JP2006141294A - 新規水酸化酵素、該酵素をコードするｄｎａおよびその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】 新規な基質特異性を有する水酸化酵素を提供すること。特に、化学合成法あるいは既知の水酸化酵素を用いる生化学的方法では製造が困難である水酸化された化合物を製造する方法を提供すること。
【解決手段】 放線菌から水酸化酵素の遺伝子をコードするＤＮＡを単離し、該ＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換された微生物の形質転換体を得る。この形質転換体は新規な基質特異性を有する水酸化酵素を生産する。さらに、この形質転換体の培養物から水酸化された化合物を採取することにより、水酸化された化合物を製造することができる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、新規水酸化酵素、該酵素をコードするＤＮＡおよびその利用に関する。本発明はまた、この水酸化酵素をコードする遺伝子を含有する形質転換体から、新規な水酸化された化合物を製造する方法に関する。

微生物を利用する水酸化反応については、広範な研究が行われており、芳香族化合物の位置特異的水酸化反応についても多数の報告がある（例えば、非特許文献１）。しかし、水酸化酵素の種類によって反応特異性が異なるため、所望の位置に水酸基が導入された芳香族化合物を製造することは困難な場合が多い。例えば、トリプトファンの直接水酸化に関して、トリプトファンの５位を水酸化する酵素については知られている（非特許文献２）が、これまでのところ、その他の位置、例えば、４位、６位、または７位を直接水酸化する酵素は知られていない。

微生物を活用する物質変換プロセスは、基質特異性や反応特異性（例えば、位置特異性や立体構造特異性）があること、温和な条件（常温常圧）で反応可能であること、有害な副産物が生成しにくいことなどの特徴を有している。そのため、これまでに知られている水酸化酵素とは異なる基質特異性を有する新規な水酸化酵素があれば、種々の立体選択的な水酸化反応が可能となり、医薬品の製造などへの有用性が高い。

例えば、ストレプトバーティシリウム属に属する微生物の培養物中から得られた化合物は、トリプトファンの縮合体からなる骨格を有し、この骨格に２つの水酸基が存在している化合物であり、抗腫瘍作用を有することが知られている（特許文献１）。一方、インドロカルバゾール系抗生物質であるスタウロスポリンは、上記化合物と同様にトリプトファンの縮合体を骨格として有するが、この骨格には水酸基はない（非特許文献３）。そこで、スタウロスポリンの芳香環の任意の位置に水酸基が導入されれば、抗菌作用だけでなく、抗腫瘍作用も有するようになると期待される。
特許第３０１０６７５号公報 ディー．ティー．ギブソン（Ｄ．Ｔ．Ｇｉｂｓｏｎｓ）ら，「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）」，１９９５年，１７７巻，２６１５−２６２１頁 ジェイ．ピー．チッパー（Ｊ．Ｐ．Ｔｉｐｐｅｒ）ら，「アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・バイオフィジオロジー（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）」，１９９４年，１５巻，４４５−４５３頁 尾仲宏康（Ｈｉｒｏｙａｓｕ Ｏｎａｋａ）ら，「ザ・ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」，２００２年，５５巻，１０６３−１０７１頁 尾仲宏康（Ｈｉｒｏｙａｓｕ Ｏｎａｋａ）ら，「ザ・ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」，２００３年，５６巻，９５０−９５６頁

本発明は、新規な基質特異性を有する水酸化酵素を提供することを目的とする。より詳細には、微生物を用いて、水酸化された化合物、特に、化学合成法あるいは既知の水酸化酵素を用いる生化学的方法では製造が困難である水酸化された化合物を製造する方法を提供すること目的とする。

本発明者らは、新規な水酸化酵素の遺伝子を取得し、これを適切なベクターを用いて微生物に導入し、菌体内にこの遺伝子を保持する形質転換体を得ることができれば、微生物の触媒能力を従来の方法に比して飛躍的に増大させることが可能となると考えた。これについて鋭意検討した結果、放線菌から新規水酸化酵素をコードするＤＮＡ断片を単離することに成功し、このＤＮＡ断片を含む組換えベクターを用いて微生物を形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより、新規な水酸化された化合物が生産されることを見出して、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、配列表の配列番号２の１位から５２１位までのアミノ酸配列あるいは該アミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む、水酸化酵素を提供する。

本発明はまた、配列表の配列番号２の１位から５２１位までのアミノ酸配列あるいは該アミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む水酸化酵素をコードする、ＤＮＡを提供する。

あるいは、本発明は、配列表の配列番号１の１位から１５６３位までの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを提供し、該ＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、水酸化反応を触媒する活性を有する。

本発明はさらに、上記のいずれかのＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。

本発明はまた、上記の組換えベクターを含有する形質転換体を提供する。

１つの実施態様では、上記形質転換体は、以下の式：

で表される化合物（Ｉ）の生産能を有する微生物である。

本発明はさらに、上記の形質転換体を培養する工程、および得られた培養物から水酸化酵素を採取する工程を含む、水酸化酵素の製造方法を提供する。

本発明はまた、以下の式：

で表される化合物（ＩＩ）を提供する。

本発明はさらに、上記の形質転換体を培養する工程、および得られた培養物から以下の式：

で表される化合物（ＩＩ）を回収する工程を含む、化合物（ＩＩ）の製造方法を提供する。

１つの実施態様では、上記形質転換体は放線菌に属する微生物である。

本発明の水酸化酵素は、インドロカルバゾール系抗生物質のインドール環において、これまで水酸基が導入されていない部位に水酸基を導入できる。したがって、本発明の水酸化酵素を用いることにより、種々の新規なインドロカルバゾール系抗生物質を製造することができる。さらに、インドール環を有する種々の化合物についても、従来は水酸基が導入されにくかった部位に水酸基を導入できる可能性が高い。

