KR100511233B1 - 에포틸론 생합성 유전자 - Google Patents

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Abstract

에포틸론의 생합성에 필수적인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 소란지움 셀룰로숨 (Sorangium Cellulosum)으로부터 단리되었다. 본 발명에서는 본 발명의 유전자가 형질전환된 재조합 숙주로부터 에포틸론을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에 의해, 에포틸론은 정제 뿐만 아니라 암의 치료제와 같은 제약 제형으로 사용하기에 충분한 양으로 제조될 수 있다.

Description

에포틸론 생합성 유전자 {Genes for the Biosynthesis of Epothilones}
본 발명은 폴리케티드 및 그의 합성 유전자에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 에포틸론 A 및 B의 생합성에 필수적인 신규 폴리케티드 합성효소 및 비-리보솜 펩티드 합성효소 유전자를 소란지움 셀룰로숨 (Sorangium cellulosum)으로부터 단리하는 방법 및 특성화 방법에 관한 것이다.
폴리케티드는 2개의 탄소 원자를 기본 단위로 합성되는 화합물이며, 그중 β-탄소에 항상 케토기가 있기 때문에 이름이 폴리케티드이다. 이런 화합물에는 많은 중요한 항생제, 면역억제제, 암 치료제 및 생물학적 특성 범위가 넓은 기타 화합물이 포함된다. 폴리케티드 사슬 길이의 상이함, 도입된 (두 탄소 원자 기본 단위의 일부로서 도입되거나 폴리케티드 골격이 형성된 후 도입된) 측쇄의 상이함, 및 이러한 기들의 화학양론으로부터 엄청난 구조적 다양성이 생겨났다. 또한, 케토기는 히드록실기 및 에놀기로 환원되거나 모두 제거될 수 있다. 두 탄소 원자가 첨가되는 각 단계는 폴리케티드 합성효소 (polyketide synthase, PKS)라 불리우는 복잡한 효소에 의해 지방산 생합성과 유사한 방식으로 수행된다.
폴리케티드의 수를 증가시키는 생합성 유전자는 이미 단리되어 서열분석되어 있다. 예를 들면, 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제5,639,919호, 동 제5,693,774호 및 동 제5,716,849호를 참조할 수 있으며, 이들 문헌은 소라펜 (soraphen)의 생합성 유전자에 대해 기재되어 있다. 또한, 리팜피신의 생합성 유전자에 대해 기재된 [Schupp et al., FEMS Microbiology Letters 159:201-207 (1998)] 및 WO 98/07868호, 및 틸락톤 (tylactone)의 생합성 유전자에 대해 기재된 미국 특허 제5,876,991호를 참조할 수 있으며, 이들 모든 문헌은 본원에 참고문헌으로 포함된다. 통상, 코딩 단백질은 두 가지 유형 (Ⅰ형 및 Ⅱ형)으로 나누어진다. Ⅰ형 단백질은 상이한 효소적 단계를 수행하는 여러 가지 촉매 도메인이 함께 공유결합에 의해 결합된 다관능성 단백질 (예를 들면, 에리쓰로마이신 (erythromycin), 소라펜, 리파마이신 및 아버멕틴 (avermectin)의 PKS, MacNeil et al., Industrial Microorganisms: Basic and Applied Mo-lecular Genetics, (ed.: Baltz et al.), American Society for Microbiology, Washington D. C. pp. 245-256 (1993))인 반면, Ⅱ형 단백질은 일관능성 (Hutchinson et al., in Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (ed.: Baltz et al.), American Society for Microbiology, Washington D. C. pp. 203-216 (1993) 참조)이다.
악티노르호딘 (actinorhodin, 스트렙토마이세스 코엘리칼라 (Streptomyces coelicolor)에 의해 생성됨)과 같은 더 단순한 폴리케티드의 경우, 한 세트의 PKS 유전자에 의해 코딩되는 PKS 효소에 의한 두 탄소 첨가 단계가 여러번 반복적으로 수행된다. 반면, 에리쓰로마이신 및 소라펜과 같은 더 복잡한 화합물의 합성은 모듈로 조직화된 PKS 효소에 관련되어 있는데, 이 때 각 모듈이 두 탄소 첨가 단계를 1회 수행한다 (Hopwood et al., in Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, (ed.: Baltz et al.), American Society for Microbiology, Washington D. C., pp. 267-275 (1993) 참조).
통상, 복잡한 폴리케티드 및 이차대사 물질은 단순 카르복실산 대신 아미노산으로부터 유래한 하부 구조를 가질 수 있다. 이러한 기본 단위는 비-리보솜 폴리펩티드 합성효소 (non-ribosomal polypeptide synthetase, NRPS)에 의해 도입된다. NRPS는 모듈로 조직화되는 다중 효소이다. 각각의 모듈은 1개의 아미노산 기본 단위를 첨가 (필요한 경우, 부가 과정 수행)하는 기능을 한다. NRPS는 아미노아실-아데닐레이트를 형성하여 아미노산을 활성화시키고, 펩티딜 캐리어 단백질 내 포스포판테테이닐 보결 분자단의 티올기에 활성화된 아미노산을 결합시킨다. 추가로, NRPS는 에피머화, N-메틸화, 또는 필요한 경우 고리화에 의해 아미노산을 변형시키고, 효소에 결합된 아미노산 사이에 펩티드 결합의 형성을 촉매한다. NRPS는 시클로스포린 (cyclosporin)과 같은 펩티드 이차대사 물질의 생합성에 관련되어 있고, 라파마이신에 나타나는 바와 같은 폴리케티드 사슬 종결 단위를 제공할 수 있거나, 또는 예르시니아박틴 (yersiniabactin) 생합성에 나타나는 바와 같이 PKS와 혼합 시스템을 형성한다.
에포틸론 A 및 B는 소란지움 셀룰로숨이라는 박테리아의 So ce90 균주에 의해 생성되는, 아실시스테인에서 유래한 출발 단위가 있는 16-원 거대고리화 폴리케티드이다 (본원에 참고문헌으로 포함되는 [Gerth et al., J. Antibiotics 49:560-563 (1996)] 참조). 에포틸론 A 및 B의 구조는 하기 화학식 Ⅰ과 같다.
상기 식에서, R은 수소 (에포틸론 A) 또는 메틸 (에포틸론 B)을 의미한다.
에포틸론은 항진균성의 범위가 좁으며, 특히 동물 세포 배양에서 높은 세포 독성을 나타낸다 (본원에 참고문헌으로 포함되는 독일 특허 4138042호 (Hoefle 등, 1993) 참조). 특히 중요한 것은, 생체내 및 배양된 세포에서 에포틸론이 탁솔 (taxol)의 생물학적 효과를 모방한다는 것이다 (본원에 참고문헌으로 포함되는 [Bollag et al., Cancer Research 55:2325-2333 (1995)] 참조). 세포내 미세관을 안정화시키는 탁솔 및 탁소테르 (taxotere)는 다양한 인간 충실성 종양에 대해 높은 활성이 있는 암의 화학치료제이다 (Rowinsky et al., J. Natl. Cancer Inst. 83:1778-1781 (1991)). 경쟁 연구로 에포틸론이 미세관에 대한 탁솔 결합의 경쟁적 억제제로 작용함을 알아냈고, 이는 에포틸론이 동일한 미세관 결합 부위를 공유하며 미세관에 대한 친화도가 탁솔과 유사하다는 해석과 일치한다. 그러나, 에포틸론은 탁솔에 비해 훨씬 적은 양으로 다중 약물-내성 세포주에 대한 효능을 나타낸다는 점에서 탁솔보다 우월하다 (Bollag et al. (1995)). 게다가, 에포틸론은 탁솔에 비해 P-당단백질에 의해 세포로부터 유출되는 효율이 매우 낮다 (Gerth et al. (1996)). 또한, 에포틸론 A 또는 에포틸론 B에 비해 세포독성이 월등한 몇몇 에포틸론 유사체가 합성되었으며, 이들은 미세관의 중합 및 안정화를 유도하는 능력이 증가되어 있다 (본원에 참고문헌으로 포함되는 WO 98/25929호 참조).
항암제로서 에포틸론의 장래성에도 불구하고, 현재 이러한 화합물의 제조에 관련된 문제가 그 상업적 잠재성을 제한하고 있다. 이 화합물은 산업적 규모로 화학 합성하기에는 너무 복잡하기 때문에, 발효에 의해 제조되어야 한다. 소란지움 셀룰로숨과 같은 믹소박테리아의 유전자 조작에 관한 기술은 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제5,686,295호에 기재되어 있다. 그러나, 소란지움 셀룰로숨은 발효시키기가 매우 어렵기 때문에 에포틸론의 제조량은 매우 적다. 발효에 적합한 이종 숙주에서 에포틸론의 재조합 제조는 현행 제조 방법상의 문제점을 해결할 수 있다. 그러나, 에포틸론을 생합성하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 지금까지 단리되지 않았다. 게다가, 에포틸론을 생성하는 균주 (즉, So ce 90)는 1종 이상의 부가의 폴리케티드인 스피란기엔 (spirangien)도 생성하기 때문에, 에포틸론 생합성 유전자를 단리하기가 매우 복잡할 것이라고 생각하였다.
따라서, 앞서 말한 것을 고려하여 본 발명의 한 목적은 소란지움 및 폴리안지움 군의 믹소박테리아 (즉, 소란지움 셀룰로숨 균주 So ce90)에서 에포틸론의 합성에 관여하는 유전자, 특히 에포틸론 A 및 B의 합성에 관여하는 유전자를 단리하는 것이다. 본 발명 추가의 목적은 항암제 제형에 사용할 수 있는 에포틸론의 재조합 제조 방법을 제공하는 것이다.
<발명의 요약>
상기 및 기타 목적을 추진함에 있어서, 본 발명은 예상외로 상기 기재된 난점을 극복하여 에포틸론 생합성에 관여하는 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 최초로 제공하게 되었다. 바람직한 실시양태에서, 이 뉴클레오티드 서열은 믹소박테리아에 속한 종 (가장 바람직하게는 소란지움 셀룰로숨)으로부터 단리된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열 2, 서열 2의 아미노산 11-437, 서열 2의 아미노산 543-864, 서열 2의 아미노산 974-1273, 서열 2의 아미노산 1314-1385, 서열 3, 서열 3의 아미노산 72-81, 서열 3의 아미노산 118-125, 서열 3의 아미노산 199-212, 서열 3의 아미노산 353-363, 서열 3의 아미노산 549-565, 서열 3의 아미노산 588-603, 서열 3의 아미노산 669-684, 서열 3의 아미노산 815-821, 서열 3의 아미노산 868-892, 서열 3의 아미노산 903-912, 서열 3의 아미노산 918-940, 서열 3의 아미노산 1268-1274, 서열 3의 아미노산 1285-1297, 서열 3의 아미노산 973-1256, 서열 3의 아미노산 1344-1351, 서열 4, 서열 4의 아미노산 7-432, 서열 4의 아미노산 539-859, 서열 4의 아미노산 869-1037, 서열 4의 아미노산 1439-1684, 서열 4의 아미노산 1722-1792, 서열 5, 서열 5의 아미노산 39-457, 서열 5의 아미노산 563-884, 서열 5의 아미노산 1147-1399, 서열 5의 아미노산 1434-1506, 서열 5의 아미노산 1524-1950, 서열 5의 아미노산 2056-2377, 서열 5의 아미노산 2645-2895, 서열 5의 아미노산 2932-3005, 서열 5의 아미노산 3024-3449, 서열 5의 아미노산 3555-3876, 서열 5의 아미노산 3886-4048, 서열 5의 아미노산 4433-4719, 서열 5의 아미노산 4729-4974, 서열 5의 아미노산 5010-5082, 서열 5의 아미노산 5103-5525, 서열 5의 아미노산 5631-5951, 서열 5의 아미노산 5964-6132, 서열 5의 아미노산 6542-6837, 서열 5의 아미노산 6857-7101, 서열 5의 아미노산 7140-7211, 서열 6, 서열 6의 아미노산 35-454, 서열 6의 아미노산 561-881, 서열 6의 아미노산 1143-1393, 서열 6의 아미노산 1430-1503, 서열 6의 아미노산 1522-1946, 서열 6의 아미노산 2053-2373, 서열 6의 아미노산 2383-2551, 서열 6의 아미노산 2671-3045, 서열 6의 아미노산 3392-3636, 서열 6의 아미노산 3673-3745, 서열 7, 서열 7의 아미노산 32-450, 서열 7의 아미노산 556-877, 서열 7의 아미노산 887-1051, 서열 7의 아미노산 1478-1790, 서열 7의 아미노산 1810-2055, 서열 7의 아미노산 2093-2164, 서열 7의 아미노산 2165-2439, 서열 8, 서열 10, 서열 11 및 서열 22로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는, 에포틸론의 생합성에 관여하는 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열 2, 서열 2의 아미노산 11-437, 서열 2의 아미노산 543-864, 서열 2의 아미노산 974-1273, 서열 2의 아미노산 1314-1385, 서열 3, 서열 3의 아미노산 72-81, 서열 3의 아미노산 118-125, 서열 3의 아미노산 199-212, 서열 3의 아미노산 353-363, 서열 3의 아미노산 549-565, 서열 3의 아미노산 588-603, 서열 3의 아미노산 669-684, 서열 3의 아미노산 815-821, 서열 3의 아미노산 868-892, 서열 3의 아미노산 903-912, 서열 3의 아미노산 918-940, 서열 3의 아미노산 1268-1274, 서열 3의 아미노산 1285-1297, 서열 3의 아미노산 973-1256, 서열 3의 아미노산 1344-1351, 서열 4, 서열 4의 아미노산 7-432, 서열 4의 아미노산 539-859, 서열 4의 아미노산 869-1037, 서열 4의 아미노산 1439-1684, 서열 4의 아미노산 1722-1792, 서열 5, 서열 5의 아미노산 39-457, 서열 5의 아미노산 563-884, 서열 5의 아미노산 1147-1399, 서열 5의 아미노산 1434-1506, 서열 5의 아미노산 1524-1950, 서열 5의 아미노산 2056-2377, 서열 5의 아미노산 2645-2895, 서열 5의 아미노산 2932-3005, 서열 5의 아미노산 3024-3449, 서열 5의 아미노산 3555-3876, 서열 5의 아미노산 3886-4048, 서열 5의 아미노산 4433-4719, 서열 5의 아미노산 4729-4974, 서열 5의 아미노산 5010-5082, 서열 5의 아미노산 5103-5525, 서열 5의 아미노산 5631-5951, 서열 5의 아미노산 5964-6132, 서열 5의 아미노산 6542-6837, 서열 5의 아미노산 6857-7101, 서열 5의 아미노산 7140-7211, 서열 6, 서열 6의 아미노산 35-454, 서열 6의 아미노산 561-881, 서열 6의 아미노산 1143-1393, 서열 6의 아미노산 1430-1503, 서열 6의 아미노산 1522-1946, 서열 6의 아미노산 2053-2373, 서열 6의 아미노산 2383-2551, 서열 6의 아미노산 2671-3045, 서열 6의 아미노산 3392-3636, 서열 6의 아미노산 3673-3745, 서열 7, 서열 7의 아미노산 32-450, 서열 7의 아미노산 556-877, 서열 7의 아미노산 887-1051, 서열 7의 아미노산 1478-1790, 서열 7의 아미노산 1810-2055, 서열 7의 아미노산 2093-2164, 서열 7의 아미노산 2165-2439, 서열 8, 서열 10, 서열 11 및 서열 22로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 에포틸론의 생합성에 관여하는 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 뉴클레오티드 1900-3171, 서열 1의 뉴클레오티드 3415-5556, 서열 1의 뉴클레오티드 7610-11875, 서열 1의 뉴클레오티드 7643-8920, 서열 1의 뉴클레오티드 9236-10201, 서열 1의 뉴클레오티드 10529-11428, 서열 1의 뉴클레오티드 11549-11764, 서열 1의 뉴클레오티드 11872-16104, 서열 1의 뉴클레오티드 12085-12114, 서열 1의 뉴클레오티드 12223-12246, 서열 1의 뉴클레오티드 12466-12507, 서열 1의 뉴클레오티드 12928-12960, 서열 1의 뉴클레오티드 13516-13566, 서열 1의 뉴클레오티드 13633-13680, 서열 1의 뉴클레오티드 13876-13923, 서열 1의 뉴클레오티드 14313-14334, 서열 1의 뉴클레오티드 14473-14547, 서열 1의 뉴클레오티드 14578-14607, 서열 1의 뉴클레오티드 14623-14692, 서열 1의 뉴클레오티드 15673-15693, 서열 1의 뉴클레오티드 15724-15762, 서열 1의 뉴클레오티드 14788-15639, 서열 1의 뉴클레오티드 15901-15924, 서열 1의 뉴클레오티드 16251-21749, 서열 1의 뉴클레오티드 16269-17546, 서열 1의 뉴클레오티드 17865-18827, 서열 1의 뉴클레오티드 18855-19361, 서열 1의 뉴클레오티드 20565-21302, 서열 1의 뉴클레오티드 21414-21626, 서열 1의 뉴클레오티드 21746-43519, 서열 1의 뉴클레오티드 21860-23116, 서열 1의 뉴클레오티드 23431-24397, 서열 1의 뉴클레오티드 25184-25942, 서열 1의 뉴클레오티드 26045-26263, 서열 1의 뉴클레오티드 26318-27595, 서열 1의 뉴클레오티드 27911-28876, 서열 1의 뉴클레오티드 29678-30429, 서열 1의 뉴클레오티드 30539-30759, 서열 1의 뉴클레오티드 30815-32092, 서열 1의 뉴클레오티드 32408-33373, 서열 1의 뉴클레오티드 33401-33889, 서열 1의 뉴클레오티드 35042-35902, 서열 1의 뉴클레오티드 35930-36667, 서열 1의 뉴클레오티드 36773-36991, 서열 1의 뉴클레오티드 37052-38320, 서열 1의 뉴클레오티드 38636-39598, 서열 1의 뉴클레오티드 39635-40141, 서열 1의 뉴클레오티드 41369-42256, 서열 1의 뉴클레오티드 42314-43048, 서열 1의 뉴클레오티드 43163-43378, 서열 1의 뉴클레오티드 43524-54920, 서열 1의 뉴클레오티드 43626-44885, 서열 1의 뉴클레오티드 45204-46166, 서열 1의 뉴클레오티드 46950-47702, 서열 1의 뉴클레오티드 47811-48032, 서열 1의 뉴클레오티드 48087-49361, 서열 1의 뉴클레오티드 49680-50642, 서열 1의 뉴클레오티드 50670-51176, 서열 1의 뉴클레오티드 51534-52657, 서열 1의 뉴클레오티드 53697-54431, 서열 1의 뉴클레오티드 54540-54758, 서열 1의 뉴클레오티드 54935-62254, 서열 1의 뉴클레오티드 55028-56284, 서열 1의 뉴클레오티드 56600-57565, 서열 1의 뉴클레오티드 57593-58087, 서열 1의 뉴클레오티드 59366-60304, 서열 1의 뉴클레오티드 60362-61099, 서열 1의 뉴클레오티드 61211-61426, 서열 1의 뉴클레오티드 61427-62254, 서열 1의 뉴클레오티드 62369-63628, 서열 1의 뉴클레오티드 67334-68251 및 서열 1의 뉴클레오티드 1-68750의 상보 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한, 에포틸론의 생합성에 관여하는 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 뉴클레오티드 1900-3171, 서열 1의 뉴클레오티드 3415-5556, 서열 1의 뉴클레오티드 7610-11875, 서열 1의 뉴클레오티드 7643-8920, 서열 1의 뉴클레오티드 9236-10201, 서열 1의 뉴클레오티드 10529-11428, 서열 1의 뉴클레오티드 11549-11764, 서열 1의 뉴클레오티드 11872-16104, 서열 1의 뉴클레오티드 12085-12114, 서열 1의 뉴클레오티드 12223-12246, 서열 1의 뉴클레오티드 12466-12507, 서열 1의 뉴클레오티드 12928-12960, 서열 1의 뉴클레오티드 13516-13566, 서열 1의 뉴클레오티드 13633-13680, 서열 1의 뉴클레오티드 13876-13923, 서열 1의 뉴클레오티드 14313-14334, 서열 1의 뉴클레오티드 14473-14547, 서열 1의 뉴클레오티드 14578-14607, 서열 1의 뉴클레오티드 14623-14692, 서열 1의 뉴클레오티드 15673-15693, 서열 1의 뉴클레오티드 15724-15762, 서열 1의 뉴클레오티드 14788-15639, 서열 1의 뉴클레오티드 15901-15924, 서열 1의 뉴클레오티드 16251-21749, 서열 1의 뉴클레오티드 16269-17546, 서열 1의 뉴클레오티드 17865-18827, 서열 1의 뉴클레오티드 18855-19361, 서열 1의 뉴클레오티드 20565-21302, 서열 1의 뉴클레오티드 21414-21626, 서열 1의 뉴클레오티드 21746-43519, 서열 1의 뉴클레오티드 21860-23116, 서열 1의 뉴클레오티드 23431-24397, 서열 1의 뉴클레오티드 25184-25942, 서열 1의 뉴클레오티드 26045-26263, 서열 1의 뉴클레오티드 26318-27595, 서열 1의 뉴클레오티드 27911-28876, 서열 1의 뉴클레오티드 29678-30429, 서열 1의 뉴클레오티드 30539-30759, 서열 1의 뉴클레오티드 30815-32092, 서열 1의 뉴클레오티드 32408-33373, 서열 1의 뉴클레오티드 33401-33889, 서열 1의 뉴클레오티드 35042-35902, 서열 1의 뉴클레오티드 35930-36667, 서열 1의 뉴클레오티드 36773-36991, 서열 1의 뉴클레오티드 37052-38320, 서열 1의 뉴클레오티드 38636-39598, 서열 1의 뉴클레오티드 39635-40141, 서열 1의 뉴클레오티드 41369-42256, 서열 1의 뉴클레오티드 42314-43048, 서열 1의 뉴클레오티드 43163-43378, 서열 1의 뉴클레오티드 43524-54920, 서열 1의 뉴클레오티드 43626-44885, 서열 1의 뉴클레오티드 45204-46166, 서열 1의 뉴클레오티드 46950-47702, 서열 1의 뉴클레오티드 47811-48032, 서열 1의 뉴클레오티드 48087-49361, 서열 1의 뉴클레오티드 49680-50642, 서열 1의 뉴클레오티드 50670-51176, 서열 1의 뉴클레오티드 51534-52657, 서열 1의 뉴클레오티드 53697-54431, 서열 1의 뉴클레오티드 54540-54758, 서열 1의 뉴클레오티드 54935-62254, 서열 1의 뉴클레오티드 55028-56284, 서열 1의 뉴클레오티드 56600-57565, 서열 1의 뉴클레오티드 57593-58087, 서열 1의 뉴클레오티드 59366-60304, 서열 1의 뉴클레오티드 60362-61099, 서열 1의 뉴클레오티드 61211-61426, 서열 1의 뉴클레오티드 61427-62254, 서열 1의 뉴클레오티드 62369-63628, 서열 1의 뉴클레오티드 67334-68251 및 서열 1의 뉴클레오티드 1-68750의 상보 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 에포틸론의 생합성에 관여하는 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 뉴클레오티드 1900-3171, 서열 1의 뉴클레오티드 3415-5556, 서열 1의 뉴클레오티드 7610-11875, 서열 1의 뉴클레오티드 7643-8920, 서열 1의 뉴클레오티드 9236-10201, 서열 1의 뉴클레오티드 10529-11428, 서열 1의 뉴클레오티드 11549-11764, 서열 1의 뉴클레오티드 11872-16104, 서열 1의 뉴클레오티드 12085-12114, 서열 1의 뉴클레오티드 12223-12246, 서열 1의 뉴클레오티드 12466-12507, 서열 1의 뉴클레오티드 12928-12960, 서열 1의 뉴클레오티드 13516-13566, 서열 1의 뉴클레오티드 13633-13680, 서열 1의 뉴클레오티드 13876-13923, 서열 1의 뉴클레오티드 14313-14334, 서열 1의 뉴클레오티드 14473-14547, 서열 1의 뉴클레오티드 14578-14607, 서열 1의 뉴클레오티드 14623-14692, 서열 1의 뉴클레오티드 15673-15693, 서열 1의 뉴클레오티드 15724-15762, 서열 1의 뉴클레오티드 14788-15639, 서열 1의 뉴클레오티드 15901-15924, 서열 1의 뉴클레오티드 16251-21749, 서열 1의 뉴클레오티드 16269-17546, 서열 1의 뉴클레오티드 17865-18827, 서열 1의 뉴클레오티드 18855-19361, 서열 1의 뉴클레오티드 20565-21302, 서열 1의 뉴클레오티드 21414-21626, 서열 1의 뉴클레오티드 21746-43519, 서열 1의 뉴클레오티드 21860-23116, 서열 1의 뉴클레오티드 23431-24397, 서열 1의 뉴클레오티드 25184-25942, 서열 1의 뉴클레오티드 26045-26263, 서열 1의 뉴클레오티드 26318-27595, 서열 1의 뉴클레오티드 27911-28876, 서열 1의 뉴클레오티드 29678-30429, 서열 1의 뉴클레오티드 30539-30759, 서열 1의 뉴클레오티드 30815-32092, 서열 1의 뉴클레오티드 32408-33373, 서열 1의 뉴클레오티드 33401-33889, 서열 1의 뉴클레오티드 35042-35902, 서열 1의 뉴클레오티드 35930-36667, 서열 1의 뉴클레오티드 36773-36991, 서열 1의 뉴클레오티드 37052-38320, 서열 1의 뉴클레오티드 38636-39598, 서열 1의 뉴클레오티드 39635-40141, 서열 1의 뉴클레오티드 41369-42256, 서열 1의 뉴클레오티드 42314-43048, 서열 1의 뉴클레오티드 43163-43378, 서열 1의 뉴클레오티드 43524-54920, 서열 1의 뉴클레오티드 43626-44885, 서열 1의 뉴클레오티드 45204-46166, 서열 1의 뉴클레오티드 46950-47702, 서열 1의 뉴클레오티드 47811-48032, 서열 1의 뉴클레오티드 48087-49361, 서열 1의 뉴클레오티드 49680-50642, 서열 1의 뉴클레오티드 50670-51176, 서열 1의 뉴클레오티드 51534-52657, 서열 1의 뉴클레오티드 53697-54431, 서열 1의 뉴클레오티드 54540-54758, 서열 1의 뉴클레오티드 54935-62254, 서열 1의 뉴클레오티드 55028-56284, 서열 1의 뉴클레오티드 56600-57565, 서열 1의 뉴클레오티드 57593-58087, 서열 1의 뉴클레오티드 59366-60304, 서열 1의 뉴클레오티드 60362-61099, 서열 1의 뉴클레오티드 61211-61426, 서열 1의 뉴클레오티드 61427-62254, 서열 1의 뉴클레오티드 62369-63628, 서열 1의 뉴클레오티드 67334-68251 및 서열 1의 뉴클레오티드 1-68750의 상보 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분 각각과 동일한 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분을 포함하는, 에포틸론의 생합성에 관여하는 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터 서열을 포함하는 키메라 유전자를 제공한다. 추가로, 본 발명은 이러한 키메라 유전자를 포함하는, 숙주 세포에 안정하게 형질전환될 수 있는 재조합 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 키메라 유전자를 포함하며, 에포틸론을 생합성시키는 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 발현할 수 있는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 이 재조합 숙주 세포는 악티노마이세탈레스 (Actinomycetales) 목에 속하는 박테리아이며, 더욱 바람직한 실시양태에서는 숙주 세포가 스트렙토마이세스 균주이다. 다른 실시양태에서, 재조합 숙주 세포는 슈도모나드 (pseudomonad) 또는 대장균 (E. coli)과 같이 발효 가능한 임의의 다른 박테리아이다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 Bac 클론, 바람직하게는 Bac 클론 pEPO15를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 에포틸론 합성효소 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
