JP2006061166A - エポチロン生合成用遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Sorangium cellulosum からエポチロンの生合成に必要なポリペプチドをコードする核酸分子が分離される。本発明の遺伝子で形質転換した組換え宿主中でエポチロンを生産する方法を開示する。このようにして、精製およびたとえば癌の処置のような医薬製剤中での使用を可能にするには十分に多量なエポチロンを製造できる。
【選択図】なし
Description
本発明は一般にポリケチドおよびその合成のための遺伝子に関する。特に、本発明は Sorangium cellulosum から得られ、エポチロン A および B の生合成に必要な新規ポリケチドシンターゼおよび非リボソーム性ペプチドシンターゼ遺伝子の分離および確認に関する。
ポリケチドは炭素2個のビルディングブロックから合成される化合物で、そのβ−炭素は常にケト基を持つのでポリケチドと名付けられている。これらの化合物には多数の重要な抗生物質、免疫抑制剤、癌化学療法剤、その他の広範囲な生物学的特性を持つ化合物を含む。無数の構造的多様性はポリケチド鎖長の多様性、導入される側鎖の多様性(2炭素ビルディングブロックの部分として、またはポリケチド骨格形成後のいずれかについて)、および該基の立体化学からから誘導される。ケト基はまた還元されてヒドロキシル、エノイルを与えるか、または完全に除去されることもある。2炭素付加の各段階は脂肪酸生合成と同様にポリケチドシンターゼ(PKS)と呼ばれる酵素複合体によって行われる。
エポチロンの抗癌剤としての有望さにも拘らず、これら化合物の生産に関する問題点が商業的潜在能力を減殺している。これらの化合物は工業的規模で化学合成をするには複雑過ぎるので、醗酵によって生産しなければならない。たとえば Sorangium cellulosum のようなミクソバクテリアの遺伝子操作についての技術はここに参考のために引用する米国特許第5,686,295号に記載されている。しかしながら、Sorangium cellulosum の発酵は著しく困難なので、エポチロンの産生レベルは低い。もっと醗酵に適する異種宿主でのエポチロンの組換え生産が現存する生産上の問題点を解決できると推測した。しかしながら、エポロチン生合成を行うポリペプチドをコードする遺伝子はまだ分離されていなかった。さらに、エポチロンを産生する株、すなわち So ce90 株、は別のポリケチド少なくとも一種、スピランギエン、も産生し、これがエポチロンの生合成に特異的な遺伝子の分離を大いに複雑化するものと思われた。
前記の目的およびその他の目的に加え、本発明は意外にもエポチロンの生合成に関与するポリペプチドの少なくとも一種をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を初めて提供することによって前記困難性を克服する。好適な態様においては、そのヌクレオチド配列はミクソバクテリア、最も好ましくは Sorangium cellulosumに属する種から分離される。
本発明を記載するに当り、以下の定義を意図して次の用語を採用する。
連携/作動可能に結合:物理的にまたは機能的に関連する2個のDNA配列を示す。例えば、その2個の配列が作動可能に結合しているか、またはコードDNA配列または構造DNA配列の発現レベルに影響を与えるように位置しているならプロモーターまたは調節DNA配列はRNAまたは蛋白質をコードするDNA 配列と「連携」している。
コードDNA配列:生物中で翻訳されて蛋白質を産生するDNA配列。
エポチロン:16員環のマクロ環ポリケチド。天然にはバクテリアである Sorangium cellulosum の Soce 90 株が産生する。この物質はタキソールの生物学的効果と似た効果を示す。本明細書では「エポチロン」は一群のポリケチドを示し、エポチロンAおよびエポチロンBならびにたとえばWO 98/25929に記載のようなその誘導体が含まれる。
遺伝子:ゲノム内に存在する一定の領域であって、前記のコードDNA配列のほかに主として発現の調節すなわちコード部分の転写および翻訳の制御を行うDNA配列も含む。
同種DNA配列:導入される宿主細胞にとって天然に関連のあるDNA配列。
同種組換え:同種DNA分子間で行われるDNA断片の相互の交換。
分離された:本発明の文脈では、分離された核酸分子または分離された酵素は核酸分子または酵素であって、人の手でその在来の環境から離れて存在する。それ故、天然産物ではない。分離された核酸分子または酵素は精製された形で存在しても、例えば組換え宿主細胞のような非在来の環境内に存在してもよい。
核酸分子:いずれかの起源から分離できる単鎖または二重鎖DNAまたはRNAの線状セグメント。本発明では核酸分子は好ましくはDNAのセグメントである。
PKS:ポリケチドシンターゼ。例えばケトレダクターゼ、デヒドラターゼ、アシルキャリアー蛋白質、エノイルレダクターゼ、ケトアシルACPシンターゼおよびアシル転移酵素などを含む、ポリケチドの生合成を行う酵素活性複合体(ドメイン)。機能性 PKS はポリケチドの合成を触媒する。
形質転換/トランスジェニック/組換え:たとえば異種核酸分子を導入したバクテリアのような宿主生物を示す。核酸分子は宿主のゲノムまたは核酸分子に安定に組込むことができ、またはその核酸分子を染色体外に存在させることもできる。この染色体外分子は自己複製が可能である。形質転換した細胞、組織または植物は形質転換過程の最終目的物ばかりでなく、トランスジェニックな子孫をも含むものと理解される。「非形質転換」、「非トランスジェニック」または「非組換え」宿主は異種核酸分子を含まないバクテリアのような野生型生物を示す。
配列番号1はエポチロン生合成遺伝子を含むオープン読取り枠(ORF)22個を含む 68750 bpのコンティグのヌクレオチド配列である。
配列番号2はepoA(配列番号1のヌクレオチド7610-11875)がコードするI型ポリケチドシンターゼ(EPOS A)の蛋白質配列である。
配列番号3はepoP(配列番号1のヌクレオチド11872-16104)がコードする非リボソーム性ペプチド合成酵素(EPOS P)の蛋白質配列である。
配列番号4はepoB(配列番号1のヌクレオチド16251-21749)がコードするI型ポリケチドシンターゼ(EPOS B)の蛋白質配列である。
配列番号5はepoC (配列番号1のヌクレオチド21746-43519)がコードするI型ポリケチドシンターゼ(EPOS C)の蛋白質配列である。
配列番号6はepoD (配列番号1のヌクレオチド43524-54920)がコードするI型ポリケチドシンターゼ (EPOS D)の蛋白質配列である。
配列番号7はepoE (配列番号1のヌクレオチド54935-62254)がコードするI型ポリケチドシンターゼ(EPOS E)の蛋白質配列である。
配列番号8はepoF(配列番号1のヌクレオチド62369-63628)がコードするチトクローム P450 酸化酵素ホモローグ(EPOS F)の蛋白質配列である。
配列番号9はorf1(配列番号1のヌクレオチド1-1826)がコードする部分的な蛋白質配列(部分Orf1)である。
配列番号11はorf3(配列番号1のヌクレオチド3415-5556)がコードする蛋白質配列(Orf3)である。
配列番号12はorf4(配列番号1の逆方向相補鎖上のヌクレオチド5992-5612)がコードする蛋白質配列(Orf4)である。
配列番号13はorf5(配列番号1のヌクレオチド6226-6675)がコードする蛋白質配列(Orf5)である。
配列番号14はorf6(配列番号1のヌクレオチド63779-64333)がコードする蛋白質配列(Orf6)である。
配列番号15はorf7(配列番号1の逆方向相補鎖上のヌクレオチド64290- 63853)がコードする蛋白質配列(Orf7)である。
配列番号17はorf9(配列番号1の逆方向相補鎖上のヌクレオチド64727- 64287)がコードする蛋白質配列(Orf9)である。
配列番号18はorf10(配列番号1のヌクレオチド65063-65767)がコードする蛋白質配列(Orf10)である。
配列番号19はorf11(配列番号1の逆方向相補鎖上のヌクレオチド65874- 65008)がコードする蛋白質配列(Orf11)である。
配列番号20はorfl2(配列番号1の逆方向相補鎖上のヌクレオチド66338- 65871)がコードする蛋白質配列(Orf12)である。
配列番号21はorf13(配列番号1のヌクレオチド66667-67137)がコードする蛋白質配列(Orf13)である。
配列番号23はorf15(配列番号1のヌクレオチド68346-68750)がコードする部分的蛋白質配列(partial Orf15)である。
配列番号24はユニバーサル逆方向PCRプライマー配列である。
配列番号25はユニバーサル正方向PCRプライマー配列である。
配列番号26はNH24端末 "B" PCRプライマー配列である。
配列番号27はNH2端末 "A" PCRプライマー配列である。
配列番号28はNH2端末 "B" PCRプライマー配列である。
配列番号29はpEPO15-NH6端末 "B" PCRプライマー配列である。
配列番号30はpEPO15-H2.7端末 "A" PCRプライマー配列である。
以下の材料はイリノイ州61604、ペオリア、ノースユニバーシティ−ストリート1815所在のAgricultural Research Service 特許培養物コレクション(NRRL)に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定の下に寄託した。寄託物の入手に関する全制限は特許付与時に取消不能に解除される。
寄託材料 受託番号 寄託日
pEP015 NRRL B-30033 1998年6月11日
pEP032 NRRL B-30119 1999年4月16日
