請求項29の分離され
た核酸分子。 - 【請求項56】 該β-ケトレダクターゼドメインが:配列番号4のアミノ
酸1439-1684、配列番号5のアミノ酸1147-1399、配列番号5のアミノ酸2645-289
5、配列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸6857-7101、配列番
号6のアミノ酸1143-1393、配列番号6のアミノ酸3392-3636および配列番号7の
アミノ酸1810-2055:からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む請求項55
の分離された核酸分子。 - 【請求項57】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド20565-
21302、配列番号1のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド2967
8-30429、配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド42
314-43048、配列番号1のヌクレオチド46950-47702、配列番号1のヌクレオチド
53697-54431および配列番号1のヌクレオチド60362-61099:からなる群から選択
されたヌクレオチド配列と実質的に類似な請求項55の分離された核酸分子。 - 【請求項58】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド20565-
21302、配列番号1のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド2967
8-30429、配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド42
314-43048、配列番号1のヌクレオチド46950-47702、配列番号1のヌクレオチド
53697-54431および配列番号1のヌクレオチド60362-61099:からなる群から選択
されたヌクレオチド配列の連続する20塩基対部分と配列が同一な連続する20塩基
対ヌクレオチド部分を含む請求項55の分離された核酸分子。 - 【請求項59】 該ヌクレオチド配列が:配列番号1のヌクレオチド20565-
21302、配列番号1のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド2967
8-30429、配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド42
314-43048、配列番号1のヌクレオチド46950-47702、配列番号1のヌクレオチド
53697-54431および配列番号1のヌクレオチド60362-61099:からなる群から選択
された請求項55の分離された核酸分子。 - 【請求項60】 該エポチロンシンターゼドメインが配列番号6のアミノ酸
2671-3045と実質的に類似なアミノ酸配列を含むメチル転移酵素ドメインである
請求項29の分離された核酸分子。 - 【請求項61】 該メチル転移酵素ドメインが配列番号6のアミノ酸2671-
3045 を含む請求項60の分離された核酸分子。 - 【請求項62】 該ヌクレオチド配列が配列番号1のヌクレオチド51534- 5
2657に実質的に類似している請求項60の分離された核酸分子。 - 【請求項63】 該ヌクレオチド配列が配列番号1のヌクレオチド51534- 5
2657の連続する20塩基対部分と配列が同一な連続する20塩基対ヌクレオチド部分
を含む請求項60の分離された核酸分子。 - 【請求項64】 該ヌクレオチド配列が配列番号1のヌクレオチド 51534-
52657である請求項60の分離された核酸分子。 - 【請求項65】 該エポチロンシンターゼドメインが配列番号7のアミノ酸
2165-2439と実質的に類似なアミノ酸配列を含むチオエステラーゼドメインであ
る請求項29の分離された核酸分子。 - 【請求項66】 該チオエステレーゼドメインが配列番号7のアミノ酸2165
-2439 を含む請求項65の分離された核酸分子。 - 【請求項67】 該ヌクレオチド配列が配列番号1のヌクレオチド61427-
62254と実質的に類似な請求項65の分離された核酸分子。 - 【請求項68】 該ヌクレオチド配列が配列番号1のヌクレオチド61427-
62254の連続する20塩基対部分と配列が同一な連続する20塩基対ヌクレオチド部
分を含む請求項65の分離された核酸分子。 - 【請求項69】 該ヌクレオチド配列が配列番号1のヌクレオチド61427-
62254である請求項65の分離された核酸分子。 - 【請求項70】 非リボソーム性ペプチド合成酵素が:配列番号3、配列番
号3のアミノ酸72-81、配列番号3のアミノ酸118-125、配列番号3のアミノ酸19
9-212、配列番号3のアミノ酸353-363、配列番号3のアミノ酸549-565、配列番
号3のアミノ酸588-603、配列番号3のアミノ酸669-684、配列番号3のアミノ酸
815-821、配列番号3のアミノ酸868-892、配列番号3のアミノ酸903-912、配列
番号3のアミノ酸918-940、配列番号3のアミノ酸1268-1274、配列番号3のアミ
ノ酸1285-1297、配列番号3のアミノ酸973-1256および配列番号3のアミノ酸134
4-1351:からなる群から選択されたアミノ酸配列と実質的に類似なアミノ酸配列
を含む非リボソーム性ペプチド合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む分
離された核酸分子。 - 【請求項71】 該非リボソーム性ペプチド合成酵素が:配列番号3、配列
番号3のアミノ酸72-81、配列番号3のアミノ酸118-125、配列番号3のアミノ酸
199-212、配列番号3のアミノ酸353-363、配列番号3のアミノ酸549-565、配列
番号3のアミノ酸588-603、配列番号3のアミノ酸669-684、配列番号3のアミノ
酸815-821、配列番号3のアミノ酸868-892、配列番号3のアミノ酸903-912、配
列番号3のアミノ酸918-940、配列番号3のアミノ酸1268-1274、配列番号3のア
