KR101645105B1 - 테레프탈산칼륨염으로부터의 유용화학품의 제조법 - Google Patents

테레프탈산칼륨염으로부터의 유용화학품의 제조법 Download PDF

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Abstract

테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하인 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 원료로 하는 것에 의해 테레프탈산1,2-디옥시게나아제를 발현하는 미생물을 이용하여 TPA-DHD를 제조할 수 있다. 그리고 TPA-DHD 디히드로게나아제에 의해 TPA-DHD를 프로토카테큐산으로 전환하고 또한 파라히드록시벤조산 히드록실라아제에 의해 프로토카테큐산을 갈산으로 전환할 수 있다. 또한 폐기 폴리에스테르를 수산화칼륨을 포함하는 에틸렌글리콜 용매 또는 1-부탄올 용매 중에서 가열처리하는 것에 의해 효율적으로 그 폴리에스테르를 해중합할 수 있으며 또한 미생물에 의한 화학품 제조에 적합한 테레프탈산칼륨을 조제할 수 있다.

Description

테레프탈산칼륨염으로부터의 유용화학품의 제조법{METHOD FOR PRODUCING USEFUL CHEMICAL SUBSTANCE FROM TEREPHTHALIC ACID POTASSIUM SALT}
본 발명은 테레프탈산칼륨염을 원료로 하고 테레프탈산1,2-디옥시게나아제를 발현하는 미생물을 이용하여 테레프탈산-1,2-시스-디히드로디올(이하 필요에 따라 TPA-DHD라고 약칭함)을 제조하는 방법, 또 TPA-DHD를 프로토카테큐산이나 갈산으로 전환하는 방법, 및 원료가 되는 테레프탈산칼륨염을 폐기 폴리에스테르의 해중합에 의해 얻는 방법에 관한 것이다. 다만 본 발명에서는 테레프탈산칼륨염이란 테레프탈산2칼륨염, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염 및 테레프탈산1-칼륨4-암모늄염 등의 테레프탈산이 테레프탈산 중 적어도 하나의 카복실기 잔기가 칼륨 이온과 염을 형성한 화합물을 말한다.
테레프탈산은 주로 폴리에틸렌테레프탈레이트(이하 PET라고 약칭함), 폴리트리메틸렌테레프탈레이트(이하 PTT라고 약칭함) 및 폴리부틸렌테레프탈레이트(이하 PBT라고 약칭함) 등의 테레프탈산계 폴리에스테르의 원료로서 대량으로 생산되고 있는 저가의 화학품이다. 테레프탈산이 저가이기 때문에 미생물을 이용해서 테레프탈산을 원료로 하여 TPA-DHD, 2-피론-4,6-디카복시산, 프로토카테큐산, 갈산 등의 유용화학품을 제조하는 기술도 개발되어 있다(문헌 1∼5). TPA-DHD의 탈수반응에 의해 의약품이나 수지 재료의 원료가 되는 2-히드록시테레프탈산을 제조할 수 있다는 것이 알려져 있다(특허문헌 1과 2).
테레프탈산을 원료로 하고 미생물을 이용하여 유용화학품을 제조하는 경우, 테레프탈산 자체가 아니라 수용성이 우수한 테레프탈산염을 배지 안에 첨가하는 것이 바람직하다. 수산화나트륨이 수산화칼륨보다 저가이기 때문에 지금까지 테레프탈산의 나트륨염이 그 원료로 이용되어 왔지만, 테레프탈산의 칼륨염을 원료로 하고 미생물을 이용하여 유용화학품을 제조한 보고 및 테레프탈산의 나트륨염보다 테레프탈산의 칼륨염을 이용하는 것이 목적화합물의 생산성이 우수하다는 것을 나타낸 보고는 없다.
테레프탈산계 폴리에스테르의 리사이클에 대해서는 특히 폐기 PET병의 리사이클을 중심으로 다수의 리사이클 기술이 개발되었고 사업화도 진행되고 있다. 그러나 그 리사이클 비용은 높아 보다 수익성이 높은 리사이클 기술이 요구되고 있다. 이와 같이 테레프탈산을 원료로 하는 화학품 제조에 있어서 폐기 폴리에스테르 유래의 테레프탈산을 원료로 하는 것은 환경문제의 해결과 제조 비용의 저감으로 이어지는 점에서 중요한 연구개발 과제이다.
폐기 폴리에스테르의 리사이클법으로는 원래 폴리에스테르를 얻는 머테리얼 리사이클법에 더하여 폴리에스테르를 화학적으로 해중합하여 테레프탈산이나 비스-2-히드록시에틸테레프탈레이트 등을 얻는 케미컬 리사이클법(특허문헌 6∼11)이 알려져 있다. PET 등의 폴리에스테르를 수산화나트륨 등의 알칼리금속 수산화물을 포함하는 에틸렌글리콜 반응용매 또는 알코올 반응용매 중에서 가열하는 것에 의해 해중합할 수 있다고 알려져 있다. 이 경우, 수산화나트륨이 저가이기 때문에 일반적으로 알칼리금속 수산화물로는 수산화나트륨이 이용된다. 단, 얻어지는 테레프탈산 알칼리금속염의 이용용도가 없기 때문에 테레프탈산 알칼리금속염을 더욱 산처리하는 것에 의해 테레프탈산을 얻는 리사이클 사업의 추진이 기대되고 있다. 그러나 그 리사이클 사업은 제조 비용이 많이 드는 경향이 있으며 또한 얻어지는 테레프탈산이 저가이기 때문에 거의 실시되고 있지 않다.
PET가 수산화칼륨을 포함하는 에틸렌글리콜 용매 중에서 해중합할 수 있는 것은 알려져 있지만(비특허문헌 1), 에틸렌글리콜 용매 중에서 수산화칼륨과 수산화나트륨의 PET 해중합의 차이를 비교한 결과는 보고되어 있지 않다. 그리고 수산화칼륨을 포함하는 에틸렌글리콜 반응용매 중에서 PET, PTT 또는 PBT를 해중합하는 것에 의해 테레프탈산칼륨염을 얻은 후, 미생물을 이용하여 그 테레프탈산칼륨염을 다른 유용화학품으로 전환한다고 하는 폐기 폴리에스테르의 리사이클 기술에 관한 보고는 없다.
수산화나트륨을 포함하는 1-부탄올 반응용매 중에서 폐기 PET를 해중합하고 황산 첨가에 의해 테레프탈산이 얻어지는 실험예가 보고되어 있는데(특허문헌 12), 수산화칼륨을 포함하는 1-부탄올 반응용매 중에서 폐기 PET를 해중합하는 사례 및 알칼리를 포함하는 1-부탄올 반응용매 중에서 폴리에스테르의 해중합 반응에서의 수산화칼륨과 수산화나트륨의 차이를 비교한 사례는 보고되어 있지 않다.
수산화칼륨을 포함하는 에틸렌글리콜 중에서 폐기 폴리에스테르를 해중합한 경우, 순도가 높은 테레프탈산칼륨염을 얻고자 하면 그 리사이클 비용이 증대된다. 따라서 에틸렌글리콜을 포함하는 순도가 낮은 테레프탈산칼륨염을 원료로 하고 미생물을 이용하여 유용화학품으로 전환하는 것이 바람직하다. 그러나 테레프탈산염과 에틸렌글리콜을 공존시킨 상태로 미생물에 의한 화학품 생산을 실시한 보고는 없다. 다만 기초연구분야 및 공업생산분야에서 자주 이용되는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli; 이하 적절히 대장균이라고 한다.) K-12주에 대해서는 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제에 의해 에틸렌글리콜을 글리콜산으로 전환할 수 있다는 것이 알려져 있을 뿐만 아니라 락토알데히드 리덕타아제에 대한 변이도입에 의해 에틸렌글리콜의 대사능이 향상된다는 것도 보고되어 있다(비특허문헌 2∼4).
특허문헌 1: United States Patent 5,068,414 특허문헌 2: United States Patent 5,124,479 특허문헌 3: 일본 공개특허공보 2007-104942호 특허문헌 4: 일본 공개특허공보 2009-65839호 특허문헌 5: 일본 공개특허공보 2009-213392호 특허문헌 6: 일본 특허 제3715812호 특허문헌 7: 일본 공개특허공보 2000-169623호 특허문헌 8: United States Patent 3,544,622 특허문헌 9: 일본 공개특허공보 2002-60542호 특허문헌 10: 일본 공개특허공보 평11-21374호 특허문헌 11: United States Patent 4,542,239 특허문헌 12: WO2005/082826
비특허문헌 1: Polym. -Plastics Tech. Eng., 43, 369 (2004) 비특허문헌 2: J. Bacteriol., 153, 134 (1983) 비특허문헌 3: J. Bacteriol., 171, 6097 (1989) 비특허문헌 4: J. Biol. Chem., 273, 8308 (1998)
본 발명의 과제는 테레프탈산 알칼리금속염을 원료로 하여 TPA-DHD를 생산함과 함께, 그 생산된 TPA-DHD를 프로토카테큐산으로 미생물을 이용하여 전환할 때 이 화합물의 생산성을 향상시키는 방법을 제공하는 것에 있으며, 또한 그 테레프탈산 알칼리금속염을 폐기 폴리에스테르의 해중합에 의해 얻는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 테레프탈산계 폴리에스테르인 PET를 알칼리 용액 중에서 해중합하고 테레프탈산염을 얻는 연구를 하는 과정에서 재조합 대장균에 의한 프로토카테큐산의 생산성을 비교했더니, 테레프탈산2나트륨염보다 테레프탈산칼륨염(테레프탈산2칼륨염, 1-칼륨4-암모늄염 또는 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염)을 원료로 했을 때 프로토카테큐산의 생산성이 높다는 것을 알아내어 테레프탈산칼륨염의 이용에 주목했다.
원료가 되는 테레프탈산염의 수용성이 낮으면 원료탱크로부터 투입되는 액량이 증가하여 배양탱크당 목적 화합물의 생산량이 감소된다. 따라서 수용성이 높은 테레프탈산염을 원료로 이용하는 것이 바람직하다. 그래서 테레프탈산2나트륨염, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염 및 테레프탈산2칼륨염의 물에 대한 30℃ 용해도를 조사했더니, 테레프탈산2칼륨염의 용해도가 약 1.0M, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염의 용해도가 약 0.96M, 그리고 테레프탈산2나트륨염의 용해도가 약 0.63M으로 테레프탈산칼륨염의 수용성이 높은 것을 알아내었다. 또 테레프탈산2칼륨염이나 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염 등의 테레프탈산칼륨염이 테레프탈산2나트륨염보다 대장균 등의 미생물에 의한 목적 화합물의 생산성이 우수한 것을 알아내었다.
그리고 암모니아의 몰당 가격은 수산화칼륨이나 수산화나트륨의 몰당 가격보다 저가라는 것을 감안하여 각종 테레프탈산 암모늄염의 물에 대한 30℃ 용해도를 조사했더니, 테레프탈산1-칼륨4-암모늄염의 용해도가 약 0.85M, 테레프탈산1-나트륨4-암모늄염의 용해도가 약 0.61M, 및 테레프탈산2암모늄염의 용해도가 약 0.51M으로 테레프탈산1-칼륨4-암모늄염의 수용성이 높다는 것을 알아내었다. 또 테레프탈산1-칼륨4-암모늄염을 이용했을 때 대장균 등의 미생물에 의한 목적 화합물의 생산성이 우수한 것을 알아내어 본 발명의 과제를 해결하기에 이르렀다.
다음으로 PET, PTT 및 PBT 각각을 알칼리 용액 중에서 가열하여 해중합하는 연구를 실시한 결과, 알칼리금속 수산화물을 포함하는 에틸렌글리콜 반응용매 중에서 해중합했을 때 알칼리금속 수산화물로서 수산화나트륨보다 수산화칼륨을 이용하는 것이 폴리에스테르의 해중합 속도가 빠르며 게다가 테레프탈산염의 회수효율이 우수한 것을 알아내었다. 그 결과, 테레프탈산계 폴리에스테르를 수산화칼륨을 포함하는 에틸렌글리콜 반응용매 중에서 해중합하는 것이 폐기 폴리에스테르의 해중합에 의해 테레프탈산염을 조제하는 방법으로 우수하다는 것을 알아내었다.
그리고 해중합의 반응용매를 에틸렌글리콜에서 1-부탄올로 바꾸는 것에 의해 해중합의 반응온도를 낮출 수 있으며 또한 예상외로 테레프탈산염의 회수효율이 우수하다는 것을 알아내었다. 그리고 1-부탄올 중에서의 해중합 반응에 있어서 알칼리금속 수산화물로서 수산화나트륨보다 수산화칼륨을 이용하는 것이 예상외로 테레프탈산염의 해중합 효율이 우수한 것을 알아내었다.
이상과 같이 테레프탈산의 알칼리금속염을 원료로 하는 미생물에 의한 목적 화합물의 생산에서뿐만 아니라 원료용의 테레프탈산칼륨염을 얻기 위한 에틸렌글리콜 용매 또는 1-부탄올 용매에서의 폴리에스테르의 해중합 반응에서도, 이용하는 알칼리금속으로는 나트륨이 아니라 칼륨을 이용하는 것이 바람직하다는 것을 알아내었다.
즉 본 발명은 이하의 (1)∼(24)에 관한 것이다.
(1) 이하의 (a), (b), (c) 또는 (d)에 나타내는 DNA, 이하의 (e), (f), (g) 또는 (h)에 나타내는 DNA 및 이하의 (i), (j), (k) 또는 (l)에 나타내는 DNA를 가지며, 테레프탈산으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 생산하는 능력을 가지는 미생물 또는 그 배양물의 처리물을 테레프탈산염을 포함하는 수성매체 중에서 테레프탈산과 반응시켜 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 생성시키는 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법으로서, 상기 테레프탈산염이 테레프탈산염에 포함되는 전(全)테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 서열번호 2로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA.
(b) 서열번호 2로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 서열을 포함하고, 또한 테레프탈산으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올로의 전환에 관련되는 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(c) 서열번호 1로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
(d) 서열번호 1로 나타내는 염기서열의 전부 혹은 일부의 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고 또한 테레프탈산으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올로의 전환에 관련되는 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(e) 서열번호 4로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA.
(f) 서열번호 4로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 서열을 포함하고, 또한 테레프탈산으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올로의 전환에 관련되는 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(g) 서열번호 3으로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
(h) 서열번호 3으로 나타내는 염기서열의 전부 혹은 일부의 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고 또한 테레프탈산으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올로의 전환에 관련되는 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(i) 서열번호 6으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA.
(j) 서열번호 6으로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 서열을 포함하고, 또한 테레프탈산으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올로의 전환에 관련되는 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(k) 서열번호 5로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
(l) 서열번호 5로 나타내는 염기서열의 전부 혹은 일부의 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고 또한 테레프탈산으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올로의 전환에 관련되는 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(2) 상기 테레프탈산염을 포함하는 수성매체가 테레프탈산2칼륨염, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염, 테레프탈산1-칼륨4-암모늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종류 이상의 테레프탈산칼륨염을 포함하는 수용액인 것을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
(3) 상기 테레프탈산염을 수용액의 형태 또는 분말의 형태 또는 현탁액의 형태로 상기 미생물 또는 그 배양물의 처리물에 첨가하여 상기 미생물 또는 처리물과 테레프탈산을 반응시키는 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2)에 기재된 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
(4) (1)에 기재된 미생물이 추가로 하기 (m), (n), (o) 또는 (p)에 나타내는 DNA를 도입하는 것에 의해 테레프탈산의 세포내 수송능을 증강시킨 미생물인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
(m) 서열번호 8로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA.
(n) 서열번호 8로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 서열을 포함하고 또한 테레프탈산트랜스포터 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(o) 서열번호 7로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
(p) 서열번호 7로 나타내는 염기서열의 전부 혹은 일부의 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고 또한 테레프탈산트랜스포터 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(5) 상기 미생물은 추가로 이하의 (q), (r), (s) 또는 (t)에 나타내는 DNA를 가지며 테레프탈산으로부터 프로토카테큐산을 생산하는 능력을 가지는 미생물이고, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 테레프탈산염으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 생성시키고 다시 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 프로토카테큐산으로 전환하는 것을 특징으로 하는 프로토카테큐산의 제조법.
(q) 서열번호 10으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA.
(r) 서열번호 10으로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 서열을 포함하고 또한 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 프로토카테큐산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(s) 서열번호 9로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
(t) 서열번호 9로 나타내는 염기서열의 전부 혹은 일부의 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고 또한 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 프로토카테큐산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(6) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 테레프탈산염으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 생성시킨 후, 상기 (q), (r), (s) 또는 (t)에 나타내는 DNA를 형질전환법에 의해 도입하여 얻어진 미생물 또는 그 배양물의 처리물을 이용하여 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 프로토카테큐산으로 전환하는 것을 특징으로 하는 프로토카테큐산의 제조법.
(7) 상기 미생물은 추가로 상기 (q), (r), (s) 또는 (t)에 나타내는 DNA 및 (u), (v), (w) 또는 (x)에 나타내는 DNA를 가지며 테레프탈산으로부터 갈산을 생산하는 능력을 가지는 미생물이고, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 테레프탈산염으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 생성시키고 다시 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 갈산으로 전환하는 것을 특징으로 하는 갈산의 제조법.
(u) 서열번호 12로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA.
(v) 서열번호 12로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 서열을 포함하고 또한 프로토카테큐산을 갈산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(w) 서열번호 11로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
(x) 서열번호 11로 나타내는 염기서열의 전부 혹은 일부의 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고 또한 프로토카테큐산을 갈산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(8) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 테레프탈산염으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 생성시킨 후, 상기 (q), (r), (s) 또는 (t)에 나타내는 DNA에 추가하여 상기 (u), (v), (w) 또는 (x)에 나타내는 DNA를 형질전환법에 의해 도입하여 얻어진 미생물 또는 그 배양물의 처리물을 이용하여 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 갈산으로 전환하는 것을 특징으로 하는 갈산의 제조법.
(9) 추가로 상기 테레프탈산염을 하기 공정 (A)∼(D)에 의해 얻는 공정을 포함하는 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
(A) 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 주성분으로 하고 이물성분을 포함하는 폴리에스테르 폐기물을 수산화칼륨을 포함하는 에틸렌글리콜 반응용매 혹은 수산화칼륨 및 수산화나트륨 양쪽을 포함하는 에틸렌글리콜 반응용매 중에서 100℃ 내지 196℃ 사이에서 10분간 이상 가열하는 것에 의해 반응액 중의 수분을 증발시킴과 함께, 그 폐기물에 포함되는 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 해중합하는 공정,
(B) 공정 (A)에서 얻어진 그 폐기물의 해중합반응용액 중에 포함되는 고형이물 중, 그 용액에 부유하는 고형이물을 부유선별법에 의해 제거하는 공정,
(C) 공정 (B)의 처리를 한 그 용액으로부터 부유 고형이물 이외의 그 용액 중의 고형물을 고액분리법에 의해 회수하는 공정,
(D) 공정 (C)에 의해 회수한 고형물에 대해 가열건조처리 또는 감압건조처리 또는 원심분리처리를 하는 것에 의해 그 고형물 내 글리콜류의 함량을 감소시키고 잔존하는 고형물을 테레프탈산염으로서 얻는 공정.
(10) 상기 공정 (C)에 있어서 고액분리법으로 고형물을 회수한 후의 에틸렌글리콜 반응용매를 회수하고 그 용매를 상기 (A)에서의 에틸렌글리콜 반응용매로서 이용하는 것을 특징으로 하는 (9)에 기재된 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
(11) 추가로 상기 테레프탈산염을 상기 공정 (A)∼(D)에 의해 얻는 공정을 포함하는 (5) 또는 (6)에 기재된 프로토카테큐산의 제조법.
(12) 상기 공정 (C)에 있어서 고액분리법으로 고형물을 회수한 후의 에틸렌글리콜 반응용매를 회수하고 그 용매를 상기 공정 (A)에서의 에틸렌글리콜 반응용매로서 이용함으로써 에틸렌글리콜 반응용매를 폐기하지 않고 반복 이용하는 것에 의해 얻어지는 테레프탈산염을 이용하는 것을 특징으로 하는 (11)에 기재된 프로토카테큐산의 제조법.
(13) 추가로 상기 테레프탈산염을 상기 공정 (A)∼(D)에 의해 얻는 공정을 포함하는 (7) 또는 (8)에 기재된 갈산의 제조법.
(14) 상기 공정 (C)에 있어서 고액분리법으로 고형물을 회수한 후의 에틸렌글리콜 반응용매를 회수하고 그 용매를 상기 공정 (A)에서의 에틸렌글리콜 반응용매로서 이용함으로써 에틸렌글리콜 반응용매를 폐기하지 않고 반복 이용하는 것에 의해 얻어지는 테레프탈산염을 이용하는 것을 특징으로 하는 (13)에 기재된 갈산의 제조법.
(15) 상기 (1) 또는 (4)에 기재된 미생물이 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 발현량을 증강시키는 것에 의해 상기 공정 (A) 내지 (D)에 의해 얻어지는 테레프탈산염에 혼입되는 에틸렌글리콜을 분해하는 미생물인 (9) 또는 (10)에 기재된 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
(16) 상기 (5)에 기재된 미생물이 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 발현량을 증강시키는 것에 의해 상기 공정 (A) 내지 (D)에 의해 얻어지는 테레프탈산염에 혼입되는 에틸렌글리콜을 분해하는 미생물인 (11) 또는 (12)에 기재된 프로토카테큐산의 제조법.
(17) 상기 (7)에 기재된 미생물이 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 발현량을 증강시키는 것에 의해 상기 공정 (A) 내지 (D)에 의해 얻어지는 테레프탈산염에 혼입되는 에틸렌글리콜을 분해하는 미생물인 (13) 또는 (14)에 기재된 갈산의 제조법.
(18) 추가로 상기 테레프탈산염을 하기 공정 (E)∼(H)에 의해 얻는 공정을 포함하는 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
(E) 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 주성분으로 하고 이물성분을 포함하는 폴리에스테르 폐기물을 수산화칼륨을 포함하는 1-부탄올 반응용매 혹은 수산화칼륨 및 수산화나트륨 양쪽을 포함하는 1-부탄올 반응용매 중에서 100℃ 내지 116℃ 사이에서 10분간 이상 가열하는 것에 의해 반응액 중의 수분을 증발시킴과 함께, 그 폐기물에 포함되는 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 해중합하는 공정,
(F) 공정 (E)에서 얻어진 그 폐기물의 해중합반응용액 중에 포함되는 고형이물 중, 그 용액에 부유하는 고형이물을 부유선별법에 의해 제거하는 공정,
(G) 공정 (F)의 처리를 한 그 용액으로부터 부유 고형이물 이외의 그 용액 중의 고형물을 고액분리법에 의해 회수하는 공정,
(H) 공정 (G)에 의해 회수한 고형물에 대해 가열건조처리 또는 감압건조처리 또는 원심분리처리를 하는 것에 의해 그 고형물 내 1-부탄올 및 글리콜류의 함량을 감소시키고 잔존하는 고형물을 테레프탈산염으로서 얻는 공정.
(19) 상기 공정 (G)에서 고액분리법으로 고형물을 회수한 후의 1-부탄올 반응용매를 회수하고 그 용매를 상기 공정 (E)에서의 1-부탄올 반응용매로서 이용함으로써 에틸렌글리콜 반응용매를 폐기하지 않고 반복 이용하는 것에 의해 얻어지는 테레프탈산염을 이용하는 것을 특징으로 하는 (18)에 기재된 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
(20) 추가로 상기 테레프탈산염을 상기 공정 (E)∼(H)에 의해 얻는 공정을 포함하는 (5) 또는 (6)에 기재된 프로토카테큐산의 제조법.
(21) 상기 공정 (G)에서 고액분리법으로 고형물을 회수한 후의 1-부탄올 반응용매를 회수하고 그 용매를 상기 공정 (E)에서의 1-부탄올 반응용매로서 이용함으로써 에틸렌글리콜 반응용매를 폐기하지 않고 반복 이용하는 것에 의해 얻어지는 테레프탈산염을 이용하는 것을 특징으로 하는 (20)에 기재된 프로토카테큐산의 제조법.
