CN100374566C - 用于epothilone生物合成的基因 - Google Patents
用于epothilone生物合成的基因 Download PDFInfo
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Abstract
由纤维堆囊菌分离得到编码epothilone生物合成必需的多肽的核酸分子。还公开了用经本发明的基因转化的重组宿主生产epothilone的方法。用这种方法生产的epothilone，足够用于它们的纯化和在药用制剂(诸如治疗癌症)中的使用。
Description
发明领域
本发明主要涉及聚酮化合物(polyketide)和用于合成它们的基因。特别的，本发明涉及从纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)中分离和鉴定生物合成epothilone A和B必需的新的聚酮化合物合酶和非核糖体肽合成酶基因。
发明背景
聚酮化合物是由二碳结构单元合成的化合物，其β-碳总是携带酮基，由此命名为聚酮化合物。这些化合物包括许多重要的抗生素、免疫抑制剂、癌症化疗剂、和其它具有广泛生物学特性的化合物。巨大的结构多样性源于聚酮化合物链的不同长度、(作为二碳结构单元的一部分或在聚酮化合物主链形成之后)引入的不同侧链、和这些基团的立体化学。酮基还可以被还原成羟基、烯酰基、或完全除去。每一轮二碳的加入是由叫做聚酮化合物合酶(polyketide synthase，PKS)的酶复合物以与脂肪酸生物合成相似的方式进行的。
已经分离得到并测序的聚酮化合物的生物合成基因与日俱增。例如，见美国专利号5,639,949、5,693,774、和5,716,849描述了用于soraphen生物合成的基因，所有这些此处引用作为参考。还可见Schupp等人，FEMS微生物学通讯(FEMS Microbiology Letters)159：201-207(1998)和WO98/07868(其中描述了用于利福霉素生物合成的基因)，和美国专利号5,876,991(其中描述了用于tylactone生物合成的基因，所有这些此处引用作为参考。编码的蛋白质通常分为两类：第一类和第二类。第一类蛋白质是多功能的，有多个进行不同酶步骤的催化结构域共价连接在一起(如用于红霉素、soraphen、利福霉素、和除虫菌素的PKS(MacNeil等人，工业微生物：基础和应用分子遗传学(Industrial Microorganisms：Basic and AppliedMolecular Genetics)，编辑：Baltz等人)，美国微生物学协会，华盛顿特区，pp.245-256(1993))；而第二类蛋白质是单功能的(Hutchinson等人，工业微生物：基础和应用分子遗传学，(编辑：Baltz等人)，美国微生物学协会，华盛顿特区，pp.203-216(1993))。
对于较简单的聚酮化合物诸如放线菌紫素(由天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)产生)，几轮二碳的加入在由一组PKS基因编码的PKS酶上重复进行。相反的，更复杂的化合物诸如红霉素和soraphen的合成涉及组织成模块的PKS酶，由此每个模块进行一轮二碳的加入(为了回顾，见Hopwood等人，工业微生物：基础和应用分子遗传学，(编辑：Baltz等人)，美国微生物学协会，华盛顿特区，pp.267-275(1993))。
复杂的聚酮化合物和次级代谢物通常可能包含氨基酸、而非简单的羧酸衍生的亚结构。这些结构单元的掺入由非核糖体多肽合成酶(non-ribosomal polypeptide synthetase，NRPS)完成。NRPS是组织成模块的多酶。每个模块负责一个氨基酸结构单元的加入(和额外的处理，如果需要)。NRPS通过形成氨酰腺苷酸激活氨基酸，并将激活的氨基酸捕获于肽基载体蛋白结构域的磷酸泛酰巯基乙胺辅基的硫醇基上。然后，NRPS通过立体异构化、N-甲基化、或环化(如果需要)来修饰氨基酸，并催化被酶结合的氨基酸之间肽键的形成。NRPS负责肽次级代谢物如环孢菌素的生物合成，可以如在雷帕霉素中提供聚酮化合物链终止单位，或如在耶尔森菌素(yersiniabactin)生物合成中与PKS形成混合系统。
Epothilone A和B是16元大环聚酮化合物，具有由细菌纤维堆囊菌菌株So ce90(Gerth等人，抗生素杂志(J.Antibiotics)49：560-563(1996)，此处引用作为参考)产生的酰基半胱氨酸衍生的起始单位。Epothilone A和B的结构是(其中R在epothilone A中表示氢，在epothilone B中表示甲基)：
epothilone具有窄的抗真菌谱，且在动物细胞培养物中尤其显示高细胞毒性(见Hfle等人，德国专利4138042(1993)，此处引用作为参考)。极其重要的是，epothilone在体内和在培养细胞中都模仿紫杉醇的生物学效应(Bollag等人，癌症研究(Cancer Research)55：2325-2333(1995)，此处引用作为参考)。稳定细胞微管的紫杉醇和泰索帝(taxotere)是对各种人实体瘤具有显著活性的癌症化疗剂(Rowinsky等人，国家癌症学会会刊(J.Natl.Cancer Inst.)83：1778-1781(1991))。竞争研究已经揭示了epothilone作为紫杉醇与微管结合的竞争抑制剂，与它们共有相同的微管结合位点和拥有与紫杉醇相似的微管亲和力的解释一致。然而，epothilone具有比紫杉醇显著的优势，因为对多药抗性细胞系epothilone的效力降低比紫杉醇低许多(Bollag等人(1995))。而且，与紫杉醇相比，较少的epothilone有效通过P-糖蛋白排出细胞(Gerth等人(1996))。此外，多种epothilone类似物已经被合成，如它们增强的诱导微管聚合和稳定的能力所示，具有比epothilone A或epothilone B更高的细胞毒性活性(WO98/25929，此处引用作为参考)。
尽管epothilone有希望作为抗癌药，目前这些化合物的产量限制了它们的商业潜力。这些化合物对于工业规模的化学合成过于复杂，所以必须通过发酵生产。用于粘细菌诸如纤维堆囊菌基因操作的技术描述于美国专利号5,686,295，此处引用作为参考。然而，纤维堆囊菌难以发酵而且epothilone的产量因此低。在更适合发酵的异源宿主中的epothilone重组生产可以解决当前的产量问题。然而，编码负责epothilone生物合成的多肽的基因至今还未分离得到。而且，产生epothilone的菌株，即So ce90，还产生至少一种其它的聚酮化合物spirangien，可能使分离专门负责epothilone生物合成的基因更加复杂。
因此，综上所述，本发明的一个目的是分离涉及epothilone生物合成的基因，特别是在堆囊粘菌/-多囊粘菌属的粘细菌，即纤维堆囊菌菌株So ce90中涉及epothilone A和B合成的基因。本发明的另一个目的是提供应用于抗癌制剂的epothilone的重组生产方法。
发明概述
为了促进上述和其它目的，本发明出乎意料的克服了上面提出的困难，首次提供了包含编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列的核酸分子。在优选的实施方案中，该核苷酸序列是从属于粘细菌目的物种，最优选纤维堆囊菌中分离的。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列，其中多肽包含与选自下组的氨基酸序列基本上相似的氨基酸序列：SEQID NO：2，SEQ ID NO：2的氨基酸11-437，SEQ ID NO：2的氨基酸543-864，SEQ ID NO：2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO：2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：3的氨基酸72-81，SEQID NO：3的氨基酸118-125，SEQ ID NO：3的氨基酸199-212，SEQID NO：3的氨基酸353-363，SEQ ID NO：3的氨基酸549-565，SEQID NO：3的氨基酸588-603，SEQ ID NO：3的氨基酸669-684，SEQID NO：3的氨基酸815-821，SEQ ID NO：3的氨基酸868-892，SEQID NO：3的氨基酸903-912，SEQ ID NO：3的氨基酸918-940，SEQID NO：3的氨基酸1268-1274，SEQ ID NO：3的氨基酸1285-1297，SEQ ID NO：3的氨基酸973-1256，SEQ ID NO：3的氨基酸1344-1351，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：4的氨基酸7-432，SEQ ID NO：4的氨基酸539-859，SEQ ID NO：4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO：4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO：4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：5的氨基酸39-457，SEQ ID NO：5的氨基酸563-884，SEQ ID NO：5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO：5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO：5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO：5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO：5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO：5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO：5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO：5的氨基酸3555-3876，SEQ ID NO：5的氨基酸3886-4048，SEQ IDNO：5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO：5的氨基酸4729-4974，SEQID NO：5的氨基酸5010-5082，SEQ ID NO：5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO：5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO：5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO：5的氨基酸6542-6837，SEQ ID NO：5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO：5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO：6，SEQID NO：6的氨基酸35-454，SEQ ID NO：6的氨基酸561-881，SEQ IDNO：6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO：6的氨基酸1430-1503，SEQID NO：6的氨基酸1522-1946，SEQ ID NO：6的氨基酸2053-2373，SEQ ID NO：6的氨基酸2383-2551，SEQ ID NO：6的氨基酸2671-3045，SEQ ID NO：6的氨基酸3392-3636，SEQ ID NO：6的氨基酸3673-3745，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：7的氨基酸32-450，SEQ IDNO：7的氨基酸556-877，SEQ ID NO：7的氨基酸887-1051，SEQ IDNO：7的氨基酸1478-1790，SEQ ID NO：7的氨基酸1810-2055，SEQID NO：7的氨基酸2093-2164，SEQ ID NO：7的氨基酸2165-2439，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，和SEQ ID NO：22。
在更优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列，其中该多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：2的氨基酸11-437，SEQ ID NO：2的氨基酸543-864，SEQ ID NO：2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO：2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：3的氨基酸72-81，SEQ ID NO：3的氨基酸118-125，SEQ ID NO：3的氨基酸199-212，SEQ ID NO：3的氨基酸353-363，SEQ ID NO：3的氨基酸549-565，SEQ ID NO：3的氨基酸588-603，SEQ ID NO：3的氨基酸669-684，SEQ ID NO：3的氨基酸815-821，SEQ ID NO：3的氨基酸868-892，SEQ ID NO：3的氨基酸903-912，SEQ ID NO：3的氨基酸918-940，SEQ ID NO：3的氨基酸1268-1274，SEQ ID NO：3的氨基酸1285-1297，SEQ ID NO：3的氨基酸973-1256，SEQ ID NO：3的氨基酸1344-1351，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：4的氨基酸7-432，SEQ ID NO：4的氨基酸539-859，SEQ ID NO：4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO：4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO：4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：5的氨基酸39-457，SEQ ID NO：5的氨基酸563-884，SEQ ID NO：5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO：5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO：5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO：5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO：5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO：5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO：5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO：5的氨基酸3555-3876，SEQ IDNO：5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO：5的氨基酸4433-4719，SEQID NO：5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO：5的氨基酸5010-5082，SEQ ID NO：5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO：5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO：5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO：5的氨基酸6542-6837，SEQ ID NO：5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO：5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：6的氨基酸35-454，SEQID NO：6的氨基酸561-881，SEQ ID NO：6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO：6的氨基酸1430-1503，SEQ ID NO：6的氨基酸1522-1946，SEQ ID NO：6的氨基酸2053-2373，SEQ ID NO：6的氨基酸2383-2551，SEQ ID NO：6的氨基酸2671-3045，SEQ ID NO：6的氨基酸3392-3636，SEQ ID NO：6的氨基酸3673-3745，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：7的氨基酸32-450，SEQ ID NO：7的氨基酸556-877，SEQ ID NO：7的氨基酸887-1051，SEQ ID NO：7的氨基酸1478-1790，SEQ ID NO：7的氨基酸1810-2055，SEQ ID NO：7的氨基酸2093-2164，SEQ ID NO：7的氨基酸2165-2439，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，和SEQ ID NO：22。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本上相似：SEQ ID NO：1的核苷酸1900-3171的互补序列，SEQ ID NO：1的核苷酸3415-5556，SEQ ID NO：1的核苷酸7610-11875，SEQ ID NO：1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO：1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO：1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO：1的核苷酸11549-11764，SEQ IDNO：1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO：1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO：1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO：1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO：1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO：1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO：1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO：1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO：1的核苷酸14313-14334，SEQID NO：1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO：1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO：1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO：1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO：1的核苷酸1 5724-15762，SEQ ID NO：1的核苷酸14788-15639，SEQ ID NO：1的核苷酸15901-15924，SEQ ID NO：1的核苷酸16251-21749，SEQ ID NO：1的核苷酸16269-17546，SEQID NO：1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO：1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO：1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO：1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO：1的核苷酸21746-43519，SEQ ID NO：1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO：1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO：1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO：1的核苷酸26045-26263，SEQID NO：1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO：1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO：1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO：1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO：1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO：1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO：1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO：1的核苷酸35042-35902，SEQID NO：1的核苷酸35930-36667，SEQID NO：1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO：1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO：1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO：1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO：1的核苷酸41369-42256，SEQ ID NO：1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO：1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO：1的核苷酸43524-54920，SEQ ID NO：1的核苷酸43626-44885，SEQID NO：1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO：1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO：1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO：1的核苷酸48087-49361，SEQ ID NO：1的核苷酸49680-50642，SEQ ID NO：1的核苷酸50670-51176，SEQ ID NO：1的核苷酸51534-52657，SEQ ID NO：1的核苷酸53697-54431，SEQ ID NO：1的核苷酸54540-54758，SEQID NO：1的核苷酸54935-62254，SEQ ID NO：1的核苷酸55028-56284，SEQ ID NO：1的核苷酸56600-57565，SEQ ID NO：1的核苷酸57593-58087，SEQ ID NO：1的核苷酸59366-60304，SEQ ID NO：1的核苷酸60362-61099，SEQ ID NO：1的核苷酸61211-61426，SEQ ID NO：1的核苷酸61427-62254，SEQ ID NO：1的核苷酸62369-63628，SEQID NO：1的核苷酸67334-68251，和SEQ ID NO：1的核苷酸1-68750。
在特别优选的实施方案中，本发明提供了包含编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO：1的核苷酸1900-3171的互补序列，SEQ ID NO：1的核苷酸3415-5556，SEQ ID NO：1的核苷酸7610-11875，SEQ ID NO：1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO：1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO：1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO：1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO：1的核苷酸11872-16104，SEQID NO：1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO：1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO：1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO：1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO：1的核苷酸1 3516-13566，SEQ ID NO：1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO：1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO：1的核苷酸14313-14334，SEQ ID NO：1的核苷酸14473-14547，SEQID NO：1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO：1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO：1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO：1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO：1的核苷酸14788-15639，SEQ ID NO：1的核苷酸15901-15924，SEQ ID NO：1的核苷酸16251-21749，SEQ ID NO：1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO：1的核苷酸17865-18827，SEQID NO：1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO：1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO：1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO：1的核苷酸21746-43519，SEQ ID NO：1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO：1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO：1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO：1的核苷酸26045-26263，SEQ ID NO：1的核苷酸26318-27595，SEQID NO：1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO：1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO：1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO：1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO：1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO：1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO：1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO：1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO：1的核苷酸36773-36991，SEQID NO：1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO：1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO：1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO：1的核苷酸41369-42256，SEQ ID NO：1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO：1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO：1的核苷酸43524-54920，SEQ ID NO：1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO：1的核苷酸45204-46166，SEQID NO：1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO：1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO：1的核苷酸48087-49361，SEQ ID NO：1的核苷酸49680-50642，SEQ ID NO：1的核苷酸50670-51176，SEQ ID NO：1的核苷酸51534-52657，SEQ ID NO：1的核苷酸53697-54431，SEQ ID NO：1的核苷酸54540-54758，SEQ ID NO：1的核苷酸54935-62254，SEQID NO：1的核苷酸55028-56284，SEQ ID NO：1的核苷酸56600-57565，SEQ ID NO：1的核苷酸57593-58087，SEQ ID NO：1的核苷酸59366-60304，SEQ ID NO：1的核苷酸60362-61099，SEQ ID NO：1的核苷酸61211-61426，SEQ ID NO：1的核苷酸61427-62254，SEQ ID NO：1的核苷酸62369-63628，SEQ ID NO：1的核苷酸67334-68251，和SEQ ID NO：1的核苷酸1-68750。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分：SEQ IDNO：1的核苷酸1900-3171的互补序列，SEQ ID NO：1的核苷酸3415-5556，SEQ ID NO：1的核苷酸7610-11875，SEQ ID NO：1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO：1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO：1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO：1的核苷酸11549-11764，SEQID NO：1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO：1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO：1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO：1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO：1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO：1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO：1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO：1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO：1的核苷酸14313-14334，SEQID NO：1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO：1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO：1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO：1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO：1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO：1的核苷酸14788-15639，SEQ ID NO：1的核苷酸15901-15924，SEQ ID NO：1的核苷酸16251-21749，SEQ ID NO：1的核苷酸16269-17546，SEQID NO：1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO：1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO：1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO：1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO：1的核苷酸2 1746-43519，SEQ ID NO：1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO：1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO：1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO：1的核苷酸26045-26263，SEQID NO：1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO：1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO：1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO：1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO：1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO：1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO：1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO：1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO：1的核苷酸35930-36667，SEQID NO：1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO：1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO：1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO：1的核苷酸39535-40141，SEQ ID NO：1的核苷酸41369-42256，SEQ ID NO：1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO：1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO：1的核苷酸43524-54920，SEQ ID NO：1的核苷酸43626-44885，SEQID NO：1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO：1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO：1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO：1的核苷酸48087-4936 1，SEQ ID NO：1的核苷酸49680-50642，SEQ ID NO：1的核苷酸50670-51176，SEQ ID NO：1的核苷酸51534-52657，SEQ ID NO：1的核苷酸53697-54431，SEQ ID NO：1的核苷酸54540-54758，SEQID NO：1的核苷酸54935-62254，SEQ ID NO：1的核苷酸55028-56284，SEQ IDNO：1的核苷酸56600-57565，SEQ ID NO：1的核苷酸57593-58087，SEQ ID NO：1的核苷酸59366-60304，SEQ ID NO：1的核苷酸60362-61099，SEQ ID NO：1的核苷酸61211-61426，SEQ ID NO：1的核苷酸61427-62254，SEQ ID NO：1的核苷酸62369-63628，SEQID NO：1的核苷酸67334-68251，和SEQ ID NO：1的核苷酸1-68750。
本发明还提供包含与本发明的核酸分子可操作连接的异源启动子序列的嵌合基因。其次，本发明提供了包含这种嵌合基因的重组载体，其中所述载体能够被稳定的转化到宿主细胞中。再次，本发明提供了包含这种嵌合基因的重组宿主细胞，其中宿主细胞能够表达编码至少一种epothilone生物合成必需的多肽的核苷酸序列。在优选的实施方案中，重组宿主细胞是属于放线菌目的细菌，而且在更优选的实施方案中重组宿主细胞是链霉菌菌株。在其它实施方案中，重组宿主细胞是任何其它适合发酵的细菌，诸如假单胞菌或大肠杆菌。再其次，本发明提供了包含本发明的核酸分子的Bac克隆，优选Bac克隆pEP015。
在另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码epothilone合酶结构域的核苷酸序列。
根据一个实施方案，epothilone合酶结构域是β-酮脂酰合酶(KS)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列：SEQID NO：2的氨基酸11-437，SEQ ID NO：4的氨基酸7-432，SEQ IDNO：5的氨基酸39-457，SEQ ID NO：5的氨基酸1524-1950，SEQ IDNO：5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO：5的氨基酸5103-5525，SEQID NO：6的氨基酸35-454，SEQ ID NO：6的氨基酸1522-1946，和SEQ ID NO：7的氨基酸32-450。根据这个实施方案，优选所述KS结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸11-437，SEQ ID NO：4的氨基酸7-432，SEQ ID NO：5的氨基酸39-457，SEQID NO：5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO：5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO：5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO：6的氨基酸35-454，SEQ ID NO：6的氨基酸1522-1946，和SEQ ID NO：7的氨基酸32-450。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似：SEQ ID NO：1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO：1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO：1的核苷酸21860-23116，SEQID NO：1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO：1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO：1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO：1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO：1的核苷酸48087-49361，和SEQ ID NO：1的核苷酸55028-56284。根据这个实施方案，更优选该核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分：SEQ ID NO：1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO：1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO：1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO：1的核苷酸26318-27595，SEQID NO：1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO：1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO：1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO：1的核苷酸48087-49361，和SEQ ID NO：1的核苷酸55028-56284。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO：1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO：1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO：1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO：1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO：1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO：1的核苷酸37052-38320，SEQID NO：1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO：1的核苷酸48087-49361，和SEQ ID NO：1的核苷酸55028-56284。
