KR100702317B1 - 바실러스 섭틸리스 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈,이의 제조방법 및 이를 이용한 2,6-나프탈렌디카르복실산의 제조방법 - Google Patents

바실러스 섭틸리스 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈,이의 제조방법 및 이를 이용한 2,6-나프탈렌디카르복실산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈 (aldehyde dehydrogenase: AldX), 이의 제조방법 및 이를 이용한 고순도 2,6-나프탈렌 디카르복실산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알데하이드기를 카르복시기로 전환시키는 능력을 갖는 바실러스 섭틸리스 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈 유전자의 발현벡터를 제조하고, 이 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제조한 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 수득한 알데하이드 디하이드로게네이즈를 이용하여 2,6-나프탈렌 디카르복실산의 순도를 높이는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈를 사용할 경우, 2,6-디메틸나프탈렌을 산화시켜 생산한 조 나프탈렌 디카르복실산 내에 포함된 불순물인 2-포밀-6-나프토산을 생물학적 방법에 의해 2,6-나프탈렌 디카르복실산으로 전환시킬 수 있으므로, 고순도로 정제된 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 효율적이면서도 경제적으로 생산할 수 있는 이점이 있다.
바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 알데하이드 디하이드로게네이즈 (aldehyde dehydrogenase : AldX), 2,6-디메틸나프탈렌(2,6-Dimethylnaphthalene), 조 나프탈렌 디카르복실산(crude Naphthalene dicarboxylic acid), 2-포밀-6-나프토산(2-Formyl-6-naphthoic acid), 2,6-나프탈렌 디카르복실산(2,6-Naphthalene dicarboxylic acid)

Description

바실러스 섭틸리스 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈, 이의 제조방법 및 이를 이용한 2,6-나프탈렌 디카르복실산의 제조방법{AN ALDEHYDE DEHYDROGENASE FROM BACILLUS SUBTILIS, PREPARATION METHOD OF THE SAME AND PREPARATION METHOD OF 2,6-NAPHTHALENE DICARBOXYLIC ACID USING THE SAME}
도 1은 본 발명의 바실러스 섭틸리스 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈 를 암호화하는 유전자를 포함하는 유전자 부분(1.33 kb)의 염기서열이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 섭틸리스 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 ForexT-aldX의 개열지도이다.
본 발명은 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈 (aldehyde dehydrogenase: AldX), 이의 제조방법 및 이를 이용한 고순도 2,6-나프탈렌 디카르복실산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알데하이드기를 카르복시기로 전환시키는 능력을 갖는 바실러스 섭틸리스 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈, 상기 효소의 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물, 상기 미생물의 배양액으로부터 알데하이드 디하이드 로게네이즈를 제조하는 방법 및 상기 수득된 알데하이드 디하이드로게네이즈를 이용하여 고순도의 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 경제적이고 환경친화적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
나프탈렌 디카르복실산의 디에스테르는 폴리에스테르 및 폴리아미드와 같은 여러종류의 고분자 물질을 제조하는데 유용하다. 특히 유용한 디에스테르의 한 예로는 디메틸-2,6-나프탈렌 디카르복실레이트 (이하 NDC)가 있다. NDC는 에틸렌 글리콜과 축합반응하여 고성능 폴리에스테르 물질인 폴리(에틸렌2,6-나프탈레이트)(이하 PEN)을 생성할 수 있다. PEN으로부터 제조된 섬유 및 필름은 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)(이하 PET)에 비하여 강도가 높고 열적 성질이 우수하다. 이로 인해 PEN은 자기 녹음 테이프 및 전자 부품을 제조하는데 사용될 수 있는 박막과 같은 상용품을 제조하는데 사용되는 매우 우수한 물질이다. 또한 기체 확산, 특히 이산화탄소, 산소 및 수증기에 대한 우수한 저항성으로 인해 PEN으로 제조된 필름은 식품 용기, 특히 고온 충전물용 식품 용기를 제조하는데 유용하다. 또한 타이어 코드 제조에 유용한 강화 섬유를 제조하는데 사용될 수 있다.