(22) 추가로 상기 테레프탈산염을 상기 공정 (E)∼(H)에 의해 얻는 공정을 포함하는 (7) 또는 (8)에 기재된 갈산의 제조법.
(23) 상기 공정 (G)에서 고액분리법으로 고형물을 회수한 후의 1-부탄올 반응용매를 회수하고 그 용매를 상기 공정 (E)에서의 1-부탄올 반응용매로서 이용함으로써 에틸렌글리콜 반응용매를 폐기하지 않고 반복 이용하는 것에 의해 얻어지는 테레프탈산염을 이용하는 것을 특징으로 하는 (22)에 기재된 갈산의 제조법.
(24) 상기 미생물이 에스케리키아 콜리인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (23) 중 어느 하나에 기재된 제조법.
본 발명에 의하면, 몰환산으로 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 0.5배량 이상이며 2배량 이하인 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 원료로 했을 때, 미생물을 이용하여 TPA-DHD를 효율적으로 제조할 수 있다. 또한 본 발명에 의하면, 얻어진 TPA-DHD를 프로토카테큐산이나 갈산으로 효율적으로 변환할 수 있다. 그리고 폐기 폴리에스테르의 해중합에 의해 미생물에 의한 테레프탈산 유도체의 원료에 적합한 테레프탈산칼륨염을 효율적으로 조제할 수 있다.
도 1은 테레프탈산으로부터 TPA-DHD를 경유하여 프로토카테큐산 및 갈산을 생산하는 경로를 나타내는 도.
도 2는 수산화칼륨 및/또는 수산화나트륨을 함유하는 에틸렌글리콜 용매 중에서 폐기 PET를 해중합했을 때의 테레프탈산 생성속도를 나타내는 그래프.
도 3은 과립상 수산화칼륨 또는 수산화칼륨 수용액을 함유하는 에틸렌글리콜 용매 중에서 해중합했을 때의 테레프탈산 생성속도를 나타내는 그래프.
이하에 본 발명을 상세하게 설명한다.
미생물에 의한 화합물 제조의 원료로 이용하는 테레프탈산의 형태로는 테레프탈산 자체보다 테레프탈산염인 것이 수용성이 높기 때문에 일반적으로 테레프탈산염이 바람직하다. 이러한 목적으로 이용하는 테레프탈산염으로는 테레프탈산2칼륨염, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염, 테레프탈산1-칼륨4-암모늄염, 테레프탈산2나트륨염, 테레프탈산1-나트륨4-암모늄염, 및 테레프탈산2암모늄염을 들 수 있다.
여기서 테레프탈산2칼륨염이란 테레프탈산의 1위치와 4위치의 카복실기잔기가 칼륨 이온과 이온결합한 염이다.
테레프탈산1-칼륨4-나트륨염이란 테레프탈산의 1위치의 카복실기잔기가 칼륨 이온과 이온결합하고 또 테레프탈산의 4위치의 카복실기잔기가 나트륨 이온과 이온결합한 염이다.
테레프탈산1-칼륨4-암모늄염이란 테레프탈산의 1위치의 카복실기잔기가 칼륨 이온과 이온결합하고 또 테레프탈산의 4위치의 카복실기잔기가 암모늄 이온과 이온결합한 염이다.
테레프탈산2나트륨염이란 테레프탈산의 1위치와 4위치의 카복실기잔기가 나트륨 이온과 이온결합한 염이다.
테레프탈산1-나트륨4-암모늄염이란 테레프탈산의 1위치의 카복실기잔기가 나트륨 이온과 이온결합하고 또 테레프탈산의 4위치의 카복실기잔기가 암모늄 이온과 이온결합한 염이다.
테레프탈산2암모늄이란 테레프탈산의 1위치와 4위치의 카복실기잔기가 암모늄 이온과 이온결합한 염이다.
테레프탈산2칼륨염, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염, 테레프탈산1-칼륨4-암모늄염, 테레프탈산2나트륨염, 테레프탈산1-나트륨4-암모늄염 및 테레프탈산2암모늄염은 각각 테레프탈산 분말에 대해 몰비로 2배량의 수산화칼륨, 몰비로 1배량의 수산화칼륨과 1배량의 수산화나트륨, 몰비로 1배량의 수산화칼륨과 1배량의 암모니아를 포함하는 암모니아 수용액, 몰비로 2배량의 수산화나트륨, 몰비로 1배량의 수산화나트륨과 1배량의 암모니아를 포함하는 암모니아 수용액 및 몰비로 2배량의 암모니아를 포함하는 암모니아 수용액을 적당량의 물에 첨가한 후 가열하면서 교반하는 것에 의해 각 테레프탈산염의 수용액을 얻을 수 있다. 테레프탈산염의 분말은 테레프탈산염의 수용액에 대해 가열건조처리, 감압건조처리 또는 결정화 처리를 하여 얻을 수 있다.
본 발명에서 이용하는 테레프탈산염이란 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염이다. 보다 바람직하게는 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.6배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염이다.
여기서 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 양으로 규정하는 칼륨은 테레프탈산칼륨염에서 유래되는 칼륨, 즉 테레프탈산의 카복실기잔기와 이온결합을 형성하고 있는 칼륨의 양이다. 즉, 미정제 테레프탈산염을 사용하는 경우, 그 중에 불순물로서 수산화칼륨 등에서 유래되는 칼륨이 포함되어 있었다고 해도 그것을 제외하고 칼륨의 양을 계산한다.
반응 시에는 수성용매 중에 테레프탈산칼륨염에서 유래되는 칼륨(이온)이 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 양 포함되어 있으면 된다.
테레프탈산염으로는 테레프탈산염의 분말, 테레프탈산염을 용해한 수용액 또는 그 테레프탈산염의 수용액에 테레프탈산염의 분말이 슬러리 상태로 혼재하는 테레프탈산염의 현탁액 모든 형태를 본 발명에서 이용할 수 있다. 이하 테레프탈산염에 대해서는 특별한 기재가 없는 한 모든 형태의 테레프탈산염을 포함하는 것으로 한다.
바람직하게는 본 발명에서는 테레프탈산2칼륨염, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염, 테레프탈산1-칼륨4-암모늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종류 이상의 테레프탈산칼륨염을 포함하는 테레프탈산염이고, 또 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 이용할 수 있다.
본 발명에서는 테레프탈산2칼륨염, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염 및 테레프탈산1-칼륨4-암모늄염에서 선택되는 테레프탈산염을 단일 성분으로 하는 테레프탈산염을 이용해도 된다.
한편 본 발명에서 이용하는 테레프탈산염은 상기 칼륨 함량을 만족시키는 한 상기 테레프탈산칼륨염에 더하여 테레프탈산2나트륨염, 테레프탈산1-나트륨4-암모늄염 및 테레프탈산2암모늄염 등을 포함해도 된다.
예를 들어 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염과 테레프탈산2나트륨염의 2종류의 테레프탈산염의 혼합물을 이용하는 경우, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염을 테레프탈산2나트륨염에 대해 몰비로 1배량 이상 함유하는 테레프탈산염을 이용할 수 있다.
또 테레프탈산2칼륨염과 테레프탈산2나트륨염의 2종류의 테레프탈산염의 혼합물을 이용하는 경우, 테레프탈산2칼륨염을 테레프탈산2나트륨염에 대해 몰비로1/3배량 이상 함유하는 테레프탈산염을 이용할 수 있다.
본 발명에서는 3종류 이상의 테레프탈산염의 혼합물을 이용할 수도 있지만, 이 경우에도 그 혼합물이 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함할 필요가 있다. 바람직하게는 테레프탈산2칼륨염, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염, 테레프탈산1-칼륨4-암모늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종류 이상의 테레프탈산칼륨염과 테레프탈산2나트륨염, 테레프탈산1-나트륨4-암모늄염 및 테레프탈산2암모늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 2종류 이상의 테레프탈산염을 포함하는 테레프탈산염을 이용할 수 있다. 그 구체예로는 테레프탈산2칼륨염, 테레프탈산2나트륨염 및 테레프탈산2암모늄염을 몰비로 1:2:1의 비율로 혼합하여 제작한 수용액을 들 수 있다. 그 수용액은 전테레프탈산에 대해 0.5배량의 칼륨을 포함하고 테레프탈산 1몰에 대해 0.5몰의 수산화칼륨, 1.0몰의 수산화나트륨 및 0.5몰의 암모니아를 물에 첨가하여 용해시키는 것에 의해서도 얻을 수 있다.
본 발명에서는 수산화칼륨 혹은 수산화칼륨 및 수산화나트륨의 혼합물을 포함하는 에틸렌글리콜 용매 또는 1-부탄올 용매 중에서 폐기 폴리에스테르를 해중합하는 것에 의해 얻어지는 테레프탈산2칼륨염 또는 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염을 포함하는 테레프탈산염을 미생물에 의한 화합물제조의 원료로서 이용할 수 있다.
이 경우, 몰당 가격이 수산화칼륨보다 수산화나트륨이나 암모니아수가 싸기 싸기 때문에, 폐기 폴리에스테르의 해중합에 의해 얻어지는 테레프탈산염에 대해 고순도 테레프탈산 및 수산화나트륨 또는 암모니아수를 첨가하여 생성하는 테레프탈산염을 이용하는 것이 제조 비용이 낮아지는 경우가 있다. 그 구체예로는 예를 들어 폐기 폴리에스테르의 해중합에 의해 얻어지는 테레프탈산2칼륨염, 고순도 테레프탈산 및 암모니아수를 각각 몰비로 6:4:8의 비율로 혼합하여 얻어지는 테레프탈산염의 수용액을 이용하는 것을 들 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 테레프탈산염의 수용액은 테레프탈산2칼륨염과 테레프탈산2암모늄염을 몰비로 6:4의 비율로 혼합하여 제작한 수용액과 동등하다.
본 발명에서 개시하는 방법을 이용하여 폐기 폴리에스테르로부터 테레프탈산칼륨염을 조제한 경우, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 암모늄 이온 이외에 이물로서 칼슘 이온이나 리튬 이온 등의 다른 금속 이온이 혼입되는 경우도 있다. 이 경우, 본 발명에서 이용하는 테레프탈산염에 대해서는 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염이라면, 테레프탈산 칼슘염이나 테레프탈산 리튬염 등의 테레프탈산염이 그 함유율이 낮다면 혼입되어도 상관없다.
본 발명에 있어서 테레프탈산으로부터 TPA-DHD, 프로토카테큐산 및 갈산을 제조하는 공정을 설명한다. 도 1에 나타내는 바와 같이 테레프탈산은 테레프탈산1,2-디옥시게나아제에 의해 산화되어 TPA-DHD로 전환된다. 그리고 TPA-DHD 디히드로게나아제에 의해 TPA-DHD를 프로토카테큐산으로 전환할 수 있다. 그리고 파라히드록시벤조산 히드록실라아제 혹은 개량형 파라히드록시벤조산 히드록실라아제(예를 들어 파라히드록시벤조산 히드록실라아제의 199위치의 류신 또는 200위치의 류신을 발린 또는 글리신으로 치환하고 또 385위치 또는 386위치의 티로신을 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌으로 치환한 변이체)에 의해 프로토카테큐산을 갈산으로 전환할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 테레프탈산1,2-디옥시게나아제는 옥시게나아제 컴포넌트와 리덕타아제 컴포넌트로 이루어진다. 또 옥시게나아제 컴포넌트는 대소 2개의 서브유닛으로 이루어진다. 옥시게나아제 대서브유닛 단백질로는 예를 들어 서열번호 2로 나타내는 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testeroni) 72W2주 유래의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 들 수 있다. 이 균주는 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터(NPMD)(292-0818 일본 치바현 기사라즈시 가즈사가마타리 2-5-8)에 2012년 1월 24일자로 수령번호 NITE BP-1209로 국제기탁되었으며 분양받을 수 있다. 또한 본 발명에서 이용되는 옥시게나아제 대서브유닛 단백질로는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며 또한 테레프탈산으로부터 TPA-DHD로의 전환에 관련되는 기능을 가지는 단백질을 들 수 있다. 또 그 단백질로서 서열번호 2의 아미노산 서열과 75% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지고 또한 테레프탈산으로부터 TPA-DHD로의 전환에 관련되는 기능을 가지는 단백질을 들 수 있다. 여기서 "테레프탈산으로부터 TPA-DHD로의 전환에 관련되는 기능"이란 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질과 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질과 함께 테레프탈산과 반응시켰을 때 TPA-DHD를 생성할 수 있는 기능을 의미한다.
테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질로는 예를 들어 서열번호 4로 나타내는 상기한 코마모나스 테스토스테로니 72W2주 유래의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 들 수 있다. 또 본 발명에서 이용되는 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질로는 서열번호 4의 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로부터 이루어지고 또한 테레프탈산으로부터 TPA-DHD로의 전환에 관련되는 기능을 가지는 단백질을 들 수 있다. 또 그 단백질로서 서열번호 4의 아미노산 서열과 75% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지고 또한 테레프탈산으로부터 TPA-DHD로의 전환에 관련되는 기능을 가지는 단백질을 들 수 있다. 여기서 "테레프탈산으로부터 TPA-DHD로의 전환에 관련되는 기능"이란 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 대서브유닛 단백질과 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질과 함께 테레프탈산과 반응시켰을 때 TPA-DHD를 생성할 수 있는 기능을 의미한다.
본 발명에서 이용되는 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질로는 예를 들어 서열번호 6으로 나타내는 상기한 코마모나스 테스토스테로니 72W2주 유래의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 들 수 있다. 또 본 발명에서 이용되는 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질로는 서열번호 6의 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고 또한 테레프탈산으로부터 TPA-DHD로의 전환에 관련되는 기능을 가지는 단백질을 들 수 있다. 또 그 단백질로서 서열번호 6의 아미노산 서열과 75% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지고 또한 테레프탈산으로부터 TPA-DHD로의 전환에 관련되는 기능을 가지는 단백질을 들 수 있다. 여기서 "테레프탈산으로부터 TPA-DHD로의 전환에 관련되는 기능"이란 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 대서브유닛 단백질과 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질과 함께 테레프탈산과 반응시켰을 때 TPA-DHD를 생성할 수 있는 기능을 의미한다.
본 발명에서 이용되는 테레프탈산트랜스포터 단백질로는 예를 들어 서열번호 8로 나타내는 로도코커스 죠스티(Rhodococcus jostii) RHA1주 유래의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 들 수 있다. 또 본 발명에서 이용되는 테레프탈산트랜스포터 단백질로는 서열번호 8의 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고 또한 테레프탈산의 세포내 수송능을 가지는 단백질을 들 수 있다. 또 그 단백질로서 서열번호 8의 아미노산 서열과 75% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지고 또한 테레프탈산을 세포 내에 수송하는 활성을 가지는 단백질을 들 수 있다.
본 발명에서 이용되는 TPA-DHD 디히드로게나아제 단백질로는 예를 들어 서열번호 10으로 나타내는 상기한 코마모나스 테스토스테로니 72W2주 유래의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 들 수 있다. 또, 본 발명에서 이용되는 TPA-DHD 디히드로게나아제 단백질로는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고 또한 TPA-DHD를 프로토카테큐산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질을 들 수 있다. 또 그 단백질로서 서열번호 10의 아미노산 서열과 75% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지고 또한 TPA-DHD를 프로토카테큐산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질을 들 수 있다.
본 발명에서 이용되는 파라히드록시벤조산 히드록실라아제로는 예를 들어 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) PAO주의 GenBank(이하 GenBank를 GB라 약칭함) GB등록번호 AAG03636의 단백질 또는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT2440주의 GB등록번호 AAN69138의 단백질, 또는 서열번호 12로 나타내는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032주 유래의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 들 수 있다. 또 본 발명에서 이용되는 파라히드록시벤조산 히드록실라아제 단백질로는 서열번호 12의 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고 또한 프로토카테큐산을 갈산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질을 들 수 있다. 특히 GB등록번호 AAG03636의 199위치의 류신을 발린 또는 글리신으로 치환하고 또한 385위치의 티로신을 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌으로 치환한 변이체, GB등록번호 AAN69138의 199위치의 류신을 발린 또는 글리신으로 치환하고 또한 386위치의 티로신을 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌으로 치환한 변이체, 또는 GB등록번호 BAB98470의 200위치의 류신을 발린 또는 글리신으로 치환하고 또한 385위치의 티로신을 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌으로 치환한 변이체를 이용하는 것이 바람직하다. 또 그 단백질로서 서열번호 12의 아미노산 서열과 75% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지고 또한 프로토카테큐산을 갈산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질을 들 수 있다.
본 발명에서 이용되는 락토알데히드 리덕타아제로는 예를 들어 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) K-12주의 GB등록번호 AAB40449의 단백질을 들 수 있다. 또 본 발명에서 이용되는 락토알데히드 리덕타아제 단백질로는 GB등록번호 AAB40449의 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고 또한 에틸렌글리콜을 글리코알데히드로 전환하는 활성을 가지는 단백질을 들 수 있다. 또 그 단백질로서 GB등록번호 AAB40449의 아미노산 서열과 75% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지고 또한 에틸렌글리콜을 글리코알데히드로 전환하는 활성을 가지는 단백질을 들 수 있다.
본 발명에서 이용되는 락토알데히드 디히드로게나아제로는 예를 들어 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) K-12주의 GB등록번호 AAC74497의 단백질을 들 수 있다. 또 본 발명에서 이용되는 락토알데히드 디히드로게나아제 단백질로는 GB등록번호 AAC74497의 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고 또한 글리코알데히드를 글리콜산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질을 들 수 있다. 또 그 단백질로서 GB등록번호 AAC74497의 아미노산 서열과 75% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지고 또한 글리코알데히드를 글리콜산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질을 들 수 있다.
이 균주는 ATCC, 독립행정법인 제품기반기술기반기구 생물유전자원부문(이하 NBRC라 약칭함), 독립행정법인 이화학연구 츠쿠바연구소 바이오리소스센터, 국립유전학연구소 내셔널바이오리소스프로젝트(이하 NBRP라 약칭함) 또는 더 콜리 제네틱 스톡 센터(The Coli Genetic Stock Center; 이하 필요에 따라 CGSC라 약칭함) 등에서 입수할 수 있다.
상기한 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 대서브유닛 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질, TPA-DHD 디히드로게나아제 단백질, 테레프탈산트랜스포터 단백질, 락토알데히드 리덕타아제 단백질, 락토알데히드 디히드로게나아제 단백질에 있어서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고 각각의 목적효소활성을 가지는 단백질은 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)(이하 몰레큘러 클로닝 제2판이라 약칭), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)(이하 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지라고 약칭), Nucleic Acids Res., 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Res., 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 488 (1985) 등에 기재된 부위특이적 변이도입법을 이용하여 각 단백질에서 특정 위치에 결실, 치환 혹은 부가가 도입되도록 DNA에 부위특이적 변이를 도입하는 것에 의해 취득할 수 있다. 결실, 치환 또는 부가되는 1 또는 몇 개라고 하는 아미노산의 수는 개개의 효소활성이 유지되는 한 특별히 한정되지 않지만 원래의 아미노산 서열과 차이가 나는 개수 이내인 것이 바람직하고, 1∼20개가 바람직하며, 1∼10개가 보다 바람직하며, 1∼5개가 특히 바람직하다.
본 발명에서 이용되는 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 대서브유닛 단백질을 코딩하는 DNA로는 예를 들어 서열번호 1로 나타내는 염기서열을 가지는 DNA를 들 수 있다.
본 발명에서 이용되는 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질을 코딩하는 DNA로는 예를 들어 서열번호 3으로 나타내는 염기서열을 가지는 DNA를 들 수 있다.
본 발명에서 이용되는 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질을 코딩하는 DNA로는 예를 들어 서열번호 5로 나타내는 염기서열을 가지는 DNA를 들 수 있다.
본 발명에서 이용되는 테레프탈산트랜스포터 단백질을 코딩하는 DNA로는 예를 들어 서열번호 7로 나타내는 염기서열을 가지는 DNA를 들 수 있다.
본 발명에서 이용되는 TPA-DHD 디히드로게나아제 단백질을 코딩하는 DNA로는 예를 들어 서열번호 9로 나타내는 염기서열을 가지는 DNA를 들 수 있다.
본 발명에서 이용되는 파라히드록시벤조산 히드록실라아제 단백질을 코딩하는 DNA로는 예를 들어 서열번호 11로 나타내는 염기서열을 가지는 DNA를 들 수 있다.
본 발명에서 이용되는 락토알데히드 리덕타아제 단백질을 코딩하는 DNA로는 예를 들어 GB등록번호 U2958의 13420번째에서 14571번째까지의 염기서열을 가지는 DNA를 들 수 있다.
본 발명에서 이용되는 락토알데히드 디히드로게나아제 단백질을 코딩하는 DNA로는 예를 들어 GB등록번호 NC_000913의 1486256번째에서 1487695번째까지의 염기서열을 가지는 DNA를 들 수 있다.
본 발명에 사용하는 DNA에는 각 DNA가 코딩하는 단백질이 목적의 효소활성을 잃지 않는 범위 내에서 치환 변이, 결실 변이, 삽입 변이 등의 변이가 도입된 DNA, 예를 들어 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11로 표시되는 DNA의 전부 혹은 일부를 프로브로 하여 하이브리다이제이션법에 따라 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA도 포함한다. 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA라는 것은 구체적으로는 DNA를 고정화한 필터를 이용하여 0.7∼1.0M의 NaCl의 존재하에서 65℃에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1배 농도에서 2배 농도까지 사이의 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은 150mM NaCl, 15mM 시트르산나트륨이다) 중 65℃에서 필터를 세정하는 것에 의해 동정할 수 있는 DNA를 의미한다. 또한 하이브리다이제이션의 실험법은 몰레큘러 클로닝: 어 라보라토리 매뉴얼(Molecular Cloning, A laboratory manual), 제2판〔샘브룩(Sambrook), 프리치(Fritsch), 마니아티스(Maniatis) 편집, 콜드 스프링 하버 라보라토리 프레스(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 1989년 간행〕에 기재되어 있다.
테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 원료로 하여 TPA-DHD를 생산하기 위해 이용되는 본 발명에 사용하는 미생물로는 상기 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 대서브유닛을 코딩하는 DNA, 상기 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛을 코딩하는 DNA 및 상기 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 리덕타아제를 코딩하는 DNA를 가지고 또 테레프탈산으로부터 TPA-DHD를 생산하는 능력을 가지는 미생물이라면 어떤 미생물이든 이용할 수 있다. 즉 상기 (1)에 기재된 DNA를 가지고 또 테레프탈산으로부터 TPA-DHD를 생산하는 능력을 가지는 미생물을 이용할 수 있다. 이러한 성질을 가지는 미생물은 상기 (1)에 기재한 DNA 중 1개 이상의 DNA를 재조합 기술을 이용하여 숙주세포에 도입하여 얻은 형질전환체여도 된다.
또 상기 미생물을 이용하고 테레프탈산염을 원료로 하여 TPA-DHD를 생산할 때, 그 미생물에 테레프탈산트랜스포터를 코딩하는 DNA를 가지고 또 테레프탈산의 수송능이 증강된 미생물을 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 성질을 가지는 미생물은 상기 (1)에 기재한 DNA 중 1개 이상의 DNA에 더하여 상기 (4)에 기재한 DNA 중 1개 이상의 DNA를 재조합 기술을 이용하여 숙주세포에 도입하여 얻은 형질전환체여도 된다.
프로토카테큐산의 생산에 이용되는 본 발명에 사용하는 미생물로는 상기한 테레프탈산으로부터 TPA-DHD를 생산하는 능력에 더하여 TPA-DHD 디히드로게나아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA를 가지고 또 TPA-DHD로부터 프로토카테큐산을 생산하는 능력을 가지는 미생물이라면 어떤 미생물이든 이용할 수 있다. 즉 상기 (5)에 기재한 DNA를 가지고 또 TPA-DHD로부터 프로토카테큐산을 생산하는 능력을 가지는 상기 (1) 또는 (4)에 기재된 미생물을 이용할 수 있다. 이러한 성질을 가지는 미생물은 상기 (1)에 기재한 DNA 중 1개 이상의 DNA에 더하여 상기 (5)에 기재한 DNA 중 1개 이상의 DNA를 재조합 기술을 이용하여 숙주세포에 도입하여 얻은 형질전환체여도 된다. 또 상기 미생물을 이용하고 테레프탈산염을 원료로서 프로토카테큐산을 생산할 때, 그 미생물에 테레프탈산트랜스포터를 코딩하는 DNA를 가지고 또 테레프탈산의 수송능이 증강된 미생물을 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 성질을 가지는 미생물은 상기 (1) 및 (4)에 기재한 DNA에 더하여 상기 (5)에 기재한 DNA 중 1개 이상의 DNA를 재조합 기술을 이용하여 숙주세포에 도입하여 얻은 형질전환체를 이용할 수 있다.