（１）水酸化酵素
本発明の水酸化酵素は、５２１個のアミノ酸からなるポリペプチドを含み、このポリペプチドは配列表の配列番号２の１位から５２１位までのアミノ酸配列からなる。あるいは、本発明の水酸化酵素は、このアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有し、かつ水酸化酵素活性を有するポリペプチドも包含する。

本発明の水酸化酵素は、芳香族化合物の芳香環を水酸化する活性を有している。この活性は、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）ｐＴＹＭＣｓｔａ７株（非特許文献４を参照のこと）を用いて確認され得る。ｐＴＹＭＣｓｔａ７株は、スタウロスポリン生合成遺伝子クラスターの一部が導入された株であり、スタウロスポリンのアグリコンである以下の式：

で表される化合物（Ｉ）を生産する。以下で詳述するように、この微生物に本発明の水酸化酵素をコードするＤＮＡを含有するベクターを導入することによって得られる形質転換株は、上記化合物（Ｉ）のインドール環の６位が置換された以下の式：

で表される化合物（ＩＩ）を生産する。一方、非形質転換株は、化合物（ＩＩ）を生産せず、化合物（Ｉ）のみを生産する。したがって、本発明の水酸化酵素が、インドール環の６位に相当する位置に水酸基を導入し得る新規な水酸化酵素であることが確認できる。

（２）水酸化酵素をコードするＤＮＡ
本発明の水酸化酵素をコードするＤＮＡは、１つの実施態様において、配列番号２の１位から５２１位までのアミノ酸配列をコードしている。具体的な例としては、配列番号１の１位から１５６３位までの塩基配列である。また、本発明の水酸化酵素をコードするＤＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有し、かつ水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列も包含する。

本発明の水酸化酵素をコードするＤＮＡ（遺伝子）は、例えば、放線菌からクローニングすることにより得られ得る。この水酸化酵素の遺伝子は、ストレプトバーティシリウム属に属する放線菌、例えば、ストレプトバーティシリウム・エスピー（Streptoverticillium sp.）ＢＡ１３７９３株から得ることができる。ストレプトバーティシリウム・エスピーＢＡ１３７９３株は、インドロカルバゾール系の化合物であって、インドール環の７位に水酸基を有する新規な抗生物質を生産し得る株である。一般に、インドロカルバゾール系抗生物質は、トリプトファンの縮合によって生産されると考えられるため、この株はトリプトファンを構成するインドール環の７位に相当する位置に水酸基を導入し得る水酸化酵素を有すると考えられる。

ところで、インドロカルバゾール系抗生物質であるスタウロスポリンの生合成経路については、既に報告がある（非特許文献３）。スタウロスポリン生産株を始めとするインドロカルバゾール系抗生物質生産株は、インドロカルバゾール生合成遺伝子クラスターを有し、このクラスター内には、トリプトファン縮合酵素遺伝子、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子などが含まれている。さらに非特許文献３には、レベッカマイシン生産株のトリプトファン縮合酵素とビオラセイン生産株のトリプトファン縮合酵素とは、およそ３７％のアミノ酸相同性があることが記載され、保存領域と考えられる領域の配列が特定されている。そこで、このトリプトファン縮合酵素の保存領域配列の一部をプローブとして用いてストレプトバーティシリウム・エスピーＢＡ１３７９３株の水酸化酵素の遺伝子を取得する場合を例に挙げて、水酸化酵素の遺伝子の取得方法を説明する。

まず、水酸化酵素の遺伝子の検索に際して、トリプトファンの芳香族環の水酸化に関与する水酸化酵素遺伝子が、インドロカルバゾール生合成遺伝子クラスター内あるいはその近傍に存在すると仮定した。検索方法は以下のとおりである。

ストレプトバーティシリウム・エスピーＢＡ１３７９３株から染色体ＤＮＡを取り出し、適切な制限酵素（例えば、Ｓａｕ３ＡＩ）で部分加水分解し、適切な長さのＤＮＡ断片（例えば、２０ｋｂ以上のＤＮＡ断片）を得る。このＤＮＡ断片を、適切なベクター、例えば、ｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓ（非特許文献４）、コスミドｐＷＥ−１５（Stratagene社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（東洋紡社製）などに組込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの適切な宿主において、染色体ＤＮＡライブラリーを調製する。

