JP2008029325A - 3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造に用いられる新規微生物、該微生物を用いて3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドを製造する方法および該3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドにより得られたポリマー - Google Patents
3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造に用いられる新規微生物、該微生物を用いて3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドを製造する方法および該3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドにより得られたポリマー Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】放線菌のグリキサゾン生合成遺伝子クラスターに存在する遺伝子griC、griD、およびgriGが導入されており、さらに宿主ゲノム中のアリルアミンN−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されている微生物を作製する。該微生物を培養することにより、培地中に3,4−AHBALを生産することができる。
【選択図】なし
Description
まず、本発明を完成させるに至るまでの背景について説明する。
本発明に係る微生物は、3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造に用いられる微生物であって、アロマティックカルボキシレートリダクターゼ(aromatic carboxylate reductase)をコードする遺伝子が導入されているものであればよい。アロマティックカルボキシレートリダクターゼをコードする遺伝子が導入され、発現することにより3,4-AHBAから3,4-AHBALへの還元反応が促進され、効率よく3,4-AHBALを製造することが可能となる。
本発明に係る3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造方法は、上述の本発明に係る微生物を培養する工程;および培養液から3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドを回収・精製する工程を包含するものであればよい。
精製された3,4-AHBALを有機溶剤中で反応させることにより、ポリアゾメチンを合成することができる。有機溶剤としては、N−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトン、メタノール、エタノール、アニソール等を用いることができる。また、これらの溶媒にトルエン、ベンゼンを加えて反応させても良い。また、これらの溶媒にモレキュラーシーブのような脱水材を加えても良い。反応温度は、室温〜150℃の範囲であることが好ましく、反応温度の最高温度は、溶媒の沸点によって制限される。反応終了時のポリマー濃度が1〜70wt%になるように、溶媒に対する溶解度を考慮して、有機溶剤中の3,4-AHBALの濃度が調整される。ポリアゾメチン重合反応溶液を基板上にキャストした後、高温または真空下で溶媒を除去する。これを200〜400℃で加熱することにより目的のPBOが得られる。反応式を、以下に示す。但し、nは10以上の整数である。
(1)グリキサゾン非生産のUV変異株の取得
約3×106個のストレプトマイセス・グリセウスの胞子を10mlの10%グリセロールに懸濁し、直径9cmの滅菌したガラスシャーレに入れた。長さ5cmの細い鉄線をスターラーバーとし、マグネチックスターラーにより撹拌しつつ30cm上空よりUVランプを50秒照射し、生存率0.5%で変異処理を行った。変異処理した胞子をYMPD寒天培地(酵母エキス0.2%、肉エキス0.2%、ペプトン0.4%、食塩0.5%、MgSO4・7H2O 0.2%、ブドウ糖1%、寒天2% pH7.2)にプレーティングし、28℃で5〜7日培養した。
ストレプトマイセス・グリセウス野生株(NBRC13350株)の染色体DNAを制限酵素Sau3AIで部分消化し、6-10Kbの断片をアガロースゲル電気泳動により回収した。このDNA断片群と、制限酵素BglIIで消化後アルカリフォスファターゼ処理により5'末端の脱リン酸を行った放線菌ベクターpIJ702とをライゲーションした。この染色体DNAライブラリーをM31株に導入して約6000個の形質転換株を得た。
取得したグリキサゾン生合成遺伝子群を含むDNA断片の塩基配列をダイデオキシ法(Messing, Methods in Enzymol., 101, 20-78, (1983))により決定した。配列解析および転写解析等によって、グリキサゾン生合成に関与すると推定される13種の遺伝子が同定された。そのうちの3つの遺伝子をgriC、griDおよびgriGと命名した。griCの塩基配列およびgriC産物(GriC)の推定アミノ酸配列を配列番号1および2に示した。同様にgriDの塩基配列およびgriD産物(GriD)の推定アミノ酸配列を配列番号3および4に、griGの塩基配列およびgriG産物(GriG)の推定アミノ酸配列を配列番号5および6に、それぞれ示した。