エポチロンの生合成に関与する遺伝子は本発明の技術を使用して分離できる。エポチロン生合成遺伝子の分離のための好ましい操作はエポチロンAおよびBを産生することが確認されている生物からのゲノムDNAの分離、および分離したDNAを適当なプラスミドまたはベクターに入れて正常にはポリケチドを産生しない宿主生物に移すことが必要であり、続いて形質転換されてエポチロン産生能が与えられた宿主コロニーを確認することが必要である。たとえばλ::Tn5トランスポゾン突然変異誘発(de Bruijn & Lupski, 著、Gene、27巻:131-149 (1984年))のような技術を用いることによってエポチロンを与えるDNAで形質転換された正確な領域をより精密に決定できる。別法としてまたは付加的に、形質転換されたエポチロンを与えるDNAをより小さい断片に切断し、エポチロンを与える性能を持つ最小のものをさらに確認できる。エポチロンを産生する性能を持たない宿主生物は、一方ではポリケチドを誘導する生物とは異なる種であるが、この技術の変型には突然変異誘発によってエポチロン産生性能を破壊された同種の宿主における宿主DNAの形質転換も含む。この方法では、エポチロンを産生する生物を突然変異誘発させてエポチロン非産生突然変異体を分離する。次にこれをエポチロン産生親株から分離したゲノムDNAで補完する。
好適なプローブ分子はソラフェンPKS(米国特許第5,716,849号)の第4モジュールにあるケトシンターゼドメインをコードする 1.2 kb SmaI DNA 断片を含む。さらに、より好適なプローブ分子はリファマイシンPKSの第一および第二モジュール(Schupp など著、FEMS Microbiology Letters 159: 201-207 (1998))から得られるβ-ケトアシルシンターゼドメインを含む。これらはエポチロンの生合成を行うPKS遺伝子を分離するためのエポチロン産生微生物の遺伝子ライブラリーをプローブするために使用できる。
分離されたエポチロン生合成遺伝子は在来の宿主でできるよりも大きな効率で異種宿主中でのポリケチド産生を可能にする発現ができる。これらの遺伝子操作技術は入手可能な種々な宿主毎に特異的であって、当技術分野では公知である。例えば、異種遺伝子はたとえばここに参考のために引用する、McDaniel ほか著、Science、262巻:1546-1550(1993年)および Kaoほか著、Science、265巻:509-512 (1994年)に記載されている技術を用いてストレプトマイセス属およびその他の放線菌に発現させることができる。またここに参考のために引用する Roweほか著、Gene、216巻:215-223(1998年);Holmes ほか著、EMBO Journal、12(8)巻:3183-3191(1993年);および Bibbほか著、Gene、38巻:215-226(1985年)も参照。
実験の部
さらに以下の詳細な実施例を参照して本発明を記述する。これらの実施例は例示目的のためにのみ提供するものであって、特に指定しない限り限定を意図したものではない。ここに使用する標準的な組換えDNA技術および分子クローニング技術は当技術分野でよく知られており、Ausubel(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons刊(1994年);T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook著、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor laboratory刊、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989年)およびT. J. Silhavy, M. L. Berman, L. W. Enquist著、「Experiments with Gene Fusions」、Cold Spring Harbor Laboratory刊、Cold Spring Harbor, N.Y.(1984年)に記載されている。
Sorangium cellulosum 90株(DSM 6773, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen、Braunschweig)をSolE培地(0.35%グルコース、0.05%トリプトン、0.15% MgS04・7H20、0.05% 硫酸アンモニウム、0.1% CaCl2、0.006% K2HP04、0.01% ジチオン酸ナトリウム、0.0008% Fe-EDTA、1.2% HEPES、S. cellulosum滅菌静置培養物の3.5%(v/v)上清液)pH ad. 7.4の寒天プレートに塗布し、増殖(30℃)させる。1cm2 から得た細胞を釣り上げ、G51t 液体培地(0.2% グルコース、0.5%澱粉、0.2% トリプトン、0.1% プロビンS、0.05% CaCl2・2H20、0.05% MgS04・7H20、1.2% HEPES、pH ad. 7.4)5 mLに接種し、225 rpm で振盪しながら30℃でインキュベーションする。4日後に培養物をG51t 50 mL に移し、前記の通り5日間インキュベーションする。この培養物を用いてG51t 500 mLに接種し、前記のように6日間インキュベーションする。この培養物を4000 rpmで10 分間遠心分離し、細胞ペレットをG51t 50 mLに再懸濁する。
Bac ライブラリーを作製するために、前記の実施例1に記載のように培養した S. cellulosum細胞をアガロースブロックに置き、溶菌し、分離されたゲノムDNA を制限酵素HindIIIで部分的に消化する。消化したDNAをアガロースゲル上のパルス電界電気泳動によって分離する。大きな(約90-150 kb)DNA断片をアガロースゲルから分離し、ベクターpBelobacIIに連結する。pBelobacIIはクロラムフェニコール耐性をコードする遺伝子、適当な培地上で青色/白色選択を提供するlacZ遺伝子の多重クローニング部位、ならびに複製および1細胞当り1コピーまたは2コピーのプラスミドの維持に必要な遺伝子を含む。連結混合物を使用して電気応答能のあるEscherichia coli DH10B細胞を標準的な電気穿穴技術によって形質転換する。クロラムフェニコール耐性組換えコロニー(白色、lacZ突然変異体)をプラス荷電ナイロン膜フィルター384 3X3のグリッドフォーマットに移す。クローンを溶菌し、DNAをフィルターに交差結合する。同じクローンを液体培養物として−80℃で保存する。
Bacライブラリーフィルターを標準的サザンハイブリッド形成法によって精査する。使用したDNAプローブはリファマイシンポリケチドシンターゼの第一および第二モジュールからのβ-ケトアシルシンターゼドメイン(Schuppほか著、FEMS Microbiology Letters、159巻:201-207 (1998年))をコードする。プローブのDNAは各ケトシンターゼドメインに隣接するプライマーで鋳型にプラスミドpNE95(pNE95はSchupp et al. (1998年)が記載したコスミド2に等しい)を用いるPCRによって作製する。PCR-増幅された DNA 25 ngを0.5% アガロースゲルから分離し、ランダムプライマー標識キット(Gibco-BRL、Bethesda、MD、米国)を製造社の仕様に従って、32P-dCTPで標識する。ハイブリッド形成は65℃で36時間行い、膜は高ストリンジェンシーで洗浄する(0.1xSSCおよび0.5%SDS、20 分間、65℃、3回)。標識したブロットは螢光スクリーンに暴露し、シグナルを Phospholmager 445SI(Molecular Dynamics 社製スクリーンおよび445SI)で検出する。これである種のBacクローンが本プローブに強いハイブリッド形成を起す。このクローンを選択し、Luria培地(LB)5 mL中、37℃で一夜培養する。目的とするBacクローンから得たBac DNAを典型的な微量製造操作によって分離する。細胞をリゾチーム溶液(50mM-グルコース、10mM-EDTA、25mM-Tris-HCl、5mg/mL リゾチーム)200μLに再懸濁し、溶菌液 (0.2N-NaOHと2% SDS)400μLで溶菌し、蛋白質を(3.0 M-酢酸カリウム、酢酸でpH5.2に調節)で沈殿させ、Bac DNAをイソプロパノールで沈殿させる。DNAをヌクレアーゼ不含蒸留水20μLに再懸濁し、BamHI(New England Biolabs 社)で制限し、0.7%アガロースゲルで分離する。ゲルを前記のようにサザンハイブリッド形成でブロットし、ソラフェンポリケチドシンターゼの第4モジュールにあるケトシンターゼドメイン(米国特許第5,716,849号参照)をコードする 1.2 kb SmaI DNA断片をプローブとして前記条件下に精査する。異なるハイブリッド形成パターン5種が見出される。5種のパターンを表すクローン各1種を選択して、各々 pEP015、pEP020、pEP030、pEP031、および pEP033と命名した。
選択したBacクローン5種のDNAをBamHIで消化し、ランダム断片をBamHI部位でpBluescript II SK+ (Stratagene 社) にサブクローニングする。大きさが 2 kbと10 kbとの間の挿入物を持つサブクローンを選択して挿入体の結合端末を配列決定し、また、1.2 SmaIプローブで前記の通りに精査する。既知のポリケチドシンターゼーゼに高度な配列相同性を示すか、および/またはソラフェンのケトシンターゼドメインと強いハイブリッドを形成するサブクローンを遺伝子破壊実験に使用する。
液体培地 G52-H(0.2% 酵母エキス、0.2% 脱脂ソヤミール、0.8% バレイショ澱粉、0.2% グルコース、0.1% MgSO4・7H2O、0.1% CaCl2x2H20、0.008% Fe-EDTA、KOHでpH ad 7.4)で作成した Sorangium cellulosum So ce90株の3日培養物0.1 mL をストレプトマイシン100μg/mL添加SolE培地を含む寒天プレート上に塗布する。プレートを30℃で2週間インキュベーションする。この培地で増殖するコロニーはストレプトマイシン耐性突然変異体であって、これを再度精製のために同じストレプトマイシン含有寒天培地に塗布し、培養する。これらのストレプトマイシン耐性突然変異体の1種を選択してBCE28/2と命名した。