한 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 2의 아미노산 11-437, 서열 4의 아미노산 7-432, 서열 5의 아미노산 39-457, 서열 5의 아미노산 1524-1950, 서열 5의 아미노산 3024-3449, 서열 5의 아미노산 5103-5525, 서열 6의 아미노산 35-454, 서열 6의 아미노산 1522-1946 및 서열 7의 아미노산 32-450으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 β-케토아실-합성효소 (KS) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 KS 도메인은 서열 2의 아미노산 11-437, 서열 4의 아미노산 7-432, 서열 5의 아미노산 39-457, 서열 5의 아미노산 1524-1950, 서열 5의 아미노산 3024-3449, 서열 5의 아미노산 5103-5525, 서열 6의 아미노산 35-454, 서열 6의 아미노산 1522-1946 및 서열 7의 아미노산 32-450으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 7643-8920, 서열 1의 뉴클레오티드 16269-17546, 서열 1의 뉴클레오티드 21860-23116, 서열 1의 뉴클레오티드 26318-27595, 서열 1의 뉴클레오티드 30815-32092, 서열 1의 뉴클레오티드 37052-38320, 서열 1의 뉴클레오티드 43626-44885, 서열 1의 뉴클레오티드 48087-49361 및 서열 1의 뉴클레오티드 55028-56284로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한 것이 바람직하다. 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 7643-8920, 서열 1의 뉴클레오티드 16269-17546, 서열 1의 뉴클레오티드 21860-23116, 서열 1의 뉴클레오티드 26318-27595, 서열 1의 뉴클레오티드 30815-32092, 서열 1의 뉴클레오티드 37052-38320, 서열 1의 뉴클레오티드 43626-44885, 서열 1의 뉴클레오티드 48087-49361 및 서열 1의 뉴클레오티드 55028-56284로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분 각각과 동일한 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 게다가, 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 7643-8920, 서열 1의 뉴클레오티드 16269-17546, 서열 1의 뉴클레오티드 21860-23116, 서열 1의 뉴클레오티드 26318-27595, 서열 1의 뉴클레오티드 30815-32092, 서열 1의 뉴클레오티드 37052-38320, 서열 1의 뉴클레오티드 43626-44885, 서열 1의 뉴클레오티드 48087-49361 및 서열 1의 뉴클레오티드 55028-56284로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 가장 바람직하다.
다른 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 2의 아미노산 543-864, 서열 4의 아미노산 539-859, 서열 5의 아미노산 563-884, 서열 5의 아미노산 2056-2377, 서열 5의 아미노산 3555-3876, 서열 5의 아미노산 5631-5951, 서열 6의 아미노산 561-881, 서열 6의 아미노산 2053-2373 및 서열 7의 아미노산 556-877로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 아실전이효소 (AT) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 AT 도메인은 서열 2의 아미노산 543-864, 서열 4의 아미노산 539-859, 서열 5의 아미노산 563-884, 서열 5의 아미노산 2056-2377, 서열 5의 아미노산 3555-3876, 서열 5의 아미노산 5631-5951, 서열 6의 아미노산 561-881, 서열 6의 아미노산 2053-2373 및 서열 7의 아미노산 556-877로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 9236-10201, 서열 1의 뉴클레오티드 17865-18827, 서열 1의 뉴클레오티드 23431-24397, 서열 1의 뉴클레오티드 27911-28876, 서열 1의 뉴클레오티드 32408-33373, 서열 1의 뉴클레오티드 38636-39598, 서열 1의 뉴클레오티드 45204-46166, 서열 1의 뉴클레오티드 49680-50642 및 서열 1의 뉴클레오티드 56600-57565로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한 것이 바람직하다. 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 9236-10201, 서열 1의 뉴클레오티드 17865-18827, 서열 1의 뉴클레오티드 23431-24397, 서열 1의 뉴클레오티드 27911-28876, 서열 1의 뉴클레오티드 32408-33373, 서열 1의 뉴클레오티드 38636-39598, 서열 1의 뉴클레오티드 45204-46166, 서열 1의 뉴클레오티드 49680-50642 및 서열 1의 뉴클레오티드 56600-57565로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분 각각과 동일한 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 게다가, 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 9236-10201, 서열 1의 뉴클레오티드 17865-18827, 서열 1의 뉴클레오티드 23431-24397, 서열 1의 뉴클레오티드 27911-28876, 서열 1의 뉴클레오티드 32408-33373, 서열 1의 뉴클레오티드 38636-39598, 서열 1의 뉴클레오티드 45204-46166, 서열 1의 뉴클레오티드 49680-50642 및 서열 1의 뉴클레오티드 56600-57565로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 가장 바람직하다.
또다른 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 2의 아미노산 974-1273, 서열 5의 아미노산 4433-4719, 서열 5의 아미노산 6542-6837 및 서열 7의 아미노산 1478-1790으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 에노일 환원효소 (ER) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 ER 도메인은 서열 2의 아미노산 974-1273, 서열 5의 아미노산 4433-4719, 서열 5의 아미노산 6542-6837 및 서열 7의 아미노산 1478-1790으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 10529-11428, 서열 1의 뉴클레오티드 35042-35902, 서열 1의 뉴클레오티드 41369-42256 및 서열 1의 뉴클레오티드 59366-60304로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한 것이 바람직하다. 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 10529-11428, 서열 1의 뉴클레오티드 35042-35902, 서열 1의 뉴클레오티드 41369-42256 및 서열 1의 뉴클레오티드 59366-60304로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분 각각과 동일한 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 게다가, 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 10529-11428, 서열 1의 뉴클레오티드 35042-35902, 서열 1의 뉴클레오티드 41369-42256 및 서열 1의 뉴클레오티드 59366-60304로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 가장 바람직하다.
다른 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 2의 아미노산 1314-1385, 서열 4의 아미노산 1722-1792, 서열 5의 아미노산 1434-1506, 서열 5의 아미노산 2932-3005, 서열 5의 아미노산 5010-5082, 서열 5의 아미노산 7140-7211, 서열 6의 아미노산 1430-1503, 서열 6의 아미노산 3673-3745 및 서열 7의 아미노산 2093-2164로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 아실 캐리어 단백질 (ACP) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 ACP 도메인은 서열 2의 아미노산 1314-1385, 서열 4의 아미노산 1722-1792, 서열 5의 아미노산 1434-1506, 서열 5의 아미노산 2932-3005, 서열 5의 아미노산 5010-5082, 서열 5의 아미노산 7140-7211, 서열 6의 아미노산 1430-1503, 서열 6의 아미노산 3673-3745 및 서열 7의 아미노산 2093-2164로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 11549-11764, 서열 1의 뉴클레오티드 21414-21626, 서열 1의 뉴클레오티드 26045-26263, 서열 1의 뉴클레오티드 30539-30759, 서열 1의 뉴클레오티드 36773-36991, 서열 1의 뉴클레오티드 43163-43378, 서열 1의 뉴클레오티드 47811-48032, 서열 1의 뉴클레오티드 54540-54758 및 서열 1의 뉴클레오티드 61211-61426으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한 것이 바람직하다. 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 11549-11764, 서열 1의 뉴클레오티드 21414-21626, 서열 1의 뉴클레오티드 26045-26263, 서열 1의 뉴클레오티드 30539-30759, 서열 1의 뉴클레오티드 36773-36991, 서열 1의 뉴클레오티드 43163-43378, 서열 1의 뉴클레오티드 47811-48032, 서열 1의 뉴클레오티드 54540-54758 및 서열 1의 뉴클레오티드 61211-61426으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분 각각과 동일한 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 게다가, 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 11549-11764, 서열 1의 뉴클레오티드 21414-21626, 서열 1의 뉴클레오티드 26045-26263, 서열 1의 뉴클레오티드 30539-30759, 서열 1의 뉴클레오티드 36773-36991, 서열 1의 뉴클레오티드 43163-43378, 서열 1의 뉴클레오티드 47811-48032, 서열 1의 뉴클레오티드 54540-54758 및 서열 1의 뉴클레오티드 61211-61426으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 가장 바람직하다.
다른 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 4의 아미노산 869-1037, 서열 5의 아미노산 3886-4048, 서열 5의 아미노산 5964-6132, 서열 6의 아미노산 2383-2551 및 서열 7의 아미노산 887-1051로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 탈수효소 (DH) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 DH 도메인은 서열 4의 아미노산 869-1037, 서열 5의 아미노산 3886-4048, 서열 5의 아미노산 5964-6132, 서열 6의 아미노산 2383-2551 및 서열 7의 아미노산 887-1051로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 18855-19361, 서열 1의 뉴클레오티드 33401-33889, 서열 1의 뉴클레오티드 39635-40141, 서열 1의 뉴클레오티드 50670-51176 및 서열 1의 뉴클레오티드 57593-58087로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한 것이 바람직하다. 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 18855-19361, 서열 1의 뉴클레오티드 33401-33889, 서열 1의 뉴클레오티드 39635-40141, 서열 1의 뉴클레오티드 50670-51176 및 서열 1의 뉴클레오티드 57593-58087로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 18855-19361, 서열 1의 뉴클레오티드 33401-33889, 서열 1의 뉴클레오티드 39635-40141, 서열 1의 뉴클레오티드 50670-51176 및 서열 1의 뉴클레오티드 57593-58087로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분 각각과 동일한 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 게다가, 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 4의 아미노산 1439-1684, 서열 5의 아미노산 1147-1399, 서열 5의 아미노산 2645-2895, 서열 5의 아미노산 4729-4974, 서열 5의 아미노산 6857-7101, 서열 6의 아미노산 1143-1393, 서열 6의 아미노산 3392-3636 및 서열 7의 아미노산 1810-2055로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 가장 바람직하다.
또다른 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 4의 아미노산 1439-1684, 서열 5의 아미노산 1147-1399, 서열 5의 아미노산 2645-2895, 서열 5의 아미노산 4729-4974, 서열 5의 아미노산 6857-7101, 서열 6의 아미노산 1143-1393, 서열 6의 아미노산 3392-3636 및 서열 7의 아미노산 1810-2055로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 β-케토-환원효소 (KR) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 KR 도메인은 서열 4의 아미노산 1439-1684, 서열 5의 아미노산 1147-1399, 서열 5의 아미노산 2645-2895, 서열 5의 아미노산 4729-4974, 서열 5의 아미노산 6857-7101, 서열 6의 아미노산 1143-1393, 서열 6의 아미노산 3392-3636 및 서열 7의 아미노산 1810-2055로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 20565-21302, 서열 1의 뉴클레오티드 25184-25942, 서열 1의 뉴클레오티드 29678-30429, 서열 1의 뉴클레오티드 35930-36667, 서열 1의 뉴클레오티드 42314-43048, 서열 1의 뉴클레오티드 46950-47702, 서열 1의 뉴클레오티드 53697-54431 및 서열 1의 뉴클레오티드 60362-61099로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한 것이 바람직하다. 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 20565-21302, 서열 1의 뉴클레오티드 25184-25942, 서열 1의 뉴클레오티드 29678-30429, 서열 1의 뉴클레오티드 35930-36667, 서열 1의 뉴클레오티드 42314-43048, 서열 1의 뉴클레오티드 46950-47702, 서열 1의 뉴클레오티드 53697-54431 및 서열 1의 뉴클레오티드 60362-61099로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분 각각과 동일한 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 게다가, 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 20565-21302, 서열 1의 뉴클레오티드 25184-25942, 서열 1의 뉴클레오티드 29678-30429, 서열 1의 뉴클레오티드 35930-36667, 서열 1의 뉴클레오티드 42314-43048, 서열 1의 뉴클레오티드 46950-47702, 서열 1의 뉴클레오티드 53697-54431 및 서열 1의 뉴클레오티드 60362-61099로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 가장 바람직하다.
부가의 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 6의 아미노산 2671-3045와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 메틸전이효소 (MT) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 MT 도메인은 서열 6의 아미노산 2671-3045를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 51534-52657과 실질적으로 유사한 것이 바람직하다. 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 51534-52657의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분 각각과 동일한 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 게다가, 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 51534-52657인 것이 가장 바람직하다.
다른 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 7의 아미노산 2165-2439와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 티오에스테라제 (TE) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 MT 도메인은 서열 7의 아미노산 2165-2439를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 61427-62254와 실질적으로 유사한 것이 바람직하다. 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 61427-62254의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분 각각과 동일한 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 게다가, 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 61427-62254인 것이 가장 바람직하다.
또다른 측면에서, 본 발명은 서열 3, 서열 3의 아미노산 72-81, 서열 3의 아미노산 118-125, 서열 3의 아미노산 199-212, 서열 3의 아미노산 353-363, 서열 3의 아미노산 549-565, 서열 3의 아미노산 588-603, 서열 3의 아미노산 669-684, 서열 3의 아미노산 815-821, 서열 3의 아미노산 868-892, 서열 3의 아미노산 903-912, 서열 3의 아미노산 918-940, 서열 3의 아미노산 1268-1274, 서열 3의 아미노산 1285-1297, 서열 3의 아미노산 973-1256 및 서열 3의 아미노산 1344-1351로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 비-리보솜 펩티드 합성효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 이 실시양태에 따라, 상기 비-리보솜 펩티드 합성효소는 서열 3, 서열 3의 아미노산 72-81, 서열 3의 아미노산 118-125, 서열 3의 아미노산 199-212, 서열 3의 아미노산 353-363, 서열 3의 아미노산 549-565, 서열 3의 아미노산 588-603, 서열 3의 아미노산 669-684, 서열 3의 아미노산 815-821, 서열 3의 아미노산 868-892, 서열 3의 아미노산 903-912, 서열 3의 아미노산 918-940, 서열 3의 아미노산 1268-1274, 서열 3의 아미노산 1285-1297, 서열 3의 아미노산 973-1256 및 서열 3의 아미노산 1344-1351로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 11872-16104, 서열 1의 뉴클레오티드 12085-12114, 서열 1의 뉴클레오티드 12223-12246, 서열 1의 뉴클레오티드 12466-12507, 서열 1의 뉴클레오티드 12928-12960, 서열 1의 뉴클레오티드 13516-13566, 서열 1의 뉴클레오티드 13633-13680, 서열 1의 뉴클레오티드 13876-13923, 서열 1의 뉴클레오티드 14313-14334, 서열 1의 뉴클레오티드 14473-14547, 서열 1의 뉴클레오티드 14578-14607, 서열 1의 뉴클레오티드 14623-14692, 서열 1의 뉴클레오티드 15673-15693, 서열 1의 뉴클레오티드 15724-15762, 서열 1의 뉴클레오티드 14788-15639 및 서열 1의 뉴클레오티드 15901-15924로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한 것이 바람직하다. 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 11872-16104, 서열 1의 뉴클레오티드 12085-12114, 서열 1의 뉴클레오티드 12223-12246, 서열 1의 뉴클레오티드 12466-12507, 서열 1의 뉴클레오티드 12928-12960, 서열 1의 뉴클레오티드 13516-13566, 서열 1의 뉴클레오티드 13633-13680, 서열 1의 뉴클레오티드 13876-13923, 서열 1의 뉴클레오티드 14313-14334, 서열 1의 뉴클레오티드 14473-14547, 서열 1의 뉴클레오티드 14578-14607, 서열 1의 뉴클레오티드 14623-14692, 서열 1의 뉴클레오티드 15673-15693, 서열 1의 뉴클레오티드 15724-15762, 서열 1의 뉴클레오티드 14788-15639 및 서열 1의 뉴클레오티드 15901-15924로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분 각각과 동일한 서열의 연속적인 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 (바람직하게는 20) 염기쌍 부분을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 게다가, 이 실시양태에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 11872-16104, 서열 1의 뉴클레오티드 12085-12114, 서열 1의 뉴클레오티드 12223-12246, 서열 1의 뉴클레오티드 12466-12507, 서열 1의 뉴클레오티드 12928-12960, 서열 1의 뉴클레오티드 13516-13566, 서열 1의 뉴클레오티드 13633-13680, 서열 1의 뉴클레오티드 13876-13923, 서열 1의 뉴클레오티드 14313-14334, 서열 1의 뉴클레오티드 14473-14547, 서열 1의 뉴클레오티드 14578-14607, 서열 1의 뉴클레오티드 14623-14692, 서열 1의 뉴클레오티드 15673-15693, 서열 1의 뉴클레오티드 15724-15762, 서열 1의 뉴클레오티드 14788-15639 및 서열 1의 뉴클레오티드 15901-15924로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 가장 바람직하다.
추가로, 본 발명은 서열 2 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
다른 측면에 따라, 본 발명은 또한 정제 가능하고 암 치료제와 같은 제약 제형에 사용하기에 충분한 양으로 에포틸론과 같은 폴리케티드를 재조합 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 제조 방법의 특이한 이점은 제조된 분자에 키랄성이 있고, 유전자 이식 유기체에서의 제조로 인해 몇몇 거울 이성질체가 낮은 활성을 나타낼 수 있는 라세미 혼합물 군집의 생성을 피할 수 있다는 것이다. 특히, 본 발명은 (a) 에포틸론의 생합성에 관여하는 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터 서열을 포함하는 키메라 유전자를 숙주에 도입하는 단계, 및 (b) 숙주에서 에포틸론이 생합성되는 조건으로 숙주를 배양하는 단계를 포함하는, 재조합 숙주에서 에포틸론의 이종 발현 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 (a) 상기 방법에 의해 재조합 숙주에서 에포틸론을 발현시키는 단계, 및 (b) 재조합 숙주에서 에포틸론을 추출하는 단계를 포함하는 에포틸론의 제조 방법을 제공한다.