根据另一个实施方案，epothilone合酶结构域是酰基转移酶(AT)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列：SEQID NO：2的氨基酸543-864，SEQ ID NO：4的氨基酸539-859，SEQID NO：5的氨基酸563-884，SEQ ID NO：5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO：5的氨基酸3555-3876，SEQ ID NO：5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO：6的氨基酸561-881，SEQ ID NO：6的氨基酸2053-2373，和SEQ ID NO：7的氨基酸556-877。根据这个实施方案，优选所述AT结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸543-864，SEQ ID NO：4的氨基酸539-859，SEQ ID NO：5的氨基酸563-884，SEQ ID NO：5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO：5的氨基酸3555-3876，SEQ ID NO：5的氨基酸5631-5951，SEQ IDNO：6的氨基酸561-881，SEQ ID NO：6的氨基酸2053-2373，和SEQ ID NO：7的氨基酸556-877。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似：SEQ ID NO：1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO：1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO：1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO：1的核苷酸27911-28876，SEQID NO：1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO：1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO：1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO：1的核苷酸49680-50642，和SEQ ID NO：1的核苷酸56600-57565。根据这个实施方案，更优选所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分：SEQ ID NO：1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO：1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO：1的核苷酸23431-24397，SEQ IDNO：1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO：1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO：1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO：1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO：1的核苷酸49680-50642，和SEQ ID NO：1的核苷酸56600-57565。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO：1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO：1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO：1的核苷酸23431-24397，SEQID NO：1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO：1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO：1的核苷酸38636-39598，SEQID NO：1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO：1的核苷酸49680-50642，和SEQ ID NO：1的核苷酸56600-57565。
根据另一个实施方案，该epothilone合酶结构域是烯酰基还原酶(ER)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO：5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO：5的氨基酸6542-6837，和SEQ ID NO：7的氨基酸1478-1790。根据这个实施方案，优选所述ER结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO：5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO：5的氨基酸6542-6837，和SEQID NO：7的氨基酸1478-1790。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似：SEQ ID NO：1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO：1的核苷酸35042-35902，SEQID NO：1的核苷酸41369-42256，和SEQ ID NO：1的核苷酸59366-60304。根据这个实施方案，更优选该核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分：SEQ ID NO：1的核苷酸10529-11428，SEQ IDNO：1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO：1的核苷酸41369-42256，和SEQ ID NO：1的核苷酸59366-60304。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO：1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO：1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO：1的核苷酸41369-42256，和SEQ ID NO：1的核苷酸59366-60304。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是酰基载体蛋白(ACP)结构域，其中所述多肽包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO：4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO：5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO：5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO：5的氨基酸5010-5082，SEQ IDNO：5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO：6的氨基酸1430-1503，SEQID NO：6的氨基酸3673-3745，和SEQ ID NO：7的氨基酸2093-2164。根据这个实施方案，优选所述ACP结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO：4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO：5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO：5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO：5的氨基酸5010-5082，SEQ ID NO：5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO：6的氨基酸1430-1503，SEQ ID NO：6的氨基酸3673-3745，和SEQ ID NO：7的氨基酸2093-2164。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似：SEQ ID NO：1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO：1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO：1的核苷酸26045-26263，SEQID NO：1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO：1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO：1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO：1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO：1的核苷酸54540-54758，和SEQ ID NO：1的核苷酸61211-61426。根据这个实施方案，更优选所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分：SEQ ID NO：1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO：1的核苷酸21414-21626，SEQ IDNO：1的核苷酸26045-26263，SEQ ID NO：1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO：1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO：1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO：1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO：1的核苷酸54540-54758，和SEQ ID NO：1的核苷酸61211-61426。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO：1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO：1的核苷酸21414-21626，SEQ IDNO：1的核苷酸26045-26263，SEQ ID NO：1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO：1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO：1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO：1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO：1的核苷酸54540-54758，和SEQ ID NO：1的核苷酸61211-61426。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是脱水酶(DH)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列：SEQID NO：4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO：5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO：5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO：6的氨基酸2383-2551，和SEQ ID NO：7的氨基酸887-1051。根据这个实施方案，优选所述DH结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO：5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO：5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO：6的氨基酸2383-2551，和SEQ IDNO：7的氨基酸887-1051。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似：SEQ ID NO：1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO：1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO：1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO：1的核苷酸50670-51176，和SEQ ID NO：1的核苷酸57593-58087。根据这个实施方案，更优选所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分：SEQ IDNO：1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO：1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO：1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO：1的核苷酸50670-51176，和SEQ ID NO：1的核苷酸57593-58087。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO：1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO：1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO：1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO：1的核苷酸50670-51176，和SEQ IDNO：1的核苷酸57593-58087。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是β-酮还原酶(KR)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列：SEQ ID NO：4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO：5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO：5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO：5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO：5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO：6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO：6的氨基酸3392-3636，和SEQID NO：7的氨基酸1810-2055。根据这个实施方案，优选所述KR结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO：5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO：5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO：5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO：5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO：6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO：6的氨基酸3392-3636，和SEQ ID NO：7的氨基酸1810-2055。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似：SEQ ID NO：1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO：1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO：1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO：1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO：1的核苷酸42314-43048，SEQID NO：1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO：1的核苷酸53697-54431，和SEQ ID NO：1的核苷酸60362-61099。根据这个实施方案，更优选该核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分：SEQ ID NO：1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO：1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO：1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO：1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO：1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO：1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO：1的核苷酸53697-54431，和SEQ ID NO：1的核苷酸60362-61099。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO：1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO：1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO：1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO：1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO：1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO：1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO：1的核苷酸53697-54431，和SEQ ID NO：1的核苷酸60362-61099。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是甲基转移酶(MT)结构域，其包含与SEQ ID NO：6的氨基酸2671-3045基本相似的氨基酸序列。根据这个实施方案，优选所述MT结构域包含SEQ IDNO：6的氨基酸2671-3045。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的核苷酸51534-52657基本相似。根据这个实施方案，更优选该核苷酸序列包含与SEQ ID NO：1的核苷酸51534-52657中相应的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列是SEQ ID NO：1的核苷酸51534-52657。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是硫酯酶(TE)结构域，其包含与SEQ ID NO：7的氨基酸2165-2439基本相似的氨基酸序列。根据这个实施方案，优选所述TE结构域包含SEQ ID NO：7的氨基酸2165-2439。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的核苷酸61427-62254基本相似。根据这个实施方案，更优选该核苷酸序列包含与SEQ ID NO：1的核苷酸61427-62254中相应的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列是SEQ ID NO：1的核苷酸61427-62254。
在另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码非核糖体肽合成酶的核苷酸序列，其中所述非核糖体肽合成酶包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：3的氨基酸72-81，SEQ ID NO：3的氨基酸118-125，SEQ ID NO：3的氨基酸199-212，SEQ ID NO：3的氨基酸353-363，SEQ ID NO：3的氨基酸549-565，SEQ ID NO：3的氨基酸588-603，SEQ ID NO：3的氨基酸669-684，SEQ ID NO：3的氨基酸815-821，SEQ ID NO：3的氨基酸868-892，SEQ ID NO：3的氨基酸903-912，SEQ ID NO：3的氨基酸918-940，SEQ ID NO：3的氨基酸1268-1274，SEQ ID NO：3的氨基酸1285-1297，SEQ ID NO：3的氨基酸973-1256，和SEQ IDNO：3的氨基酸1344-1351。根据这个实施方案，优选所述非核糖体肽合成酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：3的氨基酸72-81，SEQ ID NO：3的氨基酸1 18-125，SEQ ID NO：3的氨基酸199-2 12，SEQ ID NO：3的氨基酸353-363，SEQ ID NO：3的氨基酸549-565，SEQ ID NO：3的氨基酸588-603，SEQ ID NO：3的氨基酸669-684，SEQ ID NO：3的氨基酸815-821，SEQ ID NO：3的氨基酸868-892，SEQ ID NO：3的氨基酸903-912，SEQ ID NO：3的氨基酸918-940，SEQ ID NO：3的氨基酸1268-1274，SEQ ID NO：3的氨基酸1285-1297，SEQ ID NO：3的氨基酸973-1256，和SEQ IDNO：3的氨基酸1344-1351。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似：SEQ ID NO：1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO：1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO：1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO：1的核苷酸12466-12507，SEQID NO：1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO：1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO：1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO：1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO：1的核苷酸14313-14334，SEQ ID NO：1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO：1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO：1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO：1的核苷酸15673-15693，SEQID NO：1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO：1的核苷酸14788-15639，和SEQ ID NO：1的核苷酸15901-15924。根据这个实施方案，更优选该核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分：SEQ IDNO：1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO：1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO：1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO：1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO：1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO：1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO：1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO：1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO：1的核苷酸14313-14334，SEQID NO：1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO：1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO：1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO：1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO：1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO：1的核苷酸14788-15639，和SEQ ID NO：1的核苷酸15901-15924。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO：1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO：1的核苷酸12085-12114，SEQ IDNO：1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO：1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO：1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO：1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO：1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO：1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO：1的核苷酸14313-14334，SEQ ID NO：1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO：1的核苷酸14578-14607，SEQID NO：1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO：1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO：1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO：1的核苷酸14788-15639，和SEQ ID NO：1的核苷酸15901-15924。
本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码包括选自SEQID NO：2-23的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
根据另一方面，本发明还提供了用于重组生产聚酮化合物诸如epothilone的方法，其生产产量足够用于它们的纯化和药用制剂诸如用于治疗癌症。这些生产方法的特殊优势是产生的分子有手性；在转基因有机体中进行生产，避免了产生大量的外消旋混合物，其中一些对映体可能具有降低的活性。特别的，本发明提供了在重组宿主中异源表达epothilone的方法，包括(a)将包含与本发明的核酸分子(其包括编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列)可操作连接的异源启动子序列的嵌合基因导入宿主；和(b)在适合宿主中生物合成epothilone的条件下培养宿主。本发明还提供了生产epothilone的方法，包括(a)用上述方法在重组宿主中表达epothilone；和(b)从重组宿主中提取epothilone。
根据另一方面，本发明提供了一种分离的多肽，其包括由epothilone合酶结构域组成的氨基酸序列。
根据一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是β-酮脂酰合酶(KS)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸11-437，SEQ ID NO：4的氨基酸7-432，SEQ ID NO：5的氨基酸39-457，SEQ ID NO：5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO：5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO：5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO：6的氨基酸35-454，SEQ ID NO：6的氨基酸1522-1946，和SEQ ID NO：7的氨基酸32-450。根据这个实施方案，优选所述KS结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸11-437，SEQ ID NO：4的氨基酸7-432，SEQ ID NO：5的氨基酸39-457，SEQ ID NO：5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO：5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO：5的氨基酸5103-5525，SEQ IDNO：6的氨基酸35-454，SEQ ID NO：6的氨基酸1522-1946，和SEQID NO：7的氨基酸32-450。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是酰基转移酶(AT)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸543-864，SEQ ID NO：4的氨基酸539-859，SEQ ID NO：5的氨基酸563-884，SEQ ID NO：5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO：5的氨基酸3555-3876，SEQ ID NO：5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO：6的氨基酸561-881，SEQ ID NO：6的氨基酸2053-2373，和SEQ ID NO：7的氨基酸556-877。根据这个实施方案，优选所述AT结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸543-864，SEQ ID NO：4的氨基酸539-859，SEQ ID NO：5的氨基酸563-884，SEQ ID NO：5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO：5的氨基酸3555-3876，SEQ ID NO：5的氨基酸5631-5951，SEQ IDNO：6的氨基酸561-881，SEQ ID NO：6的氨基酸2053-2373，和SEQ ID NO：7的氨基酸556-877。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是烯酰基还原酶(ER)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO：5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO：5的氨基酸6542-6837，和SEQ ID NO：7的氨基酸1478-1790。根据这个实施方案，优选该ER结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO：5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO：5的氨基酸6542-6837，和SEQ IDNO：7的氨基酸1478-1790。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是酰基载体蛋白(ACP)结构域，其中所述多肽包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO：4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO：5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO：5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO：5的氨基酸5010-5082，SEQ IDNO：5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO：6的氨基酸1430-1503，SEQID NO：6的氨基酸3673-3745，和SEQ ID NO：7的氨基酸2093-2164。根据这个实施方案，优选所述ACP结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO：4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO：5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO：5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO：5的氨基酸5010-5082，SEQ ID NO：5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO：6的氨基酸1430-1503，SEQ ID NO：6的氨基酸3673-3745，和SEQ ID NO：7的氨基酸2093-2164。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是脱水酶(DH)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列：SEQID NO：4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO：5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO：5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO：6的氨基酸2383-2551，和SEQ ID NO：7的氨基酸887-1051。根据这个实施方案，优选所述DH结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO：5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO：5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO：6的氨基酸2383-2551，和SEQ IDNO：7的氨基酸887-1051。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是β-酮还原酶(KR)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列：SEQ ID NO：4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO：5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO：5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO：5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO：5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO：6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO：6的氨基酸3392-3636，和SEQID NO：7的氨基酸1810-2055。根据这个实施方案，优选所述KR结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO：5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO：5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO：5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO：5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO：6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO：6的氨基酸3392-3636，和SEQ ID NO：7的氨基酸1810-2055。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是甲基转移酶(MT)结构域，其包含与SEQ ID NO：6的氨基酸2671-3045基本相似的氨基酸序列。根据这个实施方案，优选所述MT结构域包含SEQ IDNO：6的氨基酸2671-3045。
根据另一个实施方案，所述epothilone合成酶结构域是硫酯酶(TE)结构域，其包含与SEQ ID NO：7的氨基酸2165-2439基本相似的氨基酸序列。根据这个实施方案，优选所述TE结构域包含SEQ IDNO：7的氨基酸2165-2439。
本发明的其它方面和优点对于那些本领域的技术人员，在研究了本发明的下列描述和非限制性实施例后将是显而易见的。
定义
在本发明的描述中，将使用下列术语，并做如下定义。
相关联/可操作连接：指物理或功能相关的两种DNA序列。例如，如果将启动子或调控DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA可操作连接或放置，以至于调控DNA序列将影响编码或结构DNA序列的表达水平，则该启动子或调控序列被认为是与该DNA序列“相关联”。
嵌合基因：重组DNA序列，其中启动子或调控DNA序列与编码mRNA或表达为蛋白质的DNA序列可操作连接，或与之相关联，以至于调控DNA序列能够调控该相关联的DNA序列的转录或表达。正如在自然界中发现的，嵌合基因的调控DNA序列通常不与该相关联的DNA序列可操作连接的。
编码DNA序列：在有机体中翻译成蛋白质的DNA序列。
结构域：聚酮化合物合酶中对于特定的独特活性必需的那部分。例子包括酰基载体蛋白(acyl carrier protein，ACP)、β-酮合酶(β-ketosynthase，KS)、酰基转移酶(acyltransferae，AT)、β-酮还原酶(β-ketoreductase，KR)、脱水酶(dehydratase，DH)、烯酰基还原酶(enoylreductase，ER)、和硫酯酶(thioesterase，TE)结构域。
Epothilone：由细菌纤维堆囊菌菌株So ce90天然产生的16元大环聚酮化合物，模仿紫杉醇的生物学效应。在本申请中，“epothilore”指聚酮化合物类，包括epothilone A和epothilone B，以及它们的类似物诸如WO98/25929中描述的那些。
Epothilone合酶：负责epothilone生物合成的聚酮化合物合酶。