ミノ酸1285-1297、配列番号3のアミノ酸973-1256および配列番号3のアミノ酸1
344-1351:からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む請求項70の分離され
た核酸分子。 - 【請求項72】 該ヌクレオチド配列が: 配列番号1のヌクレオチド11872- 16104、配列番号1のヌクレオチド12085-1211
4、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド12466-12
507、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13516-
13566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド1387
6-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチド14
473-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオチド
14623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレオチ
ド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639および配列番号1のヌク
レオチド15901-15924:からなる群から選択されたヌクレオチド配列と実質的に
類似な請求項70の分離された核酸分子。 - 【請求項73】 該ヌクレオチド配列が: 配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド12085-12114
、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド12466-125
07、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13516-1
3566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド13876
-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチド144
73-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオチド1
4623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレオチ
ド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639および配列番号1のヌク
レオチド15901-15924:からなる群から選択されたヌクレオチド配列の連続する2
0塩基対部分と配列が同じ連続する20塩基対ヌクレオチド部分を含む請求項70
の分離された核酸分子。 - 【請求項74】 該ヌクレオチド配列が: 配列番号1のヌクレオチ11872-16104、配列番号1のヌクレオチド 12085-12114
、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド12466-125
07、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13516-1
3566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド13876
-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチド144
73-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオチド1
4623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレオチ
ド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639および配列番号1のヌク
レオチド15901-15924:からなる群から選択された請求項70の分離された核酸
分子。 - 【請求項75】 (a) 請求項4のキメラ遺伝子を宿主に導入すること; および(b) 宿主中でエポチロンの生合成を起す条件下に宿主を増殖させること;
を含む組換え宿主中でエポチロンを異種発現する方法。 - 【請求項76】 (a) 請求項75の方法により組換え宿主中でエポチロン
を発現すること;および (b) 組換え宿主からエポチロンを抽出すること;を含
むエポチロンを製造する方法。 - 【請求項77】 エポチロンシンターゼドメインからなるアミノ酸配列を含
む分離されたポリペプチド。 - 【請求項78】 該エポチロンシンターゼドメインが:配列番号2のアミノ
酸11-437、配列番号4のアミノ酸7-432、配列番号5のアミノ酸39-457、配列番
号5のアミノ酸1524-1950、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号5のアミ
ノ酸5103-5525、配列番号6のアミノ酸35-454、配列番号6のアミノ酸1522-1946
および配列番号7のアミノ酸32-450:からなる群から選択されたアミノ酸配列と
実質的に類似なアミノ酸配列を含むβ-ケトアシルシンターゼドメインである請
求項77の分離されたポリペプチド。 - 【請求項79】 該β-ケトアシルシンターゼドメインが:配列番号2のア
ミノ酸11-437、配列番号4のアミノ酸7-432、配列番号5のアミノ酸39-457、配
列番号5のアミノ酸1524-1950、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号5の
アミノ酸5103-5525、配列番号6のアミノ酸35-454、配列番号6のアミノ酸1522-
1946および配列番号7のアミノ酸32-450:からなる群から選択されたアミノ酸配
列を含む請求項78の分離されたポリペプチド。 - 【請求項80】 該エポチロンシンターゼドメインが:配列番号2のアミノ
酸543-864、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号5のアミノ酸563-884、配