현재 NDC는 2,6-DMN을 산화시켜 조 나프탈렌 디카르복실산(이하 CNDA)를 생산한 다음 이를 에스테르화하여 생산되고 있다. 현재 NDC가 PEN 합성시 주원료로 사용되고 있지만 2,6-나프탈렌 디카르복실산(이하 NDA)을 원료로 사용할 경우에 비해 몇 가지 문제점을 가지고 있다. 첫째, NDA 축합반응 시에는 물이 생성되는데 비해 NDC의 경우 메탄올이 부산물로 생성되어 폭발성의 위험이 있으며, 둘째, NDC 제 조 공정중 순수한 NDC를 얻기 위하여 NDA를 에스테르화하여 정제공정을 거쳐 NDC를 생산하므로 NDA에 비하여 한 단계의 공정이 더 필요하고, 셋째로 기존의 PET 생산설비를 가지고 있을 경우 기존 설비의 이용 차원에서 NDC의 사용이 적절치 못하다. 이러한 NDC의 단점에도 불구하고 PEN 제조시 NDA 대신 NDC가 사용되는 이유는 아직까지 중합에 필요한 순도를 가진 정제된 NDA의 제조가 어렵기 때문이다.
2,6-디메틸나프탈렌(이하, 2,6-DMN)의 산화시에는 2-포밀-6-나프토산(이하, FNA), 2-나프토산, 트리멜리트산 등 각종 불순물이 포함되어 있는 CNDA가 생성된다. 이 중 특히 FNA가 존재하면 중합반응이 중간에서 멈추게 되어 중합체의 물성에 나쁜 영향을 미치게 되므로 FNA를 제거해야 되나 이의 제거에는 어려운 문제가 존재한다.
따라서 CNDA에 존재하는 FNA를 제거하기 위하여 또는 NDA를 정제하기 위하여 재결정법, 산화공정을 한번 더 거치는 방법, CNDA를 메탄올을 이용하여 NDC로 제조한 후 수화시켜 NDA를 제조하거나 수소화 공정에 의해 정제된 NDA를 제조하는 방법 등이 연구되었다. 또한 용매 처리, 용융 결정, 고압 결정, 초임계 추출 등 여러 가지 정제방법을 사용하고 있으나 아직까지 만족할 만한 순도를 가진 NDA를 제조하지 못하고 있다. 또한 순도를 높이더라도 수율이 매우 떨어져 실제 생산에 적용하기가 어려운 실정이다.
본 발명은 상기한 NDA 정제시의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 효소를 이용한 생물학적인 방법에 의하여 CNDA 내에 포함된 불순물인 FNA를 선택적으로 NDA로 전환시켜 고순도의 NDA를 생산하는 새로운 방법을 제공하는데 기술적 과제를 두고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 알데하이드기를 카르복시기로 전환시키는 능력을 갖는 바실러스 섭틸리스 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 알데하이드 디하이드로게네이즈의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 알데하이드 디하이드로게네이즈를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 알데하이드 디하이드로게네이즈를 이용하여 고순도의 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 한 양상은 서열목록 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 바실러스 섭틸리스 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈에 관계한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양상은 상기한 알데하이드 디 하이드로게네이즈의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터에 관계한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양상은 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물에 관계한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양상은 상기 미생물의 배양액으로부터 정제하여 수득하는 것을 특징으로 하는 알데하이드 디하이드로게네이즈의 제조방법에 관계한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양상은 1) 기질인 조 나프탈렌 디카르복실산을 완충용액, 디메틸설폭사이드 및 NAD 용액과 혼합한 다음 상기 혼합액의 pH를 7.5 내지 8.5로 조절하여 정제반응액을 만드는 단계; 및 2) 서열번호 1로 표시되는 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) HSB-21 (KFCC-11221) 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 미생물의 배양액으로부터 정제하여 수득한 알데하이드 디하이드로게네이즈 효소 정제액과 상기 1) 단계에서 준비한 반응액을 30 내지 45 ℃에서 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디메틸카르복실산에 포함된 불순물인 2-포밀-6-나프토산을 2,6-나프탈렌 디카르복실산으로 전환시키는 단계를 포함하는 고순도 2,6-나프탈렌 디카르복실산의 제조방법에 관계한다.
