CN103703137A - 由对苯二甲酸钾盐制造有用化学品的方法 - Google Patents
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Abstract
通过将以摩尔换算相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐作为原料，可以使用表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶的微生物来制造TPA-DHD。进而，可以在TPA-DHD脱氢酶作用下将TPA-DHD转变为原儿茶酸，此外在对羟基苯甲酸羟化酶作用下将原儿茶酸转变为没食子酸。此外，通过将废弃聚酯在含有氢氧化钾的乙二醇溶剂或1-丁醇溶剂中进行加热处理，从而可以高效地将该聚酯解聚，并制备适合于利用微生物制造化学品的对苯二甲酸钾。
Description
技术领域
本发明涉及以对苯二甲酸钾盐为原料、使用表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶的微生物制造对苯二甲酸-1,2-顺式-二羟基二醇（以下根据需要简称为TPA-DHD）的方法、进一步将TPA-DHD转变成原儿茶酸、没食子酸的方法以及通过废弃聚酯的解聚获得作为原料的对苯二甲酸钾盐的方法。予以说明，本发明中对苯二甲酸钾盐是指对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐及对苯二甲酸1-钾4-铵盐等对苯二甲酸的、对苯二甲酸的至少1个羧基残基与钾离子形成了盐的化合物。
背景技术
对苯二甲酸是主要作为聚对苯二甲酸乙二醇酯（以下简称PET）、聚对苯二甲酸丙二醇酯（以下简称PTT）及聚对苯二甲酸丁二醇酯（以下简称PBT）等对苯二甲酸系聚酯的原料而大量生产的廉价化学品。由于对苯二甲酸廉价，因此还开发了使用微生物以对苯二甲酸为原料制造TPA-DHD、2-吡喃酮-4,6-二甲酸、原儿茶酸、没食子酸等有用化学品的技术（文献1～5）。还已知通过TPA-DHD的脱水反应可以制造作为药品、树脂材料的原料的2-羟基对苯二甲酸（专利文献1和2）。
在以对苯二甲酸为原料使用微生物制造有用化学品时，理想的是：不是将对苯二甲酸自身、而是将水溶性优异的对苯二甲酸盐添加在培养基中。氢氧化钠由于比氢氧化钾廉价，因此一直以来虽然使用对苯二甲酸的钠盐作为其原料，但是尚不存在以对苯二甲酸的钾盐为原料使用微生物来制造有用化学品的报告、以及与对苯二甲酸的钠盐相比使用对苯二甲酸的钾盐时目标化合物的生产性更优异的报告。
关于对苯二甲酸系聚酯的再利用，特别是以废弃PET瓶的再利用为核心开发了多种再利用技术，产业化也正在推进。但是，其再利用成本高，需要收益性更高的再利用技术。从而，在以对苯二甲酸为原料的化学品制造中由于以源自废弃聚酯的对苯二甲酸为原料关系到环境问题的解决和制造成本的降低，因此是重要的研究开发课题。
作为废弃聚酯的再利用方法，除了获得原聚酯的资源再利用法外，还已知将聚酯化学解聚而获得对苯二甲酸、双-2-羟乙基对苯二甲酸酯等的化学再利用法（专利文献6～11）。已知通过在含有氢氧化钠等碱金属氢氧化物的乙二醇反应溶剂或醇反应溶剂中加热PET等聚酯可以解聚。此时，由于氢氧化钠廉价，一般使用氢氧化钠作为碱金属氢氧化物。但是，由于获得的对苯二甲酸碱金属盐的利用用途尚不存在，因此期待再利用事业推进为：进一步通过对对苯二甲酸碱金属盐进行酸处理，以此获得对苯二甲酸。但该再利用事业的制造成本偏高且获得的对苯二甲酸廉价，因此基本未实施。
虽然已知PET在含有氢氧化钾的乙二醇溶剂中可以解聚（非专利文献1），但对于PET在乙二醇溶剂中的氢氧化钾和氢氧化钠中的解聚差异的比较结果尚无报告。进而，尚未报告在含有氢氧化钾的乙二醇反应溶剂中通过将PET、PTT或PBT解聚而获得对苯二甲酸钾盐后，使用微生物将该对苯二甲酸钾盐转变为其它有用化学品这样的废弃聚酯的再利用技术。
虽然已经报道了：在含有氢氧化钠的1-丁醇反应溶剂中将废弃PET解聚、通过添加硫酸获得对苯二甲酸的实验例（专利文献12），但尚未报告：在含有氢氧化钾的1-丁醇反应溶剂中将废弃PET解聚的事例，以及对于在包含碱的1-丁醇反应溶剂中的聚酯解聚反应中氢氧化钾和氢氧化钠的差异进行比较的事例。
在含有氢氧化钾的乙二醇中将废弃聚酯解聚时，若想获得纯度高的对苯二甲酸钾盐，则其再利用成本增加。因此，期待以含有乙二醇的纯度低的对苯二甲酸钾盐为原料、使用微生物将其转变为有用化学品。但是，尚不存在在对苯二甲酸盐和乙二醇共存的状态下利用微生物生产化学品的报告。予以说明，目前已知：对于在基础研究领域和工业生产领域被广泛使用的埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli；以下适宜简称为大肠杆菌。）K-12株能够通过乳醛还原酶及乳醛脱氢酶将乙二醇转变为乙醇酸，在此基础上还报告了通过对乳醛还原酶导入突变，提高乙二醇的代谢能力（非专利文献2～4）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：United States Patent5,068,414