갈산의 생산에 이용되는 본 발명에 사용하는 미생물로는 상기한 테레프탈산으로부터 TPA-DHD를 생산하는 능력에 더하여 TPA-DHD 디히드로게나아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA 및 파라히드록시벤조산 히드록실라아제를 가지는 단백질을 코딩하는 DNA를 가지고 또 TPA-DHD로부터 갈산을 생산하는 능력을 가지는 미생물이라면 어떤 미생물이든 이용할 수 있다. 즉 상기 (5)에 기재된 DNA에 더하여 상기 (7)에 기재한 DNA를 가지고 또 테레프탈산으로부터 갈산을 생산하는 능력을 가지는 미생물을 이용할 수 있다. 이러한 성질을 가지는 미생물은 상기 (1) 및 (5)에 기재한 DNA 중 1개 이상의 DNA에 더하여 상기 (7)에 기재한 DNA 중 1개 이상의 DNA를 재조합 기술을 이용하여 숙주세포에 도입하여 얻은 형질전환체여도 된다. 또 상기 미생물을 이용하고 테레프탈산염을 원료로서 갈산을 생산할 때, 그 미생물에 테레프탈산트랜스포터를 코딩하는 DNA를 가지고 또 테레프탈산의 수송능이 증강된 미생물을 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 성질을 가지는 미생물은 상기 (1) 및 (4) 및 (5)에 기재한 DNA에 더하여 상기 (7)에 기재한 DNA 중 1개 이상의 DNA를 재조합 기술을 이용하여 숙주세포에 도입하여 얻은 형질전환체여도 된다.
에틸렌글리콜 용매 중에서 폴리에스테르를 해중합했을 때, 테레프탈산염에 혼입되는 에틸렌글리콜을 분해하는 본 발명에 사용하는 미생물로는 상기한 테레프탈산으로부터 TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산을 생산하는 미생물에 대해 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제로의 변이 도입, 및/또는 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 발현량 증강에 의해 에틸렌글리콜 분해능을 증강시킨 미생물을 이용할 수 있다.
이하에 DNA의 클로닝과 형질전환주의 조성방법에 대해 자세하게 서술한다.
상기한 에스케리키아 콜리 K-12주, 코마모나스 테스토스테로니 72W2주, 로도코커스 죠스티 RHA1주, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032주 등의 세균은 상기 미생물분양기관이 추천하는 배양조건 또는 통상 이용되는 공지의 방법에 의해 배양한다. 배양 후 공지의 방법(예를 들어 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지에 기재된 방법)에 의해 그 미생물의 염색체 DNA를 단리하여 정제한다. 이 염색체 DNA로부터 합성 DNA를 이용하여 하이브리다이제이션법 또는 PCR법 등에 의해 목적 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 단편을 취득할 수 있다.
목적 단백질을 코딩하는 DNA는 화학합성하는 것에 의해서도 얻을 수 있다. 그 합성 DNA는 예를 들어 코마모나스 테스토스테로니 72W2주 유래의 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 대서브유닛 단백질을 코딩하는 DNA의 서열번호 1로 나타내는 염기서열 및 코마모나스 테스토스테로니 72W2주 유래의 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질을 코딩하는 DNA의 서열번호 3으로 나타내는 염기서열 및 코마모나스 테스토스테로니 72W2주 유래의 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질을 코딩하는 DNA의 서열번호 5로 나타내는 염기서열에 기초하여 설계할 수 있다.
테레프탈산트랜스포터 단백질을 코딩하는 합성 DNA로는 로도코커스 죠스티 RHA1주의 테레프탈산트랜스포터 단백질을 코딩하는 DNA의 서열번호 7로 나타내는 염기서열에 기초하여 설계할 수 있다.
TPA-DHD 디히드로게나아제를 코딩하는 합성 DNA로는 코마모나스 테스토스테로니 72W2주의 TPA-DHD 디히드로게나아제 단백질을 코딩하는 DNA의 서열번호 9로 나타내는 염기서열에 기초하여 설계할 수 있다.
파라히드록시벤조산 히드록실라아제를 코딩하는 합성 DNA로는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032주의 파라히드록시벤조산 히드록실라아제 단백질(385번째 티로신이 페닐알라닌으로 치환한 단백질)을 코딩하는 DNA의 서열번호 11로 나타내는 염기서열에 기초하여 설계할 수 있다.
락토알데히드 리덕타아제를 코딩하는 합성 DNA로는 에스케리키아 콜리 K-12주의 락토알데히드 리덕타아제 단백질을 코딩하는 DNA의 GB등록번호 U2958의 13420번째에서 14571번째까지의 염기서열에 기초하여 설계할 수 있다.
락토알데히드 디히드로게나아제를 코딩하는 합성 DNA로는 에스케리키아 콜리 K-12주의 락토알데히드 디히드로게나아제 단백질을 코딩하는 DNA의 GB등록번호 NC_000913의 1486256번째에서 1487695번째까지의 염기서열에 기초하여 설계할 수 있다.
상기 DNA를 연결하는 벡터로는 에스케리키아 콜리 K12주 등에서 자립복제 가능한 벡터라면 플라스미드 벡터, 파지 벡터 등 모두 사용 가능하지만, 구체적으로는 pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕, pUC18, pBR322, pHelix1(로슈 다이아그노스틱스사 제조), ZAP Express〔스트라타진사 제조, Strategies, 5, 58 (1992)〕, pBluescript II SK(+)〔스트라타진사 제조, Nucleic Acids Res., 17, 9494 (1989)〕, pUC118(다카라바이오사 제조) 등을 이용할 수 있다.
이 벡터에 상기에서 취득한 DNA를 연결하여 얻어지는 재조합 DNA의 숙주에 이용하는 에스케리키아 콜리는 에스케리키아 콜리에 속하는 미생물이라면 어느 것이든 이용할 수 있지만, 구체적으로는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) XL1-Blue MRF'〔스트라진사 제조, Strategies, 5, 81 (1992)〕, 에스케리키아 콜리 C600〔Genetics, 39, 440 (1954)〕, 에스케리키아 콜리 Y1088〔Science, 222, 778 (1983)〕, 에스케리키아 콜리 Y1090〔Science, 222, 778 (1983)〕, 에스케리키아 콜리 NM522〔J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)〕, 에스케리키아 콜리 K802〔J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)〕, 에스케리키아 콜리 JM105〔Gene, 38, 275 (1985)〕, 에스케리키아 콜리 JM109, 에스케리키아 콜리 BL21 등을 들 수 있다.
로도코커스(Rhodococcus)속, 코마모나스(Comamonas)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 폴라로모나스(Polaromonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속 또는 부르콜데리아(Burkholderia)속에 속하는 미생물 중에 상기 DNA를 도입할 때에는 이들 미생물 중에서 자립복제 가능한 벡터를 이용한다. 바람직하게는 그 미생물 중 어느 하나와 에스케리키아 콜리 K12주 양쪽의 미생물 중에서 자립복제 가능한 셔틀벡터를 이용하여 재조합 DNA를 숙주가 되는 그 미생물에 도입할 수 있다.
재조합 DNA의 도입방법으로는 상기 숙주세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 이용할 수 있으며, 예를 들어 칼슘 이온을 이용하는 방법〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110(1972)〕, 일렉트로포레이션법〔Nucleic Acids Res., 16, 6127(1988)〕, 접합전달법〔J. G. C. Ottow, Ann. Rev. Microbiol., Vol. 29, p.80(1975)〕, 세포융합법〔M.H. Gabor, J. Bacteriol., Vol. 137, p.1346(1979)〕 등을 들 수 있다.
상기와 같이 하여 얻어진 형질전환체로부터 재조합 DNA를 추출하여 그 재조합 DNA에 포함되는 본 발명에 사용하는 DNA의 염기서열을 결정할 수 있다. 염기서열의 결정에는 통상 이용되는 염기서열해석방법, 예를 들어 디데옥시법〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕 또는 3730xl형 DNA 애널라이저(어플라이드 바이오시스템즈사 제조) 등의 염기서열분석장치를 이용할 수 있다.
또 상기에서 결정된 DNA의 염기서열에 기초하여 퍼셉티브 바이오시스템즈사 제조 8905형 DNA합성장치 등을 이용하여 화학합성하는 것에 의해서도 목적으로 하는 DNA를 조제할 수 있다.
상기 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 대서브유닛 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질, 테레프탈산 트랜스포터 단백질, TPA-DHD 디히드로게나아제 단백질, 파라히드록시벤조산 히드록실라아제 단백질, 락토알데히드 리덕타아제 단백질 및/또는 락토알데히드 디히드로게나아제 단백질을 발현하는 형질전환체는 하기 방법을 이용하여 상기 DNA를 숙주세포 중에서 발현시키는 것에 의해 얻어진다.
상기 단백질을 코딩하는 DNA를 이용할 때에는 필요에 따라 본 발명에 사용하는 단백질을 코딩하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제할 수 있다. 또 그 단백질을 코딩하는 부분의 염기서열을 숙주의 발현에 최적인 코돈이 되도록 염기를 치환하는 것에 의해 그 단백질의 생산율을 향상시킬 수도 있다. 본 발명에 사용하는 DNA를 발현하는 형질전환체는 상기 DNA 단편을 적당한 발현벡터의 프로모터 하류에 삽입하는 것에 의해 재조합 DNA를 제작하고 그 재조합 DNA를 그 발현벡터에 적합한 숙주세포에 도입하는 것에 의해 취득할 수 있다.
본 발명에 사용하는 단백질을 발현시키는 숙주로는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 모두 이용할 수 있다. 바람직하게는 TPA-DHD의 대사능이 없는 미생물을 이용할 수 있다. 보다 바람직하게는 TPA-DHD의 대사능이 없는 에스케리키아속의 세균 또는 슈도모나스(Pseudomonas)속의 세균을 들 수 있다. 더욱 바람직하게는 에스케리키아 콜리 K-12주 또는 슈도모나스 푸티다 KT2440주를 들 수 있다.
발현벡터로는 상기 숙주세포에 있어서 자립복제 가능 혹은 염색체 속에 도입이 가능하고 본 발명에 사용하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 이용된다.
세균 등의 원핵생물을 숙주세포로서 이용하는 경우에는, 본 발명에 사용하는 DNA를 함유하여 이루어지는 재조합 DNA는 원핵생물 중에서 자립복제 가능한 동시에 프로모터, 리보솜 결합 서열, 본 발명에 사용하는 DNA, 전사종결 서열로 구성된 재조합 DNA인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있어도 된다.
본 발명에 사용하는 단백질 또는 그 단백질과 다른 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 에스케리키아 콜리 등의 미생물에 도입하고 발현하기 위한 벡터로는 이른바 멀티카피형인 것이 바람직하고, ColE1 유래의 복제개시점을 가지는 플라스미드, 예를 들어 pUC계의 플라스미드나 pBR322계의 플라스미드 혹은 그 유도체를 들 수 있다. 여기서 "유도체"란 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위 등에 의해 플라스미드에 개변을 실시한 것을 의미한다. 또 여기서 말하는 개변이란 변이제나 UV조사 등에 의한 변이처리 혹은 자연변이 등에 의한 개변도 포함한다. 보다 구체적으로 벡터로는 예를 들어 pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕, pUC18, pBR322, pHelix1(로슈 다이아그노스틱스사 제조), pKK233-2(아마샴 파마시아 바이오텍사 제조), pSE280(인비트로젠사 제조), pGEMEX-1(프로메가사 제조), pQE-8(키아겐사 제조), pET-3(노바젠사 제조) pBluescriptII SK(+), pBluescript II KS(+)(스트라타진사 제조), pSTV28(다카라바이오사 제조), pUC118(다카라바이오사 제조) 등을 이용할 수 있다.
프로모터로는 에스케리키아 콜리 등의 숙주세포 중에서 발현할 수 있는 것이라면 어떠한 것이든 좋다. 예를 들어 trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터(Plac), PL 프로모터, PR 프로모터 등, T7 프로모터 등의 에스케리키아 콜리나 파지 등에서 유래되는 프로모터 및 tac 프로모터, lacT7 프로모터와 같이 인위적으로 설계개변된 프로모터 등, 및 슈도모나스 푸티다의 TOL 플라스미드의 XylS 단백질에 의해 제어되는 Pm 프로모터를 이용할 수 있다.
리보솜 결합 서열인 샤인달가노(Shine-Dalgarno) 서열과 개시코돈 사이를 적당한 거리(예를 들어 5∼18염기)로 조절한 플라스미드를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 사용하는 재조합 DNA에서는 본 발명에 사용하는 DNA의 발현에는 전사종결 서열은 반드시 필요한 것은 아니지만, 구조유전자의 바로 밑에 전사종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다.
재조합 DNA 기술 등을 이용하여 상기 어느 하나 이상의 단백질의 생산량이 친주와 비교하여 증강된 미생물을 조성하고 TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산의 생산량을 높일 수 있다. 구체적으로는 상기 어느 하나의 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키기 위한 프로모터로서 천연 프로모터보다 전사활성이 강한 프로모터를 이용하거나 또는 그 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 종결하기 위한 터미네이터로서 천연 터미네이터보다 전사종결활성이 강한 터미네이터를 이용하거나 또는 발현벡터로서 고카피수 벡터를 이용하는 것, 상동재조합으로 염색체상에 도입하는 것 등을 들 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 대서브유닛 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질 및 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질을 발현하고 있는 미생물을 이용함으로써 테레프탈산염으로부터 TPA-DHD를 제조할 수 있다. 예를 들어 그 미생물을 액체배지에서 배양한 후, 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 그 미생물의 배양액에 0.1mM∼1M의 농도가 되도록 더하는 것에 의해 TPA-DHD를 생성, 축적시켜 그 배양액으로부터 TPA-DHD를 채취할 수 있다. 본 발명에 사용하는 미생물을 배지에 배양하는 방법은 미생물의 배양에 이용되는 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다.
또 상기 미생물을 배양한 후, 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 포함하는 수성매체 중에 그 미생물의 배양균체 혹은 그 배양균체의 처리물을 첨가하는 것에 의해 TPA-DHD를 생성, 축적시켜 그 매체로부터 TPA-DHD를 채취하는 것에 의해서도 TPA-DHD를 제조할 수 있다.
테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 대서브유닛 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질 및 TPA-DHD 디히드로게나아제를 발현하고 있는 미생물을 이용함으로써 테레프탈산염으로부터 프로토카테큐산을 제조할 수 있다. 예를 들어 그 미생물을 액체배지에서 배양한 후, 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 그 미생물의 배양액에 0.1mM∼1M의 농도가 되도록 더하는 것에 의해 프로토카테큐산을 생성, 축적시켜 그 배양액으로부터 프로토카테큐산을 채취할 수 있다. 본 발명에 사용하는 미생물을 배지에 배양하는 방법은 미생물의 배양에 이용되는 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다.
또 상기 미생물을 배양한 후, 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 포함하는 수성매체 중에 그 미생물의 배양균체 혹은 그 배양균체의 처리물을 첨가하는 것에 의해 프로토카테큐산을 생성, 축적시켜 그 매체로부터 프로토카테큐산을 채취하는 것에 의해서도 프로토카테큐산을 제조할 수 있다.
또 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 테레프탈산염으로부터 TPA-DHD를 생성시킨 후, 상기 (q), (r), (s) 또는 (t)에 나타내는 DNA를 형질전환법에 의해 도입하여 얻어진 다른 미생물의 배양물 또는 그 배양물의 처리물을 이용하여 TPA-DHD를 프로토카테큐산으로 전환하고 그 배양액 또는 그 매체로부터 프로토카테큐산을 채취하는 것에 의해서도 프로토카테큐산을 제조할 수 있다.
테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 대서브유닛 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질, TPA-DHD 디히드로게나아제 및 파라히드록시벤조산 히드록실라아제를 발현하고 있는 미생물을 이용함으로써 테레프탈산염으로부터 갈산을 제조할 수 있다. 예를 들어 그 미생물을 액체배지에서 배양한 후, 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 그 미생물의 배양액에 0.1mM∼1M의 농도가 되도록 더하는 것에 의해 갈산을 생성, 축적시켜 그 배양액으로부터 갈산을 채취할 수 있다. 본 발명에 사용하는 미생물을 배지에 배양하는 방법은 미생물의 배양에 이용되는 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다.
또 상기 미생물을 배양한 후, 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 포함하는 수성매체 중에 그 미생물의 배양균체 혹은 그 배양균체의 처리물을 첨가하는 것에 의해 갈산을 생성, 축적시켜 그 매체로부터 갈산을 채취하는 것에 의해서도 갈산을 제조할 수 있다.
또 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 테레프탈산염으로부터 TPA-DHD를 생성시킨 후, 상기 (q), (r), (s) 또는 (t)에 나타내는 DNA 및 상기 (u), (v), (w) 또는 (x)에 나타내는 DNA를 형질전환법에 의해 도입하여 얻어진 다른 미생물의 배양물 또는 그 배양물의 처리물을 이용하여 TPA-DHD를 갈산으로 전환하고 그 배양액 또는 그 매체로부터 갈산을 채취하는 것에 의해서도 갈산을 제조할 수 있다.
테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염은 테레프탈산2칼륨염, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염 및 테레프탈산1-칼륨4-암모늄염 등의 테레프탈산칼륨염을 포함하는 순도가 높은 테레프탈산염을 이용해도 되지만, 폐기 폴리에스테르로부터 얻은 것이어도 된다.
이하에 폐기 폴리에스테르로부터 미생물에 의한 화합물제조의 원료로서 이용하는 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 얻는 방법을 말한다.
폐기 폴리에스테르의 형상으로는 용기, 필름, 시트, 부품, 섬유, 입상분쇄물, 분상분쇄물 등 어떠한 형상이든 이용할 수 있다. 이러한 폴리에스테르를 주성분(주성분이란 예를 들어 80% 이상의 PET 및/또는 PTT 및/또는 PBT를 포함하는 것을 말한다)으로 하고 이물성분(이물성분이란 예를 들어 폴리에틸렌이나 폴리프로필렌을 들 수 있다)을 포함하는 폴리에스테르 폐기물을 수집한다. 필요에 따라 금속이나 폴리에스테르 이외의 플라스틱 등의 이물을 제거한 후, 분쇄기에 의해 폴리에스테르 폐기물을 분쇄한다. 폴리에스테르 폐기물의 분쇄물로는 페트병 리사이클 업자에 의해 가공처리된 페트병 플레이크를 출발원료로 이용할 수도 있다. 이와 같이 하여 얻어진 폴리에스테르 폐기물의 분쇄물을 비중분별법, 자석에 의한 금속분리법, 물에 의한 세정법 또는 물에서의 부유이물제거법 등으로 처리하는 것에 의해 금속, 유리, 돌, 식품이나 음료수 잔사, 폴리에스테르 이외의 플라스틱 및 폴리에틸렌이나 폴리프로필렌 시트 등의 이물·협잡물을 폴리에스테르 파쇄물에서 분리한다.
이와 같이 하여 얻어진 폴리에스테르 파쇄물을 칭량하여 테레프탈산의 함유량(몰수)을 측정한 후, 금속성 반응솥에 넣는다. 그리고 수산화칼륨 또는 수산화칼륨과 수산화나트륨의 혼합물 및 에틸렌글리콜 또는 1-부탄올 중 어느 한 쪽의 반응용매를 반응솥에 첨가한 후 적절한 시간만큼 가열하는 것에 의해 폴리에스테르 파쇄물의 해중합 반응을 한다. 해중합 반응의 용액 중에 적당량의 물이 포함되는 것이 반응이 빨리 진행되는데다가 회수할 수 있는 테레프탈산염의 수율도 향상된다.
첨가하는 수산화칼륨 또는 수산화나트륨은 고형입자 또는 수용액 어떤 형태로도 첨가할 수 있지만, 반응솥에 넣은 폴리에스테르 파쇄물 중 테레프탈산의 몰수에 대해 약 2배량의 몰수, 바람직하게는 합계 2∼2.2배의 몰수가 되도록 첨가하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 알칼리의 첨가량은 폴리에스테르 파쇄물 중 테레프탈산의 함유량에 대해 합계 2.10배의 몰수가 좋다.
첨가하는 에틸렌글리콜 또는 1-부탄올의 양은 그 폴리에스테르 파쇄물의 용량에 대해 3∼10배량이 되도록 첨가하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 용매의 첨가량은 합계 5배량이 좋다. 이 해중합 반응의 용액에 적당량의 물을 더하는 것이 바람직하지만, 이 해중합 반응의 용액 중에 함유되는 물의 총량은 폴리에스테르 파쇄물 내 테레프탈산의 몰수에 대해 1배량∼5배량이 바람직하다.
반응솥 내 압력은 대기압 근방의 압력, 예를 들어 0.9∼1.1기압(91.193∼111.458kPa)이 바람직하다. 반응용매로서 에틸렌글리콜을 이용할 때의 반응온도는 물은 증발하고 에틸렌글리콜은 증발하지 않는 온도이다. 반응솥 내 압력이 1기압일 때에는 100∼196℃가 바람직하다. 1기압보다 낮은 기압에서 반응시킬 때에는 100∼196℃의 범위 내에서 물은 증발하고 에틸렌글리콜은 증발하지 않는 온도에서 반응시킨다. 또 1기압보다 높은 기압에서 반응시킬 때에는 100∼196℃의 범위 내에서 물은 증발하고 에틸렌글리콜은 증발하지 않는 온도에서 반응시킨다. 반응용매로서 1-부탄올을 이용할 때의 반응온도는 물은 증발하고 1-부탄올은 증발하지 않는 온도이다. 반응솥 내 압력이 1기압일 때에는 100∼116℃가 바람직하다. 1기압보다 낮은 기압에서 반응시킬 때에는 100∼116℃의 범위 내에서 물은 증발하고 1-부탄올은 증발하지 않는 온도에서 반응시킨다. 또 1기압보다 높은 기압에서 반응시킬 때에는 100∼116℃의 범위 내에서 물은 증발하고 1-부탄올은 증발하지 않는 온도에서 반응시킨다.
가열시간은 폴리에스테르 파쇄물이 완전하게 분해되는 시간이 바람직하며 통상 10∼240분간이지만, 용해속도는 PET, PTT, PBT의 순서로 느리기 때문에 PTT와 PBT를 해중합할 때에는 가열분해시간을 길게 하는 것이 바람직하다. 가열반응 중에 증발하는 수분 등의 휘발성 물질은 응축기에 의해 회수한다.
해중합 반응이 끝난 후 에틸렌글리콜 또는 1-부탄올의 용액과 테레프탈산염 유래의 고형물에 더하여 폴리에스테르 이외의 이물 플라스틱, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 염화비닐이 부유물로 존재할 때에는 그 부유물을 제거한다. 그 후 테레프탈산염의 고형물을 여과나 원심처리 등에 의한 고액분리법을 이용하여 에틸렌글리콜 용매 또는 1-부탄올 용매에서 분리한다.
상기 고액분리법에 의해 분리한 에틸렌글리콜 용매에는 많은 양의 테레프탈산염이 용해되어 있으므로 그 용매를 상기 PET 또는 PTT 또는 PBT의 해중합 반응용매로서 이용하는 것이 바람직하다. 또 테레프탈산염의 1-부탄올 용매에 대한 용해도는 낮지만, 해중합 반응에 이용한 1-부탄올 용매를 상기 PET 또는 PTT 또는 PBT의 해중합 반응용매로서 다시 이용하는 것이 제조 비용을 저감시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 이와 같이 PET 또는 PTT 또는 PBT의 해중합 반응에 이용하는 에틸렌글리콜 용매 또는 1-부탄올 용매는 생성된 테레프탈산염을 분리하는 것에 의해 반복하여 폴리에스테르의 해중합 반응에 이용할 수 있다.