基因：位于基因组内，除了上述编码DNA序列，还包括主要是调控DNA序列(负责调控编码DNA序列的表达即转录和翻译的DNA序列)的确定区域。
异源DNA序列：与导入的宿主细胞天然不相关联的DNA序列，包括天然DNA序列的非自然产生的多拷贝。
同源DNA序列：与导入的宿主细胞天然相关联的DNA序列。
同源重组：同源DNA分子之间互相交换DNA片段。
分离的：在本发明的内容中，分离的核酸分子或分离的酶是由人工实现，脱离其自然环境存在并因而不是天然产物的核酸分子或酶。分离的核酸分子或酶可以以纯化形式存在，或者可以在非天然环境诸如重组宿主细胞中存在。
模块：编码单轮聚酮化合物生物合成(即一个缩合步骤和所有与此有关的β-羰基处理步骤)需要的所有独特活性的基因元件。每个模块编码ACP、KS、和AT活性以实现生物合成的缩合部分，编码选定的缩合后活性以进行β-羰基处理。
NRPS：非核糖体多肽合成酶，是负责将氨基酸加入到次级代谢物中的酶活性，包括，例如，氨基酸腺苷酸化、异构化、N-甲基化、环化、肽酰基载体蛋白、和缩合结构域的复合物。有功能的NRPS催化将氨基酸加入到次级代谢物中。
NRPS基因：编码在一个或多个相容的控制元件的指导下产生有功能的次级代谢物(例如epothilone A和B)的NRPS的一个或多个基因。
核酸分子：可以从任何来源分离的单链或双链DNA或RNA的线性片段。在本发明的内容中，核酸分子优选是DNA片段。
ORF：开放阅读框架。
PKS：聚酮化合物合酶，是负责聚酮化合物生物合成的酶活性(结构域)，包括，例如酮还原酶、脱水酶、酰基载体蛋白、烯酰基还原酶、酮脂酰ACP合酶、和酰基转移酶的复合物。有功能的PKS催化聚酮化合物的合成。
PKS基因：当在一个或多个相容的控制元件的指导下，编码产生有功能的聚酮化合物(如epothilone A和B)需要的各种多肽的一个或多个基因。
基本相似：对于核酸，是指具有与参考核酸分子至少60％序列相同的核酸分子。在优选的实施方案中，基本相似的DNA序列与参考DNA序列至少80％相同；在更优选的实施方案中，基本相似的DNA序列与参考DNA序列至少90％相同；而在最优选的实施方案中，基本相似的DNA序列与参考DNA序列至少95％相同。基本相似的DNA序列优选编码具有与参考DNA序列编码的蛋白质或肽基本相同活性的蛋白质或肽。基本相似的核苷酸序列通常可与参考核酸分子或它们的片段在下列条件下杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4 pH7.0、1mM EDTA中于50℃杂交；用2xSSC、1％SDS于50℃漂洗。对于蛋白质或肽，基本相似的氨基酸序列是与参考蛋白质或肽的氨基酸序列至少90％相同而且具有与参考蛋白质或肽基本相同活性的氨基酸序列。
转化：将异源核酸导入宿主细胞或有机体的过程。
经转化的/转基因的/重组的：指已经导入了异源核酸分子的宿主有机体诸如细菌。核酸分子可以稳定的整合到宿主的基因组中，或者核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这样的染色体外分子可以自主复制。经转化的细胞、组织、或植株应理解为不仅包含转化过程的终产物，而且还有它的转基因后代。“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主指野生型有机体，即细菌，其中不含有异源核酸分子。
核苷酸由它们的碱基依照下列标准缩写表示：腺嘌呤(adenine，A)，胞嘧啶(cytosine，C)，胸腺嘧啶(thymine，T)，和鸟嘌呤(guanine，G)。氨基酸类似的依照下列标准缩写表示：丙氨酸(alanine；Ala；A)，精氨酸(arginine；Arg；R)，天冬酰胺(asparagine；Asn；N)，天冬氨酸(aspartic acid；Asp；D)，半胱氨酸(cysteine；Cys；C)，谷氨酰胺(glutamine；Gln；Q)，谷氨酸(glutamic acid；Glu；E)，甘氨酸(glycine；Gly；G)，组氨酸(histidine；His；H)，异亮氨酸(isoleucine；Ile；I)，亮氨酸(leucine；Leu；L)，赖氨酸(lysine；Lys；K)，甲硫氨酸(methionine；Met；M)，苯丙氨酸(phenylalanine；Phe；F)，脯氨酸(proline；Pro；P)，丝氨酸(serine；Ser；S)，苏氨酸(threonine；Thr；T)，色氨酸(trytophan；Trp；W)，酪氨酸(tyrosine；Tyr；Y)，和缬氨酸(valine；Val；V)。此外，(Xaa；X)代表任何氨基酸。
序列表中序列的描述
SEQ ID NO：1是含有22个开放阅读框架(ORF)的68750bp毗连序列群的核苷酸序列，包括epothilone生物合成基因。
SEQ ID NO：2是由epoA(SEQ ID NO：1的核苷酸7610-11875)编码的第一类聚酮化合物合酶(EPOS A)的蛋白质序列。
SEQ ID NO：3是由epoP(SEQ ID NO：1的核苷酸11872-16104)编码的非核糖体肽合成酶(EPOS P)的蛋白质序列。
SEQ ID NO：4是由epoB(SEQ ID NO：1的核苷酸16251-21749)编码的第一类聚酮化合物合酶(EPOS B)的蛋白质序列。
SEQ ID NO：5是由epoC(SEQ ID NO：1的核苷酸21746-43519)编码的第一类聚酮化合物合酶(EPOS C)的蛋白质序列。
SEQ ID NO：6是由epoD(SEQ ID NO：1的核苷酸43524-54920)编码的第一类聚酮化合物合酶(EPOS D)的蛋白质序列。
SEQID NO：7是由epoE(SEQ ID NO：1的核苷酸54935-62254)编码的第一类聚酮化合物合酶(EPOS E)的蛋白质序列。
SEQ ID NO：8是由epoF(SEQ ID NO：1的核苷酸62369-63628)编码的细胞色素P450加氧酶同源物(EPOS F)的蛋白质序列。
SEQ ID NO：9是由orf1(SEQ ID NO：1的核苷酸1-1826)编码的部分蛋白质序列(部分Orf1)。
SEQ ID NO：10是由orf2(SEQ ID NO：1反向互补链的核苷酸3171-1900)编码的蛋白质序列(Orf2)。
SEQ ID NO：11是由orf3(SEQ ID NO：1的核苷酸3415-5556)编码的蛋白质序列(Orf3)。
SEQ ID NO：12是由orf4(SEQ ID NO：1反向互补链的核苷酸5992-5612)编码的蛋白质序列(Orf4)。
SEQ ID NO：13是由orf5(SEQ ID NO：1的核苷酸6226-6675)编码的蛋白质序列(Orf5)。
SEQ ID NO：14是由orf6(SEQ ID NO：1的核苷酸63779-64333)编码的蛋白质序列(Orf6)。
SEQ ID NO：15是由orf7(SEQ ID NO：1反向互补链的核苷酸64290-63853)编码的蛋白质序列(Orf7)。
SEQ ID NO：16是由orf8(SEQ ID NO：1的核苷酸64363-64920)编码的蛋白质序列(Orf8)。
SEQ ID NO：17是由orf9(SEQ ID NO：1反向互补链的核苷酸64727-64287)编码的蛋白质序列(Orf9)。
SEQ ID NO：18是由orf10(SEQ ID NO：1的核苷酸65063-65767)编码的蛋白质序列(Orf10)。
SEQ ID NO：19是由orf11(SEQ ID NO：1反向互补链的核苷酸65874-65008)编码的蛋白质序列(Orf11)。
SEQ ID NO：20是由orf12(SEQ ID NO：1反向互补链的核苷酸66338-65871)编码的蛋白质序列(Orf12)。
SEQ ID NO：21是由orf13(SEQ ID NO：1的核苷酸66667-67137)编码的蛋白质序列(Orf13)。
SEQ ID NO：22是由orf14(SEQ ID NO：1的核苷酸67334-68251)编码的蛋白质序列(Orf14)。
SEQ ID NO：23是由orf15(SEQ ID NO：1的核苷酸68346-68750)编码的部分蛋白质序列(部分Orf15)。
SEQ ID NO：24是通用的反向PCR引物序列。
SEQ ID NO：25是通用的正向PCR引物序列。
SEQ ID NO：26是NH24末端“B”PCR引物序列。
SEQ ID NO：27是NH2末端“A”PCR引物序列。
SEQ ID NO：28是NH2末端“B”PCR引物序列。
SEQ ID NO：29是pEPO15-NH6“B”PCR引物序列。
SEQ ID NO：30是pEPO15-H2.7“A”PCR引物序列。
保藏信息
下列物质已依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，已经储存于农业研究服务中心(Agricultural Research Service)，专利培养物收藏中心(Patent Culture Collection(NRRL))，1815北方大学街，Peoria，伊利诺斯州61604。所有对获取保藏物的限制在取得专利的授权后将消除。
保藏物 保藏号 储存日期
pEPO15 NRRL B-30033 1998年6月11日
pEPO32 NRRL B-30119 1999年4月16日
附图说明
图1是实施例14中所述的100升发酵的接种链示意图。
发明的详细描述
可以使用本发明的技术分离得到涉及epothilone生物合成的基因。分离epothilone生物合成基因的优选步骤，需要从经鉴定产生epothilone A和B的有机体中分离基因组DNA，并将分离的合适质粒或载体上的DNA转移到通常不产生聚酮化合物的宿主有机体中，随后鉴定具有epothilone生产能力的经转化的宿主菌落。使用诸如λ：：Tn5转座子诱变(de Bruijn和Lupski，基因(Gene)27：131-149(1984))技术，转化的赋予epothilone的DNA的精确区域可以更准确确定。可替代地或额外地，可以将转化的赋予epothilone的DNA切割成较小的片段，而且可以进一步鉴定维持授予epothilone能力的最小片段。然而，缺乏epothilone生产能力的宿主有机体可能是与产生聚酮化合物的物种不同的物种，这种技术的变更涉及将宿主DNA转化到epothilone生产能力已经被诱变破坏的相同宿主中。在这种方法中，产生epothilone的有机体被突变了，并分离得到不产生epothilone的突变体。然后将这些突变体用从产生epothilone的亲本菌株中分离的基因组DNA弥补。
可以用来分离epothilone生物合成需要的基因的进一步的实例，是使用转座子诱变来产生产生epothilone的有机体的突变体，其被诱变后不能产生聚酮化合物。这样，宿主基因组负责产生epothilone的区域被转座子标以标签，而且可以回收并作为探针使用来从亲代菌株中分离天然基因。由于它们与序列已知的生物合成基因诸如利福霉素或soraphen生物合成的PKS基因的序列同源性，可以分离得到合成聚酮化合物需要的、且与已知的PKS基因相似的PKS基因。利用同源性的合适分离技术，包括由DNA杂交进行常规文库筛选。
可以从在已知聚酮化合物合成中起作用的基因或其它DNA序列中得到的DNA片段，作为优选的探针分子使用。一种优选的探针分子包括编码soraphen PKS第四个模块的酮合酶结构域的1.2kb Sma I DNA片段(美国专利号5,716,849)，更优选的探针分子包括利福霉素PKS第一和第二模块的β-酮脂酰合酶结构域(Schupp等人，FEMS微生物通讯159：201-207(1998))。这些探针可以用来探测产生epothilone的微生物的基因库，以分离负责epothilone生物合成的PKS基因。
尽管众所周知分离PKS基因通常很困难，尽管预期分离epothilone生物合成基因将特别困难，通过使用此说明书中描述的方法，可以令人惊讶的从产生epothilone A和B的微生物中克隆得到该聚酮化合物的生物合成基因。使用此说明书中描述的基因操作的方法和重组产物，可以修饰和在转基因宿主有机体中表达被克隆的PKS基因。
可以在异源宿主中表达分离的epothilone生物合成基因，以比天然宿主更高效的生产聚酮化合物。用于这些基因操作的技术，对于不同的可获得的宿主是特异的，而且本领域的技术人员是知道的。例如，使用诸如那些描述于McDaniel等人，科学(Science)262：1546-1550(1993)和Kao等人，科学265：509-512(1994)(此处引用作为参考)的技术，可以在链霉菌和其它放线菌中表达异源基因。还可见，Rowe等人，基因(Gene)216：215-226(1998)；Holmes等人，欧洲分子生物学杂志(EMBO Journal)12(8)：3183-3191(1993)和Bibb等人，基因38：215-226(1985)，此处引用作为参考。
或者，还可以在其它宿主有机体诸如假单胞菌和大肠杆菌中表达负责聚酮化合物生物合成的基因，即epothilone生物合成基因。用于这些基因操作的技术对于不同的可获得的宿主是特异的，而且本领域的技术人员是知道的。例如，使用pT7-7载体(使用T7启动子)，已经在大肠杆菌中成功的表达了PKS基因。见，Tabor等人，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82：1074-1078(1985)，此处引用作为参考。此外，可以用表达载体pKK223-3和pKK223-2在大肠杆菌中表达异源基因，或以转录或以翻译融合方式，在tac或trc启动子之后。对于编码多ORF的操纵子的表达，最简单的步骤是以转录融合方式将操纵子插入到载体诸如pKK223-3中，使得能够使用异源基因的同类核糖体结合位点。用于在革兰氏阳性物种诸如芽孢杆菌中过量表达的技术，本领域的技术人员也是知道的，而且可以用于本发明中(Quax等人，工业微生物学：基础和应用分子遗传学，编辑Baltz等人，美国微生物学学会，华盛顿(1993))。
其它可以与本发明的epothilone生物合成基因使用的表达系统，包括酵母和杆状病毒表达系统。见，例如，“重组蛋白质在酵母中的表达”，P.E.Sudbery，生物技术的流行观点(Curr.Opin.Biotechnol.)7(5)：517-524(1996)；“在酵母中表达重组蛋白质的方法”，Mackay等人，编辑：Paul R.Carey，蛋白质工程评论(Protein Eng.Des.)105-153，出版商：Academic，圣地亚哥，加利福尼亚(1996)；“异源基因产物在酵母中的表达”，Pichuantes等人，编辑：J.L.Cleland，C.S.Craik，蛋白质工程(Protein Eng.)129-161，出版商：Wiley-Liss，纽约，纽约(1996)；WO98/27203；Kealey等人，美国国家科学院进展95：505-509(1998)；“昆虫细胞培养：蛋白质生产的最新进展，生物工程挑战和意义”，Palomares等人，编辑：EnriqueGalindo；Octavio T.Ramirez，高级生物工程(Adv.Bioprocess Eng.)第2卷，Invited Pap.Int.Symp.，第二版(1998)25-52，出版商：Kluwer，Dordrecht，Neth；“杆状病毒表达载体”，Donald L.Jarvis，编辑：Lois K.Miller，杆状病毒(Baculoviruses)389-431，出版商：Plenum，纽约，纽约(1997)；“使用杆状病毒/昆虫表达系统生产异源蛋白质”，Grittiths等人，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)(N.J.Totowa)75(基础细胞培养方案(第二版))427-440(1997)；和“昆虫细胞表达技术”，Verne A.Luckow，蛋白质工程183-218，出版商：Wiley-Liss，纽约，纽约(1996)；所有文献均此处引用作为参考。
在异源宿主中表达PKS基因的另一个要考虑的问题，是PKS酶的翻译后修饰(在它们能够合成聚酮化合物之前要磷酸泛酰巯基乙胺基化)需要酶。然而，负责第一类PKS酶的这种修饰的酶，磷酸泛酰巯基乙胺基(P-pant)转移酶在许多宿主诸如大肠杆菌中通常不存在。这个问题可以通过P-pant转移酶与PKS基因在异源宿主中的共表达解决，如Kealey等人，美国国家科学院进展95：505-509(1998)描述的，此处引用作为参考。
因此，为了生产聚酮化合物，选择宿主有机体的重要标准是它的操作容易，生长(即发酵)迅速，拥有适当的加工诸如翻译后修饰的分子机制，和对过量表达聚酮化合物不敏感。最优选的宿主有机体是放线菌诸如链霉菌菌株。其它优选的宿主有机体是假单胞菌和大肠杆菌。生产聚酮化合物的上述方法比制备该类化合物使用的现行技术具有明显优势。这些优势包括生产成本更低，生产更大量的化合物的能力，和生产优选生物学对映体的化合物的能力，这与有机合成生产不可避免的外消旋混合物相反。由异源宿主产生的化合物可以用于医疗(例如用epothilone治疗癌症)以及农业应用。
实验
本发明将由下列详细实施例作为参考进一步描述。提供这些实施例只是为了例证，而并不是为了限制(除非特殊说明)。此处使用的常规重组DNA和分子克隆技术是本领域的技术人员熟知的，而且由Ausubel(编辑)，分子生物学现行方案(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley and Sons Inc.(1994)；T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)；和T.J.Silhavy，M.L.Berman，和L.W.Enquist，基因融合实验(Experiments with Gene Fusion)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1994)描述。
实施例1：生产epothilone的纤维堆囊菌菌株的培养
将纤维堆囊菌菌株90(DSM 6773，Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen，Braunschweig)在SolE培养基(0.35％葡萄糖，0.05％胰蛋白胨，0.15％MgSO4·7H2O，0.05％硫酸铵，0.1％CaCl2，0.006％K2HPO4，0.01％连二亚硫酸钠，0.0008％Fe-EDTA，1.2％HEPES，3.5％[vol/vo/]经灭菌的稳定期纤维堆囊菌培养物的上清液)pH调到7.4的琼脂平板上划线，并于30℃培养。挑取来自1cm2的细胞，接种到5ml G51t液体培养基(0.2％葡萄糖，0.5％淀粉，0.2％胰蛋白胨，0.1％probion S，0.05％CaCl2·2H2O，0.05％MgSO4·7H2O，1.2％HEPES，pH调到7.4)中，并于30℃振摇225rpm培养。4天后，将培养物转移到50ml G51t中，并如上所述培养5天。用此培养物接种500ml G51t，并如上所述培养6天。将此培养物以4000rpm离心10分钟，并将细胞沉淀重悬于50ml G51t中。
实施例2：细菌人工染色体文库的构建
为了构建Bac文库，将如实施例1所述培养的纤维堆囊菌细胞包埋于琼脂糖块中，裂解，并将释放出来的基因组DNA用限制酶hindIII部分消化。在琼脂糖凝胶上用脉冲电泳分离经消化的DNA。从琼脂糖凝胶中分离大片段DNA(大约90-150kb)，并连接到载体pBelobacII中。pBelobacII包含编码氯霉素抗性的基因、位于lacZ基因中在适当培养基上提供蓝白斑选择的多克隆位点、以及复制和在每个细胞中维持一个或两个质粒拷贝需要的基因。使用常规电穿孔技术，将连接混合物转化大肠杆菌DH10B电感受态细胞。将氯霉素抗性重组体(白斑、lacZ突变)菌落转移到带正电的384 3×3栅格的尼龙滤膜上。裂解克隆并将DNA交联到滤膜上。将同一克隆以液体培养物的形式保存于-80℃。
实施例3：在纤维堆囊菌90的Bac文库中筛选第一类聚酮化合物合酶的相关序列
使用常规Southern杂交步骤探测Bac文库滤膜。使用的探针编码利福霉素聚酮化合物合酶第一和第二模块的β-酮脂酰合酶结构域(Schupp等人，FEMS微生物学通讯159：210-207(1998))。以质粒pNE95(pNE95即Schupp等人(1998)中描述的粘粒2)作为模板，使用每个酮合酶结构域两侧的引物通过PCR产生探针DNA。从0.5％琼脂糖凝胶分离得到25ng PCR扩增的DNA，并使用随机引物标记试剂盒(Gibco-BRL，Methesda，MD，美国)按照供应商的指示用32P-dCTP标记。杂交于65℃进行36小时，并在高度严谨条件下洗膜(0.1xSSC和0.5％SDS于65℃ 20分钟3次)。将经标记的斑点暴露于磷光屏上，并在Phospholmager 445SI上检测信号(屏和445SI购自MolecularDynamics)。结果某些Bac克隆与探针强杂交。选择这些克隆，并在5ml Luria肉汤(LB)培养基中于37℃培养过夜。使用典型的微量制备步骤，从感兴趣的Bac克隆中分离Bac DNA。将细胞重悬于200μl溶菌酶溶液(50mM葡萄糖，10mM EDTA，25mM Tris-HCl，5mg/ml溶菌酶)，在400μl裂解液(0.2N NaOH和2％SDS)中裂解，沉淀蛋白质(3.0M醋酸钾，用乙酸调到pH5.2)，并用异丙醇沉淀Bac DNA。将DNA重悬于20μl无核酸酶的蒸馏水中，用BamH I(New England Biolabs，Inc.)限制酶消化，并在0.7％琼脂糖凝胶上分离。如上所述通过Southern杂交将凝胶转膜，并在如上所述的条件下用编码soraphen聚酮化合物合酶第四模块的酮合酶结构域的1.2kb Sma I DNA片段作为探针(见，美国专利号5,716,849)探测。观察到五个不同的杂交样式。每种选择一个克隆作为代表，并分别命名为pEPO15、pEPO20、pEPO30、pEPO31、和pEPO33。
实施例4：pEPO15、pEPO20、pEPO30、pEPO31、和pEPO33的BamH I片段的亚克隆
用BamH I消化五个选择的Bac克隆的DNA，并将随机片段亚克隆到pBluescriptIISK+(Stragagene)的BamH I位点。选择插入片段大小在2-10kb之间的亚克隆，以测定插入片段两侧末端的序列，并且还用如上所述的1.2 Sma I探针探测。将与已知聚酮化合物合酶具有高度序列同源性和/或与soraphen酮合酶结构域强杂交的亚克隆用于基因破坏实验。
实施例5：制备纤维堆囊菌菌株So ce90的链霉素抗性自发突变体
取0.1ml纤维堆囊菌菌株So ce90在液体培养基G52-H(0.2％酵母提取物，0.2％脱脂大豆粉，0.8％土豆淀粉，0.2％葡萄糖，0.1％MgSO4·7H2O，0.1％CaCl2·2H2O，0.008％Fe-EDTA，用KOH调到pH7.4)中培养3天的培养物，铺在添加100μg/ml链霉素的SolE培养基琼脂平板上。平板于30℃培养2星期。生长在这种培养基上的菌落是链霉素抗性的突变体，将其在含链霉素的相同琼脂培养基上划线并再一次培养以纯化。选择这些链霉素抗性突变体中的一个，并命名为BCE28/2。
实施例6：纤维堆囊菌BCE28/2中的基因破坏(使用亚克隆的BamHI片段)
分离如上所述由五个选择的Bac克隆产生的亚克隆的BamH I插入片段，并连接到质粒pCIB132(见美国专利号5,716,849)的单一BamHI位点。将携带插入片段的pCIB132衍生物转化含辅助质粒pUZ8的大肠杆菌ED8767(Hedges和Matthew，质粒(Plasmid)2：269-278(1979))。使用转化体作为接合实验中的供体，而纤维堆囊菌BCE28/2作为受体。为了接合，将5-10×109个在液体培养基G51b(G51b相当于G51t，其中用蛋白胨替代胰蛋白胨)中于30℃培养的纤维堆囊菌BCE28/2稳定期早期培养物(达到大约5×108细胞/ml)，以1∶1的细胞比率，与含pCIB132衍生物(携带亚克隆的BamH I片段)和辅助质粒pUZ8的大肠杆菌ED8767的指数晚期培养物(在LB液体培养基中)混合。然后将混合的细胞以4000rpm离心10分钟，并重悬于0.5ml G51b培养基中。然后将此细胞悬浮液滴一滴在含50mg/l卡那霉素的SolE琼脂平板的中央铺板。于30℃培养24小时后收获细胞，并重悬于0.8mlG51b培养基，并将0.1-0.3ml此悬浮液在含腐草霉素(30mg/l)、链霉素(300mg/l)、和卡那霉素(50mg/l)的选择性SolE固体培养基上铺板。使用链霉素进行供体大肠杆菌菌株的负选择。于30℃培养8-12天后，用塑料环分离生长在这种选择培养基上的菌落，并在相同琼脂培养基上划线和培养以进行第二轮选择和纯化。于30℃培养7天后生长在此选择琼脂培养基上的菌落衍生的培养物，是通过携带亚克隆BamH I片段的pCIB132衍生物的接合转移获得了腐草霉素抗性的纤维堆囊菌BCE28/2的转接合体。
通过Southern杂交检验证实pCIB132衍生的质粒通过同源重组整合到了纤维堆囊菌BCE28/2的染色体中。为了这个实验，应用Pospiech和Neumann，Trends Genet.11：217(1995)描述的方法，每种转移BamH I片段的转接合体取5-10个分离完整DNA(于培养基G52-H中生长了3天的10ml培养物)。为了Southern杂交转膜，将如上所述分离的DNA用限制酶Bgl II、Cla I、或Not I切割，并使用相应的BamHI插入片段或pCIB132作为32P标记的探针。
实施例7：分析整合的BamH I片段对纤维堆囊菌在基因破坏后对epothilone生产的影响
用无菌塑料环将生长在第二轮选择的选择性SolE平板表面上大约1cm2的转接合细胞(见实施例6)转移到10ml G52-H培养基中(装在50ml Erlenmeyer烧瓶中)。于30℃和180rpm培养3天后，将培养物转移到50ml G52-H培养基中(装在200ml Erlenmeyer烧瓶中)。于30℃和180rpm培养4-5天后，将10ml此培养物转移到50ml 23B3培养基(0.2％葡萄糖，2％土豆淀粉，1.6％脱脂大豆粉，0.0008％Fe-EDTA钠盐，0.5％HEPES(4-(2-羟乙基)-哌嗪-1-乙烷磺酸)，2％vol/vol聚苯乙烯树脂XAD16(Rohm和Haas)，用NaOH调pH到7.8)中(装在200ml Erlenmeyer烧瓶中)。
培养物于30℃和180rpm培养7天后，进行产生的epothilone的定量实验。将全部培养液通过150μm尼龙滤膜抽滤过滤。然后将留在滤膜上的树脂重悬于10ml异丙醇，并通过将悬浮液以180rpm振摇1小时进行抽提。从此悬浮液中取出1ml，并在Eppendorff微量离心机中以12,000rpm离心。通过HPLC和用UV_DAD检测仪(用Waters-Symetry C18层析柱进行HPLC并用0.02％磷酸60％-0％和乙腈40％-100％的梯度)于250nm检测的方法测定其中的epothilone A和B的量。
以上述方法测试含有从pEPO15亚克隆的三种不同的BamH I整合片段的转接合体，即含有质粒pEPO15-21的BamH I片段的转接合体、含有质粒pEPO15-4-5的BamH I片段的转接合体、和含有质粒pEPO15-4-1的BamH I片段的转接合体。HPLC分析揭示所有转接合体不再产生epothilone A和B。相反的，在整合有pEPO20、pEPO30、pEPO31、pEPO33的BamH I片段的转接合体和亲本菌株BCE28/2中检测到epothilone A和B浓度为2-4mg/l。
实施例8：测定克隆的片段的核苷酸序列并构建毗连序列群
A.质粒pEPO15-21的BamH I插入片段
从大肠杆菌DH10B[pEPO15-21]菌株中分离质粒DNA，并测定插入pEPO15-21的2.3kb BamH I片段的核苷酸序列。自动DNA测序是在双链DNA模板上通过双脱氧核苷酸链终止方法进行的，使用应用Applied Biosystems 377型测序仪。使用的引物是通用反向引物(5’GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3’(SEQ ID NO：24))和通用正向引物(5’GTA AAA CGA CGG CCA GT 3’(SEQ ID NO：25))。在随后几轮测序反应中，使用为先前测定的序列的3’末端设计而定制合成的寡核苷酸来延伸并连接毗连序列群。两条链都完全测序，而且每个核苷酸至少测序两次。使用3.0版Sequencher程序(Gene Codes Corporation)编辑核苷酸序列，并使用威斯康星遗传学计算机组程序(WisconsinGenetics Computer Group programs)分析。2213-bp插入片段的核苷酸序列相应于SEQ ID NO：1的核苷酸20779-22991。
B.质粒pEPO15-4-1的BamH I插入片段
从大肠杆菌DH10B[pEPO15-4-1]菌株中分离质粒DNA，并如上(A)所述测定插入pEPO15-4-1的3.9kb BamH I片段的核苷酸序列。3909-bp插入片段的核苷酸序列相应于SEQ ID NO：1的核苷酸16876-20784。
C.质粒pEPO15-4-5的BamH I插入片段
从大肠杆菌DH10B[pEPO15-4-5]菌株中分离质粒DNA，并如上(A)所述测定插入pEPO15-4-5的2.3kb BamH I片段的核苷酸序列。2233-bp插入片段的核苷酸序列相应于SEQ ID NO：1的核苷酸42528-44760。
实施例9：含有epothilone生物合成基因的pEPO15中的DNA片段的亚克隆和排序
将pEPO15用限制酶HindIII完全消化，并将产生的片段亚克隆到已经用HindIII切割且用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化的pBluescriptIISK-或pNEB193(New England Biolabs)中。产生了六个不同的克隆，并命名为pEPO15-NH1、pEPO15-NH2、pEPO15-NH6、pEPO15-NH24(都由pNEB193衍生)、和pEPO15-H2.7和pEPO15-H3.0(都由pBluescriptII SK-衍生)。
分离并DIG标记(非放射性DNA标记和检测系统，BoehringerMannheim)pEPO15-21的BamH I插入片段，并在DNA杂交实验中在高度严谨条件下作为针对pEPO15-NH1、pEPO15-NH2、pEPO15-NH6、pEPO15-NH24、pEPO15-H2.7和pEPO15-H3.0的探针使用。对pEPO15-NH24检测到强杂交信号，说明pEPO15-NH24包含pEPO15-21。
如上所述分离并DIG标记pEPO15-4-1的BamH I插入片段，并在DNA杂交实验中在高度严谨条件下作为针对pEPO15-NH1、pEPO15-NH2、pEPO15-NH6、pEPO15-NH24、pEPO15-H2.7和pEPO15-H3.0的探针使用。对pEPO15-NH24和pEPO15-H2.7检测到强杂交信号。由pEPO15-NH24和pEPO15-H2.7的一个末端得到的核苷酸序列信息还与先前测定的pEPO15-4-1的BAmH I插入片段的序列完全一致。这些实验证明pEPO15-4-1(含有一个内部的Hind III位点)与pEPO15-H2.7和pEPO15-NH24重叠，而且pEPO15-H2.7和pEPO15-NH24是以这个顺序相邻的。
如上所述分离并DIG标记pEPO15-4-5的BamH I插入片段，并在DNA杂交实验中在高度严谨条件下作为针对pEPO15-NH1、pEPO15-NH2、pEPO15-NH6、pEPO15-NH24、pEPO15-H2.7和pEPO15-H3.0的探针使用。对pEPO15-NH2检测到强杂交信号，说明pEPO15-NH2包含pEPO15-4-5。
由pEPO15-NH2的两个末端和pEPO15-H24不与pEPO15-4-1重叠的那个末端得到核苷酸序列信息。朝向HindIII位点的PCR引物NH24末端“B”：GTGACTGGCGCCTGGAATCTGCATGAGC(SEQ ID NO：26)、NH2末端“A”：AGCGGGAGCTTGCTAGACATTCTGTTTC(SEQ ID NO：27)、和NH2末端“B”：GACGCGCCTCGGGCAGCGCCCCAA(SEQ ID NO：28)是根据这些序列设计的，并用于以pEPO15和在个别实验中以纤维堆囊菌So ce90基因组DNA作为模板的扩增反应。以NH24末端“B”和NH2末端“A”作为引物对，在两种模板中都发现特异扩增。将扩增物克隆到pBluescript II SK-中并完全测序。扩增物的序列相同，而且还与pEPO15-NH24和pEPO15-NH2的末端序列完全一致，并在HindIII位点融合，确定了pEPO15-NH2和pEPO15-NH24的HindIII片段是以此顺序相邻的。
如上所述分离并DIG标记pEPO2.7的HindIII插入片段，并在DNA杂交实验中在高度严谨条件下作为针对经Not I消化的pEPO15的探针使用。大小大约为9kb的一个Not I片段显示强杂交信号，将其进一步亚克隆到已经用Not I消化且用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化的pBluescript II SK-中，从而产生pEPO15-N9-16。如上所述分离并DIG标记pEPO15-N9-16的Not I插入片段，并在DNA杂交实验中在高度严谨条件下作为针对pEPO15-NH1、pEPO15-NH2、pEPO15-NH6、pEPO15-NH24、pEPO15-H2.7和pEPO15-H3.0的探针使用。对pEPO15-NH6、以及预期的克隆pEPO15-H2.7和pEPO15-NH24检测到强杂交信号。由pEPO15-NH6的两个末端和pEPO15-H2.7不与pEPO15-4-1重叠的那个末端得到核苷酸序列信息。设计朝向HindIII位点的PCR引物并用于以pEPO15和在个别实验中以纤维堆囊菌So ce90基因组DNA作为模板的扩增反应。以pEPO15-NH6末端“B”：CACCGAAGCGTCGATCTGGTCCATC(SEQ ID NO：29)和pEPO15-H2.7末端“A”：CGGTCAGATCGACGACGGGCTTTCC(SEQ ID NO：30)作为引物对，在两种模板中都发现特异扩增。将扩增物克隆到pBluescript H SK-中并完全测序。扩增物的序列是相同的，而且还与pEPO15-NH6和pEPO15-NH2.7的末端序列完全一致，在HindIII位点融合，确定了pEPO15-NH6和pEPO15-NH2.7的HindIII片段是以此顺序相邻的。
所有这些实验，综合起来，确定了覆盖大约55kb区域并由pEPO15-NH6、pEPO15-H2.7、pEPO15-NH24、和pEPO15-NH2的HindIII插入片段以此顺序组成的HindIII片段毗连序列群。剩余的两个HindIII亚克隆的插入片段(命名为pEPO15-NH1和pEPO15-H3.0)未发现是这个毗连序列群的部分。
实施例10：覆盖epothilone生物合成基因的亚克隆毗连序列群的进一步延伸
将pEPO15-NH2插入片段下游末端产生、并因此代表实施例9中描述的亚克隆毗连序列群的下游末端的大约2.2kb BamH I-HindIII片段分离出来、DIG标记、并用于针对经多种酶消化的pEPO15和pEPO15-NH2DNA的Southern杂交实验。总是发现在两种目的DNA之间强杂交条带大小相同，说明克隆到pEPO15中的纤维堆囊菌So ce90基因组DNA片段结束于位于pEPO15-NH2下游末端的HindIII位点。
使用已确定的步骤，在pScosTriplex-II(Ji等人，基因组学(Genomics)31：185-192(1996))中构建纤维堆囊菌So ce90的粘粒DNA文库。简单的说，将纤维堆囊菌So ce90的高分子量基因组DNA用限制酶Sau3A I部分消化以提供平均大小为大约40kb的片段，并连接到经BamH I和Xba I消化的pScosTriplex-II中。连接混合物用GigapackIII XL(Stratagene)包装，并用于转染大肠杆菌XL1 BlueMR细胞。
用所述大约2.2kb的BamH I-HindIII片段(pEPO15-NH2插入片段的下游末端产生、作为菌落杂交中的探针使用)筛选粘粒文库，选择到一个强杂交克隆，命名为pEPO4E7。
将pEPO4E7 DNA分离、用多种限制性内切酶消化、并用2.2kb BamHI-HindIII片段在Southern杂交中探测。选择到一个大小大约为9kb的强杂交的Not I片段，并亚克隆到pBluescriptII SK-以产生pEPO4E7-N9-8。进一步的Southern杂交实验揭示了pEPO4E7-N9-8大约9kb的Not I插入片段与pEPO15-NH2的NotI-HindIII片段超过6kb重叠，而剩余的大约3kb HindIII-NotI将延伸实施例9中描述的亚克隆毗连序列群。然而，末端测序揭示pEPO4E7-N9-8插入片段的下游末端包含pScosTriplex-II的BamH I-Not I多克隆位点，由此说明：pEPO4E7的基因组DNA插入片段终止于HindIII-Not I延伸片段中的Sau3A I位点，而NotI位点来自pScosTriplex-II。
将pEPO4E7-N9-8的大约3kb HindIII-Not I延伸亚片段衍生的大约1.6kb Pst I-Sal I片段(不含载体，只包含纤维堆囊菌So ce90衍生的序列)，作为针对实施例2中描述的细菌人工染色体文库的探针使用。除了先前分离的EPO15，还发现命名为EPO32的Bac克隆与该探针强杂交。将pEPO32分离、用多种限制性内切酶消化、并与大约1.6kb的PstI-Sal I探针杂交。发现大小大约为13kb的HindIII-EcoR V片段与该探针强杂交，将其亚克隆到经HindIII和HincII消化的pBluescriptIISK-中以产生pEPO32-HEV15。
根据pEPO15-NH2的下游末端序列和pEPO32-HEV15的上游(HindIII)末端序列设计寡核苷酸引物，并用于以pEPO4E7-N9-8为模板的测序反应。序列揭示了在常规限制性分析中检测不到的一个24bp小HindIII片段(EPO4E7-H0.02)的存在，分隔pEPO15-NII2下游末端的HindIII位点和pEPO32-HEV15上游末端的HindIII位点。
由此，描述于实施例9中的亚克隆毗连序列群延伸到了包括EPO4E7-H0.02的HindIII片段和pEPO32-HEV15的插入片段，而且由pEPO15-NH6、pEPO15-H2.7、pEPO15-NH24、pEPO15-NH2、EPO4E7-H0.02和pEPO32-HEV15的插入片段以此顺序组成。
实施例11：测定覆盖epothilone生物合成基因的亚克隆毗连序列群的核苷酸序列
如下测定实施例10中描述的亚克隆毗连序列群的核苷酸序列。
pEPO15-H2.7。从大肠杆菌DH10B[pEPO15-H2.7]菌株中分离质粒DNA，并测定pEPO15-H2.7的2.7kb BamHI插入片段的核苷酸序列。自动DNA测序在双链DNA模板上通过双脱氧核苷酸链终止方法进行，使用Applied Biosystems 377型测序仪。使用的引物是通用反向引物(5’GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3’(SEQ ID NO：24))和通用正向引物(5’GTA AAA CGA CGG CCA GT 3’(SEQ ID NO：25))。在随后几轮测序反应中，使用为先前测定的序列的3’末端设计而定制合成的寡核苷酸来延伸并连接毗连序列群。
pEPO15-NH6、pEPO15-NH24和pEPO15-NH2。分离这些质粒的HindIII插入片段并用于随机片段化，使用Hydroshear apparatus(GenomicInstrumentation Services，Inc.)以产生平均大小为1-2 kb的片段。使用T4 DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶在三磷酸脱氧核苷酸存在时对片段进行末端修复，并用T4 DNA激酶在ribo-ATP存在时磷酸化。从琼脂糖凝胶中分离在1.5-2.2kb大小范围内的片段，并连接到经EcoRV切割和去磷酸化的pBluescriptII SK-中。使用通用反向引物和通用正向引物对随机亚克隆测序。
pEPO32-HEV15。将pEPO32-HEV15用HindIII和Ssp I消化，分离得到包含纤维堆囊菌So ce90的大约13kb HindIII-EcoR V插入片段和pBluescriptIISK-的0.3kb HincII-Ssp I片段的大约13.3kb片段，并用HaeIII部分消化以产生平均大小为1-2kb的片段。从琼脂糖凝胶中分离在1.5-2.2kb大小范围内的片段，并连接到经EcoR V切割和去磷酸化的pBluescriptII SK-中。使用通用反向引物和通用正向引物对随机亚克隆测序。
分析了色谱图并用Phred、Phrap和Consed程序(Ewing等人，基因组研究(Genome Res.)8(3)：175-185(1998)；Ewing等人，基因组研究8(3)：186-194(1998)；Gordon等人，基因组研究8(3)：195-202(1998))装配成毗连序列群。填充毗连序列群缺口，分析序列差异，并对低准确度区域使用定制设计的用于原始亚克隆或从随机亚克隆文库中选定克隆测序的寡核苷酸引物重新测序。两条链都完全测序，而且每个碱基对的累计Phred得分至少40(置信度99.99％)。
该68750bp毗连序列群的核苷酸序列显示如SEQ ID NO：1。
实施例12：分析epothilone生物合成基因的核苷酸序列
发现SEQ ID NO：1包含22个ORF，详见下表1：
表1
| ORF | 起始密码子 | 终止密码子 | 推导出来的蛋白质的同源性 | 推导出来的蛋白质可能的功能 |
| orf1 | 测序范围之外 | 1826 | ||
| orf2* | 3171 | 1900 | 假设蛋白质SP：Q11037；DD-肽酶SP：P15555 | |
| orf3 | 3415 | 5556 | Na/H反向转运蛋白PID：D1017724 | 转运 |
| orf4* | 5992 | 5612 | ||
| orf5 | 6226 | 6675 | ||
| epoA | 7610 | 11875 | 第一类聚酮化合物合酶 | epothilone合酶：形成噻唑环 |
| epoP | 11872 | 16104 | 非核糖体肽合成酶 | epothilone合酶：形成噻唑环 |
| epoB | 16251 | 21749 | 第一类聚酮化合物合酶 | epothilone合酶：形成聚酮化合物主链 |
| epoC | 21746 | 43519 | 第一类聚酮化合物合酶 | epothilone合酶：形成聚酮化合物主链 |
| epoD | 43524 | 54920 | 第一类聚酮化合物合酶 | epothilone合酶：形成聚酮化合物主链 |
| epoE | 54935 | 62254 | 第一类聚酮化合物合酶 | epothilone合酶：形成聚酮化合物主链 |
| epoF | 62369 | 63628 | 细胞色素P450 | epothilone大内酯氧化酶 |
| orf6 | 63779 | 64333 | ||
| orf7* | 64290 | 63853 | ||
| orf8 | 64363 | 64920 | ||
