PL200157B1

PL200157B1 - Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, hybrydowy gen zawierający heterologiczną sekwencję promotora, zrekombinowany wektor, zrekombinowana komórka gospodarza, klon Bac, wyizolowany polipeptyd, sposób heterologicznej ekspresji epotilonu oraz sposób produkcji epotilonu

Info

Publication number: PL200157B1
Application number: PL345579A
Authority: PL
Inventors: Thomas Schupp; James Madison Ligon; Istvan Molnar; Ross Zirkle; Jörn Görlach; Devon Cyr
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1998-06-18
Filing date: 1999-06-16
Publication date: 2008-12-31
Also published as: IL139735A0; HUP0102186A2; KR100511233B1; NZ508326A; NO20006195L; IL190391A0; WO1999066028A3; AU4611699A; CN100374565C; WO1999066028A2; CN1305530A; TR200003759T2; PL345579A1; NO20091055L; BR9911349A; HUP0102186A3; JP2008092958A; JP2002518004A; ID29128A; IL139735A

Abstract

Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanej cz asteczki kwasu nukleinowego, hybrydowego genu zawieraj acego heterologiczn a sekwencj e promotora, zrekombinowanego wektora, zrekombinowanej komórki gospodarza, klonu Bac, wyizolowanego polipeptydu, sposobu heterologicznej ekspresji epotilo- nu oraz sposobu produkcji epotilonu. Bardziej szczegó lowo, wynalazek dotyczy poliketydów i genów ich syntezy, a w szczególno sci izolacji i charakterystyki nowej syntazy poliketydów i genów nierybosomalnej syntetazy peptydowej z Sorangium cellulosum, które s a potrzebne do biosyntezy epotilonów A i B. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, hybrydowego genu zawierającego heterologiczną sekwencję promotora, zrekombinowanego wektora, zrekombinowanej komórki gospodarza, klonu Bac, wyizolowanego polipeptydu, sposobu heterologicznej ekspresji epotilonu oraz sposobu produkcji epotilonu. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy poliketydów i genów ich syntezy, a w szczególności izolacji i charakterystyki nowej syntazy poliketydów i genów nierybosomalnej syntetazy peptydowej z Sorangium cellulosum, które są potrzebne do biosyntezy epotilonów A i B.

Poliketydy są związkami syntetyzowanymi z dwuwęglowych cegiełek, których β-węgiel zawsze niesie grupę keto, stąd nazwa poliketyd. Te związki obejmują wiele ważnych antybiotyków, związków immunosupresyjnych, czynników do chemioterapii nowotworów i innych związków mających szeroki zakres właściwości biologicznych. Olbrzymia różnorodność strukturalna jest wynikiem różnych długości łańcucha poliketydowego, różnych wprowadzanych łańcuchów bocznych (albo jako część dwuwęglowych jednostek budulcowych albo po utworzeniu szkieletu poliketydowego i stereochemii takich grup. Grupy keto mogą być też zredukowane do hydroksyli, enoili lub całkowicie usunięte. Każda runda dodawania dwóch węgli jest przeprowadzana przez kompleks enzymów zwanych syntazą poliketydów (PKS) w sposób podobny do biosyntezy kwasów tłuszczowych.

Geny biosyntetyczne dla coraz większej liczby poliketydów zostały wyizolowane i zsekwencjonowane. Na przykład zobacz amerykańskie dokumenty patentowe nr 5,639,949, 5,693,774, i 5,716,849, wszystkie tu włączone jako odnośniki, które opisują geny biosyntezy sorafanu. Zobacz też, Schupp i wsp., FEMS Microbiology Letters 159: 201-207 (1998) i WO 98/07868, który opisuje geny biosyntezy rifamycyny i amerykański dokument patentowy nr 5,876,991, który opisuje geny biosyntezy tylaktonu, które są wszystkie tu włączone jako odnośniki. Kodowane białka na ogół dzielą się na dwa typy: typ I i typ II. Białka typu I są polifunkcyjne i zawierają z kilka domen katalitycznych przeprowadzających różne etapy enzymatyczne połączonymi razem kowalencyjnie (n.p. PKS dla erytromycyny, sorafenu, rifamycyny i awermektyny (MacNeil i wsp., w Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (red.: Baltz i wsp.), American Society for Microbiology, Washington D.C. str. 245-256 (1993)); podczas gdy białka typu II są monofunkcjonalne (Hutchinson i wsp., w Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (red.: Baltz i wsp.), American Society for Microbiology, Washington D. C. str. 203-216 (1993)).

Dla prostszych poliketydów takich jak aktynorodyna (produkowana przez Streptomyces coelicolor), kilka rund dodawania po dwa węgle jest przeprowadzane iteracyjnie na enzymach PKS kodowanych przez jeden zestaw genów PKS. Przeciwnie, synteza bardziej złożonych związków takich jak erytromycyna i sorafen obejmuje enzymy PKS, które są zorganizowane w moduły gdzie gdy każdy moduł przeprowadza jedną rundę dodawania dwóch węgli (przegląd patrz Hopwood i wsp., w Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (red.: Baltz i wsp.), American Society for Microbiology, Washington D.C., str. 267- 275 (1993)).

Złożone poliketydy i metabolity wtórne na ogół mogą zawierać podstruktury pochodzące z aminokwasów raczej niż z prostych kwasów karboksylowych. Inkorporacja tych jednostek jest przeprowadzana przez nierybosomalne syntetazy peptydowe (NRPS). NRPS są multienzymami, które są zorganizowane w moduły. Każdy moduł jest odpowiedzialny za dodanie (i jeśli jest to wymagane dodatkową obróbkę) jednej cegiełki aminokwasu. NRPS aktywują aminokwasy przez tworzenie aminoacyloadenylanów i wyłapują zaktywowane aminokwasy na grupach tiolowych fosfopanteteinylowych grup prostetycznych na domenach białka nośnika peptydylu. Dalej, NRPS modyfikują aminokwasy poprzez epimeryzację, N-metylację lub cyklizację, jeśli jest to potrzebne i katalizują tworzenie wiązań peptydowych między związanymi z enzymem aminokwasami. NRPS są odpowiedzialne za biosyntezę wtórnych metabolitów peptydów takich jak cyklosporyna, mogą dostarczać jednostek zakończenia łańcucha takich jak w rapamycycynie lub tworzyć mieszane systemy z PKS jak w biosyntezie yersiniabaktyny.

Epotilony A i B są 16-członowymi makrocyklicznymi poliketydami z jednostką startera pochodzącą od acylocysteiny, które są produkowane przez bakterię Sorangium cellulosum szczep So ce90 (Gerth i wsp., J. Antibiotics 49: 560-563 (1996), włączone tu w postaci odniesienia). Struktura epotilonu A i B gdzie R oznacza wodór (epotilon A) lub metyl (epotilon B) jest następująca:

PL 200 157 B1

Epotilony mają wąskie spektrum działania przeciwgrzybowego i szczególnie wykazują wysoką cytotoksyczność w hodowlach komórek zwierząt (zobacz Hafie i wsp., dokument patentowy DE 4138042 (1993), włączony tu jako odnośnik). Bardzo ważne jest, że epotilony imitują efekt biologiczny taksolu, zarówno in vivo, jak i w hodowanych komórkach (Bollag i wsp., Cancer Research 55: 2325-2333 (1995), włączony tu jako odnośnik. Taksol i taksoter, które stabilizują mikrotubule komórek są czynnikami do chemioterapii nowotworów o znaczącej aktywności w stosunku do różnych ludzkich guzów litych (Rowinsky i wsp., J. Natl. Cancer Inst. 83: 1778-1781 (1991)). Badania kompetycyjne wykazały, że epotilony działają jako inhibitory współzawodniczące wiązania taksolu do mikrotubul, zgodnie z interpretacją, że mają wspólne miejsce wiązania mikrotubul i powinowactwo do mikrotubul jak taksol. Jednak epotilony mają znaczącą przewagę nad taksolem, jako że epotilony wykazują znacznie mniejszy spadek mocy w porównaniu z taksolem w stosunku do linii z opornością na wiele leków (801 lag i wsp. (1995)). Dalej, epotilony są znacznie mniej wydajnie eksportowane z komórki przez glikoproteiny P niż taksol (Gerth i wsp. (1996)). Dodatkowo, zsyntetyzowano kilka analogów epotilonu mających większą aktywność cytotoksyczną w porównaniu z epotilonem A lub epotilonem B jak wykazano przez ich zwiększoną zdolność do indukcji polimeryzacji i stabilizacji mikrotubul (WO 98/25929 włączony tu w postaci odniesienia).

Mimo oczekiwań w stosunku do epotilonów jako czynników przeciwnowotworowych, obecnie problemy dotyczące produkcji tych związków ograniczają ich potencjał handlowy. Związki są zbyt skomplikowane do syntezy chemicznej na skalę przemysłową i muszą być produkowane przez fermentację. Techniki do manipulacji genetycznej miksobakterii takich jak Sorangium cellulosum są opisane w amerykańskim dokumencie patentowym nr 5,686,295, włączonym tu w postaci odniesienia. Jednak jest wiadomo, że bardzo trudno jest prowadzić fermentację Sorangium cellulosum, tak więc poziomy produkcji epotilonów są niskie. Zrekombinowana produkcja epotilonów w gospodarzach heterologicznych, którzy są bardziej podatni na fermentację mogłaby rozwiązać obecne problemy. Jednak geny kodujące polipeptydy odpowiedzialne za biosyntezę epotilonu nie były dotychczas izolowane. Co więcej, szczep, który produkuje epotilony, tzn. So ce90, także produkuje przynajmniej jeden dodatkowy poliketyd, spirangien, co jak można oczekiwać bardzo by utrudniało izolację genów w szczególności odpowiedzialnych za biosyntezę epotilonu.

Tak więc ze względu na powyższe jednym celem niniejszego wynalazku jest izolacja genów, które biorą udział w syntezie epotilonów, w szczególności genów, które biorą udział w syntezie epotilonów A i B u myksobakterii grupy Sorangium/Polyangium, tzn. Sorangium cellulosum szczep So ce90. Dalszym celem wynalazku jest dostarczenie sposobu zrekombinowanej produkcji epotilonów do stosowania w formułach przeciwnowotworowych.

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydów, która koduje przynajmniej jeden polipeptyd biorący udział w biosyntezie epotilonu, charakteryzująca się tym, że ten polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: SEQ ID NO:2, aminokwasów 11-437 SEQ ID NO:2, aminokwasów 543-864 SEQ ID NO:2, aminokwasów 974-1273 SEQ ID NO:2, aminokwasów 1314-1385 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, aminokwasów 72-81 SEQ ID NO:3, aminokwasów 118-125 SEQ ID NO:3, aminokwasów 199-212 SEQ ID NO:3, aminokwasów 353-363 SEQ ID NO:3, aminokwasów 549-565 SEQ ID NO:3, aminokwasów 588-603 SEQ ID NO:3, aminokwasów 669-684 SEQ ID NO:3, aminokwasów 815-821 SEQ ID NO:3, aminokwasów 868-892 SEQ ID NO:3, aminokwasów 903-912 SEQ ID NO:3, aminokwasów 918-940 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1268-1274 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1285-1297 SEQ ID NO:3, aminokwasów 973-1256 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1344-1351 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, aminokwasów 7-432 SEQ ID NO:4, aminokwasów 539-859 SEQ ID NO:4, aminokwasów 869-1037 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1439-1684 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1722-1792 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, aminokwasów 39-457 SEQ ID NO:5, aminokwasów 563-884 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1147-1399 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1434-1506 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1524-1950 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2056-2377 SEQ ID NO:5, ami4

PL 200 157 B1 nokwasów 2645-2895 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2932-3005 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3024-3449 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3555-3876 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3886-4048 SEQ ID NO:5, aminokwasów 4433-4719 SEQ ID NO:5, aminokwasów 4729-4974 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5010-5082 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5103-5525 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5631-5951 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5964-6132 SEQ ED NO:5, aminokwasów 6542-6837 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6857-7101 SEQ ID NO:5, aminokwasów 7140-7211 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, aminokwasów 35-454 SEQ ID NO:6, aminokwasów 561-881 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1143-1393 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1430-1503 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1522-1946 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2053-2373 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2383-2551 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2671-3045 SEQ ID NO:6, aminokwasów 3392-3636 SEQ ID NO:6 aminokwasów 3673-3745 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, aminokwasów 32-450 SEQ ID NO:7, aminokwasów 556-877 SEQ ID NO:7, aminokwasów 887-1051 SEQ ID NO:7, aminokwasów 1478-1790 SEQ ID NO:7, aminokwasów 1810-2055 SEQ ID NO:7, aminokwasów 2093-2164 SEQ ID NO:7, aminokwasów 2165-2439 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:22.

Korzystnie, polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy złożonej z: SEQ ID NO:2, aminokwasów 11-437 SEQ ID NO:2, aminokwasów 543-864 SEQ ID NO:2, aminokwasów 974-1273 SEQ ID NO:2, aminokwasów 1314-1385 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, aminokwasów 72-81 SEQ ID NO:3, aminokwasów 118-125 SEQ ID NO:3, aminokwasów 199-212 SEQ ID NO:3, aminokwasów 353-363 SEQ ID NO:3, aminokwasów 549-565 SEQ ID NO:3, aminokwasów 588-603 SEQ ID NO:3, aminokwasów 669-684 SEQ ID NO:3, aminokwasów 815-821 SEQ ID NO:3, aminokwasów 868-892 SEQ ID NO:3, aminokwasów 903-912 SEQ ID NO:3, aminokwasów 918-940 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1268-1274 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1285-1297 SEQ ID NO:3, aminokwasów 973-1256 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1344-1351 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, aminokwasów 7-432 i SEQ ID NO:4, aminokwasów 539-859 SEQ ID NO:4, aminokwasów 869-1037 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1439-1684 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1722-1792 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, aminokwasów 39-457 SEQ ID NO:5, aminokwasów 563-884 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1147-1399 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1434-1506 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1524-1950 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2056-2377 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2645-2895 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2932-3005 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3024-3449 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3555-3876 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3886-4048 SEQ ID NO:5, aminokwasów 4433-4719 SEQ ID NO:5, aminokwasów 4729-4974 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5010-5082 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5103-5525 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5631-5951 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5964-6132 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6542-6837 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6857-7101 SEQ ID NO:5, aminokwasów 7140-7211 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, aminokwasów 35-454 SEQ ID NO:6, aminokwasów 561-881 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1143-1393 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1430-1503 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1522-1946 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2053-2373 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2383-2551 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2671-3045 SEQ ID NO:6, aminokwasów 3392-3636 SEQ BD NO:6, aminokwasów 3673-3745 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, aminokwasów 32-450 SEQ ID NO:7, aminokwasów 556-877 SEQ ID NO:7, aminokwasów 887-1051 SEQ ID NO:7, aminokwasów 1478-1790 SEQ ID NO:7, aminokwasów 1810-2055 SEQ ID NO:7, aminokwasów 2093-2164 SEQ ID NO:7, aminokwasów 2165-2439 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:22.

W innym korzystnym wariancie wynalazku, sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z sekwencji komplementarnych do nukleotydów 1900-3171 SEQ ID NO:1, nukleotydów 3415-5556 SEQ ID NO:1, nukleotydów 7610-11875 SEQ ID NO:1, nukleotydów 7643-8920 SEQ ID NO:1, nukleotydów 9236-10201 SEQ ID NO:1, nukleotydów 10529-11428 SEQ ID NO:1, nukleotydów 11549-11764 SEQ ID NO:1, nukleotydów 11872-16104 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12085-12114 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12223-12246 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12466-12507 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12928-12960 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13516-13566 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13633-13680 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13876-13923 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14313-14334 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14473-14547 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14578-14607 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14623-14692 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15673-15693 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15724-15762 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14788-15639 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15901-15924 SEQ ID NO:1, nukleotydów 16251-21749 SEQ ID NO:1, nukleotydów 16269-17546 SEQ ID NO:1, nukleotydów 17865-18827 SEQ ID NO:1, nukleotydów 18855-19361 SEQ ID NO:1, nukleotydów 20565-21302 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21414-21626 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21746-43519 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21860-23116 SEQ ID NO:1,

PL 200 157 B1 nukleotydów 23431-24397 SEQ ID NO:1, nukleotydów 25184-25942 SEQ ID NO:1, nukleotydów 26045-26263 SEQ ID NO:1, nukleotydów 26318-27595 SEQ ID NO:1, nukleotydów 27911-28876 SEQ ID NO:1, nukleotydów 29678-30429 SEQ ID, NO:1, nukleotydów 30539-30759 SEQ ID NO:1, nukleotydów 30815-32092 SEQ ID NO:1, nukleotydów 32408-33373 SEQ ID NO:1, nukleotydów 33401-33889 SEQ ID NO:1, nukleotydów 35042-35902 SEQ ID NO:1, nukleotydów 35930-36667 SEQ ID NO:1, nukleotydów 36773-36991 SEQ ID NO:1, nukleotydów 37052-38320 SEQ ID NO:1, nukleotydów 38636-39598 SEQ ID NO:1, nukleotydów 39635-40141 SEQ ID NO:1, nukleotydów 41369-42256 SEQ ID NO:1, nukleotydów 42314-43048 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43163-43378 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43524-54920 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43626-44885 SEQ ID NO:1, nukleotydów 45204-46166 SEQ ID NO:1, nukleotydów 46950-47702 SEQ ID NO:1, nukleotydów 47811-48032 SEQ ID NO:1, nukleotydów 48087-49361 SEQ ID NO:1, nukleotydów 49680-50642 SEQ ID NO:1, nukleotydów 50670-51176 SEQ ID NO:1, nukleotydów 51534-52657 SEQ ID NO:1, nukleotydów 53697-54431 SEQ ID NO:1, nukleotydów 54540-54758 SEQ ID NO:1, nukleotydów 54935-62254 SEQ ID NO:1, nukleotydów 55028-56284 SEQ ID NO:1, nukleotydów 56600-57565 SEQ ID NO:1, nukleotydów 57593-58087 SEQ ID NO:1, nukleotydów 59366-60304 SEQ ID NO:1, nukleotydów 60362-61099 SEQ ID NO:1, nukleotydów 61211-61426 SEQ ID NO:1, nukleotydów 61427-62254 SEQ ID NO:1, nukleotydów 62369-63628 SEQ ID NO:1, nukleotydów 67334-68251 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 1-68750 SEQ ID NO:1.

W jeszcze innym korzystnym wariancie wynalazku, sekwencja nukleotydów jest wybrana z grupy złożonej z sekwencji komplementarnych do nukleotydów 1900-3171 SEQ ID NO:1, nukleotydów 3415-5556 SEQ ID NO:1, nukleotydów 7610-11875 SEQ ID NO:1, nukleotydów 7643-8920 SEQ ID NO:1, nukleotydów 9236-10201 SEQ ID NO:1, nukleotydów 10529-11428 SEQ ID NO:1, nukleotydów 11549-11764 SEQ ID NO:1, nukleotydów 11872-16104 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12085-12114 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12223-12246 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12466-12507 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12928-12960 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13516-13566 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13633-13680 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13876-13923 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14313-14334 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14473-14547 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14578-14607 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14623-14692 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15673-15693 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15724-15762 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14788-15639 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15901-15924 SEQ ID NO:1, nukleotydów 16251-21749 SEQ ID NO:1, nukleotydów 16269-17546 SEQ ID NO:1, nukleotydów 17865-18827 SEQ ID NO:1, nukleotydów 18855-19361 SEQ ID NO:1, nukleotydów 20565-21302 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21414-21626 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21746-43519 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21860-23116 SEQ ID NO:1, nukleotydów 23431-24397 SEQ ID NO:1, nukleotydów 25184-25942 SEQ ID NO:1, nukleotydów 26045-26263 SEQ ID NO:1, nukleotydów 26318-27595 SEQ ID NO:1, nukleotydów 27911-28876 SEQ ID NO:1, nukleotydów 29678-30429 SEQ ID NO:1, nukleotydów 30539-30759 SEQ ID NO:1, nukleotydów 30815-32092 SEQ ID NO:1, nukleotydów 32408-33373 SEQ ID NO:1, nukleotydów 33401-33889 SEQ ID NO:1, nukleotydów 35042-35902 SEQ ID NO:1, nukleotydów 35930-36667 SEQ ID NO:1, nukleotydów 36773-36991 SEQ ID NO:1, nukleotydów 37052-38320 SEQ ID NO:1, nukleotydów 38636-39598 SEQ ID NO:1, nukleotydów 39635-40141 SEQ ID NO:1, nukleotydów 41369-42256 SEQ ID NO:1, nukleotydów 42314-43048 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43163-43378 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43524-54920 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43626-44885 SEQ ID NO:1, nukleotydów 45204-46166 SEQ ID NO:1, nukleotydów 46950-47702 SEQ ID NO:1, nukleotydów 47811-48032 SEQ ID NO:1, nukleotydów 48087-49361 SEQ ID NO:1, nukleotydów 49680-50642 SEQ ID NO:1, nukleotydów 50670-51176 SEQ ID NO:1, nukleotydów 51534-52657 SEQ ID NO:1, nukleotydów 53697-54431 SEQ ID NO:1, nukleotydów 54540-54758 SEQ ID NO:1, nukleotydów 54935-62254 SEQ ID NO:1, nukleotydów 55028-56284 SEQ ID NO:1, nukleotydów 56600-57565 SEQ ID NO:1, nukleotydów 57593-58087 SEQ ID NO:1, nukleotydów 59366-60304 SEQ ID NO:1, nukleotydów 60362-61099 SEQ ID NO:1, nukleotydów 61211-61426 SEQ ID NO:1, nukleotydów 61427-62254 SEQ ID NO:1, nukleotydów 62369-63628 SEQ ID NO:1, nukleotydów 67334-68251 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 1-68750 SEQ ID NO:1.