계속해서 테레프탈산염의 고형물에 포함되는 불순물이 많은 경우에는 얻어진 테레프탈산염의 고형물에 대해 적당량의 에틸렌글리콜 또는 1-부탄올에 의한 세정처리를 해도 된다. 특히 PTT나 PBT를 포함하는 폴리에스테르 폐기물을 해중합한 경우에는 그 고형물 중에 1,3-프로판디올이나 1,4-부탄디올이 혼입되므로 에틸렌글리콜 또는 1-부탄올에 의한 세정처리를 하는 것이 바람직하다. 또 PET 수지를 1-부탄올 반응용매 중에서 해중합한 경우에는 그 고형물 중에 에틸렌글리콜이 혼입되는데, 그 에틸렌글리콜은 아래에서 서술하는 감압건조에 의해서도 제거할 수 있지만 1-부탄올에 의한 세정처리에 의해 그 에틸렌글리콜을 제거해도 된다.
이와 같이 하여 얻어진 테레프탈산염의 고형물에는 많은 양의 에틸렌글리콜 또는 1-부탄올이 포함되어 있으므로, 필요에 따라 감압건조기 등을 이용하여 그 고형물 중의 에틸렌글리콜 또는 1-부탄올을 감소시키는 처리 또는 원심분리기 등을 이용하여 액체상 물질을 분리한다. 이와 같이 하여 얻어진 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산의 제조에 사용할 수 있다.
또 그 테레프탈산염에 난수용성 고형이물이 혼입되어 있는 경우에는, 그 테레프탈산염을 적당량의 물에 용해시킨 후 여과법에 의해 이물을 제거하는 것에 의해 얻어지는 테레프탈산염의 수용액을 미생물에 의한 화합물 생산에 이용해도 된다.
또 에틸렌글리콜 용매 중에서의 폐기 폴리에스테르의 해중합에 의해 얻어진 테레프탈산염에 혼입되는 에틸렌글리콜을 분해하기 위해서는 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 발현량을 증강시킨 본 발명에 사용하는 미생물을 액체배지에서 배양한 후, 에틸렌글리콜을 함유하고 또 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 배양액 중에 0.1mM∼1M의 농도가 되도록 첨가하는 것에 의해 에틸렌글리콜을 분해시키면서 TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산을 생성시킬 수도 있다.
본 발명에 사용하는 미생물을 배양한 후, 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 포함하는 수성매체 중에 그 미생물의 배양균체 혹은 그 배양균체의 처리물을 첨가하는 것에 의해 TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산을 생성, 축적시켜 그 매체로부터 TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산을 채취할 수도 있다.
본 발명에 사용하는 미생물의 배양은 탄소원, 질소원, 무기염, 각종 비타민 등을 포함하는 통상의 영양배지로 실시할 수 있으며, 탄소원으로는 예를 들어 포도당, 자당, 과당 등의 당류, 에탄올, 메탄올 등의 알코올류, 시트르산, 말산, 숙신산 등의 유기산류, 폐당밀 등이 이용된다. 질소원으로는 예를 들어 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄, 요소 등이 각각 단독 또는 혼합되어 이용된다. 또 무기염으로는 예를 들어 인산일수소칼륨, 인산이수소칼륨, 황산마그네슘 등이 이용된다. 그 밖에 펩톤, 고기추출물스, 효모추출물, 옥수수침지액(Corn Steep Liquor), 카자미노산, 비오틴 등의 각종 비타민 등의 영양소를 배지에 첨가할 수 있다. TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산을 생산하기 위한 원료로는 상기 서술과 같이 하여 조제한 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 첨가한다.
배양은 통상 통기교반, 진탕 등의 호기조건하에서 실시한다. 배양온도는 본 발명에 사용하는 미생물이 생육할 수 있는 온도라면 특별히 제한은 없고, 또 배양 도중의 pH에 대해서도 본 발명에 사용하는 미생물이 생육할 수 있는 pH라면 특별히 제한은 없다. 배양 중 pH 조정은 산 또는 알칼리를 첨가하여 실시할 수 있다.
그 배양균체의 처리물로서 본 발명에 사용하는 미생물을 담체에 고정화한 것을 이용해도 된다. 그 경우에는 배양물에서 회수된 그대로 혹은 적당한 완충액, 예를 들어 0.02∼0.2M 정도의 인산 완충액(pH6∼10) 등으로 세정된 균체를 사용할 수 있다. 또 배양물에서 회수된 균체를 초음파, 압착 등의 수단으로 파쇄하여 얻어지는 파쇄물, 그 파쇄물을 물 등으로 추출하여 얻어지는 본 발명에 사용하는 단백질을 함유하는 추출물, 그 추출물을 다시 유안염석, 컬럼 크로마토그래피 등의 처리를 하여 얻어지는 본 발명에 사용하는 단백질의 부분정제성분 등을 담체에 고정화한 것도 본 발명의 TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산의 제조에 사용할 수 있다.
이들 균체, 균체파쇄물, 추출물 또는 정제효소의 고정화는 그 자체로 기존의 통상 이용되고 있는 방법에 따라 아크릴아미드 모노머, 알긴산 또는 카라기난 등의 적당한 담체에 균체 등을 고정화시키는 방법에 의해 가능하다.
반응에 이용하는 수성매체는 테레프탈산염을 함유하는 수용액 또는 적당한 완충액, 예를 들어 0.02∼0.2M 정도의 인산 완충액(pH6∼10)으로 할 수 있다. 이 수성매체에는 다시 균체의 세포막의 물질투과성을 높일 필요가 있을 때에는 톨루엔, 자일렌, 비이온성 계면활성제 등을 0.05∼2.0%(w/v) 첨가할 수도 있다.
수성매체 중의 반응원료가 되는 테레프탈산염의 농도는 0.1mM∼1M 정도가 적당하다. 상기 수성매체에서의 효소반응온도 및 pH는 특별히 한정되지 않지만, 통상 10∼60℃, 바람직하게는 15∼50℃가 적당하고, 반응액 중 pH는 5∼10, 바람직하게는 6∼9 부근으로 할 수 있다. 또 pH의 조정은 산 또는 알칼리를 첨가하여 실시할 수 있다.
발명에서 사용하는 효소는 균체추출액을 그대로 또는 거기서 원심분리, 여과 등으로 모아서 이것을 물 또는 완충액에 현탁하여 얻을 수 있다. 이렇게 해서 얻어진 효소를 테레프탈산염의 존재하에서 반응시키는데, 반응액 중 테레프탈산염의 농도는 효소의 활성을 저해하지 않는 범위에서 가능한 한 높게 하는 것이 유리하다. 반응은 정치, 교반, 진탕 어떤 방법으로 행해도 된다. 또 효소를 적당한 지지체에 고정화하여 컬럼에 충전하고 테레프탈산염을 포함하는 용액을 흘려 보내는 방법도 이용할 수 있다. 반응은 통상 10∼60℃, 바람직하게는 15∼50℃, pH5∼9, 바람직하게는 pH6∼9로 실시한다.
또 상기 수성매체에 반응시에 항산화제 또는 환원제를 첨가하면, TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산의 생성수율이 한층 더 향상되는 경우가 있다. 항산화제/환원제로는 아스코르브산, 이소아스코르브산, 시스테인, 아황산나트륨이나 아황산수소나트륨 등의 아황산염, 티오황산나트륨 등의 티오황산염을 들 수 있다. 첨가농도는 항산화제/환원제의 종류에 따라 다르지만, TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산의 생성을 저해하지 않는 농도로 첨가하는 것이 바람직하고, 통상 0.001∼5%(w/v), 바람직하게는 0.005∼1%이다.
또 상기 수성매체에 반응시에 산화제를 첨가하면, TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산의 생성수율이 한층 더 향상되는 경우가 있다. 산화제로는 아질산나트륨, 아질산칼륨 등의 질산염, 염화 제2철이나 황산 제2철 등의 금속염, 할로겐, 과산화산 등을 들 수 있고, 바람직하게는 아질산나트륨, 염화 제2철, 황산 제2철을 들 수 있다. 첨가농도는 산화제의 종류에 따라 다르지만, TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산의 생성을 저해하지 않는 농도로 첨가하는 것이 바람직하고, 통상 0.001∼0.05%(w/v), 바람직하게는 0.005∼0.02%이다.
배양 종료후의 배양액 또는 반응액 중의 TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산은 필요에 따라 원심분리 등에 의해 그 배양액으로부터 균체 등의 불용성분을 제거한 후, 예를 들어 아세트산에틸 등의 유기용매에 의한 추출법, 활성탄을 이용하는 방법, 이온교환수지를 이용하는 방법, 정석법, 염석 등의 침전법, 증류법 등의 방법을 단독으로 또는 조합하는 것에 의해 TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산을 채취할 수 있다. TPA-DHD, 프로토카테큐산 또는 갈산에 대해 염의 형태가 아니라 산의 상태로 화합물을 얻을 필요가 있을 때에는 상기 정제공정에서 황산이나 염산 등의 첨가에 의해 pH를 낮추어 염을 형성하고 있는 카복시산을 유리산 상태로 할 수 있다.
이하에 본 발명의 방법을 실시예에 의해 구체적으로 서술하는데 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 각종 테레프탈산염의 용해도 측정
테레프탈산(분말상, 시그마알드리치재팬 제조; 이하 특별한 기재가 없는 한 시약은 시그마알드리치재팬 제품을 이용했다.) 2.99g(0.018mol)과 수산화칼륨(과립상) 0.036mol을 50mL 유리 비커에 투입하고 증류수로 약 15mL로 만들었다. 알루미늄 호일로 덮고 핫스터러(애즈원사 제조)로 교반하면서 50℃에서 60분간 가열 후, 방랭하여 30℃까지 냉각했다. 30℃에서 120분간 이상 교반하여 용액에 침전이 잔존하고 있는 것을 확인한 후, 용액 1mL를 채취하여 미량고속원심기(토미정공 제조)를 이용한 원심〔30℃, 14000rpm(17800g), 30초간〕에 의해 상청액을 회수했다.
이 상청액의 테레프탈산 농도를 측정하여 테레프탈산2칼륨염의 용해도로 했다. 테레프탈산의 농도 측정에 대해서는 샘플을 2.5% 아세토니트릴 수용액으로 16000배로 희석하고 고속 액체 크로마토그래피(Water사, LCT Premier XE)를 이용하여 표 1의 분리조건으로 분석한 후에 농도를 알고 있는 테레프탈산 수용액을 대조로 이용한 테레프탈산 피크의 면적비를 기초로 산출했다.
LCT Premier XE의 HPLC 분석조건
HPLC분리 컬럼 ACQUITY UPLC HSS T3(Waters사 제조, 내경 2.1mm, 길이 50mm)
컬럼 온도 40℃
용매속도 0.4ml/분
이동상 A 물
이동상 B 아세토니트릴
그라디엔트 조건 0분(개시) 2% 이동상 B
0.75분 5% 이동상 B
1.75분 30% 이동상 B
1.76분 5% 이동상 B
2.50분 5% 이동상 B
상기 테레프탈산2칼륨염 수용액의 제작방법과 마찬가지로 테레프탈산(분말상) 2.99g(0.018mol)에 대해 수산화나트륨(과립상) 0.036mol, 혹은 28% 암모니아수 0.036mol, 혹은 수산화칼륨 0.018mol 및 수산화나트륨 0.018mol, 혹은 수산화칼륨 0.018mol 및 28% 암모니아수 0.018mol, 혹은 수산화나트륨 0.018mol 및 28% 암모니아수 0.018mol을 첨가하는 것에 의해 테레프탈산2나트륨염, 테레프탈산2암모늄염, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염, 테레프탈산1-칼륨4-암모늄염, 혹은 테레프탈산1-나트륨4-암모늄염의 수용액을 제작한 후, 각각의 테레프탈산염의 용해도를 측정했다.
얻어진 각 테레프탈산염의 용해도를 표 2에 나타낸다. 표 2의 결과에서 테레프탈산2칼륨, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨, 테레프탈산1-칼륨4-암모늄, 테레프탈산2나트륨, 테레프탈산1-나트륨4-암모늄, 테레프탈산2암모늄의 순으로 물에 대한 용해도가 높아 테레프탈산의 적어도 하나의 카복실기잔기가 칼륨과 염을 형성하고 있는 염의 용해도가 우수한 것이 판명되었다.
테레프탈산염의 물에 대한 용해도
테레프탈산염의 종류 알칼리 용해도(mol/L)
테레프탈산2칼륨
테레프탈산2나트륨
테레프탈산2암모늄
테레프탈산1-칼륨4-나트륨
테레프탈산1-칼륨4-암모늄
테레프탈산1-나트륨4-암모늄		 수산화칼륨
수산화나트륨
암모니아
수산화칼륨, 수산화나트륨
수산화칼륨, 암모니아
수산화나트륨, 암모니아		 1.011
0.630
0.512
0.956
0.845
0.612
실시예 2. 테레프탈산염의 차이에 따른 TPA-DHD의 생산성 차이
실시예 1의 결과에 기초하여 테레프탈산, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 28% 암모니아수 및 증류수를 기초로 0.6M 테레프탈산2칼륨 수용액, 0.6M 테레프탈산1-칼륨4-나트륨 수용액, 0.6M 테레프탈산1-칼륨4-암모늄 수용액, 및 0.6M 테레프탈산2 나트륨 수용액을 500mL씩 조제했다. 이 테레프탈산염 용액 30ml와 글루코오스 7g을 혼합하여 글루코오스 기질 혼합액으로 했다.
참고예 3에서 구축한 TPA-DHD 생산 플라스미드 pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK를 대장균 M7032주(Yale 대의 CGSC에서 입수)에 형질전환법에 의해 도입하여 재조합 대장균주 M7032(pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK)를 얻었다.
이 형질전환체를 암피실린 종농도 100mg/l를 포함하는 1ml의 LB액체배지〔10g/l 트립톤(Difco사 제조), 5g/l 건조효모추출물(Difco사 제조), 10g/l 염화나트륨〕으로 하룻밤 배양했다. 다음에 암피실린 종농도 100mg/l를 포함하는 10ml의 F6.6W/P100/G2 배지에 이 하룻밤 배양액을 1%만 접종하고 30℃에서 24시간 배양했다. 또 F6.6W/P100/G2 배지는 인산이수소칼륨 13.6g/L, 시트르산1수화물 2.1g/L, 황산암모늄 9.9g/L, 황산철(II)7수화물 1.703g/L, 글루코오스 20g/L, 황산마그네슘7수화물 246mg/ml, 염화칼슘2수화물 12.9mg/L, 티아민염산염 10mg/L, 산화마그네슘 10.75mg/L, 탄산칼슘 2mg/L, 황산아연7수화물 4.5mg/ml, 황산망간(II)4수화물 1.12mg/L, 황산구리(II)5수화물 0.25mg/L, 황산코발트(II)7수화물 0.28g/L 및 붕산 0.06mg/L〕를 포함하는 수용액이다.
다음으로 이 전배양액을 기초로 본배양을 실시하기 위해 본배양 배지인 F6.6W/P10/G1 배지 65ml를 8연속 미니 자발효기(에이블사 제조)에 투입하고 30.2℃±0.2, pH6.9±0.1로 조정했다. 또 F6.6W/P10/G1 배지란 인산2수소칼륨 1.36g/L, 시트르산1수화물 2.1g/L, 황산암모늄 9.9g/L, 황산철(II)7수화물 1.703g/L, 글루코오스 20g/L, 황산마그네슘7수화물 246mg/ml, 염화칼슘2수화물 12.9mg/L, 티아민 10mg/L, 산화마그네슘 10.75mg/L, 탄산칼슘 2mg/L, 황산아연7수화물 4.5mg/ml, 황산망간4수화물 1.12mg/L, 황산구리5수화물 0.25mg/L, 황산코발트7수화물 0.28g/L, 붕산 0.06mg/L를 포함하는 수용액이다.
자발효기 배양의 통기조건은 1vvm로 조정하고 배양의 pH조정은 암모니아수와 황산을 이용해 실시했다. 또 배양액 중 용존산소는 포화산소농도를 100%로 하여 조절하고 균체증식에 수반하여 감소하는 용존산소를 15%로 유지하도록 교반날개의 회전수로 제어했다.
본배양 배지에 0.1%의 전배양액을 접종하고 상기 조건으로 배양했다. 균체 탁도가 흡광도 600nm에서 약 7이 되었을 때 유도제 m-톨루일산을 종농도 1mM가 되도록 첨가하여 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질 및 테레프탈산트랜스포터 단백질을 발현시켰다. 글루코오스 농도를 경시적으로 계측하여 글루코오스 농도가 0이 되었을 때 글루코오스 기질 혼합액을 투여했다.
본배양 개시 후 48시간 후에 샘플링을 했다. 각 샘플은 LC-TOF형 질량분석계(Waters사, LCT Premier XE)에 의한 표 1에 나타내는 조건에서의 분석에 제공했다. 테레프탈산의 동정은 표본 테레프탈산과 비교하여 고속 액체 크로마토그래피의 유지시간과 질량분석계로부터의 정밀질량치를 함께 이용하여 실시했다. TPA-DHD는 테레프탈산의 감소에 따라 출현하는 물질 중에서 TPA-DHD의 예상 정밀질량치를 기초로 동정했다. 또 TPA-DHD의 정량은 테레프탈산의 감소량과 TPA-DHD의 피크 에리어의 증가에서 작성한 검량선을 기초로 했다.
그 결과, 테레프탈산의 감소에 수반되어 TPA-DHD의 증가가 관찰되었다. 배양 48시간 후의 각 테레프탈산염으로부터의 TPA-DHD 생산량을 100%로 한 비율을 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타내는 결과로부터 3종류의 테레프탈산칼륨염이 모두 테레프탈산2나트륨염보다 TPA-DHD의 생산성이 우수하다는 것이 밝혀졌다.
테레프탈산염에 따른 TPA-DHD의 생산성 차이
원료로 한 테레프탈산염 TPA-DHD(g/L) 생산성의 비
테레프탈산2나트륨염
테레프탈산2칼륨염
테레프탈산1-칼륨4-나트륨염
테레프탈산1-칼륨4-암모늄염		 9.7
11.3
10.7
12.2		 100%
116%
110%
126%
실시예 3. 테레프탈산염 내 칼륨 이온의 농도에 따른 TPA-DHD의 생산성 차이
실시예 2의 결과에서 테레프탈산칼륨염을 원료로 하면 TPA-DHD의 생산성이 우수한 것이 나타났다. 그래서 테레프탈산염 내 칼륨 이온의 농도가 TPA-DHD에 미치는 영향을 이하와 같이 하여 조사했다.
먼저 실시예 2에서 조제한 0.6M 테레프탈산2칼륨 수용액과 0.6M 테레프탈산2나트륨 수용액을 각각 0:100, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 50:50의 비율로 혼합한 테레프탈산염의 수용액을 제작했다. 이러한 테레프탈산염 용액 30ml와 글루코오스 7g을 혼합하여 글루코오스 기질 혼합액으로 했다.
이 글루코오스 기질 혼합액을 이용하여 실시예 2의 방법과 동일한 방법에 의해 재조합 대장균주 M7032(pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK)에 의한 TPA-DHD의 생산성을 조사했다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
그 결과, 표 4에 나타내는 바와 같이 테레프탈산염 내 칼륨 이온 함량이 증가함에 따라 TPA-DHD의 생산성이 증가하는 현상이 관찰되었고, 테레프탈산2나트륨염을 원료로 했을 때의 생산성과 비교하여 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상의 칼륨을 포함하는 테레프탈산염을 이용했을 때 TPA-DHD의 생산성이 높아지는 것이 나타났다.
테레프탈산염 내 칼륨 이온 농도에 따른 TPA-DHD의 생산성 차이
테레프탈산2칼륨염과 테레프탈산2나트륨염의 혼합비 본배양 개시후 51시간째 본배양 개시후 73시간째
TPA-DHD(g/L) 생산성의 비 TPA-DHD(g/L) 생산성의 비
0:100
20:80
25:75
30:70
35:65
50:50		 15.2
15.0
15.6
16.5
16.9
17.2		 100%
99%
103%
109%
111%
113%		 17.4
18.1
18.0
19.6
19.4
20.5		 100%
104%
103%
113%
111%
118%
실시예 4. 테레프탈산염의 차이에 따른 프로토카테큐산의 생산성 차이
참고예 2에서 구축한 프로토카테큐산 생산 플라스미드 pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK를 대장균 M7032주에 형질전환법에 의해 도입하여 프로토카테큐산 생산 대장균주 M7032(pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK)를 얻었다.
계속해서 실시예 2와 동일하게 하여 본 프로토카테큐산 생산균의 전배양액을 조제한 후, 그 전배양액을 2%만 본배양 배지에 접종하여 본배양을 실시했다. 균체 탁도가 흡광도 600nm에서 약 7이 되었을 때 유도제 m-톨루일산을 종농도 1mM가 되도록 첨가하여 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질, 테레프탈산 디히드로디올디히드로게나아제 단백질 및 테레프탈산트랜스포터 단백질을 발현시켰다. 글루코오스 농도를 경시적으로 계측하여 글루코오스 농도가 0이 되었을 때 글루코오스 기질 혼합액을 투여했다.
본배양 개시 후 48시간 후에 샘플링을 했다. 각 샘플은 LC-TOF형 질량분석계(Waters사, LCT Premier XE)에 의한 분석에 제공했다. 테레프탈산 및 프로토카테큐산의 동정은 표본 테레프탈산 및 프로토카테큐산과 비교하여 고속 액체 크로마토그래피의 유지시간과 질량분석계로부터의 정밀질량치를 함께 이용하여 실시했다.
그 결과, 테레프탈산의 감소에 수반되어 프로토카테큐산의 증가가 관찰되었다. 배양 48시간 후의 각 테레프탈산염으로부터의 프로토카테큐산 생산량을 100%로 한 비율을 표 5에 나타냈다. 표 5에 나타내는 결과로부터 3종류의 테레프탈산칼륨염이 모두 테레프탈산2나트륨염보다 프로토카테큐산의 생산성이 우수하다는 것이 밝혀졌다.
테레프탈산염에 따른 프로토카테큐산의 생산성 차이
원료로 한 테레프탈산염 프로토카테큐산(g/L) 생산성의 비
테레프탈산2나트륨염
테레프탈산2칼륨염
테레프탈산1-칼륨4-나트륨염
테레프탈산1-칼륨4-암모늄염		 5.0
8.3
7.7
7.1		 100%
168%
154%
142%
실시예 5. 테레프탈산염의 차이에 따른 갈산의 생산성 차이
참고예 4에서 구축한 갈산 플라스미드 pUXPEaLT_HFM145_tphA2A3BA1_tpaK를 대장균 M7032주에 형질전환법에 의해 도입하여 갈산생산 대장균주 M7032(pUXPEaLT_HFM145_tphA2A3BA1_tpaK)를 얻었다. 계속해서 실시예 2와 동일하게 하여 이 갈산 생산균의 전배양액을 조제한 후, 이 전배양액을 2%만 본배양 배지에 접종하여 상기 조건으로 본배양했다. 균체 탁도가 흡광도 600nm에서 약 7이 되었을 때 유도제 m-톨루일산을 종농도 1mM가 되도록 첨가하여 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질, 테레프탈산 디히드로디올디히드로게나아제 단백질, 테레프탈산트랜스포터 단백질 및 개량형 파라히드록시벤조산 히드록실라아제를 발현시켰다. 글루코오스 농도를 경시적으로 계측하여 글루코오스 농도가 0이 되었을 때 글루코오스 기질 혼합액을 투여했다.
본배양 개시 후 48시간 후에 샘플링했다. 각 샘플은 LC-TOF형 질량분석계(Waters사, LCT Premier XE)에 의한 분석에 제공했다. 테레프탈산 및 갈산의 동정은 표본 테레프탈산 및 갈산과 비교하여 고속 액체 크로마토그래피의 유지시간과 질량분석계로부터의 정밀질량치를 함께 이용하여 실시했다.