列番号5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸3555-3876、配列番号5の
アミノ酸5631-5951、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸2053
-2373および配列番号7のアミノ酸556-877:からなる群から選択されたアミノ酸
配列と実質的に類似なアミノ酸配列を含むアシル転移酵素ドメインである請求項
77の分離されたポリペプチド。 - 【請求項81】 該アシル転移酵素ドメインが:配列番号2のアミノ酸543-
864、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号5のアミノ酸563-884、配列番号
5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸3555-3876、配列番号5のアミノ
酸5631-5951、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸2053-2373
および配列番号7のアミノ酸556-877:からなる群から選択されたアミノ酸配列
を含む請求項80の分離されたポリペプチド。 - 【請求項82】 該エポチロンシンターゼドメインが:配列番号2のアミノ
酸974-1273、配列番号5のアミノ酸4433-4719、配列番号5のアミノ酸6542-6837
および配列番号7のアミノ酸1478-1790:からなる群から選択されたアミノ酸配
列と実質的に類似なアミノ酸配列を含むエノイルレダクターゼドメインである請
求項77の分離されたポリペプチド。 - 【請求項83】 該エノイルレダクターゼドメインが:配列番号2のアミノ
酸974-1273、配列番号5のアミノ酸4433-4719、配列番号5のアミノ酸6542-6837
および配列番号7のアミノ酸1478-1790:からなる群から選択されたアミノ酸配
列を含む請求項82の分離されたポリペプチド。 - 【請求項84】 該エポチロンシンターゼドメインがアシルキャリアー蛋白
質ドメインであって、そのポリペプチドが:配列番号2のアミノ酸1314-1385、
配列番号4のアミノ酸1722-1792、配列番号5のアミノ酸1434-1506、配列番号5
のアミノ酸2932-3005、配列番号5のアミノ酸5010-5082、配列番号5のアミノ酸
7140-7211、配列番号6のアミノ酸1430-1503、配列番号6のアミノ酸3673-3745
および配列番号7のアミノ酸2093-2164:からなる群から選択されたアミノ酸配
列と実質的に類似なアミノ酸配列を含む請求項77の分離されたポリペプチド。 - 【請求項85】 該アシルキャリアー蛋白質ドメインが:配列番号2のアミ
ノ酸1314-1385、配列番号4のアミノ酸1722-1792、配列番号5のアミノ酸1434-1
506、配列番号5のアミノ酸2932-3005、配列番号5のアミノ酸5010-5082、配列
番号5のアミノ酸7140-7211、配列番号6のアミノ酸1430-1503、配列番号6のア
ミノ酸3673-3745および配列番号7のアミノ酸2093-2164:からなる群から選択さ
れたアミノ酸配列を含む請求項84の分離されたポリペプチド。 - 【請求項86】 該エポチロンシンターゼドメインが:配列番号4のアミノ
酸869-1037、配列番号5のアミノ酸3886-4048、配列番号5のアミノ酸5964-6132
、配列番号6のアミノ酸2383-2551および配列番号7のアミノ酸887-1051:から
なる群から選択されたアミノ酸配列と実質的に類似なアミノ酸配列を含むデヒド
ラターゼドメインである請求項77の分離されたポリペプチド。 - 【請求項87】 該デヒドラターゼドメインが:配列番号4のアミノ酸869-
1037、配列番号5のアミノ酸3886-4048、配列番号5のアミノ酸5964-6132、配列
番号6のアミノ酸2383-2551および配列番号7のアミノ酸887-1051:からなる群
から選択されたアミノ酸配列を含む請求項86の分離されたポリペプチド。 - 【請求項88】 該エポチロンシンターゼドメインが:配列番号4のアミノ
酸1439-1684、配列番号5のアミノ酸1147-1399、配列番号5のアミノ酸2645-289
5、配列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸6857-7101、配列番
号6のアミノ酸1143-1393、配列番号6のアミノ酸3392-3636および配列番号7の
アミノ酸1810-2055:からなる群から選択されたアミノ酸配列と実質的に類似な
アミノ酸配列を含むβ-ケトレダクターゼドメインである請求項77の分離され
たポリペプチド。 - 【請求項89】 該β-ケトレダクターゼドメインが:配列番号4のアミノ
酸1439-1684、配列番号5のアミノ酸1147-1399、配列番号5のアミノ酸2645-289
5、配列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸6857-7101、配列番
号6のアミノ酸1143-1393、配列番号6のアミノ酸3392-3636および配列番号7の
アミノ酸1810-2055:からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む請求項88
の分離されたポリペプチド。 - 【請求項90】 該エポチロンシンターゼドメインが配列番号6のアミノ酸
2671-3045と実質的に類似なアミノ酸配列を含むメチル転移酵素ドメインである
請求項77の分離されたポリペプチド。 - 【請求項91】 該メチル転移酵素ドメインが配列番号6のアミノ酸2671-
3045を含む請求項90の分離されたポリペプチド。 - 【請求項92】 該エポチロンシンターゼドメインが配列番号7のアミノ酸
2165-2439 と実質的に類似なアミノ酸配列を含むチオエステラーゼドメインであ
る請求項77の分離されたポリペプチド。 - 【請求項93】 該チオエステラーゼドメインが配列番号7のアミノ酸2165
-2439 を含む請求項77の分離されたポリペプチド。
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