Korzystnie, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym ta domena syntazy epotilonu jest domeną β-ketoacylo syntazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 11-437 SEQ ID NO:2, aminokwasów 7-432 SEQ ID NO:4, aminokwasów 39-457 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1524-1950 SEQ ID NO:5, amino6

PL 200 157 B1 kwasów 3024-3449 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5103-5525 SEQ ID NO:5, aminokwasów 35-454 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1522-1946 SEQ ID NO: 6 i aminokwasów 32-450 SEQ ID NO:7.

Korzystnie, sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 7643-8920 SEQ ID NO:1, nukleotydów 16269-17546 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21860-23116 SEQ ID NO:1, nukleotydów 26318-27595 SEQ ID NO:1, nukleotydów 30815-32092 SEQ ID NO:1, nukleotydów 37052-38320 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43626-44885 SEQ ID NO:1, nukleotydów 48087-49361 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 55028-56284 SEQ ID NO:1.

W innym, korzystnym wariancie wynalazku, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym ta domena syntazy epotilonu jest domeną acylotransferazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 543-864 SEQ ID NO:2, aminokwasów 539-859 SEQ ID NO:4, aminokwasów 563-884 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2056-2377 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3555-3876 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5631-5951 SEQ ID NO:5, aminokwasów 561-881 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2053-2373 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 556-877 SEQ ID NO:7.

Korzystnie, sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 9236-10201 SEQ ID NO:1, nukleotydów 17865-18827 SEQ ID NO:1, nukleotydów 23431-24397 SEQ ID NO:1, nukleotydów 27911-28876 SEQ ID NO:1, nukleotydów 32408-33373 SEQ ID NO:1, nukleotydów 38636-39598 SEQ ID NO:1, nukleotydów 45204-46166 SEQ ID NO:1, nukleotydów 49680-50642 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 56600-57565 SEQ ID NO:1.

W jeszcze innym, korzystnym wariancie wynalazku, wyizolowana czą steczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym domena syntazy epotilonu jest domeną reduktazy enoilu zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 974-1273 SEQ ID NO:2, aminokwasów 4433-4719 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6542-6837 SEQ ID NO:5 i aminokwasów 1478-1790 SEQ ID NO:7.

Korzystnie, sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 10529-11428 SEQ ID NO:1, nukleotydów 35042-35902 SEQ ID NO:1, nukleotydów 41369-42256 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 59366-60304 SEQ ID NO:1.

W kolejnym, korzystnym wariancie wynalazku, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym domena syntazy epotilonu jest domeną białka przenoszącego grupę acylową zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 1314-1385 SEQ ID NO:2, aminokwasów 1722-1792 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1434-1506 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2932-3005 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5010-5082 SEQ ID NO:5, aminokwasów 7140-7211 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1430-1503 SEQ ID NO:6, aminokwasów 3673-3745 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 2093-2164 SEQ ID NO:7.

Korzystnie, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 11549-11764 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21414-21626 SEQ ID NO:1, nukleotydów 26045-26263 SEQ ID NO:1, nukleotydów 30539-30759 SEQ ID NO:1, nukleotydów 36773-36991 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43163-43378 SEQ ID NO:1, nukleotydów 47811-48032 SEQ ID NO:1, nukleotydów 54540-54758 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 61211-61426 SEQ ID NO:1.

W innym, korzystnym wariancie wynalazku, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym domena syntazy epotilonu jest domeną dehydratazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 869-1037 SEQ ID NO:4, aminokwasów 3886-4048 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5964-6132 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2383-2551 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 887-1051 SEQ ID NO:7.

Korzystnie, sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 18855-19361 SEQ ID NO:1, nukleotydów 33401-33889 SEQ ID NO:1, nukleotydów 39635-40141 SEQ ID NO:1, nukleotydów 50670-51176 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 57593-58087 SEQ ID NO:1.

W kolejnym, korzystnym wariancie wynalazku, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym domena syntazy epotilonu jest domeną β-ketoreduktazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadPL 200 157 B1 niczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 1439-1684 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1147-1399 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2645-2895 SEQ ID NO:5, aminokwasów 4729-4974 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6857-7101 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1143-1393 SEQ ID NO:6, aminokwasów 3392-3636 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 1810-2055 SEQ ID NO:7.

Korzystnie, sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 20565-21302 SEQ ID NO:1, nukleotydów 25184-25942 SEQ ID NO:1, nukleotydów 29678-30429 SEQ ID NO:1, nukleotydów 35930-36667 SEQ ID NO:1, nukleotydów 42314-43048 SEQ ID NO:1, nukleotydów 46950-47702 SEQ ID NO:1, nukleotydów 53697-54431 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 60362-61099 SEQ ID NO:1.

W jeszcze innym, korzystnym wariancie wynalazku, wyizolowana czą steczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym domena syntazy jest domeną metylotransferazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do aminokwasów 2671-3045 SEQ ID NO:6.

Korzystnie, sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna to nukleotydów 51534-52657 SEQ ID NO:1.

W innym, korzystnym wariancie wynalazku, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym domena syntazy epotilonu jest domeną tioesterazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do aminokwasów 2165-2439 SEQ ID NO:7.

Korzystnie, sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do nukleotydów 61427-62254 SEQ ID NO:1.

W kolejnym, korzystnym wariancie wynalazku, wyizolowana czą steczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydów, która koduje nierybosomalną syntetazę peptydową, przy czym, nierybosomalna syntetaza peptydowa zawiera sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: SEQ ID NO:3, aminokwasów 72-81 SEQ ID NO:3, aminokwasów 118-125 SEQ ID NO:3, aminokwasów 199-212 SEQ ID NO:3, aminokwasów 353-363 SEQ ID NO:3, aminokwasów 549-565 SEQ ID NO:3, aminokwasów 588-603 SEQ ID NO:3, aminokwasów 669-684 SEQ ID NO:3, aminokwasów 815-821 SEQ ID NO:3, aminokwasów 868-892 SEQ ID NO:3, aminokwasów 903-912 SEQ ID NO:3, aminokwasów 918-940 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1268-1274 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1285-1297 SEQ ID NO:3, aminokwasów 973-1256 SEQ ID NO:3 i aminokwasów 1344-1351 SEQ ID NO:3.

Korzystnie, sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 11872-16104 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12085-12114 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12223-12246 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12466-12507 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12928-12960 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13516-13566 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13633-13680 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13876-13923 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14313-14334 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14473-14547 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14578-14607 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14623-14692 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15673-15693 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15724-15762 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14788-15639 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 15901-15924 SEQ ID NO:1.

Korzystnie, sekwencja nukleotydowa izolowana jest z miksobakterii.

Korzystnie, miksobakteria stanowi Sorangium cellulosum.

Przedmiotem wynalazku jest również, hybrydowy gen zawierający heterologiczną sekwencję promotora charakteryzujący się tym, że heterologiczna sekwencja promotora jest funkcjonalnie połączona z cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także zrekombinowany wektor charakteryzujący się tym, że zawiera hybrydowy gen według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zrekombinowana komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera hybrydowy gen według wynalazku.

Korzystnie, zrekombinowana komórka gospodarza jest bakterią.

Korzystnie, zrekombinowana komórka gospodarza należy do promieniowców.

Korzystnie, zrekombinowana komórka gospodarza należy do rodzaju Streptomyces.

Przedmiotem wynalazku jest także klon Bac charakteryzujący się tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wyizolowany polipeptyd charakteryzujący się tym, że zawiera sekwencję aminokwasów, w skład której wchodzi domena syntazy epotilonu.

PL 200 157 B1

Korzystnie, domena syntazy epotilonu jest domeną β-ketoacylo syntazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej grupy złożonej z: aminokwasów 11-437 SEQ ID NO:2, aminokwasów 7-432 SEQ ID NO:4, aminokwasów 39-457 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1524-1950 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3024-3449 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5103-5525 SEQ ID NO:5, aminokwasów 35-454 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1522-1946 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 32-450 SEQ ID NO:7.

W innym korzystnym wariancie wynalazku, domena syntazy epotilonu jest domeną acylotransferazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 543-864 SEQ ID NO:2, aminokwasów 539-859 SEQ ID NO:4, aminokwasów 563-884 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2056-2377 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3555-3876 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5631-5951 SEQ ID NO:5, aminokwasów 561-881 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2053-2373 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 556-877 SEQ ID NO:7.

W jeszcze innym korzystnym wariancie wynalazku, domena syntazy epotilonu jest domeną reduktazy enoilu zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 974-1273 SEQ ID NO:2, aminokwasów 4433-4719 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6542-6837 SEQ ID NO:5 i aminokwasów 1478-1790 SEQ ID NO:7.

W kolejnym korzystnym wariancie wynalazku domena syntazy enoilu jest domeną białka przenoszącego grupę acylową, przy czym polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 1314-1385 SEQ ID NO:2, aminokwasów 1722-1792 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1434-1506 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2932-3005 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5010-5082 SEQ ID NO:5, aminokwasów 7140-7211 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1430-1503 SEQ ID NO:6, aminokwasów 3673-3745 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 2093-2164 SEQ ID NO:7.

W innym korzystnym wariancie wynalazku, domena syntazy epotilonu jest domeną dehydratazy, zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 869-1037 SEQ ID NO:4, aminokwasów 3886-4048 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5964-6132 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2383-2551 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 887-1051 SEQ ID NO:7.

W kolejnym, korzystnym wariancie wynalazku domena syntazy epotilonu jest domeną β-ketoreduktazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 1439-1684 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1147-1399 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2645-2895 SEQ ID NO:5, aminokwasów 4729-4974 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6857-7101 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1143-1393 SEQ ID NO:6, aminokwasów 3392-3636 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 1810-2055 SEQ ID NO:7.

W innym korzystnym wariancie wynalazku, domena syntazy epotilonu jest domeną metylotransferazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do aminokwasów 2671-3045 SEQ ID NO:6.

W jeszcze innym korzystnym wariancie wynalazku domena syntazy epotilonu jest domeną tioesterazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do aminokwasów 2165-2439 SEQ ID NO:7.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto, sposób heterologicznej ekspresji epotilonu w zrekombinowanym gospodarzu, charakteryzujący się tym, że obejmuje:

(a) wprowadzenie hybrydowego genu według wynalazku do gospodarza; i (b) hodowlę gospodarza w warunkach, które pozwalają na biosyntezę epotilonu u gospodarza.

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest, sposób produkcji epotilonu, charakteryzujący się tym, że obejmuje:

(a) ekspresję epotilonu w zrekombinowanym gospodarzu sposobem według wynalazku; i (b) ekstrakcję epotilonu ze zrekombinowanego gospodarza.

Przedmiotowy wynalazek nieoczekiwanie przezwycięża trudności podane powyżej by po raz pierwszy dostarczyć cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydów, która koduje przynajmniej jeden polipeptyd biorący udział w biosyntezie epotilonu. W korzystnej postaci sekwencja nukleotydów jest izolowana z gatunku należącego do miksobakterii, najbardziej korzystnie

Sorangium cellulosum.

W korzystnej postaci zrekombinowana komórka gospodarza jest bakterią należącą do rzędu promieniowców (Actinomycetales), i w bardziej korzystnej postaci zrekombinowana komórka gospodarza jest szczepem Streptomyces, jednakże w innych wariantach zrekombinowana komórka gospodarza jest dowolną inną bakterią podatną na fermentacje taką jak Pseudomonas lub E. coli.

PL 200 157 B1

Korzystnie klonem Bac jest klon pEPO15.

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobów dla zrekombinowanej produkcji poliketydów takich jak epotilony w ilościach dostatecznie dużych by umożliwić ich oczyszczanie i zastosowanie w farmaceutycznych preparatach takich jak do leczenia raka. Specyficzną korzyścią tych sposobów wytwarzania jest chiralność produkowanych cząsteczek, poza tym produkcja w organizmach transgenicznych unika wytwarzania populacji mieszanin racemicznych, wśród których niektóre enancjomery mogą mieć obniżone aktywności.

Inne aspekty i korzyści niniejszego wynalazku staną się ewidentne dla specjalistów ze studiowania następującego opisu wynalazku i nieograniczających przykładów.

W opisie niniejszego wynalazku będą stosowane następujące określenia i mają być zdefiniowane jak podano poniżej:

Określenia „zasocjowane z / funkcjonalnie połączone dotyczy dwóch sekwencji DNA, które są powiązane fizycznie lub funkcjonalnie. Na przykład promotor lub regulacyjna sekwencja DNA jest określana jako zasocjowana z sekwencją DNA, która koduje RNA lub białko jeśli dwie sekwencje są połączone funkcjonalnie lub położone tak, że regulacyjna sekwencja DNA będzie wpływała na poziom ekspresji kodującej lub strukturalnej sekwencji DNA.

Określenie „hybrydowy gen oznacza zrekombinowaną sekwencję DNA, w której promotor lub regulacyjna sekwencja DNA jest funkcjonalnie połączona lub zasocjowana z sekwencją DNA, która koduje mRNA lub która jest wyrażana jako białko, tak, że sekwencja regulacyjna DNA jest zdolna do regulacji transkrypcji lub ekspresji zasocjowanej sekwencji DNA. Regulacyjna sekwencja DNA hybrydowego genu nie jest normalnie funkcjonalnie połączona do zasocjowanej sekwencji DNA znajdowanej w naturze.

Określenie „kodująca sekwencja DNA odnosi się do sekwencji DNA, która ulega translacji w organizmie by wyprodukować białko.

Określenie „domena oznacza część syntazy poliketydu potrzebną do danej konkretnej aktywności. Przykłady obejmują domeny: białka nośnika acylu (ACP), β-ketosyntazy (KS), acylotransferazy (AT), e-ketoreduktazy(KR), dehydratazy (OH), enoiloreduktazy (ER) i tioesterazy (TE).

Określenie „epotilony oznacza 16-członowe makrocykliczne poliketydy naturalnie produkowane przez bakterię Sorangium cellulosum szczep So ce90, które imitują biologiczne efekty taksolu. W tym zgłoszeniu, określenie epotilon dotyczy klasy poliketydów, która obejmuje epotilon A i epotilon B, jak i ich analogi takie jak te opisane w WO 98/25929.

Określenie „syntaza epotilonu dotyczy syntazy poliketydu odpowiedzialnej za biosyntezę epotilonu.

Określenie „gen oznacza zdefiniowany region, który jest zlokalizowany w obrębie genomu i który oprócz wymienionej sekwencji kodującej DNA, zawiera inne, przede wszystkim regulacyjne sekwencje DNA odpowiedzialne za kontrolę ekspresji, to znaczy transkrypcji i translacji, części kodującej.

Określenie „heterologiczna sekwencja DNA oznacza sekwencję DNA nie związaną naturalnie z komórką gospodarza, do której jest wprowadzana obejmując nie występujące naturalnie wielkokrotne kopie naturalnie występującej sekwencji DNA.

Określenie „homologiczna sekwencja DNA dotyczy sekwencji DNA naturalnie zasocjowanej z komórką gospodarza, do której jest wprowadzana.

Określenie „homologiczna rekombinacja odnosi się do wzajemnej wymiany fragmentów DNA między homologicznymi cząsteczkami DNA.

Określenie „izolowany: W kontekście niniejszego wynalazku, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego lub wyizolowany enzym jest cząsteczką kwasu nukleinowego lub enzymem, która, dzięki ręce ludzkiej istnieje poza swoim naturalnym środowiskiem i nie jest więc produktem naturalnym. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego lub enzym może istnieć w postaci oczyszczonej lub może istnieć w nienaturalnym otoczeniu takim jak na przykład zrekombinowana komórka gospodarza.

Określenie „moduł oznacza element genetyczny kodujący wszystkie odrębne aktywności wymagane w pojedynczej rundzie biosyntezy poliketydu tzn. jeden etap kondensacji i wszystkie związane z nią etapy obróbki β-karbonylu. Każdy moduł koduje aktywność ACP, KS, i AT aby uzyskać część kondensowaną biosyntezy i wybrane aktywności pokondensacyjne by przeprowadzić obróbkę β-karbonylu.

„NRPS - nierybosomalna syntetaza peptydu, która jest kompleksem aktywności enzymatycznych odpowiedzialnych za włączanie aminokwasów do metabolitów wtórnych obejmując na przykład domeny adenylacji aminokwasu, epimeryzacji, N-metylacji, cyklizacji, białka nośnika acylu i kondensacji. Funkcjonalny NRPS to taki, który katalizuje włączenie aminokwasu do metabolitu wtórnego.

PL 200 157 B1 „Gen NRPS - jeden lub więcej genów kodujących NRPS dla produkcji funkcjonalnych metabolitów wtórnych np. epotilonów A i B, gdy są pod kontrolą jednego lub więcej kompatybilnych elementów kontroli.

„Czą steczka kwasu nukleinowego - liniowy odcinek jedno- lub dwuniciowego DNA lub RNA, który może być wyizolowany z dowolnego źródła. W kontekście niniejszego wynalazku, cząsteczka kwasu nukleinowego korzystnie jest odcinkiem DNA.

„ORF - otwarta ramka odczytu.

„PKS - syntaza poliketydu, która jest kompleksem aktywności enzymatycznych (domen) odpowiedzialnych za biosyntezę poliketydów obejmując na przykład ketoreduktazę, dehydratazę, białko nośnika acylu, enoiloreduktazę, syntazę ketoacylo ACP i acylotransferazę. Funkcjonalna PKS to taka, która katalizuje syntezę poliketydu.

„Geny PKS - jeden lub więcej genów kodujących różne polipeptydy wymagane do produkcji funkcjonalnych poliketydów, np. epotilonów A i B, gdy są pod kontrolą jednego lub więcej kompatybilnych elementów kontrolnych.

„Zasadniczo podobne - odnośnie kwasów nukleinowych to cząsteczka kwasu nukleinowego, która ma przynajmniej 60 procent identyczności sekwencji z referencyjną cząsteczką kwasu nukleinowego. W korzystnej postaci, zasadniczo podobna sekwencja DNA jest w przynajmniej 95% identyczna podobna sekwencja DNA jest przynajmniej w 80% identyczna do referencyjnej sekwencji DNA; w bardziej korzystnej postaci, zasadniczo podobna sekwencja DNA jest w przynajmniej 90% identyczna do referencyjnej sekwencji DNA; i w najbardziej korzystnej postaci, do referencyjnej sekwencji DNA. Zasadniczo podobna sekwencja DNA korzystnie koduje białko lub peptyd mające zasadniczo tę samą aktywność jak białko lub peptyd kodowany przez referencyjną sekwencję DNA. Zasadniczo podobna sekwencja nukleotydów typowo hybrydyzuje do referencyjnej cząsteczki kwasu nukleinowego, lub jej fragmentów w następujących warunkach: hybrydyzacja w 7% dodecylosiarczanie sodu (SOS), 0,5 M NaPO4 pH 7,0, 1 mM EDTA w 50°C; płukanie 2 x SSC, 1% SOS, w 50°C. W odniesieniu do białek lub peptydów, zasadniczo podobna sekwencja aminokwasów jest sekwencją aminokwasów, która jest przynajmniej w 90% identyczna do sekwencji aminokwasów referencyjnego białka lub peptydu i ma zasadniczo tę samą aktywność jak białko referencyjne lub peptyd.

„Transformacja oznacza proces wprowadzania heterologicznego kwasu nukleinowego do komórki lub organizmu gospodarza.