그 결과, 테레프탈산의 감소에 수반하여 갈산의 증가가 관찰되었다. 배양 48시간 후의 각 테레프탈산염으로부터의 갈산 생산량을 100%로 한 비율을 표 6에 나타냈다. 표 6에 나타내는 결과로부터 3종류의 테레프탈산칼륨염이 모두 테레프탈산2나트륨염보다 갈산의 생산성이 우수하다는 것이 밝혀졌다.
테레프탈산염에 따른 갈산의 생산성 차이
원료로 한 테레프탈산염 갈산(g/L) 생산성의 비
테레프탈산2나트륨염
테레프탈산2칼륨염
테레프탈산1-칼륨4-나트륨염
테레프탈산1-칼륨4-암모늄염		 7.6
8.6
8.4
8.5		 100%
113%
111%
112%
실시예 6. 에틸렌글리콜 용매 중 폐기 PET의 해중합
(1) 알칼리금속 수산화물의 종류에 따른 폐기 PET의 해중합 속도와 해중합 효율의 차이
폐기 페트병 22kg을 모아 라벨과 캡을 분리한 후, 세정하고 바람 건조시켰다. 이 세정된 폐기 페트병을 니혼코크스고교 주식회사에 의뢰하여 사방 5mm 크기의 스크린을 통과하는 크기의 입자로 분쇄했다. 이 분쇄물을 폐기 페트병 파쇄물로서 이하의 공정에서 사용했다.
200mL의 스테인리스제 비커(주식회사산쇼에서 구입)에 폐기 페트병 파쇄물 12g과 에틸렌글리콜 60g을 투입한 후, 수산화칼륨(과립상) 0.13mol 혹은 수산화나트륨(과립상) 0.13mol 혹은 수산화칼륨 0.066mol 및 수산화나트륨 0.066mol을 투입하고 핫스터러를 이용해 강하게 교반하면서 160℃에서 120분간 가열처리했다.
이 때, 용액 내온이 160℃에 이르렀을 때부터 0분, 5분, 10분, 20분, 30분, 60분, 120분 경과한 시점에서 반응액 약 200㎕를 회수하여 각 시점에서의 테레프탈산염의 농도를 측정했다. 반응시간 경과에 따른 테레프탈산염의 생성농도는 도 2에 나타낸다.
도 2의 결과로부터 수산화칼륨을 첨가하는 것이 폐기 페트병 파쇄물로부터의 테레프탈산염의 생성속도도 빠르고 생성효율도 우수한 것을 알 수 있었다. 또 수산화칼륨만 첨가한 경우와 수산화칼륨과 수산화나트륨 양쪽을 등몰 첨가한 경우의 사이에서는 효과는 동등했다.
(2) 폐기 PET 해중합 반응 후 고형물 잔사의 분석
500mL의 스테인리스제 비커(산쇼에서 구입)에 폐기 페트병 파쇄물 30g과 에틸렌글리콜 150g을 투입한 후, 수산화칼륨(과립상) 0.33mol 혹은 수산화나트륨(과립상) 0.33mol 혹은 수산화칼륨 0.17mol 및 수산화나트륨 0.17mol을 투입하고 핫스터러로 강하게 교반하면서 160℃에서 60분간 가열처리한 후에 자연냉각시켜 내온 40℃가 이하가 되고 나서 내용물을 꺼냈다.
이 내용물을 여과지(와트만제 그레이드 540)로 여과분별하여 여과액과 잔사로 나눈 후에 각 잔사의 무게와 잔사 내 테레프탈산의 총량을 측정했다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
또 테레프탈산2칼륨염, 테레프탈산2나트륨염 및 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염의 에틸렌글리콜에 대한 용해도를 실시예 1과 동일한 방법에 의해 조사했더니 각각 231mM, 109mM, 205mM였다.
따라서 테레프탈산염의 에틸렌글리콜에 대한 용해도가 높기 때문에 수산화나트륨의 첨가와 비교하여 수산화칼륨의 첨가가 테레프탈산염의 생성효율이 우수하지만, 수산화칼륨을 첨가한 경우와 수산화나트륨을 첨가한 경우에 회수한 테레프탈산량(몰환산)은 거의 같은 것을 알 수 있었다(표 7 참조).
에틸렌글리콜 용매 중 PET의 해중합에서의 알칼리금속 수산화물에 따른 테레프탈산의 생산량 차이
PET 해중합에 이용한 알칼리금속 수산화물 잔사 회수량
(g)		 잔사 내 테레프탈산의 총량
(mmol)
수산화칼륨
수산화나트륨
수산화칼륨과 수산화나트륨		 43.0
62.8
45.4		 142.0
143.6
120.6
(3) 테레프탈산염으로 포화한 에틸렌글리콜 용매를 이용한 폐기 PET의 해중합 반응
폐기 PET를 해중합하는 공정에 있어서, 해중합을 끝낸 후에 테레프탈산염을 주성분으로 하는 고형물 잔사와 분리하는 것에 의해 얻어지는 에틸렌글리콜 용매는 재이용하는 것이 바람직하다. 폐기 PET의 해중합 반응에 제공한 에틸렌글리콜 용매에는 각각의 테레프탈산염이 포화상태로 녹아 있다는 것을 고려하여 테레프탈산염으로 포화한 에틸렌글리콜 용매를 이용한 폐기 PET의 해중합 반응을 이하와 같이 실시했다.
200mL 유리 비커에 테레프탈산 4.15g(0.025mol)를 투입한 후, 수산화칼륨(과립상) 0.050mol 혹은 수산화나트륨(과립상) 0.050mol 혹은 수산화칼륨 0.025mol 및 수산화나트륨 0.025mol을 투입하여 에틸렌글리콜로 약 100mL로 만들었다. 알루미늄 호일로 덮고 핫스터러로 교반하면서 100℃에서 60분간 가열 후, 방랭하여 30℃ 이하가 될 때까지 냉각했다. 이 용액을 여과지(와트만제 그레이드 50)로 여과하여 테레프탈산염으로 포화한 에틸렌글리콜 용매로 했다.
각각의 그 용매에 포함되는 테레프탈산염의 농도는 테레프탈산2칼륨 포화용액에서는 0.23M, 테레프탈산2나트륨 포화용액에서는 0.11M 및 테레프탈산1-칼륨4-나트륨 포화용액에서는 0.20M이었다.
200mL의 스테인리스제 비커에 폐기 페트병 파쇄물 12g을 투입한 후, 테레프탈산2칼륨으로 포화한 에틸렌글리콜 용매 65g 및 수산화칼륨 0.13mol 혹은 테레프탈산2나트륨으로 포화한 에틸렌글리콜 용매 65g 및 수산화나트륨 0.13mol 혹은 테레프탈산1-칼륨4-나트륨으로 포화한 에틸렌글리콜 용매 65g 및 수산화칼륨 0.066mol 및 수산화나트륨 0.066mol을 투입하고 핫스터러로 강하게 교반하면서 160℃, 60분간 가열처리했다. 방랭하여 내온 40℃ 이하가 되고 나서 내용물을 꺼냈다.
이 내용물을 여과지로 여과분별하여 여과액과 잔사로 나눈 후에 각 잔사의 무게와 잔사 내 테레프탈산의 총량을 측정했다. 표 8에 나타내는 결과로부터 여과 후의 잔사 내 테레프탈산의 총량은 수산화칼륨, 수산화칼륨과 수산화나트륨의 혼합물, 수산화나트륨의 순으로 많다는 것을 알 수 있었다.
테레프탈산염으로 포화한 에틸렌글리콜 용매 중 PET의 해중합에서의 테레프탈산의 생산량 차이
PET 해중합에 이용한 용매 PET 해중합에 이용한 알칼리금속 수산화물 잔사 회수량(g) 잔사 내 테레프탈산의 총량(mmol)
테레프탈산2칼륨염으로 포화한 에틸렌글리콜 수산화칼륨 21.8 63.9
테레프탈산2나트륨염으로 포화한 에틸렌글리콜 수산화나트륨 28.0 54.6
테레프탈산1-칼륨4-나트륨염으로 포화한 에틸렌글리콜 수산화칼륨과 수산화나트륨 24.1 59.9
(4) 물을 포함하는 용매 중에서의 폐기 페트병 파쇄물의 해중합 반응
200mL의 스테인리스제 비커에 폐기 페트병 파쇄물 10g 및 에틸렌글리콜 50g을 투입하고 다시 수산화칼륨(과립상)을 0.083mol 또는 0.090mol 또는 0.11mol 투입하거나 혹은 34% 수산화칼륨 수용액을 0.083mol 또는 0.090mol 또는 0.11mol 투입했다.
계속해서 핫스터러로 강하게 교반하면서 160℃, 60분간 가열처리했다. 34%수산화칼륨 수용액을 투입한 해중합 반응용액의 수분은 거의 증발되었고, 그 결과 수산화칼륨(과립상)을 투입한 해중합 반응용액의 액량과 거의 같아졌다. 자연냉각시켜 내온 40℃ 이하가 되고 나서 내용물을 꺼냈다. 이 내용물을 여과지로 여과분별하여 여과액과 잔사로 나누었다. 이 잔사의 테레프탈산염 함량을 도 3에 나타낸다.
도 3에 나타내는 결과로부터 수산화칼륨을 0.090mol 또는 0.11mol 투입한 경우 물을 포함하는 용매 중에서의 해중합 반응 쪽이 테레프탈산염의 생성효율이 우수한 것을 알 수 있었다.
실시예 7. 에틸렌글리콜 용매 중에서의 PTT의 해중합
PTT제 솜(니시카와산업사 제조, 파인스무스 솔로텍스 솜보충용 팩 RC7954) 13g, 그리고 실시예 6(3)에서 조제한 테레프탈산2칼륨으로 포화한 에틸렌글리콜 용매 130g 및 수산화칼륨 0.13mol, 또는 테레프탈산2나트륨으로 포화한 용액 130g 및 수산화나트륨 0.13mol, 또는 테레프탈산1-칼륨4-나트륨 포화용액 130g 및 수산화칼륨 0.066mol 및 수산화나트륨 0.066mol을 200mL의 스테인리스제 비커에 투입하고 핫스터러로 강하게 교반하면서 160℃, 60분간 가열하여 가수분해시켰다. 방랭하여 내온 40℃ 이하가 되고 나서 내용물을 꺼냈다. 이 내용물을 여과지(와트만제, 그레이드 540)로 여과분별하여 여과액과 잔사로 나눈 후, 각 잔사의 무게와 잔사 내 테레프탈산의 총량을 측정했다. 표 9에 나타내는 결과로부터 여과 후 잔사 내 테레프탈산의 총량은 수산화칼륨, 수산화칼륨과 수산화나트륨의 혼합물, 수산화나트륨의 순으로 많다는 것을 알 수 있었다.
테레프탈산염으로 포화한 에틸렌글리콜 용매 중 PTT의 해중합에서의 테레프탈산의 생산량 차이
PTT 해중합에 이용한 용매 PTT 해중합에 이용한 알칼리금속 수산화물 잔사 회수량(g) 잔사 내 테레프탈산의 총량(mmol)
테레프탈산2칼륨염으로 포화한 에틸렌글리콜 수산화칼륨 20.7 64.8
테레프탈산2나트륨염으로 포화한 에틸렌글리콜 수산화나트륨 21.6 59.4
테레프탈산1-칼륨4-나트륨염으로 포화한 에틸렌글리콜 수산화칼륨과 수산화나트륨 25.3 60.5
실시예 8. 에틸렌글리콜 용매 중에서의 PBT의 해중합
200mL의 스테인리스제 비커에 PBT제 사기숟가락〔아마존닷컴사에서 구입, PBT 사기숟가락 103TW 흰색(RLVH001)을 구입〕의 파쇄물 15g을 넣은 후 다시 실시예 6(3)에서 조제한 테레프탈산2칼륨염으로 포화한 에틸렌글리콜 용매 75g 및 수산화칼륨 0.15mol, 혹은 테레프탈산2나트륨염으로 포화한 에틸렌글리콜 용매 75g 및 수산화나트륨 0.15mol, 또는 테레프탈산1-칼륨 2-나트륨염으로 포화한 에틸렌글리콜 용매 75g 및 수산화칼륨 0.075mol 및 수산화나트륨 0.075mol을 투입했다.
계속해서 핫스터러로 강하게 교반하면서 160℃, 120분간 가열하여 가수분해시켰다. 방랭하여 내온 40℃ 이하가 되고 나서 내용물을 꺼냈다.
이 내용물을 여과지로 여과분별하여 여과액과 잔사로 나눈 후에 각 잔사의 무게와 잔사 내 테레프탈산의 총량을 측정했다. 표 10에 나타내는 결과로부터 여과 후 잔사 내 테레프탈산의 총량은 수산화칼륨, 수산화칼륨과 수산화나트륨의 혼합물, 수산화나트륨의 순으로 많다는 것을 알 수 있었다.
테레프탈산염으로 포화한 에틸렌글리콜 용매 중 PBT의 해중합에서의 테레프탈산의 생산량 차이
PBT 해중합에 이용한 용매 PBT 해중합에 이용한 알칼리금속 수산화물 잔사 회수량(g) 잔사 내 테레프탈산의 총량(mmol)
테레프탈산2칼륨염으로 포화한 에틸렌글리콜 수산화칼륨 25.8 53.0
테레프탈산2나트륨염으로 포화한 에틸렌글리콜 수산화나트륨 26.8 41.4
테레프탈산1-칼륨4-나트륨염으로 포화한 에틸렌글리콜 수산화칼륨과 수산화나트륨 26.6 49.7
실시예 9. 1-부탄올 중 폐기 PET의 해중합에서의 수산화칼륨과 수산화나트륨의 차이
테레프탈산2칼륨염과 테레프탈산2나트륨염의 1-부탄올에 대한 용해도를 실시예 1과 동일하게 하여 조사했더니, 각각 0.2mM과 1.9mM이었다. 이와 같이 에틸렌글리콜에 대한 용해와 달리 1-부탄올에 대해서는 용해하기가 매우 어렵다는 것을 알 수 있었다.
따라서 신품인 1-부탄올을 이용한 해중합 반응용 용매와 폐기 PET의 해중합 반응에 한 번 제공한 1-부탄올 용매 사이에서는 해중합 반응에서 생성된 테레프탈산염의 회수효율에 큰 차이가 생기지 않기 때문에 1-부탄올을 이용하는 이하의 실시예에서는 신품인 1-부탄올을 이용한 예만 나타낸다.
200mL의 스테인리스제 비커에 폐기 페트병 파쇄물 13g과 1-부탄올 80g을 투입한 후, 수산화칼륨(과립상) 0.14mol 또는 수산화나트륨(과립상) 0.14mol을 투입하여 핫스터러로 강하게 교반하면서 각각 100℃, 60분간 또는 90분간 가열처리했다. 이 용액을 자연냉각시켜 내온 40℃ 이하가 되고 나서 여과지(와트만사제 그레이드 540)로 여과분별하여 여과액과 잔사로 나누었다. 잔사를 깔때기 상에서 메탄올 50mL에 의해 세정 후, 진공건조기(애즈원사 제조)를 사용하여 60℃에서 중량감소가 0.1g/시간 미만이 될 때까지 건조시켰다. 잔사 중량과 잔사 내 테레프탈산 함량은 표 11에 나타낸다. 표 11에 나타내는 바와 같이 수산화나트륨보다 수산화칼륨을 이용하는 것이 테레프탈산염의 생성효율도 우수한 것을 알 수 있었다.
부탄올용매 중 PET의 해중합에서의 알칼리금속 수산화물에 따른 테레프탈산의 생성량 차이
PET 해중합에 이용한 알칼리금속 수산화물 가열시간(분) 잔사 회수량(g) 잔사중 테레프탈산의 총량(mmol)
수산화칼륨
수산화칼륨
수산화나트륨
수산화나트륨		 60
90
60
90		 17.1
16.1
14.5
14.5		 67.5
67.3
59.2
63.9
실시예 10. 1-부탄올 중 PTT의 해중합에서의 수산화칼륨과 수산화나트륨의 차이
200mL의 스테인리스제 비커에 PTT제 솜(니시카와산업사 제조, 파인스무스 솔로텍스 솜보충용 팩 RC7954) 13g 및 1-부탄올 130g을 투하한 후에 수산화칼륨(과립상) 0.13mol, 혹은 수산화나트륨(과립상) 0.13mol을 투입했다. 핫스터러로 강하게 교반하면서 수산화칼륨의 경우에는 100℃에서 90분간의 가열처리 및 수산화나트륨의 경우에는 100℃에서 120분간의 가열처리를 했다.
가열처리 후 자연냉각시켜 내온 40℃ 이하가 되고 나서 내용물을 꺼냈다. 이 내용물을 여과지(와트만제, 그레이드 540)로 여과분별하여 여과액과 잔사로 나눈 후, 각 잔사의 무게와 잔사 내 테레프탈산의 총량을 측정했다.
표 12에 나타내는 결과로부터 잔사 내 테레프탈산의 총량은 수산화나트륨보다 수산화칼륨을 이용하는 것이 가열시간이 짧음에도 불구하고 많다는 것을 알 수 있었다.
1-부탄올용매 중 PTT의 해중합에서의 알칼리금속 수산화물에 의한 테레프탈산의 생성량 차이
PTT 해중합에 이용한 알칼리금속 수산화물 가열시간(분) 잔사 회수량(g) 잔사중 테레프탈산의 총량(mmol)
수산화칼륨
수산화나트륨		 60
120		 26.1
22.2		 60.2
54.3
실시예 11. 1-부탄올 중 PBT의 해중합에서의 수산화칼륨과 수산화나트륨의 차이
200mL의 스테인리스제 비커에 실시예 7에서 조제한 폐기 PBT제 사기숟가락의 파쇄물 15g 및 1-부탄올 75g을 더한 후, 수산화칼륨(과립상) 0.15mol 혹은 수산화나트륨(과립상) 0.15mol을 투입하고 핫스터러로 강하게 교반하면서 100℃에서 240분간 가열처리한 후 자연냉각시켜 내온 40℃ 이하가 되고 나서 내용물을 꺼냈다.
이 내용물을 여과지로 여과분별하여 여과액과 잔사로 나눈 후, 각 잔사의 무게와 잔사 내 테레프탈산의 총량을 측정했다.
표 13에 나타내는 바와 같이 잔사 내 테레프탈산의 총량은 수산화나트륨보다 수산화칼륨을 이용하는 쪽이 많다는 것을 알 수 있었다.
1-부탄올용매 중 PBT의 해중합에서의 알칼리금속 수산화물에 의한 테레프탈산의 생성량 차이
PBT 해중합에 이용한
알칼리금속 수산화물		 잔사 회수량(g) 잔사중 테레프탈산의 총량(mmol)
수산화칼륨
수산화나트륨		 26.0
25.0		 44.5
43.3
실시예 12. 에틸렌글리콜을 포함하는 테레프탈산염에서 TPA-DHD를 생산했을 때 에틸렌글리콜의 분해
에틸렌글리콜 분해능을 가지는 TPA-DHD 생산균은 참고예 3에서 구축한 pUXPEaLT_tpaA_tpaK_Pm_fucO_I7L_aldA를 대장균 K-12 M7032주에 형질전환법에 의해 도입하는 것에 의해 대장균 M7032 (pUXPEaLT_tpaA_tpaK_Pm_fucO_I7L_aldA)주를 조성했다.
계속해서 실시예 1과 동일하게 하여 대장균 M7032 (pUXPEaLT_tpaA_tpaK_Pm_fucO_I7L_aldA)주와 대조가 되는 대장균 K-12 M7032주를 미니 자발효기로 배양했다. 원료가 되는 테레프탈산2칼륨염의 투여와 동시에 에틸렌글리콜 0.278ml(종농도 72mM)를 투입했다.
본배양 개시 후 48시간 후에 샘플링했다. 각 샘플은 LC-TOF형 질량분석계(Waters사, LCT Premier XE)에 의한 표 1에 나타내는 조건에서의 분석에 제공했다. 테레프탈산의 동정은 표본 테레프탈산과 비교하여 고속 액체 크로마토그래피의 유지시간과 질량분석계로부터의 정밀질량치를 함께 이용하여 실시했다. TPA-DHD는 테레프탈산의 감소에 따라 출현하는 물질 중에서 TPA-DHD의 예상 정밀질량치를 기초로 동정했다. 또 TPA-DHD의 정량은 테레프탈산의 감소량과 TPA-DHD의 피크 에리어의 증가에서 작성한 검량선을 기초로 했다.
그 결과 테레프탈산의 감소에 수반되어 TPA-DHD의 증가가 관찰되었다. 배양 48시간 후의 TPA-DHD 생산량은 대장균 M7032 (pUXPEaLT_tpaA_tpaK_Pm_fucO_I7L_aldA)주와 대장균 K-12 M7032주의 배양 48시간 후의 TPA-DHD 생산량은 각각 10.5g/L, 11.1g/L였다.
계속해서 배양 48시간 후의 배양액 중의 에틸렌글리콜량을 가스 크로마토그래피(GC)형 질량분석계(GC: 아질렌트사 7890A, 질량분석계: 아질렌트사 5975C)를 이용하여 표 14에 나타내는 조건으로 분석했다. 에틸렌글리콜은 표본 에틸렌글리콜과 비교하여 가스 크로마토그래피의 유지시간의 측정과 질량분석계로부터의 m/z62를 타겟 이온으로 한 측정을 함께 실시하여 동정했다. 그 결과 대장균 M7032 (pUXPEaLT_tpaA_tpaK_Pm_fucO_I7L_aldA)주와 대장균 M7032주의 배양 48시간 후의 에틸렌글리콜의 농도는 각각 37.1mM, 0.0mM인 것을 알 수 있으며, 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 발현량 증강에 따라 테레프탈산염에 포함되어 있는 에틸렌글리콜을 분해할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
가스 크로마토그래피형 질량분석계의 분석조건
컬럼 DB-WAX(내경: 0.25mm, 길이: 30m, 막두께: 0.25㎛, J&W Scientific)
주입온도 250℃
인터페이스온도 250℃
주입모드 스플릿리스
주입량 1㎕
오픈프로그램 1ml/분
MS 모드 40℃(5분), 다음에 10℃/분으로 230℃까지 승온
검출기 게인 EI(70eV)
측정모드 SIM
실시예 13. PET의 해중합에 의해 얻어진 테레프탈산염에서 프로토카테큐산 생산
참고예 2에서 조성한 프로토카테큐산 생산 대장균주 M7032(pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK)를 이용하여 실시예 2와 동일하게 하여 본 프로토카테큐산 생산균의 전배양액을 조제한 후, 그 전배양액을 2%만 본배양 배지에 접종하여 본배양을 했다. 균체 탁도가 흡광도 600nm에서 약 7이 되었을 때 유도제 m-톨루일산을 종농도 1mM가 되도록 첨가하여 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질, 테레프탈산 디히드로디올디히드로게나아제 단백질 및 테레프탈산트랜스포터 단백질을 발현시켰다. 글루코오스 농도를 경시적으로 계측하여 글루코오스 농도가 0이 되었을 때 실시예 6에서 작성한 PET 유래 테레프탈산염을 0.6M에 용해하고 글루코오스와 혼합하여 배양장치에 투여했다.
본배양 개시 후 52시간 후에 샘플링했다. 각 샘플은 LC-TOF형 질량분석계(Waters사, LCT Premier XE)에 의한 분석에 제공했다. 테레프탈산 및 프로토카테큐산의 동정은 표본 테레프탈산 및 프로토카테큐산과 비교하여 고속 액체 크로마토그래피의 유지시간과 질량분석계로부터의 정밀질량치를 함께 이용하여 실시했다.
그 결과, 테레프탈산의 감소에 수반되어 프로토카테큐산의 증가가 관찰되었다. 배양 52시간 후의 각 테레프탈산염으로부터의 프로토카테큐산 생산량을 100%로 한 비율을 표 15에 나타냈다. 표 15에 나타내는 결과로부터 2종류의 테레프탈산칼륨염이 모두 테레프탈산2나트륨염보다 프로토카테큐산의 생산성이 우수하다는 것이 밝혀졌다.