이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 알데하이드 디하이드로게네이즈는 바실러스 섭틸리스, 바람직하게는 바실러스 섭틸리스 HSB-21(KFCC-11221)로부터 유래되며, 서열목록 서열번호 1의 염기서열로 표시된다.
상기에서 바실러스 섭틸리스 HSB-21(KFCC-11221) 균주는 키토산아제를 생산하는 신균주로서 특허출원번호 제2000-63333호로 이미 출원된 바 있다.
본 발명의 알데하이드 디하이드로게네이즈는 최적 작용 pH가 7.5 내지 8.5이고, 최적 작용 온도가 30 내지 45℃이며, 알데하이드(-COH)기를 카르복시기(-COOH)로 전환시키는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 알데하이드 디하이드로게네이즈는 약 1.33 kb의 크기를 가지며, 약 49,000 달톤의 분자량을 갖는다.
이러한 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈는 바실러스 섭틸리스로부터 알데하이드 디하이드로게네이즈를 암호화하는 유전자를 얻는 단계; 상기 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 발현벡터를 이용하여 형질전환 미생물을 얻는 단계; 상기 형질전환 미생물의 배양액으로부터 통상적인 방법에 따라 알데하이드 디하이드로게네이즈를 정제하여 수득하는 단계를 통해 제조할 수 있다.
이에 대해 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저, 바실러스 섭틸리스 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈를 암호화하는 유전자 aldX를 클로닝하기 위하여, 바실러스 섭틸리스를 배양 및 원심분리하여 균체를 회수한 다음, 통상의 키트를 이용하여 지놈성 DNA(genomic DNA)를 분리하고, 상기 지놈성 DNA를 주형 DNA로 하여 프라이머를 제작하여 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭한다.
상기 증폭된 aldX 유전자의 DNA 절편을 통상적인 방법으로 정제한 후 발현벡 터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제조한다. 이 때, 상기 발현벡터 내로의 aldX 유전자의 클로닝은 제한효소 절단 및 염기 서열 분석 등을 통해 확인할 수 있으며, 상기 발현벡터로는 Forex-T(Takara 사)가 바람직하긴 하나 발현의 목적에 따라 다양한 발현벡터를 용이하게 이용할 수 있다.
그 다음 상기 재조합 발현벡터를 염화칼슘법, 염화루비듐법, 또는 전기영동법 등의 통상적인 방법에 의해 숙주 미생물에 도입하여 형질전환 미생물을 얻는다. 상기 미생물로는 목적에 따라 다양한 종류의 미생물을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 대장균을 이용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대장균 XL1-Blue를 사용할 수 있다.
상기 형질전환 미생물은 우선 엠피실린에 대해 내성을 보이는 균주를 1차 선별한 후 상기 1차 선별체의 배양액으로부터 상등액을 취해 효소 역가를 측정하여 활성을 보이는 균주를 알데하이드 디하이드로게네이즈 생성균주로 최종 선발한다. 즉, 엠피실린에 대해 내성을 갖는 1차 선별 형질전환체를 25 내지 45℃의 온도에서 5시간 내지 20시간 정도 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하고, 상기 균체를 pH 7.0 내지 8.5, 20 내지 50 mM의 칼륨 인산 완충용액(KH2PO4-KOH)으로 현탁시켜 초음파로 파괴한 뒤, 다시 원심분리하여 상등액을 취한 다음, 상기 상등액의 효소 역가를 측정하여 활성을 보이는 균주를 최종 선발한다.
최종 선발된 균주로부터 알데하이드 디하이드로게네이즈 (aldehyde dehydrogenase : AldX)를 수득하기 위하여, 상기 알데하이드 디하이드로게네이즈 생성균주 (Escherichia coli XL1-Blue/ForexT-aldX)를 상기와 동일한 방법으로 배양 및 원심분리하여 상등액을 취한 다음, 상기 얻어진 상등액을 통상적인 방법, 예를 들면 Ni-NTA(QIAGEN) 컬럼을 이용하여 정제한다.
이 때, 상기 형질전환 미생물의 배양에 사용되는 배지로는 LB배지 또는 LBA 배지가 바람직하다.
