JP2007104942A - テレフタル酸の代謝に関与する新規遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】テレフタル酸をプロトカテク酸及び/又は2−ピロン−4,6−ジカルボン酸に変換する反応に関与する遺伝子を含む組換え体DNAが導入された形質転換体を、テレフタル酸が添加された培地中で培養する工程を含むプロトカテク酸及び/又は2−ピロン−4,6−ジカルボン酸の製造方法。
【選択図】図1
Description
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号3に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号2に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号2に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(a)配列番号5に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号5に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号4に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号4に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(a)配列番号9に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号9に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼの電子伝達成分としての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号8に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号8に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼの電子伝達成分としての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(a)配列番号7に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号7に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、1,2−ジヒドロキシ−3,5−シクロヘキサジエン−1,4−ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号6に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号6に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、1,2−ジヒドロキシ−3,5−シクロヘキサジエン−1,4−ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(a)配列番号16に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号16に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、プロトカテク酸4,5−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号15に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号15に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸4,5−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(a)配列番号18に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号18に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、プロトカテク酸4,5−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号17に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号17に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸4,5−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(a)配列番号20に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号20に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、4−カルボキシ−2−ヒドロキシムコン酸−6−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号19に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号19に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、4−カルボキシ−2−ヒドロキシムコン酸−6−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(a)配列番号12に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸分解系遺伝子群のポジティブレギュレーターとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号11に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号11に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸分解系遺伝子群のポジティブレギュレーターとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(a)配列番号14に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号14に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸トランスポーターとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号13に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号13に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸トランスポーターとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
本発明は、新規遺伝子等を利用することにより、テレフタル酸を原材料とし、プロトカテク酸を経由して、2−ピロン−4,6−ジカルボン酸を生成する製造方法である。
即ち、まず、テレフタル酸に対し、テレフタル酸ジオキシゲナーゼが作用することにより、不安定な中間生成物である1,2−ジヒドロキシ−1,4−ジカルボキシ−3,5−シクロヘキサジエンが生成される。次に、この1,2−ジヒドロキシ−1,4−ジカルボキシ−3,5−シクロヘキサジエンに対し、1,2−ジヒドロキシ−1,4−ジカルボキシ−3,5−シクロヘキサジエンデヒドロゲナーゼが作用することにより、プロトカテク酸が生成される。
そして、プロトカテク酸に対して、プロトカテク酸4,5−ジオキシゲナーゼが作用することにより、不安定な中間生成物である4−カルボキシ−2−ヒドロキシムコン酸−6−セミアルデヒドが生成される。次に、この4−カルボキシ−2−ヒドロキシムコン酸−6−セミアルデヒドに対して、4−カルボキシ−2−ヒドロキシムコン酸−6−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼが作用することにより、2−ピロン−4,6−ジカルボン酸が生成される。
[テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する反応に関与する遺伝子]
前述した(1)〜(4)記載の遺伝子は、テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する反応に関与する。
また、(4)記載の遺伝子の産物であるtphBタンパク質は、1,2−ジヒドロキシ−1,4−ジカルボキシ−3,5−シクロヘキサジエンを分解してプロトカテク酸を生成する、1,2−ジヒドロキシ−1,4−ジカルボキシ−3,5−シクロヘキサジエンデヒドロゲナーゼとしての活性を示す。
即ち、(8)記載の遺伝子の産物であるtphRタンパク質は、テレフタル酸の分解反応を促進するポジティブレギュレーター(tphRタンパク質)としての活性を示し、テレフタル酸の細胞内取り込み及び分解代謝に関与する遺伝子の発現を促す。
また、(9)記載の遺伝子の産物であるtphCタンパク質は、反応が行われる場となる細胞内にテレフタル酸を取り込む(換言すれば、テレフタル酸の膜透過機能を有する)テレフタル酸トランスポーターとしての活性を示す。
前述した(5)〜(7)記載の遺伝子は、プロトカテク酸から2−ピロン−4,6−ジカルボン酸を生成する反応に関与する。
また、(7)記載の遺伝子の産物であるligCタンパク質は、4−カルボキシ−2−ヒドロキシムコン酸−6−セミアルデヒドを分解して2−ピロン−4,6−ジカルボン酸を生成する、4−カルボキシ−2−ヒドロキシムコン酸−6−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼとしての活性を示す。
上述した遺伝子は、例えば、以下のような方法で取得することができる。
即ち、まず、所定の微生物のゲノムDNAを抽出し、抽出したゲノムDNAを制限酵素により切断することで、ゲノムDNA断片を得る。一方、ファージ、プラスミド等のベクターを、同じ制限酵素末端を得られる制限酵素により切断することで、制限酵素末端を得る。次いで、これらゲノムDNA断片及び制限酵素末端を、DNAリガーゼにより結合させることで、ゲノムDNA断片を含むベクターが得られる。
そして、これらのベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体群を作製する。この形質転換体群の中から、本発明の遺伝子であるゲノムDNA断片を含むベクターが導入された形質転換体を選択し、選択した形質転換体からベクターを分離することにより、本発明の遺伝子を取得できる。
(1)〜(4)、(8)〜(9)記載の遺伝子を取得する場合、所定の微生物は、テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する酵素である、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、1,2−ジヒドロキシ−1,4−ジカルボキシ−3,5−シクロヘキサジエンデヒドロゲナーゼを合成できる微生物であれば特に限定されず、例えば、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)E6株を挙げることができる。なお、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)E6株は、例えば、LB培地中、28℃で23時間培養することにより、充分量の菌体量にまで増殖させることができる。
これらの微生物からのゲノムDNAの抽出は、例えば、以下のような方法で行うことができる。
即ち、まず、所定時間培養した微生物の菌体を集菌し、プロテアーゼKにより菌体を溶菌する。溶菌した後、アルコールを添加して塩析されたゲノムDNAを遠心分離により沈殿させることにより、ゲノムDNAを取得できる。ここで、除タンパク質処理(例えば、フェノール抽出法)、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理等を適宜組み合わせて行うのが、取得するゲノムDNAの純度を向上させる点で、好ましい。