PET 해중합에 의해 얻어진 테레프탈산염에서 프로토카테큐산 생산
원료로 한 테레프탈산염 프로토카테큐산(g/L) 생산성비
테레프탈산2나트륨염
테레프탈산2칼륨염
테레프탈산1-칼륨4나트륨염		 10.2
11.5
11.1		 100%
113%
109%
실시예 14. PTT의 해중합에 의해 얻어진 테레프탈산염에서 TPA-DHD 생산
참고예 2에서 구축한 TPA-DHD 생산 재조합 대장균주 M7032(pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK)를 이용하고 실시예 2와 동일하게 하여 본 TPA-DHD 생산균의 전배양액을 조제한 후, 그 전배양액을 2%만 본배양 배지에 접종하여 본배양을 했다. 균체 탁도가 흡광도 600nm에서 약 7이 되었을 때 유도제 m-톨루일산을 종농도 1mM가 되도록 첨가하여 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질 및 테레프탈산트랜스포터 단백질을 발현시켰다. 글루코오스 농도를 경시적으로 계측하여 글루코오스 농도가 0이 되었을 때 실시예 7에서 작성한 PTT 유래 테레프탈산염을 0.6M에 용해하고 글루코오스와 혼합하여 배양장치에 투여했다.
본배양 개시 후 48시간 후에 샘플링했다. 각 샘플은 LC-TOF형 질량분석계(Waters사, LCT Premier XE)에 의한 표 1에 나타내는 조건에서의 분석에 제공했다. 테레프탈산의 동정은 표본 테레프탈산과 비교하여 고속 액체 크로마토그래피의 유지시간과 질량분석계로부터의 정밀질량치를 함께 이용하여 실시했다. TPA-DHD는 테레프탈산의 감소에 수반되어 출현하는 물질 중에서 TPA-DHD의 예상 정밀질량치를 기초로 동정했다. 또 TPA-DHD의 정량은 테레프탈산의 감소량과 TPA-DHD의 피크 에리어의 증가에서 작성한 검량선을 기초로 했다.
그 결과, 테레프탈산의 감소에 수반되어 TPA-DHD의 증가가 관찰되었다. 배양 48시간 후의 각 테레프탈산염으로부터의 TPA-DHD 생산량을 100%로 한 비율을 표 16에 나타낸다. 표 16에 나타내는 결과로부터 2종류의 테레프탈산칼륨염이 모두 테레프탈산2나트륨염보다 TPA-DHD의 생산성이 우수하다는 것이 밝혀졌다.
PTT 해중합에 의해 얻어진 테레프탈산염에서 TPA-DHD 생산
원료로 한 테레프탈산염 TPA-DHD(g/L) 생산성비
테레프탈산2나트륨염
테레프탈산2칼륨염
테레프탈산1-칼륨4나트륨염		 12.8
17.7
14.3		 100%
138%
112%
실시예 15. PTT의 해중합에 의해 얻어진 테레프탈산염에서 프로토카테큐산 생산
참고예 2에서 조성한 프로토카테큐산 생산 대장균주 M7032(pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK)를 이용하고 실시예 2와 동일하게 하여 본 프로토카테큐산 생산균의 전배양액을 조제한 후, 그 전배양액을 2%만 본배양 배지에 접종하여 본배양을 했다. 균체 탁도가 흡광도 600nm에서 약 7이 되었을 때 유도제 m-톨루일산을 종농도 1mM가 되도록 첨가하여 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질, 테레프탈산디히드로디올디히드로게나아제 단백질 및 테레프탈산트랜스포터 단백질을 발현시켰다. 글루코오스 농도를 경시적으로 계측하여 글루코오스 농도가 0이 되었을 때 실시예 8에서 작성한 PBT 유래 테레프탈산염을 0.6M에 용해하고 글루코오스와 혼합하여 배양장치에 투여했다.
본배양 개시 후 48시간 후에 샘플링했다. 각 샘플은 LC-TOF형 질량분석계(Waters사, LCT Premier XE)에 의한 분석에 제공했다. 테레프탈산 및 프로토카테큐산의 동정은 표본 테레프탈산 및 프로토카테큐산과 비교하여 고속 액체 크로마토그래피의 유지시간과 질량분석계로부터의 정밀질량치를 함께 이용하여 실시했다.
그 결과, 테레프탈산의 감소에 수반되어 프로토카테큐산의 증가가 관찰되었다. 배양 48시간 후의 각 테레프탈산염으로부터의 프로토카테큐산 생산량을 100%로 한 비율을 표 17에 나타냈다. 표 17에 나타내는 결과로부터 2종류의 테레프탈산칼륨염이 모두 테레프탈산2나트륨염보다 프로토카테큐산의 생산성이 우수하다는 것이 밝혀졌다.
PBT 해중합에 의해 얻어진 테레프탈산염에서 프로토카테큐산 생산
원료로 한 테레프탈산염 프로토카테큐산(g/L) 생산성비
테레프탈산2나트륨염
테레프탈산2칼륨염
테레프탈산1-칼륨4나트륨염		 10.2
11.6
11.0		 100%
114%
108%
실시예 16. 1-부탄올 용매 중에서 PET의 해중합에 의해 얻어진 테레프탈산염에서 TPA-DHD 생산
참고예 2에서 조성한 TPA-DHD 생산 재조합 대장균주 M7032(pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK)를 이용하고 실시예 2와 동일하게 하여 본 TPA-DHD 생산균의 전배양액을 조제한 후, 그 전배양액을 2%만 본배양 배지에 접종하여 본배양을 했다. 균체 탁도가 흡광도 600nm에서 약 7이 되었을 때 유도제 m-톨루일산을 종농도 1mM가 되도록 첨가하여 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 단백질, 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질 및 테레프탈산트랜스포터 단백질을 발현시켰다. 글루코오스 농도를 경시적으로 계측하여 글루코오스 농도가 0이 되었을 때 실시예 9에서 작성한 1-부탄올 중에서 해중합하여 얻은 PET 유래의 테레프탈산염을 0.6M에 용해하고 글루코오스와 혼합하여 배양장치에 투여했다.
본배양 개시 후 35시간 후에 샘플링했다. 각 샘플은 LC-TOF형 질량분석계(Waters사, LCT Premier XE)에 의한 표 1에 나타내는 조건에서의 분석에 제공했다. 테레프탈산의 동정은 표본 테레프탈산과 비교하여 고속 액체 크로마토그래피의 유지시간과 질량분석계로부터의 정밀질량치를 함께 이용하여 실시했다. TPA-DHD는 테레프탈산의 감소에 수반되어 출현하는 물질 중에서 TPA-DHD의 예상 정밀질량치를 기초로 동정했다. 또 TPA-DHD의 정량은 테레프탈산의 감소량과 TPA-DHD의 피크 에리어의 증가에서 작성한 검량선을 기초로 했다.
그 결과, 테레프탈산의 감소에 수반되어 TPA-DHD의 증가가 관찰되었다. 배양 35시간 후의 각 테레프탈산염으로부터의 TPA-DHD 생산량을 100%로 한 비율을 표 18에 나타낸다. 표 18에 나타내는 결과로부터 2종류의 테레프탈산칼륨염이 모두 테레프탈산2나트륨염보다 TPA-DHD의 생산성이 우수하다는 것이 밝혀졌다.
1-부탄올 중에서의 PET 해중합에 의해 얻어진 테레프탈산염에서 TPA-DHD 생산
원료로 한 테레프탈산염 TPA-DHD(g/L) 생산성비
테레프탈산2나트륨염
테레프탈산2칼륨염
테레프탈산1-칼륨4나트륨염		 12.8
17.4
14.8		 100%
136%
116%
참고예 1. 발현벡터 pUXPEaLT19의 구축
대장균을 이용하여 유전자의 전사·번역효율에 의존하지 않는 효율 좋은 발현을 하기 위해 목적유전자의 전사는 유사유전자에 의존하고 유사유전자의 번역효율을 유지한 상태로 목적유전자도 번역되는 발현계의 구축을 했다. 보다 구체적으로는 pUC19(다카라바이오사 제조)에 터미네이터 서열을 삽입하기 위해 서열번호 13∼18로 나타내는 6개의 합성 DNA를 합성했다.
이 합성 DNA를 pUC19의 KpnI 부위와 EcoRI 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pUC1LT1을 구축했다. 이어서 pUC1LT1의 PvuII 부위와 HindIII 부위 사이를 삭제한 pULTDL1을 구축했다. pULTDL1에 T7 프로모터 서열과 유사유전자 및 목적유전자를 연결하기 위한 PacI 부위를 삽입하기 위해 서열번호 19∼24로 나타내는 6개의 합성 DNA를 합성했다. 이 합성 DNA를 pULTDL1의 SphI 부위와 SalI 부위 사이에 삽입하여 발현 플라스미드 pUTPELT19를 구축했다. 이어서 PrimeSTAR DNA 폴리메라제(다카라바이오 제조; 이하 특별히 기재하지 않는 한 PCR 반응에 이용하는 DNA 증폭효소는 본효소를 이용했다.)를 이용한 PCR법에 의해 pUTPELT19의 BglII 부위와 PacI 부위 사이를 서열번호 25로 나타내는 서열로 치환한 발현 플라스미드 pUTPEaLT19를 구축했다.
그리고 XylS-Pm 프로모터를 이용한 유도발현계를 구축하기 위해 XylS-Pm 프로모터 영역의 DNA를 취득하기로 했다. XylS-Pm 프로모터 영역은 국립유전학연구소에서 입수한 플라스미드 pJB866을 주형으로 하고 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 26과 27)를 이용한 PCR 반응에 의해 증폭하여 취득했다. Taq DNA 폴리메라제에 의해 증폭 DNA 단편의 3' 말단에 A잔기를 부가한 후, 그 증폭 DNA 단편을 겔전기영동법에 의해 정제하여 pT7Blue-T벡터(노바젠사 제조)에 도입하는 것에 의해 XylS-Pm 프로모터의 전영역을 유지하는 플라스미드 pT7-xylS_Pm를 구축했다.
플라스미드 pT7-xylS_Pm에서 제한효소 SbfI와 제한효소 BamHI에 의해 XylS-Pm 프로모터의 영역을 잘라내어 pUTPEaLT19의 SbfI 부위와 BglII 부위 사이에 도입하는 것에 의해 발현벡터 pUXPEaLT19를 조성했다.
참고예 2. 프로토카테큐산 생산 플라스미드의 구축
(1) 코마모나스 테스토스테로니 72W2주를 자연계에서 분리
코마모나스 테스토스테로니 72W2주는 도쿄 이타바시구에서 채취한 토양에서 테레프탈산을 유일한 탄소원으로 하여 생육하는 균주로서 얻었다.
구체적으로는 채취한 토양시료를 15ml 팔콘튜브에 넣은 10mM 테레프탈산을 함유하는 W액체 배지 5ml에 넣은 후 30℃에서 진탕배양했다. 다만 W액체 배지의 조성은 인산2수소칼륨 0.85g/L, 인산수소2나트륨 4.9g/L, 황산암모늄 0.5g/L, 황산마그네슘7수화물 9.5mg/L, 황산철(II)7수화물 9.5mg/L, 산화마그네슘 10.75mg/L, 탄산칼슘 2mg/L, 황산아연7수화물 4.5mg/ml, 황산망간(II)4수화물 1.12mg/L, 황산구리(II)5수화물 0.25mg/L, 황산코발트(II)7수화물 0.28g/L, 붕산 0.06mg/L이다.
배양액을 10mM 테레프탈산을 함유하는 W액체 배지의 한천플레이트에 도포하여 30℃에서 배양하는 것에 의해 테레프탈산을 유일한 탄소원으로 하여 생육하는 균주를 선택했다. 한천플레이트에의 콜로니를 10mM 테레프탈산을 포함하는 W액체 배지 5ml로 3일간 배양했다. 본 균주의 16S rDNA 서열을 결정하는 것에 의해 본 균주를 코마모나스 테스토스테로니로 동정하고 72W2주라고 명명했다.
(2) 코마모나스 테스토스테로니 72W2주에서 유전자를 단리
코마모나스 테스토스테로니 72W2주를 배양하여 집균한 후, illustra bacteria genomicPrep Mini Spin Kit(GE헬스케어 재팬 주식회사에서 구입)를 이용해 게놈 DNA를 추출했다.
다음으로 코마모나스 테스토스테로니 YZW-D주의 테레프탈산 대사유전자군을 코딩하는 오페론의 염기서열을 내셔널 센터 포 바이오테크놀러지 인포메이션(이하 NCBI로 약칭함)의 GB 데이터베이스에서 GB등록번호 AY923836으로서 얻었다. 또 코마모나스속 E6주가 보유하는 테레프탈산 대사유전자군을 코딩하는 2개의 오페론의 염기서열을 NCBI의 GB 데이터베이스에서 얻었다. 구체적으로는 코마모나스 테스토스테로니 YZW-D주는 GB등록번호 AY923836에서의 염기번호 8242∼11908을 테레프탈산 대사유전자군의 오페론의 염기서열로서 사용했다. 코마모나스속 세균 E6주는 2개의 테레프탈산 대사유전자군의 오페론을 유지하기 위해 각각 GB등록번호 AB238678.1에서의 염기번호 3260∼6926과 GB등록번호 AB238679.1에서의 염기번호 4911∼8577을 테레프탈산 대사유전자군의 오페론의 염기서열로서 사용했다.
이 서열들을 기초로 코마모나스 테스토스테로니 72W2주의 테레프탈산 대사유전자군을 코딩하는 DNA를 클로닝하기 위해 축중 프라이머를 설계했다. 그 축중 프라이머 중 5' 프라이머(서열번호 28)에는 PacI 인식 부위를 부가하고 3' 프라이머(서열번호 29)에는 SgfI 인식 부위와 NotI 인식 부위를 부가했다.
이 2종류의 축중 프라이머를 이용하여 코마모나스 테스토스테로니 72W2주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 테레프탈산 대사유전자군(tphA2 유전자-tphA3 유전자-tphB 유전자-tphA1 유전자; 이하 tphA2A3BA1 유전자라고 약칭함)의 오페론 영역을 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. 증폭 DNA 단편을 QIAquick PCR 정제키트(키아겐사 제조; 이하 특별히 기재하지 않는 한 PCR 정제키트는 본키트를 이용했다.)를 이용해 회수했다. 그 증폭 DNA 단편의 염기서열을 결정했더니 그 DNA가 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 대서브유닛 단백질을 코딩하는 tphA2 유전자(서열번호 1), 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질을 코딩하는 tphA3 유전자(서열번호 3), TPA-DHD 디히드로게나아제 단백질을 코딩하는 tphB 유전자(서열번호 9), 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질을 코딩하는 tphA1 유전자(서열번호 5)를 코딩하고 있는 것을 확인했다.
tphA2A3BA1 유전자의 오페론(서열번호 30)을 제한효소 PacI와 제한효소 NotI에 의해 PCR 산물로부터 잘라내어 참고예 1에 기재한 발현벡터 pUXPEaLT19의 PacI 부위와 NotI 부위 사이에 도입하는 것에 의해 테레프탈산에서 프로토카테큐산으로의 전환에 관련되는 효소군을 발현하는 플라스미드 pUXPEaLT_tphA2A3BA1를 조성했다.
(4) 테레프탈산트랜스포터의 클로닝과 프로토카테큐산 생산 플라스미드의 구축
대장균 K-12주의 테레프탈산 도입능이 약하다는 것을 알았으므로, 테레프탈산의 도입을 촉진하는 테레프탈산트랜스포터를 발현시키는 것에 의해 테레프탈산 도입능을 강화하려고 시도했다.
구체적으로는 테레프탈산으로부터 균체 내로의 테레프탈산 도입을 촉진시키는 효과가 있는 로도코커스 죠스티 RHA1주의 테레프탈산트랜스포터 tpaK를 코딩하는 DNA를 얻기로 했다. tpaK 유전자의 염기서열에 대해서는 NCBI의 GB 데이터베이스에서 등록번호 CP000432에서의 염기번호 175046∼176425의 서열(서열번호 7)로서 얻었다. 나가오카기술과학대학의 후쿠다 마사오 교수에게서 입수한 로도코커스 죠스티 RHA1주의 염색체 DNA(100ng)를 주형으로 하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 31과 서열번호 32)를 이용해 테레프탈산트랜스포터 단백질(서열번호 8)을 코딩하고 있는 tpaK 유전자의 전영역을 PCR 반응에 의해 증폭시켰다.
증폭 DNA 단편을 PCR 정제키트를 이용해 회수했다. tpaK 유전자를 제한효소 PacI와 제한효소 NotI에 의해 PCR 산물로부터 잘라내어 상기한 플라스미드 pUXPEaLT_tphA2A3BA1의 SgfI 부위와 NotI 부위 사이에 도입하는 것에 의해 프로토카테큐산 생산 플라스미드 pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK를 조성했다.
참고예 3. TPA-DHD 생산 플라스미드의 구축
참고예 2(4)에서 구축한 pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK(100 ng)를 주형으로 하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 28과 서열번호 33)를 이용해 tphA2 유전자-tphA3 유전자영역을 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. 또 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 29와 서열번호 34)를 이용해 tphA1 유전자영역을 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. 이들 증폭 DNA 단편을 PCR 정제키트를 이용해 회수했다. 계속해서 회수한 tphA2 유전자-tphA3 유전자영역의 증폭 단편과 tphA1 유전자 증폭 단편을 주형으로 하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 28과 서열번호 29)를 이용해 tphA2-tphA3-tphA1 유전자영역을 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. 증폭 DNA 단편을 PCR 정제키트를 이용해 회수했다. 증폭 단편을 제한효소 PacI와 제한효소 HindIII에 의해 소화한 후, 참고예 2(3)에서 조성한 발현벡터 pUXPEaLT_tphA2A3BA1의 PacI 부위와 HindIII 부위 사이에 도입하는 것에 의해 pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK를 구축했다.
참고예 4. 갈산 생산 플라스미드의 구축
프로토카테큐산을 갈산으로 효율적으로 변환하기 위해 파라히드록시벤조산 히드록실라아제 유전자를 프로토카테큐산 생산 유전자군과 함께 발현시키는 플라스미드를 하기와 같이 하여 구축했다. 구체적으로는 공개특허공보(공개번호: 일본 공개특허공보 2009-213392호)에 개시되어 있는 파라히드록시벤조산 히드록실라아제(서열번호 12)를 코딩하는 DNA(서열번호 11)를 주형으로 하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 35와 서열번호 36)를 이용해 파라히드록시벤조산 히드록실라아제 단백질을 코딩하고 있는 DNA를 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. 증폭 DNA 단편을 PCR 정제키트를 이용해 회수했다. 그 DNA를 제한효소 PacI와 제한효소 SgfI에 의해 소화한 후, 상기에서 조성한 pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK의 PacI 부위에 도입하는 것에 의해 갈산 생산 플라스미드 pUXPEaLT_HFM145_tphA2A3BA1_tpaK를 조성했다.
참고예 5. 에틸렌글리콜 분해균의 조성
(1) 대장균 K-12주의 fucO 유전자의 클로닝
대장균 K-12 MG1655주 유래의 락토알데히드 리덕타아제 단백질을 코딩하는 fucO 유전자의 염기서열을 NCBI로부터 인터넷 경유로 취득한 염기서열(GB등록번호 U29581)의 13420∼14571번째의 서열로서 얻었다. 이 서열에 기초하여 합성한 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 37 서열번호 38)를 이용해 NBRP에서 입수한 대장균 K-12 MG1655주의 염색체 DNA(100 ng)를 주형으로 하여 fucO 유전자의 전영역을 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. 이 증폭 DNA 단편을 제한효소 PacI 부위와 제한효소 NotI에 의해 PCR 산물로부터 잘라내어 참고예 1에서 조성한 발현벡터 pUXPEaLT19에 도입하는 것에 의해 플라스미드 pUXPEaLT_fucO_I7L를 조성했다.
(2) 대장균 K-12주의 aldA 유전자의 클로닝
대장균 K-12 MG1655주 유래의 락토알데히드 디히드로게나아제 단백질을 코딩하는 aldA 유전자의 염기서열을 NCBI로부터 인터넷 경유로 취득한 염기서열(GB등록번호 U00096.2)의 1486256∼1487695번째의 서열로서 얻었다. 이 서열에 기초하여 합성한 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 39와 서열번호 40)를 이용해 대장균 K-12 MG1655주의 염색체 DNA(100ng)를 주형으로 하여 aldA 유전자의 전영역을 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. 이 증폭 DNA 단편을 제한효소 SwaI와 제한효소 NotI에 의해 PCR 산물로부터 잘라내어 플라스미드 pUXPEaLT_fucO_I7L에 도입하는 것에 의해 플라스미드 pUXPEaLT_fucO_I7L_aldA를 조성했다.
제한효소 NotI와 제한효소 AscI에 의해 서열번호 41에 나타내는 서열을 가지는 합성 DNA로부터 잘라내어 플라스미드 pUEPEaLT_fucO_I7L_aldA의 NotI 부위와 AscI 부위 사이에 도입하는 것에 의해 플라스미드 pUXPEaLTEk_fucO_I7L_aldA를 조성했다.
계속해서 플라스미드 pUXPEaLTEX_fucO_I7L_aldA로부터 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 42와 서열번호 43)를 이용해 PCR 반응에 의해 fucO 유전자와 aldA 유전자를 포함하는 발현유닛(이하 fucO-aldA 발현유닛이라 약칭함)을 증폭시켰다. 제한효소 AscI 부위에 의해 PCR 산물로부터 잘라내어 상기(참고예 3)에서 조성한 발현벡터 pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK에 도입하는 것에 의해 플라스미드 pUXPEaLT_tpaA_tpaK_PmfucO_I7L_aldA를 구축했다.
<산업상 이용가능성>
본 발명에 의하면 테레프탈산칼륨염을 원료로 하고 테레프탈산1,2-디옥시게나아제를 발현하는 미생물을 이용하여 테레프탈산-1,2-시스-디히드로디올을 제조하는 방법, 그리고 TPA-DHD를 프로토카테큐산이나 갈산 등의 페놀산으로 전환하는 방법 및 원료가 되는 테레프탈산칼륨염을 폐기 폴리에스테르의 해중합에 의해 얻는 방법에 제공할 수 있다.