또다른 측면에 따라, 본 발명은 에포틸론 합성효소 도메인으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 2의 아미노산 11-437, 서열 4의 아미노산 7-432, 서열 5의 아미노산 39-457, 서열 5의 아미노산 1524-1950, 서열 5의 아미노산 3024-3449, 서열 5의 아미노산 5103-5525, 서열 6의 아미노산 35-454, 서열 6의 아미노산 1522-1946 및 서열 7의 아미노산 32-450으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 β-케토아실-합성효소 (KS) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 KS 도메인은 서열 2의 아미노산 11-437, 서열 4의 아미노산 7-432, 서열 5의 아미노산 39-457, 서열 5의 아미노산 1524-1950, 서열 5의 아미노산 3024-3449, 서열 5의 아미노산 5103-5525, 서열 6의 아미노산 35-454, 서열 6의 아미노산 1522-1946 및 서열 7의 아미노산 32-450으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
다른 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 2의 아미노산 543-864, 서열 4의 아미노산 539-859, 서열 5의 아미노산 563-884, 서열 5의 아미노산 2056-2377, 서열 5의 아미노산 3555-3876, 서열 5의 아미노산 5631-5951, 서열 6의 아미노산 561-881, 서열 6의 아미노산 2053-2373 및 서열 7의 아미노산 556-877로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 아실전이효소 (AT) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 AT 도메인은 서열 2의 아미노산 543-864, 서열 4의 아미노산 539-859, 서열 5의 아미노산 563-884, 서열 5의 아미노산 2056-2377, 서열 5의 아미노산 3555-3876, 서열 5의 아미노산 5631-5951, 서열 6의 아미노산 561-881, 서열 6의 아미노산 2053-2373 및 서열 7의 아미노산 556-877로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
또다른 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 2의 아미노산 974-1273, 서열 5의 아미노산 4433-4719, 서열 5의 아미노산 6542-6837 및 서열 7의 아미노산 1478-1790으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 에노일 환원효소 (ER) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 ER 도메인은 서열 2의 아미노산 974-1273, 서열 5의 아미노산 4433-4719, 서열 5의 아미노산 6542-6837 및 서열 7의 아미노산 1478-1790으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
다른 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 2의 아미노산 1314-1385, 서열 4의 아미노산 1722-1792, 서열 5의 아미노산 1434-1506, 서열 5의 아미노산 2932-3005, 서열 5의 아미노산 5010-5082, 서열 5의 아미노산 7140-7211, 서열 6의 아미노산 1430-1503, 서열 6의 아미노산 3673-3745 및 서열 7의 아미노산 2093-2164로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 아실 캐리어 단백질 (ACP) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 ACP 도메인은 서열 2의 아미노산 1314-1385, 서열 4의 아미노산 1722-1792, 서열 5의 아미노산 1434-1506, 서열 5의 아미노산 2932-3005, 서열 5의 아미노산 5010-5082, 서열 5의 아미노산 7140-7211, 서열 6의 아미노산 1430-1503, 서열 6의 아미노산 3673-3745 및 서열 7의 아미노산 2093-2164로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
다른 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 4의 아미노산 869-1037, 서열 5의 아미노산 3886-4048, 서열 5의 아미노산 5964-6132, 서열 6의 아미노산 2383-2551 및 서열 7의 아미노산 887-1051로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 탈수효소 (DH) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 DH 도메인은 서열 4의 아미노산 869-1037, 서열 5의 아미노산 3886-4048, 서열 5의 아미노산 5964-6132, 서열 6의 아미노산 2383-2551 및 서열 7의 아미노산 887-1051로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
또다른 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 4의 아미노산 1439-1684, 서열 5의 아미노산 1147-1399, 서열 5의 아미노산 2645-2895, 서열 5의 아미노산 4729-4974, 서열 5의 아미노산 6857-7101, 서열 6의 아미노산 1143-1393, 서열 6의 아미노산 3392-3636 및 서열 7의 아미노산 1810-2055로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 β-케토-환원효소 (KR) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 KR 도메인은 서열 4의 아미노산 1439-1684, 서열 5의 아미노산 1147-1399, 서열 5의 아미노산 2645-2895, 서열 5의 아미노산 4729-4974, 서열 5의 아미노산 6857-7101, 서열 6의 아미노산 1143-1393, 서열 6의 아미노산 3392-3636 및 서열 7의 아미노산 1810-2055로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
부가의 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 6의 아미노산 2671-3045와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 메틸전이효소 (MT) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 MT 도메인은 서열 6의 아미노산 2671-3045를 포함하는 것이 바람직하다.
다른 실시양태에 따라, 에포틸론 합성효소 도메인은 서열 7의 아미노산 2165-2439와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 티오에스테라제 (TE) 도메인이다. 이 실시양태에 따라, 상기 MT 도메인은 서열 7의 아미노산 2165-2439를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 측면 및 이점은 하기 본 발명의 기술에 대한 연구 및 무제한적 실시예에 의해 명백해질 것이다.
<정의>
본 발명을 기술함에 있어서 하기의 용어가 사용될 것이며, 이 용어들은 하기 기재된 바와 같이 정의될 것이다.
결합된 및 작동 가능하게 연결된: 2개의 DNA 서열이 물리적 및 기능적으로 관련되어 있음. 예를 들면, 프로모터 또는 조절 DNA 서열이 RNA 또는 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 작동적으로 연결되어 있는 상태, 즉 조절 DNA 서열이 코딩 DNA 또는 구조 DNA 서열의 발현 수준에 영향을 미치는 상황에 처해 있는 경우 프로모터 또는 조절 DNA 서열이 코딩 DNA에 "결합된" 상태라고 한다.
키메라 유전자: 프로모터 또는 조절 DNA 서열이 mRNA를 코딩하여 단백질로서 발현되는 DNA 서열과 작동적으로 연결되거나 결합되어, 상기 조절 DNA 서열이 결합된 DNA 서열의 전사 또는 발현을 조절할 수 있는 재조합 DNA 서열. 원래는 키메라 유전자의 조절 DNA 서열이 자연상태에 나타나는 바와 같이 결합된 DNA 서열에 작동적으로 연결되어 있지는 않다.
코딩 DNA 서열: 유기체에서 번역되어 단백질을 생성하는 DNA 서열.
도메인: 정해진 독특한 활성에 필수적인 폴리케티드 합성효소의 일부분. 예를 들면, 아실 캐리어 단백질 (ACP), β-케토합성효소 (KS), 아실전이효소 (AT), β-케토환원효소 (KR), 탈수효소 (DH), 에노일환원효소 (ER) 및 티오에스테라제 (TE) 도메인이 포함된다.
에포틸론: 원래 소란지움 셀룰로숨이라는 박테리아의 So ce90 균주에 의해 생성되는 16-원 거대고리화 폴리케티드를 의미하며, 이는 탁솔의 생물학적 효과를 모방한다. 본원에서, "에포틸론"이란 에포틸론 A 및 에포틸론 B 뿐만 아니라 WO 98-25929호에 기재된 바와 같은 이들의 유사체를 포함하는 폴리케티드 부류이다.
에포틸론 합성효소: 에포틸론을 생합성시키는 폴리케티드 합성효소.
유전자: 게놈 내에 위치하며, 상기 코딩 DNA 서열 이외에 코딩 서열 중 발현 (즉, 전사 및 번역)을 조절하는 기타 일차적인 DNA 서열을 포함하는 한정된 영역.
이종 DNA 서열: 자연 발생적인 DNA 서열이 다수의 카피로 존재하는 비-자연 발생적인 DNA 서열을 포함하는, 원래는 자신이 도입되는 숙주와 연관되어 있지 않은 DNA 서열.
동종 DNA 서열: 원래 자신이 도입되는 숙주와 연관되어 있는 DNA 서열.
동형 재조합: 동종 DNA 분자 사이에 DNA 단편의 상호 교체.
단리된: 본 발명에서, 단리된 핵산 분자 또는 단리된 효소는 사람의 손에 의해 자연적인 환경에서 분리되어 존재하는, 따라서 자연 상태의 생성물이 아닌 핵산 분자 또는 효소이다. 단리된 핵산 분자 또는 효소는 정제된 형태로 존재하거나, 재조합 숙주 세포와 같이 비-자연적인 환경에 존재할 수 있다.
모듈: 폴리케티드 생합성을 1회 수행, 즉 축합 1 단계 및 이와 연관된 모든 β-카르보닐 가공 단계를 수행하는데 필요한 개개의 활성체를 모두 코딩하는 유전자 요소. 각각의 모듈은 생합성의 축합 부분을 수행하기 위한 ACP, KS 및 AT 활성체, 및 β-카르보닐 가공에 영향을 미치는 선별된 축합-후 활성체를 코딩한다.
NRPS: 아미노산 아데닐화, 에피머화, N-메틸화, 고리화, 펩티딜 캐리어 단백질 및 축합 도메인을 포함하는, 아미노산을 이차대사 물질로 도입시키는 효소 활성의 복합체인, 리보솜 이외의 공간에서 폴리펩티드를 합성하는 효소. 관능성 NRPS는 아미노산의 이차대사 물질로의 도입을 촉매한다.
NRPS 유전자: 양립할 수 있는 1종 이상의 조절 요소의 조절하에 에포틸론 A 및 B와 같은 관능성 이차대사 물질의 생성을 위한 NRPS를 코딩하는 1종 이상의 유전자.
핵산 분자: 임의의 원천으로부터 단리될 수 있는 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA의 선형 단편. 본 발명에서는 핵산 분자가 DNA 단편인 것이 바람직하다.
ORF: 오픈 리딩 프레임 (Open Reading Frame).
PKS: 케토환원효소, 탈수효소, 아실 캐리어 단백질, 에놀환원효소, 케토아실 ACP 합성효소 및 아실전이효소와 같이 폴리케티드의 생합성에 관여하는 효소 활성체 (도메인)의 복합체인 폴리케티드 합성효소. 관능성 PKS는 폴리케티드의 합성을 촉매한다.
PKS 유전자: 양립할 수 있는 1종 이상의 조절 요소의 조절하에 에포틸론 A 및 B와 같은 관능성 폴리케티드의 생성에 필요한 다양한 폴리케티드를 코딩하는 1종 이상의 유전자.
실질적으로 유사한: 핵산의 경우, 비교 핵산 분자와의 서열 동일성이 60% 이상인 핵산 분자. 바람직한 실시양태에서, 실질적으로 유사한 DNA 서열은 비교 DNA 서열에 80% 이상의 서열 동일성이 있고, 더욱 바람직한 실시양태에서는 90% 이상의 서열 동일성이 있으며, 가장 바람직한 실시양태에서는 95% 이상의 서열 동일성이 있다. 실질적으로 유사한 DNA 서열은 비교 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질 또는 펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 것이 바람직하다. 통상, 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열은, 7% 황산 도데실 나트륨 (SDS), 0.5M NaPO4(pH 7.0) 및 1 mM EDTA 용액에서 50℃의 혼성화 조건, 및 2X SSC 및 1% SDS 용액에서 50℃의 세척 조건하에서 비교 핵산 분자 또는 그의 단편에 혼성화된다. 단백질 또는 펩티드의 경우, 실질적으로 유사한 아미노산 서열은 비교 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열에 90% 이상의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열이다.
형질전환: 이종 핵산 분자를 숙주 세포 또는 유기체에 도입하는 과정.
형질전환된 / 유전자 이식된 / 재조합: 이종 핵산 분자가 도입된, 박테리아와 같은 숙주 유기체를 칭함. 핵산 분자는 숙주의 게놈에 안정하게 도입되거나 염색체외 분자로서 존재할 수도 있다. 이와 같은 염색체외 분자는 스스로 복제할 수 있다. 형질전환된 세포, 조직 또는 식물은 형질전환 과정의 최종 산물 뿐만 아니라 그의 유전자 이식 자손을 포함하는 것으로 이해된다. "비-형질전환된", "비-유전자 이식된" 또는 "비-재조합" 숙주는 이종 핵산 분자를 함유하지 않는, 야생형 유기체 (즉, 박테리아)를 의미한다.
뉴클레오티드는 아데닌 (A), 시토신 (C), 티민 (T) 및 구아닌 (G)의 표준 약자에 의해 기본 염기를 표시한다. 이와 유사하게, 아미노산은 알라닌 (Ala, A), 아르기닌 (Arg, R), 아스파라긴 (Asn, N), 아스파르트산 (Asp, D), 시스테인 (Cys, C), 글루타민 (Gln, Q), 글루탐산 (Glu, E), 글리신 (Gly, G), 히스티딘 (His, H), 이소류신 (Ile, I), 류신 (Leu, L), 리신 (lys, K), 메티오닌 (Met, M), 페닐알라닌 (Phe, F), 프롤린 (Pro, P), 세린 (Ser, S), 트레오닌 (Thr, T), 트립토판 (Trp, W), 티로신 (Tyr, Y) 및 발린 (Val, V)을 의미한다. 추가로 (Xaa, X)는 임의의 아미노산을 의미한다.
<서열목록의 서열에 대한 설명>
서열 1은 에포틸론 생합성 유전자를 포함하는, 22개의 오픈 리딩 프레임이 있는 68750 bp 콘티그 (contig)의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 2 는 epoA (서열 1의 뉴클레오티드 7610-11875)에 의해 코딩되는 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소 (EPOS A)의 단백질 서열이다.
서열 3은 epoP (서열 1의 뉴클레오티드 11872-16104)에 의해 코딩되는 비-리보솜 펩티드 합성효소 (EPOS P)의 단백질 서열이다.
서열 4는 epoB (서열 1의 뉴클레오티드 16251-21749)에 의해 코딩되는 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소 (EPOS B)의 단백질 서열이다.
서열 5는 epoC (서열 1의 뉴클레오티드 21746-43519)에 의해 코딩되는 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소 (EPOS C)의 단백질 서열이다.
서열 6은 epoD (서열 1의 뉴클레오티드 43524-54920)에 의해 코딩되는 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소 (EPOS D)의 단백질 서열이다.
서열 7은 epoE (서열 1의 뉴클레오티드 54935-62254)에 의해 코딩되는 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소 (EPOS E)의 단백질 서열이다.
서열 8은 epoF (서열 1의 뉴클레오티드 62369-63628)에 의해 코딩되는 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소 (EPOS F)의 단백질 서열이다..
서열 9는 orf1 (서열 1의 뉴클레오티드 1-1826)에 의해 코딩되는 부분적인 단백질 서열 (부분 Orf 1)이다.
서열 10은 orf2 (서열 1의 역방향 상보 가닥 뉴클레오티드 3171-1900)에 의해 코딩되는 단백질 서열 (Orf 2)이다.
서열 11은 orf3 (서열 1의 뉴클레오티드 3415-5556)에 의해 코딩되는 단백질 서열 (Orf 3)이다.
서열 12는 orf4 (서열 1의 역방향 상보 가닥 뉴클레오티드 5992-5612)에 의해 코딩되는 단백질 서열 (Orf 4)이다.
서열 13은 orf5 (서열 1의 뉴클레오티드 6226-6675)에 의해 코딩되는 단백질 서열 (Orf 5)이다.
서열 14는 orf6 (서열 1의 뉴클레오티드 63779-64333)에 의해 코딩되는 단백질 서열 (Orf 6)이다.
서열 15는 orf7 (서열 1의 역방향 상보 가닥 뉴클레오티드 64290-63853)에 의해 코딩되는 단백질 서열 (Orf 7)이다.
서열 16은 orf8 (서열 1의 뉴클레오티드 64363-64920)에 의해 코딩되는 단백질 서열 (Orf 8)이다.
서열 17은 orf9 (서열 1의 역방향 상보 가닥 뉴클레오티드 64727-64287)에 의해 코딩되는 단백질 서열 (Orf 9)이다.
서열 18은 orf10 (서열 1의 뉴클레오티드 65063-65767)에 의해 코딩되는 단백질 서열 (Orf 10)이다.
서열 19는 orf11 (서열 1의 역방향 상보 가닥 뉴클레오티드 65874-65008)에 의해 코딩되는 단백질 서열 (Orf 11)이다.
서열 20은 orf12 (서열 1의 역방향 상보 가닥 뉴클레오티드 66338-65871)에 의해 코딩되는 단백질 서열 (Orf 12)이다.
서열 21은 orf13 (서열 1의 뉴클레오티드 66667-67137)에 의해 코딩되는 단백질 서열 (Orf 13)이다.
서열 22는 orf14 (서열 1의 뉴클레오티드 67334-68251)에 의해 코딩되는 단백질 서열 (Orf 14)이다.
서열 23은 orf15 (서열 1의 뉴클레오티드 68346-68750)에 의해 코딩되는 부분적인 단백질 서열 (부분 Orf 15)이다.
서열 24는 유니버설 (universal) 역방향 PCR 프라이머 서열이다.
서열 25는 유니버설 순방향 PCR 프라이머 서열이다.
서열 26은 NH24 말단 "B" PCR 프라이머 서열이다.
서열 27은 NH2 말단 "A" PCR 프라이머 서열이다.
서열 28은 NH2 말단 "B" PCR 프라이머 서열이다.
서열 29는 pEPO15-NH6 말단 "B" PCR 프라이머 서열이다.
서열 30은 pEPO15-H2.7 말단 "A" PCR 프라이머 서열이다.
하기의 재료가 특허 절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 미국 61604 일리노이주 페오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 위치한 애그리컬처럴 리서치 서비스 패턴트 컬쳐 콜렉션 (NRRL)에 기탁되었다. 특허 허여시 기탁된 재료의 이용에 대한 모든 제한은 제거될 것이다.
기탁된 재료 허가 번호 기탁일
pEPO15pEPO32 NRRL B-30033NRRL B-30119 1998년 6월 11일1999년 4월 16일
<발명의 상세한 설명>
에포틸론의 생합성에 관여하는 유전자는 본 발명에 따른 기술을 사용하여 단리할 수 있다. 에포틸론 생합성 유전자의 바람직한 단리 방법은 에포틸론 A 및 B를 생성하는 것으로 확인된 유기체로부터 게놈 DNA를 단리하는 단계, 적합한 플라스미드 또는 벡터상의 상기 단리된 DNA를 정상적으로는 폴리케티드를 생성하지 않는 숙주 유기체에 전달하는 단계, 및 에포틸론 생성 능력이 부여된 형질전환 숙주 콜로니를 확인하는 단계를 필요로 한다. λ::Tn5 트랜스포손 (transposon) 돌연변이화 (de Bruijn & Lupski, Gene 27:131-149 (1984))와 같은 기술을 이용하여, 형질전환시킬 에포틸론-제공 DNA의 정확한 영역을 명확하게 결정할 수 있다. 다른 방법으로 또는 추가로, 형질전환시킬 에포틸론-제공 DNA는 더 작은 단편 및 추가로 특성화될 에포틸론-제공 능력을 유지하는 가장 작은 단편으로 분해될 수 있다. 에포틸론 생성 능력이 없는 숙주 유기체는 폴리케티드가 유래되는 유기체와 상이한 종일 수 있는 반면, 이 기술의 변형은 돌연변이화에 의해 에포틸론 생성 능력이 방해된 숙주에 동일한 숙주의 DNA를 형질전환하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에서, 에포틸론 생성 유기체를 돌연변이화하고 에포틸론을 생성하지 않는 돌연변이체를 단리한다. 이 돌연변이체는 에포틸론을 생성하는 부모세대 균주로부터 단리된 게놈 DNA에 의해 보상된다.
에포틸론 생합성에 필요한 유전자를 단리하는데 사용될 수 있는 기술에 대한 추가의 실시예는 트랜스포손 돌연변이화를 이용하여, 돌연변이화 후에 폴리케티드를 생성하지 못하는 에포틸론 생성 유기체의 돌연변이체를 만드는 것이다. 따라서, 숙주 게놈에서 에포틸론을 생성하는 영역은 트랜스포손에 의해 표지되고, 이를 회수하여 부모세대 균주로부터 천연 유전자를 단리하는데 프로브로 사용할 수 있다. 폴리케티드 합성에 필요하고 공지된 PKS 유전자와 유사한 PKS 유전자는 리파마이신 또는 소라펜의 생합성 유전자와 같이 서열이 알려진 생합성 유전자와의 서열 상동성에 의해 단리될 수 있다. 상동성에 의한 단리에 적합한 기술에는 DNA 혼성화에 의한 표준 라이브러리 스크리닝이 포함된다.
유전자로부터 수득가능한 DNA 단편 또는 공지된 폴리케티드의 합성에 기능하는 기타 DNA 서열이 프로브 분자로 사용하기에 바람직하다. 바람직한 프로브 분자는 소라펜 PKS (미국 특허 제5,716,849호) 네 번째 모듈의 케토 합성효소 도메인을 코딩하는 1.2 kb의 SmaⅠ 단편을 포함하며, 더욱 바람직한 프로브 분자는 리파마이신 PKS (Schupp et al., FEMS Microbiology Letters 159:201-207 (1998))의 첫 번째 및 두 번째 모듈의 β-케토아실 합성효소 도메인을 포함한다. 이들은 에포틸론 생합성에 관여하는 유전자를 단리하기 위해 에포틸론 생성 유기체의 유전자 라이브러리를 스크린하는 프로브로 사용될 수 있다.
PKS 유전자를 단리하는데 통상적으로 잘 알려진 난점 및, 특히 에포틸론 생합성 유전자의 단리시 직면할 것으로 예상되는 난점에도 불구하고, 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여, 놀랍게도 에포틸론 A 및 B가 폴리케티드를 생성하는 유기체로부터 클로닝하였다. 본 명세서에 기재된 유전자 조작 및 재조합 생성 방법을 이용하여 클로닝된 PKS 유전자는 유전자 이식 숙주 유기체에서 변형 및 발현될 수 있다.
단리된 에포틸론 생합성 유전자는 이종 숙주에서 발현되어 천연 숙주에서 생성되는 것보다 훨씬 더 효율적으로 폴리케티드를 생성할 수 있었다. 이러한 유전자 조작 기술은 입수가능한 상이한 숙주에 특이적이며, 이는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 이종 유전자는 본원에 참고문헌으로 포함되는 문헌 [McDaniel et al., Science 262:1546-1550 (1993)] 및 [Kao et al., Science 265:509-512 (1994)]에 기재된 바와 같은 기술을 이용하여 스트렙토마이세스 및 기타 악티노마이세테스 (Actinomycetes)에서 발현될 수 있다. 또한, 본원에 참고문헌으로 포함되는 문헌 [Rowe et al., Gene 216:215-223 (1998)], [Holmes et al., EMBO Jorunal 12(8):3183-3191 (1993)] 및 [Bibb et al., Gene 38:215-226 (1985)]을 참조할 수 있다.
다른 방법으로, 폴리케티드 생합성에 관여하는 유전자 (즉, 에포틸론 생합성 유전자)는 또한 슈도모나드 및 대장균과 같은 다른 숙주 유기체에서 발현될 수 있다. 이러한 유전자 조작 기술은 입수가능한 상이한 숙주에 특이적이며, 이는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, PKS 유전자는 T7 프로모터를 이용하는 pT7-7 벡터를 사용하여 대장균에서 성공적으로 발현되었다. 이는 본원에 참고문헌으로 포함되는 문헌 [Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1074-1078 (1985)]을 참조할 수 있다. 또한, 발현 벡터인 pKK223-3 및 pKK223-2은 tac 또는 trc 프로모터의 조절하에 전사 또는 번역 융합으로 대장균에서 이종 유전자의 발현에 사용될 수 있다. 다중 ORF를 코딩하는 오페론을 발현시킴에 있어서, 가장 간단한 방법은 이 오페론을 전사 융합으로 pKK223-3과 같은 벡터에 삽입하여 사용될 이종 유전자의 리보솜 결합 부위를 인지하게하는 것이다. 바실러스와 같은 그람 양성 종에서의 과다 발현 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명에서 사용될 수 있다 (Quax et al., Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al., American Society for Microbiology, Washington (1993)).