他方、レベッカマイシンの生合成に関与するトリプトファン縮合酵素遺伝子（ｒｅｂＤ）の保存領域の部分配列に基づいて、１対のプライマー：ｒｅｂＢＮ１（配列番号３）およびｒｅｂＢＣ１（配列番号４）を設計する。次いで、このプライマー対を用い、ストレプトバーティシリウム・エスピーＢＡ１３７９３株から得られた染色体ＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを行い、トリプトファン縮合酵素遺伝子の部分配列（配列番号５）を取得する。具体的には、ｒｅｂＢＮ１（配列番号３）およびｒｅｂＢＣ１（配列番号４）は、それぞれ、ＥｃｏＲＩ切断配列およびＨｉｎｄＩＩＩ切断配列を含んでいる。ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩにより完全分解し、これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（東洋紡製）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入し、大腸菌に形質転換してアンピシリン耐性のコロニーを選択することにより、トリプトファン縮合酵素遺伝子の部分配列（配列番号５）が回収される。

次いで、得られた部分配列（配列番号５）をプローブとして、上記調製した染色体ＤＮＡライブラリーを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、このプローブとハイブリダイズするクローンを選択する。選択されたクローンの配列を決定し、挿入されたＤＮＡの両端にインドロカルバゾール生合成遺伝子クラスターの配列の一部を有するクローンを除外する。これは、両端にインドロカルバゾール生合成遺伝子クラスターの配列の一部があれば、インドロカルバゾール生合成遺伝子クラスターの一部しか得られなかったこととなり、インドロカルバゾール生合成遺伝子クラスターの全部あるいはその近傍部分が取得されていない可能性があるからである。したがって、両端にインドロカルバゾール生合成遺伝子クラスターの配列の一部を有しないクローンを選択し、このクローンを必要に応じて断片化し、配列を同定して、既知のインドロカルバゾール生合成遺伝子クラスターと照合することによって、未知の遺伝子を取得する。この未知の遺伝子を上記のようにストレプトマイセス・リビダンスｐＴＹＭＣｓｔａ７株に導入し、化合物（Ｉ）の水酸化物（例えば、上記化合物（ＩＩ））が得られることを確認することによって、水酸化酵素をコードする遺伝子が取得される。あるいは、両端にインドロカルバゾール生合成遺伝子クラスターの配列の一部を有しないクローンを選択し、このクローンから回収した遺伝子をストレプトマイセス・リビダンスｐＴＹＭＣｓｔａ７株に導入する。次いで、水酸化酵素が含まれることを確認した後、このクローンを必要に応じて断片化し、配列を同定することにより、水酸化酵素をコードする遺伝子が取得される。

上記の微生物が入手できないときは、本明細書に開示した配列番号２のアミノ酸配列または配列番号１の塩基配列に基づいて、水酸化酵素遺伝子を合成することもできる。また、配列番号１の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、または配列番号１の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＯＮ１（配列番号６）およびＴＯＣ１（配列番号７））をプライマー対とするＰＣＲを行うことによって、放線菌染色体ＤＮＡライブラリーから単離することもできる。この場合、ＴＯＮ１（配列番号６）およびＴＯＣ１（配列番号７）の各プライマーは、それぞれ、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの切断配列を有しているので、ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、所望のＤＮＡを容易に回収できる。

本発明の水酸化酵素遺伝子は、もう１つの実施態様において、配列番号１の１位から１５６３位までの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡとして取得され得る。ここで、ストリンジェントな条件とは、配列番号１の１位から１５６３位までの塩基配列と、ＢＬＡＳＴ法により算出した相同性が８０％以上、あるいは９０％以上であるＤＮＡとが特異的にハイブリダイズする条件である。ストリンジェントな条件として、より具体的には、４２℃において、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ溶液中でハイブリダイゼーションを行い、次いで、４２℃において、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄を行う条件が挙げられる。

上記のように、本発明の水酸化酵素をコードするＤＮＡはまた、配列番号２の１位から５２１位までのアミノ酸配列をコードするＤＮＡのみならず、このアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有し、かつ水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも含む。アミノ酸残基の付加、欠失または置換には、アミノ酸の挿入、逆位なども含む。アミノ酸配列の付加、欠失または置換は、当業者が通常用いる手段、例えば、部位特異的突然変異；ＵＶ照射；ＮＴＧなどの突然変異誘発剤による処理などを用いて行われ得る。変異処理後のＤＮＡによってコードされるポリペプチドの活性は、このＤＮＡを導入した微生物の水酸化活性を測定することによって、確認される。例えば、対応する遺伝子を欠損するかまたは対応する酵素活性が低い微生物に、変異処理を行った水酸化酵素遺伝子を導入した場合に、活性が回復すること；変異処理を行ったＤＮＡを上記ストレプトマイセス・リビダンスｐＴＹＭＣｓｔａ７株に導入し、化合物（Ｉ）の水酸化物（例えば、上記化合物（ＩＩ））が得られること；あるいは、水酸化反応（例えば、トリス緩衝液中に、ＦＡＤ、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ、ＤＴＴなどを加え、そこに水酸化させるべき基質を添加して行われる反応）に伴って消費されるＮＡＤ(Ｐ)Ｈの吸光度変化が生じること；によって確認することができる。

（３）水酸化酵素の遺伝子を有する組換えベクター
本発明の水酸化酵素の遺伝子は、当業者に周知の手法を用いて適切な発現ベクターに組込まれて、組換えベクターとして調製される。遺伝子は、通常、発現ベクターのプロモーターの下流に導入される。使用する発現ベクターは、所望の宿主微生物内で複製増殖あるいは染色体への組込みが可能であれば、特に制限されない。さらに、エンハンサーなどの、転写活性を高める配列を有するように構成してもよい。また、微生物の体外に分泌されるように、分泌シグナルを水酸化酵素遺伝子のＮ末端側に付けてもよい。