上記GriCの推定アミノ酸配列を解析したところ、図2に示したように他のAMP結合性のタンパク質と同様にAMP結合モチーフを有していることが確認された。また、上記GriDの推定アミノ酸配列を解析したところ、図3に示したように他の微生物由来アルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と高い相同性を有していることが明らかとなった。
さらにgriC遺伝子およびgriD遺伝子の機能を探るため、放線菌での該遺伝子の発現を検討した。即ち、griC遺伝子およびgriD遺伝子を発現させた組換えストレプトマイセス・グリセウス株(griC、griD遺伝子のセルフクローニング株)を作製した。本組換え株は、組換えプラスミドpIJ702-griCDを野生株であるストレプトマイセス・グリセウスNBRC13350
にプロトプラスト法により導入したものである。なお、組換えプラスミドpIJ702-griCDの構築については後述する。
上記griG産物の推定アミノ酸配列が、図4に示したように他の安息香酸トランスポーターのアミノ酸配列と相同性を有することが確認された。そこで、上記3-1に記載したgriC、griD遺伝子破壊株の作製と同様の操作により、griG遺伝子を破壊したストレプトマイセス・グリセウスΔgriG株を作製した。即ち、グリキサゾン生合成遺伝子群のgriG上流の遺伝子からgriGの一部まで含む断片とgriGの途中から下流までの遺伝子を含む断片とをそれぞれサブクローニングした後、マルチクローニングサイトを含んだリンカーを介して連結した。このマルチクローニングリンカー部位に抗生物質耐性遺伝子を組み込んでgriG破壊用プラスミドを作製した。この破壊用プラスミドより一本鎖線状DNAを調製し、野生株であるストレプトマイセス・グリセウスにプロトプラスト法により一本鎖線状DNAを導入した。相同組換えにより染色体上のgriG遺伝子が抗生物質耐性遺伝子を挿入することによって破壊したgriG遺伝子と入れ代わった株を、抗生物質耐性を指標に選抜した。目的の遺伝子破壊が相同組換えにより正しく起こっていることはサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
放線菌により3,4-AHBAおよび3,4-AHBALを培養中に生産する場合、それぞれのアミノ基にアセチル基が結合した修飾体が副生する。このアミノ基を含んだ部分の領域はアリルアミン構造をとっていることから、アミノ基はアリルアミン構造に特異的なアセチルトランスフェラーゼにより修飾されている可能性が予想された。3,4-AHBALの製造において培養液中の副生物量が少ない方が工程の簡略化が期待できるため、副生物の少ない宿主の造成を検討した。
ストレプトマイセス・グリセウスNBRC13350のnat遺伝子のクローニングを行った。ストレプトマイセス・グリセウスNBRC13350をLB培地(100ml仕込/500ml容坂口フラスコ)に植菌し30℃で24時間振とう培養を行った。得られた培養液から遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体から市販のDNA抽出キット(MagExtractor -Genome-;東洋紡製)を用いてgenome DNAを抽出した。本DNAを鋳型とし、配列番号10(5'-GCATATGACTCTCGACCTCGAC-3')および配列番号11(5'-GCTCGAGTCACTCCGGCAGCCGGAC-3')のオリゴDNA(プライマー)と市販のKODプラスDNAポリメラーゼ(東洋紡製)により説明書に添付の方法でPCRを行い、nat遺伝子を増幅した。増幅したDNA断片は、市販のPCR精製キット(MagExtractorR -PCR & Gel Clean up-東洋紡製)で精製後、市販のPCRクローニング用プラスミドベクターpCR4Blunt-TOPO(Invitrogen社製)と連結し、大腸菌JM109のコンピテントセル(東洋紡製)を形質転換した。形質転換体から得られた組換えプラスミドのDNAシークエンスを確認後、制限酵素NdeI(東洋紡製)とXhoI(東洋紡製)で処理し、nat遺伝子を含む断片をアガロースゲル電気泳動により分離・回収した。一方、大腸菌用プラスミドベクターpET-16b(Novagen社製)も同じ制限酵素で処理した後、両者を市販のライゲーションキット(東洋紡製)で連結し、大腸菌BL21(DE3)/pLysSを形質転換し、Natを発現する形質転換体を取得した。なお、この組換えプラスミドはnat遺伝子発現ベクターとしてpET16b-SgNATと命名した。
得られた組換え大腸菌(大腸菌BL21(DE3)/pLysS pET16b-SgNAT)を50μg/mlアンピシリンと34μg/mlクロラムフェニコールを含んだLB培地(1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.4:30ml仕込み/500ml容坂口フラスコ)に植菌し、30℃で一晩振とう培養した。この培養液を50μg/mlアンピシリン、34μg/mlクロラムフェニコールおよび1%のラクトースを含んだLB培地(120ml/2L容坂口フラスコ仕込み)に10%植菌し、26.5℃で24時間振とう培養した後、遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体をNAT抽出緩衝液(20%グリセロール、0.5M NaCl、15mM 2-メルカプトエタノールを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液pH8.0)に懸濁した後、終濃度1mg/mlとなるようリゾチームを加え、超音波処理により菌体を破砕した。この菌体破砕液から遠心分離により不溶性画分を除去した。さらに回収した上清液に終濃度0.1%となるようポリエチレンイミンを添加し、生じた不溶性画分を再び遠心分離により除去して回収した上清液をNat粗酵素液とした。