본 발명의 에포틸론 생합성 유전자의 발현에 사용될 수 있는 기타 발현 시스템에는 효모 및 베큘로바이러스 발현 시스템이 포함된다. 예를 들면, 문헌 ["The Expression of Recombinant Proteins in Yeasts," Sudbery, P.E., Curr. Opin. Biotechnol. 7(5):517-524 (1996)], ["Methods for Expressing Recombinant Proteins in Yeast," Mackay, et al., Editor(s): Carey, Paul R., Protein Eng. Des. 105-153, Publisher: Academic, San Diego, Calif (1996)], ["Expression of heterologous gene products in yeast," Pichuantes, et al., Editor(s): Cleland, J. L., Craik, C. S., Protein Eng. 129-161, Publisher: Wiley-Liss, New York, N. Y (1996)], WO 98/27203, [Kealey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 505-509 (1998)], ["Insect Cell Culture: Recent Advances, Bioengineering Challenges And Implications In Protein Production," Palomares, et al., Editor(s): Galindo, Enrique; Ramirez, Octavio T., Adv. Bioprocess Eng. Vol. II, Invited Pap. Int. Symp., 2nd (1998) 25-52, Publisher: Kluwer, Dordrecht, Neth], ["Baculovirus Expression Vectors," Jarvis, Donald L., Editor(s): Miller, Lois K., Baculoviruses 389-431, Publisher: Plenum, New York, N. Y. (1997)], ["Production Of Heterologous Proteins Using The Baculovirus/Insect Expression System," Grittiths, et al., Me-thods Mol. Biol. (Totowa, N. J.) 75 (Basic Cell Culture Protocols (2nd Edition)) 427-440 (1997)] 및 ["Insect Cell Expression Technology," Luckow, Verne A., Protein Eng. 183-218, Publisher: Wiley-Liss, New York, N. Y. (1996)]을 참조할 수 있으며, 상기 문헌들은 모두 본원에 참고문헌으로 포함된다.
이종 숙주에서 PKS 유전자를 발현시 고려해야 할 다른 점은, PKS 효소가 폴리케티드를 합성하기 전에 포스포판테닐화에 의해 번역-후 변형된다는 것이다. 그러나, Ⅰ형 PKS 효소를 이와 같이 변형시키는 효소인 포스포판테닐 (P-판트) 전이효소가 정상 상태에서는 대장균과 같은 대부분의 숙주에 존재하지 않는다. 이 문제점은 본원에 참고문헌으로 포함되는 [Kealey et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 505-509 (1998)]에 기재된 바와 같이, 이종 숙주에서 PKS 유전자와 함께 P-판트 전이효소를 동시에 발현시켜 해결할 수 있다.
따라서, 폴리케티드의 생성을 위한 숙주 유기체는 조작의 용이성, 생장 (즉, 발효)의 신속성, 번역후 과정 및 이를 수행할 수 있는 분자적 장치의 존재, 및 과다 생성된 폴리케티드에 대한 감수성 결여 등을 기준으로 선택한다. 가장 바람직한 숙주 유기체는 스트렙토마이세스의 균주와 같은 악티노마아세테스이다. 다른 바람직한 숙주 유기체는 슈도모나드 및 대장균이다. 상기 기재된 폴리케티드 생성 방법은 이러한 화합물의 제조에 있어서 현행 사용되는 기술보다 월등한 이점을 갖는다. 이러한 이점에는 제조 비용의 저렴함, 보다 많은 양의 화합물 제조 능력 및 바람직한 생물학적 거울 이성질체 화합물의 제조 능력이 포함되며, 이는 유기 합성에 의해 필연적으로 생성되는 라세미 혼합물과는 상반된다. 이종 숙주에 의해 생성되는 화합물은 농학 뿐만 아니라 의약 (예를 들면, 에포틸론의 경우 암 치료)에도 사용할 수 있다.
본 발명은 하기의 상세한 실시예를 참조로 추가로 설명될 것이다. 이들 실시예는 단지 예시하기 위한 목적으로 제공되며, 구체화된 범위로 제한하려는 의도는 아니다. 본원에 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 문헌 [Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994)], [T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] 및 [T.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)]에 기재되어 있다.
<실시예 1> 에포틸론을 생성하는 소란지움 셀룰로숨 균주의 배양
소란지움 셀룰로숨 균주 90 (DSM 6773, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig)을 스트릭 (streak)으로 접종하고, pH가 약 7.4인 SolE 배지 (0.35% 포도당, 0.05% 트립톤, 0.15% MgSO4x7H2O, 0.05% 암모늄 술페이트, 0.1% CaCl2, 0.006% K2HPO4, 0.01% 나트륨 디티오나이트, 0.0008% Fe-EDTA, 1.2% HEPES, 멸균된 에스. 셀룰로숨 배양물 3.5% [vol/vol])의 아가 플레이트 상에서 배양 (30℃)하였다. 약 1 cm2의 세포를 취하여 5 ㎖의 G51t 배지 (0.2% 포도당, 0.5% 전분, 0.2% 트립톤, 0.1% 프로비온 S, 0.05% CaCl2x2H20, 0.05% MgSO4x7H20, 1.2% HEPES, pH 약 7.4)에 접종한 후, 30℃에서 225 rpm으로 진탕 배양하였다. 4일 후에 배양물을 50 ㎖의 G51t 배지에 옮기고, 상기와 같이 5일 동안 배양하였다. 이 배양물을 500 ㎖의 G51t 배지에 접종하는데 사용하고, 상기와 같이 6일 동안 배양하였다. 배양물을 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 세포 펠릿을 50 ㎖의 G51t에 재현탁하였다.
<실시예 2> 박테리아 인공 염색체 (Bac) 라이브러리의 생성
Bac 라이브러리를 생성하기 위해, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 배양된 에스. 셀룰로숨 세포를 아가로오스 블록에 심어 용해하고, 유리된 게놈 DNA를 제한효소 HindⅢ로 부분적으로 절단하였다. 펄스-필드 (pulsed-field) 전기영동에 의해 절단된 DNA를 아가로오스 겔 상에서 분리하였다. 큰 (약 90-150 kb) DNA 단편을 아가로오스 겔로부터 단리하여 pBelobacⅡ 벡터에 라이게이션하였다. pBelobacⅡ 벡터는 클로람페니콜 (Chlroamphenicol)에 대한 내성 단백질을 코딩하는 유전자, 적합한 배지에서 색깔 (푸른색/흰색) 선별 기능을 제공하는 lacZ 유전자 내의 다중 클로닝 부위 뿐만 아니라, 복제 및 세포당 1 또는 2 카피의 플라스미드를 유지하기 위해 필요한 유전자를 함유하고 있다. 표준 일렉트로포레이션 (electroporation) 기술을 이용하여, 이 라이게이션 혼합물을 대장균 DH10B에 형질전환하였다. 클로람페니콜에 내성이 있는 재조합 (흰색, lacZ 돌연변이체) 콜로니를 양성 하전된 나일론 막 필터에 384 3×3 그리드 형태로 옮겼다. 이 클론들을 용해하고, DNA를 필터에 가교시켰다. 또한, 동일한 클론들을 -80℃에 액체 배양물로서 보관하였다.
<실시예 3> Ⅰ형 폴리케티드 합성-관련 서열의 존재에 대한 소란지움 셀룰로숨 90의 Bac 라이브러리 스크리닝
표준 써던 (Southern) 혼성화 방법에 의해 Bac 라이브러리 필터를 탐침하였다. 사용된 DNA 프로브는 리파마이신 폴리케티드 합성효소의 첫 번째 및 두 번째 모듈에 있는 β-케토아실 합성효소 도메인을 코딩한다 (Schupp et al., FEMS Microbiology Letters 159: 201-207 (1998)). 프로브 DNA는 pNE95 (pNE95Schupp et al. (1998)에 기재된 코스미드 (cosmid) 2와 동일)를 주형으로 사용하고, 각 케토합성효소 도메인을 플랭킹 (flanking)하는 프라이머를 사용한 PCR에 의해 생성되었다. PCR에 의해 증폭된 DNA 25 ng을 단리하고, 제조자의 지시에 따라 무작위 프라이머 표지 키트 (random primer labeling kit, Gibco-BRL, Bethesda MD, USA)를 사용하여 32P-dCTP로 표지하였다. 혼성화는 65℃에서 36시간 동안 수행하고, 고도의 엄격 조건 (65℃에서 0.1x SSC 및 0.5% SDS로 20분씩 3회)에서 세척하였다. 표지된 블롯 (blot)을 인광 스크린에 노출시키고, 포스포이미저 (PhosphoImager) 445SI (Molecular Dynamics 사의 스크린 및 445SI) 상에서 신호를 검출하였다. 그 결과 특정 Bac 클론에 프로브가 강하게 혼성화되었다. 이 클론을 선별하여 37℃의 루리아 브로쓰 (LB) 5 ㎖에서 밤새 배양하였다. 관심있는 Bac 클론의 Bac DNA를 통상의 미니프렙 (miniprep) 절차에 의해 단리하였다. 세포를 200 ㎕의 용해효소액 (50 mM 포도당, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl, 5 mg/ml 용해효소)에 재현탁하고, 400 ㎕의 용해액 (0.2 N NaOH 및 2% SDS)에 용해시킨 후, 단백질을 침전 (3.0 M 칼륨 아세테이트, 아세트산으로 pH 5.2로 조절)시키고, 이소프로판올로 Bac DNA를 침전시켰다. DNA를 핵산분해효소가 없는 증류수 20 ㎕에 재현탁하고, BamHⅠ (New England Biolabs, Inc.)으로 절단한 후, 0.7% 아가로오스 겔에서 분리하였다. 이 겔을 상기 기재된 바와 같이 써던 혼성화에 의해 블롯팅하고, 상기 기재된 조건하에서 소라펜 폴리케티드 합성효소의 네 번째 모듈에 있는 케토합성효소를 코딩하는 1.2 kb의 SmaⅠ DNA 단편을 프로브로 사용하여 탐침하였다 (미국 특허 제5,716,849호 참조). 다섯 가지 상이한 혼성화 패턴이 관찰되었다. 이 다섯 가지 패턴을 대표하는 각각의 클론을 pEPO15, pEPO20, pEPO30, pEPO31 및 pEPO33이라 명명하였다.
<실시예 4> pEPO15, pEPO20, pEPO30, pEPO31 및 pEPO33의 BamHⅠ 단편의 서브클로닝 (subcloning)
선별된 다섯 가지 클론의 DNA를 BamHⅠ으로 절단하고, 무작위의 단편을 pBluescriptⅡ SK+ (Stratagene)의 BamHⅠ 부위에 서브클로닝하였다. 2 내지 10 kb의 삽입체를 포함하는 서브클론을 선별하여 삽입체의 플랭킹 말단을 서열분석하고, 1.2 kb의 SmaⅠ 프로브로 상기 기재된 바와 같이 탐침하였다. 공지된 폴리케티드 합성효소에 서열 상동성이 높고(거나) 소라펜 케토합성효소 도메인에 강하게 혼성화되는 서브클론을 유전자 교체 (gene disruption) 실험에 사용하였다.
<실시예 5> 소란지움 셀룰로숨 균주 So ce90의 스트렙토마이신 (streptomycin)-내성 자발 돌연변이체 제조
G52-H 액체 배지 (0.2% 효모 추출물, 0.2% 탈지 소야 밀 (soya meal), 0.8% 감자 전분, 0.2% 포도당, 0.1% MgSO4x7H2O, 0.1% CaCl2x2H2O, 0.008% Fe-EDTA, KOH로 pH를 약 7.4로 조절)에서 3일 동안 배양된 소란지움 셀룰로숨 균주 So ce90 0.1 ㎖을 스트렙토마이신 100 ㎍/ml이 함유된 SolE 아가 플레이트 배지에 평판배양하였다. 이 플레이트를 30℃에서 2주 동안 배양하였다. 이 배지에서 생장하는 콜로니가 스트렙토마이신-내성 돌연변이체이며, 이 콜로니를 분리하기 위해 스트렙토마이신이 포함된 동일한 아가 배지에 스트릭하여 다시 한번 배양하였다. 이 스트렙토마이신-내성 돌연변이체 중 하나를 선별하여 BCE28/2라 명명하였다.
<실시예 6> 서브클로닝된 BamHⅠ 단편을 이용한 소란지움 셀룰로숨 BCE28/2에서의 유전자 교체
상기 기재된 다섯 가지 선별된 Bac 클론으로부터 생성된 서브클론의 BamHⅠ 삽입체를 단리하여 pCIB132 (미국 특허 제5,716,849호 참조) 플라스미드의 단일 BamHⅠ 부위에 라이게이션하였다. 삽입체를 포함하는 pCIB132 유도체를, 헬퍼 (helper) 플라스미드인 pUZ8이 포함된 대장균 ED8767에 형질전환하였다. 형질전환체를 공여자로 사용하고 소란지움 셀룰로숨 BCE28/2를 수용자로하여 접합 실험을 수행하였다. 접합을 위해, 액체 G51b 배지 (트립톤이 펩톤으로 대체된 것 외에는 G51t와 동일)에서 30℃로 배양된 정지기 초기 (약 5×108 세포/ml)의 소란지움 셀룰로숨 BCE28/2 세포 5×108 내지 10×108을, 서브클로닝된 BamHⅠ 단편이 있는 pCIB132 유도체 및 헬퍼 플라스미드 pUZ8이 포함된 후기-로그기의 대장균 ED8767 배양물 (LB 액체 배지)과 1:1로 혼합하였다. 이어서, 혼합된 세포를 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 0.5 ㎖의 G51b 배지에 재현탁하였다. 이 세포 현탁액을 50 mg/ℓ의 카나마이신 (kanamycin)이 함유된 SolE 아가 플레이트의 중앙에 한 방울 떨어뜨려 접종하였다. 30℃에서 24시간 동안 배양된 후 수득된 세포를 수획하여 0.8 ㎖의 G51b 배지에 재현탁하고, 이 현탁액 0.1 내지 0.3 ㎖을 플레오마이신 (phleomycin, 30 mg/ℓ), 스트렙토마이신 (300 ㎖/ℓ) 및 카나마이신 (50 mg/ℓ)이 함유된 SolE 고체 선별 배지에 평판배양하였다. 스트렙토마이신으로 인해 공여자인 대장균 균주에 상응하는 선별도 일어났다. 30℃에서 8 내지 12일 동안 배양된 후에 이 선별 배지에서 생장하는 콜로니를 플라스틱 루프로 단리하여 스트릭한 후, 2차 선별 및 콜로니 분리를 위해 동일한 아가 배지에서 배양하였다. 30℃에서 7일 후에 이 선별 배지에서 생장한 콜로니로부터 배양된 배양물은, 서브클로닝된 BamHⅠ 단편이 포함된 pCIB132 유도체가 접합에 의해 전달되어 플레오마이신 내성이 획득된 소란지움 셀룰로숨 BCE28/2의 트랜스 접합체 (transconjugant)이다.
동형 재조합에 의해 소란지움 셀룰로숨의 염색체로 pCIB132 유래의 플라스미드가 도입되는 현상은 써던 혼성화에 의해 확인하였다. 이 실험에서, 문헌 [Pospiech and Neumann, Trends Genet. 11: 217 (1995)]에 기재된 방법을 사용하여, 전달된 BamHⅠ 단편 당 5 내지 10의 트랜스 접합체로부터 완전한 DNA를 단리 (G52-H 배지에서 3일 동안 배양된 배양물 10 ㎖로부터)하였다. 써던 블롯을 위해, 상기 기재된 바와 같이 단리된 DNA를 제한효소 BglⅡ, ClaI 또는 NotI으로 절단하고, 각각의 BamHI 삽입체 또는 pCIB132를 32P 표지 프로브로 사용하였다.
<실시예 7> 유전자 교체 후 소란지움 셀룰로숨에 의한 에포틸론 생성에 대한 도입된 BamHⅠ 단편의 효과 분석
2차 선별용 So1E 플레이트 (실시예 6 참조)에서 표면이 약 1 cm2로 생장한 트랜스 접합체 세포를 멸균된 플라스틱 루프를 사용하여 50 ㎖의 엘렌마이어 (Erlenmeyer) 플라스크 중 G52-H 배지 10 ㎖에 옮겼다. 30℃에서 180 rpm으로 3일 동안 배양한 후에, 배양물을 200 ㎖의 엘렌마이어 플라스크 중 G52-H 배지 50 ㎖에 옮겼다. 30℃에서 180 rpm으로 4 내지 5일 동안 배양한 후에, 이 배양물 10 ㎖을 200 ㎖의 엘렌마이어 플라스크 중 23B3 배지 (0.2% 포도당, 2% 감자 전분, 1.6% 탈지 소야 밀, 0.0008% Fe-EDTA 나트륨염, 0.5% HEPES (4-(2-히드록시에틸)-피페라진 -1-에탄-술폰산), 2% vol/vol 폴리스테롤 수지 XAD16 (Rohm & Haas), NaOH로 pH를 7.8로 조절) 50 ㎖에 옮겼다.
배양물을 30℃에서 180 rpm으로 7일 동안 인큐베이션한 후 생성된 에포틸론을 정량하였다. 완전 배양 브로쓰 (broth)는 150 ㎛의 나일론 필터를 통한 흡입에 의해 여과하였다. 이어서, 필터에 남아있는 수지를 이소프로판올 10 ㎖에 재현탁하고, 이 현탁액을 180 rpm으로 1시간 동안 진탕하여 추출하였다. 이 현탁액으로부터 1 ㎖을 분리하여 에펜도르프 마이크로퓨즈 (Eppendorff Micorfuge)에서 12,000 rpm으로 원심분리하였다. HPLC 및 UV_DAD 검출기 상의 250 nm에서의 검출에 의해 에포틸론 A 및 B의 양을 측정하였다 (워터스 시메트리 (Waters-Symetry) C18 컬럼에서 0.02% 인산 60%-0% 및 아세토니트릴 40%-100%의 구배를 이용한 HPLC).
pEPO15로부터 서브클로닝된 세 가지 상이한 BamHⅠ 단편이 도입된 트랜스 접합체, 즉 pEPO15-21 플라스미드의 BamHⅠ 단편과의 트랜스 접합체, pEPO15-4-5 플라스미드의 BamHⅠ 단편과의 트랜스 접합체 및 pEPO15-4-1 플라스미드의 BamHⅠ 단편과의 트랜스 접합체를 상기 기재된 방식으로 시험하였다. HPLC 분석 결과, 모든 트랜스 접합체가 에포틸론 A 및 B를 더 이상 생성하지 않음을 알아냈다. 반면, pEPO20, pEPO30, pEPO31 및 pEPO33에서 유래한 BamHⅠ 단편과의 트랜스 접합체 및 모 균주 BCE28/2에서는 2 내지 4 mg/ℓ의 농도로 에포틸론 A 및 B가 검출되었다.
<실시예 8> 클로닝된 단편의 뉴클레오티드 서열 결정 및 콘티그 구성
A. 플라스미드 pEPO15-21의 BamHⅠ 삽입체
대장균 균주 DH10B[pEPO15-21]로부터 플라스미드 DNA를 단리하여, pEPO15-21에 삽입된 2.3 kb의 BamHⅠ 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems) 모델 377 서열분석기를 이용하여, 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결 방법에 의해 이중 가닥 DNA 주형 상에서 자동화 DNA 서열분석을 수행하였다. 사용된 프라이머는 유니버설 역방향 프라이머 (5' GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3'(서열 24)) 및 유니버설 순방향 프라이머 (5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3'(서열 25))였다. 이후의 서열분석 반응에서, 상기 결정된 서열의 3' 말단을 위해 고안된, 주문-합성된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 콘티그를 확장 및 결합시켰다. 양쪽 가닥 전장의 서열을 분석하고, 모든 뉴클레오티드 서열을 2회 이상 분석하였다. 시퀀서 (Sequencher) 3.0 버전 (Gene Codes Corporation)의 프로그램을 이용하여 뉴클레오티드 서열을 번역하고, 위스콘신대 유전학 컴퓨터 그룹 (University of Wisconsin Genetics Computer Group) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 2213 bp 삽입체의 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 20779-22991에 상응한다.
B. 플라스미드 pEPO15-4-1의 BamHⅠ 삽입체
대장균 균주 DH10B[pEPO15-4-1]로부터 플라스미드 DNA를 단리하여, 상기 (A)에 기재된 바와 같이 pEPO15-4-1에 삽입된 3.9 kb의 BamHⅠ 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 3909 bp 삽입체의 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 16876-20784에 상응한다.
C. 플라스미드 pEPO15-4-5의 BamHⅠ 삽입체
대장균 균주 DH10B[pEPO15-4-5]로부터 플라스미드 DNA를 단리하여, 상기 (A)에 기재된 바와 같이 pEPO15-4-5에 삽입된 2.3 kb의 BamHⅠ 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 2233 bp 삽입체의 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 42528-44760에 상응한다.