発現ベクターは、用いる宿主、例えば、細菌、放線菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などに応じて、当業者が適宜選択することができる。あるいは既知の発現ベクターを当業者が通常行う改変を加えて調製し、使用し得る。

発現ベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＴＷＶ２２８、あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＰＬ−ラムダインデューシブルエクスプレッションベクター（いずれも、ファルマシア社製）、ｐＥＴ（ノバジェン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（東洋紡製）、ｐＷＨ１５２０（モビテック社製）、ｐＩＪ７０２（ストレプトマイセス・リビダンス３１３１株（ＡＴＣＣ３５２８７株）に由来する）などが挙げられる。

枯草菌のベクターとしては、例えば、ｐＵＢ１１０、大腸菌−放線菌型細菌のシャトルベクターとしては、例えば、ｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓ、ｐＴＹＭ１８、ｐＴＹＭ１９（非特許文献４）など、あるいはこれらの誘導体などが挙げられる。

また、ファージベクターとしてはλＦｉｘＩＩベクター（Stratagene社製）などが挙げられる。

本発明の水酸化酵素の発現に用いられるプロモーターは、宿主微生物に由来するか、宿主微生物で作動するものであれば、特に制限はなく、当業者が通常使用するプロモーターが使用される。

（４）形質転換体
上記調製された組換えベクターを適切な宿主微生物に導入することにより形質転換体が得られる。この形質転換体で水酸化酵素が発現する。

宿主微生物としては、特に限定されるものではなく、細菌、放線菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。

上記宿主微生物への遺伝子の導入法としては、通常、当業者が用いる方法が適用される。例えば、コンピテントセル法（J. Molecular Biology, 53, p159 (1970)）、パルス波通電法（J. Indust. Microbiol., 5, p159 (1990)）、ファージを用いた形質導入法（Genetics, 64, p189 (1970)）、接合伝達法（Ann. Rev. Microbiol., 29, p80 (1975)）、細胞融合法（J. Bacteriol., 137, p1346 (1979)）、プロトプラスト形質導入法（Practical Streptomyces Genetics, p156, 2004年, D.A. Hopwood編者, The John Innes Foundation）などが挙げられる。

さらに、プロモーターに連結した水酸化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主微生物の染色体中に直接導入する相同組換え技術（Biosci. Biotechnol. Biochem., 57, p2036 (1993)）、あるいはトランスポゾンや挿入配列などを用いて導入する技術（Molecular Microbiol., 11, p739 (1994)）によって、遺伝子を導入することができる。

このように、本発明の水酸化酵素を有する形質転換体は、上記方法から、宿主微生物に適した方法を適宜選択し、水酸化酵素を発現可能に導入することによって得られ得る。

（５）水酸化酵素の調製
本発明の水酸化酵素は、上記のようにして得られる形質転換体を用いて、当業者が通常行う方法で調整される。形質転換体が水酸化酵素を分泌する場合、宿主微生物に適した培地を用いて培養し、培養液を集める。形質転換体が菌体内に水酸化酵素を蓄積する場合、培養菌体を集めて、機械的な摩砕、超音波処理、圧搾などの手段で破砕し、水酸化酵素を含有する破砕液を得る。この培養液あるいは破砕液に対して、例えば、濾過、硫安塩析、カラムクロマトグラフィーなどの処理を行って、粗精製または精製して、単離された水酸化酵素を製造することができる。

粗精製または精製された（単離された）水酸化酵素は、適切な担体に固定化することができる。したがって、本発明の水酸化酵素には固定化酵素も含まれる。固定化の方法に特に制限はなく、当業者が通常用いる方法が用いられる。さらに、水酸化酵素には、固定化された形質転換体が水酸化酵素活性を発揮する限り、固定化形質転換体も含まれる。固定化形質転換体は、例えば、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、またはカラギーナンなどの適当な担体に形質転換体を固定化させることにより得られる。

形質転換体の培養には、通常、宿主微生物に適した培地および培養条件が適用される。培養は、通常、通気撹拌、振とうなどの好気条件下で行う。培養温度は、宿主微生物の生育し得る温度であれば特に制限はない。培地のｐＨも、宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。

（６）水酸化された化合物の製造方法
水酸化された化合物の製造方法には、水酸化すべき化合物（前駆体）を生産する能力を有する微生物に水酸化酵素を導入した形質転換体を用いる。例えば、ストレプトマイセス・リビダンスｐＴＹＭＣｓｔａ７株にクローニングされているスタウロスポリン生合成遺伝子クラスターの一部の遺伝子と、本発明の水酸化酵素の遺伝子とを同時に宿主微生物にクローニングする。この２つの遺伝子をクローニングされた微生物は、スタウロスポリンのアグリコンである以下の式：

で表される化合物（Ｉ）を生産し、さらにこの化合物（Ｉ）が水酸化された、以下の式：

で表される化合物（ＩＩ）を生産する。得られた化合物（ＩＩ）は、適切な溶媒を用いて、当業者が通常使用する抽出方法（溶媒抽出など）、精製方法（ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィーなど）から適切に選択された方法によって精製される。

この方法に用いられる微生物に特に制限はなく、上記と同様に、細菌、放線菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。