| orf9* | 64727 | 64287 | ||
| orf10 | 65063 | 65767 | ||
| orf11* | 65874 | 65008 | ||
| orf12* | 66338 | 65871 | ||
| orf13 | 66667 | 67137 | ||
| orf14 | 67334 | 68251 | 假设蛋白质GI：3293544；阳离子流出系统蛋白质GI：2623026 | 转运 |
| orf15 | 68346 | 测序范围之外 |
*在反向互补链上。编号根据SEQ ID NO：1。
epoA(SEQ ID NO：1的核苷酸7610-11875)编码EPOS A(SEQ IDNO：2)，一种第一类聚酮化合物合酶，由单个模块组成，并包含下列结构域：β-酮脂酰合酶(KS)(SEQ ID NO：1的核苷酸7643-8920，SEQID NO：2的氨基酸11-437)、酰基转移酶(acyltransferase，AT)(SEQID NO：1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO：2的氨基酸543-864)、烯酰基还原酶(enoyl reductase，ER)(SEQ ID NO：1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO：2的氨基酸974-1273)、和酰基载体蛋白同源结构域(ACP)(SEQ ID NO：1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO：2的氨基酸1314-1385)。序列比较和基元分析(Haydock等人，FEBS通讯(FEBS Lett.)374：246-248(1995)；Tang等人，基因216：255-265(1998))揭示了EPOS A编码的AT对丙二酸单酰CoA是特异的。EPOS A应当是通过将乙酸根单元上载到多酶复合物上最终形成2-甲基噻唑环的部分(C26和C20)，而涉及epothilone生物合成的起始。
epoP(SEQ ID NO：1的核苷酸11872-16104)编码EPOS P(SEQ IDNO：3)，一种非核糖体肽合成酶，含有单个模块。EPOS P包含下列结构域：
●肽键形成结构域，由基元K(SEQ ID NO：3的氨基酸72-81[FPLTDIQESY]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置12085-12114)、基元L(SEQ ID NO：3的氨基酸118-125[VVARHDML]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置12223-12246)、基元M(SEQ ID NO：3的氨基酸199-212[SIDLINVDLGSLSI]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置12466-12507)、和基元O(SEQ ID NO：3的氨基酸353-363[GDFTSMVLLDI]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置12928-12960)描绘；
●氨酰基腺苷酸形成结构域，由基元A(SEQ ID NO：3的氨基酸549-565[LTYEELSRRSRRLGARL]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置13516-13566)、基元B(SEQ ID NO：3的氨基酸588-603[VAVLAVLESGAAYVPI]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置13633-13680)、基元C(SEQ ID NO：3的氨基酸669-684[AYVIYTSGSTGLPKGV]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置13876-13923)、基元D(SEQ ID NO：3的氨基酸815-821[SLGGATE]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置14313-14334)、基元E(SEQ ID NO：3的氨基酸868-892[GQLYIGGVGLALGYWRDEEKTRKSF]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置14473-14547)、基元F(SEQ ID NO：3的氨基酸903-912[YKTGDLGRYL]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置14578-14607)、基元G(SEQ ID NO：3的氨基酸918-940[EFMGREDNQIKLRGYRVELGEIE]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置14623-14692)、基元H(SEQ ID NO：3的氨基酸1268-1274[LPEYMVP]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置15673-15693)、和基元I(SEQ ID NO：3的氨基酸1285-1297[LTSNGKVDRKALR]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置15724-15762)描绘；
●一个未知结构域，插入在氨酰基腺苷酸形成结构域的基元G和H之间(SEQ ID NO：3的氨基酸973-1256，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置14788-15639)；和
●肽基载体蛋白同源结构域(PCP)，由基元J(SEQ ID NO：3的氨基酸1344-1351[GATSIHIV]，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置15901-15924)描绘。
有人提出EPOS P涉及半胱氨酸的腺苷酸化活化(结合经活化的半胱氨酸成为氨酰基-S-PCP，在酶结合的半胱氨酸和EPOS A提供的乙酰基-S-ACP之间形成肽键)和通过分子内杂环化形成最初的噻唑啉环。EPOS P的未知结构域显示与来自芽孢杆菌物种的NAD(P)H氧化酶和还原酶有非常弱的同源性。由此，这个未知结构域和/或EPOS A的ER结构域可能涉及最初的2-甲基噻唑啉环氧化成2-甲基噻唑。
epoB(SEQ ID NO：1的核苷酸16251-21749)编码EPOS B(SEQ IDNO：4)，一种第一类聚酮化合物合酶，由单个模块组成，并包含下列结构域：KS(SEQ ID NO：1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO：4的氨基酸7-432)、AT(SEQ ID NO：1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO：4的氨基酸539-859)、脱水酶(DH)(SEQ ID NO：1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO：4的氨基酸869-1037)、β-酮还原酶(KR)(SEQ IDNO：1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO：4的氨基酸1439-1684)和ACP(SEQ ID NO：1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO：4的氨基酸1722-1792)。序列比较和基元分析揭示了EPOS B编码的AT对甲基丙二酸单酰CoA是特异的。EPOS A可能通过催化2-甲基-4-噻唑羧基-S-PCP起始基团与甲基丙二酸单酰-S-ACP的Claisen样缩合和伴随的C17的β一酮基还原成烯酰基，而参与第一种聚酮化合物链的延伸。
epoC(SEQ ID NO：1的核苷酸21746-43519)编码EPOS C(SEQ IDNO：5)，一种第一类聚酮化合物合酶，由4个模块组成。第一个模块包含KS结构域(SEQ ID NO：1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO：5的氨基酸39-457)、丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQ ID NO：1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO：5的氨基酸563-884)、KR(SEQ ID NO：1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO：5的氨基酸1147-1399)、和ACP(SEQ ID NO：1的核苷酸26045-26263，SEQ ID NO：5的氨基酸1434-1506)。这个模块引入乙酸基延伸单元(C14-C13)，并将位于C15的β-酮基还原成参与epothilone大内酯环最终内酯化的羟基基团。EPOS C的第二个模块包含KS(SEQ ID NO：1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO：5的氨基酸1524-1950)、丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQID NO：1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO：5的氨基酸2056-2377)、KR(SEQ ID NO：1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO：5的氨基酸2645-2895)、和ACP(SEQ ID NO：1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO：5的氨基酸2932-3005)。这个模块引入乙酸基延伸单元(C12-C11)，并将位于C13的β-酮基还原成羟基基团。由此，epothilone的初生聚酮化合物链相当于epothilone A，而在epothilone B中的C12引入甲基侧链将需要PKS后续C-甲基转移酶活性。位于C13-C12的环氧环的形成也将需要PKS后续氧化步骤。EPOS C的第三个模块包含KS(SEQ ID NO：1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO：5的氨基酸3024-3449)、丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQ ID NO：1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO：5的氨基酸3555-3876)、DH(SEQ ID NO：1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO：5的氨基酸3886-4048)、ER(SEQ IDNO：1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO：5的氨基酸4433-4719)、KR(SEQ ID NO：1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO：5的氨基酸4729-4974)、和ACP(SEQ ID NO：1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO：5的氨基酸5010-5082)。这个模块引入乙酸基延伸单元(C10-C9)，并完全还原位于C11的β-酮基。EPOS C的第四个模块包含KS(SEQ IDNO：1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO：5的氨基酸5103-5525)；甲基丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQ ID NO：1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO：5的氨基酸5631-5951)、DH(SEQ ID NO：1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO：5的氨基酸5964-6132)、ER(SEQ ID NO：1的核苷酸41369-42256，SEQ ID NO：5的氨基酸6542-6837)、KR(SEQID NO：1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO：5的氨基酸6857-7101)、和ACP(SEQ ID NO：1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO：5的氨基酸7140-7211)。这个模块引入丙酸基延伸单元(C24和C8-C7)，并完全还原位于C9的β-酮基。
epoD(SEQ ID NO：1的核苷酸43524-54920)编码EPOS D(SEQIDNO：6)，一种第一类聚酮化合物合酶，由2个模块组成。第一个模块包含KS结构域(SEQ ID NO：1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO：6的氨基酸35-454)、甲基丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQ ID NO：1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO：6的氨基酸561-881)、KR(SEQ ID NO：1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO：6的氨基酸1143-1393)、和ACP(SEQ ID NO：1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO：6的氨基酸1430-1503)。这个模块引入丙酸基延伸单元(C23和C6-C5)，并将位于C7的β-酮基还原成羟基基团。第二个模块包含KS(SEQ ID NO：1的核苷酸48087-49361，SEQ ID NO：6的氨基酸1522-1946)、甲基丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQ ID NO：1的核苷酸49680-50642，SEQ IDNO：6的氨基酸2053-2373)、DH(SEQ ID NO：1的核苷酸50670-51176，SEQ ID NO：6的氨基酸2383-2551)、甲基转移酶(MT，SEQ ID NO：1的核苷酸51534-52657，SEQ ID NO：6的氨基酸2671-3045)、KR(SEQID NO：1的核苷酸53697-54431，SEQ ID NO：6的氨基酸3392-3636)、和ACP(SEQ ID NO：1的核苷酸54540-54758，SEQ ID NO：6的氨基酸3673-3745)。这个模块引入丙酸基延伸单元(C21或C22和C4-C3)，并将位于C5的β-酮基还原成羟基基团。这个还原有些出乎意料，因为epothilone在C5含有酮基。然而，PKS模块推断的还原活性和最终聚酮化合物产物相应位置的氧化还原状态之间的这种不一致，已经在文献(见，例如，Schweche等人，美国国家科学院进展92：7839-7843(1995)和Schupp等人，FEMS微生物学通讯159：201-207(1998))中有报导。epothilone的一个重要特征是位于C4的偕甲基侧链基团(C21和C22)的存在。预测EPOS D的第二个模块将丙酸基单元引入到增长的聚酮化合物链，在C4提供一个甲基侧链。这个模块还包含整合到PKS中DH和KR结构域之间的甲基转移酶结构域，与在HMWP1耶尔森菌素合酶(A.M.Gehring，E.DeMoll，J.D.Fetherston，I.Mori，G.F.Mayhew，F.R.Blattner，C.T.Walsh，和R.D.Perry，鼠疫中的铁获取：鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)产生的耶尔森菌素的酶生源论中的模块原理(Iron acquisition in plague：modularlogic in enzymatic biogenesis of yersiniabactin by Yersiniapestis)化学生物学(Chem.Biol.)5，573-586，1998)中看到的排列相似。有人提出EPOS D中的这个MT结构域负责在C4引入该第二个甲基侧链基团(C21或C22)。
epoE(SEQ ID NO：1的核苷酸54935-62254)编码EPOS E(SEQ IDNO：7)，一种第一类聚酮化合物合酶，由一个模块组成，包含KS(SEQID NO：1的核苷酸55028-56284，SEQ ID NO：7的氨基酸32-450)、丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQ ID NO：1的核苷酸56600-57565，SEQ IDNO：7的氨基酸556-877)、DH(SEQ ID NO：1的核苷酸57593-58087，SEQ ID NO：7的氨基酸887-1051)、很可能无功能的ER(SEQ ID NO：1的核苷酸59366-60304，SEQ ID NO：7的氨基酸1478-1790)、KR(SEQID NO：1的核苷酸60362-61099，SEQ ID NO：7的氨基酸1810-2055)、ACP(SEQ ID NO：1的核苷酸61211-61426，SEQ ID NO：7的氨基酸2093-2164)、和硫酯酶(TE)(SEQ ID NO：1的核苷酸61427-62254，SEQID NO：7的氨基酸2165-2439)。这个模块中的ER结构域包含活性位点基元，其中具有一些高度不平常的氨基酸取代，可能使得这个结构域无活性。该模块引入乙酸基延伸单元(C2-C1)，并将位于C3的β-酮基还原成烯酰基基团。epothilone在C3含有羟基基团，所以这个还原也显得多余，如在EPOS D的第二个模块中讨论的。EPOS E的TE结构域参与已增长的聚酮化合物链经由C1羧基基团和C15羟基基团之间的内酯化的释放和环化。
在被测序区域中，epoA上游检测到五个ORF。部分测序的orf1在序列数据库中没有同源序列。ort2(SEQ ID NO：1反向互补链上的核苷酸3171-1900)推导的蛋白质产物(Orf2，SEQ ID NO：10)显示与分枝杆菌(Mycobacterium)和天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)的假设ORF有强相似性，以及与不同细菌的羧肽酶和DD-肽酶有更远的相似性。orf3(SEQ ID NO：1的核苷酸3415-5556)推导出来的蛋白质产物，Orf3(SEQ ID NO：11)显示与不同细菌的Na/H反向转运蛋白有同源性。Orf3可能参与从生产菌株中运出epothilone。orf4和orf5在序列数据库中没有同源序列。
在被测序区域中，epoE下游检测到十一个ORF。epoF(SEQ ID NO：1的核苷酸62369-63628)编码EPOS F(SEQ ID NO：8)，一种推导出来的与细胞色素P450加氧酶有强序列相似性的蛋白质。EPOS F可能参与调整碳C12、C5、和/或C3的氧化还原状态。orf14(SEQ ID NO：1的核苷酸67334-68251)推导出来的蛋白质，Orf14(SEQ ID NO：22)显示与GI：3293544(没有推测出功能的来自天蓝色链霉菌的假设蛋白质)及GI：2654559(人胚肺蛋白质)有强相似性。它还更远的与来自热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)阳离子流出系统蛋白质类GI：2623026相关，所以它可能还参与从生产细胞中运出epothilone。剩余的ORF(orf6-orf13和orf15)与序列数据库中的条目不显示同源性。
实施例13：epothilone生物合成基因的重组表达
为了达到比纤维堆囊菌发酵更高的产量，在异源有机体中表达本发明的epothilone合酶基因。用于异源表达的一种优选的宿主是链霉菌，例如天然产生聚酮化合物放线菌紫素的天蓝色链霉菌。用于在此宿主中表达重组PKS基因的技术描述于McDaniel等人，科学262：1546-1550(1993)和Kao等人，科学265：509-512(1994)。还可见，Holmes等人，欧洲分子生物学杂志12(8)：3183-3191(1993)和Bibb等人，基因38：215-226(1985)，以及美国专利号5,521,077，5,672,491，和5,712,146，此处引用作为参考。
根据某种方法，处理异源宿主菌株以包含放线菌紫素(act)基因簇的染色体删除。通过将DNA从温度敏感的供体质粒转移到大肠杆菌中的受体穿梭载体(McDaniel等人(1993)和Kao等人(1994))，以至于合酶基因通过载体中的同源重组实现转移，由此构建了含有本发明的epothilone合酶基因的表达质粒。或者，将epothilone合酶基因簇通过限制性片段连接导入载体。按照例如Kao等人(1994)描述的选择后，根据Hopwood等人，链霉菌的基因操作：实验室手册(Genetic Manipulation of Streptomyces：A Laboratory Manual)(John Innes Foundation，Norwich，United Kingdom，1985)提出的方案，将来自载体的DNA导入act-的天蓝色链霉菌菌株(此处引用作为参考)。在R2YE培养基(Hopwood等人(1985))上培养重组链霉菌菌株并生产epothilone。或者，在其它宿主有机体诸如假单胞菌、芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞和/或大肠杆菌中表达本发明的epothilone合酶基因。PKS和NRPS基因优选在大肠杆菌中使用pT7-7载体(使用T7启动子)表达。见Tabor等人，美国国家科学院进展82：1074-1078(1985)。在另一个实施方案中，使用表达载体pKK223-3和pKK223-2在大肠杆菌中，以转录或翻译融合形式在tac或trc启动子后表达PKS和NRPS基因。在天然不含有PKS酶翻译后修饰需要的磷酸泛酰巯基乙胺基(phosphopantetheinyl，P-pant)转移酶的异源宿主中表达PKS和NRPS基因，需要在宿主中共表达P-pant转移酶，如Kealey等人，美国国家科学院进展95：505-509(1998)描述的。
实施例14：从生产菌株中分离epothilone
WO93/10121(此处引用作为参考)，在美国专利号5,639,949的实施例57中，在Gerth等人，抗生素杂志49：560-563(1996)，和在瑞士专利申请号396/98(申请日期1998年2月19日)，和美国专利申请号09/248,910(还公开了优选的纤维堆囊菌突变菌株)中(此处引用作为参考)给出了培养、发酵、和用来分离聚酮化合物的提取步骤的实施例，对从天然和本发明的重组宿主中提取epothilone有用。下列步骤可以用来从人工培养的纤维堆囊菌菌株诸如So ce90中分离epothilone，而且还可以用来从重组宿主中分离epothilone。
A：eothilone生产菌株的培养
菌株：纤维堆囊菌Soce-90或本发明的重组宿主菌株
菌株保存：液氮
培养基：预培养和中间培养：G52
主要培养：1B12
G52培养基：
酵母提取物，低盐(BioSpringer，Maison Alfort，法国) 2g/l
MgSO4(7H2O) 1g/l
CaCl2(2H2O) 1g/l
脱脂大豆粉Soyamine 50T(Lucas Meyer，汉堡，德国) 2g/l
土豆淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，瑞士) 8g/l
葡萄糖，无水 2g/l
EDTA-Fe(III)-Na盐(8g/l) 1ml/l
用KOH调到pH7.4
灭菌：20mins，120℃
1B12培养基：
土豆淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，瑞士) 20g/l
脱脂大豆粉Soyamine 50T(Lucas Meyer，汉堡，德国) 11g/l
EDTA-Fe(III)-Na盐 8mg/l
用KOH调到pH7.8
灭菌：20mins，120℃
添加环糊精和环糊精衍生物：
不同浓度的环糊精(Fluka，Buchs，瑞士，或Wacker Chemie，Munich，德国)单独灭菌并在接种前加到1B12培养基中。
培养：从液氮安瓿瓶中取1ml纤维堆囊菌Soce-90悬浮液，转移到10ml G52培养基中(装在50mlErlenmeyer烧瓶中)并在摇床中于180rpm和30℃，25mm振幅培养3天。取5ml此培养物，加到45ml G52培养基中(装在200mlErlenmeyer烧瓶中)并在摇床中于180rpm和30℃，25mm振幅培养3天。然后取50ml此培养物，加到450ml G52培养基中(装在2升的Erlenmeyer烧瓶中)并在摇床中于180rpm和30℃，50mm振幅培养3天。
维持培养：每3-4天通过将50ml培养物加入到450ml G52培养基中(装在2升的Erlenmeyer烧瓶中)将培养物过量接种。所有实验和发酵都是用这种维持培养物开始进行的。
烧瓶中的测试：
(i)在摇瓶中的预培养
由500ml维持培养物开始，用50ml维持培养物接种1×450ml G52培养基并在摇床中以180rpm和30℃，50mm振幅培养4天。
(ii)在摇瓶中的主要培养
将添加了5g/l 4-吗啉代-丙烷磺酸(MOPS)粉的40ml 1B12培养基(装在200ml Erlenmeyer烧瓶中)与5ml 10x浓缩环糊精溶液混和，接种10ml预培养物并在摇床中以180rpm和30℃，50mm振幅培养5天。
发酵：以10升、100升和500升的量进行发酵。20升和100升发酵作为中间培养步骤。预培养和中间培养接种10％(v/v)维持培养物，而主要培养接种20％(v/v)中间培养物。重要：与振摇培养相反，发酵培养基的成分是根据最终培养液体积(包括接种液)计算的。如果，例如，18升培养基+2升接种液混和，那么称量用于20升的物质但是只配制成18升。
摇瓶中的预培养物：
由500ml维持培养物开始，4×450ml G52培养基(装在2升Erlenmeyer烧瓶中)每个用50ml维持培养物接种并在摇床中以180rpm和30℃，50mm振幅培养4天。
中间培养物，20升或100升：
20升：装在总容量30升的发酵罐中的18升G52培养基接种2升预培养物。培养持续3-4天，条件是：30℃，250rpm，0.5升空气每升液体每分钟，0.5巴超压，无pH控制。
100升：装在总容量150升的发酵罐中的90升G52培养基接种20升中间培养物中的10升。培养持续3-4天，条件是：30℃，150rpm，0.5升空气每升液体每分钟，0.5巴超压，无pH控制。
主要培养物，10升、100升或500升：
10升：用于10升1B12的培养基物质在7升水中灭菌，然后加入1升无菌的10％2-(羟丙基)-β-环糊精溶液，并接种2升的20升中间培养物。主要培养的持续时间是6-7天，条件是：30℃，250rpm，0.5升空气每升液体每分钟，0.5巴超压，pH用H2SO4/KOH控制到pH7.6+/-0.5(即pH7.1和8.1之间不用控制)。
100升：用于100升1B12的培养基物质在70升水中灭菌，然后加入10升无菌的10％2-(羟丙基)-β-环糊精溶液，并接种20升的20升中间培养物。主要培养的持续时间是6-7天，条件是：30℃，200rpm，0.5升空气每升液体每分钟，0.5巴超压，pH用H2SO4/KOH控制到pH7.6+/-0.5。100升发酵的接种链示意图见图1。
500升：用于500升1B12的培养基物质在350升水中灭菌，然后加入50升无菌的10％2-(羟丙基)-β-环糊精溶液，并接种100升的100升中间培养物。主要培养的持续时间是6-7天，条件是：30℃，120rpm，0.5升空气每升液体每分钟，0.5巴超压，pH用H2SO4/KOH控制到pH7.6+/-0.5。
产物分析：
样品的制备：
将50ml样品与2ml聚苯乙烯树脂Amberlite XAD16(Rohm+Haas，Frankfurt，德国)混和，并于30℃以180rpm振摇一小时。然后使用150μm尼龙筛过滤树脂，用少量水清洗然后与滤器一起加到15ml Nunc试管中。
将产物从树脂上洗脱：
向盛有滤器和树脂的试管中加入10ml异丙醇(＞99％)。然后，将密封的试管于室温在Rota-Mixer(Labinco BV，荷兰)上振摇30分钟。然后，离心出2ml液体，并使用移液器将上清液加到HPLC管中。
HPLC分析：
层析柱： Waters-Symetry C18，100×4mm，3.5μm
WATO66220+预备柱3.9×20mm
WATO54225
溶剂： A： 0.02％磷酸
B： 乙腈(HPLC级)
梯度： 41％ B 0-7min
100％ B 7.2-7.8min
41％ B 8-12min
烤箱温度：30℃
检测： 250nm，UV-DAD检测
加样体积：10μl
保持时间：EpoA：4.30min EpoB：5.38min
B：加入环糊精和环糊精衍生物对得到的epothilone浓度的影响
环糊精是环形(α-1，4)连接的α-D-吡喃型葡萄糖的寡糖，具有相对疏水的中央腔和亲水的外部表面区域。
具体区分下述物质(括号中的数字给出了每个分子的葡萄糖单元的数目)：α-环糊精(6)、β-环糊精(7)、γ-环糊精(8)、δ-环糊精(9)、ε-环糊精(10)、ζ-环糊精(11)、η-环糊精(12)、和θ-环糊精(13)。尤其优选δ-环糊精，特别是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精，或者它们的混合物。
环糊精衍生物主要是上述环糊精的衍生物，尤其是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精的衍生物，主要是那些有一个或几个甚至多达所有羟基(每个葡萄糖自由基有3个)被醚化或酯化的衍生物。醚主要是烷基醚，尤其是低级烷基，诸如甲基或乙基醚，还有丙基或丁基醚；芳香基羟烷基醚，诸如苯基羟基低级烷基醚，尤其苯基羟乙基醚；羟烷基醚，特别是羟基低级烷基醚，尤其是2-羟乙基醚，羟丙基醚诸如2-羟丙基醚或羟丁基醚诸如2-羟丁基醚；羧基烷基醚，特别是羧基低级烷基醚，尤其是羧甲基或羧乙基醚；衍生化羧基烷基醚，特别是衍生化羧基低级烷基醚，其中衍生化羧基是醚化或酰胺化的羧基(主要是氨基羰基、单-或二-低级烷基氨基羰基、吗啉代-、哌啶子基-、吡咯烷子基(pyrrolidino)-或哌嗪子基(piperazino)-羰基、或烷氧基羰基)，特别是低级烷氧羰基-低级烷基醚，例如甲氧羰基丙基醚或乙氧羰基丙基醚；磺基烷基醚，特别是磺基低级烷基醚，尤其是磺基丁基醚；其中一个或几个OH基团被具有下式的基团醚化的环糊精：
-O-[alk-O-]n-H
其中alk是烷基，尤其是低级烷基，而且n是2-12的整数，尤其是2-5，特别是2或3；其中一个或几个OH基团被下式的基团醚化的环糊精：
其中R’是氢、羟基、-O-(alk-O)z-H、-O-(alk(-R)-O-)p-H或-O-(alk(-R)-O-)q-alk-CO-Y；alk在所有情况中是烷基，尤其是低级烷基；m、n、p、q和z是1-12的整数，优选1-5，特别是1-3；Y是OR1或NR2R3，其中R1、R2和R3互相独立地是氢或低级烷基，或R2和R3与连接氮一起表示吗啉代、哌啶子基、吡咯烷子基或哌嗪子基；或者分支环糊精，其中存在与其它糖分子的醚化或乙缩醛，尤其是葡糖基-、二葡糖基-、(G2-β-环糊精)、麦芽糖基-或二麦芽糖基环糊精，或N-乙酰氨基葡糖基、氨基葡糖基-、N-乙酰氨基半乳糖基-或氨基半乳糖基-环糊精。
酯主要是烷酰酯，特别是低级烷酰酯，诸如环糊精的乙酰酯。
还有可能环糊精中同时存在两种或更多种不同的所述醚和酯基团。
两种或更多种所述环糊精和/或环糊精衍生物的混合物也可以存在。
特别优选的是α-、β-或γ-环糊精或它们的低级烷基醚，诸如甲基-β-环糊精或特别是2，6-二-O-甲基-β-环糊精，或特别是它们的羟基低级烷基醚，诸如2-羟丙基-α-、2-羟丙基-β-或2-羟丙基-γ-环糊精。
向培养基中加入环糊精或环糊精衍生物，其浓度优选0.02-10，更优选0.05-5，尤其0.1-4，例如0.1-2重量百分比(w/v)。
环糊精或环糊精衍生物是已知的或可以通过已知的方法生产(参阅例如US3,459,731；US4,383,992；US4,535,152；US4,659,696；EP0094157；EP0149197；EP0197571；EP0300526；EP0320032；EP0499322；EP0503710；EP0818469；WO90/12035；WO91/11200；WO93/19061；WO95/08993；WO96/14090；GB2,189,245；DE3,118,218；DE3,317,064及其中提到的有关环糊精或环糊精衍生物合成的参考文献或还有：T.Loftsson和M.E.Brewster(1996)，环糊精的药物应用：药物溶解性和稳定性(PharmaceuticalApplications of Cyclodextrins：Drug Solubilization andStabilisation)，药物科学杂志(Jounal of PharmaceuticalScience)85(10)：1017-1025；R.A.Rajewski和V.J.Stella(1996)，环糊精的药物应用：体内药物投递(Pharmaceutical Applications ofCyclodextrins：In Vivo Drug Delivery)，药物科学杂志85(11)：1142-1169)。
这里测试的所有环糊精衍生物可以从Fluka公司，Buchs，CH购得。测试在具有50ml培养容量的200ml摇瓶中进行。作为对照，使用装有吸附剂树脂Amberlite XAD-16(Rohm和Haas，Frankfurt，德国)和无任何吸附剂添加的摇瓶。培养5天后，通过HPLC测定下列epothilone的浓度：
表2：
| 添加物 | 定购号 | 浓度[％w/v]<sup>1</sup> | EpoA[mg/l] | EpoB[mg/l] |
| Amberlite XAD-16(v/v) | 2.0(％v/v) | 9.2 | 3.8 | |
| 2-羟丙基-β-环糊精 | 56332 | 0.1 | 2.7 | 1.7 |
| 2-羟丙基-β-环糊精 | 同上 | 0.5 | 4.7 | 3.3 |
| 2-羟丙基-β-环糊精 | 同上 | 1.0 | 4.7 | 3.4 |
| 2-羟丙基-β-环糊精 | 同上 | 2.0 | 4.7 | 4.1 |
| 2-羟丙基-β-环糊精 | 同上 | 5.0 | 1.7 | 0.5 |
| 2-羟丙基-α-环糊精 | 56330 | 0.5 | 1.2 | 1.2 |
| 2-羟丙基-α-环糊精 | 同上 | 1.0 | 1.2 | 1.2 |
| 2-羟丙基-α-环糊精 | 同上 | 5.0 | 2.5 | 2.3 |
| β-环糊精 | 28707 | 0.1 | 1.6 | 1.3 |
| β-环糊精 | 同上 | 0.5 | 3.6 | 2.5 |
| β-环糊精 | 同上 | 1.0 | 4.8 | 3.7 |
| β-环糊精 | 同上 | 2.0 | 4.8 | 2.9 |
| β-环糊精 | 同上 | 5.0 | 1.1 | 0.4 |
| 甲基-β-环糊精 | 66292 | 0.5 | 0.8 | ＜0.3 |
| 甲基-β-环糊精 | 同上 | 1.0 | ＜0.3 | ＜0.3 |
| 甲基-β-环糊精 | 同上 | 2.0 | ＜0.3 | ＜0.3 |
| 2，6二-o-甲基-β-环糊精 | 39915 | 1.0 | ＜0.3 | ＜0.3 |
| 2-羟丙基-γ-环糊精 | 56334 | 0.1 | 0.3 | ＜0.3 |
| 2-羟丙基-γ-环糊精 | 同上 | 0.5 | 0.9 | 0.8 |
| 2-羟丙基-γ-环糊精 | 同上 | 1.0 | 1.1 | 0.7 |
| 2-羟丙基-γ-环糊精 | 同上 | 2.0 | 2.6 | 0.7 |
| 2-羟丙基-γ-环糊精 | 同上 | 5.0 | 5.0 | 1.1 |
| 无添加物 | 0.5 | 0.5 |
1)除Amberlite(％v/v)之外，所有百分比均为重量百分比(％w/v)。
少数测试的环糊精(2，6-二-O-甲基-β-环糊精、甲基-β-环糊精)显示在使用的浓度对epothilone产量没有影响或有负面影响。1-2％2-羟基-丙基-β-环糊精和β-环糊精在实施例中与不使用环糊精生产相比将epothilone产量提高6-8倍。
C：有1％2-(羟丙基)-β-环糊精的10升发酵
发酵在15升玻璃发酵罐中进行。培养基含有10g/l的2-(羟丙基)-β-环糊精(购自Wacker Chemie，Munich，德国)。发酵过程列于表3。发酵在6天后停止并开始提取。
表3：10升发酵的过程
| 培养时间[天] | epothilone A[mg/l] | epothilone B[mg/l] |
| 0 | 0 | 0 |
| 1 | 0 | 0 |
| 2 | 0.5 | 0.3 |
| 3 | 1.8 | 2.5 |
| 4 | 3.0 | 5.1 |
| 5 | 3.7 | 5.9 |
| 6 | 3.6 | 5.7 |
D：有1％2-(羟丙基)-β-环糊精的100升发酵
发酵在150升发酵罐中进行。培养基含有10g/l的2-(羟丙基)-β-环糊精。发酵过程列于表4。发酵液在7天后收获并提取。
表4：100升发酵的过程
| 培养时间[天] | epothilone A[mg/l] | epothilone B[mg/l] |
| 0 | 0 | 0 |
| 1 | 0 | 0 |
| 2 | 0.3 | 0 |
| 3 | 0.9 | 1.1 |
| 4 | 1.5 | 2.3 |
| 5 | 1.6 | 3.3 |
| 6 | 1.8 | 3.7 |
| 7 | 1.8 | 3.5 |
E：有1％2-(羟丙基)-β-环糊精的500升发酵
发酵在750升发酵罐中进行。培养基含有10g/l的2-(羟丙基)-β-环糊精。发酵过程列于表5。发酵液在7天后收获并提取。
表5：500升发酵的过程
| 培养时间[天] | epothilone A[mg/l] | epothilone B[mg/l] |
| 0 | 0 | 0 |
| 1 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 0 |
| 3 | 0.6 | 0.6 |
| 4 | 1.7 | 2.2 |
| 5 | 3.1 | 4.5 |
| 6 | 3.1 | 5.1 |
F：不加吸附剂的10升发酵比较实施例
发酵在15升玻璃发酵罐中进行。培养基不含有任何环糊精或其它吸附剂。发酵过程列于表6。没有收获并提取发酵液。
表6：不含吸附剂的10升发酵的过程
| 培养时间[天] | epothilone A[mg/l] | epothilone B[mg/l] |
| 0 | 0 | 0 |
| 1 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 0 |
| 3 | 0 | 0 |
| 4 | 0.7 | 0.7 |
| 5 | 0.7 | 1.0 |
| 6 | 0.8 | 1.3 |
G：逐步得到epothilone：从500升主要培养物中分离
从实施例2D的500升主要培养收获的体积是450升，并使用Westfalia澄清分离器(clarifying separator)SA-20-06型(rpm＝6500)分离成液相(离心液+冲洗水＝650升)和固相(细胞＝大约15kg)。发现epothilone的主要部分在离心液中。离心所得的细胞浆含有＜15％的测定的epothilone部分，不再进一步处理。然后将650升离心液置于4000升搅拌器中，与10升Amberlite XAD-16(离心液∶树脂＝65∶1)混合并搅拌。接触大约2小时后，在Heine溢流式离心机(overflow centrifuge)(桶容量40升；rpm＝2800)中离心下树脂。从离心机上卸下树脂，并用10-15升去离子水清洗。解吸附作用通过两次搅拌树脂进行，每次均将一部分与30升异丙醇在30升玻璃搅拌器中搅拌30分钟。使用抽滤器从树脂中分离出异丙醇相。然后在真空操作的循环蒸发器(Schmid-Verdampfer)中加入15-20升水将异丙醇从混合异丙醇相中除去，并将得到的大约10升水相提取3次，每次用10升乙酸乙酯抽提。提取在30升玻璃搅拌器中进行。在真空操作的循环蒸发器(Schmid-Verdampfer)中将乙酸乙酯提取液浓缩至3-5升，之后在真空下在旋转蒸发器(Büchi型)中浓缩至干燥。得到50.2g乙酸乙酯提取物。将乙酸乙酯提取物溶解于500ml甲醇中，使用折叠滤器将不溶部分滤掉，并将溶液加到10kg Sephadex LH 20层析柱(Pharmacia，Uppsala，瑞典)(层析柱直径20cm，填充高度大约1.2m)上。用甲醇作为洗脱液进行洗脱。epothilone A和B主要存在于级分21-23中(每份级分1升)。在真空中在旋转蒸发器中将这些级分浓缩至干燥(总重量9.0g)。然后将这些Sephadex洗脱峰级分(9.0g)溶解于92ml乙腈∶水∶二氯甲烷＝50∶40∶2中，将溶液用折叠滤器过滤并加到RP层析柱(配备Prepbar200，Merck；2.0kgLiChrospher RP-18，Merch，颗粒大小12μm，柱直径10cm，填充高度42cm；Merch，Darmstadt，德国)上。用乙腈∶水＝3∶7进行洗脱(流速＝500ml/min；epothilone A的保持时间＝大约51-59min；epothilone B的保持时间＝大约60-69min)。级分用UV检测仪于250nm监测。在真空下在Büchi-Rotavapor旋转蒸发器上将级分浓缩至干燥。epothilone A洗脱峰级分的重量是700mg，而且根据HPLC(外部标准)含量是75.1％。epothilone B洗脱峰级分的重量是1980mg，而且含量根据HPLC(外部标准)是86.6％。最后，epothilone A收集部分(700mg)由5ml乙酸乙酯∶甲苯＝2∶3结晶，并产生170mgepothilone A的纯晶体[含量根据HPLC(面积％)＝94.3％]。epothilone B收集部分(1980mg)由18ml甲醇进行结晶并产生1440mgepothilone B的纯晶体[含量根据HPLC(面积％)＝99.2％]。m.p.(epothilone B)：例如124-125℃；epothilone B的1H-NMR数据：500MHz-NMR，溶剂：DMSO-d6。化学取代δ以相对于TMS的ppm表示。s＝单峰；d＝双峰；m＝多重峰
δ(峰裂数) integral(H的数目)
7.34(s) 1
6.50(s) 1
5.28(d) 1
5.08(d) 1
4.46(d) 1
4.08(m) 1
3.47(m) 1
3.11(m) 1
2.83(dd) 1
2.64(s) 3
2.36(m) 2