<실시예 9> 에포틸론 생합성 유전자를 포함하는 pEPO15에서 유래한 DNA 단편의 서브클로닝 및 순서 결정
pEPO15를 제한효소 HindⅢ로 완전히 절단하여 생성된 단편을, HindⅢ로 절단된 후 송아지 장 알칼리 포스파타아제로 탈인산화된 pBluescriptⅡ SK- 또는 pNEB193 (New England Biolabs)에 서브클로닝하였다. 여섯 가지 상이한 클론이 생성되었고, 이들을 각각 pEPO15-NH1, pEPO15-NH2, pEPO15-NH6, pEPO15-NH24 (모두 pNEB193 기재), 및 pEPO15-H2.7 및 pEPO15-H3.0 (pBluescriptⅡ SK- 기재)이라 명명하였다.
pEPO15-21의 BamHⅠ 삽입체를 단리하고, DIG (비-방사성 DNA 표지 및 검출 시스템, Boehringer Mannheim)로 표지한 후, 고도의 엄격 조건에서 pEPO15-NH1, pEPO15-NH2, pEPO15-NH6, pEPO15-NH24, pEPO15-H2.7 및 pEPO15-H3.0에 대한 DNA 혼성화 실험에서 프로브로 사용하였다. pEPO15-NH24에서 강력한 혼성화 신호가 검출되었고, 이는 pEPO15-21이 pEPO15-NH24에 포함되어 있음을 의미한다.
pEPO15-4-1의 BamHⅠ 삽입체를 단리하고, 상기와 같이 DIG로 표지한 후, 고도의 엄격조건에서 pEPO15-NH1, pEPO15-NH2, pEPO15-NH6, pEPO15-NH24, pEPO15-H2.7 및 pEPO15-H3.0에 대한 DNA 혼성화 실험에서 프로브로 사용하였다. pEPO15-NH24 및 pEPO15-H2.7에서 강력한 혼성화 신호가 검출되었다. 또한, pEPO15-NH24 및 pEPO15-H2.7의 한쪽 말단으로부터 생성된 뉴클레오티드 서열분석 데이타도 이전에 결정된 pEPO15-4-1의 BamHⅠ 삽입체와 일치하였다. 이러한 실험들은 pEPO15-4-1 (내부에 HindⅢ 부위를 1개 포함)이 pEPO15-NH24 및 pEPO15-H2.7와 중복되고, pEPO15-H2.7 및 pEPO15-H24의 순서로 인접함을 입증하였다.
pEPO15-4-5의 BamHⅠ 삽입체를 단리하고, 상기와 같이 DIG로 표지한 후, 고도의 엄격 조건에서 pEPO15-NH1, pEPO15-NH2, pEPO15-NH6, pEPO15-NH24, pEPO15-H2.7 및 pEPO15-H3.0에 대한 DNA 혼성화 실험에서 프로브로 사용하였다. pEPO15-NH2에서 강력한 혼성화 신호가 검출되었고, 이는 pEPO15-4-5가 pEPO15-NH2에 포함되어 있음을 의미한다.
pEPO15-NH2의 양쪽 말단으로부터 생성된 뉴클레오티드 서열 데이타 및 pEPO15-NH24의 말단으로부터 생성된 뉴클레오티드 서열 데이타는 pEPO15-4-1과 중복되지 않았다. HindⅢ 부위 방향을 지향하는 PCR 프라이머 NH24 말단 "B": GTGAC TGGCGCCTGGAATCTGCATGAGC (서열 26), NH2 말단 "A": AGCGGGAGCTTGCTAGACATTCTGTTTC (서열 27) 및 NH2 말단 "B": GACGCGCCTCGGGCAGCGCCCCAA (서열 28)은 이러한 서열들을 기초로 제작되었고, pEPO15와의 증폭 반응 및 소란지움 셀룰로숨 So ce90의 게놈 DNA를 주형으로하는 독립된 실험에 사용되었다. NH24 말단 "B" 및 NH2 말단 "A"의 프라이머 쌍을 사용하는 경우에 두 가지 주형 모두에서 특이적으로 증폭되었다. 증폭된 DNA를 pBluescriptⅡ SK-에 클로닝하고, 완전하게 서열분석하였다. 증폭된 두 DNA의 서열은 동일하였고, 또한 HindⅢ 부위에서 융합된 pEPO15-NH24 및 pEPO15-NH2의 말단 서열과 완전히 일치하였으며, 이는 pEPO15-NH2 및 pEPO15-NH24가 이 순서로 인접함을 의미한다.
pEPO15-H2.7의 HindⅢ 삽입체를 단리하고, 상기와 같이 DIG로 표지한 후, 고도의 엄격 조건에서 NotⅠ으로 절단된 pEPO15에 대한 DNA 혼성화 실험에서 프로브로 사용하였다. 약 9 kb의 NotⅠ 단편은 강력하게 혼성화되었고, 이를 NotⅠ으로 절단된 후 송아지 장 알칼리 포스파타아제로 탈인산화된 pBluescriptⅡ SK-에 서브클로닝하여 pEPO15-N9-16을 수득하였다. pEPO15-N9-16의 NotⅠ 단편을 단리하고, 상기와 같이 DIG로 표지한 후, 고도의 엄격 조건에서 pEPO15-NH1, pEPO15-NH2, pEPO15-NH6, pEPO15-NH24, pEPO15-H2.7 및 pEPO15-H3.0에 대한 DNA 혼성화 실험에서 프로브로 사용하였다. pEPO15-NH6에서 강력한 혼성화 신호가 검출되었으며, 예상된 클론인 pEPO15-H27 및 pEPO15-NH24에서도 강력한 신호가 검출되었다. 뉴클레오티드 서열 데이타를 pEPO15-NH6의 양쪽 말단, 및 pEPO15-4-1과 중복되지 않은 pEPO15-H2.7의 말단으로부터 생성하였다. PCR 프라이머는 HindⅢ 부위 방향을 지향하도록 고안되었고, pEPO15와의 증폭 반응 및 소란지움 셀룰로숨 So ce90의 게놈 DNA를 주형으로하는 독립된 실험에 사용되었다. 두 주형 모두에서 pEPO15-NH6 말단 "B": CACCGAAGCGTCGATCTGGTCCATC (서열 29) 및 pEPO15-H2.7 말단 "A": CGGTCAGATCGACGACGGGCTTTCC (서열 30)의 프라이머 쌍을 사용하는 경우 특이적으로 증폭되었다. 증폭된 DNA를 pBluescriptⅡ SK-에 클로닝하고, 완전하게 서열분석하였다. 증폭된 두 DNA의 서열은 동일하였고, 또한 HindⅢ 부위에서 융합된 pEPO15-NH6 및 pEPO15-H2.7의 말단 서열과 완전히 일치하였으며, 이는 pEPO15-NH6 및 pEPO15-H2.7이 이 순서로 인접함을 의미한다.
이 실험들을 종합하면, 약 55 kb의 영역에 해당하며 pEPO15-NH6, pEPO15-H2.7, pEPO15-NH24 및 pEPO15-NH2가 이 순서로 이루어지는 HindⅢ 단편의 콘티그가 만들어진다. 남아있는 두 HindⅢ 단편, 즉 pEPO15-NH1 및 pEPO15-H3.0은 콘티그의 일부로 발견되지 않았다.
<실시예 10> 에포틸론 생합성 유전자에 해당하는 서브클론 콘티그의 추가의 확장
pEPO15-NH2 삽입체의 하류 말단으로부터 유래되어 실시예 9에 기재된 서브클론 콘티그의 하류 말단에 해당하는 약 2.2 kb의 BamHⅠ-HindⅢ 단편을 단리하고, DIG로 표지한 후, 여러 가지 효소로 절단된 pEPO15 및 pEPO15-NH2에 대한 써던 혼성화 실험에 사용하였다. 강력하게 혼성화되는 밴드는 항상 두 표적 사이의 동일한 크기에서 발견되었으며, 이는 소란지움 셀룰로숨 So ce90 게놈 DNA 단편이 pEPO15-NH2의 하류 말단에서 HindⅢ 부위로 pEPO15 말단에 클로닝되었음을 의미한다.
기존의 방법을 사용하여, pScosTriplex-Ⅱ (Ji, et al., Genomics 31: 185-192 (1996))에 소란지움 셀룰로숨 So ce90의 코스미드 DNA 라이브러리가 생성되었다. 간략히 설명하면, 소란지움 셀룰로숨 So ce90의 고분자량 게놈 DNA를 제한효소 Sau3AⅠ을 이용하여 부분적으로 절단하여 평균 약 40 kb의 단편을 만든 후, BamHⅠ 및 XbaⅠ으로 절단된 pScosTriplex-Ⅱ에 라이게이션하였다. 라이게이션 혼합물을 기가팩 (Gigapack) Ⅲ XL (Stratagene)으로 패키징하여 대장균 XL1 블루 (Blue) MR 세포의 형질전환에 사용하였다.
콜로니 혼성화에 프로브로 사용된 pEPO15-NH2 삽입체의 하류 말단에서 유래한 약 2.2 kb의 BamHⅠ-HindⅢ 단편으로 코스미드 라이브러리를 스크린하였다. 강력하게 혼성화되는, pEPO4E7이라 명명된 클론을 선별하였다.
pEPO4E7 DNA를 단리하고, 여러 가지 제한효소로 절단한 후, 2.2 kb의 BamHⅠ-HindⅢ 단편를 프로브로 써던 혼성화 실험을 수행하였다. 약 9 kb의 강하게 혼성화되는 NotⅠ 단편을 선별하고 pBluescriptⅡ SK-에 서브클로닝하여 pEPO4E7-N9-8을 수득하였다. 추가의 써던 혼성화 실험 결과, 약 9 kb의 pEPO4E7-N9-8의 NotⅠ 삽입체가 pEPO15-NH2의 NotⅠ-HindⅢ 단편과 6 kb에 걸쳐 중복되었기 때문에, 나머지 약 3 kb의 HindⅢ-NotⅠ 단편은 실시예 9에 기재된 서브클론 콘티그를 확장 시킬 것이라 생각했다. 그러나, 말단 서열분석 결과 pEPO4E7-N9-8 삽입체의 하류 말단은 pScosTriplex-Ⅱ의 BamHⅠ-NotⅠ 폴리링커 (polylinker)를 포함함을 알아냈고, 따라서 pEPO4E7의 게놈 DNA 삽입체는 확장되는 HindⅢ-NotⅠ 단편 내의 Sau3AⅠ 위치에서 끝나며 NotⅠ 부위는 pScosTriplex-Ⅱ에서 유래한 것이다.
벡터 없이 소란지움 셀룰로숨 So ce90 유래의 서열만을 포함하는, pEPO4E7-N9-8의 약 3 kb HindⅢ-NotⅠ 단편으로부터 유래한 약 1.6 kb의 PstⅠ-SalⅠ 단편을 실시예 2에 기재된 박테리아 인공 염색체 라이브러리에 대한 프로브로 사용하였다. 이전에 단리된 EPO15 이외에, EPO32라 불리우는 Bac 클론이 프로브에 강하게 혼성화됨을 발견하였다. pEPO32를 단리하고, 여러 가지 제한효소로 절단한 후, 약 1.6 kb의 PstⅠ-SalⅠ 프로브로 혼성화하였다. 약 13 kb의 HindⅢ-EcoRⅤ 단편이 프로브에 강하게 혼성화됨을 발견하였고, 이를 HindⅢ 및 HincⅡ로 절단된 pBluescriptⅡ SK-에 서브클론하여 pEPO32-HEV15를 수득하였다.
pEPO15-NH2의 하류 말단 서열 및 pEPO32-HEV15로부터 유래한 상류 (HindⅢ) 말단 서열을 기초로 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하여, pEPO4E7-N9-8을 주형으로하는 서열분석 반응에 사용하였다. 그 결과, 이 서열에 작은 HindⅢ 단편이 존재함을 알아냈는데, 이 단편은 pEPO15-NH2의 하류 말단 HindⅢ 부위를 pEPO32-HEV15의 상류 말단 HindⅢ 부위로부터 분리시키기 때문에 표준 제한효소 분석으로는 검출할 수 없었다.
따라서, 실시예 9에 기재된 서브클론 콘티그는 HindⅢ 단편 EPO4E7-H0.02 및 pEPO32-HEV15의 삽입체를 포함하도록 확장되었고, pEPO15-NH6, pEPO15-H2.7, pEPO15-NH24, pEPO15-NH2, EPO4E7-H0.02 및 pEPO32-HEV15의 삽입체가 이 순서로 구성된 것이다.
<실시예 11> 에포틸론 생합성 유전자에 해당하는 서브클론 콘티그의 뉴클레오티드 서열 결정
실시예 10에 기재된 서브클론 콘티그의 뉴클레오티드 서열을 하기와 같이 결정하였다.
pEPO15-H2.7: 대장균 균주 DH10B[pEPO15-H2.7]로부터 플라스미드 DNA를 단리하여, pEPO15-H2.7에 삽입된 2.7 kb의 BamHⅠ 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 어플라이드 바이오시스템스 모델 377 서열분석기를 이용하여, 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결 방법에 의해 이중 가닥 DNA 주형 상에서 자동화 DNA 서열분석을 수행하였다. 사용된 프라이머는 유니버설 역방향 프라이머 (5' GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3'(서열 24)) 및 유니버설 순방향 프라이머 (5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3'(서열 25))이었다. 이후의 서열분석 반응에서, 상기 결정된 서열의 3' 말단을 위해 고안된, 주문-합성된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 콘티그를 확장 및 결합시켰다.
pEPO15-NH6, pEPO15-NH24 및 pEPO15-NH2: 이 플라스미드들의 HindⅢ 삽입체를 단리하고, 이를 하이드로쉬어 (Hydroshear) 장치 (Genomic Instrumentation Services, Inc.)을 이용하여 무작위 단편으로 절단하여, 평균 1 내지 2 kb의 단편을 수득하였다. 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에 T4 DNA 중합효소 및 클레나우 (Klenow) DNA 중합효소를 이용하여 이 단편들의 말단을 복구 (repair)시키고, 리보-ATP의 존재하에 T4 DNA 키나아제를 이용하여 인산화시켰다. 약 1.5 내지 2.2 kb의 단편들을 아가로오스 겔로부터 단리하여, EcoRⅤ로 절단 후 탈인산화된 pBluescriptⅡ SK-에 라이게이션하였다. 유니버설 역방향 프라이머 및 유니버설 순방향 프라이머를 사용하여 무작위 서브클론을 서열분석하였다.
pEPO32-HEV15: pEPO32-HEV15를 HindⅢ 및 SspⅠ으로 절단하여, 에스. 셀룰로숨 So ce90에서 유래한 약 13 kb의 HindⅢ-EcoRⅤ 삽입체 및 pBluescriptⅡ SK-에서 유래한 0.3 kb의 HincⅡ-SspⅠ 단편을 포함하는 약 13.3 kb의 단편을 단리한 후, HaeⅡ로 부분적으로 절단하여 평균 크기가 1 내지 2 kb인 단편을 수득하였다. 크기가 1.5 내지 2.2 kb인 단편을 아가로오스 겔에서 단리하여, EcoRⅤ로 절단된 후 탈인산화된 pBluescriptⅡ SK-에 라이게이션하였다. 유니버설 역방향 프라이머 및 유니버설 순방향 프라이머를 사용하여 무작위 서브클론을 서열분석하였다.
크로마토그램 (chromatogram)을 분석하고, 프레드 (Phred), 프랩 (Phrap) 및 콘스드 (Consed) 프로그램 (Ewing, et al., Genome Res. 8(3): 175-185 (1998); Ewing, et al., Genome Res. 8(3): 186-194 (1998); Gordon, et al., Genome Res. 8(3): 195-202 (1998))를 이용하여 콘티그로 조립하였다. 콘티그의 갭 (gap)을 채워넣고, 서열의 모순을 해결하였으며, 상태가 불량한 서열 영역은 원래의 서브클론 또는 무작위 서브클론 라이브러리로부터 선별된 클론에서 주문 제작된 서열분석용 프라이머를 사용하여 다시 서열분석하였다. 양쪽 가닥을 모두 완전하게 서열분석하고, 모든 염기쌍이 집합된 최소 프레드 스코어 (score)가 40 이상 (99.99%의 신뢰도)이 되도록 하였다.
68750 bp 콘티그의 뉴클레오티드 서열을 서열 1에 기재하였다.
<실시예 12> 에포틸론 생합성 유전자의 뉴클레오티드 서열 분석
서열 1에는 하기 표 1에 상세히 기재된 22개의 ORF가 포함됨을 알아냈다.
ORF 개시 코돈 종결 코돈 추정 단백질의 상동성 추정 단백질의 예상된 기능
orf1 orf2* orf3orf4*orf5epoA epoP epoB epoC epoD epoE epoForf6orf7*orf8orf9*orf10orf11*orf12*orf13orf14 orf15 서열분석 영역 외곽3171 3415599262267610 11872 16251 21746 43524 54935 62369637796429064363647276506365874663386666767334 68346 1826 1900 55565612667511875 16104 21749 43519 54920 62254 63628643336385364920642876576765008658716713768251 서열분석 영역 외곽 가상 단백질 SP:Q11037;DD-펩티다아제 SP:P15555Na/H 역수송체 PED:D1017724 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소 비-리보솜 펩티드 합성효소 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소 시트크롬 P450 가상 단백질 GI:3293544;양이온 유출 시스템 단백질 GI:2623026 수송 에포틸론 합성효소: 티아졸 고리 형성에포틸론 합성효소: 티아졸 고리 형성에포틸론 합성효소: 폴리케티드 골격 형성에포틸론 합성효소: 폴리케티드 골격 형성에포틸론 합성효소: 폴리케티드 골격 형성에포틸론 합성효소: 폴리케티드 골격 형성에포틸론 마크로락톤 산화효소 수송
*: 역방향 상보 가닥. 번호는 서열 1에 따름.
epoA (서열 1의 뉴클레오티드 7610-11875)는, 1개의 모듈로 이루어지고 β-케토아실 합성효소 (KS) (서열 1의 뉴클레오티드 7643-8920, 서열 2의 아미노산 11-437); 아실전이효소 (AT) (서열 1의 뉴클레오티드 9236-10201, 서열 2의 아미노산 543-864); 에놀 환원효소 (ER) (서열 1의 뉴클레오티드 10529-11428, 서열 2의 아미노산 974-1273) 및 아실 캐리어 단백질 상동성 도메인 (ACP) (서열 1의 뉴클레오티드 11549-11764, 서열 2의 아미노산 1314-1385)을 포함하는 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소인 EPOS A (서열 2)를 코딩한다. 서열 비교 및 모티프 (motif) 분석 (Haydock, et al. FEBS Lett. 374: 246-248 (1995) 및 Tang, et al., Gene 216: 255-265 (1998)) 결과, EPOS A에 의해 코딩되는 AT는 말로닐-CoA에 특이적임을 알아냈다. EPOS A는 2-메틸티아졸 고리 (C26 및 C20)를 형성하는 다중 효소 복합체에 아세테이트 단위를 로딩하여 에포틸론 생합성을 개시하는 기능과 관련되어 있다.
epoP (서열 1의 뉴클레오티드 11872-16104)는 1개의 모듈을 포함하는 비-리보솜 펩티드 합성효소인 EPOS P (서열 3)를 코딩한다. EPOS P는 하기의 도메인을 포함한다.
· 모티프 K (서열 1의 뉴클레오티드 12085-12114에 상응하는 서열 3의 아미노산 72-81 [FPLTDIQESY]), 모티프 L (서열 1의 뉴클레오티드 12223-12246에 상응하는 서열 3의 아미노산 118-125 [VVARHDML]), 모티프 M (서열 1의 뉴클레오티드 12466-12507에 상응하는 서열 3의 아미노산 199-212 [SIDLINVDLGSLSI]) 및 모티프 O (서열 1의 뉴클레오티드 12928-12960에 상응하는 서열 3의 아미노산 353-363 [GDFTSMVLLDI])에 의해 서술되는 펩티드 결합 형성 도메인,
·모티프 A (서열 1의 뉴클레오티드 13516-13566에 상응하는 서열 3의 아미노산 549-565 [LTYEELSRRSRRLGARL]), 모티프 B (서열 1의 뉴클레오티드 13633-13680에 상응하는 서열 3의 아미노산 588-603 [VAVLAVLESGAAYVPI]), 모티프 C (서열 1의 뉴클레오티드 13876-13923에 상응하는 서열 3의 아미노산 669-684 [AYVIYTSGSTGLPKGV]), 모티프 D (서열 1의 뉴클레오티드 14313-14334에 상응하는 서열 3의 아미노산 815-821 [SLGGATE]), 모티프 E (서열 1의 뉴클레오티드 14473-14547에 상응하는 서열 3의 아미노산 868-892 [GQLYIGGVGLALGYWRDEEKTRKSF]), 모티프 F (서열 1의 뉴클레오티드 14578-14607에 상응하는 서열 3의 아미노산 903-912 [YKTGDLGRYL]), 모티프 G (서열 1의 뉴클레오티드 14623-14692에 상응하는 서열 3의 아미노산 918-940 [EFMGREDNQIKLRGYRVELGEIE]), 모티프 H (서열 1의 뉴클레오티드 15673-15693에 상응하는 서열 3의 아미노산 1268-1274 [LPEYMVP]) 및 모티프 I (서열 1의 뉴클레오티드 15724-15762에 상응하는 서열 3의 아미노산 1285-1297 [LTSNGKVDRKALR])에 의해 서술되는 아미노아실 아데닐레이트 형성 도메인,
· 아미노아실 아데닐레이트 형성 도메인의 모티프 G 및 H 사이에 삽입된 알려지지 않은 도메인 (서열 1의 뉴클레오티드 14788-15639에 상응하는 서열 3의 아미노산 973-1256), 및
· 모티프 J (서열 1의 뉴클레오티드 15901-15924에 상응하는 서열 3의 아미노산 1344-1351 [GATSIHIV]) 펩티딜 캐리어 단백질 상동성 도메인 (PCP).
EPOS P가 아데닐화에 의한 시스테인의 활성화, 활성화된 시스테인의 아미노아실-S-PCP로서의 결합, 효소-결합 시스테인 및 EPOS A에 의해 제공되는 아세틸-S-ACP 사이에 펩티드 결합의 형성, 및 분자내 헤테로고리화에 의한 초기 티아졸린 고리의 형성에 관련되어 있다고 제안되었다. EPOS P의 알려지지 않은 도메인은 바실러스 종의 NAD(P)H 산화효소 및 환원효소와 매우 약한 상동성을 나타낸다. 따라서, EPOS A의 알려지지 않은 도메인 및(또는) ER 도메인은 초기 2-메틸티아졸린 고리의 2-메틸티아졸로의 산화에 연관되어 있을 수 있다.
epoB (서열 1의 뉴클레오티드 16251-21749)는, 1개의 모듈로 이루어지고 KS (서열 1의 뉴클레오티드 16269-17546, 서열 4의 아미노산 7-432), AT (서열 1의 뉴클레오티드 17865-18827, 서열 4의 아미노산 539-859), 탈수효소 (DH) (서열 1의 뉴클레오티드 18855-19361, 서열 4의 아미노산 869-1037), β-케토환원효소 (KR) (서열 1의 뉴클레오티드 20565-21302, 서열 4의 아미노산 1439-1684) 및 ACP (서열 1의 뉴클레오티드 21414-21626, 서열 4의 아미노산 1722-1792)를 포함하는 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소인 EPOS B (서열 4)를 코딩한다. 서열 비교 및 모티프 (모티프) 분석 결과, EPOS A에 의해 코딩되는 AT는 말로닐-CoA에 특이적임을 알아냈다. EPOS B는 2-메틸-4-티아졸카르복실-S-PCP 출발 기의 메틸말로닐S-ACP와의 클라이젠 (Claisen)-유사 축합을 촉매하여 첫 번째 폴리케티드 사슬을 확장시키는 기능 및 C17의 β-케토기의 에노일로의 환원에 연관되어 있을 수 있다.
epoC (서열 1의 뉴클레오티드 21746-43519)는 4개의 모듈로 구성되는 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소인 EPOS C (서열 5)를 코딩한다. 첫 번째 모듈은 KS (서열 1의 뉴클레오티드 21860-23116, 서열 5의 아미노산 39-457), 말로닐 CoA-특이적 AT (서열 1의 뉴클레오티드 23431-24397, 서열 5의 아미노산 563-884), KR (서열 1의 뉴클레오티드 25184-25942, 서열 5의 아미노산 1147-1399) 및 ACP (서열 1의 뉴클레오티드 26045-26263, 서열 5의 아미노산 1434-1506)를 포함한다. 이 모듈은 아세테이트 확장제 단위 (C14-C13)를 도입시키고, C15에서 β-케토기를 히드록실기로 환원시키며, 이는 에포틸론 마크로락톤 고리의 최종 락톤화에 기여한다. EPOS C의 두 번째 모듈은 KS (서열 1의 뉴클레오티드 26318-27595, 서열 5의 아미노산 1524-1950), 말로닐 CoA-특이적 AT (서열 1의 뉴클레오티드 27911-28876, 서열 5의 아미노산 2056-2377), KR (서열 1의 뉴클레오티드 29678-30429, 서열 5의 아미노산 2645-2895) 및 ACP (서열 1의 뉴클레오티드 30539-30759, 서열 5의 아미노산 2932-3005)을 포함한다. 이 모듈은 아세테이트 확장제 단위 (C12-C11)를 도입시키고, C13에서 β-케토기를 히드록실기로 환원시킨다. 따라서, 발생중인 에포틸론의 폴리케티드 사슬은 에포틸론 A에 상응하고, 에포틸론 B의 C12에서 메틸 측쇄의 도입은 PKS C-메틸전이효소의 후기 활성을 필요로 한다. 또한, C13-C12에서의 에폭시 고리 형성에는 PKS 산화 후의 단계를 필요로 한다. EPOS C의 세 번째 모듈은 KS (서열 1의 뉴클레오티드 30815-32092, 서열 5의 아미노산 3024-3449), 말로닐 CoA-특이적 AT (서열 1의 뉴클레오티드 32408-33373, 서열 5의 아미노산 3555-3876), DH (서열 1의 뉴클레오티드 33401-33889, 서열 5의 아미노산 3886-4048), ER (서열 1의 뉴클레오티드 35042-35902, 서열 5의 아미노산 4433-4719), KR (서열 1의 뉴클레오티드 35930-36667, 서열 5의 아미노산 4729-4974) 및 ACP (서열 1의 뉴클레오티드 36773-36991, 서열 5의 아미노산 5010-5082)를 포함한다. 이 모듈은 아세테이트 확장제 단위 (C10-C9)를 도입시키고, C11에서 β-케토기를 완전히 환원시킨다. EPOS C의 네 번째 모듈은 KS (서열 1의 뉴클레오티드 37052-38320, 서열 5의 아미노산 5103-5525), 메틸말로닐 CoA-특이적 AT (서열 1의 뉴클레오티드 38636-39598, 서열 5의 아미노산 5631-5951), DH (서열 1의 뉴클레오티드 39635-40141, 서열 5의 아미노산 5964-6132), ER (서열 1의 뉴클레오티드 41369-42256, 서열 5의 아미노산 6542-6837), KR (서열 1의 뉴클레오티드 42314-43048, 서열 5의 아미노산 6857-7101) 및 ACP (서열 1의 뉴클레오티드 43163-43378, 서열 5의 아미노산 7140-7211)를 포함한다. 이 모듈은 아세테이트 확장제 단위 (C24 및 C8-C7)를 도입시키고, C9에서 β-케토기를 완전히 환원시킨다.