Określenie „transformowany / transgeniczny / zrekombinowany - dotyczy organizmu gospodarza takiego jak bakteria, do którego wprowadzono heterologiczną cząsteczkę kwasu nukleinowego. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być stabilnie wprowadzona do genomu gospodarza lub cząsteczka kwasu nukleinowego może być też obecna jako cząsteczka pozachromosomalna. Taka cząsteczka pozachromosomalna może być autoreplikująca. Transformowane tkanki, komórki lub rośliny są rozumiane jako obejmujące nie tylko produkt procesu transformacji ale także jego transgeniczne potomstwo. Nieransformowany, nietransgeniczny, lub niezrekombinowany gospodarz dotyczy organizmu typu dzikiego, tzn. bakterii, która nie zawiera heterologicznej cząsteczki kwasu nukleinowego.

Nukleotydy są wskazywane poprzez ich zasady przez następujące standardowe skróty: adenina (A), cytozyna (C), tymina (T), i guanina (G). Aminokwasy są podobnie wskazywane przez następujące standardowe skróty: alanina (ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), kwas asparaginowy (Asp; D), cysteina (Cys; C), glutamina (Gin; Q), kwas glutaminowy (Glu; E), glicyna (Gly; G), histydyna (His; H), izoleucyna (Ile; I), leucyna (Leu; L), lizyna (lys; K), metionina (Met; M), fenyloalanina (Phe; F), pralina (Pro; P), seryna (Ser; S), treonina (Thr; T), tryptofan (Trp; W), tyrozyna (Tyr; y), i walina (Val; V). Co więcej, (Xaa; X) przedstawia dowolny aminokwas.

Opis sekwencji w liście sekwencji

SEQ ID NO:1 jest sekwencją nukleotydów kontigu 68750 bp zawierającego 22 otwarte ramki odczytu (ORF), które obejmują gen biosyntezy epotilonu.

SEQ ID NO:2 jest sekwencją białka syntazy poliketydu typu I (EPOS A) kodowanej przez epoA (nukleotydy 7610-11875 SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:3 jest sekwencją białka nierybosomalnej syntetazy peptydowej (EPOS P) kodowanej przez epoP (nukleotydy 11872-16104 SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:4 jest sekwencją białka syntazy poliketydu typu I (EPOS B) kodowanej przez epoB (nukleotydy 16251-21749 SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:5 jest sekwencją białka syntazy poliketydu typu I (EPOS C) kodowanej przez epoC (nukleotydy 21746-43519 SEQ ID NO:1).

PL 200 157 B1

SEQ ID NO:6 jest sekwencją białka syntazy poliketydu typu I (EPOS D) kodowanej przez epoD (nukleotydy 43524-54920 SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:7 jest sekwencją białka syntazy poliketydu typu I (EPOS E) kodowanej przez epoE (nukleotydy 54935-62254 SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:8 jest sekwencją białka homologu oksygenazy cytochromu P450 (EPOS F) kodowaną przez ep (nukleotydy 62369-63628 SEQ ID NO:1).

SEQ ED NO:9 jest częściową sekwencją białka (częściową Orf 1) kodowaną przez orf1 (nukleotydy 1-1826 SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:10 jest sekwencją białka (Orf 2) kodowaną przez orf2 (nukleotydy 3171-1900 na odwrotnym komplemencie nici SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:11 jest sekwencją białka (Orf 3) kodowaną przez orf3 (nukleotydy 3415-5556 SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:12 jest sekwencją białka (Orf 4) kodowaną przez orf4 (nukleotydy 5992-5612 na odwrotnym komplemencie nici SEQ ID NO: 1).

SEQ ID NO:13 jest sekwencją białka (Orf 5) kodowaną przez orf5 (nukleotydy 6226-6675 SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:14 jest sekwencją białka (Orf 6) kodowaną przez orf6 (nukleotydy 63779-64333 SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:15 jest sekwencją białka (Orf 7) kodowaną przez orf7 (nukleotydy 64290-63853 na odwrotnym komplemencie nici SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:16 jest sekwencją białka (Orf 8) kodowaną przez orf8 (nukleotydy 64363-64920 SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:17 jest sekwencją białka (Orf 9) kodowaną przez orf9 (nukleotydy 64727-64287 na odwrotnym komplemencie nici SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:18 jest sekwencją białka (Orf 10) kodowaną przez orf10 (nukleotydy 65063-65767 SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:19 jest sekwencją białka (Orf 11) kodowaną przez orf11 (nukleotydy 65874-65008 na odwrotnym komplemencie nici SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:20 jest sekwencją białka (Orf 12) kodowaną przez orf12 (nukleotydy 66338-65871 na odwrotnym komplemencie nici SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:21 jest sekwencją białka (Orf 13) kodowaną przez orf13 (nukleotydy 66667-67137 SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:22 jest sekwencją białka (Orf 14) kodowaną przez orf14 (nukleotydy 67334-68251 SEQ ID NO: 1).

SEQ ID NO:23 jest częściową sekwencję białka (częściowy Orf 15) kodowaną przez orf15 (nukleotydy 68346-68750 SEQ ID NO:1).

SEQ ID NO:24 jest sekwencją uniwersalnego odwrotnego primera do PCR.

SEQ ID NO:25 jest sekwencją uniwersalnego primera 5' do PCR.

SEQ ID NO:26 jest sekwencją NH24 końca B do PCR.

SEQ ID NO:27 jest sekwencją NH2 końca A do PCR.

SEQ ID NO:28 jest sekwencją NH2 końca B do PCR.

SEQ ID NO:29 jest sekwencją pEPO15-NH6 końca B do PCR.

SEQ ID NO:30 jest sekwencją pEPO15-H2.7 końca A do PCR.

Informacja o depozytach

Następujący materiał zdeponowano w Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, w ramach traktatu Budapeszteńskiego o Międzynarodowym uznaniu Depozytów Mikroorganizmów dla Celów Procedury Patentowej. Wszystkie ograniczenia odnośnie dostępności materiału zostaną nieodwołalnie usunięte po przyznaniu patentu.

Zdeponowany materiał Numer dostępu Data depozytu pEPO15 NRRLB-30033 11 czerwca 1998 pEPO32 NRRLB-30119 16 kwietnia 1999

Geny biorące udział w biosyntezie epotilonów mogą być wyizolowane przy zastosowaniu sposobu według niniejszego wynalazku. Korzystna procedura izolacji genu biosyntezy epotilonu wymaga izolacji genomowego DNA z organizmu zidentyfikowanego jako produkujący epotilony A i B i przeniesienie wyizolowanego DNA na odpowiednim plazmidzie lub wektorze do organizmu gospodarza, który normalnie nie produkuje poliketydu, a następnie identyfikacja stransformowanych kolonii gospodarza,

PL 200 157 B1 którym nadano zdolność do produkcji epotilonu. Stosując technikę taką jak mutageneza transpozonem λ::Τη5 (de Bruijn i Lupski, Gene 27: 131149 (1984)), można bardziej dokładnie zidentyfikować dokładny region nadający transformujący DNA epotilonu. Alternatywnie lub dodatkowo transformujący DNA nadający epotilon może być pocięty na mniejsze fragmenty i najmniejszy, który utrzymuje zdolność do nadawania epotilonu może być dalej scharakteryzowany. Podczas gdy organizm nie posiadający zdolności do produkcji epotilonu może być innym gatunkiem od organizmu, z którego pochodzi poliketyd, wariant tej techniki obejmuje transformację DNA gospodarza do tego samego gospodarza, który ma zdolność do syntezy epotilonu zniszczoną przez mutagenezę. W tym sposobie mutuje się organizm produkujący epotilon i izoluje się mutanty nie produkujące epotilonu. Te są następnie komplementowane przez genomowy DNA, wyizolowany z rodzicielskiego szczepu produkującego epotilon.

Dalszy przykład techniki, która może być stosowana do wyizolowania genu wymaganego do biosyntezy epotilonu jest stosowanie mutagenezy transpozonowej do wytwarzania mutantów produkującego epotilon organizmu, który po mutagenezie nie produkuje poliketydu. Tak więc region genomu gospodarza odpowiedzialny za produkcję epotilonu jest znakowany przez transpozon i może być odzyskany i stosowany jako sonda do izolacji natywnego genu ze szczepu rodzicielskiego. Geny PKS, które są wymagane do syntezy poliketydów i które są podobne do znanych genów PKS mogą być wyizolowane na podstawie ich homologii sekwencji do genów biosyntetycznych, których sekwencja jest znana, takich jak biosyntezy rifamycyny lub sorafenu. Techniki odpowiednie do izolacji na podstawie homologii obejmują standardowy skrining bibliotek poprzez hybrydyzację DNA.

Korzystne do stosowania jako cząsteczka sondy jest fragment DNA, który jest do uzyskania z genu lub innej sekwencji DNA, która bierze udział w syntezie znanego poliketydu. Korzystna cząsteczka sondy zawiera fragment DNA 1,2 kb Smal kodujący domenę ketosyntazy czwartego modułu PKS sorafenu (amerykański dokument patentowy nr 5,716,849) i bardziej preferowana cząsteczka sondy obejmuje domeny syntazy β-ketoacylu z pierwszego i drugiego modułu PKS rifamycyny (Schupp i wsp., FEMS Microbiology Letters 159: 201-207 (1998)). Mogą one być zastosowane do przeszukania biblioteki genowej aby wyizolować gen PKS odpowiedzialny za biosyntezę epotilonu.

Mimo dobrze znanych ogólnych trudności z izolacją genu PKS i mimo spodziewanych trudności przy izolacji w szczególności genu biosyntezy epotilonu przez stosowanie sposobów opisanych w niniejszej specyfikacji jest zadziwiające, że geny biosyntezy dla epotilonów A i B mogą być sklonowane z mikroorganizmu, który produkuje ten poliketyd.

Stosując sposoby manipulacji genów i produkcji zrekombinowanej opisane w tej specyfikacji, sklonowany gen PKS może być zmodyfikowany i wyrażony w transgenicznym organizmie gospodarza.

Wyizolowany gen biosyntezy epotilonu może być wyrażony w heterologicznym gospodarzu aby pozwolić na produkcję poliketydu z większą skutecznością niż by było możliwe z naturalnych gospodarzy. Techniki dla tych genetycznych manipulacji są specyficzne dla różnych odpowiednich gospodarzy i są znane w dziedzinie. Na przykład heterologiczny gen może być wyrażony w Streptomyces i innych promieniowcach stosując techniki takie jak opisane w McDaniel i wsp., Science 262: 1546-1550 (1993) i Kao i wsp., Science 265: 509-512 (1994), z których oba są tu włączone w postaci odniesienia. Zobacz też, Rowe i wsp., Gene 216: 215-223 (1998); Holmes i wsp., EMBO Journal 12(8): 31833191 (1993) i Bibb i wsp., Gene 38: 215-226 (1985), z których wszystkie są tu włączone jako odnośniki. Alternatywnie, gen odpowiedzialny za biosyntezę poliketydu, np. gen biosyntezy epotilonu może być też wyrażony w innych organizmach gospodarza takich jak Pseudomonas i E. coli. Techniki dla tych genetycznych manipulacji są specyficzne dla różnych dostępnych gospodarzy i są znane w dziedzinie. Na przykład geny PKS wyrażano z powodzeniem w E.coli stosując wektor pT7-7, który stosuje promotor T7. Zobacz Tabor i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1074-1078 (1985), włączone w postaci odniesienia. Dodatkowo, wektory ekspresyjne pKK223-3 i pKK223-2 mogą być stosowane do ekspresji heterologicznego genu w E. coli, w postaci fuzji transkrypcyjnej lub translacyjnej, za promotorem tac lub trc. Dla ekspresji operonów kodujących wielokrotne ORF, najprostszą procedurą jest wstawienie operonu do wektora takiego jak pKK223-3 w fuzji transkrypcyjnej fuzji pozwalając na stosowanie odpowiedniego miejsca wiązania heterologicznego genu. Techniki do nadekspresji w gatunkach Gram-dodatnich takich jak Bacillus są dobrze znane w dziedzinie i mogą być stosowane w kontekście tego wynalazku (Quax i wsp., w: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Red. Baltz i wsp., American Society for Microbiology, Washington (1993)).

Inne systemy ekspresyjne, które mogą być stosowane z genem biosyntezy epotilonu według wynalazku obejmują układy ekspresyjne drożdży i bakulowirusów. Zobacz na przykład The Expression of Recombinant Proteins in Yeasts, Sudbery, P. E., Curr. Opin. Biotechnol. 7(5): 517-524 (1996);

PL 200 157 B1

Methods for Expressing Recombinant Proteins in Yeast, Mackay i wsp., pod redakcją Carey, Paul R., Protein Eng. Des. 105-153, Wydawca: Academic, San Diego, Calif (1996); Expression of heterologous gene products in yeast, Pichuantes, i wsp., Redaktor(zy): Cieli, J. L., Craik, C. S., Protein Eng. 129-161, Wydawca: Wiley-Liss, New York, N. Y (1996); WO 98/27203; Kealey i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 505-509 (1998); Insect Cell Culture: Recent Advances, Bioengineering Challenges And Implications In Protein Production, Palomares, i wsp., pod redakcją: Galindo, Enrique; Ramirez, Octavio T., Adv. Bioprocess Eng. Tom. II, Invited Pap. Int. Symp., 2gi (1998) 25-52, Wydawca: Kluwer, Dordrecht, Holandia; Baculovirus Expression Wectors, Jarvis, Donald L., pod redakcją: Miller, Lois K., Baculoviruses 389-431, wydawca: Plenum, New York, N. Y. (1997); Production Of Heterologous Proteins Using The Baculovirus/Insect Expression System, Grittiths, i wsp., Methods Mol. Biol. (Totowa, N. J.) 75 (Basic Cell Hodowla Protocols (wydanie 2) 427-440 (1997); i Insect Cell Expression Technology, Luckow, Verne A., Protein Eng. 183-218, Wydawca: Wiley-Liss, New York,

N. Y. (1996); które wszystkie są tu włączone w postaci odniesienia.

Innym rozważaniem dla ekspresji genu PKS w heterologicznym gospodarzu jest wymaganie enzymów dla posttranslacyjnej modyfikacji enzymów PKS przez fosfopanteteinylację zanim mogą zsyntetyzować poliketydy. Jednak enzymy odpowiedzialne za tę modyfikację enzymów PKS typu I, fosfopanteteinylo (P-pant) transferazy nie są normalnie obecne u wielu gospodarzy takich jak E. coli. Ten problem może być rozwiązany przez koekspresję transferazy P-pant z genem PKS w heterologicznym gospodarzu, jak opisali Kealey i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 505-509 (1998) włączone jako odnośniki.

Tak więc dla celów produkcji poliketydów znaczące kryteria w wyborze organizmu gospodarza jest łatwość jego manipulacji, szybkość wzrostu (tzn. fermentacja), właściwości odpowiedniej maszynerii molekularnej takich jak modyfikacja posttranslacyjna i jego brak wrażliwości na nadprodukcję poliketydu. Najbardziej korzystnym organizmem gospodarza są promieniowce takie jak szczepy Streptomyces. Inne korzystne organizmy gospodarza to Pseudomonas i E. coli. Opisane powyżej sposoby produkcji poliketydu mają znaczące przewagi nad obecnie stosowaną w przygotowaniu związków technologią. Te zalety obejmują niższy koszt produkcji, zdolność do produkcji większych ilości związków, i zdolność do produkcji korzystnego biologicznego enancjomeru, w przeciwieństwie do mieszanin racemicznych nieuchronnie wytwarzanych przez syntezę organiczną. Związki produkowane przez heterologicznego gospodarza mogą być stosowane w zastosowaniach medycznych (np. terapia raka w przypadku epotilonów) jak i rolniczych.

Wynalazek będzie dalej opisany w odniesieniu do następujących szczegółowych przykładów. Te przykłady są dostarczone wyłącznie jako ilustracje i nie mają na celu bycie ograniczeniem o ile nie jest podane inaczej. Standardowe techniki rekombinacji DNA i klonowania molekularnego są dobrze znane w dziedzinie i były opisane przez Ausubel (red.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch i J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Col d Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); i przez T.J. Silhavy, M.L. Berman i L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Col d Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (l984).

P r z y k ł a d 1: Hodowla produkującego epotilon szczepu Sorangium cellulosum

Sorangium cellulosum szczep 90 (OSM 6773, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig) wysiewano i hodowano (30°C) na płytce z podłożem agarowym So1E (0,35% glukoza, 0,050% trypton, 0,15% MgSO4 x 7H2O, 0,05% siarczan amonu, 0,1% CaCl2, 0,006% K2HPO4, 0,01% ditionian sodu, 0,0008% Fe-EOTA, 1,2% HEPES, 3,5% [obj.] nadsącz sterylizowanej stacjonarnej hodowli S. cellulosum) pH do 7,4. Komórki z około 1 cm kwadratowego zbierano i zaszczepiano do 5 ml płynnej pożywki G51t (0,2% glukoza, 0,5% skrobia, 0,2% trypton, 0,1% probion S,

O, 05% CaCl2 x 2H2O, 0,05% MgSO4 x 7H2O, 1,2% HEPES, pH do 7,4) i inkubowano w 30°C z wytrząsaniem przy 225 obr/min. Po 4 dniach hodowlę przenoszono do 50 ml G51t i inkubowano jak powyżej przez 5 dni. Tę hodowlę użyto by zaszczepić 500 ml G51t i inkubowano jak powyżej przez 6 dni. Hodowlę wirowano przez 10 minut przy 4000 obr/min i osad komórek przeprowadzono w zawiesinę w 50 ml G51t.

P r z y k ł a d 2: Wytworzenie biblioteki sztucznego chromosomu bakteryjnego (Bac)

Aby wytworzyć bibliotekę Bac, komórki S. cellulosum hodowane jak opisano w przykładzie 1 powyżej zatapiano w blokach agarozy, lizowano i uwolniony genomowy DNA częściowo trawiono enzymem restrykcyjnym Hindlll. Strawiony DNA rozdzielono na żelu agarozowym za pomocą elektroforezy w pulsującym polu. Duże fragmenty DNA (około 90-150 kb) wyizolowano z żelu agarozowego

PL 200 157 B1 i ligowano do wektora pBelobacll. pBelobacll zawiera gen kodują cy oporność na chloramfenikol, wielokrotne miejsce klonowania w genie lacZ dostarczające selekcję białe/niebieskie na odpowiednim podłożu jak i geny wymagane do replikacji i utrzymania plazmidu w jednej lub dwóch kopiach na komórkę. Mieszaninę ligacyjną stosuje się do transformacji elektrokompetentnych komórek Escherichia coli DH10B stosując standardowe techniki elektroporacji. Oporne na chloramfenikol zrekombinowane kolonie (białe, mutant lacZ) przenosi się na dodatnio naładowany filtr nylonowy w formacie siatki 384 3x3. Klony poddaje lizie i DNA łączy się krzyżowo z filtrami. Te same klony są też zachowywane jako hodowle płynne w -80°C.

P r z y k ł a d 3: Przeszukiwanie biblioteki Bac Sorangium cellulosum na obecność sekwencji pokrewnych do syntazy poliketydu Typu I

Filtry biblioteki Bac przeszukuje się standardowymi procedurami hybrydyzacji Southerna. Stosowane sondy DNA kodują domenę syntazy β-ketoacylu z pierwszego i drugiego modułu syntazy poliketydów rifamycyny (Schupp i wsp., FEMS Microbiology Letters 159: 201-207 (1998)). DNA sondy jest generowany przez PCR z primerami flankującymi każdą domenę ketosyntazy stosując plazmid pNE95 jako matrycę (pNE95 równa się kosmid 2 opisany w Schupp i wsp. (1998)). 25 ng DNA zamplifikowanego za pomocą PCR izoluje się z 0,5% żelu agarozowego i znakuje za pomocą ³²P-dCTP stosując zestaw do znakowania za pomocą primerów losowych (Gibco-BRL, Bethesda MO, USA) według instrukcji producenta. Hybrydyzacja jest w 65°C przez 36 godzin i błony płucze się w wysokiej ostrości (3 razy 0,1x SSC i 0,5% SDS przez 20 min w 65°C). Oznakowany filtr eksponuje się na ekranie fosforyzującym i sygnały wykrywa się w Fosfolmager 445S1 (ekran i 445S1 od Molecular Dynamics). To daje silną hybrydyzację pewnych klonów Bac z sondą. Te klony wybiera się i hoduje przez noc w 5 ml bulionu Lurii (LB) w 37°C. DNA Bac z interesujących klonów Bac izoluje się w typowej procedurze minipreparatu. Komórki zawiesza się w 200 μl roztworu lizozymu (50 mM glukoza, 10 mM EOTA, 25 mM Tris-HCI, 5 mg/ml lizozym), lizuje w 400 μl roztworu do lizy (0,2 N NaOH i 2% SOS), białka strąca się (3,0 M octan potasu, doprowadzony do pH 5,2 kwasem octowym), i DNA Bac strąca się izopropanolem. DNA zawiesza się w 20 μl wody destylowanej wolnej od nukleaz, trawi SamHI (New England Biolabs, Inc.) i rozdziela na 0,7% żelu agarozowym. Żel przenosi się techniką Southerna jak opisano powyżej i przeszukuje w warunkach opisanych powyżej fragmentem 1.2 kb Smal kodującym domenę ketosyntazy czwartego modułu syntazy poliketydów sorafenu jako sondą (zobacz amerykański dokument patentowy nr. 5,716,849). Obserwuje się pięć różnych wzorów hybrydyzacji. Jeden klon reprezentujący każdy z pięciu wzorów został wybrany i nazwany odpowiednio pEPO15, pEPO20, pEPO30, pEPO31 i pEPO33.