2.09(s) 3
2.04(m) 1
1.83(m) 1
1.61(m) 1
1.47-1.24(m) 4
1.18(s) 6
1.13(m) 2
1.06(d) 3
0.89(d+s，重叠) 6
∑＝41
实施例15：重组生产的epothilone的医疗用途
包含epothilone的药物制剂或组合物可被用于例如癌症(诸如各种人实体瘤)的治疗。这些抗癌制剂包含(例如)活性剂量的epothilone和一种或几种有机或无机液体或固体的适合药用的载体物质。这些制剂以例如肠道、鼻腔、直肠、口腔、或非肠道方式，尤其是肌肉内或静脉内方式给药。活性成分的剂量取决于病人的体重、年龄和体格和药物动力学状况并进一步取决于给药方式。因为epothilone模仿紫杉醇的生物学效应，故epothilone有可能在使用紫杉醇治疗癌症的组合物和方法中取代紫杉醇。见，例如，美国专利号5,496,804，5,565,478，和5,641,803，引用这些作为参考。
例如，用于治疗时，提供的epothilone B是2ml玻璃瓶单独包装，配制成1mg/ml清亮的、无色静脉注射液浓缩物。该物质用聚乙二醇300(PEG300)配制并用50或100ml 0.9％氯化钠注射液USP稀释以达到药物输液需要的最终浓度。以每21天一次30分钟静脉输液(三周治疗一次)六个循环或者每7天一次30分钟静脉输液(一周治疗一次)进行。
优选的，对于每周一次的治疗，剂量在大约0.1-大约6mg/m2，优选大约0.1-大约5mg/m2，更优选大约0.1-大约3mg/m2，甚至更优选0.1-1.7mg/m2，最优选大约0.3-大约1mg/m2之间；对于三周一次的治疗(每三周一次或每个第三周治疗)，剂量在大约0.3-18mg/m2，优选大约0.3-大约15mg/m2，更优选大约0.3-12mg/m2，甚至更优选大约0.3-大约7.5mg/m2，还要更优选大约0.3-大约5mg/m2，最优选大约1.0-3.0mg/m2之间。优选这个剂量通过对人进行2-180min，优选2-120min，更优选大约5-大约30min，最优选大约10-大约30min(如大约30min)完成静脉内(i.v.)给药。
虽然本发明已经由它们的特定实施方案作为参考描述过，明显的，众多的变化、修饰和实施方案是可能的，相应的，所有这些变化、修饰和实施方案将被看作是在本发明的精神和范围之内。
序列表
<110>Novartis AG
<120>用于epothilone生物合成的基因
<130>4-30582A
<140>
<141>
<160>30
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>68750
<212>DNA
<213>纤维堆囊菌
<400>1
aagcttcgct cgacgccctc ttcgcccgcg ccacctctgc ccgtgtgctc gatgatggcc 60
acggccgggc cacggagcgg catgtgctcg ccgaggcgcg cgggatcgag gacctccgcg 120
ccctccgaga gcacctccgc atccaggaag gggggccgtc ctttcactgc atgtgcctcg 180
gcgacctgac ggtggagctc ctcgcgcacg accagcccct cgcgtccatc agcttccacc 240
atgcccgcag cctgaggcac cccgactgga cctcggacgc gatgctcgtc gacggccccg 300
cgctcgtccg gtggctcgcc gcgcgcggcg cgccgggtcc cctccgcgag tacgaagagg 360
agcgcgagcg agcccgaacc gcgcaggagg cgaggcgcct gtggctcgcg gccgcgccgc 420
cctgcttcgc gcccgatctg ccccgcttcg aggacgacgc caacgggctg ccgctcggcc 480
cgatgtcgcc tgaagtcgcc gaggccgagc ggcgcctccg cgcctcgtac gcgactcctg 540
agctcgcctg tgccgcgctg ctcgcctggc tcgggacggg cgcgggtccc tggtccggat 600
atcccgccta cgagatgctg ccagagaatc tgctcctcgg gtttggcctc ccgaccgcga 660
tcgccgcggc ctccgcgccc ggcacatcgg aggccgctct ccgcggcgca gcgcggctgt 720
tcgcctcctg ggaggtcgta tcgagcaaga agagccagct cggcaacatc cccgaagccc 780
tgtgggagcg gctccggacg atcgtccgcg cgatgggcaa tgccgacaac ctctctcgct 840
tcgagcgcgc cgaggcgatc gcggcggagg tgcgccgcct gcgcgcacag ccggcgccct 900
tcgcggcggg cgccggcctg gcggtcgctg gggtctcctc gagcggccgg ctctcgggcc 960
tcgtgaccga cggagacgca ttgtactccg gcgacggcaa cgacatcgtc atgttccaac 1020
ccggccggat ctcgccggtc gtgctgctcg ccggaaccga tcccttcttc gagctcgcac 1080
cgcccctcag ccagatgctc ttcgtcgcgc acgccaacgc gggcaccatc tccaaggtcc 1140
tgacggaagg cagccccctc atcgtgatgg caagaaacca ggcgcgaccg atgagcctcg 1200
tccacgctcg cgggttcatg gcgtgggtca accaggccat ggtgcccgac cccgagcggg 1260
gcgcgccctt cgtcgtccag cgctcgacca tcatggaatt cgagcacccc acgcctcgtt 1320
gtctccacga gcccgccggc agcgctttct ccctcgcctg cgacgaggag cacctctact 1380
ggtgcgagct ttcggctggc cggctcgagc tatggcgcca cccgcaccac cgccccggcg 1440
ccccgagccg cttcgcgtac ctcggcgagc accccattgc ggcgacctgg tacccctcgc 1500
tcaccctcaa tgcgacccac gtgctgtggg ccgaccctga tcgcagggcc atcctcgggg 1560
tcgacaagcg caccggcgta gagcccatcg tcctcgcgga gacgcgccat cccccggcgc 1620
acgtcgtgtc cgaggaccgg gacatcttcg cgcttaccgg acagcccgac tcccgcgact 1680
ggcacgtcga gcacatccgc tccggcgcct ccaccgtcgt ggccgactac cagcgccagc 1740
tatgggaccg ccctgacatg gtgctcaatc ggcgcggcct cttcttcacg acgaacgacc 1800
gcatcctgac gctcgcccgc agctgacatc gctcgacgcc gggccgctca tcgagggcgc 1860
ccggaccgag ctggcgaccc gccgctggcg ggccgcagct catgccgatt cggtggcgac 1920
gtagacgctg cgccagaaac gctcgagagc ccccgagaac aggaagccgg cggattgtgt 1980
catcacgatc ccgatcagct cgcggcccgg atcattgatc caggacgtcc cgaacccgcc 2040
gtcccaccca tagcgcccgg gcacctccga gaccgcgtcc ggcgccgtga ccacggccat 2100
cccataaccc cagccgtgcg tctcgaagaa gcccgggaaa aacgaggacg ccgccttctg 2160
ggccggcgtg aggtgatcgg ccgtcatctc gcgcaccgag gcggcgctca agagccgccg 2220
gccctcgtgc acaccgccgt tcatgagcat gcgcgcgaac aggaggtagt cgtccaccgt 2280
cgacacgagc ccggcggcgc ccgaagggaa cgccggcggg ctggcatagg cgctctcggc 2340
cccgtcgcga tccatgcgcg tcttctcccc cgtctgctcg tcggtgaagt aaccgcagcc 2400
cgcgaaccga gcgagcttgt ccgccgggac gtgaaagtcg gtgtcccgca tcccgagcgg 2460
cgcgaggatg cgctcgcgca cgaacgcatc gaagccctgg tcggccgcgc gccccacgag 2520
caccccctgc accaggctcc ccgtgttgta catccactgc gcccccggct gatgcatgag 2580
cggcagcgtc ccgagccgcc ggatccactc gtctggcccg tgcggcgtca tcggcaccgg 2640
ctgcgcgttg acgagcccga gctcgtcgat ggcccgctgg atcggcgacg atgcgtcgaa 2700
cgagattccg aagcccatcg tgaacgtcat caggtcgcgc accgtgatcg gccgctccgc 2760
gggcaccgtc tcgtcgatcg gaccatcgat gcgcgccagc accttccggt tcgcgagctc 2820
cggcaaccat cggtcgacgg gggagtcgag gtcgagcttg ccttcctcga cgagcatcat 2880
caccgccgtc gcggtgaccg ccttcgtcat cgaggcgatc cggaagatcg tgtcccgccg 2940
catgggcgcg ctgccgccga gctcggtcac gcccaccgcg tccacgtgca cgtcgtcgcc 3000
gcgcgcgacc agccagaccg ctcccggcat ctgccccgcc gccacctccg ccgccatcac 3060
ctcgcgcgcg ggcgccagcg cgccggcccc cgcgtcctgc cctggctgcc cctcctcctc 3120
ggccccaccc aacgcgcacc ccggcgccgc cacgctgatc aaagctccca taaactcccg 3180
ccttctcatg accgtcgatg cctctccgag cgggggcgcc tgcccctgcc gagagcactg 3240
actgcccgcg cccgaaaaaa tcatcggtgc cccgtcacga tcgccgccgg gcgtggctcc 3300
gcccggccgc ccgctcgggc gcccgcccct ggacgagcaa agctcgcccg cccgcgctca 3360
gcacgccgct tgccatgtcc ggcctgcacc cacaccgagg agccacccac cctgatgcac 3420
ggcctcaccg agcggcaggt cctgctctcg ctcgtcaccc tcgcgctcat cctcgtgacc 3480
gcgcgcgcct ccggcgagct cgcgcggcgg ctgcgccagc ccgaggtgct cggggagctc 3540
ttcggcggcg tcgtgctggg cccctccgtc gtcggcgcgc tcgcgcccgg gttccatcga 3600
gccctcttcc aggagccggc ggtcggggtc gtgctctcgg gcatctcctg gataggcgcg 3660
ctcctcctgc tgctgatggc gggcatcgag gtcgacgtgg gcatcctgcg caaggaggcg 3720
cgccccgggg cgctctcggc gctcggcgcg atcgcgcccc cgctcgcggc gggcgccgcc 3780
ttctcggcgc tcgtgctcga tcggcccctt ccgagcggcc tcttcctcgg gatcgtgctc 3840
tcggtgacgg cggtcagcgt gatcgcgaag gtgctgatcg agcgcgagtc gatgcgccgc 3900
agctatgcgc aggtgacgct cgcggcgggg gtggtcagcg aggtcgctgc ctgggtgctc 3960
gtcgcgatga cgtcgtcgag ctacggcgcg tcgcccgcgc tggcggtcgc ccggagcgcg 4020
ctcctggcga gcggattctt gctgttcatg gtgctcgtcg ggcggcggct cacccacctc 4080
gcgatgcgct gggtggccga cgcgacgcgc gtctccaagg gacaggtgtc gctcgtcctc 4140
gtcctcacgt tcctggccgc ggcgctgacg cagcggctcg gcctgcaccc gctgctcggc 4200
gcgttcgcgc tcggcgtgct gctcaacagc gctcctcgca ccaaccgccc tctcctcgac 4260
ggcgtgcaga cgctcgtggc gggcctcttc gcgcctgtgt tcttcgtcct cgcgggcatg 4320
cgcgtcgacg tgtcgcagct gcgcacgccg gcggcgtggg ggacggtcgc gttgctgctg 4380
gcgaccgcga cggcggcgaa ggtcgtcccc gccgcgctcg gcgcgcggct cggcgggctc 4440
aggggcagcg aggcggcgct cgtggcggtg ggcctgaaca tgaagggcgg cacggacctc 4500
atcgtcgcga tcgtcggcgt cgagctcggg ctcctctcca acgaggctta tacgatgtac 4560
gccgtcgtcg cgctggtcac ggtgaccgcc tcacccgcgc tcctcatctg gctcgagaaa 4620
agggcgcctc cgacgcagga ggagtcggct cgcctcgagc gcgaggaggc cgcgaggcgc 4680
gcgtacatcc ccggggtcga gcggatcctc gtcccgatcg tggcgcacgc cctgcccggg 4740
ttcgccacgg acatcgtgga gagcatcgtc gcctccaagc gaaagctcgg cgagacggtc 4800
gacatcacgg agctctccgt ggagcagcag gcgcccggcc catcgcgcgc cgcgggggag 4860
gcgagccggg ggctcgcgag gctcggcgcg cgcctccgcg tcggcatctg gcggcaaagg 4920
cgcgagctgc gcggctcgat ccaggcgatc ctgcgcgcct cgcgggatca cgatctgctc 4980
gtgatcggcg cgcgatcgcc ggcgcgcgcg cgcggaatgt cgttcggtcg cctgcaggac 5040
gcgatcgtcc agcgggccga gtccaacgtg ctcgtcgtgg tgggcgaccc tccggcggcg 5100
gagcgcgcct ccgcgcggcg gatcctcgtc ccgatcatcg gcctcgagta ctccttcgcc 5160
gccgccgatc tcgcggccca cgtggcgctg gcgtgggacg ccgagctcgt gctgctcagc 5220
agcgcgcaga ccgatccggg cgcggtcgtc tggcgcgatc gcgagccatc ccgggtgcgc 5280
gcggtggcgc ggagcgtcgt cgacgaggcg gtcttccggg ggcgccggct cggcgtgcgc 5340
gtctcgtcgc gcgtgcacgt gggcgcgcac ccgagcgacg agataacgcg ggagctcgcg 5400
cgcgccccgt acgatctgct cgtgctcgga tgctacgacc atgggccgct cggccggctc 5460
tacctcggca gcacggtcga gtcggtggtg gtccggagcc gggtgccggt cgcgttgctc 5520
gtcgcgcatg gagggactcg agagcaggtg aggtgaggct tccaccgcgc tcgcccgtga 5580
ggaagcgagc gcccggctct gccgacgatc gtcactcccg gtccgtgtag gcgatcgtgc 5640
tgagcagcgc gttctccgcc tgacgcgagt cgagccgggt atgctgcacg acgatggggg 5700
cgtccgattc gatcacgctg gcatagtccg tatcgcgcgg gatcggctcg ggttcggtca 5760
gatcgttgaa ccggacgtgc cgggtgcgcc tcgctggaac ggtcacccgg taaggcccgg 5820
cggggtcgcg gtcgctgaag taaacggtga tggcgacctg cgcgtcccgg tccgacgcat 5880
tcaacaggca ggccgtctca tggctcgtca tctgcggctc aggtccgttg ctcccgcctg 5940
ggatgtagcc ctctgcgatt gcacagcgcg tccgcccgat cggcttgtcc atgtgtcctc 6000
cctcctggct cctctttggc agcctccctc tgctgtccag gagcgatggc ctcttcgctc 6060
gacgcgctcg gggatccatg gctgaggatc ctcgccgagc gctccctgcc gaccggcgcg 6120
ccgagcgccg acgggctttg aaagcgcgcg accggccagc ccggacgcgg gcccgagagg 6180
gacagtgggt ccgccgtgaa gcagagaggc gatcgaggtg gtgagatgaa acacgtcgac 6240
acgggccgac gattcggccg ccggataggg cacacgctcg gtcttctcgc gagcatggcg 6300
ctcgccggct gcggcggtcc gagcgagaaa accgtgcagg gcacgcggct cgcgcccggc 6360
gccgatgcgc gcgtcaccgc cgacgtcgac cccgacgccg cgaccacgcg gctggcggtg 6420
gacgtcgttc acctctcgcc gcccgagcgg ctcgaggccg gcagcgagcg gttcgtcgtc 6480
tggcagcgtc cgagccccga gtccccgtgg cgacgggtcg gagtgctcga ctacaatgct 6540
gacagccgaa gaggcaagct ggccgagacg accgtgccgt atgccaactt cgagctgctc 6600
atcaccgccg agaagcagag cagccctcag tcgccatcgt ctgccgccgt catcgggccg 6660
acgtctgtcg ggtgacatcg cgctatcagc agcgctgagc ccgccagcag gccccagggc 6720
cctgcctcga tggccttccc catcacccct gcgcactcct ccagcgacgg ccgcgcagcg 6780
acggccgcgt ccaagcaacc gccgtgccgg cgcggctcca cgcgcgcgac aggcgagcgt 6840
cctggcgcgg cctgcgcatc gctggaagga tcggcggagc atggatagag aatcgaggat 6900
cgcgatcttt gttgccatcg cagccaacgt ggcgatcgcg gcggtcaagt tcatcgccgc 6960
cgccgtgacc ggcagctcgg cgaggcgttt gccgacttcg gcggcgtccc gcgcgtgctg 7020
ctctacgaca acctcaagag cgccgtcgtc gagcgccacg gcgacgcgat ccggttccac 7080
cccacgctgc tggctctgtc ggcgcattac cgcttcgagc cgcgccccgt cgccgtcgcc 7140
cgcggcaacg agaagggccg cgtccagcgc gccatcacgg cgtggacgac atggcgcgga 7200
aacgtcgtcg taaccgccca gcaatgtcat gggaatggcc ccttgaaatg gccccttgag 7260
ggggctggcc ggggtcgacg atatcgcgcg atctccccgt caattcccga tggtaaaaga 7320
aaaatttgtc atagatcgta agctgtgata gtggtctgtc ttacgttgcg tcttccgcac 7380
ctcgagcgag ttctctcgga taactttcaa tttttccgag gggggcttgg tctctggttc 7440
ctcaggaagc ctgatcggga cgagctaatt cccatccatt tttttgaggc tctgctcaaa 7500
gggattagat cgagtgagac agttcttttg cagtgcgcga agaacctggg cctcgaccgg 7560
aggacgatcg acgtccgcga gcgggtcagc cgctgaggat gtgcccgtcg tggcggatcg 7620
tcccatcgag cgcgcagccg aagatccgat tgcgatcgtc ggagcgagtt gccgtctgcc 7680
cggtggcgtg atcgatctga gcgggttctg gacgctcctc gagggctcgc gcgacaccgt 7740
cgggcgagtc cccgccgaac gctgggatgc agcagcgtgg tttgatcccg accccgatgc 7800
cccggggaag acgcccgtta cgcgcgcatc tttcctgagc gacgtagcct gcttcgacgc 7860
ctccttcttc ggcatctcgc ctcgcgaagc gctgcggatg gaccctgcac atcgactctt 7920
gctggaggtg tgctgggagg cgctggagaa cgccgcgatc gctccatcgg cgctcgtcgg 7980
tacggaaacg ggagtgttca tcgggatcgg cccgtccgaa tatgaggccg cgctgccgca 8040
agcgacggcg tccgcagaga tcgacgctca tggcgggctg gggacgatgc ccagcgtcgg 8100
agcgggccga atctcgtatg ccctcgggct gcgagggccg tgtgtcgcgg tggatacggc 8160
ctattcgtcc tcgctggtgg ccgttcatct ggcctgtcag agcttgcgct ccggggaatg 8220
ctccacggcc ctggctggtg gggtatcgct gatgttgtcg ccgagcaccc tcgtgtggct 8280
ctcgaagacc cgggcgctgg ccagggacgg tcgctgcaag gcattttcgg cggaggccga 8340
tgggttcgga cgaggcgaag ggtgcgccgt cgtggtcctc aagcggctca gtggagcccg 8400
cgcggacggc gatcggatat tggcggtgat tcgaggatcc gcgatcaatc acgacggtgc 8460
gagcagcggt ctgaccgtgc cgaacgggag ctcccaagaa atcgtgctga aacgggccct 8520
ggcggacgca ggctgcgccg cgtcttcggt gggttatgtc gaggcacacg gcacgggcac 8580
gacgcttggt gaccccatcg aaatccaagc tctgaatgcg gtatacggcc tcgggcgaga 8640
tgtcgccacg ccgctgctga tcgggtcggt gaagaccaac cttggccatc ctgagtatgc 8700
gtcggggatc actgggctgc tgaaggtcgt cttgtccctt cagcacgggc agattcctgc 8760
gcacctccac gcgcaggcgc tgaacccccg gatctcatgg ggtgatcttc ggctgaccgt 8820
cacgcgcgcc cggacaccgt ggccggactg gaatacgccg cgacgggcgg gggtgagctc 8880
gttcggcatg agcgggacca acgcgcacgt ggtgctggaa gaggcgccgg cggcgacgtg 8940
cacaccgccg gcgccggagc gaccggcaga gctgctggtg ctgtcggcaa ggaccgcgtc 9000
agccctggat gcacaggcgg cgcggctgcg cgaccatctg gagacctacc cttcgcagtg 9060
tctgggcgat gtggcgttca gtctggcgac gacgcgcagc gcgatggagc accggctcgc 9120
ggtggcggcg acgtcgaggg aggggctgcg ggcagccctg gacgctgcgg cgcagggaca 9180
gacgtcgccc ggtgcggtgc gcagtatcgc cgattcctca cgcggcaagc tcgcctttct 9240
cttcaccgga cagggggcgc agacgctggg catgggccgt gggctgtacg atgtatggtc 9300
cgcgttccgc gaggcgttcg acctgtgcgt gaggctgttc aaccaggagc tcgaccggcc 9360
gctccgcgag gtgatgtggg ccgaaccggc cagcgtcgac gccgcgctgc tcgaccagac 9420
agccttcacc cagccggcgc tgttcacctt cgaatatgcg ctcgccgcgc tgtggcggtc 9480
gtggggtgta gagccggagt tggtcgccgg ccatagcatc ggtgagctgg tggctgcctg 9540
cgtggcgggc gtgttctcgc ttgaggacgc ggtgttcctg gtggctgcgc gcgggcgcct 9600
gatgcaggcg ctgccggccg gcggggcgat ggtgtcgatc gaggcgccgg aggccgatgt 9660
ggctgctgcg gtggcgccgc acgcagcgtc ggtgtcgatc gccgcggtca acgctccgga 9720
ccaggtggtc atcgcgggcg ccgggcaacc cgtgcatgcg atcgcggcgg cgatggccgc 9780
gcgcggggcg cgaaccaagg cgctccacgt ctcgcatgcg ttccactcac cgctcatggc 9840
cccgatgctg gaggcgttcg ggcgtgtggc cgagtcggtg agctaccggc ggccgtcgat 9900
cgtcctggtc agcaatctga gcgggaaggc ttgcacagac gaggtgagct cgccgggcta 9960
ttgggtgcgc cacgcgcgag aggtggtgcg cttcgcggat ggagtgaagg cgctgcacgc 10020
ggccggtgcg ggcaccttcg tcgaggtcgg tccgaaatcg acgctgctcg gcctggtgcc 10080
tgcctgcatg ccggacgccc ggccggcgct gctcgcatcg tcgcgcgctg ggcgtgacga 10140
gccggcgacc gtgctcgagg cgctcggcgg gctctgggcc gtcggtggcc tggtctcctg 10200
ggccggcctc ttcccctcag gggggcggcg ggtgccgctg cccacgtacc cttggcagcg 10260
cgagcgctac tggatcgaca cgaaagccga cgacgcggcg cgtggcgacc gccgtgctcc 10320
gggagcgggt cacgacgagg tcgaggaggg gggcgcggtg cgcggcggcg accggcgcag 10380
cgctcggctc gaccatccgc cgcccgagag cggacgccgg gagaaggtcg aggccgccgg 10440
cgaccgtccg ttccggctcg agatcgatga gccaggcgtg cttgatcacc tcgtgcttcg 10500
ggtcacggag cggcgcgccc ctggtctggg cgaggtcgag atcgccgtcg acgcggcggg 10560
gctcagcttc aatgatgtcc agctcgcgct gggcatggtg cccgacgacc tgccgggaaa 10620
gcccaaccct ccgctgctgc tcggaggcga gtgcgccggg cgcatcgtcg ccgtgggcga 10680
gggcgtgaac ggcctcgtgg tgggccaacc ggtcatcgcc ctttcggcgg gagcgtttgc 10740
tacccacgtc accacgtcgg ctgcgctggt gctgcctcgg cctcaggcgc tctcggcgat 10800
cgaggcggcc gccatgcccg tcgcgtacct gacggcatgg tacgcgctcg acagaatagc 10860
ccgccttcag ccgggggagc gggtgctgat ccatgcggcg accggcgggg tcggtctcgc 10920
cgcggtgcag tgggcgcagc acgtgggagc cgaggtccat gcgacggccg gcacgcccga 10980
gaaacgcgcc tacctggagt cgctgggcgt gcggtatgtg agcgattccc gctcggaccg 11040
gttcgtcgcc gacgtgcgcg cgtggacggg cggcgaggga gtagacgtcg tgctcaactc 11100
gctctcgggc gagctgatcg acaagagttt caatctcctg cgatcgcacg gccggtttgt 11160
ggagctcggc aagcgcgact gttacgcgga taaccagctc gggctgcggc cgttcctgcg 11220
caatctctcc ttctcgctgg tggatctccg ggggatgatg ctcgagcggc cggcgcgggt 11280
ccgtgcgctc ttggaggagc tcctcggcct gatcgcggca ggcgtgttca cccctccccc 11340
catcgcgacg ctcccgatcg cccgtgtcgc cgatgcgttc cggagcatgg cgcaggcgca 11400
gcatcttggg aagctcgtac tcacgctggg tgacccggag gtccagatcc gtattccaac 11460
ccacgcaggc gccggcccgt ccaccgggga tcgggacctg ctcgacaggc tcgcgtcagc 11520
tgcgccggcc gcgcgcgcgg cggcgctgga ggcgttcctc cgtacgcagg tctcgcaggt 11580
gctgcgcacg cccgaaatca aggtcggcgc ggaggcgctg ttcacccgcc tcggcatgga 11640
ctcgctcatg gccgtggagc tgcgcaatcg tatcgaggcg agcctcaagc tgaagctgtc 11700
gacgacgttc ctgtccacgt cccccaatat cgccttgttg gcccaaaacc tgttggatgc 11760
tctcgccaca gctctctcct tggagcgggt ggcggcggag aacctacggg caggcgtgca 11820
aaacgacttc gtctcatcgg gcgcagatca agactgggaa atcattgccc tatgacgatc 11880
aatcagcttc tgaacgagct cgagcaccag ggtatcaagc tggcggccga tggggagcgc 11940
ctccagatac aggcccccaa gaacgccctg aacccgaacc tgctcgctcg aatctccgag 12000
cacaaaagca cgatcctgac gatgctccgt cagagactcc ccgcagaatc catcgtgccc 12060
gccccagccg agcggcacgc tccgtttcct ctcacagaca tccaagaatc ctactggctg 12120
ggccggacag gagcgtttac ggtccccagc gggatccacg cctatcgcga atacgactgt 12180
acggatctcg acgtgccgag gctgagccgc gcctttcgga aagtcgtcgc gcggcacgac 12240
atgcttcggg cccacacgct gcccgacatg atgcaggtga tcgagcctaa agtcgacgcc 12300
gacatcgaga tcatcgatct gcgcgggctc gaccggagca cacgggaagc gaggctcgtg 12360
tcgttgcgag atgcgatgtc gcaccgcatc tatgacaccg agcgccctcc gctctatcac 12420
gtcgtcgccg ttcggctgga cgagcggcaa acccgtctcg tgctcagtat cgatctcatt 12480
aacgttgacc taggcagcct gtccatcatc ttcaaggact ggctcagctt ctacgaagat 12540
cccgagacct ctctccctgt cctggagctc tcgtaccgcg attatgtact cgcgctggag 12600
tctcgcaaga agtctgaggc gcatcaacga tcgatggatt actggaagcg gcgcatcgcc 12660
gagctcccac ctccgccgac gcttccgatg aaggccgatc catctaccct gaaggagatc 12720
cgcttccggc acacggagca atggctgccg tcggactcct ggggtcgatt gaagcggcgt 12780
gtcggggagc gcgggctgac cccgacgggc gtcatcctgg ctgcattttc cgaggtgatc 12840
gggcgctgga gcgcgagccc ccggtttacg ctcaacataa cgctcttcaa ccggctcccc 12900
gtccatccgc gcgtgaacga tatcaccggg gacttcacgt cgatggtcct cctggacatc 12960
gacaccactc gcgacaagag cttcgaacag cgcgctaagc gtattcaaga gcagctgtgg 13020
gaagcgatgg atcactgcga cgtaagcggt atcgaggtcc agcgagaggc cgcccgggtc 13080
ctggggatcc aacgaggcgc attgttcccc gtggtgctca cgagcgcgct taaccagcaa 13140
gtcgttggtg tcacctcgtt gcagaggctc ggaactccgg tgtacaccag cacgcagact 13200
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gacatcgtcg acggagtgtt cccgcccgac cttctggacg acatgctcga agcgtacgtc 13320
gtttttctcc ggcggctcac tgaggaacca tggggtgaac aggtgcgctg ttcgcttccg 13380
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gtgatgatcg atcatcgggg tgccgtcaac accatcctgg acatcaacga gcgcttcgaa 13980
atagggcccg gagacagggt gctggcgctc tcctcgctga gcttcgatct ctcggtctat 14040
gatgtgttcg ggatcctggc ggcgggcggt acgatcgtgg tgccggacgc gtccaagctg 14100
cgcgatccgg cgcattgggc agagttgatc gaacgagaga aggtgacggt gtggaactcg 14160
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ctccaggcca tcaggcccgg cgtgtcggtg atcagcctgg gcggggccac cgaagcgtcg 14340
atctggtcca tcgggtaccc cgtgaggaac gtcgacctat cgtgggcgag catcccctac 14400
ggccgtccgc tgcgcaacca gacgttccac gtgctcgatg aggcgctcga accgcgcccg 14460
gtctgggttc cggggcaact ctacattggc ggggtcgggc tggcactggg ctactggcgc 14520
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ggaaagcccg tcgtcgatct gaccgggcag gatccgcggg aggcggggct ggacgtctac 15000
gcgcgtcgcc gtagcgtccg aacgttcctt gaggccccga ttccgtttgt tgagtttggt 15060
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tatccatcgg cgggcagcac gtacccggtg caaacctacg cgtatgtcaa atccggccgc 15180
atcgagggcg tggacgaggg cttctattat taccacccgt tcgagcaccg tttgctgaag 15240
ctctccgatc acgggatcga gcgcggagcg cacgttcggc aaaacttcga cgtgttcgat 15300
gaagcggcgt tcaacctcct gttcgtgggc aggatcgacg ccatcgagtc gctgtatgga 15360
tcgtcgtcgc gagaattttg cctgctggag gccggatata tggcgcagct cctgatggag 15420
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ccgctgacgt ccaacggcaa ggtcgatcgt aaggccctgc gcgagcggaa ggatacctcg 15780
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aggagctcgc ggcgtccgga gtcgaccccg cgctggtgct ggacccgagc tacgtccggg 16440
cgggcagcgt gctggaagac gtcgaccggt tcgacgctgc tttcttcggc atcagcccgc 16500
gcgaggcaga gctcatggat ccgcagcacc ggatcttcat ggaatgcgcc tgggaggcgc 16560
tggagaacgc cggatacgac ccgacggctt acgagggctc tatcggcgtg tacgccggcg 16620
ccaacatgag ctcgtacttg acgtcgaacc tccacgagca cccagcgatg atgcggtggc 16680
ccggctggtt tcagacgttg atcggcaacg acaaggatta cctcgcgacc cacgtctcct 16740
acaggctgaa tctgagaggg ccgagcatct ccgttcaaac tgcctgctcc acctcgctcg 16800
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gcgggattac cgtccggatc ccccatcgag ccggctatgt atatgctgag gggggcatct 16920