(서열표 설명)
서열번호 1: 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 대서브유닛 단백질을 코딩하는 DNA
서열번호 2: 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 대서브유닛 단백질
서열번호 3: 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질을 코딩하는 DNA
서열번호 4: 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 옥시게나아제 소서브유닛 단백질
서열번호 5: 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질을 코딩하는 DNA
서열번호 6: 테레프탈산1,2-디옥시게나아제 리덕타아제 단백질
서열번호 7: 테레프탈산트랜스포터 단백질을 코딩하는 DNA
서열번호 8: 테레프탈산트랜스포터 단백질
서열번호 9: TPA-DHD 디히드로게나아제 단백질을 코딩하는 DNA
서열번호 10: TPA-DHD 디히드로게나아제 단백질
서열번호 11: 파라히드록시벤조산 히드록실라아제 단백질을 코딩하는 DNA
서열번호 12: 파라히드록시벤조산 히드록실라아제 단백질
서열번호 13: 터미네이터 구축용 합성 DNA
서열번호 14: 터미네이터 구축용 합성 DNA
서열번호 15: 터미네이터 구축용 합성 DNA
서열번호 16: 터미네이터 구축용 합성 DNA
서열번호 17: 터미네이터 구축용 합성 DNA
서열번호 18: 터미네이터 구축용 합성 DNA
서열번호 19: T7 프로모터와 유사유전자의 구축용 합성 DNA
서열번호 20: T7 프로모터와 유사유전자의 구축용 합성 DNA
서열번호 21: T7 프로모터와 유사유전자의 구축용 합성 DNA
서열번호 22: T7 프로모터와 유사유전자의 구축용 합성 DNA
서열번호 23: T7 프로모터와 유사유전자의 구축용 합성 DNA
서열번호 24: T7 프로모터와 유사유전자의 구축용 합성 DNA
서열번호 25: 플라스미드 pUTPELT19의 제한효소 BglII 부위와 제한효소 PacI 부위 사이의 서열
서열번호 26: XylS-Pm 프로모터 영역의 DNA의 취득용 PCR 프라이머
서열번호 27: XylS-Pm 프로모터 영역의 DNA의 취득용 PCR 프라이머
서열번호 28: 코마모나스 테스토스테로니의 테레프탈산대사유전자군의 클로닝용 축중 PCR 프라이머
서열번호 29: 코마모나스 테스토스테로니의 테레프탈산대사유전자군의 클로닝용 축중 PCR 프라이머
서열번호 30: 코마모나스 테스토스테로니 72W2주의 테레프탈산대사유전자군을 코딩하는 DNA
서열번호 31: 테레프탈산트랜스포터 클로닝용 PCR 프라이머
서열번호 32: 테레프탈산트랜스포터 클로닝용 PCR 프라이머
서열번호 33: tphA2 유전자-tphA3 유전자영역 클로닝용 PCR 프라이머
서열번호 34: tphA1 유전자영역 클로닝용 PCR 프라이머
서열번호 35: 개량형 파라히드록시벤조산 히드록실라아제 클로닝용 PCR 프라이머
서열번호 36: 개량형 파라히드록시벤조산 히드록실라아제 클로닝용 PCR 프라이머
서열번호 37: 대장균 락토알데히드 리덕타아제 클로닝용 PCR 프라이머
서열번호 38: 대장균 락토알데히드 리덕타아제 클로닝용 PCR 프라이머
서열번호 39: 대장균 락토알데히드 디히드로게나아제 클로닝용 PCR 프라이머
서열번호 40: 대장균 락토알데히드 디히드로게나아제 클로닝용 PCR 프라이머
서열번호 41: 플라스미드 pUXPEaLTEk_fucO_I7L_aldA의 NotI 부위와 AscI 부위 사이의 서열
서열번호 42: fucO 유전자와 aldA 유전자를 포함하는 발현유닛 클로닝용 PCR 프라이머
서열번호 43: fucO 유전자와 aldA 유전자를 포함하는 발현유닛 클로닝용 PCR 프라이머
독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터 NITEBP-1209 20120124
SEQUENCE LISTING <110> Genaris Inc. <120> Method of producing useful chemicals from potassium terephthalate as a raw material <130> GP1102-11321 <160> 43 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1242 <212> DNA <213> Comamonas testosteroni <220> <221> CDS <222> (1)..(1242) <400> 1 atg caa gaa tcc att atc cag tgg cat ggg gcc act aat aca cgc gtg 48 Met Gln Glu Ser Ile Ile Gln Trp His Gly Ala Thr Asn Thr Arg Val 1 5 10 15 cct ttc ggt atc tac act gac aca gcc aat gct gat caa gaa cag cag 96 Pro Phe Gly Ile Tyr Thr Asp Thr Ala Asn Ala Asp Gln Glu Gln Gln 20 25 30 cgc atc tat cgc ggc gag gtc tgg aac tac ctg tgc ctg gaa tct gaa 144 Arg Ile Tyr Arg Gly Glu Val Trp Asn Tyr Leu Cys Leu Glu Ser Glu 35 40 45 atc ccc gag gct ggt gat ttc cgt act acc ttt gcc ggt gaa aca ccg 192 Ile Pro Glu Ala Gly Asp Phe Arg Thr Thr Phe Ala Gly Glu Thr Pro 50 55 60 ata gtt gtc gta cgg gat gcc gac cag gaa atc tac gcc ttc gag aac 240 Ile Val Val Val Arg Asp Ala Asp Gln Glu Ile Tyr Ala Phe Glu Asn 65 70 75 80 cgc tgc gcg cat cgc ggc gct ctc atc gct ctg gag aaa tcg gga cgt 288 Arg Cys Ala His Arg Gly Ala Leu Ile Ala Leu Glu Lys Ser Gly Arg 85 90 95 acg gat agt ttc cag tgc gtc tat cac gcc tgg agc tac aac cga cag 336 Thr Asp Ser Phe Gln Cys Val Tyr His Ala Trp Ser Tyr Asn Arg Gln 100 105 110 gga gat ctg acc ggc gtt gcc ttc gag aaa ggt gtc aag ggc cag ggt 384 Gly Asp Leu Thr Gly Val Ala Phe Glu Lys Gly Val Lys Gly Gln Gly 115 120 125 ggc atg ccg gcc tca ttc tgc aaa gaa gag cat ggc ccg cgc aag ctc 432 Gly Met Pro Ala Ser Phe Cys Lys Glu Glu His Gly Pro Arg Lys Leu 130 135 140 cgc gtg gct gtc ttt tgc ggt ttg gtc ttt ggc agt ttt tcc gag gac 480 Arg Val Ala Val Phe Cys Gly Leu Val Phe Gly Ser Phe Ser Glu Asp 145 150 155 160 gta ccc agc att gag gat tac ctt ggc cct gag att tgc gag cgc ata 528 Val Pro Ser Ile Glu Asp Tyr Leu Gly Pro Glu Ile Cys Glu Arg Ile 165 170 175 gag cgc gtg ctg cac aag ccc gta gaa gtc atc ggt cgc ttc acg caa 576 Glu Arg Val Leu His Lys Pro Val Glu Val Ile Gly Arg Phe Thr Gln 180 185 190 aag 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295 300 agc atc gcc gtg cgt cag ttg ttg ccc aag agc atc tcc agc tcg gaa 960 Ser Ile Ala Val Arg Gln Leu Leu Pro Lys Ser Ile Ser Ser Ser Glu 305 310 315 320 ctc aac tgg acc tat ctt ggc tat gca gat gac agt gca gag cag cgc 1008 Leu Asn Trp Thr Tyr Leu Gly Tyr Ala Asp Asp Ser Ala Glu Gln Arg 325 330 335 aag gtc aga ctc aaa cag gcc aac ctc atc ggc cct gca gga ttt att 1056 Lys Val Arg Leu Lys Gln Ala Asn Leu Ile Gly Pro Ala Gly Phe Ile 340 345 350 tcc atg gag gac gga gct gtc ggt gga ttc gtg cag cgt ggc atc gca 1104 Ser Met Glu Asp Gly Ala Val Gly Gly Phe Val Gln Arg Gly Ile Ala 355 360 365 ggc gct gcc aac ctt gat gcg gtc atc gag atg ggc gga gac cac gaa 1152 Gly Ala Ala Asn Leu Asp Ala Val Ile Glu Met Gly Gly Asp His Glu 370 375 380 ggc tct agc gag ggc cgc gcc aca gaa acc tcg gta cgc ggc ttt tgg 1200 Gly Ser Ser Glu Gly Arg Ala Thr Glu Thr Ser Val Arg Gly Phe Trp 385 390 395 400 aag gcc tac cgc aag cat atg gga cag gag atg caa gca tga 1242 Lys Ala Tyr Arg Lys His Met Gly Gln Glu Met Gln Ala 405 410 <210> 2 <211> 413 <212> PRT <213> Comamonas testosteroni <400> 2 Met Gln Glu Ser Ile Ile Gln Trp His Gly Ala Thr Asn Thr Arg Val 1 5 10 15 Pro Phe Gly Ile Tyr Thr Asp Thr Ala Asn Ala Asp Gln Glu Gln Gln 20 25 30 Arg Ile Tyr Arg Gly Glu Val Trp Asn Tyr Leu Cys Leu Glu Ser Glu 35 40 45 Ile Pro Glu Ala Gly Asp Phe Arg Thr Thr Phe Ala Gly Glu Thr Pro 50 55 60 Ile Val Val Val Arg Asp Ala Asp Gln Glu Ile Tyr Ala Phe Glu Asn 65 70 75 80 Arg Cys Ala His Arg Gly Ala Leu Ile Ala Leu Glu Lys Ser Gly Arg 85 90 95 Thr Asp Ser Phe Gln Cys Val Tyr His Ala Trp Ser Tyr Asn Arg Gln 100 105 110 Gly Asp Leu Thr Gly Val Ala Phe Glu Lys Gly Val Lys Gly Gln Gly 115 120 125 Gly Met Pro Ala Ser Phe Cys Lys Glu Glu His Gly Pro Arg Lys Leu 130 135 140 Arg Val Ala Val Phe Cys Gly Leu Val Phe Gly Ser Phe Ser Glu Asp 145 150 155 160 Val Pro Ser Ile Glu Asp Tyr Leu Gly Pro Glu Ile Cys Glu Arg Ile 165 170 175 Glu Arg Val Leu His Lys Pro Val Glu Val Ile Gly Arg Phe Thr Gln 180 185 190 Lys Leu Pro Asn Asn Trp 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ttg cat gag 480 Met Leu Val Gly Ala Gly Leu Arg Ile Val His Val Thr Leu His Glu 145 150 155 160 agc gtg cgt agc gca cta gag cgg ctc tca cct cag ttg gtt atc aac 528 Ser Val Arg Ser Ala Leu Glu Arg Leu Ser Pro Gln Leu Val Ile Asn 165 170 175 gcg gtg gat gcc gcc gtg cag aca tgc acc cta ctc ggg gtg cct aaa 576 Ala Val Asp Ala Ala Val Gln Thr Cys Thr Leu Leu Gly Val Pro Lys 180 185 190 ccg caa gtc gct gta ttc ggg atc aac cct cat gca tcc gaa gga cag 624 Pro Gln Val Ala Val Phe Gly Ile Asn Pro His Ala Ser Glu Gly Gln 195 200 205 ttg ttc ggc ctg gag gac tcg cag atc acc gtt cct gcc gtc gag aca 672 Leu Phe Gly Leu Glu Asp Ser Gln Ile Thr Val Pro Ala Val Glu Thr 210 215 220 ctg cgc aag cgc ggc ctg acg gta gac ggc ccc atg gga gca gac atg 720 Leu Arg Lys Arg Gly Leu Thr Val Asp Gly Pro Met Gly Ala Asp Met 225 230 235 240 gtt ctg gca cag cgc aag cac gac ttg tat gtg gcc atg ctg cat gac 768 Val Leu Ala Gln Arg Lys His Asp Leu Tyr Val Ala Met Leu His Asp 245 250 255 caa ggg cac att ccc atc aag ctg ctg gct cct aac gga gcc agt gcg 816 Gln Gly His Ile Pro Ile Lys Leu Leu Ala Pro Asn Gly Ala Ser Ala 260 265 270 ctc tcc atc ggc ggc agg gtg gtg ctt tcc agc gtg ggc cat ggc agc 864 Leu Ser Ile Gly Gly Arg Val Val Leu Ser Ser Val Gly His Gly Ser 275 280 285 gcc atg gac att gcc ggc cgt ggc gtg gct gac gcc acg gcc ctc cta 912 Ala Met Asp Ile Ala Gly Arg Gly Val Ala Asp Ala Thr Ala Leu Leu 290 295 300 cgc aca atc gcc cta ctc gga gcc caa ccg gtc tga 948 Arg Thr Ile Ala Leu Leu Gly Ala Gln Pro Val 305 310 315 <210> 10 <211> 315 <212> PRT <213> Comamonas testosteroni <400> 10 Met Thr Ile Val His Arg Arg Leu Ala Leu Ala Ile Gly Asp Pro His 1 5 10 15 Gly Ile Gly Pro Glu Ile Ala Leu Lys Ala Leu Gln Gln Leu Ser Ala 20 25 30 Thr Glu Arg Ser Leu Ile Lys Val Tyr Gly Pro Trp Ser Ala Leu Glu 35 40 45 Gln Ala Ala Gln Ile Cys Gln Met Glu Ser Leu Leu Gln Asp Leu Ile 50 55 60 His Glu Glu Ala Gly Ser Leu Ala Gln Pro Val Gln Cys Gly Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Gln Ala Gly Leu Ser Thr Val Gln Ser Ala Thr Ala Ala Ile 85 90 95 Arg Ala Cys Glu Ser Gly Glu Val Asp Ala Val Ile Ala Cys Pro His 100 105 110 His Glu Thr Ala Ile His Arg Ala Gly Ile Ala Phe Ser Gly Tyr Pro 115 120 125 Ser Leu Leu Ala Asn Val Leu Gly Met Asn Glu Asp Glu Val Phe Leu 130 135 140 Met Leu Val Gly Ala Gly Leu Arg Ile Val His Val Thr Leu His Glu 145 150 155 160 Ser Val Arg Ser Ala Leu Glu Arg Leu Ser Pro Gln Leu Val Ile Asn 165 170 175 Ala Val Asp Ala Ala Val Gln Thr Cys Thr Leu Leu Gly Val Pro Lys 180 185 190 Pro Gln Val Ala Val Phe Gly Ile Asn Pro His Ala Ser Glu Gly Gln 195 200 205 Leu Phe Gly Leu Glu Asp Ser Gln Ile Thr Val Pro Ala Val Glu Thr 210 215 220 Leu Arg Lys Arg Gly Leu Thr Val Asp Gly Pro Met Gly Ala Asp Met 225 230 235 240 Val Leu Ala Gln Arg Lys His Asp Leu Tyr Val Ala Met Leu His Asp 245 250 255 Gln Gly His Ile Pro Ile Lys Leu Leu Ala Pro Asn Gly Ala Ser Ala 260 265 270 Leu Ser Ile Gly Gly Arg Val Val Leu Ser Ser Val Gly His Gly Ser 275 280 285 Ala Met Asp Ile Ala Gly Arg Gly Val Ala Asp Ala Thr Ala Leu Leu 290 295 300 Arg Thr Ile Ala Leu Leu Gly Ala Gln Pro Val 305 310 315 <210> 11 <211> 1188 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220> <221> CDS <222> (1)..(1188) <400> 11 atg aac cac gta cca gtg gca att att ggc gca gga cca gca gga cta 48 Met Asn His Val Pro Val Ala Ile Ile Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu 1 5 10 15 acc ctc gcc cac ctc ctc cac ctt caa ggt gtg gaa tca atc gtc ttt 96 Thr Leu Ala His Leu Leu His Leu Gln Gly Val Glu Ser Ile Val Phe 20 25 30 gaa tcc cgc acc cgc aag gac gtc gaa gaa acc gtc cga gca ggc atc 144 Glu Ser Arg Thr Arg Lys Asp Val Glu Glu Thr Val Arg Ala Gly Ile 35 40 45 ctg gaa caa ggc acc ctg aat ctg atg cgc gaa acc gga gtc ggc gca 192 Leu Glu Gln Gly Thr Leu Asn Leu Met Arg Glu Thr Gly Val Gly Ala 50 55 60 cgc atg gaa gca gaa gcc gat cac gat gaa gca atc gac atc tcc atc 240 Arg Met Glu Ala Glu Ala Asp His Asp Glu Ala Ile Asp Ile Ser Ile 65 70 75 80 aac aat gag cgc acc cgc att ccg ctg acc gaa ctc acc ggc cac aag 288 Asn Asn Glu Arg Thr Arg Ile Pro Leu Thr Glu Leu Thr Gly His Lys 85 90 95 gtt gcg atc tac ccg cag cac gaa tac ctc aaa gat ttc att gcc aag 336 Val Ala Ile Tyr Pro Gln His Glu Tyr Leu Lys Asp Phe Ile Ala Lys 100 105 110 cgc atc gaa gat ggc ggc gaa ctc ctt ttc acc acc act gtt gat tcc 384 Arg Ile Glu Asp Gly Gly Glu Leu Leu Phe Thr Thr Thr Val Asp Ser 115 120 125 gta gaa aac tac gaa ggc gac ctc gcc aag gtg acc tac acc gaa gcc 432 Val Glu Asn Tyr Glu Gly Asp Leu Ala Lys Val Thr Tyr Thr Glu Ala 130 135 140 gat ggt tcc tcc acc acc atc acc gcc gac tac gtc atc gca gct gac 480 Asp Gly Ser Ser Thr Thr Ile Thr Ala Asp Tyr Val Ile Ala Ala Asp 145 150 155 160 ggc tcc aac tcc cct tac cgc aag ctg atc acc gaa gac ggt ggc gtg 528 Gly Ser Asn Ser Pro Tyr Arg Lys Leu Ile Thr Glu Asp Gly Gly Val 165 170 175 cgc gcc cgc cat gaa tac cct tac gca tgg ttc ggc att ttg gtg gaa 576 Arg Ala Arg His Glu Tyr Pro Tyr Ala Trp Phe Gly Ile Leu Val Glu 180 185 190 gca cca aaa acc caa aag gaa ctc atc tac gca acc cac cct gag ggc 624 Ala Pro Lys Thr Gln Lys Glu Leu Ile Tyr Ala Thr His Pro Glu Gly 195 200 205 ttt gcg ctg atc tcc acc cgt acc gat gaa atc cag cgc tac tac ctg 672 Phe Ala Leu Ile Ser Thr Arg Thr Asp Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Leu 210 215 220 cag tgc aac cct gac gac acc cca gac atg tgg ccc gat gac cgc att 720 Gln Cys Asn Pro Asp Asp Thr Pro Asp Met Trp Pro Asp Asp Arg Ile 225 230 235 240 tgg gaa cag ctg cac ctg cgt gcg gac tcc cct ggc atc acc gtg tct 768 Trp Glu Gln Leu His Leu Arg Ala Asp Ser Pro Gly Ile Thr Val Ser 245 250 255 gaa ggg cgc atc ttt gac aag gcc gtg ctg cgt ttc cgc tcc gcg gtc 816 Glu Gly Arg Ile Phe Asp Lys Ala Val Leu Arg Phe Arg Ser Ala Val 260 265 270 acc gaa cca atg caa aag gga cgc ctc ttc ctt gct ggc gat gct gca 864 Thr Glu Pro Met Gln Lys Gly Arg Leu Phe Leu Ala Gly Asp Ala Ala 275 280 285 cac acc gtg ccg cca acc gga gct aag ggc ctc aac ttg gct gtt gcc 912 His Thr Val Pro Pro Thr Gly Ala Lys Gly Leu Asn Leu Ala Val Ala 290 295 300 gat gtc tca gta ctc gcg cca gca ctg gtt cgt gcc ctg aag aag aag 960 Asp Val Ser Val Leu Ala Pro Ala Leu Val Arg Ala Leu Lys Lys Lys 305 310 315 320 gac acc ggc ttg ctc gat agc tac acc tcc ctg gca gtc ccc cgc atc 1008 Asp Thr Gly Leu Leu Asp Ser Tyr Thr Ser Leu Ala Val Pro Arg Ile 325 330 335 tgg aaa gca cag cac ttc tcc tac tgg atg agc tcc atg ctc cac gca 1056 Trp Lys Ala Gln His Phe Ser Tyr Trp Met Ser Ser Met Leu His Ala 340 345 350 gta ccc ggc gaa gat cac ttt gcc acc cag cgc cga ttc gct gaa ttg 1104 Val Pro Gly Glu Asp His Phe Ala Thr Gln Arg Arg Phe Ala Glu Leu 355 360 365 cgc tcc gtc cta gaa tcc caa tcc ggc caa cgc tac ctc gca gag cag 1152 Arg Ser Val Leu Glu Ser Gln Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Glu Gln 370 375 380 ttc gtt ggg cgc gac cta cca cgc ttc gag gta taa 1188 Phe Val Gly Arg Asp Leu Pro Arg Phe Glu Val 385 390 395 <210> 12 <211> 395 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <400> 12 Met Asn His Val Pro Val Ala Ile Ile Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ala His Leu Leu His Leu Gln Gly Val Glu Ser Ile Val Phe 20 25 30 Glu Ser Arg Thr Arg Lys Asp Val Glu Glu Thr Val Arg Ala Gly Ile 35 40 45 Leu Glu Gln Gly Thr Leu Asn Leu Met Arg Glu Thr Gly Val Gly Ala 50 55 60 Arg Met Glu Ala Glu Ala Asp His Asp Glu Ala Ile Asp Ile Ser Ile 65 70 75 80 Asn Asn Glu Arg Thr Arg Ile Pro Leu Thr Glu Leu Thr Gly His Lys 85 90 95 Val Ala Ile Tyr Pro Gln His Glu Tyr Leu Lys Asp Phe Ile Ala Lys 100 105 110 Arg Ile Glu Asp Gly Gly Glu Leu Leu Phe Thr Thr Thr Val Asp Ser 115 120 125 Val Glu Asn Tyr Glu Gly Asp Leu Ala Lys Val Thr Tyr Thr Glu Ala 130 135 140 Asp Gly Ser Ser Thr Thr Ile Thr Ala Asp Tyr Val Ile Ala Ala Asp 145 150 155 160 Gly Ser Asn Ser Pro Tyr Arg Lys Leu Ile Thr Glu Asp Gly Gly Val 165 170 175 Arg Ala Arg His Glu Tyr Pro Tyr Ala Trp Phe Gly Ile Leu Val Glu 180 185 190 Ala Pro Lys Thr Gln Lys Glu Leu Ile Tyr Ala Thr His Pro Glu Gly 195 200 205 Phe Ala Leu Ile Ser Thr Arg Thr Asp Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Leu 210 215 220 Gln Cys Asn Pro Asp Asp Thr Pro Asp Met Trp Pro Asp Asp Arg Ile 225 230 235 240 Trp Glu Gln Leu His Leu Arg Ala Asp Ser Pro Gly Ile Thr Val Ser 245 250 255 Glu Gly Arg Ile Phe Asp Lys Ala Val Leu Arg Phe Arg Ser Ala Val 260 265 270 Thr Glu Pro Met Gln Lys Gly Arg Leu Phe Leu Ala Gly Asp Ala Ala 275 280 285 His Thr Val Pro Pro Thr Gly Ala Lys Gly Leu Asn Leu Ala Val Ala 290 295 300 Asp Val Ser Val Leu Ala Pro Ala Leu Val Arg Ala Leu Lys Lys Lys 305 310 315 320 Asp Thr Gly Leu Leu Asp Ser Tyr Thr Ser Leu Ala Val Pro Arg Ile 325 330 335 Trp Lys Ala Gln His Phe Ser Tyr Trp Met Ser Ser Met Leu His Ala 340 345 350 Val Pro Gly Glu Asp His Phe Ala Thr Gln Arg Arg Phe Ala Glu Leu 355 360 365 Arg Ser Val Leu Glu Ser Gln Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Glu Gln 370 375 380 Phe Val Gly Arg Asp Leu Pro Arg Phe Glu Val 385 390 395 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 13 cgagctcgaa ttcgcggccg ctaatagtac ctg 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sythetic DNA <400> 14 tgaagtgaaa aatggcgcac attgtgcgac att 33 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 15 ttttttgtct gccgtttacc ggcgcgccgc gatcgcc 37 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 16 aattggcgat cgcggcgcgc cggtaaacgg cagacaa 37 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 17 aaaaaatgtc gcacaatgtg cgccattttt ca 32 <210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 18 cttcacaggt actattagcg gccgcgaatt cgagctcggt ac 42 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 19 tggccggcct gcaggtaata cgactcacta tagggttc 38 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 20 ctggcgttac ctaaggagat ctaaattatg actaatataa a 41 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 21 taaggaggtc cttaattaat aagcttgcat gcctgcagg 39 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 22 tcgacctgca ggcatgcaag cttattaatt aaggacc 37 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 23 tccttattta tattagtcat aatttagatc tccttaggta ac 42 <210> 24 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 24 gccaggaacc ctatagtgag tcgtattacc tgcaggccgg ccacatg 47 <210> 25 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 25 agatctaaaa attatgaata atataaaagg aggaattaat taa 43 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 26 ttggatcctc ctttattatt gtttctgttg c 31 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 27 ttcctgcagg ttaagccact tcctttttgc 30 <210> 28 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 28 ggatccgcga