取得したゲノムDNAの断片化は、例えば、このゲノムDNAの制限酵素の消化により行うことができる。
ベクターを導入する宿主細胞としては、このベクターが安定的かつ自律的に複製でき、更に、外来性遺伝子の形質を安定的に発現できるものであれば特に限定されず、例えば大腸菌やシュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)を挙げることができる。
これらの形質転換体群の中から本発明の遺伝子を含むベクターが導入された形質転換体を選択するのは、例えば、本発明の遺伝子のDNA断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法により行うことができる。なお、このプローブの標識は、例えば、放射性同位元素、ジゴキシゲニン、酵素処理により行うことができる。
そして、抽出したベクターから本発明の遺伝子を分離するのは、例えば、制限酵素処理により行うことができる。
この組換え体DNAによれば、tphB遺伝子をtphA3遺伝子とtphA1遺伝子との間に配置したので、1,2−ジヒドロキシ−1,4−ジカルボキシ−3,5−シクロヘキサジエンデヒドロゲナーゼが、テレフタル酸ジオキシゲナーゼと同調して合成されるから、テレフタル酸からプロトカテク酸への生成反応を効率的に行うことができる。
[テレフタル酸を分解してプロトカテク酸を生成する反応に関与する遺伝子を含むベクター]
配列番号1記載の塩基配列を有するDNA断片の上流域に、配列番号10記載の塩基配列を有するDNA断片を結合させたDNA断片、あるいは、さらにこのDNA断片に配列番号21記載のターミネーターを結合したDNA断片を、「pBluescript」、「pUC119」、「pUC118」および、「pKT230MC」等のベクターに、そのマルチクローニングサイトにおいて結合させたベクターは、(17)記載のベクターの一例として適用できる。
配列番号10記載の塩基配列を有するDNA断片、配列番号1記載のDNA断片および、配列番号21記載の塩基配列を有するDNA断片を「pBluescript」、「pUC119」、「pUC118」および、「pKT230MC」等のベクターに、そのマルチクローニングサイトにおいて結合させたベクターは、(17)記載のベクターの一例として適用できる。
配列番号22記載の塩基配列を有するDNA断片を、「pBluescript」、「pUC119」、「pUC118」および、「pKT230MC」等のベクターに、そのマルチクローニングサイトにおいて結合させたベクターは、(17)記載のベクターの一例として適用できる。
このベクターによれば、大腸菌などの形質転換体において、プロトカテク酸から2−ピロン−4,6−ジカルボン酸を高効率で生成できる。
配列番号10記載の塩基配列を有するDNA断片、配列番号1記載のDNA断片および、配列番号22記載の塩基配列を有するDNA断片を「pBluescript」、「pUC119」、「pUC118」および、「pKT230MC」等のベクターに、そのマルチクローニングサイトにおいて結合させたベクターは、(17)記載のベクターの一例として適用できる。
このベクターによれば、大腸菌などの形質転換体において、テレフタル酸から2−ピロン−4,6−ジカルボン酸を高効率で生成できる。
本発明に係る形質転換体は、前述したベクターを、常法に従って所定の宿主細胞に導入することにより作製できる。
受領番号がFERM AP−20676であるコマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)DPI株は、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)E6株から、pmdI遺伝子(2−ピロン−4,6−ジカルボン酸分解酵素遺伝子)が欠損された形質転換体である。
この形質転換体によれば、2−ピロン−4,6−ジカルボン酸の分解が抑制されるから、生成された2−ピロン−4,6−ジカルボン酸を高効率で蓄積できる。
この形質転換体によれば、プロトカテク酸の分解が抑制されるから、生成されたプロトカテク酸を高効率で蓄積できる。
なお、このpmdABC遺伝子が欠損された形質転換体は、コマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)E6からのみではなく、受領番号がFERM AP−20676であるコマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)DPI株からでも作製できる。
2−ピロン−4,6−ジカルボン酸は、例えば、以下のような方法で生成できる。
即ち、まず、後述するベクター「pHE96R−LABCT/pKT230MC」が導入された形質転換体(例えば、シュードモナス属細菌、コマモナス属細菌)を、約5LのLB培地内で、27〜28℃で約16時間培養する。培地には、ベクターの脱落を防止するために、抗生物質(例えば、カナマイシン)を添加しておく。
菌体濃度がOD660において13〜14程度になるまで培養した形質転換細胞の懸濁液に、テレフタル酸約16gを溶解させたNaOH溶液(0.1mol/L、pH8〜9)約500mLを、5〜6時間かけて添加する。反応の進行に伴って生成される2−ピロン−4,6−ジカルボン酸による培地pHの低下を防ぐため、NaOH溶液(0.1mol/L)を少量ずつ添加する。この反応を、27〜28℃で行う。反応時間については、得たい2−ピロン−4,6−ジカルボン酸の収量に応じて、適宜設定することができるが、たとえば、48時間以上反応させることが好ましい。
反応液に塩酸を加え、pHを2〜3とすることで、反応を停止させる。この反応液を遠心分離し、菌体成分を沈殿させて除去する。得られた上清に、更に塩酸を添加することにより、pHを約1に低下させる。この上清を低温(4〜5℃)で静置することにより、2−ピロン−4,6−ジカルボン酸が沈殿となり、この沈殿を分離することで2−ピロン−4,6−ジカルボン酸が得られる。
なお、得られた2−ピロン−4,6−ジカルボン酸は、活性炭処理により、さらに純度を向上できる。
プロトカテク酸は、例えば、以下のような方法で製造できる。
即ち、後述するベクター「pHE96R−T/pKT230MC」が導入された形質転換体(例えば、シュードモナス属細菌、コマモナス属細菌)を、約5LのLB培地内で、27〜28℃で約16時間培養する。培地には、ベクターの脱落を防止するために、抗生物質(例えば、カナマイシン)を添加しておく。