tctctcccga cggccattgc cgggccttcg acgccaaggc gaacggcacg atcatgggca 16980
acggctgcgg cgttgtcctc ctgaagccgc tggaccgggc gctctccgat ggtgatcccg 17040
tccgcgcggt tatccttggg tctgccacaa acaacgacgg agcgaggaag atcgggttca 17100
ctgcgcccag tgaggtgggc caggcgcaag cgatcatgga ggcgctggcg ctggcagggg 17160
tcgaggcccg gtccatccaa tacatcgaga cccacgggac cggcacgctg ctcggagacg 17220
ccatcgagac ggcggcgctg cggcgggtgt tcggtcgcga cgcttcggcc cggaggtctt 17280
gcgcgatcgg ctccgtgaag accggcatcg gacacctcga atcggcggct ggcatcgccg 17340
gtttgatcaa gacggtcttg gcgctggagc accggcagct gccgcccagc ctgaacttcg 17400
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gcaccaacgc ccatgtcgtg ctggaggaag cgcccgcggc gaagcttcca gccgcggcgc 17580
cggcgcgctc tgccgagctc ttcgtcgtct cggccaagag cgcagcggcg ctggatgccg 17640
cggcggcacg gctacgagat catctgcagg cgcaccaggg gatttcgttg ggcgacgtcg 17700
ccttcagcct ggcgacgacg cgcagcccca tggagcaccg gctcgcgatg gcggcgccgt 17760
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tgttcgccct cgcggtggca tttgcggcgc tgtggcggtc gtggggtgtc gcgcccgacg 18120
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ccacgaagtc gcttcgctcg acgaagacgg gttgttcgcg ttgattgatg agtcactcgc 43500
gcgcgcggga aagaggtgat tgcgtgacag accgagaagg ccagctcctg gagcgcttgc 43560
gtgaggttac tctggccctt cgcaagacgc tgaacgagcg cgataccctg gagctcgaga 43620
agaccgagcc gatcgccatc gtggggatcg gctgccgctt ccccggcgga gcgggcactc 43680
cggaggcgtt ctgggagctg ctcgacgacg ggcgcgacgc gatccggccg ctcgaggagc 43740
gctgggcgct cgtaggtgtc gacccaggcg acgacgtacc gcgctgggcg gggctgctca 43800
ccgaggccat cgacggcttc gacgccgcgt tcttcggtat cgccccccgg gaggcacggt 43860
cgctcgaccc gcagcatcgc ctgctgctgg aggtcgcctg ggaggggttc gaagacgccg 43920
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cggagtacct ccacgccgcc gtcgcgcacc agccgcgcga agagcgggac gcgtacagca 44040
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gaccttgcct gaccgtcgat acggcgtgct cgtcatcgct ggtggccatt cacctcgcct44160
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gccagacctt cgacgcgtcg gccaacgggt tcgtccgtgg ggagggctgc ggtctgatcg 44340
tgctcaagcg attgagcgac gcgcggcggg atggggaccg gatctgggcg ctgatccgag 44400
gatcggccat caatcaggac ggccggtcga cggggttgac ggcgcccaac gtgctcgccc 44460
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ggatcgaggg gaccgcgctc gcgttggcga ccgaaccggt gccctggccg cggacgggcc 44820
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catcgccgcg tacccggagc agggtctcgg agacgtcgcg ttcagcctgg tatcgacgcg 56460
tagcccgatg gagcaccggc tcgcggtggc ggcgacctcg cgcgaggcgc tgcgaagcgc 56520
gctggaggtt gcggcgcagg ggcagacccc ggcaggcgcg gcgcgcggca gggccgcttc 56580
ctcgcccggc aagctcgcct tcctgttcgc cgggcagggc gcgcaggtgc cgggcatggg 56640
ccgtgggttg tgggaggcgt ggccggcgtt ccgcgagacc ttcgaccggt gcgtcacgct 56700
cttcgaccgg gagctccatc agccgctctg cgaggtgatg tgggccgagc cgggcagcag 56760
caggtcgtcg ttgctggacc agacggcgtt cacccagccg gcgctctttg cgctggagta 56820
cgcgctggcc gcgctcttcc ggtcgtgggg cgtggagccg gagctcgtcg ctggccatag 56880
cctcggcgag ctggtggccg cctgcgtggc gggtgtgttc tccctcgagg acgccgtgcg 56940
cttggtggtc gcgcgcggcc ggttgatgca ggcgctgccg gccggcggcg cgatggtatc 57000
gatcgccgcg ccggaggccg acgtggctgc cgcggtggcg ccgcacgcag cgttggtgtc 57060
gatcgcggca gtcaatgggc cggagcaggt ggtgatcgcg ggcgccgaga aattcgtgca 57120
gcagatcgcg gcggcgttcg cggcgcgggg ggcgcgaacc aaaccgctgc atgtctcgca 57180
cgcgttccac tcgccgctca tggatccgat gctggaggcg ttccggcggg tgactgagtc 57240
ggtgacgtac cggcggcctt cgatcgcgct ggtgagcaac ctgagcggga agccctgcac 57300
cgatgaggtg agcgcgccgg gttactgggt gcgtcacgcg cgagaggcgg tgcgcttcgc 57360
ggacggagtg aaggcgctgc acgcggccgg tgcgggcctc ttcgtcgagg tggggccgaa 57420
gccgacgctg ctcggccttg tgccggcctg cctgccggat gccaggccgg tgctgctccc 57480
agcgtcgcgc gccgggcgtg acgaggctgc gagcgcgcta gaggcgctgg gtgggttctg 57540
ggtcgtcggt ggatcggtca cctggtcggg tgtcttccct tcgggcggac ggcgggtacc 57600
gctgccaacc tatccctggc agcgcgagcg ttactggatc gaagcgccgg tcgatcgtga 57660
ggcggacggc accggccgtg ctcgggcggg gggccacccc cttctgggtg aagtcttttc 57720
cgtgtcgacc catgccggtc tgcgcctgtg ggagacgacg ctggaccgaa agcggctgcc 57780
gtggctcggc gagcaccggg cgcaggggga ggtcgtgttt cctggcgccg ggtacctgga 57840
gatggcgctg tcgtcggggg ccgagatctt gggcgatgga ccgatccagg tcacggatgt 57900
ggtgctcatc gagacgctga ccttcgcggg cgatacggcg gtaccggtcc aggtggtgac 57960
gaccgaggag cgaccgggac ggctgcggtt ccaggtagcg agtcgggagc cgggggaacg 58020
tcgcgcgccc ttccggatcc acgcccgcgg cgtgctgcgc cggatcgggc gcgtcgagac 58080
cccggcgagg tcgaacctcg ccgccctgcg cgcccggctt catgccgccg tgcccgctgc 58140
ggctatctat ggtgcgctcg ccgagatggg gcttcaatac ggcccggcgt tgcgggggct 58200
cgccgagctg tggcggggtg agggcgaggc gctgggcagg gtgagactgc ctgaggccgc 58260
cggctccgcg acagcctacc agctgcatcc ggtgctgctg gacgcgtgcg tccaaatgat 58320
tgttggcgcg ttcgccgatc gcgatgaggc gacgccgtgg gcgccggtgg aggtgggctc 58380
ggtgcggctg ttccagcggt ctcctgggga gctatggtgc catgcgcgcg tcgtgagcga 58440
tggtcaacag gcctccagcc ggtggagcgc cgactttgag ttgatggacg gtacgggcgc 58500
ggtggtcgcc gagatctccc ggctggtggt ggagcggctt gcgagcggtg tacgccggcg 58560
cgacgcagac gactggttcc tggagctgga ttgggagccc gcggcgctcg gtgggcccaa 58620
gatcacagcc ggccggtggc tgctgctcgg cgagggtggt gggctcgggc gctcgttgtg 58680
ctcggcgctg aaggccgccg gccatgtcgt cgtccacgcc gcgggggacg acacgagcac 58740
tgcaggaatg cgcgcgctcc tggccaacgc gttcgacggc caggccccga cggccgtggt 58800
gcacctcagc agcctcgacg ggggcggcca gctcggcccg gggctcgggg cgcagggcgc 58860
gctcgacgcg ccccggagcc cagatgtcga tgccgatgcc ctcgaatcgg cgctgatgcg 58920
tggttgcgac agcgtgctct ccctggtgca agcgctggtc ggcatggacc tccgaaacgc 58980
gccgcggctg tggctcttga cccgcggggc tcaggcggcc gccgccggcg atgtctccgt 59040
ggtgcaagcg ccgctgttgg ggctgggccg caccatcgcc ttggagcacg ccgagctgcg 59100
ctgtatcagc gtcgacctcg atccagccga gcctgaaggg gaagccgatg ctttgctggc 59160
cgagctactt gcagatgatg ccgaggagga ggtcgcgctg cgcggtggcg accggctcgt 59220
tgcgcggctc gtccaccggc tgcccgacgc tcagcgccgg gagaaggtcg agcccgccgg 59280
tgacaggccg ttccggctag agatcgatga acccggcgcg ctggaccaac tggtgctccg 59340
agccacgggg cggcgcgctc ctggtccggg cgaggtcgag atctccgtcg aagcggcggg 59400
gctcgactcc atcgacatcc agctggcgtt gggcgttgct cccaatgatc tgcctggaga 59460
agaaatcgag ccgttggtgc tcggaagcga gtgcgccggg cgcatcgtcg ctgtgggcga 59520
gggcgtgaac ggccttgtgg tgggccagcc ggtgatcgcc cttgcggcgg gagtatttgc 59580
tacccatgtc accacgtcgg ccacgctggt gttgcctcgg cctctggggc tctcggcgac 59640
cgaggcggcc gcgatgcccc tcgcgtattt gacggcctgg tacgccctcg acaaggtcgc 59700
ccacctgcag gcgggggagc gggtgctgat ccatgcggag gccggtggtg tcggtctttg 59760
cgcggtgcga tgggcgcagc gcgtgggcgc cgaggtgtat gcgaccgccg acacgcccga 59820
gaaccgtgcc tacctggagt cgctgggcgt gcggtacgtg agcgattccc gctcgggccg 59880
gttcgtcaca gacgtgcatg catggacgga cggcgagggt gtggacgtcg tgctcgactc 59940
gctttcgggc gagcgcatcg acaagagcct catggtcctg cgcgcctgtg gtcgccttgt 60000
gaagctgggc aggcgcgacg actgcgccga cacgcagcct gggctgccgc cgctcctacg 60060
gaatttttcc ttctcgcagg tggacttgcg gggaatgatg ctcgatcaac cggcgaggat 60120
ccgtgcgctc ctcgacgagc tgttcgggtt ggtcgcagcc ggtgccatca gcccactggg 60180
gtcggggttg cgcgttggcg gatccctcac gccaccgccg gtcgagacct tcccgatctc 60240
tcgcgcagcc gaggcattcc ggaggatggc gcaaggacag catctcggga agctcgtgct 60300
cacgctggac gacccggagg tgcggatccg cgctccggcc gaatccagcg tcgccgtccg 60360
cgcggacggc acctaccttg tgaccggcgg tctgggtggc ctcggtctgc gcgtggccgg 60420
atggctggcc gagcggggcg cggggcaact ggtgctggtg ggccgctccg gtgcggcgag 60480
cgcagagcag cgagccgccg tggcggcgct ggaggcccac ggcgcgcgcg tcacggtggc 60540
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ggggatgccg ctgcggggtg tcgtgcatgc ggcaggtctc gtggatgacg ggctgctgat 60660
gcagcagact ccggcgcggt tccgcacggt gatgggacct aaggtccagg gggccttgca 60720
cttgcacacg ctgacacgcg aagcgcctct ttccttcttc gtgctgtacg cttctgcagc 60780
tgggcttttc ggctcgccag gccagggcaa ctatgccgca gccaacgcgt tcctcgacgc 60840
cctttcgcat caccgaaggg cgcagggcct gccggcgctg agcatcgact ggggcatgtt 60900
cacggaggtg gggatggccg ttgcgcaaga aaaccgtggc gcgcggcaga tctctcgcgg 60960
gatgcggggc atcacccccg atgagggtct gtcagctctg gcgcgcttgc tcgagggtga 61020
tcgcgtgcag acgggggtga taccgatcac tccgcggcag tgggtggagt tctacccggc 61080
aacagcggcc tcacggaggt tgtcgcggct ggtgaccacg cagcgcgcgg tcgctgatcg 61140
gaccgccggg gatcgggacc tgctcgaaca gcttgcgtcg gctgagccga gcgcgcgggc 61200
ggggctgctg caggacgtcg tgcgcgtgca ggtctcgcat gtgctgcgtc tccctgaaga 61260
caagatcgag gtggatgccc cgctctcgag catgggcatg gactcgctga tgagcctgga 61320
gctgcgcaac cgcatcgagg ctgcgctggg cgtcgccgcg cctgcagcct tggggtggac 61380
gtacccaacg gtagcagcga taacgcgctg gctgctcgac gacgccctcg tcgtccggct 61440
tggcggcggg tcggacacgg acgaatcgac ggcgagcgcc ggttcgttcg tccacgtcct 61500
ccgctttcgt cctgtcgtca agccgcgggc tcgtctcttc tgttttcacg gttctggcgg 61560
ctcgcccgag ggcttccgtt cctggtcgga gaagtctgag tggagcgatc tggaaatcgt 61620
ggccatgtgg cacgatcgca gcctcgcctc cgaggacgcg cctggtaaga agtacgtcca 61680
agaggcggcc tcgctgattc agcactatgc agacgcaccg tttgcgttag tagggttcag 61740
cctgggtgtc cggttcgtca tggggacagc cgtggagctc gccagtcgtt ccggcgcacc 61800
ggctccgctg gccgtcttca cgttgggcgg cagcttgatc tcttcttcag agatcacccc 61860
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atccacccaa caagtccagg ccgatgctcg cgcagacaag gtcatcacag acaccatggt 61980
ggctccggcc cccggggact cgaaggagcc gcccgtgaag atcgcggtcc ctatcgtcgc 62040
catcgccggc tcggacgatg tgatcgtgcc tccgagcgac gttcaggatc tacaatctcg 62100
caccacggag cgcttctata tgcatctcct tcccggagat cacgaatttc tcgtcgatcg 62160
agggcgcgag atcatgcaca tcgtcgactc gcatctcaat ccgctgctcg ccgcgaggac 62220
gacgtcgtca ggccccgcgt tcgaggcaaa atgatggcag cctccctcgg gcgcgcgaga 62280
tggttgggag cagcgtgggc gctggcggcc ggcggcaggc cgcggaggcg catgagcctt 62340
cctggacgtt tgcagtatag gagattttat gacacaggag caagcgaatc agagtgagac 62400
gaagcctgct ttcgacttca agccgttcgc gcctgggtac gcggaggacc cgttccccgc 62460
gatcgagcgc ctgagagagg caacccccat cttctactgg gatgaaggcc gctcctgggt 62520
cctcacccga taccacgacg tgtcggcggt gttccgcgac gaacgcttcg cggtcagtcg 62580
agaagagtgg gaatcgagcg cggagtactc gtcggccatt cccgagctca gcgatatgaa 62640
gaagtacgga ttgttcgggc tgccgccgga ggatcacgct cgggtccgca agctcgtcaa 62700
cccgtcgttt acgtcacgcg ccatcgacct gctgcgcgcc gaaatacagc gcaccgtcga 62760
ccagctgctc gatgctcgct ccggacaaga ggagttcgac gttgtgcggg attacgcgga 62820
gggaatcccg atgcgcgcga tcagcgctct gttgaaggtt ccggccgagt gtgacgagaa 62880
gttccgtcgc ttcggctcgg cgactgcgcg cgcgctcggc gtgggtttgg tgccccaggt 62940
cgatgaggag accaagaccc tggtcgcgtc cgtcaccgag gggctcgcgc tgctccatga 63000
cgtcctcgat gagcggcgca ggaacccgct cgaaaatgac gtcttgacga tgctgcttca 63060
ggccgaggcc gacggcagca ggctgagcac gaaggagctg gtcgcgctcg tgggtgcgat 63120
tatcgctgct ggcaccgata ccacgatcta ccttatcgcg ttcgctgtgc tcaacctgct 63180
gcggtcgccc gaggcgctcg agctggtgaa ggccgagccc gggctcatga ggaacgcgct 63240
cgatgaggtg ctccgcttcg acaatatcct cagaatagga actgtgcgtt tcgccaggca 63300
ggacctggag tactgcgggg catcgatcaa gaaaggggag atggtctttc tcctgatccc 63360
gagcgccctg agagatggga ctgtattctc caggccagac gtgtttgatg tgcgacggga 63420
cacgggcgcg agcctcgcgt acggtagagg cccccatgtc tgccccgggg tgtcccttgc 63480
tcgcctcgag gcggagatcg ccgtgggcac catcttccgt aggttccccg agatgaagct 63540
gaaagaaact cccgtgtttg gataccaccc cgcgttccgg aacatcgaat cactcaacgt 63600
catcttgaag ccctccaaag ctggatagct cgcgggggta tcgcttcccg aacctcattc 63660
cctcatgata cagctcgcgc gcgggtgctg tctgccgcgg gtgcgattcg atccagcgga 63720
caagcccatt gtcagcgcgc gaagatcgaa tccacggccc ggagaagagc ccgtccgggt 63780
gacgtcggaa gaagtgccgg gcgccgccct gggagcgcaa agctcgctcg ttcgcgctca 63840
gcacgccgct cgtcatgtcc ggccctgcac ccgcgccgag gagccgcccg ccctgatgca 63900
cggcctcacc gagcggcagg ttctgctctc gctcgtcgcc ctcgcgctcg tcctcctgac 63960
cgcgcgcgcc ttcggcgagc tcgcgcggcg gctgcgccag cccgaggtgc tcggcgagct 64020
cttcggcggc gtggtgctgg gcccgtccgt cgtcggcgcg ctcgctcctg ggttccatcg 64080
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gacatccggc cgcccgccgc ggcccagctc gagccggact cgccggatga cgaggccgac 64440
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cggtgggcgg aggcggcgca gcggccgcgg ctggagagcc tcgtgcggct cgcgatcgtg 64560
cggctgggca aggcgctcga caaggtccct ttcgcgcaca cgacggccgg cgtctcccag 64620
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gccggcccgt accgcggatc gagccgcgtg tccgctgccg taggggagtt tcggggggag 64800
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ctgcgcgcag ccgagcgggc gctcatcgcg ctctacactg cgttcgcccg tgaggagtga 64920
gcctctctcg ggcgcagccg agcggcggcg tgccggtggt tccctcttcg caaccatgac 64980
cggagccgcg ctcggtccgc gcagcggcta gcgcgcgtcg cggcagagat cgctggagcg 65040
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accgtccccg accagaacag ccgcatgcgg gtttctcgca acatgccccg acatccttgc 65580
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acccgccgat tcacatccca ccgcggcacg acgcttgctc aaaccgcggc gagacggccg 66600
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cgccatcctc cgcggcgccc gggctcaggt ggccctcgca gcagggcgcg cctggcgggc 68340
aaaccgtgca gacgtcgtcc ttcgacgcga ggtacgctgg ttgcaagtcg tcacgccgta 68400
tcgcgaggtc cggcagcgcc ggagcccggg cgggccgggc gcacgaaggc gcggcgagcg 68460
caggcttcga ggggggcgac gtcatgagga aggccagggc gcatggggcg atgctcggcg 68520
ggcgagatga cggctggcgt cgcggcctcc ccggcgccgg cgcgcttcgc gccgcgctcc 68580
agcgcggtcg ctcgcgcgat ctcgcccggc gccggctcat cgcctccgtg tccctcgccg 68640
gcggcgccag catggcggtc gtctcgctgt tccagctcgg gatcatcgag cgcctgcccg 68700
atcctccgct tccagggttc gattcggcca aggtgacgag ctccgatatc 68750
<210>2
<211>1421
<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>2
Val Ala Asp Arg Pro Ile Glu Arg Ala Ala Glu Asp Pro Ile Ala Ile
1 5 10 15
Val Gly Ala Ser Cys Arg Leu Pro Gly Gly Val Ile Asp Leu Ser Gly
20 25 30
Phe Trp Thr Leu Leu Glu Gly Ser Arg Asp Thr Val Gly Arg Val Pro
35 40 45
Ala Glu Arg Trp Asp Ala Ala Ala Trp Phe Asp Pro Asp Pro Asp Ala
50 55 60
Pro Gly Lys Thr Pro Val Thr Arg Ala Ser Phe Leu Ser Asp Val Ala
65 70 75 80
Cys Phe Asp Ala Ser Phe Phe Gly Ile Ser Pro Arg Glu Ala Leu Arg
85 90 95
Met Asp Pro Ala His Arg Leu Leu Leu Glu Val Cys Trp Glu Ala Leu
100 105 110
Glu Asn Ala Ala Ile Ala Pro Ser Ala Leu Val Gly Thr Glu Thr Gly
115 120 125
Val Phe Ile Gly Ile Gly Pro Ser Glu Tyr Glu Ala Ala Leu Pro Gln
130 135 140
Ala Thr Ala Ser Ala Glu Ile Asp Ala His Gly Gly Leu Gly Thr Met
145 150 155 160
Pro Ser Val Gly Ala Gly Arg Ile Ser Tyr Ala Leu Gly Leu Arg Gly
165 170 175
Pro Cys Val Ala Val Asp Thr Ala Tyr Ser Ser Ser Leu Val Ala Val
180 185 190
His Leu Ala Cys Gln Ser Leu Arg Ser Gly Glu Cys Ser Thr Ala Leu
195 200 205
Ala Gly Gly Val Ser Leu Met Leu Ser Pro Ser Thr Leu Val Trp Leu
210 215 220
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Met Leu Glu Ala Gly Gly His Ala Val Val His Ala Ala Glu Asn Asn
1235 1240 1245
Thr Ser Ala Ala Gly Val Arg Ala Leu Leu Ala Lys Ala Phe Asp Gly
1250 1255 1260
Gln Ala Pro Thr Ala Val Val His Leu Gly Ser Leu Asp Gly Gly Gly
1265 1270 1275 1280
Glu Leu Asp Pro Gly Leu Gly Ala Gln Gly Ala Leu Asp Ala Pro Arg
1285 1290 1295
Ser Ala Asp Val Ser Pro Asp Ala Leu Asp Pro Ala Leu Val Arg Gly
1300 1305 1310
Cys Asp Ser Val Leu Trp Thr Val Gln Ala Leu Ala Gly Met Gly Phe
1315 1320 1325
Arg Asp Ala Pro Arg Leu Trp Leu Leu Thr Arg Gly Ala Gln Ala Val
1330 1335 1340
Gly Ala Gly Asp Val Ser Val Thr Gln Ala Pro Leu Leu Gly Leu Gly
1345 1350 1355 1360
Arg Val Ile Ala Met Glu His Ala Asp Leu Arg Cys Ala Arg Val Asp
1365 1370 1375
Leu Asp Pro Ala Arg Pro Glu Gly Glu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Glu
1380 1385 1390
Leu Leu Ala Asp Asp Ala Glu Ala Glu Val Ala Leu Arg Gly Gly Glu
1395 1400 1405
Arg Cys Val Ala Arg Ile Val Arg Arg Gln Pro Glu Thr Arg Pro Arg
1410 1415 1420
G1y Arg Ile Glu Ser Cys Val Pro Thr Asp Val Thr Ile Arg Ala Asp
1425 1430 1435 1440
Ser Thr Tyr Leu Val Thr Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Leu Ser Val
1445 1450 1455
Ala Gly Trp Leu Ala Glu Arg Gly Ala Gly His Leu Val Leu Val Gly
1460 1465 1470
Arg Ser Gly Ala Ala Ser Val Glu Gln Arg Ala Ala Val Ala Ala Leu
1475 1480 1485
Glu Ala Arg Gly Ala Arg Val Thr Val Ala Lys Ala Asp Val Ala Asp
1490 1495 1500
Arg Ala Gln Leu Glu Arg Ile Leu Arg Glu Val Thr Thr Ser Gly Met
1505 1510 1515 1520
Pro Leu Arg Gly Val Val His Ala Ala Gly Ile Leu Asp Asp Gly Leu
1525 1530 1535
Leu Met Gln Gln Thr Pro Ala Arg Phe Arg Lys Val Met Ala Pro Lys
1540 1545 1550
Val Gln Gly Ala Leu His Leu His Ala Leu Thr Arg Glu Ala Pro Leu
1555 1560 1565
Ser Phe Phe Val Leu Tyr Ala Ser Gly Val Gly Leu Leu Gly Ser Pro
1570 1575 1580
Gly Gln Gly Asn Tyr Ala Ala Ala Asn Thr Phe Leu Asp Ala Leu Ala
1585 1590 1595 1600
His His Arg Arg Ala Gln Gly Leu Pro Ala Leu Ser Val Asp Trp Gly
1605 1610 1615
Leu Phe Ala Glu Val Gly Met Ala Ala Ala Gln Glu Asp Arg Gly Ala
1620 1625 1630
Arg Leu Val Ser Arg Gly Met Arg Ser Leu Thr Pro Asp Glu Gly Leu
1635 1640 1645
Ser Ala Leu Ala Arg Leu Leu Glu Ser Gly Arg Ala Gln Val Gly Val
1650 1655 1660
Met Pro Val Asn Pro Arg Leu Trp Val Glu Leu Tyr Pro Ala Ala Ala
1665 1670 1675 1680
Ser Ser Arg Met Leu Ser Arg Leu Val Thr Ala His Arg Ala Ser Ala
1685 1690 1695
Gly Gly Pro Ala Gly Asp Gly Asp Leu Leu Arg Arg Leu Ala Ala Ala
1700 1705 1710
Glu Pro Ser Ala Arg Ser Ala Leu Leu Glu Pro Leu Leu Arg Ala Gln
1715 1720 1725
Ile Ser Gln Val Leu Arg Leu Pro Glu Gly Lys Ile Glu Val Asp Ala
1730 1735 1740
Pro Leu Thr Ser Leu Gly Met Asn Ser Leu Met Gly Leu Glu Leu Arg
1745 1750 1755 1760
Asn Arg Ile Glu Ala Met Leu Gly Ile Thr Val Pro Ala Thr Leu Leu
1765 1770 1775
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Ala Cys Glu Ala Ala Pro Val Glu Ser Pro His Thr Thr Ala Asp Ser
1795 1800 1805
Ala Val Glu Ile Glu Glu Met Ser Gln Asp Asp Leu Thr Gln Leu Ile
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Ala Ala Lys Phe Lys Ala Leu Thr
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<213>纤维堆囊菌
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Met Glu Ala Ala Ala Arg Thr Gln Ala Leu Ser Pro Asp Gly Arg Cys
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Gly Leu Val Val Leu Lys Arg Leu Ser Asp Ala Gln Arg Asp Gly Asp
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Ala Gly Val Ala Gly Leu Ile Lys Ala Ala Leu Ser Leu Thr His Glu
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Arg Ala Arg Ser Gly Gly Trp Leu Val Leu Ala Asp Arg Gly Gly Val
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Lys Val Thr His Leu Ala Ala Ala Pro Val Leu Ala Leu Ile Gln Ala
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Arg Ile Ala Ala Ile Glu Ala Leu Glu Ala Gln Gly Ala Arg Val Thr
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Val Ala Ala Val Asp Val Ala Asp Ala Glu Gly Met Ala Ala Leu Leu
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Leu Asp Asp Gly Leu Leu Ala His Gln Asp Ala Gly Arg Leu Ala Arg
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Val Leu Arg Pro Lys Val Glu Gly Ala Trp Val Leu His Thr Leu Thr
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Arg Ala Glu Gly Cys Ala Val Val Val Leu Lys Arg Leu Ser Asp Ala
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Gln Arg Asp Arg Asp Pro Ile Leu Ala Val Ile Arg Gly Thr Ala Ile
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2145 2150 2155 2160
Val Phe Ser Leu Glu Asp Gly Val Arg Leu Val Ala Ala Arg Gly Arg
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Leu Met Gln Gly Leu Ser Ala Gly Gly Ala Met Val Ser Leu Gly Ala
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3090 3095 3100