专利文献2：United States Patent5,124,479
专利文献3：日本特开2007-104942
专利文献4：日本特开2009-65839
专利文献5：日本特开2009-213392
专利文献6：日本专利第3715812号
专利文献7：日本特开2000-169623
专利文献8：United States Patent3,544,622
专利文献9：日本特开2002-60542
专利文献10：日本特开平11-21374
专利文献11：United States Patent4,542,239
专利文献12：WO2005/082826
非专利文献
非专利文献1：Polym.-Plastics Tech.Eng.,43,369(2004)
非专利文献2：J.Bacteriol.,153,134(1983)
非专利文献3：J.Bacteriol.,171,6097(1989)
非专利文献4：J.Biol.Chem.,273,8308(1998)
发明内容
本发明的课题在于，提供一种在使用微生物以对苯二甲酸碱金属盐为原料生产TPA-DHD并将生产的TPA-DHD转变为原儿茶酸转变时，使这些化合物的生产性提高的方法，进一步提供一种通过废弃聚酯的解聚获得该对苯二甲酸碱金属盐的方法。
本发明人等为了解决上述课题，在将作为对苯二甲酸系聚酯的PET在碱溶液中解聚获得对苯二甲酸盐的研究过程中，对由重组大肠杆菌的原儿茶酸的生产性进行了比较，结果发现，与对苯二甲酸二钠盐相比，以对苯二甲酸钾盐（对苯二甲酸二钾盐、1-钾4-铵盐或对苯二甲酸1-钾4-钠盐）为原料时原儿茶酸的生产性更高，从而关注对苯二甲酸钾盐的利用。
当作为原料的对苯二甲酸盐的水溶性低时，通过从原料槽投入的液量增加，从而减少每一培养槽的目标化合物的生产量。因此，优选使用水溶性高的对苯二甲酸盐作为原料。在这里，研究了对苯二甲酸二钠盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐及对苯二甲酸二钾盐在水中30℃时的溶解度，结果是：对苯二甲酸二钾盐的溶解度为约1.0M、对苯二甲酸1-钾4-钠盐的溶解度为约0.96M、对苯二甲酸二钠盐的溶解度为约0.63M，发现对苯二甲酸钾盐的水溶性高。此外发现，与对苯二甲酸二钠盐相比，对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐等对苯二甲酸钾盐通过大肠杆菌等微生物生产目标化合物的生产性更优异。
进而，鉴于每摩尔氨的价格比每摩尔氢氧化钾、氢氧化钠的价格更低廉，研究了各种对苯二甲酸铵盐在水中、30℃时的溶解度，结果是：对苯二甲酸1-钾4-铵盐的溶解度为约0.85M、对苯二甲酸1-钠4-铵盐的溶解度为约0.61M、对苯二甲酸二铵盐的溶解度为约0.51M，发现对苯二甲酸1-钾4-铵盐的水溶性高。此外发现，使用对苯二甲酸1-钾4-铵盐时，通过大肠杆菌等微生物生产目标化合物的生产性更优异，直至解决了本发明的课题。
然后，对将PET、PTT及PBT分别在碱溶液中加热解聚进行了深入研究，结果发现，当在含有碱金属氢氧化物的乙二醇反应溶剂中解聚时，与氢氧化钠相比，当使用氢氧化钾作为碱金属氢氧化物时聚酯的解聚速度快且对苯二甲酸盐的回收率优异。结果发现，作为通过废弃聚酯的解聚制备对苯二甲酸盐的方法，在含有氢氧化钾的乙二醇反应溶剂中将对苯二甲酸系聚酯解聚的方式更为优异。
进而发现，通过将解聚的反应溶剂由乙二醇变更为1-丁醇，可以降低解聚的反应温度，且意外的是对苯二甲酸盐的回收效率也优异。进而，在1-丁醇中的解聚反应中，与氢氧化钠相比，使用氢氧化钾作为碱金属氢氧化物的方式中，意外地发现对苯二甲酸盐的解聚效率更优异。
如上所述，发现了不仅在以对苯二甲酸的碱金属盐为原料通过微生物生产目标化合物中，而且在用于获得原料用对苯二甲酸钾盐的在乙二醇溶剂或1-丁醇溶剂中的聚酯解聚反应中，不使用钠而使用钾作为所用的碱金属也更为优选。
即，本发明涉及以下的（1）～（24）。
（1）一种对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，使具有以下的（a）、（b）、（c）或（d）所示的DNA、以下的（e）、（f）、（g）或（h）所示的DNA、以及以下的（i）、（j）、（k）或（l）所示的DNA且具有由对苯二甲酸生产对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的能力的微生物或该培养物的处理物，在包含对苯二甲酸盐的水性介质中与对苯二甲酸反应，生成对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇，前述对苯二甲酸盐相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。