한편, 본 발명은 바실러스 섭틸리스 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈를 이용하여 고순도의 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명은,
1) 기질인 조 나프탈렌 디카르복실산(crude Naphthalene dicarboxylic aicd)을 완충용액, 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide) 및 NAD 용액과 혼합한 다음 상기 혼합액의 pH를 7.5 내지 8.5로 조절하여 정제반응액을 만드는 단계; 및
2) 서열번호 1로 표시되는 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) HSB-21 (KFCC-11221) 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 미생물의 배양액으로부터 정제하여 수득한 알데하이드 디하이드로게네이즈 효소 정제액과 상기 1)의 과정에서 준비한 반응액을 30 내지 45℃에서 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디메틸카르복실산에 포함된 불순물인 2-포밀-6-나프토산(2-Formyl-6-naphthoic acid)를 2,6-나프탈렌 디카르복실산(2,6-Naphthalene dicarboxylic acid)으로 전환시키는 단계를 포함하는 단계로 이루어진다.
본 발명에서는 조 나프탈렌 디카르복실산 내에 포함되어 있는 불순물인 2- 포밀-6-나프토산(FNA)을 제거하기 위하여, 정제하고자 하는 조 나프탈렌 디카르복실산을 완충용액, 디메틸설폭사이드 및 NAD 용액이 들어있는 효소 반응조에 넣고, 여기에 상기 정제된 본 발명의 알데하이드 디하이드로게네이즈 효소액을 첨가하여 교반하면서 반응을 진행시킨다.
상기에서, 본 발명의 반응온도는 30 내지 45℃인 것이 바람직하며, 특히 37℃에서 반응시키는 것이 가장 좋다.
상기 정제반응액의 pH는 7.5 내지 8.5, 특히 pH 8.0이 바람직하며, 상기 완충용액으로는 물 또는 칼륨 인산 완충용액(KH2PO4-KOH), 소디움 피로포스페이트 완충용액(Sodium pyrophosphate-HCl), 붕산 완충용액(Boric acid-NaOH), 소디움 보래이트 완충용액(Sodium borate-HCl) 등을 0 내지 100 mM의 농도로 이용할 수 있다.
또한 상기에서 기질로 사용하는 조 나프탈렌 디카르복실산은 10 내지 100,000 ppm의 농도로 사용하는 것이 바람직하며, 나아가 0.01 내지 10%의 2-포밀-6-나프토산을 포함하는 조 나프탈렌 디메틸카르복실산을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 디메틸설폭사이드(Dimethyl-sulfoxide)는 0 내지 20 %, 특히 5 % 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
또한 상기 NAD 용액의 농도는 1-30 mM, 특히 15 mM이 바람직하다.
상기와 같은 방법에 의해 수득될 수 있는 본 발명에 따른 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈 (aldehyde dehydrogenase : AldX)는 알데하이드기를 카르복시기로 전환시키는 활성이 높은 효소이므로, 이를 이용할 경우 2,6-디메틸나프탈렌을 산화시켜 생산한 조 나프탈렌 디카르복실산 내에 포함된 불순물인 2-포밀-6-나프토산을 선택적으로 2,6-나프탈렌 디카르복실산으로 전환시켜, 고순도로 정제된 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 효율적이고 경제적으로 생산할 수 있게 하는 이점이 있다.
이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 이는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 권리범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1 : 알데하이드 디하이드로게네이즈 ( aldehyde dehydrogenase : AldX)의 클로닝 및 발현
바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) HSB-21 (KFCC-11221)를 LB배지에 접종하여 30℃에서 16시간 동안 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하였다. QIAGEN의 DNeasy Tissue Kit를 이용하여 상기 균체로부터 염색체 DNA를 분리하였다. 알데하이드 디하이드로게네이즈 (aldehyde dehydrogenase : AldX)를 암호화하는 유전자 aldX를 클로닝하기 위하여 상기 지놈성 DNA 를 주형 DNA로 하여 하기의 PCR 증폭용 프라이머쌍을 제조하였다.