このように本発明の水酸化酵素または形質転換体を用いて製造される水酸化された化合物の前駆体である上記の水酸化すべき化合物は、どのような化合物であってもよい。例えば、トリプトファンを骨格として有する化合物、あるいはトリプトファンの縮合体を骨格として有する化合物（例えば、スタウロスポリンのアグリコン部分）が挙げられる。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されないことはいうまでもない。

（実施例１）水酸化酵素遺伝子の取得
（１−１）ストレプトバーティシリウム・エスピー（Streptoverticillium sp.）ＢＡ１３７９３株の染色体ＤＮＡの調製
ストレプトバーティシリウム・エスピーＢＡ１３７９３株を、０．５％のグリシンを加えたトリプティック・ソイ・ブロス培地（ベクトン・ディッキンソン社製）５０ｍＬ中で３０℃にて１６０ｒｐｍで２日間培養した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により菌体を回収した。ＴＳ緩衝液（１０．３％スクロース、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、および２５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）３０ｍＬで菌体を洗浄し、再び遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分、４℃）を行って菌体を回収した。次いで、０．５％のリゾチームと０．００２％のＮ−アセチルムラミダーゼとを含有するＴＳ緩衝液１０ｍＬを菌体に加え、３７℃で６０分間静置した。プロトプラスト状になった菌体溶液に、１０％ＳＤＳ水溶液２．４ｍＬおよび２ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含有するＴＳ緩衝液０．４ｍＬを加え、ゆっくり撹拌した後、３７℃で６０分間静置して、さらに５０℃、３０分間静置した。次いで、５Ｍ塩化ナトリウム水溶液２ｍＬと６５℃に加温した１０％セチルトリメチルアンモニウムブロマイドの０．７Ｍ塩化ナトリウム水溶液１．６ｍＬとを加え、ゆっくり撹拌した後、６５℃で２０分間静置した。次いで、クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（２４／１(v/v)）２０ｍＬを加え、ピペットで撹拌した。遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃）した後、上層を回収し、上層の０．６倍容量のイソプロピルアルコールを加え、生じた沈殿を回収した。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥した。真空乾燥後、沈殿を、ＲＮａｓｅ（０．５ｍｇ）を加えたＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）（１０ｍＬ）に溶解し、ＢＡ１３７９３株の染色体ＤＮＡ溶液を調製し、４℃で保存した。

（１−２）染色体ＤＮＡの部分分解
上記（１−１）で得られた染色体ＤＮＡ溶液４０．４μＬに、１０×Ｈ緩衝液（タカラバイオ社製）４．６μＬと０．２５ユニットの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩとを加え、３７℃で４０分間静置した。０．５Ｍ ＥＤＴＡ水溶液５０μＬを加え、０．５％低融点アガロースゲルで電気泳動して、２３ｋｂ以上の大きさのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル画分を切り出した。切り出したゲルブロックを蒸留水５０ｍＬに入れ、ゆっくりと１５分間振とうし、再度同じ操作を繰り返した。ゲルブロックの重量に対し、最終濃度が１×となるように１０×β−アガラーゼの緩衝液を加え、融解するまで６８℃で静置した。ゲルが融解した後、４０℃で１０分間静置して、β−アガラーゼをゲル０．５ｇあたり３ユニット加え、４０℃で６０分間静置した。次いで、５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を終濃度０．５Ｍとなるように加え、氷上で１５分間静置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した。得られた上清に、上清の３倍容量のエタノールを加えた。−８０℃で１０分間静置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、生じた沈殿に７０％エタノールを加え、再度遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した。沈殿を真空乾燥した後、蒸留水８μＬに溶解した。このＤＮＡ溶液に１０×アルカリフォスファターゼ緩衝液１μＬとアルカリフォスファターゼ１μＬとを加え、３７℃で６０分間静置した。次いで、蒸留水９０μＬおよびフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（２５／２４／１(v/v/v)）１００μＬを加え、撹拌した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分、２５℃）した。上層を回収し、上層の３倍容量のエタノールを加えた。−８０℃で１０分間静置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、生じた沈殿に７０％エタノールを加え、再度遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した。沈殿を真空乾燥した後、蒸留水５μＬに溶解し、染色体ＤＮＡの部分分解断片を含む水溶液を得た。

（１−３）ＢＡ１３７９３株染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーの作製
放線菌−大腸菌シャトルコスミドベクターｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓ（富山県立大学工学部より供与された）１０μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲルで電気泳動し、８．３ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル画分を切り出した。切り出したゲルブロックから、ジンクリーンキット（Ｑバイオジーン社製）を用いてＤＮＡ断片を精製し、蒸留水２．５μＬに溶解した。このＤＮＡ断片含有溶液に、上記（１−２）で調製したＢＡ１３７９３株の染色体ＤＮＡの部分分解断片水溶液５μＬを加え、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）７．５μＬを加え、１６℃で１７時間静置した。次いで、このライゲーション溶液中のプラスミドを、ギガパックＩＩＩパッケージングエクストラクトキット（Stratagene社製）を用いて、大腸菌に導入した。カルベニシリン（５０μｇ／Ｌ）含有ＬＢ寒天培地で、３０℃で２日間、プラスミドを導入した大腸菌を培養し、生育した形質転換体（大腸菌）から１９２０コロニーを釣菌して別のカルベニシリン（５０μｇ／Ｌ）含有ＬＢ寒天培地で３０℃にて１日間培養した。