菌体濃度がOD660において13〜14程度になるまで培養した形質転換細胞の懸濁液に、テレフタル酸約16gを溶解させたNaOH溶液(0.1mol/L、pH8〜9)約500mLを、5〜6時間かけて添加する。反応の進行に伴って生成されるプロトカテク酸による培地pHの低下を防ぐため、NaOH溶液(0.1mol/L)を少量ずつ添加する。この反応を、27〜28℃で行う。反応時間については、得たいプロトカテク酸の収量に応じて、適宜設定することができるが、たとえば、48時間以上反応させることが好ましい。
この反応液から、酢酸エチルエステルで抽出分離することにより、プロトカテク酸が得られる。
図2は、本発明に係る組換え体DNAを含むベクターの製法及び構造を示す概略図である。そして、「pHE96/pBluescript II SK(+)」は、(11)記載の組換え体DNAを含むベクター、換言すれば、(17)記載のベクターの一例である。
即ち、ベクター「pHE96/pBluescript II SK(+)」は、配列番号10記載の塩基配列を含むDNA断片が配列番号1記載の塩基配列を含むDNA断片の上流に結合された組換え体DNAを、公知の大腸菌プラスミド「pBluescript II SK(+)」内に挿入して構成したものである。なお、この組換え体DNAは、この「pBluescript II SK(+)」が備えるマルチクローニングサイト内に存在する制限酵素EcoRI切断部位に挿入した。
図4は、本発明に係る組換え体DNAを含むベクターの製法及び構造を示す概略図である。そして、「pHE96R−/pBluescript II SK(+)」は、(11)記載の組換え体DNAを含むベクター、換言すれば、(17)記載のベクターの一例である。
即ち、ベクター「pHE96R−/pBluescript II SK(+)」は、配列番号13記載の塩基配列を備え、tphC遺伝子をコードする遺伝子の塩基配列の上流に制限酵素BamHI切断部位を有するように設計されたDNA断片と、配列番号1に示される塩基配列を持つDNA断片とからなる組換え体DNAとを公知の大腸菌プラスミド「pBluescript II SK(+)」に挿入したものである。なお、この組換え体DNAは、この「pBluescript II SK(+)」が備えるマルチクローニングサイト内に存在する制限酵素BamHI切断部位及び制限酵素EcoRI切断部位において挿入されている。
「pHE96R−/pBluescript II SK(+)」は、例えば、以下のような方法で作製した。
即ち、まず、ベクター「pHE96/pBluescript II SK(+)」内に挿入されているtphC遺伝子領域を、Uniプライマー(制限酵素BamHI認識配列を含む)およびRevプライマー(制限酵素EcoRI、XhoI認識配列を含む)を用いてPCR法により、選択的に増幅した。なお、Uniプライマー及びRevプライマーの塩基配列は、次の通りであった。
Uniプライマー配列:5’−AGTCGGTCCCATCCTCATACTGCAGTTC−3’
Revプライマー配列:5’−ATCGCTCGAGAATTCGATGAACTGAGCAGTCTTG−3’
図4は、本発明に係る組換え体DNAを含むベクターの製法及び構造を示す概略図である。そして、「pLG200/pUC119」は、(12)記載の組換え体DNAを含むベクター、換言すれば、(17)記載のベクターの一例である。
即ち、ベクター「pLG200/pUC119」は、配列番号22記載の塩基配列を含む組換え体DNAを、公知の大腸菌プラスミド「pUC119」に挿入して構成したものである。なお、この組換え体DNAは、この「pUC119」が備えるマルチクローニングサイト内に存在する制限酵素XbaI切断部位において挿入した。
図5は、本発明に係る組換え体DNAを含むベクターの製法及び構造を示す概略図である。そして、「pKTLABCT」は、(12)記載の組換え体DNAを含むベクター、換言すれば、(17)記載のベクターの一例である。
即ち、広宿主域性を有するベクター「pKTLABCT」は、配列番号22記載の塩基配列を含む組換え体DNAを、公知の広宿主域プラスミド「pKT230MC」に挿入したものである。なお、この組換え体DNAは、この「pKT230MC」が備えるマルチクローニングサイト内に存在する制限酵素XbaI切断部位において挿入した。
このpKTLABCTは、シュードモナス属細菌(例えば、Pseudomonas putida)やコマモナス属細菌(例えば、Comamonas sp.)等において複製できる。
図6は、本発明に係る組換え体DNAを含むベクターの製法及び構造を示す概略図である。そして、「pHE96R−LABCT/pKT230MC」は、(13)記載の組換え体DNAを含むベクター、換言すれば、(17)記載のベクターの一例である。
即ち、広宿主域性を有するベクター「pHE96R−LABCT/pKT230MC」は、lacZプロモーター、配列番号13で示される塩基配列、配列番号1で示される塩基配列を、ベクター「pKTLABCT」に挿入することにより構成したものである。なお、この組換え体DNAは、この「pKTLABCT」内に存在する制限酵素XbaI切断部位のうち、配列番号22記載の塩基配列の上流に存在するXbaI切断部位において、挿入したものである。
ベクター「pKTLABCT」を、このベクター内に存在する2つの制限酵素XbaI切断部位のうち、ligA遺伝子の塩基配列の上流に存在するXbaI切断部位のみにおいて、切断した。この制限酵素XbaIによる部分切断によって得られるDNA断片に、「pHE96R−/pBluescript II SK(+)」を制限酵素VspI及びEcoRIにより切断して得られるDNA断片を、配列番号22記載の塩基配列がlacZプロモーターの下流に位置するように、T4DNAリガーゼで連結することにより、ベクター「pHE96R−LABCT/pKT230MC」を作製した。
図7は、本発明に係る組換え体DNAを含むベクターの製法及び構造を示す概略図である。そして、「pHE96R−T/pKT230MC」は、(10)記載の組換え体DNAを含むベクター、換言すれば、(17)記載のベクターの一例である。