P r z y k ł a d 4: Subklonowanie fragmentów BamHI z pEPO15, pEPO20, pEPO30, pEPO31 i pEPO33

DNA pięciu wybranych klonów Bac strawiono BamHI i losowe fragmenty subklonowano w pBluescript II SK + (Stratagene) w miejscu BamHI. Subklony niosące wstawki o wielkości między 2 i 10 kb wybrano do sekwencjonowania końców flankujących wstawek i także hybrydyzowano z sondą 1.2 Smal jak opisano powyżej. Subklony, które wykazują wysoki stopień homologii sekwencji do znanych syntaz poliketydów i/lub silną hybrydyzację do domeny ketosyntazy sorafenu są stosowane do doświadczeń z dysrupcją genów.

P r z y k ł a d 5: Przygotowanie opornych na streptomycynę spontanicznych mutantów Sorangium cellulosum szczep So ce90

0,1 ml trzydniowej hodowli Sorangium cellulosum szczep So ce90, którą wyhodowano na pożywce płynnej G52-H (0,2% ekstrakt drożdżowy, 0,20% odtłuszczona mączka sojowa, 0,8% skrobia ziemniaczana, 0,2% glukoza, 0,1% MgSO4 x 7H2O, 0,1% CaCl2 x 2H2O, 0,008% FeEDTA, pH do 7,4 za pomocą KOH), jest wysiewany na płytkach agarowych z podłożem So1E uzupełnionym 100 μg/mil streptomycyny. Płytki inkubowano w 30°C przez 2 tygodnie. Kolonie rosnące na tym podłożu są mutantami opornymi na streptomycynę, które wysiewa się i hoduje jeszcze raz na tym samym podłożu agarowym ze streptomycyną w celu oczyszczenia. Wybrano jeden z tych mutantów opornych na streptomycynę i nazwano BCE28/2.

P r z y k ł a d 6: Dysrupcje genów w Sorangium cellulosum BCE28/2 stosując subklonowane fragmenty BamHI

Wstawki BamHI subklonów wygenerowanych z pięciu wybranych klonów Bac jak opisano powyżej wyizolowano i wligowano w unikalne miejsce BamHI plazmidu pCIB132 (zobacz amerykański dokument patentowy 5,716,849). Pochodnymi pCIB132 niosącymi wstawki transformowano Escherichia coli ED8767 zawierającą plazmid pomocniczy pUZ8 (Hedges i Matthew, Plazmid 2: 269-278

PL 200 157 B1 (1979). Transformanty stosuje się jako dawców w doświadczeniach z koniugacją z Sorangium cellulosum BCE28/2 jako biorcą. Dla koniugacji 5-10 x 10⁹ komórek Sorangium cellulosum BCE28/2 z hodowli ze wczesnej fazy stacjonarnej (osiągającej około 5 x 10⁸ komórek/ml) hodowanej w 30°C w pożywce płynnej G51b (G51b równa się pożywce G51t z tryptonem zastąpionym przez pepton) mieszano w stosunku komórek 1:1 z hodowlą późnej fazy logarytmicznej (w pożywce płynnej LB) E.coli ED8767 zawierającej pochodne pCIB132 niosące subklonowane fragmenty BamHI i plazmid pomocniczy pUZ8. Zmieszane komórki następnie wirowano przy 4000 obr/min przez 10 minut i zawieszono w 0,5 ml podłoża G51b. Tę zawiesinę komórek następnie umieszczono jako kropelkę na środku płytki z agarem So1E zawierającym 50 mg/l kanamycyny. Komórki uzyskane po inkubacji przez 24 godziny w 30°C zbierano i zawieszano w 0,8 ml podłoża G51b i 0,1 do 0,3 ml tej zawiesiny wysiewano na selekcyjne podłoże stałe So1E zawierające fleomycynę (30 mg/l), streptomycynę (300 mg/l) i kanamycynę (50 mg/l). Przeciwselekcja szczepu dawcy Escherichia coli odbywa się za pomocą streptomycyny. Kolonie, które wyrastają na tej pożywce selekcyjnej po czasie inkubacji 8-12 dni w temperaturze 30°C są izolowane plastikową ezą, wysiewane i hodowane na tym samym podłożu agarowym dla drugiej rundy selekcji i oczyszczania. Hodowle pochodzące z kolonii, które rosną na tym selekcyjnym podłożu agarowym po 7 dniach w temperaturze 30°C są transkoniugantami Sorangium cellulosum BCE28/2, które uzyskały oporność na fleomycynę przez przeniesienie koniugacyjne pochodnych pCIB132 niosących subklonowane fragmenty BamHI.

Integrację pochodzących od pCIB132 plazmidów do chromosomu Sorangium cellulosum BCE28/2 za pomocą rekombinacji homologicznej sprawdzono za pomocą hybrydyzacji typu Southerna. Dla tego eksperymentu izolowano całkowity DNA z 5-10 transkoniugantów na transformowany fragment BamHI (z 10 ml hodowli hodowanych w podłożu G52-H przez trzy dni) stosując sposób opisany przez Pospiech i Neumann, Trends Genet. 11: 217 (1995). Dla hybrydyzacji typu Southerna wyizolowany jak opisano powyżej DNA trawiono enzymami restrykcyjnymi BglII, ClaI, lub Notl i odpowiednie wstawki BamHl lub pCIB132 są stosowane jako sondy znakowane 32P.

P r z y k ł a d 7: Analiza wpływu wprowadzonych fragmentów BamHI na produkcję epotilonu przez Sorangium cellulosum po dysrupcji genu

Komórki transkoniugantów hodowane na około 1 cm kwadratowym powierzchni na selekcyjnych płytkach So1E drugiej rundy selekcji (zobacz przykład 6) przenoszono sterylną plastikową ezą do 10 ml pożywki G52-H w 50 ml kolbie Erlenmeyera. Po inkubacji w 30°C i 180 obr/min przez 3 dni, hodowlę przenoszono do 50 ml podłoża G52-H w 200 ml kolbie Erlenmeyera. Po inkubacji w 30°C i 180 obr/min przez 4-5 dni, 10 ml tej hodowli przenoszono do 50 ml pożywki 23B3 (0,2% glukoza, 2% skrobia ziemniaczana, 1,6% odtłuszczona mączka sojowa, 0,0008% Fe-EOTA sól sodowa, 0,5% HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-piperazyno-1-etano-sulfonowy), 2% obj. żywicy polisterolowej XAD16 (Rohm & Haas), pH doprowadzone do 7,8 NaOH) w 200 ml kolbie Erlenmeyera.

Ilościowe oznaczenie wyprodukowanego epotilonu odbywa się po inkubacji hodowli w 30°C i 180 obr/min przez 7 dni. Całkowity bulion hodowlany filtruje się przez ssanie przez filtr nylonowy 150 μί Żywica pozostająca na filtrze jest następnie zawieszana w 10 ml izopropanolu i ekstrahowana przez wytrząsanie zawiesiny przy 180 obr/min przez 1 godzinę. Z tej zawiesiny usuwa się 1 ml i wiruje przy 12000 obr/min w wirówce Eppendorff Microfuge. Zawarta ilość epotilonów A i B jest określana za pomocą HPLC i detekcji przy 250 nm detektorem UV_DAD (HPLC na kolumnie Waters-Symetry C18 i gradiencie 0,02% kwasu fosforowego 60%-0% i acetonitrilu 40%-100%).

Transkoniuganty z trzema różnymi wintegrowanymi fragmentami BamHI subklonowanymi z pEPO15, a mianowicie transkoniuganty z fragmentem BamHl plazmidu pEPO15-21, transkoniuganty z fragmentem BamHI plazmidu pEPO15-4-5 i transkoniuganty z fragmentem BamHl plazmidu pEPO15-4-1 są testowane w sposób opisany powyżej. Analiza HPLC wykazuje ze wszystkie transkoniuganty już nie produkują epotilonów A ani B. Przeciwnie, epotilon A i B są wykrywalne w stężeniu 2-4 mg/l u transkoniugantów z wprowadzonymi fragmentami BamHI, które pochodzą z pEPO20, pEPO30, pEPO31, pEPO33 i w rodzicielskim szczepie BCE28/2.

P r z y k ł a d 8: Określenie sekwencji nukleotydów sklonowanych fragmentów i konstrukcja kontigów

A. Wstawka BamHl plazmidu pEPO15-21

Plazmidowy DNA izolowano ze szczepu Escherichia coli DH10B [pEPO15-21] i określono sekwencję nukleotydów wstawki 2,3-kb BamHl w pEPO15-21. Przeprowadzono zautomatyzowane sekwencjonowanie DNA na dwuniciowej matrycy DNA za pomocą metody terminacji łańcucha z dideoksynukleotydami stosując sekwenatory model 377 Applied Biosystems. Stosowano primery uniwersalny

PL 200 157 B1 odwrotny primer (5' GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3' (SEQ ID NO:24)) i uniwersalny primer 5' (5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3' (SEQ ID NO:25)). W kolejnych rundach reakcji sekwencjonowania stosowano syntetyzowane na żądanie oligonukleotydy, zaprojektowane dla końców 3' uprzednio określonych sekwencji aby rozszerzyć i połączyć kontigi. Obie nici sekwencjonowano w całości i każdy nukleotyd sekwencjonowano przynajmniej dwa razy. Sekwencję nukleotydów kompilowano stosując program Sequencher verso 3.0 (Gene Codes Corporation) i analizowano stosując programy University of Wisconsin Genetics Computer Group programs. Sekwencja nukleotydów wstawki 2213 bp odpowiada nukleotydom 20779-22991 SEQ ID NO:1.

B. Wstawka BamHl plazmidu pEPO15-4-1

Plazmidowy DNA izolowano ze szczepu Escherichia coli DH10B [pEPO15-4-1] i sekwencję nukleotydów wstawki 3,9-kb BamHl w pE-PO15-4-1 określono jak opisano w (A) powyżej. Sekwencja nukleotydów wstawki 3909 bp odpowiada nukleotydom 16876-20784 SEQ ID NO:1.

C. Wstawka BamHl plazmidu pEPO15-4-5

Plazmidowy DNA izolowano ze szczepu Escherichia coli DH10B [pEPO15-4-5] i sekwencję nukleotydów wstawki 2,3 kb BamHl w pE-PO15-4-5 określono jak opisano w (A) powyżej. Sekwencja nukleotydów wstawki 2233 bp odpowiada nukleotydom 42528-44760 SEQ ID NO:1.

P r z y k ł a d 9: Subklonowanie i uporzą dkowanie fragmentów DNA z pEPO15 zawierają cych geny biosyntezy epotilonu pEPO15 strawiono do końca enzymem restrykcyjnym Hindlll i powstałe fragmenty subklonowano w pBluescript II SK- lub pNEB193 (New England Biolabs), ciętego Hindlll i defosforylowanego fosfatazą alkaliczną z jelita cielęcia. Uzyskano sześć różnych klonów nazwanych pE-PO15-NH1, pEPO15-NH2, pEPO15-NH6, pEPO15-NH24 (wszystkie oparte na pNEB193) i pEPO15-H2.7 i pEPO15H3.0 (oba oparte na pBluescript II SK-).

Wyizolowano wstawkę BamHl pEPO15-21 i znakowano DIG (System do nieradioaktywnego znakowania i detekcji DNA, Boehringer Mannheim) i stosowano jako sondę w doświadczeniach z hybrydyzacją DNA w warunkach wysokiej ostrości z pEPO15-NH1, pEPO15-NH2, pEPO15-NH6, pEPO15-NH24, pEPO15-H2.7 i pEPO15-H3.0. Wykryto silny sygnał hybrydyzacji dla pEPO15-NH24, wskazując, że pEPO15-21 jest zawarty w obrębie pEPO15-NH24.

Wyizolowano wstawkę BamHl pEPO15-4-1 i znakowano DIG jak powyżej i zastosowano jako sondę w doświadczeniach z hybrydyzacją DNA w warunkach wysokiej ostrości w stosunku do pEPO15-NHl, pEPO15-NH2, pEPO15-NH6, pEPO15-NH24, pEPO15-H2.7 i pEPO15H3.0. Wykryto silne sygnały hybrydyzacji dla pEPO15-NH24 i pEPO15H2.7. Dane sekwencji nukleotydów wygenerowane z jednego koń ca każ dego z pEPO15-NH24 i pEPO15-H2.7 s ą też cał kowicie zgodne z uprzednio ustaloną sekwencją fragmentu wstawki BamHl pEPO15-4-1. Te doświadczenia wykazują, że pEPO154-1 (który zawiera jedno wewnętrzne miejsce Hindlll) zachodzi na pEPO15-H2.7 i pEPO15-NH24 i że pEPO15-H2.7 i pEPO15-NH24, w tej kolejności, przylegają do siebie.

Wstawkę BamHl pEPO15-4-5 wyizolowano i znakowano DIG jak powyżej i zastosowano jako sondę w doświadczeniach z hybrydyzacją DNA w warunkach wysokiej ostrości w stosunku do pEPO15-NH1, pEPO15-NH2, pEPO15-NH6, pEPO15-NH24, pEPO15-H2.7 i pEPO15H3.0. Wykryto silny sygnał hybrydyzacji dla pEPO15-NH2, co wskazuje, że pEPO15-21 jest zawarty w obrębie pEPO15-NH2.

Dane o sekwencji nukleotydów wygenerowano dla obu końców pEPO15-NH2 i od końca pEPO15-NH24, który nie zachodzi na pEPO154-1. Primery do PCR NH24 koniec B: GTGACTGGCGCCTGGAATCTGCATGAGC (SEQ ID NO:26), NH2 koniec A: AGCGGGAGCTTGCTAGACATTCTGTTTC (SEQ ID NO:27) i NH2 koniec B: GACGCGCCTCGGGCAGCGCCCCAA (SEQ ID NO:28), skierowane w stronę miejsc HindIII są zaprojektowane w oparciu o te sekwencje i stosowane w reakcjach amplifikacji z pEPO15 i w odrębnych doświadczeniach z genomowym DNA Sorangium cellulosum So ce90 jako matrycami. Specyficzną amplifikację stwierdza się z parą primerów NH24 koniec B i NH2 koniec A z obydwoma matrycami. Amplimery wklonowuje się do pBluescript II SKi sekwencjonuje w całości. Sekwencje amplimerów są identyczne i są całkowicie zgodne z sekwencjami końców pEPO15-NH24 i pEPO15-NH2, połączonych w miejscu HindIII, ustalając, że fragmenty Hindlll pEPO15-NH2 i pEPO15-NH24 są, w tej kolejności, przylegające.

Wstawkę Hindlll pEPO15-H2.7 wyizolowano i wyznakowano DIG jak powyżej i zastosowano jako sondę w doświadczeniu z hybrydyzacją DNA w ostrych warunkach w stosunku do pEPO15 strawionego NotI. Fragment Notl wielkości około 9 kb wykazuje silną hybrydyzację i jest dalej subklonowany do pBluescript II SK-, który był strawiony Notl i defosforylowany fostfatazą alkaliczną z jelita cielęcia aby uzyskać pEPO15-N9-16. Wstawkę Notl pEPO15-N9-16 izolowano i znakowano DIG jak

PL 200 157 B1 powyżej i zastosowano jako sondę do doświadczeń z hybrydyzacją DNA w wysokiej ostrości w stosunku do pEPO15-NH1, pEPO15-NH2, pEPO15-NH6, pEPO15-NH24, pEPO15-H2.7 i pEPO15-H3.0. Wykryto silne sygnały hybrydyzacji dla pEPO15-NH6 i także dla oczekiwanych klonów pEPO15-H2.7 i pEPO15-NH24. Wygenerowano dane o sekwencji nukleotydów z obu końców pEPO15-NH6 i z końca pEPO15H2.7, który nie zachodzi na pEPO15-4-1. Zaprojektowano primery do PCR skierowane w kierunku miejsca Hindlll i zastosowano je do reakcji amplifikacji z pEPO15 i w oddzielnych eksperymentach z genomowym DNA Sorangium cellulosum So ce90 jako matrycami. Specyficzną amplifikację wykryto z parą primerów pEPO15-NH6 koniec B: CACCGAAGCGTCGATCTGGTCCATC (SEQ ID NO:29) i pEPO15-H2.7 koniec A: CGGTCAGATCGACGACGGGCTTTCC (SEQ ID NO:30) z obydwiema matrycami. Amplimery sklonowano w pBluescript II SK- i w całości zsekwencjonowano. Sekwencje amplimerów są identyczne i także są całkowicie zgodne z końcowymi sekwencjami pEPO15NH6 i pEPO15-H2.7, połączonymi w miejscu HindIII ustalając, że fragmenty Hindlll pEPO15-NH6 i pEPO15-H2.7 są w tej kolejności przylegające.

Wszystkie te doświadczenia wzięte razem ustalają kontig fragmentów Hindlll pokrywających region około 55 kb i złożony ze wstawek Hindlll pEPO15-NH6, pEPO15-H2.7, pEPO15-NH24 i pEPO15NH2, w tej kolejności. Wstawki pozostałych dwóch subklonów Hindlll, a mianowicie pEPO15-NH1 i pEPO15-H3.0 okazały się nie być częściami tego kontigu.

P r z y k ł a d 10: Dalsze rozszerzenie kontigu subklonów pokrywających gen biosyntezy epotilonu

Fragment około 2.2 kb BamHl - Hindlll pochodzący z końca poniżej wstawki pEPO15-NH2 i tak więc reprezentujący część 3' kontigu subklonów opisanego w przykładzie 9 został wyizolowany, znakowany DIG i zastosowany w doświadczeniach z hybrydyzacją typu Southerna w stosunku do DNA pEPO15 i pEPO15-NH2 strawionych kilkoma enzymami. Silnie hybrydyzujące prążki zawsze okazują się mieć te same wielkości w obu docelowych DNA wskazując, że fragment genomowego DNA Sorangium cellulosum Sa ce90 wklonowany do końców pEPO15 kończy się na miejscu HindIII na końcu 3' pEPO15-NH2.

Wygenerowano bibliotekę kosmidową DNA Sorangium cellulosum Sa ce90 stosując ustalone procedury, w pScosTriplex-1I (Ji, i wsp., Genomics 31: 185-192 (1996)). Pokrótce, genomowy DNA Sorangium cellulosum Sa ce90 o wysokiej masie cząsteczkowej strawiono częściowo enzymem restrykcyjnym Sau3Al aby dostarczyć fragmenty o średniej wielkości około 40 kb, i zligowano z pScosTriplex-1I strawionym BamHl i Xbal. Mieszaninę ligacyjną pakowano za pomocą Gigapack III XL (Stratagene) i użyto do transfekcji komórek E. coli XL l Blue MR.

Bibliotekę kosmidową przeszukano fragmentem BamHl-Hindlll około 2,2 kb pochodzącym z końca 3' wstawki pEPO15-NH2, stosowanym jako sonda w hybrydyzacji kolonijnej. Wybrano silnie hybrydyzujący klon, nazwany pEPO4E7.