（１−４）プローブの作製
オリゴＤＮＡプライマーｒｅｂＢＮ１（配列番号３）およびｒｅｂＢＣ１（配列番号４）を化学合成した。ｒｅｂＢＮ１（配列番号３）は、レベッカマイシンの生合成に関与するトリプトファン縮合酵素遺伝子（ｒｅｂＤ）のＮ末端近傍の配列の一部に基づき、ｒｅｂＢＣ１（配列番号４）は、Ｃ末端近傍の配列の一部に基づいて合成した。この２つの配列をプライマーとして、上記（１−１）で調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９８℃で２０秒、６０℃で３０秒、次いで７２℃で１分の処理を１サイクルとし、合計３０サイクル行った。ＰＣＲ溶液をアガロースゲルで電気泳動して、増幅した４２０ｂｐのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル画分を切り出した。切り出したゲルブロックから、ジンクリーンキットでＤＮＡ断片を精製した。この精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。切断したＤＮＡ断片溶液に蒸留水を加えて１００μＬとし、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（２５／２４／１(v/v/v) ）１００μＬを加えて撹拌した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分、２５℃）した。上層を回収し、上層の３倍容量のエタノールを加えた。−８０℃で１０分間静置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分、４℃）し、生じた沈殿に７０％エタノールを加えて、再度遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分、４℃）した。得られた沈殿を真空乾燥し、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を得た。

一方、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）３μｇも制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。切断したＤＮＡ断片を含む溶液に蒸留水を加えて１００μＬとし、上記と同様に処理して真空乾燥し、切断したプラスミドを得た。

上記真空乾燥したＰＣＲ産物および切断したプラスミドを、それぞれ蒸留水３．５μＬに溶解した。この２つの溶液を混合し、さらにライゲーションキット７μＬを加え、１６℃で１７時間静置した。ＤＮＡを回収し、ヒートショック法で大腸菌に導入し、アンピシリンを５０μｇ／Ｌ含有するＬＢ寒天培地中で３０℃にて２日間培養した。生育した形質転換体（大腸菌）を、アンピシリンを５０μｇ／Ｌ含有するＬＢ培地５ｍＬ中で３０℃にて２４時間培養し、菌体を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１分、２５℃）により回収した。回収した菌体からＱＩＡｐｒｅｐＭｉｎｉキット（キアゲン社製）を用いて、プラスミドを精製した。このプラスミドを、制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩにより完全分解して、ＰＣＲ産物を回収した。このＰＣＲ産物の遺伝子配列を決定したところ、配列番号５に示す配列を有していた。この配列を水酸化酵素スクリーニングのためのプローブとして用いた。

（１−５）コロニーハイブリダイゼーションによるターゲットクローンの特定
上記（１−３）で得た１９２０コロニーをニトロセルロースメンブレン（アドバンテック社製）上に移し、アンピシリンを５０μｇ／Ｌ含有するＬＢ培地５ｍＬ中で３０℃にて２４時間培養した。メンブレン上で生育した形質転換体（大腸菌）を、上記（１−４）で作製したプローブを用いるコロニーハイブリダイゼーションに供した。コロニーハイブリダイゼーションは、ＤＮＡランダム標識・検出キット（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ化学発光）（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いた。オートラジオグラフィーは、ハイパーフィルムＴＭ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて行い、現像して目視で確認した。その結果、３株についてハイブリダイズしたことが確認され、それぞれ１−２−１株、１−３−２６株、および１−４−８８株と命名した。そこで、この３株からそれぞれプラスミドを抽出し、それらを鋳型として、オリゴＤＮＡプライマーｒｅｂＢＮ１（配列番号３）およびｒｅｂＢＣ１（配列番号４）を用いて、上記（１−４）と同じ条件でＰＣＲを行った。その結果、上記（１−４）と同様に、４２０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅したことを確認した。

（１−６）水酸化酵素遺伝子の取得
１−２−１株、１−３−２６株、および１−４−８８株を、それぞれアンピシリンを５０μｇ／Ｌ含有するＬＢ培地１００ｍＬ中で３０℃にて２４時間培養し、菌体を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分、４℃）して回収した。回収した菌体からＨｉＳｐｅｅｄ ＰｌａｓｍｉｄＭｉｄｉキット（キアゲン社製）を用いて、プラスミドを精製し、クローニングされたＤＮＡ断片の両端の配列を確認した。その結果、１−２−１株および１−３−２６株由来のプラスミドから得られたＤＮＡ断片の両端には、それぞれ既知のインドロカルバゾール系化合物の生合成遺伝子クラスターに含まれる、Ｌ−アミノ酸オキダーゼ遺伝子およびトリプトファンの縮合酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡ配列が確認された。これらは、それぞれＢＡ１３７９３株のインドロカルバゾール系抗生物質の生合成遺伝子クラスターの一部と考えられた。したがって、これらのプラスミドについては、水酸化酵素をコードする遺伝子を含む可能性が低いと判断した。