アリルアミンN−アセチルトランスフェラーゼ活性の測定は以下の方法で行った。即ち、0.1mlの活性測定液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液、2mMアセチル-CoA、1mM3,4-AHBA,pH7.0)に酵素液0.01mlを加え、30℃、20分間反応させた。この反応液をTSKgel-ODSカラム(東ソー社製)を用いたHPLCで分析し、アセチル化された産物を定量して酵素活性を算出した。
(1)nat遺伝子破壊用ベクターの構築
上記実施例2(1)で取得したnat遺伝子、並びにその上流とおよび下流のgenome DNAの塩基配列解析に基づいて、以下の配列番号12〜15のプライマーを合成した。
配列番号12:5'-GCATATGGTTGTTGACGGCGACCAC-3'
配列番号13:5'-GAAGCTTCGGGCGAAGTACGCGTCG-3'
配列番号14:5'-GCATATGCTGCAGAAGCTTCGGCATCCGGCTCCCTG-3'
配列番号15:5'-GCCCAGTTCGTCGGTGAC-3'
実施例2(1)で取得したストレプトマイセス・グリセウスNBRC13350のgenome DNAを鋳型とし、配列番号12と配列番号13とのプライマーの組合せでPCRを行い、nat遺伝子のN末端から上流の一部を含む約2Kbの増幅断片を得た。また同様に配列番号14と配列番号15とのプライマーの組合せでPCRを行いnat遺伝子下流からC末端までの一部を含む約2Kbの増幅断片を得た。それぞれのPCR増幅断片は、PCR精製キット(東洋紡製)で精製後、pCR4Blunt-TOPO(Invitrogen社製)と連結して組換えプラスミドを作成した。このとき得られた組換えプラスミドでnat遺伝子のN末端から上流の一部を含むプラスミドをpΔNAT-up、nat遺伝子の下流の一部からC末端領域を含むプラスミドをpΔNAT-downと命名した。
上記pΔNAT2の溶液に1/10液量の2N NaOH溶液を加え、37℃で5分間放置しDNAをアルカリ変性した。この溶液に5M酢酸アンモニウム溶液、pH4.5を1/10量添加して中和した後、エタノール沈殿により1本鎖に変性したp△NAT2を回収した。
実施例1(3)で得たグリキサゾン代謝遺伝子群の解析結果に基づいて、griC、griDおよびgriG各遺伝子の共発現ベクターを構築した。なお、griC、griDおよびgriGの共発現ベクター構築の概略を図8に示した。
上記実施例2(1)で取得したストレプトマイセス・グリセウスNBRC13350のgenome DNAを鋳型とし、配列番号16(5'-GCATGCTCCTCATCGATGATC-3')と配列番号17(5'-AGATCTTCAGCGCCGGGCCACGAC-3')とのプライマーの組合せでPCRを行い、griCとgriDの両遺伝子全長約2.4Kbの断片を増幅した。増幅したDNA断片は、PCR精製キット(東洋紡製)で精製後、pCR4Blunt-TOPO(Invitrogen社製)に結合し、組換えプラスミドpCR-griCDを得た。得られたpCR-griCDを制限酵素SphI(東洋紡製)とBglII(東洋紡製)で2重切断した後、アガロースゲル電気泳動によりgriC遺伝子およびgriD遺伝子を含んだ約2.4Kbの断片を分離・回収した。なお、griCとgriDの両遺伝子全長の塩基配列を配列番号9に示した。
放線菌用発現ベクターであるプラスミドpIJ702を鋳型とし、配列番号18(5'-CTGCAGAAGCTTGAATTCTGATCACGTCAGTTTTC-3')と配列番号19(5'-AAGCTTCTGCAGTTGTAGATCTCGTCGAAG-3')とのプライマーの組合せでPCRを行い、melCプロモーター領域約0.5Kbを増幅した。この増幅断片を制限酵素HindIIIとPstI(東洋紡製)で2重切断した。一方、同じ制限酵素でプラスミドpUC19を切断後、上記melCプロモータ領域を含むDNA断片とライゲーションキットにより連結し、得られた組換えプラスミドをpUC703と命名した。
上記(2)で得た組換えプラスミドpUC703を制限酵素SphIで消化した後,T4 DNA polymerase(東洋紡製)で平滑末端化し、続いて制限酵素BglIIで切断し、アガロースゲル電気泳動により分離回収して直鎖状のプラスミドを得た。
上記(3)で得たpIJ702-griGを制限酵素NdeIとBglIIで切断した後、griG遺伝子を含む断片をアガロースゲル電気泳動で分離・回収した。また、上記(1)で得たpIJ702-griCDも同様に制限酵素NdeIとBglIIで切断し、griC、griD遺伝子を含むDNA断片をアガロースゲル電気泳動により分離・回収した。この両DNA断片をライゲーションキットにより連結し、griC、griDおよびgriG遺伝子が同時に発現できる組換えプラスミドpIJ702-griCDGを構築した。
(1)3,4-AHBALの生産菌の作製
上記実施例4で構築した組換えプラスミドpIJ702-griCDGで、上記実施例3で得たnat遺伝子欠損株であるストレプトマイセス・グリセウスΔNATを形質転換して3,4-AHBAL生産菌を作製した。なお、ストレプトマイセス・グリセウスΔNATの形質転換は、上記実施例3(2)に記載した方法で実施した。