DNA pEPO4E7 wyizolowano, strawiono kilkoma enzymami restrykcyjnymi i badano w doświadczeniach z hybrydyzacją typu Southerna z fragmentem 2,2 kb BamHl - Hindlll. Wybrano silnie hybrydyzujący fragment Not1 o wielkości około 9 kb i subklonowano do pBluescript II SK- aby uzyskać pEPO4E7-N9-8. Dalsze doświadczenia z hybrydyzacją typu Southerna wykazują, że wstawka około 9 kb Not1 pEPO4E7-N9-8 zachodzi na pEPO15-NH2 na 6 kb we fragmencie Not1 - Hindlll, podczas gdy pozostały fragment Hindlll - Not1 około 3 kb rozszerzałby kontig subklonów opisany w przykładzie 9. Jednak sekwencjonowanie końców pokazało, że koniec 3' wstawki pEPO4E7-N9-8 zawiera polilinker BamHl - Not1 pScosTriplex-H, wskazując, że wstawka genomowegoDNA pEPO4E7 kończy się na miejscu Sau3A w obrębie przedłużającego fragmentu Hindlll - Not1 i że miejsce Not1 pochodzi od pScosTriplex-II.

Zastosowano fragment Pstl - Sall około 1,6 kb pochodzący z około 3 kb przedłużającego subfragmentu Hindlll - Not1 pEPO4E7-N9-8, zawierający tylko sekwencje pochodzące od Sorangium cellulosum Sa ce90 wolne od wektora w stosunku do biblioteki w sztucznym chromosomie bakteryjnym opisanej w przykładzie 2. Oprócz uprzednio wyizolowanego EPO15, stwierdzono, że klon Bac nazwany EPO32 silnie hybrydyzuje do sondy. pEPO32 wyizolowano, strawiono kilkoma enzymami restrykcyjnymi i zhybrydyzowano z sondą około 1,6 kb Pstl - Sall. Stwierdzono, że fragment Hindlll EcoRV o wielkości około 13 kb silnie hybrydyzuje z sondą i został on subklonowany do pBluescript II SK strawionego HindIII i HincII aby uzyskać pEPO32-HEV15.

Zaprojektowano primery oligonukleotydowe oparte na sekwencji końca 3' pEPO15-NH2 i końca 5' (Hindlll) sekwencji pochodzącej z pEPO32-HEV15 i zastosowano w reakcjach sekwencjonowania z pEPO4E7-N9-8 jako matrycą. Sekwencje wykazują istnienie małego fragmentu Hindlll (EPO4E718

PL 200 157 B1

HO.02) 24 bp, niewykrywalnego przy standardowej analizie restrykcyjnej, rozdzielającego miejsce Hindlll na 3'końcu pEPO15-NH2 od miejsca Hindlll na 5' końcu pEPO32-HEV15.

Tak więc kontig subklonów opisany w przykładzie 9 jest rozszerzony tak by obejmował fragment Hindlll EPO4E7-HO.02 i wstawkę pEPO32-HEV15 i stanowi wstawki: pEPO15-NH6, pEPO15-H2.7, pEPO15-NH24, pEPO15-NH2, EPO4E7-HO.02 i pEP032-HEV15, w tej kolejności.

P r z y k ł a d 11: Określenie sekwencji nukleotydów kontigu subklonów pokrywającego geny biosyntezy epotilonu

Sekwencję nukleotydów kontigu subklonów opisanego w przykładzie 10 ustalono w sposób następujący.

pEPO15-H2.7. DNA plazmidowy izolowano ze szczepu Escherichia coli DH10B [pEPO15-H2.7], i określono sekwencję nukleotydów wstawki 2,7-kb BamHI w pEPO15-H2.7. Zautomatyzowane sekwencjonowanie DNA przeprowadzono na dwuniciowej matrycy DNA za pomocą metody terminacji dideoksynukleotydów stosując sekwenator 377 Applied Biosystems. Stosowane primery to uniwersalny odwrotny primer (5' GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3' (SEQ ID NO:24)) i uniwersalny primer 5' (5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3' (SEQ ID NO:25)). W kolejnych rundach reakcji sekwencjonowania specjalnie syntetyzowane oligonukleotydy zaprojektowane dla końców 3' uprzednio ustalonych sekwencji były stosowane do przedłużania i łączenia kontigów.

pEPO15-NH6, pEPO15-NH24 i pEPO15-NH2 wyizolowano wstawki Hindlll tych plazmidów i poddano je losowej fragmentacji stosując urządzenie Hydroshear (Genomic Instrumentation Sendces, Inc.) aby uzyskać średnią wielkość fragmentów 1-2 kb. We fragmentach naprawiano końce stosując polimerazę DNA T4 i polimerazę DNA Klenowa w obecności trifosforanów deoksyrybonukleotydów i fosforylowano kinazą DNA T 4 w obecności ribo-ATP. Fragmenty w zakresie wielkości 1,5 - 2,2 kb izolowano z żeli agarozowych i ligowano do pBluescript II SK- przeciętego EcoRV i defosforylowanego. Sekwencjonowano losowe subklony stosując uniwersalne primery odwrotny i 5'.

pEPO32-HEV15. pEPO32-HEV15 trawiono Hindlll i Sspl, izolowano fragmenty około 13,3 kb zawierający wstawkę -13 kb Hindlll - EcoRV z So. cellulosum So ce90 i 0,3 kb Hincll - Sspl z pBluescript II SK- i trawiono częściowo Haelll aby uzyskać fragmenty ze średnią wielkością 1-2 kb. Fragmenty w zakresie wielkości 1,5-2,2 kb izolowano z żeli agarozowych i ligowano z pBluescript II SKstrawionym EcoRV i defosforylowanym. Sekwencjonowano losowe subklony stosując uniwersalne primery odwrotny i 5'.

Chromatogramy analizowano i montowano do kontigów programami Phred, Phrap i Consed (Ewing i wsp., Genome Res. 8(3): 175-185 (1998); Ewing i wsp., Genome Res. 8(3): 186-194 (1998); Gordon i wsp., Genome Res. 8(3): 195-202 (1998)). Przerwy w kontigach wypełniano, rozwiązywano rozbieżności sekwencji i ponownie sekwencjonowano regiony o niskiej jakości stosując specjalnie zaprojektowane oligonukleotydowe primery do sekwencjonowania na albo oryginalnych subklonach lub wybranych klonach z bibliotek losowych subklonów. Obie nici sekwencjonowano w całości i każdą parę zasad pokryto z minimalną wartością scaloną Phred 40 (poziom ufności 99,99%).

Sekwencja nukleotydów kontigu 68750 bp jest przedstawiona jako SEQ ID NO:1.

P r z y k ł a d 12: Analiza sekwencji nukleotydów genu biosyntezy epotilonu

Stwierdzono, że SEQ ID NO:1 zawiera 22 ORF jak podano szczegółowo w tabeli 1 poniżej:

T a b e l a 1

ORF	Kodon start	Kodon stop	Homologia wydedukowanego białka	Proponowana funkcja wydedukowanego białka
1	2	3	4	5
orfl	poza sekwencjonowanym obszarem	1826
orf2 *	3171	1900	Hipotetyczne białko SP:Q11 037; oo-peptydaza SP:P15555
orf3	3415	5556	antyporter Na/H PIO:01017724	Transport
orf4 *	5992	5612

PL 200 157 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5
orf5	6226	6675
epoA	7610	11875	Syntaza poliketydu Typ I	Syntaza epotilonu: tworzenie pierścienia tiazolowego
epoP	11872	16104	Nierybosomalna syntetaza peptydowa	Syntaza epotilonu: tworzenie pierścienia tiazolowego
epoB	16251	21749	Syntaza poliketydu Typ I	Syntaza epotilonu: tworzenie szkieletu poliketydowego
epoC	21746	43519	Syntaza poliketydu Typ I	Syntaza epotilonu: tworzenie szkieletu poliketydowego
eopD	43524	54920	Syntaza poliketydu Typ i	Syntaza epotilonu: tworzenie szkieletu poliketydowego
epoE	54935	62254	Syntaza poliketydu Typ i	Syntaza epotilonu: tworzenie szkieletu poliketydowego
ep	62369	63628	Cytochrom P450	Oksydaza makrolaktonu epotilonu
orf6	63779	64333
orfl *	64290	63853
orf8	64363	64920
orf9 *	64727	64287
orf10	65063	65767
orf11 *	65874	65008
orf12 *	66338	65871
orf13	66667	67137
orf14	67334	68251	Hipotetyczne białko GI:3293544; Białko systemu wypływu kationów GI:2623026	Transport
orf15	68346	poza sekwencjonowanym obszarem

* Na odwrotnej nici komplementarnej. Numeracja według SEQ ID NO:1.

epoA (nukleotydy 7610-11875 SEQ ID NO:1) koduje EPOS A (SEQ ID NO:2), syntazy poliketydu typu I złożonej z pojedynczego modułu i niosącego następujące domeny: β-ketoacylosyntazy (KS) (nukleotydy 7643-8920 SEQ ID NO:1, aminokwasy 11-437 SEQ ID NO:2); acylotransferazy (AT) (nukleotydy 9236-10201 SEQ ID NO:1, aminokwasy 543-864 SEQ ID NO:2); reduktazy enoilu (ER) (nukleotydy 10529-11428 SEQ ID NO:1, aminokwasy 974-1273 SEQ ID NO:2); i domenę homololiczną do białka nośnika acylu (ACP) (nukleotydy 11549-11764 SEQ ID NO:1, aminokwasy 1314-1385 SEQ ID NO:2). Porównanie sekwencji i analiza motywów (Haydock i wsp. FEBS Lett. 374: 246-248 (1995); Tang i wsp., Gene 216: 255-265 (1998)) wykazuje, że AT kodowany przez EPOS A jest specyficzny dla malonylo-CoA. EPOS A powinien być związany z inicjacją biosyntezy epotilonu przez ładowanie jednostki octanowej na kompleks multienzymatyczny, który w końcu wytworzy część pierścienia 2-metylotiazolowego (C26 i C20).

epoP (nukleotydy 11872-16104 SEQ ID NO:1) koduje EPOS P (SEQ ID NO:3), nierybosomalną syntetazę peptydową zawierającą jeden moduł. EPOS P niesie następujące domeny:

• domenę tworzenia wiązania peptydowego wyznaczoną przez motyw K (aminokwasy 72-81 [FPL TDIQESY] SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 12085-12114 SEQ ID NO:1); motyw L (aminokwasy 118-125 [VVARHDML] SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 12223-12246 SEQ ID NO:1); motyw M (aminokwasy 199212 [SIDLINVDLGSLSI] SEQ ID NO:3, od20

PL 200 157 B1 powiadające pozycjom nukleotydów 12466-12507 SEQ ID NO:1); i motyw O (aminokwasy 353-363 [GDFTSMVLLDI] SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 12928-12960 SEQ ID NO:1);

• domenę tworzenia aminoacyloadenylanów, wyznaczoną przez motyw A (aminokwasy 549-565 [L TYEELSRRSRRLGARL] SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 13516-13566 SEQ ID NO:1); motyw B (aminokwasy 588-603 [VAVLAVLESGAAYVPI] SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 13633-13680 SEQ ID NO:1); motyw C (aminokwasy 669-684 [AYVIYTSGSTGLPKGV] SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 13876-13923 SEQ ED NO:1); motyw D (aminokwasy 815-821 [SLGGATE] SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 14313-14334 SEQ ID NO:1); motyw E (aminokwasy 868-892 [GQL YIGGVGLALGYWRDEEKTRKSF] SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 14473-14547 SEQ ID NO:1); motyw F (aminokwasy 903-912 [YKTGDLGRYL] SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 14578-14607 SEQ ID NO:1); motyw G (aminokwasy 918-940 [EFMGREDNQIKLRGYRVELGEIE] SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 14623-14692 SEQ ID NO:1); motyw H (aminokwasy 1268-1274 [LPEYMVP] SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 15673-15693 SEQ ID NO:1); i motyw I (aminokwasy 1285-1297 [LTSNGKVDRKALR] SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 15724-15762 SEQ ID NO:1);

• nieznaną domenę, wstawioną między motywy G i H domeny wytwarzania aminoacyloadenylanu (aminokwasy 973-1256 SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 14788-15639 SEQ ID NO:1); i • domenę homologiczną do białka nośnika acylu (PCP), wyznaczona przez motyw J (aminokwasy 1344-1351 [GATSIHIV] SEQ ID NO:3, odpowiadające pozycjom nukleotydów 15901-15924 SEQ ID NO:1).

Proponuje się, że EPOS P bierze udział w aktywacji cysteiny przez adenylację, wiążąc zaktywowaną cysteinę jako aminoacylo-S-PCP, tworząc wiązanie peptydowe między związaną z enzymem cysteiną i acetylo-S-ACP dostarczanym przez EPOS A i tworzenie pierwotnego pierścienia tiazolinowego poprzez wewnątrzcząsteczką heterocyklizację. Nieznana domena EPOS P wykazuje bardzo słabe homologie do oksydaz i reduktaz NADP(H) z gatunków Sacillus. Tak więc ta nieznana domena i/lub domena ER EPOS A może brać udział w utlenianiu pierwotnego pierścienia 2-metylotiazolinowego do 2-metylotiazolu.

epoB (nukleotydy 16251-21749 SEQ ID NO:1) koduje EPOS S (SEQ ID N0:4), syntazę poliketydu typu I złożoną z pojedynczego modułu i niosącą następujące domeny: KS (nukleotydy 16269-17546 SEQ ID NO:1, aminokwasy 7-432 SEQ ID NO:4); AT (nukleotydy 17865-18827 SEQ ID NO:1, aminokwasy 539-859 SEQ ID NO:4); dehydratazy (DH) (nukleotydy 18855-19361 SEQ ID NO:1, aminokwasy 869-1037 SEQ ID NO:4); β-ketoreduktazy (KR) (nukleotydy 2056521302 SEQ ID NO:1, aminokwasy 1439-1684 SEQ ID NO:4); i ACP (nukleotydy 21414-21626 SEQ ID NO:1, aminokwasy 1722-1792 SEQ ID NO:4). Porównania sekwencji i analiza motywów wykazują, że AT kodowana przez EPOS S jest specyficzna dla metylomalonylo-CoA. EPOS A powinien brać udział w pierwszym przedłużeniu łańcucha poliketydowego przez katalizę kondensacji typu Claisena grupy starterowej 2-metylo-4-tiazolokarboksylo-SPCP z metylomalonylo-S-ACP i równoczesną redukcją grupy β-keto C17 do enoilu.

epoC (nukleotydy 21746-43519 SEQ ID NO:1) koduje EPOS C (SEQ ID NO:5), syntazę poliketydu typu I złożoną z 4 modułów. Pierwszy moduł niesie KS (nukleotydy 21860-23116 SEQ ID NO:1, aminokwasy 39-457 SEQ ID NO:5); AT specyficzną dla malonylo CoA (nukleotydy 23431-24397 SEQ ID NO:1, aminokwasy 563-884 SEQ ID NO:5); KR (nukleotydy 25184-25942 SEQ ID NO:1, aminokwasy 1147-1399 SEQ ID NO:5); i ACP (nukleotydy 26045-26263 SEQ ID NO:1, aminokwasy 1434-1506 SEQ ID NO:5). Ten moduł włącza jednostkę przedłużającą octan (C14-C13) i redukuje β-keto grupę w C15 do grupy hydroksylowej, grupy, która bierze udział w końcowej laktonizacji makrolaktonowego pierścienia epotilonowego. Drugi moduł EPOS C niesie KS (nukleotydy 26318-27595 SEQ ID NO:1, aminokwasy 1524-1950 SEQ ID NO:5); malonylo CoA specyficzną AT (nukleotydy 27911-28876 SEQ ID NO:1, aminokwasy 2056-2377 SEQ ID NO:5); KR (nukleotydy 29678-30429 SEQ ID NO:1, aminokwasy 2645-2895 SEQ ID NO:5); i ACP (nukleotydy 30539-30759 SEQ ID NO:1, aminokwasy 2932-3005 SEQ ID NO:5). Ten moduł zawiera jednostkę przedłużającą octan (C12-C11) i redukuje grupę β-ketonową w C13 do grupy hydroksylowej. Tak więc powstający łańcuch poliketydowy epotilonu odpowiada epotilonowi A i włączenie bocznego łańcucha metylowego przy C12 w epotilonie B by wymagało aktywności po-PKS C-metylotransferazy. Tworzenie pierścienia epoksydowego w C13-C12 by także wymagało etapu utleniania po PKS. Trzeci moduł EPOS C niesie KS (nukleotydy 30815PL 200 157 B1

-32092 SEQ ID NO:1, aminokwasy 3024-3449 SEQ ID NO:5); malonylo CoA specyficzną AT (nukleotydy 32408-33373 SEQ ID NO:1 aminokwasy 3555-3876 SEQ ID NO:5); OH (nukleotydy 33401-33889 SEQ ID NO:1, aminokwasy 3886-4048 SEQ ID NO:5); ER (nukleotydy 35042-35902 SEQ ID NO:1, aminokwasy 4433-4719 SEQ ID NO:5); KR (nukleotydy 35930-36667 SEQ ID NO:1, aminokwasy 4729-4974 SEQ ID NO:5); i ACP (nukleotydy 36773-36991 SEQ ID NO:1, aminokwasy 5010-5082 SEQ ID NO:5). Ten moduł włącza jednostkę przedłużającą octan (C10-C9) i całkowicie redukuje grupę β-keto w C11. Czwarty moduł EPOS C niesie KS (nukleotydy 37052-38320 SEQ ID NO:1, aminokwasy 5103-5525 SEQ ID NO:5); metylomalonylo CoA specyficzną AT (nukleotydy 38636-39598 SEQ ID NO:1, aminokwasy 5631-5951 SEQ ID NO:5); OH (nukleotydy 3963540141 SEQ ID NO:1, aminokwasy 5964-6132 SEQ ID NO:5); ER (nukleotydy 41369-42256 SEQ ID NO:1, aminokwasy 6542-6837 SEQ ID NO:5); KR (nukleotydy 42314-43048 SEQ ID NO:1, aminokwasy 68577101 SEQ ID NO:5); ACP (nukleotydy 43163-43378 SEQ ID NO:1, aminokwasy 7140-7211 SEQ ID NO:5). Ten moduł włącza jednostkę przedłużającą propionian (C24 i C8-C7) i całkowicie redukuje grupę β-keto przy C9.

epoD (nukleotydy 43524-54920 SEQ ID NO:1) koduje EPOS D (SEQ ID NO:6), syntazy poliketydu typu I złożonej z 2 modułów. Ten pierwszy moduł niesie KS (nukleotydy 43626-44885 SEQ ID NO:1, aminokwasy 35-454 SEQ ID NO:6); metylomalonylo CoA specyficzną AT (nukleotydy 45204-46166 SEQ ID NO:1, aminokwasy 561-881 SEQ ID NO:6); KR (nukleotydy 46950-47702 SEQ ID NO:1, aminokwasy 11431393 SEQ ID NO:6); i ACP (nukleotydy 47811-48032 SEQ ID NO:1, aminokwasy 1430-1503 SEQ ID NO:6). Ten moduł zawiera jednostkę przedłużającą o propionian (C23 i C6C5) i całkowicie redukuje grupę β-keto przy C7 do grupy hydoksylowej. Drugi moduł niesie KS (nukleotydy 48087-49361 SEQ ID NO:1, aminokwasy 1522-1946 SEQ ID NO: 6); metylomalonylo CoA specyficzną AT (nukleotydy 49680-50642 SEQ ID NO:1, aminokwasy 2053-2373 SEQ ID NO:6); OH (nukleotydy 5067051176 SEQ ID NO:1, aminokwasy 2383-2551 SEQ ID NO:6); metylo transferazę (MT, nukleotydy 51534-52657 SEQ ID NO:1, aminokwasy 2671-3045 SEQ ID NO:6); KR (nukleotydy 53697-54431 SEQ ID NO:1, aminokwasy 3392-3636 SEQ ID NO:6); i ACP (nukleotydy 54540-54758 SEQ ID NO:1, aminokwasy 3673-3745 SEQ ID NO:6). Ten moduł zawiera jednostkę przedłużającą o propionian (C21 lub C22 i C4-C3) i redukuje grupę β-keto przy C11 do a grupy hydoksylowej. Ta redukcja jest nieco nieoczekiwana, jako że epotilony zawierają grupę keto przy C5. Rozbieżności tego typu między wydedukowanymi zdolnościami do redukcji modułów PKS i stanem redoks odpowiednich pozycji w ostatecznych produktach poliketydowych były jednak opisywane w literaturze (zobacz, na przykład, Schwecke i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7839-7843 (1995) i Schupp i wsp., FEMS Microbiology Letlers 159: 201-207 (1998)). Ważną cechą epotilonów jest obecność bocznych grup gem metylowych w C4 (C21 i C22). Przewiduje się, że drugi moduł EPOS D inkorporuje jednostkę propionianową do rosnącego łańcucha poliketyowego, dostarczając jeden łańcuch metylowy w C4. Ten moduł też zawiera domenę metylotransferazy wintegrowaną do PKS między domenami OH i KR, w ułożeniu podobnym w spotykanym w syntazie yersiniabaktyny HMWP1 (Gehring, A.M., DeMolI, E., Fetherston, J.D., Mori, L, Mayhew, G.F., Blattner, F.R., Walsh, C.T. i Perry, R.D.: Iron acquisition in plague: modular logic in enzymatic biogenesis of yersiniabactin by Yersinia pestis. Chem. Biol. 5, 573-586, 1998). Proponuje się, że ta domena MT w EPOS D jest odpowiedzialna za inkorporację drugiej bocznej grupy metylowej (C21 lub C22) w C4.

epoE (nukleotydy 54935-62254 SEQ ID NO:1) koduje EPOS E (SEQ ID NO:7), syntazy poliketydu typu I złożonej z jednego modułu, niosącego KS (nukleotydy 55028-56284 SEQ ID NO:1, aminokwasy 32450 SEQ ID NO:7); malonylo CoA-specyficzną AT (nukleotydy 56600-57565 SEQ ID NO:1, aminokwasy 556-877 SEQ ID NO:7); OH (nukleotydy 57593-58087 SEQ ID NO:1, aminokwasy 887-1051 SEQ ID NO:?); prawdopodobnie niefunkcjonalną ER (nukleotydy 59366-60304 SEQ ID NO:1, aminokwasy 1478-1790 SEQ ID NO:7); KR (nukleotydy 60362-61099 SEQ ID NO:1, aminokwasy 1810-2055 SEQ ID NO:7); ACP (nukleotydy 61211-61426 SEQ ID NO:1, aminokwasy 2093-2164 SEQ ID NO:7); i tioesterazę (TE) (nukleotydy 61427-62254 SEQ ID NO:1, aminokwasy 2165-2439 SEQ ID NO:7). Domena ER w tym module niesie motyw miejsca aktywnego z pewnymi wysoce nietypowymi podstawieniami aminokwasów, które prawdopodobnie sprawiają, że domena ta jest nieaktywna. Moduł zawiera jednostkę przedłużającą o octan (C2-C1) i redukuje grupę β-keto w C3 do grupy enoilowej. Epotilony zawierają grupę hydroksylową w C3, tak, że ta redukcja też wydaje się być nadmiarowa jak przedyskutowano dla drugiego modułu EPOS D. Domena TE domena EPOS E bierze udział w uwalnianiu i cyklizacji gotowego łańcucha poliketydowego poprzez laktonizację między grupą karboksylową C1 i grupą hydroksylową C15.