他方、１−４−８８株由来のプラスミドにクローニングされたＤＮＡ断片の両端には、Ｌ−アミノ酸オキダーゼ遺伝子およびトリプトファンの縮合酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡ配列は確認されなかった。このＤＮＡ断片の内部にはトリプトファンの縮合酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡ配列があることがハイブリダイゼーションで確認されているので、１−４−８８株に由来するＤＮＡ断片には、大きなインドロカルバゾール系抗生物質の生合成遺伝子クラスターが含まれていると考えられた。ターゲットとなる水酸化酵素遺伝子は、このクラスター内に含まれている可能性が高いため、この１−４−８８株由来のＤＮＡ断片のサブクローニングを行い、ＤＮＡ配列を解析した。

まず、１−４−８８株由来のプラスミド５μｇをＢａｍＨＩで切断してアガロースゲル電気泳動にかけたところ、図１に示すようないくつかの断片が検出された。各ＢａｍＨＩ切断断片を含むアガロースゲル画分を切り出し、各ゲルブロックから、ジンクリーンキットで各ＤＮＡ断片を精製した。一方、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）３μｇも制限酵素ＢａｍＨＩで分解した。１−４−８８株由来のプラスミドからの各ＢａｍＨＩ切断断片とＢａｍＨＩで分解したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）断片とをライゲーションキットによってライゲーションし、ヒートショック法で大腸菌に導入した。アンピシリンを５０μｇ／Ｌ含むＬＢ寒天培地で３０℃にて２日間培養し、生育した形質転換体（大腸菌）を、さらにアンピシリンを５０μｇ／Ｌ含むＬＢ培地（５ｍＬ）で３０℃にて２４時間培養した。菌体を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１分、２５℃）で回収し、ＱＩＡｐｒｅｐＭｉｎｉキットを用いて、プラスミドを精製し、配列を確認した。その結果、図１に示すアガロースゲル電気泳動写真でＢ断片として示されるＤＮＡ断片中に、インドロカルバゾール系抗生物質の生合成遺伝子クラスターを構成するシトクロムＰ４５０遺伝子と相同性の高い配列があること、およびその下流に配列番号１に示す構造遺伝子配列があることを確認した。

（実施例２）水酸化酵素の水酸化活性の確認
上記実施例１で得られた配列番号１のＤＮＡが水酸化酵素をコードすることを確認する実験を行った。まず、この遺伝子配列をＰＣＲで増幅した。配列番号１の５’末端のプライマーとしてのＴＯＮ１（配列番号６）、および３’末端のプライマーとしてＴＯＣ１（配列番号７）を化学合成した。ＰＣＲは、９８℃で２０秒、６０℃で３０秒、ついで７２℃で１分の処理を１サイクルとし、合計３０サイクル行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約１６００ｂｐのＤＮＡ断片を含むアガロースゲル画分を切り出した。切り出したゲルブロックから、ＤＮＡ断片をジンクリーンキットで精製し、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで分解した。分解したＤＮＡ断片溶液に蒸留水を加えて１００μＬとし、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（２５／２４／１(v/v/v)）１００μＬを加え、撹拌した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分、２５℃）した。上層を回収し、上層の３倍容量のエタノールを加えた。−８０℃で１０分間静置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分、４℃）し、生じた沈殿に７０％エタノールを加え、再度遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、得られた沈殿を真空乾燥して、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を得た。

一方、ベクターとして、図２に示すｐＴＹＭ１ｅｐベクター（富山県立大学工学部より供与された）を用いた。このベクターは、大腸菌プラスミドベクターｐＫ１８ｍｏｂ（非特許文献４）をベースに放線菌ファージＴＧ１由来integration遺伝子およびエリスロマイシン耐性遺伝子のプロモーター（アームＥプロモーター）を組み込んだものである。このｐＴＹＭ１ｅｐベクター３μｇを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、切断したＤＮＡ断片溶液に蒸留水を加えて１００μＬとし、上記と同様に処理して真空乾燥し、切断したベクターを得た。

真空乾燥したＰＣＲ産物のＤＮＡ断片および切断したベクターを、それぞれ蒸留水３．５μＬに溶解した後、混合した。この混合液に、さらにライゲーションキット７μＬを加え、１６℃で１７時間静置した。ＤＮＡを回収し、ヒートショック法で接合性大腸菌Ｓ１７−１株に挿入し、カナマイシンを５０μｇ／Ｌ含有するＬＢ寒天培地で３０℃にて２日間培養し、形質転換株（接合性大腸菌）を得た。

次に、この形質転換された接合性大腸菌を用いる接合法により、形質転換体中のプラスミドを、ストレプトマイセス・リビダンスｐＴＹＭＣｓｔａ７株（非特許文献３）に導入した。このｐＴＹＭＣｓｔａ７株は、スタウロスポリン生合成遺伝子の一部が組み込まれており、スタウロスポリンのアグリコン（上記化合物（Ｉ））を生産し得る。まず、形質転換された接合性大腸菌を、カナマイシンを５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ培地５ｍＬ中で、吸光度６６０ｎｍが０．６になるまで３０℃にて培養した。この培養液２ｍＬを、滅菌済みのエッペンドルフチューブに移し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分、４℃）した。上清をデカンテーションした後、ＬＢ培地１ｍＬを加えて激しく撹拌し、菌体を洗浄した。この操作を３回繰り返し、最後にＬＢ培地０．５ｍＬを加えて菌体を懸濁した。別に用意した滅菌済みのエッペンドルフチューブにｐＴＹＭＣｓｔａ７株の胞子懸濁液１μＬと形質転換された接合性大腸菌の懸濁液０．１ｍＬとを入れ、よく混合し、放線菌培地「ダイゴ」Ｎｏ．４（日本製薬社製）で培養した。３０℃で１８時間培養した後、チオストレプトン（１６７μｇ／ｍＬ）およびナリジキシン酸Ｎａ（６７μｇ／ｍＬ）を含有するニュートリエント・ブロス（ベクトン・ディッキンソン社製）寒天培地（寒天０．５％）３ｍＬを重層し、さらに３日間培養を継続した。生育したコロニーをStreptomyces lividans ｐＴＹＭＣｓｔａ７＋ＴＯ株と命名した。