前記の選択したBacクローン5種から作製したサブクローンの BamHI 挿入体を分離し、プラスミドpCIB132(米国特許第5,716,849号参照)の独特なBamHI部位に連結する。挿入体を有するこのpCIB132誘導体でヘルパープラスミドpUZ8(Hedges and Matthew 著、Plasmid、2巻:269-278(1979年)を含むEscherichia coli ED8767を形質転換する。この形質転換体をSorangium cellulosum BCE28/2をレシピエントとする接合実験のドナーに用いる。接合には液体培地G51b(G51b はトリプトン置換ペプトンG51t培地)中、30℃の早期定常期静置培養物(約5x108細胞/mLまで)からの Sorangium cellulosum BCE28/2の5-10x109 細胞とサブクローニングしたBamHI断片およびヘルパープラスミドpUZ8を有するpCIB132誘導体を含むE. coli ED8767の後期対数期培養物(LB液体培地中)とを細胞比1:1で混合する。細胞の混合物を次に4000 rpmで10分間遠心分離し、G51b培地0.5 mLに再懸濁する。この細胞懸濁液の1滴を次にカナマイシン 50 mg/L を含むSolE寒天プレートの中央に塗布する。30℃で24時間インキュベーション後に得られた細胞を収集し、G51b培地0.8 mLに再懸濁し、この懸濁液0.1から0.3 mLをフレオマイシン(30 mg/L)、ストレプトマイシン(300 mg/L)およびカナマイシン(50 mg/L)を含む選択SolE固形培地に塗布する。ストレプトマイシンによってドナー大腸菌株の逆選択が起きる。この選択培地上、温度30℃で8-12日インキュベーション後に増殖したコロニーをプラスチックループで分離し、同じ寒天培地上に塗布し、培養して2回目の選択と精製を行う。この選択寒天培地に温度30℃で7日後に増殖していたコロニー由来培養物は、サブクローニングされたBamHI断片を持つpCIB132誘導体の接合伝達によってフレオマイシン耐性を獲得したSorangium cellulosum BCE28/2のトランス接合体である。
2回目の選択(実施例6参照)に用いた選択So 1E プレート表面約1 cm2 にトランス接合体細胞を増殖させ、滅菌プラスチックループを用いて50 mLエルレンマイヤーフラスコ中のG52-H培地10 mLに移植する。30℃、180 rpmで3日間インキュベーションした後、培養物を200 mLエルレンマイヤーフラスコ中のG52-H 培地50 mLに移植する。30℃、180 rpmで4-5日間インキュベーション後、この培養物10 mLを200 mLエルレンマイヤーフラスコ中の23B3培地(0.2 % グルコース、2 % ポテトスターチ、1.6 % 脱脂ソヤミール、0.0008 % Fe-EDTA ナトリウム塩、0.5 % HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸)、2 % v/vポリスチロール樹脂XAD16(Rohm & Haas社)、pHはNaOHで7.8に調整)50 mLに移植する。
A.プラスミド pEP015-21 の BamHI 挿入体
Escherichia coli DH10B [pEP015-21] 株からプラスミドDNAを分離し、pEP0 15-21の2.3-kb BamHI挿入体のヌクレオチド配列を決定する。自動化DNA配列決定は二重鎖DNA鋳型上でのジデオキシヌクレオチド鎖終結法によってApplied Biosystems 社の377型配列決定装置を用いて行う。使用したプライマーはユニバーサル逆方向プライマー(5'GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3'(配列番号24))およびユニバーサル正方向プライマー(5'GTA AAA CGA CGG CCA GT 3'(配列番号: 25))である。次回の配列決定反応では前回に決定した配列の3'末端用に設計して注文合成したオリゴヌクレオチドを用いてコンティグを伸長し、結合する。両鎖を完全に配列決定し、各ヌクレオチドは少なくとも2回配列決定する。ヌクレオチド配列をプログラムSequencher 3.0 版(Gene Codes 社)に集積し、ウィスコンシン大学遺伝子学電算機グループのプログラムを用いて解析する。2213-bp挿入体のヌクレオチド配列は配列番号1のヌクレオチド20779-22991に対応する。
Escherichia coli DH10B株[pEP015-4-1]からプラスミドDNAを分離して、pEP015-4-1中の3.9-kb BamHI挿入体のヌクレオチド配列を前項のAに記載のようにして決定する。3909-bp挿入体のヌクレオチド配列は配列番号1のヌクレオチド16876-20784に対応する。
Escherichia coli DH10B株[pEP015-4-5]からプラスミドDNAを分離して、pEP015-4-5中の2.3-kb BamHI挿入体のヌクレオチド配列を前項Aに記載のようにして決定する。2233-bp挿入体のヌクレオチド配列は配列番号1のヌクレオチド42528-44760に対応する。
pEP015を制限酵素HindIIIで完全に消化し、得られた断片をHindIIIで切断しておいたpBluescript II SK- または予めHindIIIで切断し、ウシ小腸アルカリホスファターゼで脱ホスホリル化しておいたpNEB193(New England Biolabs 社)にサブクローニングする。クローン6種の異なるを作製して、pEP015-NH1、 pEP015-NH2、pEP015-NH6およびpEP015-NH24(全てpNEB193由来)、ならびにpEP015-H2.7およびpEP015-H3.0 と命名した(共にpBluescript II SK-由来)。
NH2 末端 "A": AGCGGGAGCTTGCTAGACATTCTGTTTC(配列番号27)および
NH2 末端 "B":GACGCGCCTCGGGCAGCGCCCCAA(配列番号28)
はこれらの配列に基づいて設計し、pEP015 での増幅反応および別の実験で、Sorangium cellulosum So ce90のゲノムDNAを鋳型とする増幅反応に使用する。両鋳型についてNH24末端"B"とNH2末端 "A"とのプライマー対で特異的な増幅が見出された。増幅体をpBluescript II SK- にクローニングし、完全な配列決定を行った。増幅体の配列は同一であり、HindIII部位で融合したpEP015-NH24およびpEP015-NH21の末端配列とも全く一致し、pEP015-NH2およびpEP015-NH24の HindIII 断片はこの順序で連続的であることが確認される。
pEP015-NH6 末端"B":CACCGAAGCGTCGATCTGGTCCATC (配列番号29)および pEP015-H2.7 末端 "A":CGGTCAGATCGACGACGGGCTTTCC(配列番号30)
で特異的増殖が見出される。増幅体をpBluescript II SK- にクローニングし、完全な配列決定を行う。増幅体の配列は同一で、pEP015-NH6およびpEP015-H2.7の末端配列と完全に一致し、HindIII部位で融合させてpEP015-NH6および pEP015-H2.7の断片がこの順序で連続的であることを確認する。
pEP015-NH2 の挿入物の下流末端に由来し、実施例9に記載したサブクローンコンティグの下流末端を示す約2.2 kbのBamHI-HindIII断片を分離し、DIG-標識し、数種の酵素で消化したpEP015およびpEP015-NH2 DNAに対するサザンハイブリッド形成実験に用いる。強いハイブリッド形成バンドが常に同じ大きさで標的DNA2個の間に見出されるが、これはSorangium cellulosum So ce90のゲノムDNA断片がpEP015-NH2の下流末端にあるHindIII部位でpEP015末端にクローニングされていることを示す。
実施例10に記載のヌクレオチド配列サブクローンコンティグは次のようにして決定される。
β-ケトアシルシンターゼ(KS)(配列番号1のヌクレオチド7643-8920、配列番号2のアミノ酸 11437);
アシル転移酵素 (AT)(配列番号1のヌクレオチド9236-10201、配列番号2のアミノ酸 543-864);
エノイルレダクターゼ(ER)(配列番号1のヌクレオチド 10529-11428、配列番号2のアミノ酸 974-1273); および
アシルキャリアー蛋白質相同ドメイン (ACP) (配列番号1のヌクレオチド 11549-11764、配列番号2のアミノ酸 1314-1385)。
ペプチド結合形成ドメインであって、モチーフK(配列番号3のアミノ酸72-81 [FPLTDIQESY]、配列番号1のヌクレオチド位置12085-12114に対応);モチーフL(配列番号3のアミノ酸118-125 [VVARHDML]、配列番号1のヌクレオチド位置12223-12246に対応);モチーフM(配列番号3のアミノ酸199-212 [SIDLINVDLG- SLSI]、配列番号1のヌクレオチド位置12466-12507に対応);およびモチーフO(配列番号3のアミノ酸353-363 [GDFTSMVLLDI]、配列番号1のヌクレオチド位置12928-12960に対応);で代表されるもの。
ペプチジルキャリアー蛋白質相同的ドメイン(PCP)であって、モチーフJ(配列番号3のアミノ酸1344-1351 [GATSIHIV] 、配列番号1のヌクレオチド位置15901-15924に対応)で代表されるもの。
Sorangium cellulosumによる発酵で達成されるよりも多量にエポチロンを産生する目的で本発明のエポチロンシンターゼ遺伝子を異種生物中で発現した。異種発現に好適な宿主は元来ポリケチド、アクチノロジンを産生する、たとえば Streptomyces coelicolorのような放線菌である。この宿主での組換えPKS遺伝子発現技術はここに参考のために引用するMcDaniel ほか著、Science、262巻:1546-1550 (1993年);Kaoほか著、Science、265巻:509-512 (1994年);また、Holmesほか著、EMBO Journal、12 (8)巻:3183-3191(1993年);Bibbほか著、Gene、38巻:215-226(1985年);ならびに米国特許第5,521,077号;米国特許第5,672,491号;米国特許第5,712,146号には記載がある。