tcgctaaatg cargaatcya tyatycartg gca 43 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 29 tctagagcgg ccgctagcta cttctartgg ykrccagtcg g 41 <210> 30 <211> 3667 <212> DNA <213> Comamonas testosteroni <400> 30 atgcaagaat ccattatcca gtggcatggg gccactaata cacgcgtgcc tttcggtatc 60 tacactgaca cagccaatgc tgatcaagaa cagcagcgca tctatcgcgg cgaggtctgg 120 aactacctgt gcctggaatc tgaaatcccc gaggctggtg atttccgtac tacctttgcc 180 ggtgaaacac cgatagttgt cgtacgggat gccgaccagg aaatctacgc cttcgagaac 240 cgctgcgcgc atcgcggcgc tctcatcgct ctggagaaat cgggacgtac ggatagtttc 300 cagtgcgtct atcacgcctg gagctacaac cgacagggag atctgaccgg cgttgccttc 360 gagaaaggtg tcaagggcca gggtggcatg ccggcctcat tctgcaaaga agagcatggc 420 ccgcgcaagc tccgcgtggc tgtcttttgc ggtttggtct ttggcagttt ttccgaggac 480 gtacccagca ttgaggatta ccttggccct gagatttgcg agcgcataga gcgcgtgctg 540 cacaagcccg tagaagtcat cggtcgcttc acgcaaaagc tgcctaacaa ctggaagctc 600 tacttcgaga acgtgaagga cagctatcac gccagcctcc tgcatatgtt cttcaccacc 660 ttcgagctga atcgcctctc acaaaaaggc ggagtcatcg tcgacgagtc gggtggccac 720 catgtgagct attccatgat tgatcgtagc gccaaagacg actcgtacaa ggaccaggcc 780 atccgctccg acaacgagcg ttaccggctc aaagatccca gccttctaga gggcttcgag 840 gagttcgagg acggcgtgac cctgcagatc ctttctgtgt tccctggctt tgtgctgcag 900 cagattcaga acagcatcgc cgtgcgtcag ttgttgccca agagcatctc cagctcggaa 960 ctcaactgga cctatcttgg ctatgcagat gacagtgcag agcagcgcaa ggtcagactc 1020 aaacaggcca acctcatcgg ccctgcagga tttatttcca tggaggacgg agctgtcggt 1080 ggattcgtgc agcgtggcat cgcaggcgct gccaaccttg atgcggtcat cgagatgggc 1140 ggagaccacg aaggctctag cgagggccgc gccacagaaa cctcggtacg cggcttttgg 1200 aaggcctacc gcaagcatat gggacaggag atgcaagcat gatccatgaa attcaaatcg 1260 cggccttcaa tgccgcttac gcgaagacca tagacagtga cgttatggag caatggccaa 1320 ccttcttcac gaaggattgc cattatcgcg tcaccaatgt cgacaaccat gctgaaggac 1380 ttgctgctgg cattgtctgg gcagattcgc aggacatgct caccgaccga atttctgcgc 1440 tgcgcgaagc caatatctac gagcgccacc gctatcgcca tatcctgggt ctgccttcga 1500 tccagtcagc cgatgcaaca caggccagtg cttccacgcc attcctggtg ctgcgcatca 1560 tgcataccgg ggaaacagag gtctttgcca gcggtgagta ccacgacaaa ttcaccacga 1620 tcgatggaaa gttacgtctg caagagcgcg tcgcggtttg cgacagcacg gtgacggaca 1680 cgctgatgtc attgccgcta tgacaatagt gcaccgtaga ttggctttgg ccatcggcga 1740 tccccacggc attggcccag aaatcgcact gaaagctctt cagcagttgt ctgccaccga 1800 aagatccctg atcaaggtct atggaccgtg gagcgctctt gaacaagcag cgcagatctg 1860 ccaaatggag tcccttcttc aagacctcat tcatgaggaa gccggctcgc ttgcacaacc 1920 agtgcaatgc ggagagatca ccccgcaggc aggcctatcc acggtgcaat ccgcaacagc 1980 agccatccgg gcgtgcgaaa gcggcgaggt cgatgccgtc attgcctgcc cccaccatga 2040 gacggccatt caccgtgcag gcatagcgtt cagcggctac ccatctttgc tcgccaatgt 2100 tcttggcatg aacgaagacg aggtattcct gatgctggta ggggctggac tgcgcatcgt 2160 gcatgtcacc ttgcatgaga gcgtgcgtag cgcactagag cggctctcac ctcagttggt 2220 tatcaacgcg gtggatgccg ccgtgcagac atgcacccta ctcggggtgc ctaaaccgca 2280 agtcgctgta ttcgggatca accctcatgc atccgaagga cagttgttcg gcctggagga 2340 ctcgcagatc accgttcctg ccgtcgagac actgcgcaag cgcggcctga cggtagacgg 2400 ccccatggga gcagacatgg ttctggcaca gcgcaagcac gacttgtatg tggccatgct 2460 gcatgaccaa gggcacattc ccatcaagct gctggctcct aacggagcca gtgcgctctc 2520 catcggcggc agggtggtgc tttccagcgt gggccatggc agcgccatgg acattgccgg 2580 ccgtggcgtg gctgacgcca cggccctcct acgcacaatc gccctactcg gagcccaacc 2640 ggtctgagga ctctctatga accaccagat ccatatccac gactctgata tcgcgttccc 2700 ctgcgcgcct gggcaatccg tactggatgc agccctgcag gccggcatcg agctgcccta 2760 ttcctgccgc aaaggtagct gtggcaactg tgcgagtacg ctgctcgacg gaaatattac 2820 ttccttcaat ggcatggccg tgcgcagcga actctgcacc tcggagcagg tattgctgtg 2880 cggctgcacc gccgccagcg atatacgtat ccagccgagc tcctttcgcc gtctcgaccc 2940 ggaagcccgc aaacgtttta cggccaaggt gtacagcaat acactggcgg cacccgatgt 3000 ctcgctactg cgcctgcgcc tgcctgtggg caagcgcgcc aaatttgaag ccggccaata 3060 cctgctgatt cacctcgacg gcggggaaag ccgcagctac tctatggcca acccacccca 3120 tgagagcgat ggcatcacat tgcatatcag gcatgtaccg ggtggtcgct tcagcactat 3180 cgttcagcag ttgaagtctg gtgacacatt ggatatcgaa ctgccattcg gcagcatcgc 3240 gttgaagcct gacgacagca gacccctagt ttgcgttgca ggaggcaccg gatttgcacc 3300 catcaagtcc gttctggatg acctggccaa acgcaaggta cagcgcgaca tcacgctgat 3360 ttggggtgct cgcaacccct ctggcctgta tcttcctagc gccatcgaca agtggcgcaa 3420 agcttggccg cagtttcgct acattgcagc catcactgac ctaagcaacg tgcctgcgga 3480 tgctcacgcc ggtcgggtgg atgacgcgct acgcatgcac tttgacaacc tacacgatca 3540 tgttgtccac tgctgtggct caccagccct cgttcaatct gtgcgcacag cagcctccaa 3600 tatgggcctg ctagcacaag actttcatgc ggatgtgttc gctacagacc cgactggcca 3660 ccactaa 3667 <210> 31 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 31 aatttaatta aggaggatta ataaatgtcc ttagcaccat cgcgcgtg 48 <210> 32 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 32 aagcggccgc gatcgcattc atttacttgc gggcgagcga atgactttc 49 <210> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 33 ggtggttcat agcggcaatg acatcagcgt gtccgtc 37 <210> 34 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 34 cattgccgct atgaaccacc agatccatat ccacgac 37 <210> 35 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 35 aatttaatta aggaggataa ataaatgaac cacgtaccag tggc 44 <210> 36 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 36 aagcggccgc gatcgcattc atttatacct cgaagcgtgg taggtcg 47 <210> 37 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 37 aattaattaa atgatggcta acagaatgct tttaaacgaa acggcatgg 49 <210> 38 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 38 tgcggccgct tgtttaaacc tccttatttt accaggcggt atggtaaagc 50 <210> 39 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 39 tgatttaaat ttatgagtgt acccgttcaa catcc 35 <210> 40 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 40 tgcggccgct tgtttaaacc tccttatttt aagactgtaa ataaaccacc 50 <210> 41 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 41 gcggccgcga tatcgttgta aaaaaccccg ctccggcggg gttttttgta tctggccagg 60 cgcgcc 66 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 42 aaggcgcgcc gtgtccggtt tgataggg 28 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 43 tgtaaaacga cggccagt 18

Claims (26)

  1. 이하의 (a) 또는 (c)에 나타내는 DNA, 이하의 (e) 또는 (g)에 나타내는 DNA 및 이하의 (i) 또는 (k)에 나타내는 DNA를 가지며, 테레프탈산으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 생산하는 능력을 가지는 미생물 또는 그 배양물의 처리물을 테레프탈산염을 포함하는 수성매체 중에서 테레프탈산과 반응시켜 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 생성시키는 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법으로서, 상기 테레프탈산염이 테레프탈산염에 포함되는 전테레프탈산에 대해 몰환산으로 0.5배량 이상이며 2배량 이하의 칼륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    (a) 서열번호 2로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA.
    (c) 서열번호 1로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
    (e) 서열번호 4로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA.
    (g) 서열번호 3으로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
    (i) 서열번호 6으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA.
    (k) 서열번호 5로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 테레프탈산염을 포함하는 수성매체가 테레프탈산2칼륨염, 테레프탈산1-칼륨4-나트륨염, 테레프탈산1-칼륨4-암모늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종류 이상의 테레프탈산칼륨염을 포함하는 수용액인 것을 특징으로 하는 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 테레프탈산염을 수용액의 형태 또는 분말의 형태 또는 현탁액의 형태로 상기 미생물 또는 그 배양물의 처리물에 첨가하여 상기 미생물 또는 처리물과 테레프탈산을 반응시키는 것을 특징으로 하는 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1항에 기재된 미생물이 추가로 하기 (m) 또는 (o)에 나타내는 DNA를 도입하는 것에 의해 테레프탈산의 세포내 수송능을 증강시킨 미생물인 것을 특징으로 하는 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
    (m) 서열번호 8로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA.
    (o) 서열번호 7로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
  5. 제1항 또는 제2항에 기재된 방법에 의해 테레프탈산염으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 생성시키고 다시 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 프로토카테큐산으로 전환하는 것을 특징으로 하는 프로토카테큐산의 제조법으로,
    이 때, 상기 미생물은 추가로 이하의 (q) 또는 (s) 에 나타내는 DNA를 가지며 테레프탈산으로부터 프로토카테큐산을 생산하는 능력을 가지는 미생물인, 프로토카테큐산의 제조법:
    (q) 서열번호 10으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA.
    (s) 서열번호 9로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
  6. 제1항 또는 제2항에 기재된 방법에 의해 테레프탈산염으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 생성시킨 후, (q) 또는 (s)에 나타내는 DNA를 형질전환법에 의해 도입하여 얻어진 미생물 또는 그 배양물의 처리물을 이용하여 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 프로토카테큐산으로 전환하는 것을 특징으로 하는 프로토카테큐산의 제조법:
    (q) 서열번호 10으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA.
    (s) 서열번호 9로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
  7. 제1항 또는 제2항에 기재된 방법에 의해 테레프탈산염으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 생성시키고 다시 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 갈산으로 전환하는 것을 특징으로 하는 갈산의 제조법으로,
    이 때, 상기 미생물은 추가로 (q) 또는 (s)에 나타내는 DNA 및 (u), (v) 또는 (w)에 나타내는 DNA를 가지며 테레프탈산으로부터 갈산을 생산하는 능력을 가지는 미생물인 갈산의 제조법:
    (q) 서열번호 10으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA.
    (s) 서열번호 9로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
    (u) 서열번호 12로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA.
    (v) GB등록번호 AAG03636의 199위치의 류신을 발린 또는 글리신으로 치환하고 또한 385위치의 티로신을 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌으로 치환한 변이체, GB등록번호 AAN69138의 199위치의 류신을 발린 또는 글리신으로 치환하고 또한 386위치의 티로신을 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌으로 치환한 변이체, 또는 GB등록번호 BAB98470의 200위치의 류신을 발린 또는 글리신으로 치환하고 또한 385위치의 티로신을 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌으로 치환한 변이체.
    (w) 서열번호 11로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
  8. 제1항 또는 제2항에 기재된 방법에 의해 테레프탈산염으로부터 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 생성시킨 후, (q) 또는 (s)에 나타내는 DNA에 추가하여 (u), (v) 또는 (w)에 나타내는 DNA를 형질전환법에 의해 도입하여 얻어진 미생물 또는 그 배양물의 처리물을 이용하여 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올을 갈산으로 전환하는 것을 특징으로 하는 갈산의 제조법:
    (q) 서열번호 10으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA.
    (s) 서열번호 9로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
    (u) 서열번호 12로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA.
    (v) GB등록번호 AAG03636의 199위치의 류신을 발린 또는 글리신으로 치환하고 또한 385위치의 티로신을 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌으로 치환한 변이체, GB등록번호 AAN69138의 199위치의 류신을 발린 또는 글리신으로 치환하고 또한 386위치의 티로신을 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌으로 치환한 변이체, 또는 GB등록번호 BAB98470의 200위치의 류신을 발린 또는 글리신으로 치환하고 또한 385위치의 티로신을 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌으로 치환한 변이체.
    (w) 서열번호 11로 나타내는 염기서열로 이루어지는 DNA.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    추가로 상기 테레프탈산염을 하기 공정 (A)∼(D)에 의해 얻는 공정을 포함하는 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
    (A) 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 주성분으로 하고 이물성분을 포함하는 폴리에스테르 폐기물을 수산화칼륨을 포함하는 에틸렌글리콜 반응용매 혹은 수산화칼륨 및 수산화나트륨 양쪽을 포함하는 에틸렌글리콜 반응용매 중에서 100℃ 내지 196℃ 사이에서 10분간 이상 가열하는 것에 의해 반응액 중의 수분을 증발시킴과 함께, 그 폐기물에 포함되는 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 해중합하는 공정,
    (B) 공정 (A)에서 얻어진 그 폐기물의 해중합반응용액 중에 포함되는 고형이물 중, 그 용액에 부유하는 고형이물을 부유선별법에 의해 제거하는 공정,
    (C) 공정 (B)의 처리를 한 그 용액으로부터 부유 고형이물 이외의 그 용액 중의 고형물을 고액분리법에 의해 회수하는 공정,
    (D) 공정 (C)에 의해 회수한 고형물에 대해 가열건조처리 또는 감압건조처리 또는 원심분리처리를 하는 것에 의해 그 고형물 내 글리콜류의 함량을 감소시키고 잔존하는 고형물을 테레프탈산염으로서 얻는 공정.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 공정 (C)에 있어서 고액분리법으로 고형물을 회수한 후의 에틸렌글리콜 반응용매를 회수하고 그 용매를 상기 (A)에서의 에틸렌글리콜 반응용매로서 이용하는 것을 특징으로 하는 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
  11. 제5항에 있어서,
    추가로 상기 테레프탈산염을 하기 공정 (A)∼(D)에 의해 얻는 공정을 포함하는 프로토카테큐산의 제조법.
    (A) 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 주성분으로 하고 이물성분을 포함하는 폴리에스테르 폐기물을 수산화칼륨을 포함하는 에틸렌글리콜 반응용매 혹은 수산화칼륨 및 수산화나트륨 양쪽을 포함하는 에틸렌글리콜 반응용매 중에서 100℃ 내지 196℃ 사이에서 10분간 이상 가열하는 것에 의해 반응액 중의 수분을 증발시킴과 함께, 그 폐기물에 포함되는 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 해중합하는 공정,
    (B) 공정 (A)에서 얻어진 그 폐기물의 해중합반응용액 중에 포함되는 고형이물 중, 그 용액에 부유하는 고형이물을 부유선별법에 의해 제거하는 공정,
    (C) 공정 (B)의 처리를 한 그 용액으로부터 부유 고형이물 이외의 그 용액 중의 고형물을 고액분리법에 의해 회수하는 공정,
    (D) 공정 (C)에 의해 회수한 고형물에 대해 가열건조처리 또는 감압건조처리 또는 원심분리처리를 하는 것에 의해 그 고형물 내 글리콜류의 함량을 감소시키고 잔존하는 고형물을 테레프탈산염으로서 얻는 공정.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 공정 (C)에 있어서 고액분리법으로 고형물을 회수한 후의 에틸렌글리콜 반응용매를 회수하고 그 용매를 상기 공정 (A)에서의 에틸렌글리콜 반응용매로서 이용함으로써 에틸렌글리콜 반응용매를 폐기하지 않고 반복 이용하는 것에 의해 얻어지는 테레프탈산염을 이용하는 것을 특징으로 하는 프로토카테큐산의 제조법.
  13. 제7항에 있어서,
    추가로 상기 테레프탈산염을 하기 공정 (A)∼(D)에 의해 얻는 공정을 포함하는 갈산의 제조법.
    (A) 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 주성분으로 하고 이물성분을 포함하는 폴리에스테르 폐기물을 수산화칼륨을 포함하는 에틸렌글리콜 반응용매 혹은 수산화칼륨 및 수산화나트륨 양쪽을 포함하는 에틸렌글리콜 반응용매 중에서 100℃ 내지 196℃ 사이에서 10분간 이상 가열하는 것에 의해 반응액 중의 수분을 증발시킴과 함께, 그 폐기물에 포함되는 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 해중합하는 공정,
    (B) 공정 (A)에서 얻어진 그 폐기물의 해중합반응용액 중에 포함되는 고형이물 중, 그 용액에 부유하는 고형이물을 부유선별법에 의해 제거하는 공정,
    (C) 공정 (B)의 처리를 한 그 용액으로부터 부유 고형이물 이외의 그 용액 중의 고형물을 고액분리법에 의해 회수하는 공정,
    (D) 공정 (C)에 의해 회수한 고형물에 대해 가열건조처리 또는 감압건조처리 또는 원심분리처리를 하는 것에 의해 그 고형물 내 글리콜류의 함량을 감소시키고 잔존하는 고형물을 테레프탈산염으로서 얻는 공정.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 공정 (C)에 있어서 고액분리법으로 고형물을 회수한 후의 에틸렌글리콜 반응용매를 회수하고 그 용매를 상기 공정 (A)에서의 에틸렌글리콜 반응용매로서 이용함으로써 에틸렌글리콜 반응용매를 폐기하지 않고 반복 이용하는 것에 의해 얻어지는 테레프탈산염을 이용하는 것을 특징으로 하는 갈산의 제조법.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 미생물이 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 발현량을 증강시키는 것에 의해 상기 공정 (A) 내지 (D)에 의해 얻어지는 테레프탈산염에 혼입되는 에틸렌글리콜을 분해하는 미생물인 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 미생물이 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 발현량을 증강시키는 것에 의해 상기 공정 (A) 내지 (D)에 의해 얻어지는 테레프탈산염에 혼입되는 에틸렌글리콜을 분해하는 미생물인 프로토카테큐산의 제조법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 미생물이 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 발현량을 증강시키는 것에 의해 상기 공정 (A) 내지 (D)에 의해 얻어지는 테레프탈산염에 혼입되는 에틸렌글리콜을 분해하는 미생물인 갈산의 제조법.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    추가로 상기 테레프탈산염을 하기 공정 (E)∼(H)에 의해 얻는 공정을 포함하는 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
    (E) 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 주성분으로 하고 이물성분을 포함하는 폴리에스테르 폐기물을 수산화칼륨을 포함하는 1-부탄올 반응용매 혹은 수산화칼륨 및 수산화나트륨 양쪽을 포함하는 1-부탄올 반응용매 중에서 100℃ 내지 116℃ 사이에서 10분간 이상 가열하는 것에 의해 반응액 중의 수분을 증발시킴과 함께, 그 폐기물에 포함되는 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 해중합하는 공정,
    (F) 공정 (E)에서 얻어진 그 폐기물의 해중합반응용액 중에 포함되는 고형이물 중, 그 용액에 부유하는 고형이물을 부유선별법에 의해 제거하는 공정,
    (G) 공정 (F)의 처리를 한 그 용액으로부터 부유 고형이물 이외의 그 용액 중의 고형물을 고액분리법에 의해 회수하는 공정,
    (H) 공정 (G)에 의해 회수한 고형물에 대해 가열건조처리 또는 감압건조처리 또는 원심분리처리를 하는 것에 의해 그 고형물 내 1-부탄올 및 글리콜류의 함량을 감소시키고 잔존하는 고형물을 테레프탈산염으로서 얻는 공정.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 공정 (G)에서 고액분리법으로 고형물을 회수한 후의 1-부탄올 반응용매를 회수하고 그 용매를 상기 공정 (E)에서의 1-부탄올 반응용매로서 이용함으로써 에틸렌글리콜 반응용매를 폐기하지 않고 반복 이용하는 것에 의해 얻어지는 테레프탈산염을 이용하는 것을 특징으로 하는 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
  20. 제5항에 있어서,
    추가로 상기 테레프탈산염을 하기 공정 (E)∼(H)에 의해 얻는 공정을 포함하는 프로토카테큐산의 제조법.
    (E) 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 주성분으로 하고 이물성분을 포함하는 폴리에스테르 폐기물을 수산화칼륨을 포함하는 1-부탄올 반응용매 혹은 수산화칼륨 및 수산화나트륨 양쪽을 포함하는 1-부탄올 반응용매 중에서 100℃ 내지 116℃ 사이에서 10분간 이상 가열하는 것에 의해 반응액 중의 수분을 증발시킴과 함께, 그 폐기물에 포함되는 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 해중합하는 공정,
    (F) 공정 (E)에서 얻어진 그 폐기물의 해중합반응용액 중에 포함되는 고형이물 중, 그 용액에 부유하는 고형이물을 부유선별법에 의해 제거하는 공정,
    (G) 공정 (F)의 처리를 한 그 용액으로부터 부유 고형이물 이외의 그 용액 중의 고형물을 고액분리법에 의해 회수하는 공정,
    (H) 공정 (G)에 의해 회수한 고형물에 대해 가열건조처리 또는 감압건조처리 또는 원심분리처리를 하는 것에 의해 그 고형물 내 1-부탄올 및 글리콜류의 함량을 감소시키고 잔존하는 고형물을 테레프탈산염으로서 얻는 공정.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 공정 (G)에서 고액분리법으로 고형물을 회수한 후의 1-부탄올 반응용매를 회수하고 그 용매를 상기 공정 (E)에서의 1-부탄올 반응용매로서 이용함으로써 에틸렌글리콜 반응용매를 폐기하지 않고 반복 이용하는 것에 의해 얻어지는 테레프탈산염을 이용하는 것을 특징으로 하는 프로토카테큐산의 제조법.
  22. 제7항에 있어서,
    추가로 상기 테레프탈산염을 하기 공정 (E)∼(H)에 의해 얻는 공정을 포함하는 갈산의 제조법.
    (E) 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 주성분으로 하고 이물성분을 포함하는 폴리에스테르 폐기물을 수산화칼륨을 포함하는 1-부탄올 반응용매 혹은 수산화칼륨 및 수산화나트륨 양쪽을 포함하는 1-부탄올 반응용매 중에서 100℃ 내지 116℃ 사이에서 10분간 이상 가열하는 것에 의해 반응액 중의 수분을 증발시킴과 함께, 그 폐기물에 포함되는 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트를 해중합하는 공정,
    (F) 공정 (E)에서 얻어진 그 폐기물의 해중합반응용액 중에 포함되는 고형이물 중, 그 용액에 부유하는 고형이물을 부유선별법에 의해 제거하는 공정,
    (G) 공정 (F)의 처리를 한 그 용액으로부터 부유 고형이물 이외의 그 용액 중의 고형물을 고액분리법에 의해 회수하는 공정,
    (H) 공정 (G)에 의해 회수한 고형물에 대해 가열건조처리 또는 감압건조처리 또는 원심분리처리를 하는 것에 의해 그 고형물 내 1-부탄올 및 글리콜류의 함량을 감소시키고 잔존하는 고형물을 테레프탈산염으로서 얻는 공정.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 공정 (G)에서 고액분리법으로 고형물을 회수한 후의 1-부탄올 반응용매를 회수하고 그 용매를 상기 공정 (E)에서의 1-부탄올 반응용매로서 이용함으로써 에틸렌글리콜 반응용매를 폐기하지 않고 반복 이용하는 것에 의해 얻어지는 테레프탈산염을 이용하는 것을 특징으로 하는 갈산의 제조법.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 미생물이 에스케리키아 콜리인 것을 특징으로 하는 테레프탈산1,2-시스-디히드로디올의 제조법.
  25. 제5항에 있어서,
    상기 미생물이 에스케리키아 콜리인 것을 특징으로 하는 프로토카테큐산의 제조법.
  26. 제7항에 있어서,
    상기 미생물이 에스케리키아 콜리인 것을 특징으로 하는 갈산의 제조법.
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