得られたｐＴＹＭＣｓｔａ７＋ＴＯ株を、魚粉培地（グルコース０．１％、デキストリン２．０％、大豆ポリペプトン１．０％、カツオ肉エキス０．５％、酵母エキス０．１％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カルシウム０．０５％、硫酸第一鉄0.0002％、塩化第二銅0.00004％、塩化マンガン0.00004％、塩化コバルト0.00004％、塩化亜鉛0.00008％、ホウ酸ナトリウム0.00008％、モリブデン酸アンモニウム0.00024％、および３−(Ｎ−モルホリノ)プロパンスルホン酸０．５％）１．４Ｌに植菌し、３０℃で７日間、１６０ｒｐｍで振とう培養した。遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０分、４℃）を行って菌体を回収した。蒸留水で菌体を洗浄し、再び遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０分、４℃）で菌体を回収した後、メタノール２００ｍＬで２日間抽出した。このメタノール溶液を、エバポレーターで減圧濃縮後、酢酸エチルに分配し、上層を分取した。上層を乾燥し、エバポレーターで減圧濃縮し、シリカゲル６０（ナカライテスク社製）のカラムに供した。溶出液は、ヘキサン１００％から開始し、酢酸エチル濃度を１０％ずつ上昇させながら、最終的には酢酸エチルが１００％となるように段階的にグラジエントをかけた。１００％酢酸エチル溶出画分を減圧濃縮し、水酸化された化合物２ｍｇを得た。このようにして精製された化合物の分子量をマススペクトル法により測定し、分子量が３２６であり、化合物（ＩＩ）と同じであることを確認した（図３）。さらに^１Ｈ−および^１３Ｃ−ＮＭＲ（いずれもＤＭＳＯ−ｄ_６中）によりその構造を決定した。図４は、化合物（ＩＩ）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ）を示し、そして図５は、化合物（ＩＩ）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ）を示す。その結果、以下の構造：

を有する化合物（ＩＩ）であることを確認した。なお、比較として、形質転換していないｐＴＹＭＣｓｔａ７株を同様に培養したところ、水酸基が導入されていない化合物（Ｉ）が得られた（化合物（Ｉ）の同定データは示さず）。以上のことから、配列番号１の遺伝子が、水酸化酵素をコードしていることが明らかとなった。さらに、この水酸化酵素をコードする遺伝子を導入することにより、新規な水酸化された化合物が生産され得ることが明らかとなった。

本発明の水酸化酵素は、インドロカルバゾール系抗生物質のインドール環の、従来水酸基が導入されたことがない部位に水酸基を導入できる。したがって、種々の新規なインドロカルバゾール系抗生物質の製造に有用である。また、インドール環を有する種々の化合物の、従来水酸基が導入されにくかった部位に水酸基を導入し得る可能性が高い。そのため、種々の新規な化合物、特に医薬品などの製造に利用され得る。

１−４−８８株由来のプラスミドのＢａｍＨＩ切断物のアガロースゲル電気泳動の写真である。 放線菌の形質転換に用いたプラスミドｐＴＹＭ１ｅｐの構造を示す模式図である。 本発明の方法により製造された化合物（ＩＩ）のマススペクトル図である。 本発明の方法により製造された化合物（ＩＩ）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。 本発明の方法により製造された化合物（ＩＩ）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル図である。

Claims (10)

1. 配列表の配列番号２の１位から５２１位までのアミノ酸配列あるいは該アミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む、水酸化酵素。
2. 配列表の配列番号２の１位から５２１位までのアミノ酸配列あるいは該アミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む水酸化酵素をコードする、ＤＮＡ。
3. 配列表の配列番号１の１位から１５６３位までの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、該ＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドが、水酸化反応を触媒する活性を有する、ＤＮＡ。
4. 請求項２または３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
5. 請求項４に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
6. 前記形質転換体が、以下の式：
   

   

   で表される化合物（Ｉ）の生産能を有する微生物である、請求項５に記載の形質転換体。
7. 請求項５または６に記載の形質転換体を培養する工程、および得られた培養物から水酸化酵素を採取する工程を含む、水酸化酵素の製造方法。
8. 以下の式：
   

   

   で表される化合物（ＩＩ）。
9. 請求項６に記載の形質転換体を培養する工程、および得られた培養物から以下の式：
   

   

   で表される化合物（ＩＩ）を回収する工程を含む、化合物（ＩＩ）の製造方法。
10. 前記形質転換体が放線菌に属する微生物である、請求項９に記載の方法。

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