Glu Ala Met Ser Leu Asp Pro Gln Gln Arg Leu Leu Leu Glu Val Ser
3105 3110 3115 3120
Trp Glu Ala Leu Glu Ser Ala Gly Ile Ala Pro Asp Thr Leu Arg Asp
3125 3130 3135
Ser Pro Thr Gly Val Phe Val Gly Ala Gly Pro Asn Glu Tyr Tyr Thr
3140 3145 3150
Gln Arg Leu Arg Gly Phe Thr Asp Gly Ala Ala Gly Leu Tyr Gly Gly
3155 3160 3165
Thr Gly Asn Met Leu Ser Val Thr Ala Gly Arg Leu Ser Phe Phe Leu
3170 3175 3180
Gly Leu His Gly Pro Thr Leu Ala Met Asp Thr Ala Cys Ser Ser Ser
3185 3190 3195 3200
Leu Val Ala Leu His Leu Ala Cys Gln Ser Leu Arg Leu Gly Glu Cys
3205 3210 3215
Asp Gln Ala Leu Val Gly Gly Val Asn Val Leu Leu Ala Pro Glu Thr
3220 3225 3230
Phe Val Leu Leu Ser Arg Met Arg Ala Leu Ser Pro Asp Gly Arg Cys
3235 3240 3245
Lys Thr Phe Ser Ala Asp Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Gly Glu Gly Cys
3250 3255 3260
Ala Val Val Val Leu Lys Arg Leu Arg Asp Ala Gln Arg Ala Gly Asp
3265 3270 3275 3280
Ser Ile Leu Ala Leu Ile Arg Gly Ser Ala Val Asn His Asp Gly Pro
3285 3290 3295
Ser Ser Gly Leu Thr Val Pro Asn Gly Pro Ala Gln Gln Ala Leu Leu
3300 3305 3310
Arg Gln Ala Leu Ser Gln Ala Gly Val Ser Pro Val Asp Val Asp Phe
3315 3320 3325
Val Glu Cys His Gly Thr Gly Thr Ala Leu Gly Asp Pro Ile Glu Val
3330 3335 3340
Gln Ala Leu Ser Glu Val Tyr Gly Pro Gly Arg Ser Gly Asp Arg Pro
3345 3350 3355 3360
Leu Val Leu Gly Ala Ala Lys Ala Asn Val Ala His Leu Glu Ala Ala
3365 3370 3375
Ser Gly Leu Ala Ser Leu Leu Lys Ala Val Leu Ala Leu Arg His Glu
3380 3385 3390
Gln Ile Pro Ala Gln Pro Glu Leu Gly Glu Leu Asn Pro His Leu Pro
3395 3400 3405
Trp Asn Thr Leu Pro Val Ala Val Pro Arg Lys Ala Val Pro Trp Gly
3410 3415 3420
Arg Gly Ala Arg Pro Arg Arg Ala Gly Val Ser Ala Phe Gly Leu Ser
3425 3430 3435 3440
Gly Thr Asn Val His Val Val Leu Glu Glu Ala Pro Glu Val Glu Pro
3445 3450 3455
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Arg Pro Val Glu Leu Val Val Leu Ser Ala
3460 3465 3470
Lys Ser Ala Ala Ala Leu Asp Ala Ala Ala Ala Arg Leu Ser Ala His
3475 3480 3485
Leu Ser Ala His Pro Glu Leu Ser Leu Gly Asp Val Ala Phe Ser Leu
3490 3495 3500
Ala Thr Thr Arg Ser Pro Met Glu His Arg Leu Ala Ile Ala Thr Thr
3505 3510 3515 3520
Ser Arg Glu Ala Leu Arg Gly Ala Leu Asp Ala Ala Ala Gln Gln Lys
3525 3530 3535
Thr Pro Gln Gly Ala Val Arg Gly Lys Ala Val Ser Ser Arg Gly Lys
3540 3545 3550
Leu Ala Phe Leu Phe Thr Gly Gln Gly Ala Gln Met Pro Gly Met Gly
3555 3560 3565
Arg Gly Leu Tyr Glu Thr Trp Pro Ala Phe Arg Glu Ala Phe Asp Arg
3570 3575 3580
Cys Val Ala Leu Phe Asp Arg Glu Ile Asp Gln Pro Leu Arg Glu Val
3585 3590 3595 3600
Met Trp Ala Ala Pro Gly Leu Ala Gln Ala Ala Arg Leu Asp Gln Thr
3605 3610 3615
Ala Tyr Ala Gln Pro Ala Leu Phe Ala Leu Glu Tyr Ala Leu Ala Ala
3620 3625 3630
Leu Trp Arg Ser Trp Gly Val Glu Pro His Val Leu Leu Gly His Ser
3635 3640 3645
Ile Gly Glu Leu Val Ala Ala Cys Val Ala Gly Val Phe Ser Leu Glu
3650 3655 3660
Asp Ala Val Arg Leu Val Ala Ala Arg Gly Arg Leu Met Gln Ala Leu
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Pro Ala Gly Gly Ala Met Val Ala Ile Ala Ala Ser Glu Ala Glu Val
3685 3690 3695
Ala Ala Ser Val Ala Pro His Ala Ala Thr Val Ser Ile Ala Ala Val
3700 3705 3710
Asn Gly Pro Asp Ala Val Val Ile Ala Gly Ala Glu Val Gln Val Leu
3715 3720 3725
Ala Leu Gly Ala Thr Phe Ala Ala Arg Gly Ile Arg Thr Lys Arg Leu
3730 3735 3740
Ala Val Ser His Ala Phe His Ser Pro Leu Met Asp Pro Met Leu Glu
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Asp Phe Gln Arg Val Ala Ala Thr Ile Ala Tyr Arg Ala Pro Asp Arg
3765 3770 3775
Pro Val Val Ser Asn Val Thr Gly His Val Ala Gly Pro Glu Ile Ala
3780 3785 3790
Thr Pro Glu Tyr Trp Val Arg His Val Arg Ser Ala Val Arg Phe Gly
3795 3800 3805
Asp Gly Ala Lys Ala Leu His Ala Ala Gly Ala Ala Thr Phe Val Glu
3810 3815 3820
Val Gly Pro Lys Pro Val Leu Leu Gly Leu Leu Pro Ala Cys Leu Gly
3825 3830 3835 3840
Glu Ala Asp Ala Val Leu Val Pro Ser Leu Arg Ala Asp Arg Ser Glu
3845 3850 3855
Cys Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Gly Ala Trp Tyr Ala Trp Gly Gly
3860 3865 3870
Ala Leu Asp Trp Lys Gly Val Phe Pro Asp Gly Ala Arg Arg Val Ala
3875 3880 3885
Leu Pro Met Tyr Pro Trp Gln Arg Glu Arg His Trp Met Asp Leu Thr
3890 3895 3900
Pro Arg Ser Ala Ala Pro Ala Gly Ile Ala Gly Arg Trp Pro Leu Ala
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Gly Val Gly Leu Cys Met Pro Gly Ala Val Leu His His Val Leu Ser
3925 3930 3935
Ile Gly Pro Arg His Gln Pro Phe Leu Gly Asp His Leu Val Phe Gly
3940 3945 3950
Lys Val Val Val Pro Gly Ala Phe His Val Ala Val Ile Leu Ser Ile
3955 3960 3965
Ala Ala Glu Arg Trp Pro Glu Arg Ala Ile Glu Leu Thr Gly Val Glu
3970 3975 3980
Phe Leu Lys Ala Ile Ala Met Glu Pro Asp Gln Glu Val Glu Leu His
3985 3990 3995 4000
Ala Val Leu Thr Pro Glu Ala Ala Gly Asp Gly Tyr Leu Phe Glu Leu
4005 4010 4015
Ala Thr Leu Ala Ala Pro Glu Thr Glu Arg Arg Trp Thr Thr His Ala
4020 4025 4030
Arg Gly Arg Val Gln Pro Thr Asp Gly Ala Pro Gly Ala Leu Pro Arg
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4050 4055 4060
Phe Leu Asp Arg Leu Ser Ala Val Arg Ile Gly Trp Gly Pro Leu Trp
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Arg Trp Leu Gln Asp Gly Arg Val Gly Asp Glu Ala Ser Leu Ala Thr
4085 4090 4095
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Val Arg Trp Trp Arg Ala Pro Val Gly Arg Val Arg Cys Gly Gly Val
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Thr Gly Glu Val Val Ala Glu Val Glu Gly Phe Val Cys Arg Arg Ala
4180 4185 4190
Pro Arg Glu Val Phe Leu Arg Gln Glu Ser Gly Ala Ser Thr Ala Ala
4195 4200 4205
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Ile Cys Leu Trp Glu Ala Gly Ala His Glu Glu Ala Pro Ala Ala Ala
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Leu Val Pro Asp Ala Glu Ser Tyr Arg Leu Glu Ala Gly Gln Lys Gly
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Gly Gly Asp Cys Ala Gly Val Ala Thr Ala Val Gly Gln Gly Val Arg
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Ile His Ala Ala Ala Gly Gly Val Gly Met Ala Ala Val Gln Ile Ala
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Thr Asp Ile Arg Asp Arg Ala Ala Val Ala Ala Ala His Pro Gly Val
4645 4650 4655
Arg Tyr Arg Val Phe Asp Ile Leu Glu Leu Ala Pro Asp Arg Thr Arg
4660 4665 4670
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Ala Leu Pro Val His Ala Phe Ala Ile Thr Lys Ala Glu Ala Ala Phe
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Arg Phe Met Ala Gln Ala Arg His Gln Gly Lys Val Val Leu Leu Pro
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Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly Leu His Val Ala Arg Trp Leu Ala Gln
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pro Gly Ala Ala Lys Ala Val Ala Glu Ile Glu Ala Leu Gly Ala Arg
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Ser Met Ser Gly Leu Leu Gly Ser Ala Gly Gln Ser Asn Tyr Ala Ala
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Ala Asn Thr Phe Leu Asp Ala Leu Ala Ala His Arg Arg Ala Glu Gly
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Leu Ala Ala Gln Ser Leu Ala Trp Gly Pro Trp Ser Asp Gly Gly Met
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Ala Ala Ser Gln Ala Ser Gly Ala Ala Val Pro Pro Val Trp Arg Ala
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Leu Val Arg Ala Glu Ala Arg His Thr Ala Ala Gly Ala Gln Gly Ala
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Val Arg Lys Val Val Gln Ala Glu Ile Ala Arg Val Leu Ser Trp Ser
5010 5015 5020
Ala Ala Ser Ala Val Pro Val Asp Arg Pro Leu Ser Asp Leu Gly Leu
5025 5030 5035 5040
Asp Ser Leu Thr Ala Val Glu Leu Arg Asn Val Leu Gly Gln Arg Val
5045 5050 5055
Gly Ala Thr Leu Pro Ala Thr Leu Ala Phe Asp His Pro Thr Val Asp
5060 5065 5070
Ala Leu Thr Arg Trp Leu Leu Asp Lys Val Leu Ala Val Ala Glu Pro
5075 5080 5085
Ser Val Ser Ser Ala Lys Ser Ser Pro Gln Val Ala Leu Asp Glu Pro
5090 5095 5100
Ile Ala Ile Ile Gly Ile Gly Cys Arg Phe Pro Gly Gly Val Ala Asp
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Pro Glu Ser Phe Trp Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ser Asp Ala Val Val
5125 5130 5135
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Pro Asp Val Arg Gly Lys Met Thr Thr Arg Phe Gly Gly Phe Leu Ser
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Glu Ala Phe Glu Arg Ala Gly Ile Leu Pro Glu Arg Leu Met Gly Ser
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5220 5225 5230
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5250 5255 5260
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5300 5305 5310
Ser Arg Leu Arg Gly Leu Ala Pro Asp Gly Arg Cys Lys Ser Phe Ser
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Ala Ala Ala Asp Gly Val Gly Trp Ser Glu Gly Cys Ala Met Leu Leu
5330 5335 5340
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Thr Ala Pro Asn Gly Ser Ser Gln Gln Glu Val Ile Arg Arg Ala Leu
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5425 5430 5435 5440
Ser Val Lys Ser Asn Ile Gly His Thr Gln Ala Ala Ala Gly Val Ala
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Gly Val Ile Lys Val Ala Leu Ala Leu Glu Arg Gly Leu Ile Pro Arg
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His Val Val Leu Glu Glu Ala Pro Ala Ala Ala Phe Ala Pro Ala Ala
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Ala Arg Ser Ala Glu Leu Phe Val Leu Ser Ala Lys Ser Ala Ala Ala
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Ser Ala Ala Leu Asp Thr Ala Ala Gln Gly Gln Ala Pro Pro Ala Ala
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Phe Ala Ile Glu Val Ala Leu Ser Ala Leu Trp Arg Ser Trp Gly Val
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6705 6710 6715 6720
Glu Gly Val Asp Val Val Leu Asn Ser Leu Ser Gly Ala Ala Ile Asp
6725 6730 6735
Ala Ser Leu Ser Thr Leu Val Pro Asp Gly Arg Phe Ile Glu Leu Gly
6740 6745 6750
Lys Thr Asp Ile Tyr Ala Asp Arg Ser Leu Gly Leu Ala His Phe Arg
6755 6760 6765
Lys Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Val Asp Leu Ala Gly Leu Ala Val Arg
6770 6775 6780
Arg Pro Glu Arg Val Ala Ala Leu Leu Ala Glu Val Val Asp Leu Leu
6785 6790 6795 6800
Ala Arg Gly Ala Leu Gln Pro Leu Pro Val Glu Ile Phe Pro Leu Ser
6805 6810 6815
Arg Ala Ala Asp Ala Phe Arg Lys Met Ala Gln Ala Gln His Leu Gly
6820 6825 6830
Lys Leu Val Leu Ala Leu Glu Asp Pro Asp Val Arg Ile Arg Val Pro
6835 6840 6845
Gly Glu Ser Gly Val Ala Ile Arg Ala Asp Gly Ala Tyr Leu Val Thr
6850 6855 6860
Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Leu Ser Val Ala Gly Trp Leu Ala Glu
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Gln Gly Ala Gly His Leu Val Leu Val Gly Arg Ser Gly Ala Val Ser
6885 6890 6895
Ala Glu Gln Gln Thr Ala Val Ala Ala Leu Glu Ala His Gly Ala Arg
6900 6905 6910
Val Thr Val Ala Arg Ala Asp Val Ala Asp Arg Ala Gln Met Glu Arg
6915 6920 6925
Ile Leu Arg Glu Val Thr Ala Ser Gly Met Pro Leu Arg Gly Val Val
6930 6935 6940
His Ala Ala Gly Ile Leu Asp Asp Gly Leu Leu Met Gln Gln Thr Pro
6945 6950 6955 6960
Ala Arg Phe Arg Ala Val Met Ala Pro Lys Val Arg Gly Ala Leu His
6965 6970 6975
Leu His Ala Leu Thr Arg Glu Ala Pro Leu Ser Phe Phe Val Leu Tyr
6980 6985 6990
Ala Ser Gly Ala Gly Leu Leu Gly Ser Pro Gly Gln Gly Asn Tyr Ala
6995 7000 7005
Ala Ala Asn Thr Phe Leu Asp Ala Leu Ala His His Arg Arg Ala Gln
7010 7015 7020
Gly Leu Pro Ala Leu Ser Ile Asp Trp Gly Leu Phe Ala Asp Val Gly
7025 7030 7035 7040
Leu Ala Ala Gly Gln Gln Asn Arg Gly Ala Arg Leu Val Thr Arg Gly
7045 7050 7055
Thr Arg Ser Leu Thr Pro Asp Glu Gly Leu Trp Ala Leu Glu Arg Leu
7060 7065 7070
Leu Asp Gly Asp Arg Thr Gln Ala Gly Val Met Pro Phe Asp Val Arg
7075 7080 7085
Gln Trp Val Glu Phe Tyr Pro Ala Ala Ala Ser Ser Arg Arg Leu Ser
7090 7095 7100
Arg Leu Met Thr Ala Arg Arg Val Ala Ser Gly Arg Leu Ala Gly Asp
7105 7110 7115 7120
Arg Asp Leu Leu Glu Arg Leu Ala Thr Ala Glu Ala Gly Ala Arg Ala
7125 7130 7135
Gly Met Leu Gln Glu Val Val Arg Ala Gln Val Ser Gln Val Leu Arg
7140 7145 7150
Leu Ser Glu Gly Lys Leu Asp Val Asp Ala Pro Leu Thr Ser Leu Gly
7155 7160 7165
Met Asp Ser Leu Met Gly Leu Glu Leu Arg Asn Arg Ile Glu Ala Val
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Leu Gly Ile Thr Met Pro Ala Thr Leu Leu Trp Thr Tyr Pro Thr Val
7185 7190 7195 7200
Ala Ala Leu Ser Ala His Leu Ala Ser His Val Val Ser Thr Gly Asp
7205 7210 7215
Gly Glu Ser Ala Arg Pro Pro Asp Thr Gly Ser Val Ala Pro Thr Thr
7220 7225 7230
His Glu Val Ala Ser Leu Asp Glu Asp Gly Leu Phe Ala Leu Ile Asp
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Glu Ser Leu Ala Arg Ala Gly Lys Arg
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<210>6
<211>3798
<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>6
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Gly Ala Gly Thr Pro Glu Ala Phe Trp Glu Leu Leu Asp Asp Gly Arg
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Asp Ala Ile Arg Pro Leu Glu Glu Arg Trp Ala Leu Val Gly Val Asp
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Pro Gly Asp Asp Val Pro Arg Trp Ala Gly Leu Leu Thr Glu Ala Ile
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Asp Gly Phe Asp Ala Ala Phe Phe Gly Ile Ala Pro Arg Glu Ala Arg
100 105 110
Ser Leu Asp Pro Gln His Arg Leu Leu Leu Glu Val Ala Trp Glu Gly
115 120 125
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130 135 140
Gly Val Phe Val Gly Val Cys Ala Thr Glu Tyr Leu His Ala Ala Val
145 150 155 160
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165 170 175
Met Leu Ser Ile Ala Ala Gly Arg Leu Ser Tyr Thr Leu Gly Leu Gln
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Gly Pro Cys Leu Thr Val Asp Thr Ala Cys Ser Ser Ser Leu Val Ala
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Ala Pro Ile Ser Leu Ser Ala Glu Gly Ser Tyr Leu Val Thr Gly Gly
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Leu Asp Leu Phe Val Leu Phe Ser Ser Gly Ala Ala Val Trp Gly Gly
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2020 2025 2030
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Pro Lys Val Val Phe Val Phe Pro Gly Gln Gly Ser Gln Trp Val Gly
2050 2055 2060
Met Gly Arg Lys Leu Met Ala Glu Glu Pro Val Phe Arg Ala Ala Leu
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Glu Gly Cys Asp Arg Ala Ile Glu Ala Glu Ala Gly Trp Ser Leu Leu
2085 2090 2095
Gly Glu Leu Ser Ala Asp Glu Ala Ala Ser Gln Leu Gly Arg Ile Asp
2100 2105 2110
Val Val Gln Pro Val Leu Phe Ala Met Glu Val Ala Leu Ser Ala Leu
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Trp Arg Ser Trp Gly Val Glu Pro Glu Ala Val Val Gly His Ser Met
2130 2135 2140
Gly Glu Val Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ala Leu Ser Leu Glu Asp
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Ala Val Ala Ile Ile Cys Arg Arg Ser Arg Leu Leu Arg Arg Ile Ser
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Val Leu Ala Ala Leu Thr Ala Lys Gly Val Phe Trp Arg Gln Val Lys
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Ala Glu Gln Gly Gly Ala Ala Val Gly Ser Leu Arg Arg Gly Gln Asp
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Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Ala Leu Gly Thr Leu Trp Ala Ser Gly
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2725 2730 2735
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2740 2745 2750
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2835 2840 2845
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Glu Trp Gln Arg Lys Asp Pro Ile Pro Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ser
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Ser Ser Ser Ala Gly Ala Trp Leu Val Leu Met Asp Gln Gly Gly Thr
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Gly Ala Ala Leu Val Ser Leu Leu Glu Gly Arg Gly Glu Ala Cys Val
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Arg Val Ile Ala Gly Thr Ala Tyr Ala Cys Leu Ala Pro Gly Leu Tyr
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Gln Val Asp Pro Ala Gln Pro Asp Gly Phe His Thr Leu Leu Arg Asp
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Ala Phe Gly Glu Asp Arg Ile Cys Arg Ala Val Val His Met Trp Ser
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Leu Asp Ala Thr Ala Ala Gly Glu Arg Ala Thr Ala Glu Ser Leu Gln
3250 3255 3260
Ala Asp Gln Leu Leu Gly Ser Leu Ser Ala Leu Ser Leu Val Gln Ala
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Leu Val Arg Arg Arg Trp Arg Asn Met Pro Arg Leu Trp Leu Leu Thr
3285 3290 3295
Arg Ala Val His Ala Val Gly Ala Glu Asp Ala Ala Ala Ser Val Ala
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Gln Ala Pro Val Trp Gly Leu Gly Arg Thr Leu Ala Leu Glu His Pro
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Glu Leu Arg Cys Thr Leu Val Asp Val Asn Pro Ala Pro Ser Pro Glu
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Asp Ala Ala Ala Leu Ala Val Glu Leu Gly Ala Ser Asp Arg Glu Asp
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Gln Val Ala Leu Arg Ser Asp Gly Arg Tyr Val Ala Arg Leu Val Arg
3365 3370 3375
Ser Ser Phe Ser Gly Lys Pro Ala Thr Asp Cys Gly Ile Arg Ala Asp
3380 3385 3390
Gly Ser Tyr Val Ile Thr Asp Gly Met Gly Arg Val Gly Leu Ser Val
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Ala Gln Trp Met Val Met Gln Gly Ala Arg His Val Val Leu Val Asp
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Arg Gly Gly Ala Ser Glu Ala Ser Arg Asp Ala Leu Arg Ser Met Ala
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Glu Ala Gly Ala Glu Val Gln Ile Val Glu Ala Asp Val Ala Arg Arg
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Asp Asp Val Ala Arg Leu Leu Ser Lys Ile Glu Pro Ser Met Pro Pro
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Leu Arg Gly Ile Val Tyr Val Asp Gly Thr Phe Gln Gly Asp Ser Ser
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<210>7
<211>2439
<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>7
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Asn Leu Leu Leu Gly Phe Gly Leu Pro Thr Ala Ile Ala Ala Ala Ser
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Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ala Ala Leu Arg Gly Ala Ala Arg Leu Phe
225 230 235 240
Ala Ser Trp Glu Val Val Ser Ser Lys Lys Ser Gln Leu Gly Asn Ile
245 250 255
Pro Glu Ala Leu Trp Glu Arg Leu Arg Thr Ile Val Arg Ala Met Gly
260 265 270
Asn Ala Asp Asn Leu Ser Arg Phe Glu Arg Ala Glu Ala Ile Ala Ala
275 280 285
Glu Val Arg Arg Leu Arg Ala Gln Pro Ala Pro Phe Ala Ala Gly Ala
290 295 300
Gly Leu Ala Val Ala Gly Val Ser Ser Ser Gly Arg Leu Ser Gly Leu
305 310 315 320
Val Thr Asp Gly Asp Ala Leu Tyr Ser Gly Asp Gly Asn Asp Ile Val
325 330 335
Met Phe Gln Pro Gly Arg Ile Ser Pro Val Val Leu Leu Ala Gly Thr
340 345 350
Asp Pro Phe Phe Glu Leu Ala Pro Pro Leu Ser Gln Met Leu Phe Val
355 360 365
Ala His Ala Asn Ala Gly Thr Ile Ser Lys Val Leu Thr Glu Gly Ser
370 375 380
Pro Leu Ile Val Met Ala Arg Asn Gln Ala Arg Pro Met Ser Leu Val
385 390 395 400
His Ala Arg Gly Phe Met Ala Trp Val Asn Gln Ala Met Val Pro Asp
405 410 415
Pro Glu Arg Gly Ala Pro Phe Val Val Gln Arg Ser Thr Ile Met Glu
420 425 430
Phe Glu His Pro Thr Pro Arg Cys Leu His Glu Pro Ala Gly Ser Ala
435 440 445
Phe Ser Leu Ala Cys Asp Glu Glu His Leu Tyr Trp Cys Glu Leu Ser
450 455 460
Ala Gly Arg Leu Glu Leu Trp Arg His Pro His His Arg Pro Gly Ala
465 470 475 480
Pro Ser Arg Phe Ala Tyr Leu Gly Glu His Pro Ile Ala Ala Thr Trp
485 490 495