PL 200 157 B1

W regionie sekwencjonowanym wykryto pięć ORF powyżej epoA. Częściowo zsekwencjonowany orf1 nie ma homologów w bazach danych sekwencji. Wydedukowany produkt białkowy (Orf 2, SEQ ID NO:10) orf2 (nukleotydy 3171-1900 na nici odwrotnie komplementarnej SEQ ID NO:1) wykazuje silne podobieństwa do hipotetycznych ORF z Mycobacterium i Streptomyces coelicolor, i bardziej odległe podobieństwa do karboksypeptydaz i DD-peptydaz różnych bakterii. Wydedukowany produkt białkowy orf3 (nukleotydy 3415-5556 SEQ ID NO:1), Orf 3 (SEQ ID NO:11), wykazuje homologie do antyporterów Na/H różnych bakterii. Orf 3 mógłby brać udział w eksporcie epotilonów ze szczepu produkującego. orf4 i orf5 nie mają homologów w bazach danych sekwencji.

Poniżej epoE w obszarze sekwencjonowanym znaleziono jedenaście ORF. ep(nukleotydy 62369-63628 SEQ ID NO:1) koduje EPOS F (SEQ ID NO:8), wydedukowane białko z silnym podobieństwem sekwencji do oksygenaz cytochromu P450. EPOS F może brać udział w dopasowywaniu stanu redoks węgli C12, C5, i/lub C3. Wydedukowany produkt białkowy orf14 (nukleotydy 67334 -68251 SEQ ID NO:1), Orf 14 (SEQ ID NO:22) wykazuje silne podobieństwa do GI:3293544, hipotetycznego białka bez proponowanej funkcji ze Streptomyces coelicolor i także do GI2654559, białka płuca ludzkiego zarodka. Jest też bardziej daleko spokrewnione z białkami systemu wypływu kationów takich jak GI:2623026 z Methanobacterium thermoautotrophicum, tak że mogłoby też brać udział w eksporcie epotilonów z produkujących komórek. Pozostałe ORF (orf6-orf13 i orf15j nie wykazują homologii do informacji w bazach danych.

P r z y k ł a d 13: Zrekombinowana ekspresja genu biosyntezy epotilonu

Geny syntazy epotilonu według niniejszego wynalazku są wyrażane w heterologicznych organizmach w celu produkcji epotilonu w większych ilościach niż mogą być uzyskane przez fermentację Sorangium cellulosum. Korzystnym gospodarzem dla ekspresji heterologicznej jest Streptomyces, np. Streptomyces coelicolor, który naturalnie produkuje poliketyd - aktynorodynę. Techniki dla ekspresji zrekombinowanego genu PKS w tym gospodarzu są opisane w McDaniel i wsp., Science 262: 1546-1550 (1993) i Kao i wsp., Science 265: 509-512 (1994). Zobacz też Holmes i wsp., EMBO Journal 12(8): 3183-3191 (1993) i Bibb i wsp., Gene 38: 215-226 (1985), jak i amerykańskie dokumenty patentowe nr 5,521,077, 5,672,491, i 5,712,146, które są tu włączone jako odnośniki.

Według jednej metody heterologiczny szczep gospodarza jest zmieniany technikami inżynierii genetycznej aby zawierał chromosomalną delecję skupienia genów aktynorodyny (act). Plazmidy ekspresyjne zawierające gen syntazy epotilonu według wynalazku skonstruowano przez przeniesienie DNA wrażliwego na temepraturę plazmidu dawcy do biorcy - wektora wahadłowego w E. coli (McDaniel i wsp. (1993) i Kao i wsp. (1994)), takich, że gen syntazy jest wbudowany przez homologiczną rekombinację w obrębie wektora. Alternatywnie, skupienie genów syntazy epotilonu wprowadza się do wektora poprzez ligację fragmentów restrykcyjnych. Po selekcji np. jak opisano w Kao i wsp. (1994), DNA z wektora wprowadza się do szczepu act-minus Streptomyces coelicolor według protokołów podanych w Hopwood i wsp., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual (John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom, 1985), włączonym tu w jako odnośniki. Zrekombinowany szczep Streptomyces hoduje się na pożywce R2YE (Hopwood i wsp. (1985)) i produkuje epotilony. Alternatywnie, geny syntazy epotilonu według niniejszego wynalazku są wyrażane w innych organizmach gospodarzach takich jak pseudomonas, Bacillus, drożdże, komórki owadów i/lub E. coli. Geny PKS i NRPS są korzystnie wyrażane w E. coli stosując wektor pT7-7, który stosuje promotor T7. Zobacz Tabor i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1074-1078 (1985). W innej postaci, wektory ekspresyjne pKK223-3 i pKK223-2 są stosowane do ekspresji genów PKS i NRPS gen w E. coli, w postaci fuzji transkrypcyjnej lub translacyjnej, za promotorem tac lub trc. Ekspresja genów PKS i NRPS w heterologicznym gospodarzu, który nie ma normalnie transferaz fosfopanteteinylo (P-pant) potrzebnych do posttranslacyjnej modyfikacji enzymów PKS wymaga współ-ekspresji w gospodarzu P-pant transferazy, jak opisali Kealey i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 505-509 (1998).

P r z y k ł a d 14: Isolacja epotilonów ze szczepów produkujących

Przykłady procedur hodowli, fermentacji i ekstrakcji dla izolacji poliketydów, które są pożyteczne dla ekstrakcji epotilonów zarówno z natywnych i zrekombinowanych gospodarzy według niniejszego wynalazku są podane w WC 93/10121, włączonego tu w postaci odniesienia, w przykładzie 57 amerykańskiego dokumentu patentowego nr 5,639,949, w Gerth i wsp., J. Antibiotics 49: 560-563 (1996), i w szwajcarskim zgłoszeniu patentowym nr 396/98, złożonym 19 lutego, 1998, i amerykańskim zgłoszeniu patentowym nr 09/248,910 (który także ujawnia korzystnego mutanta szczepu Sorangium cellulosum), z których oba są tu włączone jako odnośniki. Poniżej podano procedury, które są pożyteczPL 200 157 B1 ne do izolacji epotilonów z hodowanych szczepów Sorangium cellulosum takich jak So ce90, i mogą też być stosowane do izolacji epotilonu ze zrekombinowanego gospodarza.

A: Hodowla szczepów produkujących epotilon:

Szczep: Sorangium cellulosum So ce90 lub zrekombinowany szczep gospodarza według niniejszego wynalazku

Przechowywanie szczepu: W ciekłym N2.

Pożywki: Hodowle wstępne i hodowle pośrednie: G52

Hodowla główna: 1 B12

Pożywka G52: ekstrakt z drożdży, z niską solą (BioSpringer, Maison Alfort, France) 2 g/l

MgSO4 (7 H2O) 1 g/l

CaCl2 (2 H2O) 1 g/l odtłuszczona mąka sojowa Soyamine 50T (Lucas Meyer, Hamburg, Niemcy) 2 g/l skrobia ziemniaczana Noredux A- 1 50 (Blattmann, Waedenswil, Szwajcaria) 8 g/l glukoza bezwodna 2 g/l

EDTA-Fe(III)-sól Na (8 g/l) 1 ml/l pH 7,4, doprowadzone KOH Sterylizacja: 20 min. 120°C Pożywka 1 B12 skrobia ziemniaczana Noredux A-150 (Blattmann, Waedenswil, Szwajcaria) 20 g/l odtłuszczona mąka sojowa Soyamine 50T (Lucas Meyer, Hamburg, Niemcy) 11 g/l

EDTA-Fe(III)-sól Na 8 mg/l pH 7,8, doprowadzone KOH

Sterylizacja: 20 min. 120°C

Dodatek cyklodekstryn i pochodnych cyklodekstryn:

cyklodekstryny (Fluka, Suchs, Szwajcaria lub Wacker Chemie,

Monachium, Niemcy) w różnych stężeniach są oddzielnie sterylizowane i dodawane do pożywki 1 B12 przed zaszczepieniem.

Hodowla: 1 ml zawiesiny Sorangium cellulosum So ce90 z ampułki z ciekłego N2 przenoszono do 10 ml pożywki G52 (w 50 ml kolbie Erlenmeyera) i inkubowano przez 3 dni przy 180 obr/min w wytrząsarce w 30°C, 25 mm przesunięcia. 5 ml tej hodowli dodano do 45 ml pożywki G52 (w 200 ml kolbie Erlenmeyera) i inkubowano przez 3 dni przy 180 obr/min w wytrząsarce w 30°C, 25 mm przesunięcia. 50 ml tej hodowli wówczas dodano do 450 ml pożywki G52 (w 2 litrowej kolbie Erlenmeyera) i inkubowano przez 3 dni przy 180 obr/min w wytrząsarce w 30°C, 50 mm przesunięcia.

Hodowla podtrzymująca: Hodowlę przeszczepia się co 3-4 dni, przez dodanie 50 ml hodowli do 450 ml podłoża G52 (w 2 litrowej kolbie Erlenmeyera). Wszystkie eksperymenty i fermentacje przeprowadza się startując z hodowli podtrzymującej.

Testy w kolbie:

(i) Hodowla wstępna w kolbie wytrząsanej

Startując z 500 ml hodowli podtrzymującej, zaszczepiano 1 x 450 ml podłoża G52 50 ml hodowli podtrzymującej i inkubowano przez 4 dni przy 180 obr/min w wytrząsarce w 30°C, 50 mm przesunięcia.

(ii) Główna hodowla w kolbie wytrząsanej ml podłoża 1S12 plus 5 g/l sproszkowanego kwasu 4-morflino-propanosulfonowego (= MOPS) (w 200 ml kolbie Erlenmeyera) zmieszano z 5 ml 10 x stężonego roztworu cyklodekstryny zaszczepiono 10 ml hodowli wstępnej i inkubowano przez 5 dni przy 180 obr/min w wytrząsarce w 30°C, przesunięcie 50 mm.

Fermentacja: Fermentację przeprowadza się na skalę 10 litrów, 100 litrów i 500 litrów.

litrowa i 100 litrowa fermentacja służą jako pośredni etap hodowli. Podczas gdyd prehodowle i pośrednie hodowle zaszczepia się hodowlą podtrzymującą 10% (obj.), główne hodowle zaszczepia się 20% (obj). hodowlą pośrednią. Ważne: w przeciwieństwie do hodowli wytrząsanych, składniki pożywek do fermentacji są wyliczane dla ostatecznej objętości razem z inokulum. Jeśli na przykład łączy

PL 200 157 B1 się 18 litrów pożywki + 2 litry inokulum wówczas waży się substancje na 20 litrów ale miesza się tylko z 18 litrami.

Prehodowla w kolbie do wytrząsania:

Startując z 500 ml hodowli podtrzymującej, 4 x 450 ml podłoża G52 (w 2 litrowej kolbie Erlenmeyera) są każda zaszczepiana po 50 ml i inkubowane przez 4 dni w 180 obr/min w wytrząsarce w 30°C, 50 mm przesunię cia.

Pośrednia hodowla, 20 litrów lub 100 litrów:

litrów: 18 litrów podłoża G52 w fermentorze mającym całkowitą objętość 30 litrów zaszczepiano 2 litrami prehodowli. Hodowla trwa 3-4 dni i warunki są: 30°C, 250 obr/min, 0,5 litrów powietrza na litr płynu na min, 0,5 barów nadciśnienia, bez kontroli pH.

100 litrów: 90 litrów podłoża G52 w fermentorze mającym całkowitą objętość 150 litrów zaszczepiono 10 litrami 20 litrowej hodowli pośredniej. Hodowla trwa 3-4 dni, i warunki są: 30°C, 150 obr/min, 0,5 litrów powietrza na litr płynu na min, 0,5 barów nadciśnienia, bez kontroli pH.

Główna hodowla, 10 litrów, 100 litrów lub 500 litrów:

litrów: Substancje na 10 litrów podłoża 1B12 sterylizowano w 7 litrach wody, a następnie dodawano 1 litr sterylnego 10% roztworu 2-(hydroksypropylo)-e-cyklodekstryny i zaszczepiano 2 litrami litrowej hodowli pośredniej. Czas hodowli głównej jest 6-7 dni i to warunki są: 30°C, 250 obr/min,

0,5 litrów powietrza na litr płynu na min, 0,5 barów nadciśnienia, kontrola pH z H2SO4/KOH do pH 7,6 +/- 0.5 (tzn. bez kontroli między pH 7,1 i 8,1).

100 litrów: Substancje na 10 litrów podłoża 1B12 sterylizowano w 70 litrach wody, a następnie dodawano 10 litrów sterylnego 10% roztworu 2-(hydroksypropylo)-e-cyklodekstryny i zaszczepiano 20 litrami 20 litrowej hodowli pośredniej. Czas hodowli głównej jest 6-7 dni, i warunki są następujące: 30°C, 200 obr/min, 0,5 litrów powietrza na litr płynu na min, 0,5 barów nadciśnienia, kontrola pH z H2SO4/KOH do pH 7,6 +/- 0,5. Łańcuch zaszczepiania dla 100 I fermentacji przedstawiono schematycznie poniżej.

500 litrów: Substancje na 500 litrów podłoża 1B12 sterylizowano w 350 litrach wody, a następnie dodawano 50 litrów sterylnego 10% roztworu 2-(hydroksypropylo)-e-cyklodekstryny i zaszczepiano 100 litrami 100 litrowej hodowli pośredniej. Czas hodowli głównej jest 67 dni, i warunki są: 30°C, 120 obr/min, 0,5 litrów powietrza na litr płynu na min, 0,5 barów nadciśnienia, kontrola pH z H2SO4/KOH do pH 7,6 +/- 0,5

Analiza produktu:

Przygotowanie próbki ml próbek mieszano z 2 ml polistyrenowej żywicy Amberlite XAD16 (Rohm + Haas, Frankfurt, Niemcy) i mieszano przy 180 obr/min przez jedną godzinę w 30°C. Żywicę następnie odsączono stosując sito nylonowe 150 μm płukano niewielką ilością wody i dodawano razem z filtrem do 15 ml probówki Nunc.

Elucja produktu z żywicy:

ml izopropanolu (>99%) dodano do probówki z filtrem i żywicą. Następnie zamkniętą probówkę wytrząsano przez 30 minut w temperaturze pokojowej na Rota-Mixer (Labinco BV, Holandia). Następnie odwirowano 2 ml płynu i nadsącz dodano stosując pipetę do probówek HPLC.

Analiza HPLC:

Kolumna: Waters-Symetry C18,100 x 4 mm, 3,5 μm

WAT066220 + wstępna kolumna 3,9 x 20 mm WAT054225

PL 200 157 B1

Rozpuszczalniki:	A: B:	0,02% kwas fosforowy Acetonitryl (Jakość HPLC)
Gradient:	41% B	od 0 do 7 min.
	100% B	od 7,2 do 7,8 min.
	41% B	od 8 do 12 min.
Temperatura pieca:	30°C

Detekcja: Wstrzyknięta obj: Czas retencji:

250 nm, detekcja UV-DAD 10 μ

Epo A: 4,30 min Epo B: 5,38 min

B: Wpływ dodania cyklodekstryny i pochodnych cyklodekstryny na uzyskane stężenia epotilonu.

Cyklodekstryny są cyklicznymi (a-1,4)-połączonymi oligosacharydarni α-D-glukopiranozy z względnie hydrofobową jamą centralną i hydrofilowym obszarem powierzchni zewnętrznej.

W szczególności wyróżniane są następujące (liczby w nawiasie podają liczbę jednostek glukozowych na cząsteczkę): α-cyklodekstryna (6), β-cyklodekstryna (7), γ-cyklodekstryna (8), δ-cyklodekstryna (9), ε-cyklodekstryna (10), Z-cyklodekstryna (11), η-cyklodekstryna (12) i θ-cyklodekstryna (13). Szczególnie korzystne są δ-cyklodekstryna i w szczególności α-cyklodekstryna, β-cyklodekstryna lub γ-cyklodekstryna, lub ich mieszaniny.

Pochodne cyklodekstryn są przede wszystkim pochodnymi powyższych cyklodekstryn, szczególnie α-cyklodekstryny, β-cyklodekstryny lub γ-cyklodekstryny, przede wszystkim tych, w których jedna lub więcej wszystkich grup hydroksy (3 na resztę glukozy) jest eterowanych lub estryfikowanych. Etery są przede wszystkim eterami alkilowymi, korzystnie z niższymi alkilami takimi jak eter metylowy lub eter etylowy, także eter propylowy lub butylowy; etery arylohydroksyalkilowe, korzystnie z fenylo-hydroksy-niższym alkilem, szczególnie eter fenylohydroksyetylowy; etery hydroksyalkilowe, w szczególności etery z hydroksy-niższy-alkilem, szczególnie 2-hydroksyetylo-, hydroksypropylo-, takie jak 2-hydroksypropylo lub hydroksybutylo-, takie jak eter 2-hydroksybutylowy; etery karboksyalkilowe, w szczególności etery z karboksy-niższym alkilem, szczególnie eter karboksymetylowy lub karboksyetylowy, podstawione karboksyalkilo etery, w szczególności podstawione karboksy-niższe-alkilo etery, w których podstawiony karboksyl jest eterowanym lub amidowanym karboksylem (przede wszystkim aminokarbonylem, mono- lub di-niższym-alkilo-aminokarbonylem, morfolino-, piperydino-, pirolidynolub piperazazyno-karbonylem, lub alkiloksykarbonylem), w szczególności niższy alkoksykarbonyloniższy-alkilo eter, na przykład eter metylooksykarbonylopropylowy lub eter etyloksykarbonylopropylowy; etery sulfoalkilowe, w szczególności etery sulfoniższe-alkilowe, szczególnie eter sulfobutylowy; cyklodekstryny, w których jedna lub więcej grup OH są eterowane resztą o wzorze

-O-[alk-O-]-H w którym alk jest alkilem, szczególnie niższym alkilem i n jest liczbą całkowitą 2 do 12, szczególnie 2 do 5, w szczególności 2 lub 3; cyklodekstryny w których jedna lub więcej grup OH jest eterowanych resztą o wzorze:

R' i ⁰ (Alk-Ο)-Alk / V w którym R' oznacza wodór, hydroksy, -O-(alk-O)z-H, -O-(alk(-R)-O-)p-H lub -O-(alk(-R)-O-)q-alk-CO-Y; alk we wszystich przypadkach jest alkilem, szczególnie niższym alkilem; m, n, p, q i z są liczbą całkowitą od 1 do 12, korzystnie 1 do 5, w szczególności 1 do 3; i Y jest OR1 lub NR2R3, w którym R1, R2 i R3 są niezależnie od siebie wodorem lub niższym alkilem lub R2 i R3 połączone razem z łączącym azotem oznaczają, grupę morfolinową, piperydynową, pirolidonową albo piperazynową; lub rozgałęzione cyklodekstryny, w których są obecne pochodne eterowe lub acetale z innymi cząsteczkami cukru, szczególnie glukozylo-, diglukozylo-(G2-p-cyklodekstryna), maltozylo- lub dimaltozylo-cyklodekstryna, lub N-acetyloglukozaminylo-, glukozaminylo-, N-acetylogalaktozaminylo- lub galaktozaminylo-cyklodekstryna.