在来の宿主および本発明の組換え宿主からエポチロンを抽出するために有用なポリケチド単離のための培養、醗酵および抽出操作法の例はここに参考のために引用するWO 93/10121;米国特許第 5,639,949号の実施例57;Gerthほか著、J. Antibiotics、49巻:560-563 (1996年);1998年2月19日出願のスイス特許出願第396/98号;および米国特許出願第09/248,910号(Sorangium cellulosumの好適な突然変異株も開示)に記載されている。
以下は培養された、たとえばSo ce90株のようなSorangium cellulosumからエポチロンを単離するために有用な操作法であって、組換え宿主からエポチロンを単離するためにも使用できよう。
株:Sorangium cellulosum Soce-90 または本発明の組換え宿主株。
株の保存:液体窒素中。
培地:前培養および中間培養: G52。
主培養: 1B12。
G52 培地:
低塩酵母エキス(BioSpringer社、Maison Aifort、FR) 2 g/L
MgS04(7H20) 1 g/L
CaC12(2H20) 1 g/L
脱脂ソヤミール Soyamine 50T(Lucas Meyer社、Hamburg、DE) 2 g/L
ポテト澱粉 Noredux A-150 (Blattmann社、Waedenswil、CH) 8 g/L
乾燥グルコース 2 g/L
EDTA-Fe(III)-Na 塩(8 g/L)、pH 7.4、KOHで補正。 1 mL/L
滅菌:20 分、120 ℃。
1B12 培地:
ポテト澱粉 Noredux A-150(Blattmann社、Waedenswil、CH) 20 g/L
脱脂ソヤミール Soyamine 50T(Lucas Meyer社、Hamburg、DE)11g/L
EDTA-Fe (III)-Na 塩、pH 7.8、KOH で補正。 8 mg/L
滅菌:20 分、120 ℃。
様々な濃度のサイクロデキストリン(Fluka社、Buchs, スイスまたは Wacker Chemie社、Munich、ドイツ)を個別に滅菌し、接種前に 1B12 培地に添加する。
実験および発酵はすべてこの維持培養から出発して行う。
(i) 振盪フラスコ中での前培養:
維持培養500 mLから出発して、G52培地1x450 mLに維持培養液50 mLを接種し、4日間、180 rpmで撹拌下、30℃で50 mm置換下にインキュベーションする。
(ii) 振盪フラスコ中での主培養:
1B12 培地プラス5 g/L 4-モルホリン-プロパンスルホン酸(MOPS)粉末(200 mL エルレンマイヤーフラスコ中)40 mLに10x濃サイクロデキストリン溶液5mLを混合し、前培養物10 mL を接種し、5日間、180 rpmで撹拌下、30℃で50 mm置換下にインキュベーションする。
維持培養 500 mLから出発し、G52培地(2 Lエルレンマイヤーフラスコ中)4x450 mLにそれぞれ維持培養液50 mLを接種し、4日間、180 rpmで撹拌下、30℃で 50 mm 置換下にインキュベーションする。
20 L:G52培地18 Lを全容積30 Lの発酵機に入れ、前培養物2 Lを接種する。培養は3-4日間継続する。条件:30℃、250 rpm、空気0.5 L/液体L/分、加圧0.5 バール、pH 無調節。
100 L:G52培地90 Lを全容積150 Lの発酵機に入れ、20 L中間培養物10 Lを接種する。培養は3-4日間継続する。条件:30℃、150 rpm、空気0.5 L/液体L/分、加圧0.5 バール、pH 無調節。
10 L:1B12培地10 L用の培地材料を水7 L中で滅菌し、次に滅菌した10% 2-(ヒドロキシプロピル)-β-サイクロデキストリン溶液1 Lを添加し、20 L中間培養液2 Lを接種する。主培養時間は6-7日で、条件は30℃、250 rpm、空気 0.5 L/液体L/分、加圧0.5バール、pH調節H2SO4/KOHでpH 7.6 +/-0.5(すなわちpH 7.1と8.1の間では無調節)。
次に100 L醗酵での一連の接種を図式的に示す:
試料の調製: 50 mL試料をポリスチレン樹脂アンバーライトXAD16(Rohm + Haas社、Frankfurt、ドイツ)2 mLと混合し、180 rpmで1時間30℃で振盪する。次に樹脂を150 μmナイロン篩で濾過し、少量の水で洗い、フィルターとともに15 mL Nunc管に加える。
樹脂から産物の溶離:イソプロパノール(> 99%)10 mLをフィルターおよび樹脂と共にこのチューブに加える。その後、封鎖した管を室温で30分間、Rota- Mixer (Labinco 社、オランダ)で振盪する。次に2 mLの液体を遠心分離し、上清液をピペットでHPLC管に注入する。
カラム:ウォータース-Symetry C18,100 x 4 mm, 3.5 μm。
WAT 066220+プレリミナリーカラム 3.9 x 20 mm。
WAT 054225。
溶媒 A:0.02 % 燐酸。
B:アセトニトリル(HPLC-級)。
勾配:41% -B: 0-7分、100% B: 7.2から7.8分、41% B: 8-12分。
オーブン温度:30℃
検出:250 nm、UV-DAD検出。
注入容積:10μL。
保持時間:Epo A:4.30 分。Epo B: 5.38 分。
サイクロデキストリンはα-D-グルコピルラノースが環状に(α-1,4)-結合したオリゴサッカライドで、比較的に疎水性の中心空間と親水性外部表面を持つ。
特に代表的なものを以下に記載する(括弧内の数字は分子当りグルコースユニットの数を示す):α-サイクロデキストリン (6)、β-サイクロデキストリン (7)、γ-サイクロデキストリ ン (8)、δ-サイクロデキストリン (9)、ε-サイクロデキストリン (10)、ζ-サイクロデキストリン (11)、η-サイクロデキストリン(12)、およびθ-サイクロデキストリン (13)。δ-サイクロデキストリンおよび特にα-サイクロデキストリン、β-サイクロデキストリンまたはγ-サイクロデキストリンまたはその混合物は好適である。
-O-[alk-O-] n-H
[式中、alk はアルキル、特に低級アルキルであり;
n は 2 から 12、特に 2から 5、殊に 2から 3 までの全数字である]
で示される基でエーテル化されたサイクロデキストリン、OH 基1個またはそれ以上が式:
alk は常にアルキル、特に低級アルキルである;
m、n、p、q および z は 1から 12までの全数字、好ましくは1から5まで、特に1から3までであり;および
Y は OR または NR2R3 である;ここに
R1、R2 および R3 は独立にまたは各個に水素であるかまたは低級アルキルであるか、または R2 および R3 は結合して結合する窒素とともにモルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノまたはピペラジノを形成するか;または
他の糖分子、特にグルコシル-、ジグルコシル-(G2-β-サイクロデキストリン)、マルトシル-またはジマルトシル-サイクロデキストリン、またはN-アセチルグルコサミニル-} グルコサミニル、N-アセチルガラクトサミニル-またはガラクトサミニル-とのエーテル化またはアセタールが存在して分枝サイクロデキストリンを形成する]
で示される基でエーテル化されたサイクロデキストリンである。
異なる前記のエーテルおよびエステル基が同時に2種またはそれ以上存在するサイクロデキストリンも可能である。
サイクロデキストリンおよび/またはサイクロデキストリン誘導体の2種またはそれ以上の混合物も存在しうる。
醗酵は15 Lガラス発酵槽で行った。培地には2-(ヒドロキシプロピル)-β-サイクロデキストリン(Wacker Chemie社、Munich、ドイツ)10 g/Lを加えた。醗酵の進行状況を表3に示す。醗酵は6日後に終了し、後処理を行った。
醗酵は150 L 発酵槽で行った。培地には10 g/Lの2-(ヒドロキシプロピル)-β-サイクロデキストリン10 g/Lを加えた。発酵の進行状況を表4に示す。醗酵産物は7日後に収集し、後処理した。
醗酵は750 L発酵槽で行った。培地には 2-(ヒドロキシプロピル)-β-サイクロデキストリン10 g/Lを加えた。発酵の進行状況を表5に示す。醗酵産物は7日後に収集し、後処理した。
醗酵は 15 L ガラス発酵槽で行った。培地にはいずれのサイクロデキストリンも、その他の吸着剤も加えなかった。発酵の進行状況を表6に示す。醗酵産物は収集も後処理も行わなかった。