AldX-F(정방향 프라이머; 서열번호 2):
5'-GAGGGGGATTTTCATATGGAACAGCAAGTA
AldX-R(역방향 프라이머; 서열번호 3):
5'-GGAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACATGGAACAGCAAGTAAAGGACGACA
바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis)의 주염색체 DNA에 대해 상기 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 중합효소 연쇄반응에서, 첫번째 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 5분간 1회, 이후 두번째 변성 단계는 94℃에서 1분간, 교잡(annealing) 단계는 56℃에서 1분간, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1.5분간 수행하였으며, 이를 40회 반복하고, 이후 72℃에서 10분간 마지막 연장 단계를 1회 수행하였다. 이와 같은 방법으로 약 1.33 kb의 생성물을 얻었으며, ABI PrismTM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit를 이용하여 상기 생성물의 염기서열을 분석한 결과를 도 1에 도시하였다.
상기 증폭된 유전자 절편을 제한효소 NdeI과 BamHI으로 처리한 다음, 이를 동일한 제한효소로 절단한 Forex-T 벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터 ForexT-aldX를 제조하였다. 도 2는 제작된 ForexT-aldX의 개열지도를 나타낸 것이다.
염화칼슘법 (참조 : Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 상기 재조합 발현벡터 ForexT-aldX로 형질전 환시켰다. 이를 엠피실린 (ampicillin, 100mg/L) 및 박토-아가 (bacto-agar, 15g/L)가 첨가된 LB 평판배지 (이스트 추출물, 5g/L ; 트립톤, 10g/L ; NaCl, 10g/L)에서 배양하여 엠피실린에 대해 내성을 보이는 형질전환균주를 1차 선별하였다.
상기 1차 선별된 형질전환체를 LB배지 5 ml에 접종하여 37 ℃에서 12시간 배양한 다음 원심분리하여 균체를 얻었다. 회수한 균체를 pH 7.0의 50 mM 칼륨 인산 완충용액(KH2PO4-KOH)으로 현탁시킨 다음 초음파로 파괴한 뒤 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상기 상등액의 알데하이드 디하이드로게네이즈 효소 역가를 측정하여 활성을 보이는 균주를 알데하이드 디하이드로게네이즈 생성균주 (Escherichia coli XL1-Blue/ForexT-aldX)로 최종 선발하였다.
이 때, 효소 역가는 효소액 0.5 ml에 NAD 용액 3 ml와 1 % (v/v)의 벤즈알데하이드 용액 0.5 ml를 넣어 25 ℃에서 10분간 반응시킨 후 상기 반응액을 340 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
실시예 2 : 알데하이드 디하이드로게네이즈 ( aldehyde dehydrogenase : AldX )의 정제
실시예 1에 의하여 얻은 알데하이드 디하이드로게네이즈 생성균주 (Escherichia coli XL1-Blue/ForexT-aldX)를 LBA배지에 접종하여 37 ℃에서 10시간 배양하고 원심분리하여 균체를 얻었다. 회수한 균체를 pH 7.0의 50 mM 칼륨 인산 완충용액(KH2PO4-KOH)으로 현탁시킨 다음 초음파로 파괴한 뒤 원심분리하여 상등액을 취하였다. 얻어진 상등액을 Ni-NTA (QIAGEN) 컬럼을 이용하여 정제하였다.
실시예 3 : 분자량 측정
실시예 2에서 제조된 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) HSB-21 (KFCC-11221) 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈 (aldehyde dehydrogenase : AldX)를 SDS-PAGE를 이용하여 분석한 결과, 분자량이 약 49,000 달톤이었다.
실시예 4 : 정제된 알데하이드 디하이드로게네이즈 ( aldehyde dehydrogenase : AldX )를 이용한 2- 포밀 - 6나프토산 ( FNA )으로부터 2,6-나프탈렌 디카르복실산( NDA )으로의 전환
실시예 1에서 얻은 형질전환 미생물 알데하이드 디하이드로게네이즈 생성균주 (Escherichia coli XL1-Blue/ForexT-aldX)와, 대조군으로서 재조합 발현벡터가 포함되지 않은 야생주 XL1-Blue를 각각 5 mL LB 시험관에 접종한 다음, 25 내지 45 ℃의 온도, 특히 37 ℃에서 충분히 키우고, 이를 다시 100㎖의 LB 배지에 1 %(V/V)가 되도록 접종하여 37 ℃에서 16시간 배양하였다.