上記の組換えストレプトマイセス・グリセウスΔNAT株を100mlのSMM培地へ植菌し、26.5℃で24時間振とう培養を行った。その後、終濃度1.53mg/ml(10mM)の3,4-AHBAを添加して2日間振とう培養を継続した。この培養液をTSKgel-ODSカラム(東ソー社製)を用いたHPLCで分析した。その際の分析用の溶媒は水/アセトニトリル/トリフルオロ酢酸の混合溶媒で分離した。その結果、3,4-AHBALおよびそのアセチル誘導体は図9に示したチャートのように分離した。また、図10に示したように、本組換えストレプトマイセス・グリセウスΔNAT株を用いた場合、その培養液あたりに生産された3,4-AHBAL類のうち、3,4-AHBAL含有比率は約85%となり、アセチル修飾体の副生を抑制することで高純度の3,4-AHBALの生産が可能であった。
実施例5で得られた培養液から遠心分離により菌体を除去した後、等量の酢酸エチルを添加し、分液ロート中で十分混合して2層分配した後、有機溶媒層に3,4-AHBALとそのアセチル誘導体を回収した。次いで、回収した酢酸エチルに等量の0.1N HClを添加し十分混合した後、培養液からの抽出と同様にして2層分配し、3,4-AHBALを水層に、アセチルアミノ誘導体を酢酸エチル層に回収した。3,4-AHBAL溶液は1N NaOHで中和した後、再度等量の酢酸エチルを添加混合した後、酢酸エチル層に3,4-AHBALを抽出した。その後減圧乾燥により濃縮した後、分取用のODSカラムクロマトにより精製3,4-AHBAL画分を取得した。最初に分取したアセチルアミノ誘導体はそのまま減圧乾固して回収した。
攪拌器、温度計および冷却管を装備した反応フラスコに実施例6で取得した3,4-AHBALアセチルアミノ誘導体粗精製物の全量と1N HClを3.0ml入れ、98℃加熱還流下、2時間撹拌した。反応終了後、反応処理液は薄い褐色を示していた。反応液を室温まで冷却したのち該反応液に活性炭粉末0.15gを入れた。室温で30分間、活性炭粉末を撹拌した後、該活性炭粉末をフィルター濾過することによって無色の上清を回収した。回収した上清をロータリーエバポレーターによって減圧濃縮して脱アセチル化された精製3,4-AHBAL画分を取得した。
3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒド13.615gおよびモレキュラーシーブス3.250gをN−メチルピロリドン18ml中で、窒素気流下20℃、24時間撹拌した。得られたポリアゾメチンの還元粘度は0.2dl/gであった。
上記実施例で重合したアゾメチン溶液を5ml分取して5cm×5cmのアルミニウムプレート上に流延した。その後、室温にて24時間3mmHg、次いで100℃、200℃にて各1時間3mmHgの環境下で溶媒を留去した。このプレートを空気中で350℃、1時間加熱してポリベンザゾールへの転換を行い、白色の樹脂が得られた。
Claims (26)
- 3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造に用いられる微生物であって、
アロマティックカルボキシレートリダクターゼ(aromatic carboxylate reductase)をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする微生物。 - 上記アロマティックカルボキシレートリダクターゼをコードする遺伝子が、放線菌のグリキサゾン生合成遺伝子クラスターに存在するgriCおよびgriDであることを特徴とする請求項1に記載の微生物。
- 3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸トランスポーター(3-amino-4-hydroxybenzoic acid transporter)をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項1または2に記載の微生物。
- 上記3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸トランスポーターをコードする遺伝子が、放線菌のグリキサゾン生合成遺伝子クラスターに存在するgriGであることを特徴とする請求項3に記載の微生物。
- 上記微生物のゲノム中のN−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されていることを特徴とする請求項3または4に記載の微生物。
- 上記N−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子がアリルアミンN−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項5に記載の微生物。
- 上記微生物が放線菌であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の微生物。
- 上記放線菌がグリキサゾン生合成経路を有する放線菌であることを特徴とする請求項7に記載の微生物。
- 上記グリキサゾン生合成経路を有する放線菌がストレプトマイセス属の放線菌であることを特徴とする請求項8に記載の微生物。
- 上記ストレプトマイセス属の放線菌がストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)であることを特徴とする請求項9に記載の微生物。
- 上記ストレプトマイセス・グリセウスがストレプトマイセス・グリセウスNBRC13350であることを特徴とする請求項10に記載の微生物。
- 上記ストレプトマイセス・グリセウスNBRC13350がストレプトマイセス グリセウス ΔNAT(pIJ702−griCDG)株(受領番号NITE AP−248)であることを特徴とする請求項11に記載の微生物。