実施例2Dの500 L主培養から収集した容積は450 Lであって、Westfalia清澄分離器SA-20-06型(rpm=6500)を用いて液相(遠心分離液+洗浄水=650 L)と固相(細胞=約 15 kg)とに分離する。エポチロンの主な部分は遠心分離液に見出された。遠心分離した細胞のケーキには測定されたエポチロンの<15%を含んでおり、それ以上の処理はしなかった。650 Lの遠心分離液を4000 L撹拌槽に入れ、10 LアンバーライトXAD-16(遠心液:樹脂容積比=65:1)と混合し、撹拌した。約2時間接触の後、樹脂をHeineオーバーフロー遠心分離(バスケット容積=40 L; rpm= 2800)で遠心分離した。樹脂を遠心分離機から出し、10-15 Lの脱イオン水で洗浄した。脱着は樹脂を30 L ガラス撹拌器中で30 Lのイソプロパノールと30分間づつ2回撹拌して行った。樹脂からのイソプロパノール相の分離は吸引濾過で行った。次に集めたイソプロパノール相に15-20 Lの水を添加してイソプロパノールを除去した。真空で操作する循環蒸発器(Schmid-Verdampfer社)で処理して約10 Lの水層を得た。これを毎回10 Lの酢酸エチルで3回抽出した。抽出は30 Lのガラス撹拌容器で行った。酢酸エチル抽出物を3-5 Lまで真空循環蒸発器(Schmid-Verdampfer社)まで濃縮した後、ロータリーエバポレータ(Buchi 型)で真空下に濃縮乾固した。酢酸エチル抽出物50.2 gを得た。酢酸エチル抽出物をメタノール500 mLに溶かし、折り畳みフィルターで不溶部を濾去した。溶液を10 kg Sephadex LH 20カラム(Pharmacia社、Uppsala、スウェーデン)(カラム直径20 cm、注入レベル約 1.2 m)に加えた。メタノールを溶離液として溶離した。エポチロンAおよびエポチロンBは主に画分21-23(画分サイズ1 L)に存在した。各画分を真空下にロータリーエバポレータ濃縮乾固した(総量9.0 g)。これらのSephadexピーク画分(9.0 g)を次に92 mLのアセトニトリル:水;塩化メチレン=50:40:2 に溶解し、溶液を折り畳みフィルターで濾過し、RPカラム(装置Prepbar 200、Merck、2.0 kg LiChrospher RP-18 Merck、粒サイズ12μm、カラム径10 cm、充填レベル42 cm、Merck社、Darmstadt、ドイツ)に加え、アセトニトリル:水=3:7(流速= 500 mL/分;保持時間:エポチロンA = 約 51-59 分;エポチロンB = 約60-69分)で溶離した。分別の進行は250 nmのUV検出器でで監視した。各画分はBuchi-Rotavaporロータリーエバポレータで真空下に濃縮乾固した。エポチロンAのピーク画分重量は700 mgで、HPLC(外部標準)による含量は75.1 %であった。エポチロンBのピーク画分重量は1980 mgで、HPLC(外部基準)による含量は86.6%であった。最後にエポチロンA画分(700 mg)を5 mLの酢酸エチル:トルエン= 2:3から結晶化して170 mgのエポチロンA純結晶[HLPC 純度(面積%)=94.3%]を得た。エポチロンB画分(1980 mg)の結晶化はメタノール18 mLから行い、1440 mgのエポチロンB純結晶[HPLC純度(面積%)=99.2%]を得た。m.p. (エポチロンB):124-125 ℃;
1H-NMR(エポチロン B)500 MHz-NMR、溶媒:DMSO-d6。ピークは対 TMS 化学シフト(多重度:s = シングレット;d = ダブレット;m = マルチプレット)、積分値(H 数)で示す。δ ppm:7.34 (s) 1H,6.50 (s) 1H,5.28 (d) 1H,5.08 (d) 1H,4.46 (d) 1H,4.08 (m) 1H,3.47 (m) 1H,3.11 (m) 1H,2.83 (dd) 1H,2.64 (s) 3H,2.36 (m) 2H,2.09 (s) 3H,2.04 (m) 1H,1.83 (m) 1H,1.61 (m) 1H,1.47-1.24 (m) 4H,1.18 (s) 6H,1.13 (m) 2H,1.06 (d) 3H,0.89 (d + s, 重複) 6 H。H数計 = 41。
エポチロンを含有する組成物は医薬的製剤または、例えば様々なヒトの固形癌のような癌性疾患の処置に使用される。そのような抗癌製剤は例えば有効量のエポチロンとともに有機または無機の、液体または固体の医薬的に適当な担体材料1種またはそれ以上を含有する。そのような製剤は例えば経腸的に、経鼻的、経直腸的に、経口的に、または非経口的に、殊に筋肉内または静脈内などに送達される。活性成分の用量は患者の体重、年齢、および身体的および薬力学的条件に依存し、さらに送達法にも依存する。エポチロンは生物学的効果がタキソールと類似しているので、癌の処置でタキソールを用いる組成物および方法でのタキソールにエポチロンは替わり得るかもしれない。例えば、参考のためにここに引用する米国特許第5,496,804号;第5,565,478号;および第5,641,803号参照。
Claims (36)
- (a)核酸分子と作動可能に結合する異種プロモーター配列とを含むキメラ遺伝子を宿主に導入すること、および(b)宿主中でエポチロンの生合成を起す条件下に宿主を増殖させることを含む、組換え宿主中でエポチロンを異種発現させる方法であって、上記核酸分子がエポチロンの生合成に関与するポリペプチドの少なくとも1種をコードするヌクレオチド配列を含み、当該ポリペプチドが下記の群から選択されたアミノ酸配列に実質的に類似したアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする方法:
配列番号2、配列番号2のアミノ酸11-437、配列番号2のアミノ酸543-864、配列番号2のアミノ酸974-1273、配列番号2のアミノ酸1314-1385、配列番号3、配列番号3のアミノ酸72-81、配列番号3のアミノ酸118-125、配列番号3のアミノ酸199-212、配列番号3のアミノ酸353-363、配列番号3のアミノ酸549-565、配列番号3のアミノ酸588-603、配列番号3のアミノ酸669-684、配列番号3のアミノ酸815-821、配列番号3のアミノ酸868-892、配列番号3のアミノ酸903-912、配列番号3のアミノ酸918-940、配列番号3のアミノ酸1268-1274、配列番号3のアミノ酸1285-1297、配列番号3のアミノ酸973-1256、配列番号3のアミノ酸1344-1351、配列番号4、配列番号4のアミノ酸7-432、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号4のアミノ酸869-1037、配列番号4のアミノ酸1439-1684、配列番号4のアミノ酸1722-1792、配列番号5、配列番号5のアミノ酸39-457、配列番号5のアミノ酸563-884、配列番号5のアミノ酸1147-1399、配列番号5のアミノ酸1434-1506、配列番号5のアミノ酸1524-1950、配列番号5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸2645-2895、配列番号5のアミノ酸2932-3005、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号5のアミノ酸3555-3876、配列番号5のアミノ酸3886-4048、配列番号5のアミノ酸4433-4719、配列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸5010-5082、配列番号5のアミノ酸5103-5525、配列番号5のアミノ酸5631-5951、配列番号5のアミノ酸5964-6132、配列番号5のアミノ酸6542-6837、配列番号5のアミノ酸6857-7101、配列番号5のアミノ酸7140-7211、配列番号6、配列番号6のアミノ酸35-454、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸1143-1393、配列番号6のアミノ酸1430-1503、配列番号6のアミノ酸1522-1946、配列番号6のアミノ酸2053-2373、配列番号6のアミノ酸2383-2551、配列番号6のアミノ酸2671-3045、配列番号6のアミノ酸3392-3636、配列番号6のアミノ酸3673-3745、配列番号7、配列番号7のアミノ酸32-450、配列番号7のアミノ酸556-877、配列番号7のアミノ酸887-1051、配列番号7のアミノ酸1478-1790、配列番号7のアミノ酸1810-2055、配列番号7のアミノ酸2093-2164、配列番号7のアミノ酸2165-2439、配列番号8、配列番号10、配列番号11および配列番号22。 - さらに(c)組換え宿主中で発現させたエポチロンを分離、回収することを含む、請求項1記載の方法。
- ポリペプチドが下記の群から選択されたアミノ酸配列を含むものである、請求項lまたは2に記載の方法:
配列番号2、配列番号2のアミノ酸11-437、配列番号2のアミノ酸543-864、配列番号2のアミノ酸974-1273、配列番号2のアミノ酸1314-1385、配列番号3、配列番号3のアミノ酸72-81、配列番号3のアミノ酸118-125、配列番号3のアミノ酸199-212、配列番号3のアミノ酸353-363、配列番号3のアミノ酸549-565、配列番号3のアミノ酸588-603、配列番号3のアミノ酸669-684、配列番号3のアミノ酸815-821、配列番号3のアミノ酸868-892、配列番号3のアミノ酸903-912、配列番号3のアミノ酸918-940、配列番号3のアミノ酸1268-1274、配列番号3のアミノ酸1285-1297、配列番号3のアミノ酸973-1256、配列番号3のアミノ酸1344-1351、配列番号4、配列番号4のアミノ酸7-432、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号4のアミノ酸869-1037、配列番号4のアミノ酸1439-1684、配列番号4のアミノ酸1722-1792、配列番号5、配列番号5のアミノ酸39-457、配列番号5のアミノ酸563-884、配列番号5のアミノ酸1147-1399、配列番号5のアミノ酸1434-1506、配列番号5のアミノ酸1524-1950、配列番号5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸2645-2895、配列番号5のアミノ酸2932-3005、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号5のアミノ酸3555-3876、配列番号5のアミノ酸3886-4048、配列番号5のアミノ酸4433-4719、配列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸5010-5082、配列番号5のアミノ酸5103-5525、配列番号5のアミノ酸5631-5951、配列番号5のアミノ酸5964-6132、配列番号5のアミノ酸6542-6837、配列番号5のアミノ酸6857-7101、配列番号5のアミノ酸7140-7211、配列番号6、配列番号6のアミノ酸35-454、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸1143-1393、配列番号6のアミノ酸1430-1503、配列番号6のアミノ酸1522-1946、配列番号6のアミノ酸2053-2373、配列番号6のアミノ酸2383-2551、配列番号6のアミノ酸2671-3045、配列番号6のアミノ酸3392-3636、配列番号6のアミノ酸3673-3745、配列番号7、配列番号7のアミノ酸32-450、配列番号7のアミノ酸556-877、配列番号7のアミノ酸887-1051、配列番号7のアミノ酸1478-1790、配列番号7のアミノ酸1810-2055、配列番号7のアミノ酸2093-2164、配列番号7のアミノ酸2165-2439、配列番号8、配列番号10、配列番号11および配列番号22。 - ヌクレオチド配列が下記の群から選択されたヌクレオチド配列に実質的に類似したものである、請求項1または2に記載の方法:
配列番号1のヌクレオチド1900-3171の相補鎖、配列番号1のヌクレオチド3415-5556、配列番号1のヌクレオチド7610-11875、配列番号1のヌクレオチド7643-8920、配列番号1のヌクレオチド9236-10201、配列番号1のヌクレオチド10529-11428、配列番号1のヌクレオチド11549-11764、配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド12085-12114、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド12466-12507、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13516-13566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド13876-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチド14473-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオチド14623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレオチド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639、配列番号1のヌクレオチド15901-15924、配列番号1のヌクレオチド16251-21749、配列番号1のヌクレオチド16269-17546、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号1のヌクレオチド18855-19361、配列番号1のヌクレオチド20565-21302、配列番号1のヌクレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド21746-43519、配列番号1のヌクレオチド21860-23116、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号1のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド26045-26263、配列番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド27911-28876、配列番号1のヌクレオチド29678-30429、配列番号1のヌクレオチド30539-30759、配列番号1のヌクレオチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド32408-33373、配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド35042-35902、配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド36773-36991、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド38636-39598、配列番号1のヌクレオチド39635-40141、配列番号1のヌクレオチド41369-42256、配列番号1のヌクレオチド42314-43048、配列番号1のヌクレオチド43163-43378、配列番号1のヌクレオチド43524-54920、配列番号1のヌクレオチド43626-44885、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオチド46950-47702、配列番号1のヌクレオチド47811-48032、配列番号1のヌクレオチド48087-49361、配列番号1のヌクレオチド49680-50642、配列番号1のヌクレオチド50670-51176、配列番号1のヌクレオチド51534-52657、配列番号1のヌクレオチド53697-54431、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、配列番号1のヌクレオチド54935-62254、配列番号1のヌクレオチド55028-56284、配列番号1のヌクレオチド56600-57565、配列番号1のヌクレオチド57593-58087、配列番号1のヌクレオチド59366-60304、配列番号1のヌクレオチド60362-61099、配列番号1のヌクレオチド61211-61426、配列番号1のヌクレオチド61427-62254、配列番号1のヌクレオチド62369-63628、配列番号1のヌクレオチド67334-68251および配列番号1のヌクレオチド1-68750。 - ヌクレオチド配列が下記の群から選択されたものである、請求項1または2に記載の方法:
配列番号1のヌクレオチド1900-3171の相補鎖、配列番号1のヌクレオチド3415-5556、配列番号1のヌクレオチド7610-11875、配列番号1のヌクレオチド7643-8920、配列番号1のヌクレオチド9236-10201、配列番号1のヌクレオチド10529-11428、配列番号1のヌクレオチド11549-11764、配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド12085-12114、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド12466-12507、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13516-13566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド13876-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチド14473-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオチド14623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレオチド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639、配列番号1のヌクレオチド15901-15924、配列番号1のヌクレオチド16251-21749、配列番号1のヌクレオチド16269-17546、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号1のヌクレオチド18855-19361、配列番号1のヌクレオチド20565-21302、配列番号1のヌクレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド21746-43519、配列番号1のヌクレオチド21860-23116、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号1のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド26045-26263、配列番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド27911-28876、配列番号1のヌクレオチド29678-30429、配列番号1のヌクレオチド30539-30759、配列番号1のヌクレオチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド32408-33373、配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド35042-35902、配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド36773-36991、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド38636-39598、配列番号1のヌクレオチド39635-40141、配列番号1のヌクレオチド41369-42256、配列番号1のヌクレオチド42314-43048、配列番号1のヌクレオチド43163-43378、配列番号1のヌクレオチド43524-54920、配列番号1のヌクレオチド43626-44885、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオチド46950-47702、配列番号1のヌクレオチド47811-48032、配列番号1のヌクレオチド48087-49361、配列番号1のヌクレオチド49680-50642、配列番号1のヌクレオチド50670-51176、配列番号1のヌクレオチド51534-52657、配列番号1のヌクレオチド53697-54431、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、配列番号1のヌクレオチド54935-62254、配列番号1のヌクレオチド55028-56284、配列番号1のヌクレオチド56600-57565、配列番号1のヌクレオチド57593-58087、配列番号1のヌクレオチド59366-60304、配列番号1のヌクレオチド60362-61099、配列番号1のヌクレオチド61211-61426、配列番号1のヌクレオチド61427-62254、配列番号1のヌクレオチド62369-63628、配列番号1のヌクレオチド67334-68251および配列番号1のヌクレオチド1-68750。 - 核酸分子が少なくとも一つのエポチロンシンターゼドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、当該エポチロンシンターゼドメインが下記の群から選択されたアミノ酸配列に実質的に類似したアミノ酸配列を含むβ-ケトアシルシンターゼドメインである、請求項1または2に記載の方法:
配列番号2のアミノ酸11-437、配列番号4のアミノ酸7-432、配列番号5のアミノ酸39-457、配列番号5のアミノ酸1524-1950、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号5のアミノ酸5103-5525、配列番号6のアミノ酸35-454、配列番号6のアミノ酸1522-1946および配列番号7のアミノ酸32-450。 - ヌクレオチド配列が下記の群から選択されたヌクレオチド配列に実質的に類似したものである、請求項6に記載の方法:
配列番号1のヌクレオチド7643-8920、配列番号1のヌクレオチド16269-17546、配列番号1のヌクレオチド21860-23116、配列番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド43626-44885、配列番号1のヌクレオチド48087-49361、および配列番号1のヌクレオチド55028-56284。 - 核酸分子が少なくとも一つのエポチロンシンターゼドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、当該エポチロンシンターゼドメインが下記の群から選択されたアミノ酸配列に実質的に類似したアミノ酸配列を含むアシル転移酵素ドメインである、請求項1または2に記載の方法:
配列番号2のアミノ酸543-864、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号5のアミノ酸563-884、配列番号5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸3555-3876、配列番号5のアミノ酸5631-5951、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸2053-2373および配列番号7のアミノ酸556-877。 - ヌクレオチド配列が下記の群から選択されたヌクレオチド配列に実質的に類似したものである、請求項8に記載の方法:
配列番号1のヌクレオチド9236-10201、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号1のヌクレオチド27911-28876、配列番号1のヌクレオチド32408-33373、配列番号1のヌクレオチド38636-39598、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオチド49680-50642および配列番号1のヌクレオチド56600-57565。 - 核酸分子が少なくとも一つのエポチロンシンターゼドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、当該エポチロンシンターゼドメインが下記の群から選択されたアミノ酸配列に実質的に類似したアミノ酸配列を含むエノイルレダクターゼドメインである、請求項1または2に記載の方法:
配列番号2のアミノ酸974-1273、配列番号5のアミノ酸4433-4719、配列番号5のアミノ酸6542-6837および配列番号7のアミノ酸1478-1790。 - ヌクレオチド配列が下記の群から選択されたヌクレオチド配列に実質的に類似したものである、請求項10に記載の方法:
配列番号1のヌクレオチド10529-11428、配列番号1のヌクレオチド35042-35902、配列番号1のヌクレオチド41369-42256および配列番号1のヌクレオチド59366-60304。 - 核酸分子が少なくとも一つのエポチロンシンターゼドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、当該エポチロンシンターゼドメインが下記の群から選択されたアミノ酸配列に実質的に類似したアミノ酸配列を含むアシルキャリアー蛋白質ドメインである、請求項1または2に記載の方法:
配列番号2のアミノ酸1314-1385、配列番号4のアミノ酸1722-1792、配列番号5のアミノ酸1434-1506、配列番号5のアミノ酸2932-3005、配列番号5のアミノ酸5010-5082、配列番号5のアミノ酸7140-7211、配列番号6のアミノ酸1430-1503、配列番号6のアミノ酸3673-3745および配列番号7のアミノ酸2093-2164。 - ヌクレオチド配列が下記の群から選択されたヌクレオチド配列に実質的に類似したものである、請求項12に記載の方法:
配列番号1のヌクレオチド11549-11764、配列番号1のヌクレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド26045-26263、配列番号1のヌクレオチド30539-30759、配列番号1のヌクレオチド36773-36991、配列番号1のヌクレオチド43163-43378、配列番号1のヌクレオチド47811-48032、配列番号1のヌクレオチド54540-54758および配列番号1のヌクレオチド61211-61426。 - 核酸分子が少なくとも一つのエポチロンシンターゼドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、当該エポチロンシンターゼドメインが下記の群から選択されたアミノ酸配列に実質的に類似したアミノ酸配列を含むデヒドラターゼドメインである、請求項1または2に記載の方法:
配列番号4のアミノ酸869-1037、配列番号5のアミノ酸3886-4048、配列番号5のアミノ酸5964-6132、配列番号6のアミノ酸2383-2551および配列番号7のアミノ酸887-1051。 - ヌクレオチド配列が下記の群から選択されたヌクレオチド配列に実質的に類似したものである、請求項14に記載の方法:
配列番号1のヌクレオチド18855-19361、配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド39635-40141、配列番号1のヌクレオチド50670-51176、および配列番号1のヌクレオチド57593-58087。 - 核酸分子が少なくとも一つのエポチロンシンターゼドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、当該エポチロンシンターゼドメインが下記の群から選択されたアミノ酸配列に実質的に類似したアミノ酸配列を含むβ-ケトレダクターゼドメインである、請求項1または2に記載の方法:
配列番号4のアミノ酸1439-1684、配列番号5のアミノ酸1147-1399、配列番号5のアミノ酸2645-2895、配列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸6857-7101、配列番号6のアミノ酸1143-1393、配列番号6のアミノ酸3392-3636および配列番号7のアミノ酸1810-2055。 - ヌクレオチド配列が下記の群から選択されたヌクレオチド配列に実質的に類似したものである、請求項16に記載の方法:
配列番号1のヌクレオチド20565-21302、配列番号1のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド29678-30429、配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド42314-43048、配列番号1のヌクレオチド46950-47702、配列番号1のヌクレオチド53697-54431および配列番号1のヌクレオチド60362-61099。 - 核酸分子が少なくとも一つのエポチロンシンターゼドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、当該エポチロンシンターゼドメインが配列番号6のアミノ酸2671-3045に実質的に類似したアミノ酸配列を含むメチル転移酵素ドメインである、請求項1または2に記載の方法。
- ヌクレオチド配列が配列番号1のヌクレオチド51534-52657に実質的に類似したものである、請求項18に記載の方法。
- 核酸分子が少なくとも一つのエポチロンシンターゼドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、当該エポチロンシンターゼドメインが配列番号7のアミノ酸2165-2439に実質的に類似したアミノ酸配列を含むチオエステラーゼドメインである、請求項1または2に記載の方法。
- ヌクレオチド配列が配列番号1のヌクレオチド61427-62254に実質的に類似したものである、請求項20に記載の方法。
- 核酸分子が非リボソーム性ペプチド合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、当該非リボソーム性ペプチド合成酵素が下記の群から選択されたアミノ酸配列に実質的に類似したアミノ酸配列を含むものである、請求項1または2に記載の方法:
配列番号3、配列番号3のアミノ酸72-81、配列番号3のアミノ酸118-125、配列番号3のアミノ酸199-212、配列番号3のアミノ酸353-363、配列番号3のアミノ酸549-565、配列番号3のアミノ酸588-603、配列番号3のアミノ酸669-684、配列番号3のアミノ酸815-821、配列番号3のアミノ酸868-892、配列番号3のアミノ酸903-912、配列番号3のアミノ酸918-940、配列番号3のアミノ酸1268-1274、配列番号3のアミノ酸1285-1297、配列番号3のアミノ酸973-1256および配列番号3のアミノ酸1344-1351。 - ヌクレオチド配列が下記の群から選択されたヌクレオチド配列に実質的に類似したものである、請求項22に記載の方法:
配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド12085-12114、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド12466-12507、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13516-13566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド13876-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチド14473-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオチド14623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレオチド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639および配列番号1のヌクレオチド15901-15924。 - ヌクレオチド配列がミクソバクテリウムから分離されるものである、請求項1〜23のいずれかに記載の方法。
- ミクソバクテリウムがソランジウム・セルロースム(Sorangium cellulosum)である、請求項24に記載の方法。
- エポチロンの生合成に関与するポリペプチドの少なくとも1種をコードするヌクレオチド配列を含み、当該ヌクレオチド配列が下記の群から選択されたヌクレオチド配列と少なくとも60%の同一性を有する、分離された核酸分子:
配列番号1のヌクレオチド1900-3171の相補鎖、配列番号1のヌクレオチド3415-5556、配列番号1のヌクレオチド7610-11875、配列番号1のヌクレオチド7643-8920、配列番号1のヌクレオチド9236-10201、配列番号1のヌクレオチド10529-11428、配列番号1のヌクレオチド11549-11764、配列番号1のヌクレオチド11872-16104、配列番号1のヌクレオチド12085-12114、配列番号1のヌクレオチド12223-12246、配列番号1のヌクレオチド12466-12507、配列番号1のヌクレオチド12928-12960、配列番号1のヌクレオチド13516-13566、配列番号1のヌクレオチド13633-13680、配列番号1のヌクレオチド13876-13923、配列番号1のヌクレオチド14313-14334、配列番号1のヌクレオチド14473-14547、配列番号1のヌクレオチド14578-14607、配列番号1のヌクレオチド14623-14692、配列番号1のヌクレオチド15673-15693、配列番号1のヌクレオチド15724-15762、配列番号1のヌクレオチド14788-15639、配列番号1のヌクレオチド15901-15924、配列番号1のヌクレオチド16251-21749、配列番号1のヌクレオチド16269-17546、配列番号1のヌクレオチド17865-18827、配列番号1のヌクレオチド18855-19361、配列番号1のヌクレオチド20565-21302、配列番号1のヌクレオチド21414-21626、配列番号1のヌクレオチド21746-43519、配列番号1のヌクレオチド21860-23116、配列番号1のヌクレオチド23431-24397、配列番号1のヌクレオチド25184-25942、配列番号1のヌクレオチド26045-26263、配列番号1のヌクレオチド26318-27595、配列番号1のヌクレオチド27911-28876、配列番号1のヌクレオチド29678-30429、配列番号1のヌクレオチド30539-30759、配列番号1のヌクレオチド30815-32092、配列番号1のヌクレオチド32408-33373、配列番号1のヌクレオチド33401-33889、配列番号1のヌクレオチド35042-35902、配列番号1のヌクレオチド35930-36667、配列番号1のヌクレオチド36773-36991、配列番号1のヌクレオチド37052-38320、配列番号1のヌクレオチド38636-39598、配列番号1のヌクレオチド39635-40141、配列番号1のヌクレオチド41369-42256、配列番号1のヌクレオチド42314-43048、配列番号1のヌクレオチド43163-43378、配列番号1のヌクレオチド43524-54920、配列番号1のヌクレオチド43626-44885、配列番号1のヌクレオチド45204-46166、配列番号1のヌクレオチド46950-47702、配列番号1のヌクレオチド47811-48032、配列番号1のヌクレオチド48087-49361、配列番号1のヌクレオチド49680-50642、配列番号1のヌクレオチド50670-51176、配列番号1のヌクレオチド51534-52657、配列番号1のヌクレオチド53697-54431、配列番号1のヌクレオチド54540-54758、配列番号1のヌクレオチド54935-62254、配列番号1のヌクレオチド55028-56284、配列番号1のヌクレオチド56600-57565、配列番号1のヌクレオチド57593-58087、配列番号1のヌクレオチド59366-60304、配列番号1のヌクレオチド60362-61099、配列番号1のヌクレオチド61211-61426、配列番号1のヌクレオチド61427-62254、配列番号1のヌクレオチド62369-63628、配列番号1のヌクレオチド67334-68251および配列番号1のヌクレオチド1-68750。 - 同一性が少なくとも80%である、請求項26に記載の分離された核酸分子。
- 同一性が少なくとも90%である、請求項27に記載の分離された核酸分子。
- 同一性が少なくとも95%である、請求項28に記載の分離された核酸分子。
- ポリペプチドが下記の群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項26〜29のいずれかに記載の分離された核酸分子:
配列番号2、配列番号2のアミノ酸11-437、配列番号2のアミノ酸543-864、配列番号2のアミノ酸974-1273、配列番号2のアミノ酸1314-1385、配列番号3、配列番号3のアミノ酸72-81、配列番号3のアミノ酸118-125、配列番号3のアミノ酸199-212、配列番号3のアミノ酸353-363、配列番号3のアミノ酸549-565、配列番号3のアミノ酸588-603、配列番号3のアミノ酸669-684、配列番号3のアミノ酸815-821、配列番号3のアミノ酸868-892、配列番号3のアミノ酸903-912、配列番号3のアミノ酸918-940、配列番号3のアミノ酸1268-1274、配列番号3のアミノ酸1285-1297、配列番号3のアミノ酸973-1256、配列番号3のアミノ酸1344-1351、配列番号4、配列番号4のアミノ酸7-432、配列番号4のアミノ酸539-859、配列番号4のアミノ酸869-1037、配列番号4のアミノ酸1439-1684、配列番号4のアミノ酸1722-1792、配列番号5、配列番号5のアミノ酸39-457、配列番号5のアミノ酸563-884、配列番号5のアミノ酸1147-1399、配列番号5のアミノ酸1434-1506、配列番号5のアミノ酸1524-1950、配列番号5のアミノ酸2056-2377、配列番号5のアミノ酸2645-2895、配列番号5のアミノ酸2932-3005、配列番号5のアミノ酸3024-3449、配列番号5のアミノ酸3555-3876、配列番号5のアミノ酸3886-4048、配列番号5のアミノ酸4433-4719、配列番号5のアミノ酸4729-4974、配列番号5のアミノ酸5010-5082、配列番号5のアミノ酸5103-5525、配列番号5のアミノ酸5631-5951、配列番号5のアミノ酸5964-6132、配列番号5のアミノ酸6542-6837、配列番号5のアミノ酸6857-7101、配列番号5のアミノ酸7140-7211、配列番号6、配列番号6のアミノ酸35-454、配列番号6のアミノ酸561-881、配列番号6のアミノ酸1143-1393、配列番号6のアミノ酸1430-1503、配列番号6のアミノ酸1522-1946、配列番号6のアミノ酸2053-2373、配列番号6のアミノ酸2383-2551、配列番号6のアミノ酸2671-3045、配列番号6のアミノ酸3392-3636、配列番号6のアミノ酸3673-3745、配列番号7、配列番号7のアミノ酸32-450、配列番号7のアミノ酸556-877、配列番号7のアミノ酸887-1051、配列番号7のアミノ酸1478-1790、配列番号7のアミノ酸1810-2055、配列番号7のアミノ酸2093-2164、配列番号7のアミノ酸2165-2439、配列番号8、配列番号10、配列番号11および配列番号22。 - ヌクレオチド配列がミクソバクテリウムから分離される、請求項26〜30のいずれかに記載の分離された核酸分子。
- ミクソバクテリウムがソランジウム・セルロースム(Sorangium cellulosum)である、請求項31に記載の分離された核酸分子。
- 請求項26〜32のいずれかに記載の核酸分子と作動可能に結合する異種プロモーター配列を含むキメラ遺伝子。
- 請求項33に記載のキメラ遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項33に記載のキメラ遺伝子を含む組換え宿主細胞。
- 請求項26〜32のいずれかに記載の核酸分子を含む Bac クローン。
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