epoD (서열 1의 뉴클레오티드 43524-54920)는 2개의 모듈로 이루어지는 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소인 EPOS D (서열 6)를 코딩한다. 첫 번째 모듈은 KS (서열 1의 뉴클레오티드 43626-44885, 서열 6의 아미노산 35-454), 메틸말로닐 CoA-특이적 AT (서열 1의 뉴클레오티드 45204-46166, 서열 6의 아미노산 561-881), KR (서열 1의 뉴클레오티드 46950-47702, 서열 6의 아미노산 1143-1393) 및 ACP (서열 1의 뉴클레오티드 47811-48032, 서열 6의 아미노산 1430-1503)를 포함한다. 이 모듈은 프로피오네이트 확장제 단위 (C23 및 C6-C5)를 도입시키고, C7에서 β-케토기를 히드록실기로 환원시킨다. 두 번째 모듈은 KS (서열 1의 뉴클레오티드 48087-49361, 서열 6의 아미노산 1522-1946), 메틸말로닐 CoA-특이적 AT (서열 1의 뉴클레오티드 49680-50642, 서열 6의 아미노산 2053-2373), DH (서열 1의 뉴클레오티드 50670-51176, 서열 6의 아미노산 2383-2551), 메틸전이효소 (MT, 서열 1의 뉴클레오티드 51534-52657, 서열 6의 아미노산 2671-3045), KR (서열 1의 뉴클레오티드 53697-54431, 서열 6의 아미노산 3392-3636) 및 ACP (서열 1의 뉴클레오티드 54540-54758, 서열 6의 아미노산 3673-3745)를 포함한다. 이 모듈은 프로피오네이트 확장제 단위 (C21 또는 C4-C3)를 도입시키고, C5에서 β-케토기를 히드록실기로 환원시킨다. 이 환원은 에포틸론이 C5에 케토기를 함유하고 있기 때문에, 다소 예상하지 못한 것이었다. 그러나, 추정된 PKS 모듈의 환원 능력 및 최종 폴리케티드 생성물에서 이에 상응하는 위치에서의 산화환원 상태 사이의 모순은 문헌 [Schwecke, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7839-7843 (1995)] 및 [Schupp, et al., FEMS Microbiology Letters 159: 201-207 (1998)] 등에 보고되어 있다. 에포틸론의 중요한 특성은 C4 (C21 및 C22)에 겜-메틸 측기 (gem-methyl side group)이 존재한다는 것이다. EPOS D의 두 번째 모듈은 프로피오네이트 단위를 연장되는 폴리케티드 사슬에 도입시켜 C4에 하나의 메틸 측기를 제공할 것으로 예상하였다. 또한, 이 모듈은 PKS의 DH 및 KR 도메인 사이에 HMWP1 예르시니아박틴 합성효소 와 유사한 배열 (Gehring, A.M., DeMoll, E., Fetherston, J.D., Mori, I., Mayhew, G.F., Blattner, F.R., Walsh, C.T. 및 Perry, R.D.: Iron acquisition in plague: modular logic in enzymatic biogenesis of yersiniabactin by Yersinia pestis. Chem. Biol. 5, 573-586, 1998)로 도입된 메틸전이효소 도메인을 포함하였다. EPOS D에서 이 도메인은 C4에 두 번째 메틸 측기 (C21 또는 C22)를 도입시킬 것이라 예상되었다.
epoE (서열 1이 뉴클레오티드 54935-62254)는 KS (서열 1의 뉴클레오티드 55028-56284, 서열 7의 아미노산 32-450), 말로닐 CoA-특이적 AT (서열 1의 뉴클레오티드 56600-57565, 서열 7의 아미노산 556-877), DH (서열 1의 뉴클레오티드 57593-58087, 서열 7의 아미노산 887-1051), 아마도 기능이 없는 ER (서열 1의 뉴클레오티드 59366-60304, 서열 7의 아미노산 1478-1790), KR (서열 1의 뉴클레오티드 60362-61099, 서열 7의 아미노산 1810-2055), ACP (서열 1의 뉴클레오티드 61211-61426, 서열 7의 아미노산 2093-2164) 및 티오에스테라제 (TE) (서열 1의 뉴클레오티드 61427-62254, 서열 7의 아미노산 2165-2439)을 포함하는 1개의 모듈로 이루어지는 Ⅰ형 폴리케티드 합성효소인 EPOS E (서열 7)를 코딩한다. 이 모듈의 ER 도메인은 이 도메인을 불활성화시킬 수 있는 보기드문 아미노산 치환이 있는 활성화 부위 모티프를 포함하고 있다. 이 모듈은 아세테이트 확장제 단위 (C2-C1)를 도입시키고, C3에서 β-케토를 에노일기로 환원시킨다. 에포틸론은 C3에 히드록실기를 함유하기 때문에, 이 환원은 EPOS D의 두 번째 모듈에 논의된 바와 같이 지나친 것으로 보인다. EPOS D의 TE 도메인은 C1의 카르복실기 및 C15의 히드록실기 사이에서 락톤화를 통해 신장되는 폴리케티드 사슬의 방출 및 고리화에 기여한다.
서열분석된 영역 중 epoA의 상류에 5개의 ORF가 발견되었다. 부분적으로 서열분석된 orf1의 서열은 서열 데이타뱅크 (databack)에 상동성인 서열이 존재하지 않았다. orf2 (서열 1의 역방향 상보 가닥 뉴클레오티드 3171-1900)의 추정 단백질 생성물 (Orf 2, 서열 10)은 미코박테리움 (Mycobacterium) 및 스트렙토마이세스로부터의 가상 ORF에 강한 유사성을 나타내었고, 다른 박테리아의 카르복시펩티다아제 및 DD-펩티다아제와는 더 먼 유사성을 나타내었다. orf3 (서열 1의 뉴클레오티드 3415-5556)의 추정 단백질 생성물인 Orf3 (서열 11)은 다른 박테리아의 Na/H 역수송체에 상동성을 나타내었다. Orf3은 제조 균주로부터 에포틸론의 방출에 기여할 것이다. orf4 및 orf5의 서열은 서열 데이타뱅크에 상동성인 서열이 존재하지 않았다.
서열분석된 영역 중 epoE의 하류에 11개의 ORF가 발견되었다. epoF (서열 1의 뉴클레오티드 62369-63628)의 추정 단백질인 EPOS F (서열 8)는 시트크롬 P450 산소첨가효소와 강력한 서열 유사성이 있는 단백질을 코딩한다. EPOS F는 탄소 C12, C5 및(또는) C3의 산화환원 상태를 조절하는데 기여할 것이다. orf14 (서열 1의 뉴클레오티드 67334-68251)의 추정 단백질 생성물인 Orf14 (서열 22)는 스트렙토마이세스 코엘리칼라로부터의 제안된 기능이 없는 가상 단백질 GI:3293544 및 인간 배아의 폐 단백질인 GI:2654559에 강한 유사성을 나타내었다. 또한, 더 멀게는 메타노박테리움 써모오토트로피쿰 (Methanobacterium thermoautotrophicum)으로부터의 GI:2623026과 같은 양이온 방출 시스템 단백질과 연관되어 있으며, 이는 에포틸론을 생성하는 세포로부터 에포틸론의 방출에 기여할 것이다. 남아있는 ORF (orf6-orf15)의 서열은 서열 데이타뱅크에 상동성인 서열이 존재하지 않았다.
<실시예 13> 에포틸론 생합성 유전자의 재조합 발현
소란지움 셀룰로숨의 발효에 의해 수득되는 에포틸론의 제조량보다 더 많은 양을 얻기 위해, 본 발명에 따른 에포틸론 생합성 유전자를 이종 유기체에서 발현하였다. 이종 발현에 바람직한 숙주는 스트렙토마이세스, 즉 원래 폴리케티드 악티노르호딘을 생성하는 스트렙토마이세스 코엘리칼라이다. 이 숙주에서 재조합 PKS 유전자의 발현 기술은 문헌 [McDaniel et al., Science 262: 1546-1550 (1993)] 및 [Kao et al., Science 265: 509-512 (1994)]에 기재되어 있다. 또한, 본원에 참고문헌으로 포함되는 문헌 [Holmes et al., EMBO Journal 12(8): 3183-3191 (1993)] 및 [Bibb et al., Gene 38: 215-226 (1985)] 뿐만 아니라 미국 특허 제5,521,077호, 동 제5,672,491호 및 동 제5,712,146호를 참조할 수 있다.
한 방법에 따라, 이종 숙주 균주를 조작하여 악티노르호딘 (act) 유전자 단편이 염색체에서 결실되게 하였다. 온도 감응성 공여 플라스미드를 대장균의 수용 셔틀 벡터에 전달 (McDaniel et al. (1993) 및 Kao et al. (1994))하여 벡터 내에서 동형 재조합에 의해 합성효소 유전자를 삽입함으로써, 본 발명의 에포틸론 합성효소 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 제작하였다. 별법으로, 에포틸론 합성효소 유전자 단편을 제한 단편 라이게이션에 의해 벡터에 도입하였다. 예를 들면, 문헌 [Kao et al. (1994)]에 기재된 바와 같이 선별한 후에, 본원에 참고문헌으로 포함되는 문헌 [Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual (John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom, 1985]에 기재된 방법에 따라 벡터로부터의 DNA를 act-음성 스트렙토마이세스 코엘리칼라 균주에 도입하였다. 재조합 스트렙토마이세스 균주를 R2YE 배지 (Hopwood et al. (1985))에서 배양하여 에포틸론을 생성하였다. 별법으로, 본 발명에 따른 에포틸론 합성효소 유전자를 슈도모나드, 바실러스, 효모, 곤충 세포 및(또는) 대장균과 같은 다른 숙주 유기체에서 발현하였다. PKS 및 NRPS 유전자는 T7 프로모터를 이용하는 pT7-7 벡터를 사용하여 대장균에서 발현하는 것이 바람직하다 (Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1074-1078 (1985)). 다른 실시양태에서, pKK223-3 및 pKK223-2 발현 벡터를 이용하여, tac 또는 trc 프로모터 뒤에서 전사 또는 번역 융합으로 대장균에서 PKS 및 NRPS 유전자를 발현하였다. 원래 PKS 효소의 번역 후 변형에 필요한 포스포판테테이닐 (P-판트) 전이효소를 갖고 있지 않은 이종 숙주에서의 PKS 및 NRPS 유전자의 발현은 P-판트 전이효소의 동시 발현을 필요로 한다 (Kealey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 505-509 (1998)).
<실시예 14> 생성 균주로부터의 에포틸론 단리
본 발명의 천연 및 재조합 숙주로부터 에포틸론을 추출하는데 유용한 배양, 발효 및 폴리케티드 단리에 대한 추출 방법에 관한 실시예는, 본원에 참고문헌으로 포함되는 WO 93/10121호, 미국 특허 제5,639,949호의 실시예 57, 문헌 [Gerth et al., J. Antibiotics 49: 560-563 (1996)], 및 본원에 참고문헌으로 포함되는 1998년 2월 19일자 스위스 특허 출원 제396/98호 및 미국 특허 출원 제09/248,910호 (소란지움 셀룰로숨의 바람직한 돌연변이 균주에 대해 개시됨)에 기재되어 있다. 배양된 소란지움 셀룰로숨 균주로부터 에포틸론을 단리하는데 유용하며, 재조합 숙주로부터 에포틸론의 단리에도 유용할 수 있는 절차를 하기에 기재하였다.
A: 에포틸론 생성 균주의 배양:
균주: 소란지움 셀룰로숨 Soce-90 또는 본 발명에 따른 재조합 숙주
균주의 보관: 액체 N2
배지: 전배양 및 중간 배양: G52
주요 배양: 1B12
G52 배지:
저농도 염의 효모 추출물 (BioSpringer, Maison Alfort, France) 2 g/ℓ
MgSO4(7 H2O) 1 g/ℓ
CaCl2(2 H2O) 1 g/ℓ
탈지 소야 밀 소야민(Soyamine) 50T (Lucas Meyer, Hamburg,
Germany) 2 g/ℓ
감자 전분 노레덕스 (Noredux) A-150 (Blattmann, Waedenswil,
Switzerland) 8 g/ℓ
무수 포도당 2 g/ℓ
EDTA-Fe(Ⅲ)-Na 염 (8 g/ℓ), KOH로 pH 7.4로 조절 1 ㎖/ℓ
멸균: 20분, 120℃
1B12 배지:
감자 전분 노레덕스 A-150 (Blattmann, Waedenswil,
Switzerland) 20 g/ℓ
탈지 소야 밀 소야민 50T (Lucas Meyer, Hamburg, Germany) 11 g/ℓ
EDTA-Fe(Ⅲ)-Na 염, , KOH로 pH 7.4로 조절 8 mg/ℓ
멸균: 20분, 120℃
시클로덱스트린 및 시클로덱스티린 유도체의 첨가:
상이한 농도의 시클로덱스트린 (Fluka, Buchs, Switzerland, or Wacker Chemie, Munich, Germany)을 각각 멸균하여 시딩하기 전에 1B12 배지에 가하였다.
배양:
액체 N2 앰플에서 1 ㎖의 소란지움 셀룰로숨 Soce-90 현탁액을 취하여 G52 배지 (50 ㎖의 엘렌마이어 플라스크 중) 10 ㎖에 옮기고, 30℃에서 25 mm 이동하는 교반기에서 180 rpm으로 3일 동안 배양하였다. 이 배양액 5 ㎖을 G52 배지 (200 ㎖의 엘렌마이어 플라스크 중) 45 ㎖에 가하고, 30℃에서 25 mm 이동하는 교반기에서 180 rpm으로 3일 동안 배양하였다. 이 배양액 50 ㎖을 G52 배지 (2 ℓ의 엘렌마이어 플라스크 중) 450 ㎖에 가하고, 30℃에서 50 mm 이동하는 교반기에서 180 rpm으로 3일 동안 배양하였다.
배양물의 유지:
3 내지 4일 마다 배양물 50 ㎖을 G52 배지 (2 ℓ의 엘렌마이어 플라스크 중) 450 ㎖에 가하여 과도하게 시딩하였다. 모든 실험 및 발효는 이 유지 배양물로부터 출발하여 수행하였다.
플라스크 중의 시험:
(1) 교반 플라스크 중의 전배양:
500 ㎖의 유지 배양물에서 출발하여, 450 ㎖의 G52 배지 1개를 50 ㎖의 유지 배양물로 시딩하고, 이를 30℃에서 50 mm 이동하는 교반기에서 180 rpm으로 4일 동안 배양하였다.
(2) 교반 플라스크 중의 주요 배양:
5 g/ℓ의 4-모르폴린-프로판-술폰산 (=MOPS)이 가해진 40 ㎖의 1B12 배지 (200 ㎖의 엘렌마이어 플라스크 중)를 5 ㎖의 10x 농축 시클로덱스트린 용액과 혼합한 후, 10 ㎖의 전배양물로 시딩하여 30℃에서 50 mm 이동하는 교반기에서 180 rpm으로 5일 동안 배양하였다.
발효:
발효는 10 ℓ, 100 ℓ 및 500 ℓ의 규모로 수행하였다. 20 ℓ 및 100 ℓ의 발효는 중간 배양 단계로서 수행하였다. 전배양 및 중간 배양은 유지 배양물 10% (v/v)로서 시딩되는 반면, 주요 배양은 중간 배양물 20% (v/v)로서 시딩되었다. 특히, 교반 배양과는 대조적으로 발효 배지의 성분은 접종물을 포함하는 최종 배양 부피로 계산되었다. 예를 들면, 18 ℓ의 배지에 2 ℓ의 접종물이 혼합되는 경우, 20 ℓ에 해당하는 물질의 중량을 측정하여 18 ℓ의 배지에 혼합하였다.
교반 플라스크 중의 전배양:
500 ㎖의 유지 배양물로 출발하여, 450 ㎖의 G52 배지 (200 ㎖의 엘렌마이어 플라스크 중) 4개를 유지 배양물 50 ㎖로 시딩하고, 30℃에서 50 mm 이동하는 교반기에서 180 rpm으로 4일 동안 배양하였다.
중간 배양, 20 ℓ 또는 100 ℓ:
20 ℓ: 총 부피가 30 ℓ인 발효기 중의 G52 배지 18 ℓ를 2 ℓ의 전배양물로 시딩하였다. 이 배양을 3 내지 4일 동안 지속하였고, 그 배양 조건은 30℃, 250 rpm, 액체 배지에 분당 0.5 ℓ의 공기 공급 및 0.5 bar의 과도한 압력이었으며 pH를 조절하지 않았다.
100 ℓ: 총 부피가 150 ℓ인 발효기 중의 G52 배지 90 ℓ를 20 ℓ의 중간 배양물 중 10 ℓ로 시딩하였다. 이 배양을 3 내지 4일 동안 지속하였고, 그 배양 조건은 30℃, 150 rpm, 액체 배지에 분당 0.5 ℓ의 공기 공급 및 0.5 bar의 과도한 압력이었으며 pH를 조절하지 않았다.
주요 배양, 10 ℓ, 100 ℓ 또는 500 ℓ:
10 ℓ: 1B12 배지 10 ℓ에 대한 배지 물질을 7 ℓ의 물 중에서 멸균하고 나서, 1 ℓ의 멸균된 10% 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 용액을 가한 후, 20 ℓ의 중간 배양물 중 2 ℓ로 시딩하였다. 주요 배양 시간은 6 내지 7일이었고, 그 배양 조건은 30℃, 250 rpm, 액체 배지에 분당 0.5 ℓ의 공기 공급 및 0.5 bar의 과도한 압력이었으며, H2SO4 또는 KOH로 pH를 7.6±0.5로 조절 (즉, pH 7.1 및 8.1 사이에서는 조절하지 않음)하였다.
100 ℓ: 1B12 배지 100 ℓ에 대한 배지 물질을 70 ℓ의 물 중에서 멸균하고 나서, 10 ℓ의 멸균된 10% 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 용액을 가한 후, 20 ℓ의 중간 배양물로 시딩하였다. 주요 배양 시간은 6 내지 7일이었고, 그 배양 조건은 30℃, 200 rpm, 액체 배지에 분당 0.5 ℓ의 공기 공급 및 0.5 bar의 과도한 압력이었으며, H2SO4 또는 KOH로 pH를 7.6±0.5로 조절하였다. 100 ℓ 발효에 대한 일련의 시딩 모식도를 하기에 도시하였다.
500 ℓ: 1B12 배지 500 ℓ에 대한 배지 물질을 350 ℓ의 물 중에서 멸균하고 나서, 50 ℓ의 멸균된 10% 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 용액을 가한 후, 100 ℓ의 중간 배양물로 시딩하였다. 주요 배양 시간은 6 내지 7일이었고, 그 배양 조건은 30℃, 120 rpm, 액체 배지에 분당 0.5 ℓ의 공기 공급 및 0.5 bar의 과도한 압력이었으며, H2SO4 또는 KOH로 pH를 7.6±0.5로 조절하였다.
생성물 분석:
시료 준비:
50 ㎖의 시료를 2 ㎖의 폴리스티렌 수지 앰벌라이트 (Amberlite) XAD 16 (Rohm & Haas, Frankfurt, Germany)에 혼합하고 30℃에서 180 rpm으로 1시간 동안 교반하였다. 이후에 150 ㎛의 나일론 체를 사용하여 수지를 여과하고, 약간의 물로 세척한 후, 여과지와 함께 15 ㎖의 넝크 (Nunc) 튜브에 넣었다.
수지로부터 생성물의 용출:
여과지 및 수지에 10 ㎖의 이소프로판올 (>99%)을 가하였다. 그 후에, 밀봉된 튜브를 로타-믹서 (Rota-Mixer, Labinco BV, Netherlands) 중 상온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 2 ㎖의 액체를 원심분리하고, 피펫을 이용하여 상층액을 HPLC 튜브에 넣었다.
HPLC 분석:
컬럼: 워터스-시메트리 C18, 100×4 mm, 3.5 ㎛
WAT066220 + 예비 컬럼 3.9×20 mm
WAT054225
용매: A: 0.02% 인산
B: 아세토니트릴 (HPLC 등급)
구배: 41% B, 0 내지 7분
100% B, 7.2 내지 7.8분
41% B, 8 내지 12분
오븐 온도: 30℃
검출: 250 nm, UV-DAD 검출법
주입 부피: 10 ㎕
보유 시간: EpoA: 4.30분, EpoB: 5.38분
B: 수득된 에포틸론 농도에 대한 시클로덱스트린 및 시클로덱스트린 유도체 첨가의 효과:
시클로덱스트린은 상대적으로 중심 공극은 소수성이며 외부 표면은 친수성인 α-D-글루코피라노오스의 시클릭(α-1,4)-결합 올리고사카라이드이다.
예를 들면, α-시클로덱스트린(6), β-시클로덱스트린(7), γ-시클로덱스트린(8), δ-시클로덱스트린(9), ε-시클로덱스트린(10), ζ-시클로덱스트린(11), η-시클로덱스트린(12) 및 θ-시클로덱스트린(13) (괄호 안의 숫자는 분자당 포도당 단위의 수임)이 있다. 특히 δ-시클로덱스트린이 바람직하며, α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린 또는 이들의 혼합물도 바람직하다.