Estry są przede wszystkim estrami alkanoilowymi, w szczególności estrami niższych alkanoili, takich jak estry acetylowe cyklodekstryn.

Jest też możliwe wykorzystanie cyklodekstryn, w których dwie lub więcej różne grupy eterowe i estrowe są obecne równocześnie.

PL 200 157 B1

Mogą też istnieć mieszaniny dwóch lub więcej z tych tych cyklodekstryn i/lub cyklodekstryn.

Preferuje się w szczególności α-, β- lub γ-cyklodekstryny lub ich niższe etery alkilowe, takie jak metylo-e-cyklodekstryna lub w szczególności 2,6-di-O-metylo-e-cyklodekstryna, lub w szczególności ich hydroksy niższe etery alkilowe, takie jak 2-hydroksypropylo-a-,2-hydroksypropylo-e- lub 2-hydroksypropylo-Y-cyklodekstryna.

Cyklodekstryny lub pochodne cyklodekstryn dodaje się do pożywki hodowlanej korzystnie w stężeniu 0,02 do 10, korzystnie 0,05 do 5, szczególnie 0,1 do 4, na przykład 0,1 do 2% stężenia wagowego.

Cyklodekstryny lub pochodne cyklodekstryn są znane lub mogą być produkowane za pomocą znanych procesów (zobacz US 3,459,731; US 4,383,992; US 4,535,152; US 4,659,696; EP O 094 157; EP O 149 197; EP O 197 571; EP O 300 526; EP O 320 032; EP O 499 322; EP O 503 710; EP O 818469; WO 90/12035; WO 91/11200; WO 93/19061; WO 95/08993; WO 96/14090; GB 2,189,245;

DE 3,118,218; DE 3,317,064 i wymienione w nich odnośniki, które także dotyczą syntezy cyklodekstryn lub pochodnych cyklodekstryn, lub także: T. Loftsson i M.E. Brewster (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: Drug Solubilization and Stabilisation: Journal of Pharmaceutical Science 85 (10): 10 17-1025; R.A. Rajewski i V.J. Stella (1996): Pharmaceutical Applications of Cyklodextrins: In Vivo Drug Delivery: Journal of Pharmaceutical Science 85 (11): 1142-1169).

Wszystkie tu badane pochodne cyklodekstryn można uzyskać od firmy Fluka, Buchs, CH. Testy przeprowadza się w 200 ml wytrząsanych kolbach z 50 ml objętości hodowli. Jako kontrolę stosuje się kolby z żywicą absorbującą Amberlite XAD-16 (Rohm & Haas, Frankfurt, Niemcy) i bez dodatku adsorbentu. Po inkubacji przez 5 dni, można ustalić następujące miana epotilonu za pomocą HPLC:

T a b e l a 2

Dodatek	Nr zamówienia	Stęż. [% stęż. wagowego]	Epo A [mg/l]	Epo B [mg/l]
1	2	3	4	5
Amberlite XAD-16 (obj.)		2,0 (% obj.)	9,2	3,8
2-hydroksypropylo-e- cyklodekstryna	56332	0,1	2,7	1,7
2-hydroksypropylo-e- cyklodekstryna	„	0,5	4,7	3,3
2-hydroksypropylo-e- cyklodekstryna	„	1,0	4,7	3,4
2-hydroksypropylo-e- cyklodekstryna	„	2,0	4,7	4,1
2-hydroksypropylo-e- cyklodekstryna	„	5,0	1,	70,5
2-hydroksypropylo-a- cyklodekstryna	56330	0,5	1,2	1,2
2-hydroksypropylo-a- cyklodekstryna	„	1,0	1,2	1,2
2-hydroksypropylo-a- cyklodekstryna	„	5,0	2,5	2,3
β-cyklodekstryna	28707	0,1	1,6	1,3
β-cyklodekstryna	„	0,5	3,6	2,5
β-cyklodekstryna	„	1,0	4,8	3,7
β-cyklodekstryna	„	2,0	4,8	2,9
β-cyklodekstryna	„	5,0	1,1	0,4
metylo-e-cyklodekstryna	66292	0,5	0,8	<0,3

PL 200 157 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5
metylo-e-cyklodekstryna	„	1,0	<0,3	<0,3
metylo-^-cyklodekstryna	„	2,0	<0,3	<0,3
2,6-di-o-metylo-e- cyklodekstryna	39915	1,0	<0,3	<0,3
2-hydroksypropylo-Y- cyklodekstryna	56334	0,1	0,3	<0,3
2-hydroksypropylo-Y- cyklodekstryna	„	0,5	0,9	0,8
2-hydroksypropylo-Y- cyklodekstryna	„	1,0	1,1	0,7
2-hydroksypropylo-Y- cyklodekstryna	„	2,0	2,6	0,7
2-hydroksypropylo-Y- cyklodekstryna	„	5,0	5,0	1,1
bez dodatku			0,5	0,5

¹⁾ Z wyjątkiem Amberlite (% obj.), wszystkie procenty są wagowe (% wag/obj).

Kilka z badanych cyklodekstryn (2,6-di-o-metylo-e-cyklodekstryna, metylo-e-cyklodekstryna) nie wykazują wpływu lub negatywny wpływ na produkcję epotilonu w stosowanych stężeniach. 1-2% 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryna i β-cyklodekstryna zwiększają produkcję epotilonu w przykładach 6 do 8 razy w porównaniu z produkcją bez użycia cyklodekstryn.

C: 10 litrowa fermentacja z 1% 2-(hydroksypropylo)-e-cyklodekstryną:

Fermentacja jest przeprowadzana w 15 litrowym fermentorze szklanym. Pożywka zawiera 10 g/l 2-(hydroksypropylo)-e-cyklodekstryny od Wacker Chemie, Monachium, Niemcy. Postęp fermentacji jest zilustrowany w tabeli 3. Fermentację kończy się po 6 dniach i poddaje się obróbce.

T a b e l a 3: Postęp fermentacji w 10 litrach

Czas hodowli [d]	Epotilon A [mg/l]	Epotilon B [mg/l]
0	0	0
1	0	0
2	0,5	0,3
3	1,8	2,5
4	3,0	3,1
5	3,7	5,9
6	3,6	5,7

D: 100 litrowa fermentacja z 1% 2-(hydroksypropylo)-e-cyklodekstryną:

Fermentacja jest przeprowadzana w 150 litrowym fermentorze. Pożywka zawiera 10 g/l 2-(hydroksypropylo)-e-cyklodekstryny. Postęp fermentacji jest zilustrowany w tabeli 4. Fermentację kończy się po 7 dniach i poddaje się obróbce.

T a b e l a 4: Postęp fermentacji w 100 litrach

Czas hodowli [d]	Epotilon A [mg/l]	Epotilon B [mg/l]
1	2	3
0	0	0
1	0	0
2	0,3	0

PL 200 157 B1 cd. tabeli 4

1	2	3
3	0,9	1,1
4	1,5	2,3
5	1,6	3,3
6	1,8	3,7
7	1,8	3,5

E: 500 litrowa fermentacja z 1% 2-(hydroksypropylo)-e-cyklodekstryną:

Fermentacja jest przeprowadzana w 750 litrowym fermentorze. Pożywka zawiera 10 g/l

2-(hydroksypropylo)-e-cyklodekstryny. Postęp fermentacji jest zilustrowany w tabeli 5.

Fermentację kończy się po 6 dniach i poddaje się obróbce.

T a b e l a 5: Postęp fermentacji w 500 litrach

Czas hodowli [d]	Epotilon A [mg/l]	Epotilon B [mg/l]
0	0	0
1	0	0
2	0	0
3	0,6	0,6
4	1,7	2,2
5	3,1	4,5
6	3,1	5,1

F: Przykład porównawczy fermentacji 10 litrów bez dodatku adsorbentu:

Fermentacja jest przeprowadzana w 15 litrowym fermentorze szklanym. Pożywka nie zawiera żadnej cyklodekstryny ani innego adsorbentu. Postęp fermentacji jest zilustrowany w tabeli 6. Fermentacji nie zbiera się i nie obrabia.

T a b e l a 6: Postęp 10 litrowej fermentacji bez adsorbentu

Czas hodowli [d]	Epotilon A [mg/l]	Epotilon B [mg/l]
0	0	0
1	0	0
2	0	0
3	0	0
4	0,7	0,7
5	0,7	1,0
6	0,8	1,3

G: Obróbka epotilonów: izolacja z 500 litrowej hodowli głównej

Objętość zebrana z 500 litrowej hodowli głównej przykładu 2D wynosi 450 litrów i jest rozdzielana przy zastosowaniu klarującego separator Westfalia Typ SA-20-06 (obr/min = 6500) do fazy płynnej (centryfugat + woda do płukania = 650 litrów) i fazy stałej (komórki = około 15 kg). Główna część epotilonów jest w centryfugacie. Odwirowana miazga komórkowa zawiera < 15% określonej części epotilonowej i nie jest dalej obrabiana. 650 l centryfugatu następnie umieszcza się w 4000 litrowym naczyniu do mieszania, miesza z 10 litrami Amberlite XAD-16 (objętość centryfugat: żywica = 65:1) i miesza. Po okresie kontaktu około 2 godziny żywicę odwirowuje się w wirówce przelewowej Heine (zawartość koszyka 40 litrów; obr/min = 2800). Żywicę uwalnia się z wirówki i płucze 1015 litrami wody dejonizowanej. Desorpcję przeprowadza przez mieszanie żywicy dwukrotnie, każdy raz w porcjach

PL 200 157 B1 z 30 litrami izopropanolu w 30 litrowych naczyniach szklanych mieszających przez 30 minut. Rozdział fazy izopropanolowej od żywicy odbywa się z zastosowaniem filtra ssącego. Izopropanol wówczas usuwa się z połączonych faz izopropanolu przez dodanie 15-20 litrów wody na wyparce rotacyjnej próżniowej (Schmid-Verdampfer) i powstałą fazę wodną około 10 litrów ekstrahuje się 3 x każdy z 10 litrami octanu etylu. Ekstrakcję przeprowadza się w 30 litrowym szklanym naczyniu do mieszania. Ekstrakt octanu etylu zatęża się do 3-5 litrów na próżniowej wyparce rotacyjnej (Schmid-Verdampfer) i następnie zatężonych do suchości na wyparce rotacyjnej (typ Βϋ^ϊ) pod próżnią. Wynikiem jest ekstrakt octanu etylu 50,2 g. Octan etylu jest rozpuszczany w 500 ml metanolu, nierozpuszczane części odsącza się stosując złożony filtr i roztwór dodaje się do kolumny Sephadex LH 20 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) (średnica kolumny 20 cm, poziom wypełnienia około 1,2 m). Elucję przeprowadza się z metanolem jako eluantem. Epotilon A i B jest obecny przede wszystkim we frakcjach 21-23 (przy wielkości frakcji 1 litr). Te frakcje zatęża się do suchości pod próżnią na wyparce rotacyjnej (całkowita masa 9,0 g). Te frakcje ze szczytu Sephadex (9,0 g) następnie rozpuszcza się w 92 ml acetonitryl:woda:chlorek metylenu = 50:40:2, roztwór przesącza się przez złożony sączek i dodaje do kolumny RP (wyposażenie Prepbar 200, Merck; 2,0 kg Li-Chrospher RP-18 Merck, wielkość ziarna 12 μm, średnica kolumny 10 cm, poziom wypełnienia 42 cm; Merck, Oarmstadt, Niemcy). Elucję przeprowadza się acetonitrilem:wodą = 3,7 (tempo przepływu = 500 ml/min.; czas retencji epotilon A = około 51-59 min.; czas retencji epotilon B = około 60-69 min.). Frakcjonowanie monitorowano za pomocą detektora UV przy 250 nm. Frakcje zatęża się do suchości pod próżnią na wyparce rotacyjnej BijchiRotavapor. Waga frakcji szczytowej epotilonu A wynosi 700 mg i na podstawie HPLC (standard zewnętrzny) ma zawartość 75,1%. Frakcja szczytu epotilonu B waży 1980 mg, i zawartość na podstawie HPLC (standard zewnętrzny) wynosi 86,6%. Na koniec frakcję epotilonu A (700 mg) krystalizowano z 5 ml octan etylu:toluen = 2:3, i wydajność 170 mg czystego krystalicznego epotilonu A [zawartość na podstawie HLPC (% powierzchni) = 94,3%]. Krystaliczną frakcję epotilonu B (1980 mg) uzyskuje się z 18 ml metanolu i daje 1440 mg czystego krystalicznego epotilonu B [zawartość na podstawie HPLC (% powierzchni) = 99,2%]. t. topn. (Epotilon B): np. 124-125°C; dane ¹H-NMR dla Epotilonu B:

500 MHz-NMR, rozpuszczalnik: DMSO-d6. Chemiczne przesunięcie δ względem TMS w ppm. s = pojedynczy; d = podwójny; m = wielokrotne δ (Wielokrotność) Całka (liczba H)

7,34 (s)

6,50 (s)

5,28 (d)

5,08 (d)

4.46 (d)

4,08 (m)

3.47 (m)

3,11 (m)

2.83 (dd)

2,64 (s)

2,36 (m)

2,09 (s)

2,04 (m)

1.83 (m)

1,61 (m)

1,47-1,24 (m)

1,18 (s)

1,13 (m)

1,06 (d)

0,89 (d + s, zachodzące)

Σ = 41

P r z y k ł a d 15: Medyczne zastosowanie epotilonów produkowanych technikami rekombinacji

Farmaceutyczne preparaty lub kompozycje zawierające epotilony są stosowane na przykład w leczeniu chorób nowotworowych, takich jak różne ludzkie guzy lite. Takie preparaty przeciwnowotworowe zawierają na przykład, czynną ilość epotilonu razem z jednym lub więcej organicznym lub nieorganicznym, płynnym lub stałym, farmaceutycznie odpowiednim materiałem nośnikowym. Takie

PL 200 157 B1 formuły dostarcza się na przykład dojelitowo, do nosa, doodbytniczo, doustnie, lub pozajelitowo, w szczególności domięśniowo lub dożylnie. Dawka czynnika aktywnego zależy od wagi, wieku, i fizycznego i farmakokinetycznego stanu pacjenta i dalej zależy od sposobu dostarczenia. Ponieważ epotilony imitują biologiczne efekty taksolu mogą zastępować taksol w kompozycjach i sposobach wykorzystujących aksol w leczeniu raka. Zobacz na przykład, amerykańskie dokumenty patentowe nr 5,496,804, 5,565,478 i 5,641,803, które są wszystkie tu włączone jako odnośniki.

Na przykład, dla celów leczeniczych, epotilon B jest dostarczany w indywidualnych 2 ml szklanych fiolkach w postaci 1 mg/l ml przezroczystego, bezbarwnego koncentratu dożylnego. Substancja znajduje się w poli(glikolu etylenowym) 300 (PEG 300) rozcieńczonym 50 lub 100 ml 0,9% chlorku sodu do iniekcji, USP, w celu uzyskania pożądanego stężenia końcowego leku do infuzji. Jest podawany jako pojedynczy 30-minutowy dożylny wlew co 21 dni (leczenie trzy razy na tydzień) przez sześć cykli lub jako pojedyncza 30-minutowa dożylna wlewka co 7 dni (leczenie tygodniowe).

Korzystnie, do terapii tygodniowej dawka wynosi pomiędzy około 0,1 i około 6, korzystnie pomiędzy około 0,1 i około 5 mg/m², bardziej korzystnie pomiędzy około 0,1 i około 3 mg/m², jeszcze bardziej korzystnie pomiędzy 0,1 i 1,7 mg/m², najbardziej korzystnie około pomiędzy 0,3 i około 1 mg/m²; dla leczenia trzytygodniowego (leczenie, co trzy tygodnie lub każdy trzeci tydzień) dawka wynosi między około 0,3 i około 18 mg/m², korzystnie pomiędzy około 0,3 i około 15 mg/m², bardziej korzystnie pomiędzy około 0,3 i około 12 mg/m², jeszcze bardziej korzystnie pomiędzy około 0,3 i około 7,5 mg/m², jeszcze bardziej korzystnie pomiędzy około 0,3 i około 5 mg/m², najbardziej korzystnie pomiędzy około 1,0 i około 3,0 mg/m². Ta dawka jest korzystnie podawana człowiekowi przez podawanie dożylne, przez okres równy od 2 do 180 min, korzystnie od 2 do 120 min, bardziej korzystnie od około 5 do około 30 min, najbardziej korzystnie od około 10 do około 30 min, np. podczas około 30 min.