- 放線菌のゲノム中の遺伝子griFが破壊されていることを特徴とする請求項7〜12のいずれか1項に記載の微生物。
- 放線菌のグリキサゾン生合遺伝子クラスターに存在する3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子griHおよびgriIが導入されていることを特徴とする請求項1〜6および13のいずれか1項に記載の微生物。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の微生物を培養する工程;および
培養液から3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドを回収・精製する工程
を包含することを特徴とする3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造方法。 - 請求項1〜14のいずれか1項に記載の微生物を培養する工程;
培養液から3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒド修飾体を回収する工程;
3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒド修飾体を脱修飾する工程;および
3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドを精製する工程
を包含することを特徴とする3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造方法。 - 上記3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒド修飾体が3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドであり、上記脱修飾が脱アセチル化であることを特徴とする請求項16に記載の3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造方法。
- 上記微生物を培養する工程において、培養液に3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの前駆体を添加することを特徴とする請求項15または16に記載の3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造方法。
- 上記3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの前駆体が3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸であることを特徴とする請求項18に記載の3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造方法。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の微生物を培養する工程;および
培養液から3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒド修飾体を回収・精製する工程
を包含することを特徴とする3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒド修飾体の製造方法。 - 上記3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒド修飾体が3−アセチルアミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドであることを特徴とする請求項20に記載の3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒド修飾体の製造方法。
- 上記微生物を培養する工程において、培養液に3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの前駆体を添加することを特徴とする請求項21に記載の3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒド修飾体の製造方法。
- 上記3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの前駆体が3−アミノ−4−ヒドロキシ安息香酸であることを特徴とする請求項22に記載の3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒド修飾体の製造方法。
- 請求項15〜19のいずれか1項に記載の3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造方法により得られた3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドを重合して得られることを特徴とするポリマー。
- 請求項15〜19のいずれか1項に記載の3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造方法により得られた3−アミノ−4−ヒドロキシベンズアルデヒドを有機溶剤中で重合することを特徴とするポリアゾメチンの製造方法。
- 請求項25に記載のポリアゾメチンの製造方法により得られたポリアゾメチンを空気中で加熱してオキサゾール環を形成することを特徴とするポリベンゾオキサゾールの製造方法。
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