상기 각 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수한 균체를 pH 7.0의 50 mM 칼륨 인산 완충용액(KH2PO4-KOH)으로 현탁시킨 다음, 초음파로 파괴한 뒤 원 심분리하여 상등액을 취하였다. 얻어진 각 상등액을 Ni-NTA (QIAGEN) column으로 정제하여 알데하이드 디하이드로게네이즈 효소 정제액을 수득하였다.
하기 표 1의 조성으로 반응액을 제조하고, 이를 25 내지 45 ℃의 온도, 특히 37 ℃의 반응조에서 1 시간 동안 반응시킨 후 상기 반응액을 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.
반응액에서 사용된 완충용액의 pH는 8.0으로 하였으며, 디메틸설폭사이드(Dimethyl-sulfoxide)의 농도는 5 %로 하였다. NAD용액의 농도는 15 mM로 하였고, 상기 NDA내 FNA 함량은 2.49 %인 것을 사용하였다.
실험 결과는 하기 표 2에 나타내었으며, 형질전환 미생물 알데하이드 디하이드로게네이즈 생성균주 (Escherichia coli XL1-Blue/ForexT-aldX)가 야생주XL1-Blue에 비하여 높은 FNA의 NDA로의 전환능을 가지고 있었다. HPLC의 분석조건은 하기 표 3과 같았다.
Figure 112005058105110-pat00001
Figure 112005058105110-pat00002
Figure 112005058105110-pat00003
본 발명의 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) HSB-21 (KFCC-11221) 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈 (aldehyde dehydrogenase : AldX)는 2,6-디메틸 나프탈렌을 산화시켜 생산된 조 나프탈렌 디카르복실산에 포함되어 있는 불순물인 2-포밀-6-나프토산을 2,6-나프탈렌 디카르복실산으로 전환시키는데 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 알데하이드 디하이드로게네이즈 (aldehyde dehydrogenase : AldX)를 이용할 경우 경제적이며 친환경적인 방법으로 고순도의 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 생산할 수 있어 산업적으로 유용한 가치가 있다.
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  8. 1) 기질인 조 나프탈렌 디카르복실산(crude Naphthalene dicarboxylic aicd)을 완충용액, 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide) 및 NAD 용액과 혼합한 다음 상기 혼합액의 pH를 7.5 내지 8.5로 조절하여 정제반응액을 만드는 단계; 및
    2) 서열번호 1로 표시되는 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) HSB-21 (KFCC-11221) 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 미생물의 배양액으로부터 정제하여 수득한 알데하이드 디하이드로게네이즈 효소 정제액과 상기 1)의 과정에서 준비한 반응액을 30 내지 45℃에서 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디메틸카르복실산에 포함된 2-포밀-6-나프토산(2-Formyl-6-naphthoic acid)을 2,6-나프탈렌 디카르복실산(2,6-Naphthalene dicarboxylic acid)으로 전환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고순도 2,6-나프탈렌 디카르복실산(2,6-Naphthalene dicarboxylic acid)의 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 완충용액으로 물, 칼륨 인산 완충용액(KH2PO4-KOH), 소디움 피로포스페이트 완충용액(Sodium pyrophosphate-HCl), 붕산 완충용액(Boric acid-NaOH) 및 소디움 보래이트 완충용액(Sodium borate-HCl)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 완충용액을 0 내지 100 mM의 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 기질인 조 나프탈렌 디카르복실산(crude Naphthalene dicarboxylic aicd)은 10 내지 100,000 ppm의 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 기질로는 0.01 내지 10%의 2-포밀-6-나프토산(2-Formyl-6-naphthoic acid)을 포함하는 조 나프탈렌 디메틸카르복실산(crude Naphthalene dicarboxylic acid)을 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제 8항에 있어서, 상기 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide)는 0 내지 20 %의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제 8항에 있어서, 상기 NAD 용액은 1 내지 30 mM의 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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