시클로덱스트린 유도체는 상기 시클로덱스트린, 특히 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린 또는 γ-시클로덱스트린의 1차 유도체로서, 이는 1개 이상의 또는 모든 히드록시기 (포도당 라디칼당 3)가 에테르화 또는 에스테르화 된다. 에테르는 1차 알킬 에테르로, 특히 저급 알킬 (예를 들면, 메틸 또는 에틸 에테르 및 프로필 또는 부틸 에테르); 아릴-히드록시알킬 에테르 (예를 들면, 페닐-히드록시-저급-알킬, 특히 페닐-히드록시에틸 에테르); 히드록시알킬 에테르, 특히 히드록시-저급-알킬 에테르 (특히, 2-히드록시에틸, 2-히드록시프로필과 같은 히드록시프로필 또는 2-히드록시부틸 에테르와 같은 히드록시-부틸); 카르복시알킬 에테르, 특히 카르복시-저급-알킬 에테르 (특히, 카르복시메틸 또는 카르복시에틸 에테르); 유도된 카르복시알킬 에테르, 특히 유도된 카르복시가 에테르화 또는 아미드화 카르복시 (1차 아미노카르보닐, 모노- 또는 디-저급-알킬-아미노카르보닐, 모르폴리노-, 피페리디노-, 피롤리디노- 또는 피페라지노-카르보닐, 또는 알킬옥시카르보닐), 특히 저급 알크옥시카르보닐-저급-알킬 에테르 (예를 들면, 메틸옥시-카르보닐-프로필 에테르 또는 에틸옥시-카르보닐-프로필 에테르)인 유도된 카르복시-저급-알킬 에테르; 술포알킬 에테르, 특히 술포부틸 에테르와 같은 술포-저급-알킬 에테르; 1개 이상의 OH기가 하기 화학식 Ⅱ의 라디칼로 에테르화된 시클로덱스트린; 1개 이상의 OH기가 하기 화학식 Ⅲ의 라디칼로 에테르화된 시클로덱스트린; 또는 글루코실-, 디글루코실-(G2-β-시클로덱스트린), 말토실- 또는 디-말토실-시클로덱스트린, 또는 N-아세틸글루코스아밀-, 글루코스아밀-, N-아세틸갈락토스아밀- 또는 갈락토스아밀-시클로덱스트린과 같이 에테르화 또는 다른 당 분자가 존재하는 아세탈인 분지형 시클로덱스트린이다.
-O-[알크-O-]n-H
상기 식에서, 알크는 알킬 (특히, 저급 알킬)이고, n은 2 내지 12 (바람직하게는 2 내지 5, 더욱 바람직하게는 2 또는 3임)로부터의 전체 수이다.
상기 식에서, R'은 수소, 히드록시, -O-(알크(-R)-O-)p-H 또는 -O-(알크(-R)-O-)q-CO-Y이고; 모든 경우에 알크는 알킬, 특히 저급 알킬이고; m, n, p, q 및 z는 1 내지 12 (바람직하게는 1 내지 5, 특히 1 내지 3임)로부터의 전체 수이며; Y는 OR1 또는 NR2R3 (여기서, R1, R2 및 R3 는 서로 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이거나, R2 및 R3가 연결 질소와 함께 혼합되어 모르폴리노, 피페리디노, 피롤리디노 또는 피페라지노가 됨)이다.
에스테르는 일차 알카노일 에스테르로, 특히 시클로덱스트린의 아세틸 에스테르와 같은 저급 알카노일 에스테르이다.
또한, 2종 이상의 상이한 상기 에테르기 및 에스테르기가 동시에 존재하는 시클로덱스트린을 갖을 수 있다.
또한, 2종 이상의 상기 시클로덱스트린 및(또는) 시클로덱스트린 유도체도 존재할 수 있다.
특히, 메틸-β-시클로덱스트린 또는 특히 2,6-디-O-메틸-β-시클로덱스트린, 또는 그의 히드록시 저급 알킬 에테르 (예를 들면, 2-히드록시프로필-α-, 2-히드록시프로필-β- 또는 2-히드록시프로필-γ-시클로덱스트린)와 같은 α-, β- 또는 γ-시클로덱스트린 또는 이들의 저급 알킬 에테르가 바람직하다.
시클로덱스트린 또는 시클로덱스트린 유도체는, 바람직하게는 0.02 내지 10 중량%(w/v)의 농도, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 5 중량%(w/v)의 농도, 특히 0.1 내지 4 (예를 들면, 0.1 내지 2) 중량%(w/v)의 농도로 배양 배지에 가해진다.
시클로덱스트린 또는 시클로덱스트린 유도체는 공지되어 있고, 알려진 방법 (US 3,459,731호, US 4,383,992호, US 4,535,152호, US 4,659,696호, EP 0 094 157호, EP 0 149 197호, EP 0 197 571호, EP 0 300 526호, EP 0 320 032호, EP 0 499 322호, EP 0 503 710호, EP 0 818 469호, WO 90/12035호, WO 91/11200호, WO 93/19061호, WO 95/08993호, WO 96/14090호, GB 2,189,245호, DE 3,118,218호, DE 3,317,064호, 및 시클로덱스트린 또는 시클로덱스트린 유도체의 합성에 관하여 이들에 언급된 참고문헌 뿐만 아니라, [T. Loftsson 및 M.E. Brewster (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodex-trins: Drug Solubilization and Stabilisation: Journal of Pharmaceutical Science 85 (10):1017-1025호] 및 [R.A. Rajewski 및 V.J. Stella(1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodex-trins: In Vivo Drug Delivery: Journal of Pharmaceutical Science 85 (11): 1142-1169)] 참조)에 의해 제조될 수도 있다.
본원에서 시험된 모든 시클로덱스트린 유도체는 플루카 (Fluka, Buchs, CH)사로부터 수득할 수 있다. 시험은 200 ㎖의 교반 플라스크 중에서 50 ㎖의 배양 부피로 수행하였다. 대조군으로서, 흡수 수지 앰벌라이트 XAD-16 (Rohm & Haas, Frankfurt, Germany)에 어떤 흡수체도 가하지 않은 것을 사용하였다. 5일 동안 배양한 후에, HPLC에 의해 하기와 같은 에포틸론 타이터 (titer)를 측정할 수 있었다.
가해진시클로덱스트린 주문번호 농도[% w/v]1 EpoA[mg/ℓ] EpoB[mg/ℓ]
앰벌라이트 XAD-16 (v/v)2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린2-히드록시프로필-α-시클로덱스트린2-히드록시프로필-α-시클로덱스트린2-히드록시프로필-α-시클로덱스트린β-시클로덱스트린β-시클로덱스트린β-시클로덱스트린β-시클로덱스트린β-시클로덱스트린메틸-β-시클로덱스트린메틸-β-시클로덱스트린메틸-β-시클로덱스트린2,6-디-O-메틸-β-시클로덱스트린2-히드록시프로필-γ-시클로덱스트린2-히드록시프로필-γ-시클로덱스트린2-히드록시프로필-γ-시클로덱스트린2-히드록시프로필-γ-시클로덱스트린2-히드록시프로필-γ-시클로덱스트린가하지 않음 56332""""56330""28707""""66292""3991556334"""" 2.0 (% v/v)0.10.51.02.05.00.51.05.00.10.51.02.05.00.51.02.01.00.10.51.02.05.0 9.22.44.74.74.71.71.21.22.51.63.64.84.81.10.8<0.3<0.3<0.30.30.91.12.65.00.5 3.81.73.33.44.10.51.21.22.31.32.53.72.90.4<0.3<0.3<0.3<0.3<0.30.80.70.71.10.5
1) 앰벌라이트 (% v/v)를 제외한 모든 %가 중량% (% w/v)이다.
사용된 농도에서 시험된 시클로덱스트린 중 극소수 (2,6-디-O-메틸-β-시클로덱스트린, 메틸-β-시클로덱스트린)만이 에포틸론 생성에 대해 효과가 없거나 음성 효과가 나타났다.
실시예에서, 1 내지 2%의 2,6-디-O-메틸-β-시클로덱스트린 및 메틸-β-시클로덱스트린은 시클로덱스트린을 사용하지 않은 경우에 비해 6 내지 8배만큼 에포틸론 생성이 증가하였다.
C: 1% 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린을 사용한 10 ℓ 발효:
15 ℓ의 유리 발효기에서 발효를 수행하였다. 배지는 바커 케미(Wacker Chemie, Munich, Germany)사로부터 입수한 10 g/ℓ의 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린을 함유하고 있었다. 발효의 진행을 표 3에 도시하였다. 6일 후에 발효를 종결하고, 연구를 수행하였다.
10 ℓ 발효의 진행
배양 시간 [일] 에포틸론 A [mg/ℓ] 에포틸론 B [mg/ℓ]
0 0 0
1 0 0
2 0.5 0.3
3 1.8 2.5
4 3.0 5.1
5 3.7 5.9
6 3.6 5.7
D: 1% 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린을 사용한 100 ℓ 발효:
150 ℓ의 발효기에서 발효를 수행하였다. 배지는 10 g/ℓ의 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린을 함유하고 있었다. 발효의 진행을 표 4에 도시하였다. 7일 후에 발효물을 수획하여 연구를 수행하였다.
100 ℓ 발효의 진행
배양 시간 [일] 에포틸론 A [mg/ℓ] 에포틸론 B [mg/ℓ]
0 0 0
1 0 0
2 0.3 0
3 0.9 1.1
4 1.5 2.3
5 1.6 3.3
6 1.8 3.7
7 1.8 3.5
E: 1% 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린을 사용한 500 ℓ 발효:
750 ℓ의 발효기에서 발효를 수행하였다. 배지는 10 g/ℓ의 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린을 함유하고 있었다. 발효의 진행을 표 5에 도시하였다. 7일 후에 발효물을 수획하여 연구를 수행하였다.
100 ℓ 발효의 진행
배양 시간 [일] 에포틸론 A [mg/ℓ] 에포틸론 B [mg/ℓ]
0 0 0
1 0 0
2 0 0
3 0.6 0.6
4 1.7 2.2
5 3.1 4.5
6 3.1 5.1
F: 비교 실시예 - 흡수체를 사용하지 않은 10 ℓ 발효:
15 ℓ의 유리 발효기에서 발효를 수행하였다. 배지는 어떤 덱스트린 또는 기타 흡수체도 함유하지 않았다. 발효의 진행을 표 6에 도시하였다. 배양물을 회수하지 않고 연구를 수행하였다.
흡수체가 없는 10 ℓ 발효의 진행
배양 시간 [일] 에포틸론 A [mg/ℓ] 에포틸론 B [mg/ℓ]
0 0 0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0.7 0.7
5 0.7 1.0
6 0.8 1.3
G: 에포틸론의 연구 - 500 ℓ 주요 배양물로부터의 단리:
실시예 2D의 500 ℓ 주요 배양물로부터 수획된 부피는 450 ℓ였으며, 이를 웨스트팔리아 투명화 분리기 (Westfalia clarifying separator) 타입 SA-20-6 (rpm=6500)를 이용하여 액상 (원심분리 + 세정수=650 ℓ) 및 고상 (세포=약 15 kg)으로 분리하였다. 에포틸론은 주로 원심분리된 부분에서 발견되었다. 원심분리된 세포 펄프는 15% 미만의 에포틸론 부분을 함유하는 것으로 측정되었지만, 이를 추가로 가공하지는 않았다. 이어서, 650 ℓ의 원심분리물을 4000 ℓ의 교반 용기에 넣고, 10 ℓ의 앰벌라이트 XAD-16 (원심분리물:수지 부피=65:1)를 넣으면서 교반하였다. 약 2시간 동안 접촉시킨 후에, 수지를 헤인 오버플로우 (Heine overflow) 원심분리기 (40 ℓ의 용기 용량, rpm=2800)에서 원심분리하였다. 수지를 원심분리기에서 꺼낸 후 10 내지 15 ℓ의 탈이온수로 세척하였다. 30 ℓ의 유리 교반 용기에서 30 ℓ의 이소프로판올로 30분 동안 교반하는 과정을 2회 수행하여 흡수체에서 흡수물을 떨어뜨렸다. 흡입 필터를 사용하여 수지로부터 이소프로판올상을 분리하였다. 이어서, 진공-조작 순환 증발기 (vacuum-operated circulating evaporator, Schmid-Verdampfer)에서 혼합된 이소프로판올상에 물을 가하고, 결과의 수상 약 10 ℓ를 10 ℓ의 에틸 아세테이트로 3회 추출하여 이소프로판올을 제거하였다. 추출은 30 ℓ의 유리 교반기에서 수행하였다. 진공-조작 순환 증발기 (Schmid-Verdampfer)에서 에틸 아세테이트 추출물을 3 내지 5 ℓ로 농축시키고, 이후에 진공하의 회전 증발기 (rotary evaporator, Buechi형)에서 건조시켰다. 에틸 아세테이트 추출물을 500 ㎖의 메탄올에 용해시키고, 중첩 (folded) 필터로 여과하여 용해되지 않은 부분을 제거한 후, 이 용액을 10 kg의 세파덱스 (Sephadex) LH 20 컬럼 (Pharmacia, uppsala, Sweden)(컬럼 직경은 20 cm이며, 충전 수준은 약 1.2 m임)에 가하였다. 용출액으로 메탄올을 사용하여 용출하였다. 에포틸론 A 및 B는 주로 분획 21 내지 23 (분획의 크기는 1 ℓ임)에 존재하였다. 진공하의 회전 증발기 (총 중량은 9.0 g임)에서 이 분획들을 농축하여 건조시켰다. 이 세파덱스 피크 분획 (9.0 g)을 아세토니트릴, 물 및 염화에틸렌이 50 대 40 대 2의 혼합물 92 ㎖에 용해시키고, 중첩 필터를 통해 이 용액을 여과시킨 후 RP 컬럼 (장치 Prepbar 200, Merck; 2.0 kg LiChrospher RP-18 Merck, 과립 크기 12 ㎛, 컬럼 직경 10 cm, 충전 수준 42 cm; Merck, Darmstadt, Germany)에 가하였다. 아세토니트릴 및 물이 3 대 7인 혼합물로 용출 (유속=500 ㎖/분; 에포틸론 A의 보유 시간=약 51-59분; 에포틸론 B의 보유 시간=약 60-69분)하였다. UV 검출기로 250 nm에서 분획을 모니터하였다. 이 분획들을 진공하의 뷔치-로타베이포 (Buechi-Rotavapor) 회전 증발기 상에서 농축하여 건조시켰다. 에포틸론 A 피크 분획의 중량은 700 mg이었고, HPLC (외부 표준)에 따르면 그 함량은 75.1%이었다. 에포틸론 B 피크 분획의 중량은 1980 mg이었고, HPLC (외부 표준)에 따르면 그 함량은 86.6%이었다. 결국, 에포틸론 A 분획 (700 mg)이 5 ml의 에틸 아세테이트:톨루엔=2:3인 용매로부터 결정화되어, 170 mg의 순수한 에포틸론 A 결정을 산출하였다 [HPLC에 따른 함량 (면적의 %)=94.3%]. 에포틸론 B 분획 (1980 mg)은 18 ml의 메탄올로부터 결졍화되어, 1440 mg의 순수한 에포틸론 B 결정을 산출하였다 [HPLC에 따른 함량 (면적의 %)=99.2%]. 융점 (에포틸론 B)은 예를 들면, 124-125℃이고, 에포틸론 B에 대한 1H NMR 데이타 (500 MHz-NMR, 용매: DMSO-d6, TMS에 대한 상대적인 화학적 이동 δ(ppm), s=단일 피크, d=이중 피크 분열, m=다중 피크 분열)는 하기와 같다.
δ (피크 분열 정도) 정수 (H의 수)
7.34 (s) 1
6.50 (s) 1
5.28 (d) 1
5.08 (d) 1
4.46 (d) 1
4.08 (m) 1
3.47 (m) 1
3.11 (m) 1
2.83 (dd) 1
2.64 (s) 3
2.36 (m) 2
2.09 (s) 3
2.04 (m) 1
1.83 (m) 1
1.16 (m) 1
1.47 - 1.24 (m) 4
1.18 (s) 6
1.13 (m) 2
1.06 (d) 3
0.89 (d+s, 중복) 6
합계 = 41
<실시예 15> 재조합 생성된 에포틸론의 의학적 용도
에포틸론을 포함하는 제약 제제 또는 조성물은 예를 들면, 다양한 인간 충실성 종양과 같은 암 질환의 치료에 사용된다. 이러한 항암 제형은 제약상 적합한 1종 이상의 유기 또는 무기, 액체 또는 고체 담체 물질과 함께 활성량의 에포틸론을 포함한다. 이러한 제형은 예를 들면, 장내 투여, 비강 투여, 직장 투여, 구강 투여 또는 비구강 투여, 특히 근육내 투여 또는 정맥내 투여로 전달될 수 있다. 활성 성분의 투여량은 환자의 체중, 연령, 및 물리학적 약물동력학적 조건에 따라 좌우되며, 추가로 전달 방법에 따라 좌우된다. 에포틸론은 탁솔의 생물학적 효과를 모방하기 때문에, 에포틸론은 암의 치료를 위한 조성물 및 방법에 있어서 탁솔을 대체할 수 있다. 이는 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제5,496,804호, 동 제5,565,478호 및 동 제5,641,803호를 참조할 수 있다.
예를 들면, 치료용 에포틸론 B는 무색 투명한 정맥내 투여용인 1 mg/㎖의 농축액으로서 제형화된 2 ㎖의 유리 바이알에 제공될 수 있다. 이 물질은 폴리에틸렌 글리콜 300 (PEG 300) 중에 제형화하고 0.9% 염화나트륨 주입액 (USP) 50 또는 100 ㎖에 희석하여, 관주용 약물의 바람직한 최종 농도를 수득한다. 이 약물은 21일에 1회 30분 정맥내 관주 (3주에 1회 치료)로서 6회 반복 투여하거나, 7일에 1회 30분 정맥내 관주 (주 1회 치료)로서 투여한다.