即ち、広宿主域性を有するベクター「pHE96R−LABCT/pKT230MC」は、ベクター「pHE96R−LABCT/pKT230MC」から、配列番号15、配列番号17および、配列番号19記載の塩基配列を含むDNA断片が除去されて構成したものである。
前述したベクター「pHE96R−LABCT/pKT230MC」を、このベクター内に存在する制限酵素NdeIおよび制限酵素SalI切断部位において切断し、DNA断片を抽出した。このDNA断片に対して、平滑化酵素による末端平滑化処理を行った後、平滑化された末端同士をT4DNAリガーゼで連結することにより、ベクター「pHE96R−T/pKT230MC」を作製した。
前述したベクター「pHE96R−LABCT/pKT230MC」を大腸菌HB101株に導入し、25mg/Lのアンピシリンを含むLB培地(100mL)で、37℃で18時間振とう培養することで、このベクターが導入された大腸菌を選抜した。この大腸菌から、ベクター「pHE96R−LABCT/pKT230MC」を抽出した。
まず、ベクター「pHE96R−T/pKT230MC」を大腸菌HB101株に導入し、25mg/Lのアンピシリンを含むLB培地(100mL)で、37℃で18時間振とう培養することで形質転換体を選抜した。選抜された形質転換体から、ベクター「pHE96R−T/pKT230MC」を抽出した。
なお、このようにして得られた形質転換体を、シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)PpY1100(pHE96R−T/pKT230MC)株と呼ぶ。
シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)PpY1100(pHE96R−LABCT/pKT230MC)株およびコマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)DPI(pHE96R−LABCT/pKT230MC)株を、各々、200mLのLB液体培地(25mg/Lのカナマイシンを含む)に接種した後、28℃で16時間培養することで前培養菌体懸濁液を得た。LB液体培地8Lおよび消泡剤(Antiform A)3mLを10L容量のジャーファーメンター(発酵槽)により混合することで培地を調製し、この調整した培地に前培養菌体懸濁液200mLを混合した後、28℃、500rpm/分の通気攪拌条件のもと、菌体濃度がOD660において13程度になるまで培養した(約11時間)。培養に伴う増殖曲線を図8に示す。図8に示されるように、時間経過とともに菌体濃度が順調に増加していたことから、上述の培養条件で、シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)PpY1100(pHE96R−LABCT/pKT230MC)株は順調に増殖していたことが分かった。
図12左側に示されるように、反応開始後8時間において、反応開始後0時間において視認されていたテレフタル酸を示すシグナルが消失し、2−ピロン−4,6−ジカルボン酸を示すシグナルが現れていたことから、反応液中のテレフタル酸から2−ピロン−4,6−ジカルボン酸が生成されていたことが分かった。
図12の右上側に示されるように、テレフタル酸の誘導体(分子量310)及びこの誘導体からメチル基(分子量15)が順次脱離した化合物に対応するピークが視認されたことから、図12左上のシグナルはテレフタル酸を示すものであることが確認された。
また、図12の右下側に示されるように、2−ピロン−4,6−ジカルボン酸の誘導体(分子量328)及びこの誘導体からメチル基(分子量15)が順次脱離した化合物に対応するピークが視認されたことから、図12左下のシグナルは2−ピロン−4,6−ジカルボン酸を示すものであることが確認された。
シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)PpY1100(pHE96R−T/pKT230MC)株を、200mLのLB液体培地(25mg/Lのカナマイシンを含む)に接種し28℃で16時間培養し前培養菌体懸濁液とした。8LのLB液体培地および消泡剤(Antiform A)3mLを10L容量のジャーファーメンター(発酵槽)を用いて調製し、そこに培養したシュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)PpY1100(pHE96R−T/pKT230MC)株の前培養菌体懸濁液200mLを混合し、28℃、500rpm/分の通気攪拌下、OD660が13程度になるまで培養した(約11時間)。
Claims (21)
- 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号3に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号2に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号2に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号5に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号5に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号4に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号4に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号9に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号9に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼの電子伝達成分としての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号8に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号8に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼの電子伝達成分としての機能を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