Choć, niniejszy wynalazek został opisany w odniesieniu do specyficznych jego postaci, są możliwe różne jego warianty, modyfikacje i postacie, tak więc wszystkie te warianty, modyfikacje i postacie uważa się za wchodzące w zakres niniejszego wynalazku.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydów, która koduje przynajmniej jeden polipeptyd biorący udział w biosyntezie epotilonu, znamienna tym, że ten polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: SEQ ID NO:2, aminokwasów 11-437 SEQ ID NO:2, aminokwasów 543-864 SEQ ID NO:2, aminokwasów 974-1273 SEQ ID NO:2, aminokwasów 1314-1385 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, aminokwasów 72-81 SEQ ID NO:3, aminokwasów 118-125 SEQ ID NO:3, aminokwasów 199-212 SEQ ID NO:3, aminokwasów 353-363 SEQ ID NO:3, aminokwasów 549-565 SEQ ID NO:3, aminokwasów 588-603 SEQ ID NO:3, aminokwasów 669-684 SEQ ID NO:3, aminokwasów 815-821 SEQ ID NO:3, aminokwasów 868-892 SEQ ID NO:3, aminokwasów 903-912 SEQ ID NO:3, aminokwasów 918-940 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1268-1274 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1285-1297 SEQ ID NO:3, aminokwasów 973-1256 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1344-1351 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, aminokwasów 7-432 SEQ ID NO:4, aminokwasów 539-859 SEQ ID NO:4, aminokwasów 869-1037 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1439-1684 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1722-1792 SEQ ID NO:4, SEQ ID 2 NO:5, aminokwasów 39-457 SEQ ID NO:5, aminokwasów 563-884 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1147-1399 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1434-1506 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1524-1950 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2056-2377 SEQ ID N0:5, aminokwasów 2645-2895 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2932-3005 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3024-3449 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3555-3876 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3886-4048 SEQ ID NO:5, aminokwasów 4433-4719 SEQ ID NO:5, aminokwasów 4729-4974 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5010-5082 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5103-5525 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5631-5951 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5964-6132 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6542-6837 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6857-7101 SEQ ID NO:5, aminokwasów 7140-7211 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, aminokwasów 35-454 SEQ ID NO:6, aminokwasów 561-881 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1143-1393 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1430-1503 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1522-1946 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2053-2373 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2383-2551 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2671-3045 SEQ ID NO:6, aminokwasów 3392-3636 SEQ ID NO:6 aminokwasów 3673-3745 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, aminokwasów 32-450 SEQ ID NO:7, aminokwasów 556-877 SEQ ID NO:7, aminokwasów 887-1051 SEQ ID NO:7,

PL 200 157 B1 aminokwasów 1478-1790 SEQ ID NO:7, aminokwasów 1810-2055 SEQ ID NO:7, aminokwasów 2093-2164 SEQ ID NO:7, aminokwasów 2165-2439 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:22.
2. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że ten polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy złożonej z: SEQ ID NO:2, aminokwasów 11-437 SEQ ID NO:2, aminokwasów 543-864 SEQ ID NO:2, aminokwasów 974-1273 SEQ ID NO:2, aminokwasów 1314-1385 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, aminokwasów 72-81 SEQ ID NO:3, aminokwasów 118-125 SEQ ID NO:3, aminokwasów 199-212 SEQ ID NO:3, aminokwasów 353-363 SEQ ID NO:3, aminokwasów 549-565 SEQ ID NO:3, aminokwasów 588-603 SEQ ID NO:3, aminokwasów 669-684 SEQ ID NO:3, aminokwasów 815-821 SEQ ID NO:3, aminokwasów 868-892 SEQ ID NO:3, aminokwasów 903-912 SEQ ID NO:3, aminokwasów 918-940 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1268-1274 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1285-1297 SEQ ID NO:3, aminokwasów 973-1256 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1344-1351 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, aminokwasów 7-432 SEQ ID NO:4, aminokwasów 539-859 SEQ ID NO:4, aminokwasów 869-1037 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1439-1684 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1722-1792 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, aminokwasów 39-457 SEQ ID NO:5, aminokwasów 563-884 SEQ ID N0:5, aminokwasów 1147-1399 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1434-1506 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1524-1950 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2056-2377 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2645-2895 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2932-3005 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3024-3449 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3555-3876 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3886-4048 SEQ ID NO:5, aminokwasów 4433-4719 SEQ ID NO:5, aminokwasów 4729-4974 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5010-5082 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5103-5525 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5631-5951 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5964-6132 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6542-6837 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6857-7101 SEQ ID NO:5, aminokwasów 7140-7211 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, aminokwasów 35-454 SEQ ID NO:6, aminokwasów 561-881 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1143-1393 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1430-1503 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1522-1946 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2053-2373 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2383-2551 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2671-3045 SEQ ID NO:6, aminokwasów 3392-3636 SEQ ID NO:6, aminokwasów 3673-3745 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, aminokwasów 32-450 SEQ ID NO:7, aminokwasów 556-877 SEQ ID NO:7, aminokwasów 887-1051 SEQ ID NO:7, aminokwasów 1478-1790 SEQ ID NO:7, aminokwasów 1810-2055 SEQ ID NO:7, aminokwasów 2093-2164 SEQ ID NO:7, aminokwasów 2165-2439 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:22.
3. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że ta sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z sekwencji komplementarnych do nukleotydów 1900-3171 SEQ ID NO:1, nukleotydów 3415-5556 SEQ ID NO:1, nukleotydów 7610-11875 SEQ ID NO:1, nukleotydów 7643-8920 SEQ ID NO:1, nukleotydów 9236-10201 SEQ ID NO:1, nukleotydów 10529-11428 SEQ ID NO:1, nukleotydów 11549-11764 SEQ ID NO:1, nukleotydów 11872-16104 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12085-12114 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12223-12246 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12466-12507 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12928-12960 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13516-13566 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13633-13680 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13876-13923 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14313-14334 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14473-14547 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14578-14607 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14623-14692 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15673-15693 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15724-15762 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14788-15639 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15901-15924 SEQ ID NO:1, nukleotydów 16251-21749 SEQ ID NO:1, nukleotydów 16269-17546 SEQ ID NO:1, nukleotydów 17865-18827 SEQ ID NO:1, nukleotydów 18855-19361 SEQ ID NO:1, nukleotydów 20565-21302 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21414-21626 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21746-43519 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21860-23116 SEQ ID NO:1, nukleotydów 23431-24397 SEQ ID NO:1, nukleotydów 25184-25942 SEQ ID NO:1, nukleotydów 26045-26263 SEQ ID NO:1, nukleotydów 26318-27595 SEQ ID NO:1, nukleotydów 27911-28876 SEQ ID NO:1, nukleotydów 29678-30429 SEQ ID, NO:1, nukleotydów 30539-30759 SEQ ID NO:1, nukleotydów 30815-32092 SEQ ID NO:1, nukleotydów 32408-33373 SEQ ID NO:1, nukleotydów 33401-33889 SEQ ID NO:1, nukleotydów 35042-35902 SEQ ID NO:1, nukleotydów 35930-36667 SEQ ID NO:1, nukleotydów 36773-36991 SEQ ID NO:1, nukleotydów 37052-38320 SEQ ID NO:1, 5 nukleotydów 38636-39598 SEQ ID NO:1, nukleotydów 39635-40141 SEQ ID NO:1 nukleotydów 41369-42256 SEQ ID NO:1, nukleotydów 42314-43048 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43163-43378 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43524-54920 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43626-44885 SEQ ID NO:1, nukleotydów 45204-46166 SEQ ID NO:1, nukleotydów 4695032

PL 200 157 B1

-47702 SEQ ID NO:1, nukleotydów 47811-48032 SEQ ID NO:1, nukleotydów 48087-49361 SEQ ID NO:1, nukleotydów 49680-50642 SEQ ID NO:1, nukleotydów 50670-51176 SEQ ID NO:1, nukleotydów 51534-52657 SEQ ID NO:1, nukleotydów 53697-54431 SEQ ID NO:1, nukleotydów 54540-54758 SEQ ID NO:1, nukleotydów 54935-62254 SEQ ID NO:1, nukleotydów 55028-56284 SEQ ID NO:1, nukleotydów 56600-57565 SEQ ID NO:1, nukleotydów 57593-58087 SEQ ID NO:1, nukleotydów 59366-60304 SEQ ID NO:1, nukleotydów 60362-61099 SEQ ID NO:1, nukleotydów 61211-61426 SEQ ID NO:1, nukleotydów 61427-62254 SEQ ID NO:1, nukleotydów 62369-63628 SEQ ID NO:1, nukleotydów 67334-68251 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 1-68750 SEQ ID NO:1.
4. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja nukleotydów jest wybrana z grupy złożonej z sekwencji komplementarnych do nukleotydów 1900-3171 SEQ ID NO:1, nukleotydów 3415-5556 SEQ ID NO:1, nukleotydów 7610-11875 SEQ ID NO:1 nukleotydów 7643-8920 SEQ ID NO:1, nukleotydów 9236-10201 SEQ ID NO:1, nukleotydów 10529-11428 SEQ ID NO:1, nukleotydów 11549-11764 SEQ ID NO:1, nukleotydów 11872-16104 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12085-12114 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12223-12246 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12466-12507 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12928-12960 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13516-13566 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13633-13680 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13876-13923 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14313-14334 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14473-14547 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14578-14607 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14623-14692 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15673-15693 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15724-15762 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14788-15639 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15901-15924 SEQ ID NO:1, nukleotydów 16251-21749 SEQ ID NO:1, nukleotydów 16269-17546 SEQ ID NO:1, nukleotydów 17865-18827 SEQ ID NO:1, nukleotydów 18855-19361 SEQ ID NO:1, nukleotydów 20565-21302 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21414-21626 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21746-43519 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21860-23116 SEQ ID NO:1, nukleotydów 23431-24397 SEQ ID NO:1, nukleotydów 25184-25942 SEQ ID NO:1, nukleotydów 26045-26263 SEQ ID NO:1, nukleotydów 26318-27595 SEQ ID NO:1, nukleotydów 27911-28876 SEQ ID NO:1, nukleotydów 29678-30429 SEQ ID NO:1, nukleotydów 30539-30759 SEQ ID NO:1, nukleotydów 30815-32092 SEQ ID NO:1, nukleotydów 32408-33373 SEQ ID NO:1, nukleotydów 33401-33889 SEQ ID NO:1, nukleotydów 35042-35902 SEQ ID NO:1, nukleotydów 35930-36667 SEQ ID NO:1, nukleotydów 36773-36991 SEQ ID NO:1, nukleotydów 37052-38320 SEQ ID NO:1, nukleotydów 38636-39598 SEQ ID NO:1, nukleotydów 39635-40141 SEQ ID NO:1, nukleotydów 41369-42256 SEQ ID NO:1, nukleotydów 42314-43048 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43163-43378 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43524-54920 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43626-44885 SEQ ID NO:1, nukleotydów 45204-46166 SEQ ID NO:1, nukleotydów 46950-47702 SEQ ID NO:1, nukleotydów 47811-48032 SEQ ID NO:1, nukleotydów 48087-49361 SEQ ID NO:1, nukleotydów 49680-50642 SEQ ID NO:1, nukleotydów 50670-51176 SEQ ID NO:1, nukleotydów 51534-52657 SEQ ID NO:1, nukleotydów 53697-54431 SEQ ID NO:1, nukleotydów 54540-54758 SEQ ID NO:1, nukleotydów 54935-62254 SEQ ID NO:1, nukleotydów 55028-56284 SEQ ID NO:1, nukleotydów 56600-57565 SEQ ID NO:1, nukleotydów 57593-58087 SEQ ID NO:1, nukleotydów 59366-60304 SEQ ID NO:1, nukleotydów 60362-61099 SEQ ID NO:1, nukleotydów 61211-61426 SEQ ID NO:1, nukleotydów 61427-62254 SEQ ID NO:1, nukleotydów 62369-63628 SEQ ID NO:1, nukleotydów 67334-68251 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 1-68750 SEQ ID NO:1.
5. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym ta domena syntazy epotilonu jest domeną β-ketoacylo syntazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 11-437 SEQ ID NO:2, aminokwasów 7-432 SEQ ID NO:4, aminokwasów 39-457 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1524-1950 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3024-3449 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5103-5525 SEQ ID NO:5, aminokwasów 35-454 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1522-1946 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 32-450 SEQ ID NO:7.
6. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 5, znamienna tym, że sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 7643-8920 SEQ ID NO:1, nukleotydów 16269-17546 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21860-23116 SEQ ID NO:1, nukleotydów 26318-27595 SEQ ID NO:1, nukleotydów 30815-32092 SEQ ID NO:1, nukleotydów 37052-38320 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43626-44885 SEQ ID NO:1, nukleotydów 48087-49361 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 55028-56284 SEQ ID NO:1.

PL 200 157 B1
7. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym ta domena syntazy epotilonu jest domeną acylotransferazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 543-864 SEQ ID NO:2, aminokwasów 539-859 SEQ ID NO:4, aminokwasów 563-884 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2056-2377 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3555-3876 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5631-5951 SEQ ID NO:5, aminokwasów 561-881 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2053-2373 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 556-877 SEQ ID NO:7.
8. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 7, znamienna tym, że sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 9236-10201 SEQ ID NO:1, nukleotydów 17865-18827 SEQ ID NO:1, nukleotydów 23431-24397 SEQ ID NO:1, nukleotydów 27911-28876 SEQ ID NO:1, nukleotydów 32408-33373 SEQ ID NO:1, nukleotydów 38636-39598 SEQ ID NO:1, nukleotydów 45204-46166 SEQ ID NO:1, nukleotydów 49680-50642 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 56600-57565 SEQ ID NO:1.
9. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym domena syntazy epotilonu jest domeną reduktazy enoilu zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 974-1273 SEQ ID NO:2, aminokwasów 4433-4719 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6542-6837 SEQ ID NO:5 i aminokwasów 1478-1790 SEQ ID NO:7.
10. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 9, znamienna tym, że sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 10529-11428 SEQ ID NO:1, nukleotydów 35042-35902 SEQ ID NO:1, nukleotydów 41369-42256 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 59366-60304 SEQ ID NO:1.
11. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym domena syntazy epotilonu jest domeną białka przenoszącego grupę acylową zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 1314-1385 SEQ ID NO:2, aminokwasów 1722-1792 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1434-1506 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2932-3005 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5010-5082 SEQ ID NO:5, aminokwasów 7140-7211 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1430-1503 SEQ ID NO:6, aminokwasów 3673-3745 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 2093-2164 SEQ ID NO:7.
12. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 11, znamienna tym, że sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 11549-11764 SEQ ID NO:1, nukleotydów 21414-21626 SEQ ID NO:1, nukleotydów 26045-26263 SEQ ID NO:1, nukleotydów 30539-30759 SEQ ID NO:l, nukleotydów 36773-36991 SEQ ID NO:1, nukleotydów 43163-43378 SEQ ID NO:1, nukleotydów 47811-48032 SEQ ID NO:1, nukleotydów 54540-54758 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 61211-61426 SEQ ID NO:1.
13. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym domena syntazy epotilonu jest domeną dehydratazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 869-1037 SEQ ID NO:4, aminokwasów 3886-4048 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5964-6132 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2383-2551 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 887-1051 SEQ ID NO:7.
14. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 18855-19361 SEQ ID NO:1, nukleotydów 33401-33889 SEQ ID NO:1, nukleotydów 39635-40141 SEQ ID NO:1, nukleotydów 50670-51176 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 57593-58087 SEQ ID NO:1.
15. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym domena syntazy epotilonu jest domeną β-ketoreduktazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 1439-1684 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1147-1399 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2645-2895 SEQ ID NO:5, aminokwasów 4729-4974 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6857-7101 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1143-1393 SEQ ID NO:6, aminokwasów 3392-3636 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 1810-2055 SEQ ID NO:7.

PL 200 157 B1
16. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 15, znamienna tym, że sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 20565-21302 SEQ ID NO:1, nukleotydów 25184-25942 SEQ ID NO:1, nukleotydów 29678-30429 SEQ ID NO:1, nukleotydów 35930-36667 SEQ ID NO:1, nukleotydów 42314-43048 SEQ ID NO:1, nukleotydów 46950-47702 SEQ ID NO:1, nukleotydów 53697-54431 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 60362-61099 SEQ ID NO:1.
17. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym domena syntazy jest domeną metylotransferazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do aminokwasów 2671-3045 SEQ ID NO:6.
18. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 17, znamienna tym, że sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna to nukleotydów 51534-52657 SEQ ID NO:1.
19. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydów kodującą co najmniej jedną domenę syntazy epotilonu, przy czym domena syntazy epotilonu jest domeną tioesterazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do aminokwasów 2165-2439 SEQ ID NO:7.
20. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 19, znamienna tym, że sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do nukleotydów 61427-62254 SEQ ID NO:1.
21. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydów, która koduje nierybosomalną syntetazę peptydową, przy czym, nierybosomalna syntetaza peptydowa zawiera sekwencje aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: SEQ ID NO:3, aminokwasów 72-81 SEQ ID NO:3, aminokwasów 118-125 SEQ ID NO:3, aminokwasów 199-212 SEQ ID NO:3, aminokwasów 353-363 SEQ ID NO:3, aminokwasów 549-565 SEQ ID NO:3, aminokwasów 588-603 SEQ ID NO:3, aminokwasów 669-684 SEQ ID NO:3, aminokwasów 815-821 SEQ ID NO:3, aminokwasów 868-892 SEQ ID NO:3, aminokwasów 903-912 SEQ ID NO:3, aminokwasów 918-940 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1268-1274 SEQ ID NO:3, aminokwasów 1285-1297 SEQ ID NO:3, aminokwasów 973-1256 SEQ ID NO:3 i aminokwasów 1344-1351 SEQ ID NO:3.
22. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 21, znamienna tym, że sekwencja nukleotydów jest zasadniczo podobna do sekwencji nukleotydów wybranej z grupy złożonej z: nukleotydów 11872-16104 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12085-12114 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12223-12246 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12466-12507 SEQ ID NO:1, nukleotydów 12928-12960 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13516-13566 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13633-13680 SEQ ID NO:1, nukleotydów 13876-13923 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14313-14334 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14473-14547 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14578-14607 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14623-14692 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15673-15693 SEQ ID NO:1, nukleotydów 15724-15762 SEQ ID NO:1, nukleotydów 14788-15639 SEQ ID NO:1 i nukleotydów 15901-15924 SEQ ID NO:1.
23. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 6 albo 8 albo 10 albo 12 albo 14 albo 16 albo 18 albo 20 albo 22, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa izolowana jest z miksobakterii.
24. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 23, znamienna tym, że miksobakteria stanowi Sorangium cellulosum.
25. Hybrydowy gen zawierający heterologiczną sekwencję promotora, znamienny tym, że heterologiczna sekwencja promotora jest funkcjonalnie połączona z cząsteczką kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 5 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11 albo 12 albo 13 albo 14 albo 15 albo 16 albo 17 albo 18 albo 19 albo 20 albo 21 albo 22 albo 23 albo 24.
26. Zrekombinowany wektor, znamienny tym, że zawiera hybrydowy gen określony w zastrz. 25.
27. Zrekombinowana komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera hybrydowy gen określony w zastrz. 25.
28. Zrekombinowana komórka gospodarza według zastrz. 27, znamienna tym, że jest bakterią.
29. Zrekombinowana komórka gospodarza według zastrz. 28, znamienna tym, że należy do promieniowców.
30. Zrekombinowana komórka gospodarza według zastrz. 29, znamienna tym, że należy do rodzaju Streptomyces.

PL 200 157 B1
31. Klon Bac, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 5 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11 albo 12 albo 13 albo 14 albo 15 albo 16 albo 17 albo 18 albo 19 albo 20 albo 21 albo 22 albo 23 albo 24.
32. Wyizolowany polipeptyd, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasów, w skład której wchodzi domena syntazy epotilonu.
33. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 32, znamienny tym, że domena syntazy epotilonu jest domeną β-ketoacylo syntazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej grupy złożonej z: aminokwasów 11-437 SEQ ID NO:2, aminokwasów 7-432 SEQ ID NO:4, aminokwasów 39-457 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1524-1950 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3024-3449 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5103-5525 SEQ ID NO:5, aminokwasów 35-454 SEQ ID NO:6, aminokwasów 1522-1946 SEQ ID NO: 6 i aminokwasów 32-450 SEQ ID NO:7.
34. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 32, znamienny tym, że domena syntazy epotilonu jest domeną acylotransferazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 543-864 SEQ ID NO:2, aminokwasów 539-859 SEQ ID NO:4, aminokwasów 563-884 SEQ ID NO:5, 13 aminokwasów 2056-2377 SEQ ID NO:5, aminokwasów 3555-3876 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5631-5951 SEQ ID NO:5, aminokwasów 561-881 SEQ ID NO:6, aminokwasów 2053-2373 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 556-877 SEQ ID NO:7.
35. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 32, znamienny tym, że domena syntazy epotilonu jest domeną reduktazy enoilu zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 974-1273 SEQ ID NO:2, aminokwasów 4433-4719 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6542- 6837 SEQ ID NO:5 i aminokwasów 1478-1790 SEQ ID NO:7.
36. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 32, znamienny tym, że domena syntazy enoilu jest domeną białka przenoszącego grupę acylową, przy czym polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 1314-1385 SEQ ID NO:2, aminokwasów 1722-1792 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1434-1506 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2932-3005 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5010-5082 SEQ ID NO:5, aminokwasów 7140-7211 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1430-1503 SEQ ID NO:6, aminokwasów 3673-3745 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 2093-2164 SEQ ID NO:7.
37. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 32, znamienny tym, że domena syntazy epotilonu jest domeną dehydratazy, zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 869-1037 SEQ ID NO:4, aminokwasów 3886-4048 SEQ ID NO:5, aminokwasów 5964-6132 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2383-2551 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 887-1051 SEQ ID NO:7.
38. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 32, znamienny tym, że domena syntazy epotilonu jest domeną β-ketoreduktazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasów wybranej z grupy złożonej z: aminokwasów 1439-1684 SEQ ID NO:4, aminokwasów 1147-1399 SEQ ID NO:5, aminokwasów 2645-2895 SEQ ID 14 NO:5, aminokwasów 4729-4974 SEQ ID NO:5, aminokwasów 6857-7101 SEQ ID NO:5, aminokwasów 1143-1393 SEQ ID NO:6, aminokwasów 3392-3636 SEQ ID NO:6 i aminokwasów 1810-2055 SEQ ID NO:7.
39. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 32, znamienny tym, domena syntazy epotilonu jest domeną metylotransferazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do aminokwasów 2671-3045 SEQ ID NO:6.
40. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 32, znamienny tym, że ta domena syntazy epotilonu jest domeną tioesterazy zawierającą sekwencję aminokwasów zasadniczo podobną do aminokwasów 2165-2439 SEQ ID NO:7.
41. Sposób heterologicznej ekspresji epotilonu w zrekombinowanym gospodarzu, znamienny tym, że obejmuje:

(a) wprowadzenie hybrydowego genu określonego w zastrz. 25 do gospodarza; i (b) hodowlę gospodarza w warunkach, które pozwalają na biosyntezę epotilonu u gospodarza.
42. Sposób produkcji epotilonu, znamienny tym, że obejmuje:

(a) ekspresję epotilonu w zrekombinowanym gospodarzu sposobem określonym w zastrz. 41; i (b) ekstrakcję epotilonu ze zrekombinowanego gospodarza.