주 1회 치료시 투여량은 통상 약 0.1 내지 약 6 mg/m2이며, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 5 mg/m2, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 약 3 mg/m2, 더더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1.7 mg/m2, 가장 바람직하게는 약 0.3 내지 약 1 mg/m2이다. 3주에 1회 치료시 (3주마다 치료 또는 매 세째 주에 치료) 투여량은 약 0.3 내지 약 18 mg/m2이며, 바람직하게는 약 0.3 내지 약 15 mg/m2, 더욱 바람직하게는 약 0.3 내지 약 12 mg/m2, 더더욱 바람직하게는 약 0.3 내지 약 7.5 mg/m2, 이보다 더 바람직하게는 약 0.3 내지 약 5 mg/m2, 가장 바람직하게는 약 1.0 내지 약 3.0 mg/m2이다. 이 투여량은 2 내지 180분 동안, 바람직하게는 2 내지 120분 동안, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 30분 동안, 가장 바람직하게는 약 10 내지 약 30분 (예를 들면, 약 30분) 동안에 인간에게 정맥내 (i.v.) 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명이 그의 구체적인 실시양태를 참조로 설명되었지만, 다양한 변형, 변화 및 실시양태가 가능하며, 따라서 그러한 모든 변형, 변화 및 실시양태는 본 발명의 정신 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
<110> Novartis AG <120> GENES FOR THE BIOSYNTHESIS OF EPOTHILONES <130> 4-30582A <140> <141> <160> 30 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 68750 <212> DNA <213> Sorangium cellulosum <400> 1 aagcttcgct cgacgccctc ttcgcccgcg ccacctctgc ccgtgtgctc gatgatggcc 60 acggccgggc cacggagcgg catgtgctcg ccgaggcgcg cgggatcgag gacctccgcg 120 ccctccgaga gcacctccgc atccaggaag gggggccgtc ctttcactgc atgtgcctcg 180 gcgacctgac ggtggagctc ctcgcgcacg accagcccct cgcgtccatc agcttccacc 240 atgcccgcag cctgaggcac cccgactgga cctcggacgc gatgctcgtc gacggccccg 300 cgctcgtccg gtggctcgcc gcgcgcggcg cgccgggtcc cctccgcgag tacgaagagg 360 agcgcgagcg agcccgaacc gcgcaggagg cgaggcgcct gtggctcgcg gccgcgccgc 420 cctgcttcgc gcccgatctg ccccgcttcg aggacgacgc caacgggctg ccgctcggcc 480 cgatgtcgcc tgaagtcgcc gaggccgagc ggcgcctccg cgcctcgtac gcgactcctg 540 agctcgcctg tgccgcgctg ctcgcctggc tcgggacggg cgcgggtccc tggtccggat 600 atcccgccta cgagatgctg ccagagaatc tgctcctcgg gtttggcctc ccgaccgcga 660 tcgccgcggc ctccgcgccc ggcacatcgg 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tcgcagggcc atcctcgggg 1560 tcgacaagcg caccggcgta gagcccatcg tcctcgcgga gacgcgccat cccccggcgc 1620 acgtcgtgtc cgaggaccgg gacatcttcg cgcttaccgg acagcccgac tcccgcgact 1680 ggcacgtcga gcacatccgc tccggcgcct ccaccgtcgt ggccgactac cagcgccagc 1740 tatgggaccg ccctgacatg gtgctcaatc ggcgcggcct cttcttcacg acgaacgacc 1800 gcatcctgac gctcgcccgc agctgacatc gctcgacgcc gggccgctca tcgagggcgc 1860 ccggaccgag ctggcgaccc gccgctggcg ggccgcagct catgccgatt cggtggcgac 1920 gtagacgctg cgccagaaac gctcgagagc ccccgagaac aggaagccgg cggattgtgt 1980 catcacgatc ccgatcagct cgcggcccgg atcattgatc caggacgtcc cgaacccgcc 2040 gtcccaccca tagcgcccgg gcacctccga gaccgcgtcc ggcgccgtga ccacggccat 2100 cccataaccc cagccgtgcg tctcgaagaa gcccgggaaa aacgaggacg ccgccttctg 2160 ggccggcgtg aggtgatcgg ccgtcatctc gcgcaccgag gcggcgctca agagccgccg 2220 gccctcgtgc acaccgccgt tcatgagcat gcgcgcgaac aggaggtagt cgtccaccgt 2280 cgacacgagc ccggcggcgc ccgaagggaa cgccggcggg ctggcatagg cgctctcggc 2340 cccgtcgcga tccatgcgcg tcttctcccc cgtctgctcg tcggtgaagt aaccgcagcc 2400 cgcgaaccga gcgagcttgt ccgccgggac gtgaaagtcg gtgtcccgca tcccgagcgg 2460 cgcgaggatg cgctcgcgca cgaacgcatc gaagccctgg tcggccgcgc gccccacgag 2520 caccccctgc accaggctcc ccgtgttgta catccactgc gcccccggct gatgcatgag 2580 cggcagcgtc ccgagccgcc ggatccactc gtctggcccg tgcggcgtca tcggcaccgg 2640 ctgcgcgttg acgagcccga gctcgtcgat ggcccgctgg atcggcgacg atgcgtcgaa 2700 cgagattccg aagcccatcg tgaacgtcat caggtcgcgc accgtgatcg gccgctccgc 2760 gggcaccgtc tcgtcgatcg gaccatcgat gcgcgccagc accttccggt tcgcgagctc 2820 cggcaaccat cggtcgacgg gggagtcgag gtcgagcttg ccttcctcga cgagcatcat 2880 caccgccgtc gcggtgaccg ccttcgtcat cgaggcgatc cggaagatcg tgtcccgccg 2940 catgggcgcg ctgccgccga gctcggtcac gcccaccgcg tccacgtgca cgtcgtcgcc 3000 gcgcgcgacc agccagaccg ctcccggcat ctgccccgcc gccacctccg ccgccatcac 3060 ctcgcgcgcg ggcgccagcg cgccggcccc cgcgtcctgc cctggctgcc cctcctcctc 3120 ggccccaccc aacgcgcacc ccggcgccgc cacgctgatc aaagctccca taaactcccg 3180 ccttctcatg accgtcgatg cctctccgag cgggggcgcc 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ggcggcggct cacccacctc 4080 gcgatgcgct gggtggccga cgcgacgcgc gtctccaagg gacaggtgtc gctcgtcctc 4140 gtcctcacgt tcctggccgc ggcgctgacg cagcggctcg gcctgcaccc gctgctcggc 4200 gcgttcgcgc tcggcgtgct gctcaacagc gctcctcgca ccaaccgccc tctcctcgac 4260 ggcgtgcaga cgctcgtggc gggcctcttc gcgcctgtgt tcttcgtcct cgcgggcatg 4320 cgcgtcgacg tgtcgcagct gcgcacgccg gcggcgtggg ggacggtcgc gttgctgctg 4380 gcgaccgcga cggcggcgaa ggtcgtcccc gccgcgctcg gcgcgcggct cggcgggctc 4440 aggggcagcg aggcggcgct cgtggcggtg ggcctgaaca tgaagggcgg cacggacctc 4500 atcgtcgcga tcgtcggcgt cgagctcggg ctcctctcca acgaggctta tacgatgtac 4560 gccgtcgtcg cgctggtcac ggtgaccgcc tcacccgcgc tcctcatctg gctcgagaaa 4620 agggcgcctc cgacgcagga ggagtcggct cgcctcgagc gcgaggaggc cgcgaggcgc 4680 gcgtacatcc ccggggtcga gcggatcctc gtcccgatcg tggcgcacgc cctgcccggg 4740 ttcgccacgg acatcgtgga gagcatcgtc gcctccaagc gaaagctcgg cgagacggtc 4800 gacatcacgg agctctccgt ggagcagcag gcgcccggcc catcgcgcgc cgcgggggag 4860 gcgagccggg ggctcgcgag gctcggcgcg cgcctccgcg 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gatcggctcg ggttcggtca 5760 gatcgttgaa ccggacgtgc cgggtgcgcc tcgctggaac ggtcacccgg taaggcccgg 5820 cggggtcgcg gtcgctgaag taaacggtga tggcgacctg cgcgtcccgg tccgacgcat 5880 tcaacaggca ggccgtctca tggctcgtca tctgcggctc aggtccgttg ctcccgcctg 5940 ggatgtagcc ctctgcgatt gcacagcgcg tccgcccgat cggcttgtcc atgtgtcctc 6000 cctcctggct cctctttggc agcctccctc tgctgtccag gagcgatggc ctcttcgctc 6060 gacgcgctcg gggatccatg gctgaggatc ctcgccgagc gctccctgcc gaccggcgcg 6120 ccgagcgccg acgggctttg aaagcgcgcg accggccagc ccggacgcgg gcccgagagg 6180 gacagtgggt ccgccgtgaa gcagagaggc gatcgaggtg gtgagatgaa acacgtcgac 6240 acgggccgac gattcggccg ccggataggg cacacgctcg gtcttctcgc gagcatggcg 6300 ctcgccggct gcggcggtcc gagcgagaaa accgtgcagg gcacgcggct cgcgcccggc 6360 gccgatgcgc gcgtcaccgc cgacgtcgac cccgacgccg cgaccacgcg gctggcggtg 6420 gacgtcgttc acctctcgcc gcccgagcgg ctcgaggccg gcagcgagcg gttcgtcgtc 6480 tggcagcgtc cgagccccga gtccccgtgg cgacgggtcg gagtgctcga ctacaatgct 6540 gacagccgaa gaggcaagct ggccgagacg accgtgccgt atgccaactt cgagctgctc 6600 atcaccgccg agaagcagag cagccctcag tcgccatcgt ctgccgccgt catcgggccg 6660 acgtctgtcg ggtgacatcg cgctatcagc agcgctgagc ccgccagcag gccccagggc 6720 cctgcctcga tggccttccc catcacccct gcgcactcct ccagcgacgg ccgcgcagcg 6780 acggccgcgt ccaagcaacc gccgtgccgg cgcggctcca cgcgcgcgac aggcgagcgt 6840 cctggcgcgg cctgcgcatc gctggaagga tcggcggagc atggatagag aatcgaggat 6900 cgcgatcttt gttgccatcg cagccaacgt ggcgatcgcg gcggtcaagt tcatcgccgc 6960 cgccgtgacc ggcagctcgg cgaggcgttt gccgacttcg gcggcgtccc gcgcgtgctg 7020 ctctacgaca acctcaagag cgccgtcgtc gagcgccacg gcgacgcgat ccggttccac 7080 cccacgctgc tggctctgtc ggcgcattac cgcttcgagc cgcgccccgt cgccgtcgcc 7140 cgcggcaacg agaagggccg cgtccagcgc gccatcacgg cgtggacgac atggcgcgga 7200 aacgtcgtcg taaccgccca gcaatgtcat gggaatggcc ccttgaaatg gccccttgag 7260 ggggctggcc ggggtcgacg atatcgcgcg atctccccgt caattcccga tggtaaaaga 7320 aaaatttgtc atagatcgta agctgtgata gtggtctgtc ttacgttgcg tcttccgcac 7380 ctcgagcgag ttctctcgga taactttcaa tttttccgag 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Leu Arg Leu Ala Gln Ser Val Ala Ala Arg Arg Arg Asp 130 135 140 Pro Thr 145 <210> 18 <211> 288 <212> PRT <213> Sorangium cellulosum <400> 18 Val Thr Val Ser Ser Met Pro Arg Ser Trp Ser Ser Arg Val Arg Thr 1 5 10 15 Val Val Thr Ala Leu Gly Cys Ala Arg Arg Leu Ser Gly Ser Ile Ser 20 25 30 Arg Leu Arg Arg His Pro Glu Ala Gly Arg Ala Pro Arg Ser Arg Leu 35 40 45 Arg Ala Trp Arg Arg Leu Pro Gln His Ile Ser Ser Pro Trp Arg His 50 55 60 Leu Pro Pro Gly Ala Arg Val Gly Thr Ser Cys Pro Ala Asp Arg Arg 65 70 75 80 Ile Leu Pro Ser His Arg Thr Ala Asp Leu Gly Thr Ser Gly Gly Thr 85 90 95 Leu Val Ala Arg Met Ser Gly His Val Ala Arg Asn Pro His Ala Ala 100 105 110 Val Leu Val Gly Asp Gly Ser Ala Arg Gly Arg Arg Arg Leu Ser Asn 115 120 125 Arg Arg Ala Glu Arg Arg Val Ser Asp Val Thr Cys Arg Glu Gly Gly 130 135 140 Glu Ala Met Gln Lys Ile Ala Gly Lys Leu Val Val Gly Leu Ile Ser 145 150 155 160 Val Ser Gly Met Ser Leu Leu Ala Ala Cys Gly Gly Glu Lys Arg Ser 165 170 175 Gly Gly Glu Ala Gln Thr Pro Gly Gly Ala Gln Gly Glu Ala Pro Val 180 185 190 Pro Val Gly Ser Ala Val Asp Ser Ile Val Ala Ala Arg Cys Asp Arg 195 200 205 Glu Ala Arg Cys Asn Asn Ile Gly Gln Asp Arg Glu Tyr Ser Ser Lys 210 215 220 Asp Ala Cys Ser Asn Lys Ile Arg Ser Glu Trp Arg Asp Glu Leu Thr 225 230 235 240 Phe Gly Glu Cys Pro Gly Gly Ile Asp Ala Lys Gln Leu Asn Glu Cys 245 250 255 Leu Glu Gly Ile Arg Asn Glu Gly Cys Gly Asn Pro Phe Asp Thr Leu 260 265 270 Gly Arg Val Val Ala Cys Arg Ser Ser Asp Leu Cys Arg Asp Ala Arg 275 280 285 <210> 19 <211> 288 <212> PRT <213> Sorangium cellulosum <400> 19 Val Thr Val Ser Ser Met Pro Arg Ser Trp Ser Ser Arg Val Arg Thr 1 5 10 15 Val Val Thr Ala Leu Gly Cys Ala Arg Arg Leu Ser Gly Ser Ile Ser 20 25 30 Arg Leu Arg Arg His Pro Glu Ala Gly Arg Ala Pro Arg Ser Arg Leu 35 40 45 Arg Ala Trp Arg Arg Leu Pro Gln His Ile Ser Ser Pro Trp Arg His 50 55 60 Leu Pro Pro Gly Ala Arg Val Gly Thr Ser Cys Pro Ala Asp Arg Arg 65 70 75 80 Ile Leu Pro Ser His Arg Thr Ala Asp Leu Gly Thr Ser Gly Gly Thr 85 90 95 Leu Val Ala Arg Met Ser Gly His Val Ala Arg Asn Pro His Ala Ala 100 105 110 Val Leu Val Gly Asp Gly Ser Ala Arg Gly Arg Arg Arg Leu Ser Asn 115 120 125 Arg Arg Ala Glu Arg Arg Val Ser Asp Val Thr Cys Arg Glu Gly Gly 130 135 140 Glu Ala Met Gln Lys Ile Ala Gly Lys Leu Val Val Gly Leu Ile Ser 145 150 155 160 Val Ser Gly Met Ser Leu Leu Ala Ala Cys Gly Gly Glu Lys Arg Ser 165 170 175 Gly Gly Glu Ala Gln Thr Pro Gly Gly Ala Gln Gly Glu Ala Pro Val 180 185 190 Pro Val Gly Ser Ala Val Asp Ser Ile Val Ala Ala Arg Cys Asp Arg 195 200 205 Glu Ala Arg Cys Asn Asn Ile Gly Gln Asp Arg Glu Tyr Ser Ser Lys 210 215 220 Asp Ala Cys Ser Asn Lys Ile Arg Ser Glu Trp Arg Asp Glu Leu Thr 225 230 235 240 Phe Gly Glu Cys Pro Gly Gly Ile Asp Ala Lys Gln Leu Asn Glu Cys 245 250 255 Leu Glu Gly Ile Arg Asn Glu Gly Cys Gly Asn Pro Phe Asp Thr Leu 260 265 270 Gly Arg Val Val Ala Cys Arg Ser Ser Asp Leu Cys Arg Asp Ala Arg 275 280 285 <210> 20 <211> 155 <212> PRT <213> Sorangium cellulosum <400> 20 Met Asp Pro Arg Ala Arg Arg Glu Lys Arg Pro Ser Leu Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Gly Arg Gln Pro Lys Arg Ser Gln Gln Gly Gly His Met Glu Lys 20 25 30 Pro Ile Gly Arg Thr Arg Trp Ala Ile Ala Glu Gly Tyr Ile Pro Gly 35 40 45 Arg Ser Asn Gly Pro Glu Pro Gln Met Thr Ser His Glu Thr Ala Cys 50 55 60 Leu Leu Asn Ala Ser Asp Arg Asp Ala Gln Val Ala Ile Thr Val Tyr 65 70 75 80 Phe Ser Asp Arg Asp Pro Ala Gly Pro Tyr Arg Val Thr Val Pro Ala 85 90 95 Arg Arg Thr Arg His Val Arg Phe Asn Asp Leu Thr Glu Pro Glu Pro 100 105 110 Ile Pro Arg Asp Thr Asp Tyr Ala Ser Val Ile Glu Ser Asp Val Pro 115 120 125 Ile Val Val Gln His Thr Arg Leu Asp Ser Arg Gln Ala Glu Asn Ala 130 135 140 Leu Ile Ser Thr Ile Ala Tyr Thr Asp Arg Glu 145 150 155 <210> 21 <211> 156 <212> PRT <213> Sorangium cellulosum <400> 21 Val Arg Arg Ser Arg Trp Gln Met Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg 1 5 10 15 Val Gly Arg Arg Ile Gly Leu Thr Leu Gly Leu Leu Ala Ser Met Ala 20 25 30 Leu Ala Gly Cys Gly Gly Pro Ser Glu Lys Ile Val Gln Gly Thr Arg 35 40 45 Leu Ala Pro Gly Ala Asp Ala His Val Ala Ala Asp Val Asp Pro Asp 50 55 60 Ala Ala Thr Thr Arg Leu Ala Val Asp Val Val His Leu Ser Pro Pro 65 70 75 80 Glu Arg Ile Glu Ala Gly Ser Glu Arg Phe Val Val Trp Gln Arg Pro 85 90 95 Ser Ser Glu Ser Pro Trp Gln Arg Val Gly Val Leu Asp Tyr Asn Ala 100 105 110 Ala Ser Arg Arg Gly Lys Leu Ala Glu Thr Thr Val Pro His Ala Asn 115 120 125 Phe Glu Leu Leu Ile Thr Val Glu Lys Gln Ser Ser Pro Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Ala Ala Val Ile Gly Pro Thr Ser Val Gly 145 150 155 <210> 22 <211> 305 <212> PRT <213> Sorangium cellulosum <400> 22 Met Glu Lys Glu Ser Arg Ile Ala Ile Tyr Gly Ala Ile Ala Ala Asn 1 5 10 15 Val Ala Ile Ala Ala Val Lys Phe Ile Ala Ala Ala Val Thr Gly Ser 20 25 30 Ser Ala Met Leu Ser Glu Gly Val His Ser Leu Val Asp Thr Ala Asp 35 40 45 Gly Leu Leu Leu Leu Leu Gly Lys His Arg Ser Ala Arg Pro Pro Asp 50 55 60 Ala Glu His Pro Phe Gly His Gly Lys Glu Leu Tyr Phe Trp Thr Leu 65 70 75 80 Ile Val Ala Ile Met Ile Phe Ala Ala Gly Gly Gly Val Ser Ile Tyr 85 90 95 Glu Gly Ile Leu His Leu Leu His Pro Arg Gln Ile Glu Asp Pro Thr 100 105 110 Trp Asn Tyr Val Val Leu Gly Ala Ala Ala Val Phe Glu Gly Thr Ser 115 120 125 Leu Ile Ile Ser Ile His Glu Phe Lys Lys Lys Asp Gly Gln Gly Tyr 130 135 140 Leu Ala Ala Met Arg Ser Ser Lys Asp Pro Thr Thr Phe Thr Ile Val 145 150 155 160 Leu Glu Asp Ser Ala Ala Leu Ala Gly Leu Thr Ile Ala Phe Leu Gly 165 170 175 Val Trp Leu Gly His Arg Leu Gly Asn Pro Tyr Leu Asp Gly Ala Ala 180 185 190 Ser Ile Gly Ile Gly Leu Val Leu Ala Ala Val Ala Val Phe Leu Ala 195 200 205 Ser Gln Ser Arg Gly Leu Leu Val Gly Glu Ser Ala Asp Arg Glu Leu 210 215 220 Leu Ala Ala Ile Arg Ala Leu Ala Ser Ala Asp Pro Gly Val Ser Ala 225 230 235 240 Val Gly Arg Pro Leu Thr Met His Phe Gly Pro His Glu Val Leu Val 245 250 255 Val Leu Arg Ile Glu Phe Asp Ala Ala Leu Thr Ala Ser Gly Val Ala 260 265 270 Glu Ala Ile Glu Arg Ile Glu Thr Arg Ile Arg Ser Glu Arg Pro Asp 275 280 285 Val Lys His Ile Tyr Val Glu Ala Arg Ser Leu His Gln Arg Ala Arg 290 295 300 Ala 305 <210> 23 <211> 135 <212> PRT <213> Sorangium cellulosum <400> 23 Val Gln Thr Ser Ser Phe Asp Ala Arg Tyr Ala Gly Cys Lys Ser Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ile Ala Arg Ser Gly Ser Ala Gly Ala Arg Ala Gly Arg Ala 20 25 30 His Glu Gly Ala Ala Ser Ala Gly Phe Glu Gly Gly Asp Val Met Arg 35 40 45 Lys Ala Arg Ala His Gly Ala Met Leu Gly Gly Arg Asp Asp Gly Trp 50 55 60 Arg Arg Gly Leu Pro Gly Ala Gly Ala Leu Arg Ala Ala Leu Gln Arg 65 70 75 80 Gly Arg Ser Arg Asp Leu Ala Arg Arg Arg Leu Ile Ala Ser Val Ser 85 90 95 Leu Ala Gly Gly Ala Ser Met Ala Val Val Ser Leu Phe Gln Leu Gly 100 105 110 Ile Ile Glu Arg Leu Pro Asp Pro Pro Leu Pro Gly Phe Asp Ser Ala 115 120 125 Lys Val Thr Ser Ser Asp Ile 130 135 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: universal reverse primer <400> 24 ggaaacagct atgaccatg 19 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: universal forward primer <400> 25 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer NH24 end "B" <400> 26 gtgactggcg cctggaatct gcatgagc 28 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer NH2 end "A" <400> 27 agcgggagct tgctagacat tctgtttc 28 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer NH2 end "B" <400> 28 gacgcgcctc gggcagcgcc ccaa 24 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer pEPO15-NH6 end "B" <400> 29 caccgaagcg tcgatctggt ccatc 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer pEPO15H2.7 end "A" <400> 30 cggtcagatc gacgacgggc tttcc 25

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  94. (i) 서열 2의 아미노산 11-437, 서열 4의 아미노산 7-432, 서열 5의 아미노산 39-457, 서열 5의 아미노산 1524-1950, 서열 5의 아미노산 3024-3449, 서열 5의 아미노산 5103-5525, 서열 6의 아미노산 35-454, 서열 6의 아미노산 1522-1946 및 서열 7의 아미노산 32-450으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 β-케토아실-합성효소 도메인;
    (ii) 서열 2의 아미노산 543-864, 서열 4의 아미노산 539-859, 서열 5의 아미노산 563-884, 서열 5의 아미노산 2056-2377, 서열 5의 아미노산 3555-3876, 서열 5의 아미노산 5631-5951, 서열 6의 아미노산 561-881, 서열 6의 아미노산 2053-2373 및 서열 7의 아미노산 556-877로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 아실전이효소 도메인;
    (iii) 서열 2의 아미노산 974-1273, 서열 5의 아미노산 4433-4719, 서열 5의 아미노산 6542-6837 및 서열 7의 아미노산 1478-1790으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 에노일 환원효소 도메인;
    (iv) 서열 2의 아미노산 1314-1385, 서열 4의 아미노산 1722-1792, 서열 5의 아미노산 1434-1506, 서열 5의 아미노산 2932-3005, 서열 5의 아미노산 5010-5082, 서열 5의 아미노산 7140-7211, 서열 6의 아미노산 1430-1503, 서열 6의 아미노산 3673-3745 및 서열 7의 아미노산 2093-2164로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 아실 캐리어 단백질 도메인;
    (v) 서열 4의 아미노산 869-1037, 서열 5의 아미노산 3886-4048, 서열 5의 아미노산 5964-6132, 서열 6의 아미노산 2383-2551 및 서열 7의 아미노산 887-1051로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 탈수효소 도메인;
    (vi) 서열 4의 아미노산 1439-1684, 서열 5의 아미노산 1147-1399, 서열 5의 아미노산 2645-2895, 서열 5의 아미노산 4729-4974, 서열 5의 아미노산 6857-7101, 서열 6의 아미노산 1143-1393, 서열 6의 아미노산 3392-3636 및 서열 7의 아미노산 1810-2055로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 β-케토환원효소 도메인;
    (vii) 서열 6의 아미노산 2671-3045의 아미노산 서열을 갖는 메틸전이효소 도메인;
    (viii) 서열 7의 아미노산 2165-2439의 아미노산 서열을 갖는 티오에스테라제 도메인; 및
    (ix) 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 비-리보솜 펩티드 합성효소
    로 이루어진 군에서 선택되는, 에포틸론 생합성에 관여하는 폴리펩티드 하나 이상을 코딩하는 단리된 핵산.
  95. 삭제
  96. 제94항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 믹소박테리움 (myxobacterium)으로부터 단리된 것인 단리된 핵산 분자.
  97. 제96항에 있어서, 상기 믹소박테리움이 소란지움 셀룰로숨 (Sorangium cellulosum)인 단리된 핵산 분자.
  98. 제94항에 따른 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터 서열을 포함하는 키메라 유전자.
  99. 제98항에 따른 키메라 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  100. 제98항에 따른 키메라 유전자를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  101. 제94항에 따른 핵산 분자를 포함하는 Bac 클론.
  102. (i) 서열 2의 아미노산 11-437, 서열 4의 아미노산 7-432, 서열 5의 아미노산 39-457, 서열 5의 아미노산 1524-1950, 서열 5의 아미노산 3024-3449, 서열 5의 아미노산 5103-5525, 서열 6의 아미노산 35-454, 서열 6의 아미노산 1522-1946 및 서열 7의 아미노산 32-450으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 β-케토아실-합성효소 도메인;
    (ii) 서열 2의 아미노산 543-864, 서열 4의 아미노산 539-859, 서열 5의 아미노산 563-884, 서열 5의 아미노산 2056-2377, 서열 5의 아미노산 3555-3876, 서열 5의 아미노산 5631-5951, 서열 6의 아미노산 561-881, 서열 6의 아미노산 2053-2373 및 서열 7의 아미노산 556-877로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 아실전이효소 도메인;
    (iii) 서열 2의 아미노산 974-1273, 서열 5의 아미노산 4433-4719, 서열 5의 아미노산 6542-6837 및 서열 7의 아미노산 1478-1790으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 에노일 환원효소 도메인;
    (iv) 서열 2의 아미노산 1314-1385, 서열 4의 아미노산 1722-1792, 서열 5의 아미노산 1434-1506, 서열 5의 아미노산 2932-3005, 서열 5의 아미노산 5010-5082, 서열 5의 아미노산 7140-7211, 서열 6의 아미노산 1430-1503, 서열 6의 아미노산 3673-3745 및 서열 7의 아미노산 2093-2164로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 아실 캐리어 단백질 도메인;
    (v) 서열 4의 아미노산 869-1037, 서열 5의 아미노산 3886-4048, 서열 5의 아미노산 5964-6132, 서열 6의 아미노산 2383-2551 및 서열 7의 아미노산 887-1051로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 탈수효소 도메인;
    (vi) 서열 4의 아미노산 1439-1684, 서열 5의 아미노산 1147-1399, 서열 5의 아미노산 2645-2895, 서열 5의 아미노산 4729-4974, 서열 5의 아미노산 6857-7101, 서열 6의 아미노산 1143-1393, 서열 6의 아미노산 3392-3636 및 서열 7의 아미노산 1810-2055로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 β-케토환원효소 도메인;
    (vii) 서열 6의 아미노산 2671-3045의 아미노산 서열을 갖는 메틸전이효소 도메인;
    (viii) 서열 7의 아미노산 2165-2439의 아미노산 서열을 갖는 티오에스테라제 도메인; 또는
    (ix) 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 비-리보솜 펩티드 합성효소
    를 갖는, 에포틸론 생합성에 관여하는 단리된 폴리펩티드.
  103. (a) 제98항에 따른 키메라 유전자를 숙주에 도입하는 단계, 및
    (b) 숙주에서의 에포틸론 생합성을 위하여 상기 숙주를 배양하는 단계
    를 포함하는, 재조합 숙주에서 에포틸론의 발현 방법.
  104. (a) 제103항의 방법에 의해 재조합 숙주에서 에포틸론을 발현하는 단계, 및
    (b) 상기 재조합 숙주로부터 에포틸론을 추출하는 단계
    를 포함하는 에포틸론의 제조 방법.
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