号7に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号7に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、1,2−ジヒドロキシ−3,5−シクロヘキサジエン−1,4−ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号6に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号6に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、1,2―ジヒドロキシ―3,5―シクロヘキサジエン―1,4−ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号16に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号16に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、プロトカテク酸4,5−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号15に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号15に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸4,5−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号18に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号18に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、プロトカテク酸4,5−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号17に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号17に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸4,5−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号20に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号20に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、4−カルボキシ−2−ヒドロキシムコン酸−6−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号19に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号19に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、4−カルボキシ−2−ヒドロキシムコン酸−6−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号12に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号12に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸分解系遺伝子群のポジティブレギュレーターとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号11に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号11に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸分解系遺伝子群のポジティブレギュレーターとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号14に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号14に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸トランスポーターとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号13に示される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号13に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸トランスポーターとしての機能を有するタンパク質をコードするDNA - 少なくとも請求項1〜4記載の全ての遺伝子を含む組換え体DNA。
- 少なくとも請求項1〜4、8、及び9記載の全ての遺伝子を含む組換え体DNA。
- 少なくとも請求項5〜7記載の全ての遺伝子を含む組換え体DNA。
- 少なくとも請求項1〜7記載の全ての遺伝子を含む組換え体DNA。
- 少なくとも請求項1〜9記載の全ての遺伝子を含む組換え体DNA。
- ターミネーターを含む請求項10〜14のいずれか記載の組換え体DNA。
- 前記ターミネーターは、ρ非依存性転写ターミネーターである請求項15記載の組換え体DNA。
- 請求項10〜16いずれか記載の組換え体DNAを含むベクター。
- 請求項17記載のベクターが導入された形質転換体。
- テレフタル酸が添加された培地中で、請求項18記載の形質転換体を培養する工程を含む2−ピロン−4,6−ジカルボン酸及び/又はプロトカテク酸の製造方法。
- 受領番号がFERM AP−20676であるコマモナス スピーシーズ(Comamonas sp.)に属する形質転換体。
- 受領番号がFERM AP−20677であるスフィンゴモナス パウシモビリス(Sphingomonas paucimobilis)に属する形質転換体。
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