Tyr Pro Ser Leu Thr Leu Asn Ala Thr His Val Leu Trp Ala Asp Pro
500 505 510
Asp Arg Arg Ala Ile Leu Gly Val Asp Lys Arg Thr Gly Val Glu Pro
515 520 525
Ile Val Leu Ala Glu Thr Arg His Pro Pro Ala His Val Val Ser Glu
530 535 540
Asp Arg Asp Ile Phe Ala Leu Thr Gly Gln Pro Asp Ser Arg Asp Trp
545 550 555 560
His Val Glu His Ile Arg Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Asp Tyr
565 570 575
Gln Arg Gln Leu Trp Asp Arg Pro Asp Met Val Leu Asn Arg Arg Gly
580 585 590
Leu Phe Phe Thr Thr Asn Asp Arg Ile Leu Thr Leu Ala Arg Ser
595 600 605
<210>10
<211>423
<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>10
Met Gly Ala Leu Ile Ser Val Ala Ala Pro Gly Cys Ala Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ala Glu Glu Glu Gly Gln Pro Gly Gln Asp Ala Gly Ala Gly Ala Leu
20 25 30
Ala Pro Ala Arg Glu Val Met Ala Ala Glu Val Ala Ala Gly Gln Met
35 40 45
Pro Gly Ala Val Trp Leu Val Ala Arg Gly Asp Asp Val His Val Asp
50 55 60
Ala Val Gly Val Thr Glu Leu Gly Gly Ser Ala Pro Met Arg Arg Asp
65 70 75 80
Thr Ile Phe Arg Ile Ala Ser Met Thr Lys Ala Val Thr Ala Thr Ala
85 90 95
Val Met Met Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Asp Leu Asp Ser Pro Val
100 105 110
Asp Arg Trp Leu Pro Glu Leu Ala Asn Arg Lys Val Leu Ala ArgIle
115 120 125
Asp Gly Pro Ile Asp Glu Thr Val Pro Ala Glu Arg Pro Ile Thr Val
130 135 140
Arg Asp Leu Met Thr Phe Thr Met Gly Phe Gly Ile Ser Phe Asp Ala
145 150 155 160
Ser Ser Pro Ile Gln Arg Ala Ile Asp Glu Leu Gly Leu Val Asn Ala
165 170 175
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180 185 190
Leu Gly Thr Leu Pro Leu Met His Gln Pro Gly Ala Gln Trp MetTyr
195 200 205
Asn Thr Gly Ser Leu Val Gln Gly Val Leu Val Gly Arg Ala Ala Asp
210 215 220
Gln Gly Phe Asp Ala Phe Val Arg Glu Arg Ile Leu Ala Pro Leu Gly
225 230 235 240
Met Arg Asp Thr Asp Phe His Val Pro Ala Asp Lys Leu Ala Arg Phe
245 250 255
Ala Gly Cys Gly Tyr Phe Thr Asp Glu Gln Thr Gly Glu Lys Thr Arg
260 265 270
Met Asp Arg Asp Gly Ala Glu Ser Ala Tyr Ala Ser Pro Pro Ala Phe
275 280 285
Pro Ser Gly Ala Ala Gly Leu Val Ser Thr Val Asp Asp Tyr Leu Leu
290 295 300
Phe Ala Arg Met Leu Met Asn Gly Gly Val His Glu Gly Arg Arg Leu
305 310 315 320
Leu Ser Ala Ala Ser Val Arg Glu Met Thr Ala Asp His Leu Thr Pro
325 330 335
Ala Gln Lys Ala Ala Ser Ser Phe Phe Pro Gly Phe Phe Glu Thr His
340 345 350
Gly Trp Gly Tyr Gly Met Ala Val Val Thr Ala Pro Asp Ala Val Ser
355 360 365
Glu Val Pro Gly Arg Tyr Gly Trp Asp Gly Gly Phe Gly Thr Ser Trp
370 375 380
Ile Asn Asp Pro Gly Arg Glu Leu Ile Gly Ile Val Met Thr Gln Ser
385 390 395 400
Ala Gly Phe Leu Phe Ser Gly Ala Leu Glu Arg Phe Trp Arg Ser Val
405 410 415
Tyr Val Ala Thr Glu Ser Ala
420
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<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>11
Met His Gly Leu Thr Glu Arg Gln Val Leu Leu Ser Leu Val Thr Leu
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Ala Leu Ile Leu Val Thr Ala Arg Ala Ser Gly Glu Leu Ala Arg Arg
20 25 30
Leu Arg Gln Pro Glu Val Leu Gly Glu Leu Phe Gly Gly Val Val Leu
35 40 45
Gly Pro Ser Val Val Gly Ala Leu Ala Pro Gly Phe His Arg Ala Leu
50 55 60
Phe Gln Glu Pro Ala Val Gly Val Val Leu Ser Gly Ile Ser Trp Ile
65 70 75 80
Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Met Ala Gly Ile Glu Val Asp Val Gly
85 90 95
Ile Leu Arg Lys Glu Ala Arg Pro Gly Ala Leu Ser Ala Leu Gly Ala
100 105 110
Ile Ala Pro Pro Leu Ala Ala Gly Ala Ala Phe Ser Ala Leu ValLeu
115 120 125
Asp Arg Pro Leu Pro Ser Gly Leu Phe Leu Gly Ile Val Leu Ser Val
130 135 140
Thr Ala Val Ser Val Ile Ala Lys Val Leu Ile Glu Arg Glu Ser Met
145 150 155 160
Arg Arg Ser Tyr Ala Gln Val Thr Leu Ala Ala Gly Val Val Ser Glu
165 170 175
Val Ala Ala Trp Val Leu Val Ala Met Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Ala
180 185 190
Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala Arg Ser Ala Leu Leu Ala Ser Gly Phe
195 200 205
Leu Leu Phe Met Val Leu Val Gly Arg Arg Leu Thr His Leu Ala Met
210 215 220
Arg Trp Val Ala Asp Ala Thr Arg Val Ser Lys Gly Gln Val Ser Leu
225 230 235 240
Val Leu Val Leu Thr Phe Leu Ala Ala Ala Leu Thr Gln Arg Leu Gly
245 250 255
Leu His Pro Leu Leu Gly Ala Phe Ala Leu Gly Val Leu Leu Asn Ser
260 265 270
Ala Pro Arg Thr Asn Arg Pro Leu Leu Asp Gly Val Gln Thr Leu Val
275 280 285
Ala Gly Leu Phe Ala Pro Val Phe Phe Val Leu Ala Gly Met Arg Val
290 295 300
Asp Val Ser Gln Leu Arg Thr Pro Ala Ala Trp Gly Thr Val Ala Leu
305 310 315 320
Leu Leu Ala Thr Ala Thr Ala Ala Lys Val Val Pro Ala Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Arg Leu Gly Gly Leu Arg Gly Ser Glu Ala Ala Leu Val Ala Val
340 345 350
Gly Leu Asn Met Lys Gly Gly Thr Asp Leu Ile Val Ala Ile Val Gly
355 360 365
Val Glu Leu Gly Leu Leu Ser Asn Glu Ala Tyr Thr Met Tyr Ala Val
370 375 380
Val Ala Leu Val Thr Val Thr Ala Ser Pro Ala Leu Leu Ile Trp Leu
385 390 395 400
Glu Lys Arg Ala Pro Pro Thr Gln Glu Glu Ser Ala Arg Leu Glu Arg
405 410 415
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420 425 430
Val Pro Ile Val Ala His Ala Leu Pro Gly Phe Ala Thr Asp Ile Val
435 440 445
Glu Ser Ile Val Ala Ser Lys Arg Lys Leu Gly Glu Thr Val Asp Ile
450 455 460
Thr Glu Leu Ser Val Glu Gln Gln Ala Pro Gly Pro Ser Arg Ala Ala
465 470 475 480
Gly Glu Ala Ser Arg Gly Leu Ala Arg Leu Gly Ala Arg Leu Arg Val
485 490 495
Gly Ile Trp Arg Gln Arg Arg Glu Leu Arg Gly Ser Ile Gln Ala Ile
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Val Gln Arg Ala Glu Ser Asn Val Leu Val Val Val Gly Asp Pro Pro
545 550 555 560
Ala Ala Glu Arg Ala Ser Ala Arg Arg Ile Leu Val Pro Ile Ile Gly
565 570 575
Leu Glu Tyr Ser Phe Ala Ala Ala Asp Leu Ala Ala His Val Ala Leu
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Ala Trp Asp Ala Glu Leu Val Leu Leu Ser Ser Ala Gln Thr Asp Pro
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Ala Arg Ser Val Val Asp Glu Ala Val Phe Arg Gly Arg Arg Leu Gly
625 630 635 640
Val Arg Val Ser Ser Arg Val His Val Gly Ala His Pro Ser Asp Glu
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660 665 670
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Glu Ser Val Val Val Arg Ser Arg Val Pro Val Ala Leu Leu Val Ala
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<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
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Met Asp Lys Pro Ile Gly Arg Thr Arg Cys Ala Ile Ala Glu Gly Tyr
1 5 10 15
Ile Pro Gly Gly Ser Asn Gly Pro Glu Pro Gln Met Thr Ser His Glu
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Asp Ala Pro Ile Val Val Gln His Thr Arg Leu Asp Ser Arg Gln Ala
100 105 110
Glu Asn Ala Leu Leu Ser Thr Ile Ala Tyr Thr Asp Arg Glu
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<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
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Met Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Phe Gly Arg Arg Ile Gly His
1 5 10 15
Thr Leu Gly Leu Leu Ala Ser Met Ala Leu Ala Gly Cys Gly Glv Pro
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Val Asp Val Val His Leu Ser Pro Pro Glu Arg Leu Glu Ala Gly Ser
65 70 75 80
Glu Arg Phe Val Val Trp Gln Arg Pro Ser Pro Glu Ser Pro Trp Arg
85 90 95
Arg Val Gly Val Leu Asp Tyr Asn Ala Asp Ser Arg Arg Gly Lys Leu
100 105 110
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115 120 125
Glu Lys Gln Ser Ser Pro Gln Ser Pro Ser Ser Ala Ala Val Ile Gly
130 135 140
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145
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<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>14
Val Thr Ser Glu Glu Val Pro Gly Ala Ala Leu Gly Ala Gln Ser Ser
1 5 10 15
Leu Val Arg Ala Gln His Ala Ala Arg His Val Arg Pro Cys Thr Arg
20 25 30
Ala Glu Glu Pro Pro Ala Leu Met His Gly Leu Thr Glu Arg Gln Val
35 40 45
Leu Leu Ser Leu Val Ala Leu Ala Leu Val Leu Leu Thr Ala Arg Ala
50 55 60
Phe Gly Glu Leu Ala Arg Arg Leu Arg Gln Pro Glu Val Leu Gly Glu
65 70 75 80
Leu Phe Gly Gly Val Val Leu Gly Pro Ser Val Val Gly Ala Leu Ala
85 90 95
Pro Gly Phe His Arg Val Leu Phe Gln Asp Pro Ala Val Gly Val Val
100 105 110
Leu Ser Gly Ile Ser Trp Ile Gly Ala Leu Val Leu Leu Leu Met Ala
115 120 125
Gly Ile Glu Val Asp Val Ser Ile Leu Arg Lys Glu Ala Arg Pro Gly
130 135 140
Ala Leu Ser Ala Leu Gly Ala Ile Ala Pro Pro Leu Arg Thr Pro Gly
145 150 155 160
Pro Leu Val Gln Arg Met Gln Gly Ala Phe Thr Trp Asp Leu Asp Val
165 170 175
Ser Pro Arg Arg Ser Ala Gln Ala
180
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<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>15
Val Asn Ala Pro Cys Met Arg Cys Thr Ser Gly Pro Gly Val Arg Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ala Ile Ala Pro Ser Ala Glu Ser Ala Pro Gly Arg Ala Ser
20 25 30
Leu Arg Arg Met Leu Thr Ser Thr Ser Ile Pro Ala Met Ser Ser Arg
35 40 45
Thr Ser Ala Pro Ile Gln Glu Met Pro Glu Ser Thr Thr Pro Thr Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Asp Gly Pro Ser Thr Thr Pro Pro Lys Ser Ser Pro Ser Thr Ser
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Gly Trp Arg Ser Arg Arg Ala Ser Ser Pro Lys Ala Arg Ala Val Arg
100 105 110
Arg Thr Ser Ala Arg Ala Thr Ser Glu Ser Arg Thr Cys Arg Ser Val
115 120 125
Arg Pro Cys Ile Arg Ala Gly Gly Ser Ser Ala Arg Val Gln Gly Arg
130 135 140
Thr
145
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<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>16
Val Leu Ala Pro Pro Ala Asp Ile Arg Pro Pro Ala Ala Ala Gln Leu
1 5 10 15
Glu Pro Asp Ser Pro Asp Asp Glu Ala Asp Glu Ala Asp Glu Ala Leu
20 25 30
Arg Pro Phe Arg Asp Ala Ile Ala Ala Tyr Ser Glu Ala Val Arg Trp
35 40 45
Ala Glu Ala Ala Gln Arg Pro Arg Leu Glu Ser Leu Val Arg Leu Ala
50 55 60
Ile Val Arg Leu Gly Lys Ala Leu Asp Lys Val Pro Phe Ala His Thr
65 70 75 80
Thr Ala Gly Val Ser Gln Ile Ala Gly Arg Leu Gln Asn Asp Ala Val
85 90 95
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100 105 110
His Ala Leu Arg Asp Ala Ala Ser Ala Met Glu Ala Leu Ala Ala Gly
115 120 125
Pro Tyr Arg Gly Ser Ser Arg Val Ser Ala Ala Val Gly Glu Phe Arg
130 135 140
Gly Glu Ala Ala Arg Leu His Pro Ala Asp Arg Val Pro Ala Ser Asp
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Gln Gln Ile Leu Thr Ala Leu Arg Ala Ala Glu Arg Ala Leu Ile Ala
165 170 175
Leu Tyr Thr Ala Phe Ala Arg Glu Glu
180 185
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<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>17
Met Ala Asp Ala Ala Ser Arg Ser Ala Cys Ser Val Ala Ala Arg Lys
1 5 10 15
Leu Ala Tyr Arg Ala Ala Thr Ser Asn Gln Thr Ala Ser Phe Trp Ser
20 25 30
Leu Pro Ala Ile Trp Glu Thr Pro Ala Val Val Cys Ala Lys Gly Thr
35 40 45
Leu Ser Ser Ala Leu Pro Ser Arg Thr Ile Ala Ser Arg Thr Arg Leu
50 55 60
Ser Ser Arg Gly Arg Cys Ala Ala Ser Ala His Arg Thr Ala Ser Glu
65 70 75 80
Tyr Ala Ala Ile Ala Ser Arg Asn Gly Arg Ser Ala Ser Ser Ala Ser
85 90 95
Ser Ala Ser Ser Ser Gly Glu Ser Gly Ser Ser Trp Ala Ala Ala Gly
100 105 110
Gly Arg Met Ser Ala Gly Gly Ala Ser Thr Gly Glu Val Tyr Glu Gln
115 120 125
Ala Pro Arg Leu Arg Leu Ala Gln Ser Val Ala Ala Arg Arg Arg Asp
130 135 140
Pro Thr
145
<210>18
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<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>18
Val Thr Val Ser Ser Met Pro Arg Ser Trp Ser Ser Arg Val Arg Thr
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Val Val Thr Ala Leu Gly Cys Ala Arg Arg Leu Ser Gly Ser Ile Ser
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Arg Leu Arg Arg His Pro Glu Ala Gly Arg Ala Pro Arg Ser Arg Leu
35 40 45
Arg Ala Trp Arg Arg Leu Pro Gln His Ile Ser Ser Pro Trp Arg His
50 55 60
Leu Pro Pro Gly Ala Arg Val Gly Thr Ser Cys Pro Ala Asp Arg Arg
65 70 75 80
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100 105 110
Val Leu Val Gly Asp Gly Ser Ala Arg Gly Arg Arg Arg Leu Ser Asn
115 120 125
Arg Arg Ala Glu Arg Arg Val Ser Asp Val Thr Cys Arg Glu Gly Gly
130 135 140
Glu Ala Met Gln Lys Ile Ala Gly Lys Leu Val Val Gly Leu Ile Ser
145 150 155 160
Val Ser Gly Met Ser Leu Leu Ala Ala Cys Gly Gly Glu Lys Arg Ser
165 170 175
Gly Gly Glu Ala Gln Thr Pro Gly Gly Ala Gln Gly Glu Ala Pro Val
180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
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<213>纤维堆囊菌
<400>19
Val Thr Val Ser Ser Met Pro Arg Ser Trp Ser Ser Arg Val Arg Thr
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Val Val Thr Ala Leu Gly Cys Ala Arg Arg Leu Ser Gly Ser Ile Ser
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65 70 75 80
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Leu Val Ala Arg Met Ser Gly His Val Ala Arg Asn Pro His Ala Ala
100 105 110
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115 120 125
Arg Arg Ala Glu Arg Arg Val Ser Asp Val Thr Cys Arg Glu Gly Gly
130 135 140
Glu Ala Met Gln Lys Ile Ala Gly Lys Leu Val Val Gly Leu Ile Ser
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Val Ser Gly Met Ser Leu Leu Ala Ala Cys Gly Gly Glu Lys Arg Ser
165 170 175
Gly Gly Glu Ala Gln Thr Pro Gly Gly Ala Gln Gly Glu Ala Pro Val
180 185 190
Pro Val Gly Ser Ala Val Asp Ser Ile Val Ala Ala Arg Cys Asp Arg
195 200 205
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225 230 235 240
Phe Gly Glu Cys Pro Gly Gly Ile Asp Ala Lys Gln Leu Asn Glu Cys
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Leu Glu Gly Ile Arg Asn Glu Gly Cys Gly Asn Pro Phe Asp Thr Leu
260 265 270
Gly Arg Val Val Ala Cys Arg Ser Ser Asp Leu Cys Arg Asp Ala Arg
275 280 285
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<211>155
<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>20
Met Asp Pro Arg Ala Arg Arg Glu Lys Arg Pro Ser Leu Leu Asp Ser
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Leu Ile Ser Thr Ile Ala Tyr Thr Asp Arg Glu
145 150 155
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<211>156
<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>21
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1 5 10 15
Val Gly Arg Arg Ile Gly Leu Thr Leu Gly Leu Leu Ala Ser Met Ala
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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Ser Ser Ala Ala Val Ile Gly Pro Thr Ser Val Gly
145 150 155
<210>22
<211>305
<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>22
Met Glu Lys Glu Ser Arg Ile Ala Ile Tyr Gly Ala Ile Ala Ala Asn
1 5 10 15
Val Ala Ile Ala Ala Val Lys Phe Ile Ala Ala Ala Val Thr Gly Ser
20 25 30
Ser Ala Met Leu Ser Glu Gly Val His Ser Leu Val Asp Thr Ala Asp
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Gly Leu Leu Leu Leu Leu Gly Lys His Arg Ser Ala Arg Pro Pro Asp
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Ala Glu His Pro Phe Gly His Gly Lys Glu Leu Tyr Phe Trp Thr Leu
65 70 75 80
Ile Val Ala Ile Met Ile Phe Ala Ala Gly Gly Gly Val Ser Ile Tyr
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100 105 110
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Leu Ala Ala Met Arg Ser Ser Lys Asp Pro Thr Thr Phe Thr Ile Val
145 150 155 160
Leu Glu Asp Ser Ala Ala Leu Ala Gly Leu Thr Ile Ala Phe Leu Gly
165 170 175
Val Trp Leu Gly His Arg Leu Gly Asn Pro Tyr Leu Asp Gly Ala Ala
180 185 190
Ser Ile Gly Ile Gly Leu Val Leu Ala Ala Val Ala Val Phe Leu Ala
195 200 205
Ser Gln Ser Arg Gly Leu Leu Val Gly Glu Ser Ala Asp Arg Glu Leu
210 215 220
Leu Ala Ala Ile Arg Ala Leu Ala Ser Ala Asp Pro Gly Val Ser Ala
225 230 235 240
Val Gly Arg Pro Leu Thr Met His Phe Gly Pro His Glu Val Leu Val
245 250 255
Val Leu Arg Ile Glu Phe Asp Ala Ala Leu Thr Ala Ser Gly Val Ala
260 265 270
Glu Ala Ile Glu Arg Ile Glu Thr Arg Ile Arg Ser Glu Arg Pro Asp
275 280 285
Val Lys His Ile Tyr Val Glu Ala Arg Ser Leu His Gln Arg Ala Arg
290 295 300
Ala
305
<210>23
<211>135
<212>PRT
<213>纤维堆囊菌
<400>23
Val Gln Thr Ser Ser Phe Asp Ala Arg Tyr Ala Gly Cys Lys Ser Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ile Ala Arg Ser Gly Ser Ala Gly Ala Arg Ala Gly Arg Ala
20 25 30
His Glu Gly Ala Ala Ser Ala Gly Phe Glu Gly Gly Asp Val Met Arg
35 40 45
Lys Ala Arg Ala His Gly Ala Met Leu Gly Gly Arg Asp Asp Gly Trp
50 55 60
Arg Arg Gly Leu Pro Gly Ala Gly Ala Leu Arg Ala Ala Leu Gln Arg
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Lys Val Thr Ser Ser Asp Ile
130 135
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：通用反向引物
<400>24
ggaaacagct atgaccatg 19
<210>25
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：通用正向引物
<400>25
gtaaaacgac ggccagt 17
<210>26
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR引物NH24末端”B”
<400>26
gtgactggcg cctggaatct gcatgagc 28
<210>27
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR引物NH2末端”A”
<400>27
agcgggagct tgctagacat tctgtttc 28
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR引物NH2末端”B”
<400>28
gacgcgcctc gggcagcgcc ccaa 24
<210>29
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR引物pEPO15-NH6末端”B”
<400>29
caccgaagcg tcgatctggt ccatc 25
<210>30
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR引物pEPO15H2.7 末端”A”
<400>30
cggtcagatc gacgacgggc tttcc 25
Claims (27)
1.一种分离的核酸分子，其中包含编码至少一种参与epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列的互补体能够与选自下组的核苷酸序列在下面定义的杂交条件下杂交：SEQ IDNO：1的核苷酸21746-43519和SEQ ID NO：1的核苷酸21746-54920；所述杂交条件是在7％十二烷基硫酸钠、0.5M NaPO4 pH7.0、1mM EDTA中于50℃杂交，在2×SSC、1％SDS中于50℃洗涤。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中包含其互补序列能与选自下组的核苷酸序列在下面定义的杂交条件下杂交的核苷酸序列：SEQID NO：1的核苷酸21746-43519和SEQ ID NO：1的核苷酸21746-54920；所述杂交条件是在65℃杂交36小时，并用0.1×SSC和0.5％SDS于65℃洗涤20分钟3次。
3.权利要求1或2的分离的核酸分子，其中包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：5。
4.权利要求1或2的分离的核酸分子，其中包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO：1的核苷酸21746-43519和SEQ ID NO：1的核苷酸21746-54920。
5.一种分离的核酸分子，其中包含参与epothilone生物合成的核苷酸序列，所述核苷酸序列的互补体能够与选自下组的核苷酸序列在下面定义的杂交条件下杂交：SEQ ID NO：1的核苷酸20779-22991；所述杂交条件是在7％十二烷基硫酸钠、0.5M NaPO4 pH7.0、1mM EDTA中于50℃杂交，在2×SSC、1％SDS中于50℃洗涤。
6.权利要求5的分离的核酸分子，其中包含其互补序列能与选自下组的核苷酸序列在下面定义的杂交条件下杂交的核苷酸序列：SEQID NO：1的核苷酸20779-22991；所述杂交条件是在65℃杂交36小时，并用0.1×SSC和0.5％SDS于65℃洗涤20分钟3次。
7.权利要求5或6的分离的核酸分子，其中包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：5。
8.权利要求5或6的分离的核酸分子，其中包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO：1的核苷酸20779-22991。
9.权利要求1-2和5-6中任何一项的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列分离自粘细菌。
10.权利要求9的分离的核酸分子，其中所述粘细菌是纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)。
11.一种嵌合基因，其中包含权利要求1-10中任一项的核酸分子以及与之可操作连接的异源启动子序列。
12.一种重组载体，其中包含权利要求11的嵌合基因。
13.一种重组宿主细胞，其中包含权利要求11的嵌合基因。
14.权利要求13的重组宿主细胞，它是细菌。
15.权利要求14的重组宿主细胞，它是放线菌(Actinomycete)。
16.权利要求15的重组宿主细胞，它是链霉菌(Streptomyces)。
17.一种Bac克隆，其中包含权利要求1-10中任一项的核酸分子。
18.权利要求17的Bac克隆，它是pEPO15。
19.在重组宿主中异源表达epothilone的方法，包括：
a)将权利要求11的嵌合基因导入宿主；和
b)在适合宿主生物合成epothilone的条件下培养宿主。
20.生产epothilone的方法，包括：
a)用权利要求19的方法在重组宿主中表达epothilone；和
b)从重组宿主中提取epothilone。
21.一种分离的多肽，其参与epothilone生物合成，并且其由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列的互补体能够与选自下组的核苷酸序列在下面定义的杂交条件下杂交：SEQ ID NO：1的核苷酸21746-43519；所述杂交条件是在7％十二烷基硫酸钠、0.5M NaPO4pH7.0、1mM EDTA中于50℃杂交，在2×SSC、1％SDS中于50℃洗涤。
22.权利要求21的分离的多肽，其中所述核苷酸序列的互补序列能与选自下组的核苷酸序列在下面定义的杂交条件下杂交：SEQ ID NO：1的核苷酸21746-43519；所述杂交条件是在65℃杂交36小时，并用0.1×SSC和0.5％SDS于65℃洗涤20分钟3次。
23.权利要求21或22的分离的多肽，其中包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：5。
24.一种重组宿主细胞，其中包含重组表达的权利要求21、22或23的多肽。
25.权利要求24的重组宿主细胞，它是细菌。
26.权利要求25的重组宿主细胞，它是放线菌。
27.权利要求26的重组宿主细胞，它是链霉菌。
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