（a）编码包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA。
（b）包含在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1个或多个氨基酸而成的序列且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。
（c）包含序列号1所示的碱基序列的DNA。
（d）与包含和序列号1所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。
（e）编码包含序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA。
（f）包含在序列号4所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1个或多个氨基酸而成的序列且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。
（g）包含序列号3所示的碱基序列的DNA。
（h）与包含和序列号3所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。
（i）编码包含序列号6所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA。
（j）包含在序列号6所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1个或多个氨基酸而成的序列且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。
（k）包含序列号5所示的碱基序列的DNA。
（l）与包含和序列号5所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。
（2）根据（1）所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，前述包含对苯二甲酸盐的水性介质为包含选自对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐、对苯二甲酸1-钾4-铵盐组成的组中的1种以上对苯二甲酸钾盐的水溶液。
（3）根据（1）或（2）所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，将前述对苯二甲酸盐以水溶液的形态、粉末的形态或悬浊液的形态添加在前述微生物、或该培养物的处理物中，使前述微生物或处理物与对苯二甲酸反应。
（4）根据（1）～（3）中任一项所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，（1）所述的微生物为，进一步通过导入下述（m）、（n）、（o）或（p）所示的DNA从而增强对苯二甲酸的细胞内输送能力的微生物。
（m）编码包含序列号8所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA。
（n）包含在序列号8所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1个或多个氨基酸而成的序列且编码具有对苯二甲酸转运体活性的蛋白质的DNA。
（o）包含序列号7所示的碱基序列的DNA。
（p）与包含和序列号7所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有对苯二甲酸转运体活性的蛋白质的DNA。
（5）一种原儿茶酸的制造方法，其特征在于，通过（1）～（4）中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇、进而将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸，前述微生物为进一步具有以下的（q）、（r）、（s）或（t）所示的DNA、具有由对苯二甲酸生产原儿茶酸的能力的微生物，
（q）编码包含序列号10所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA。
（r）包含在序列号10所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1个或多个氨基酸而成的序列且编码具有将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸的活性的蛋白质的DNA。
（s）包含序列号9所示的碱基序列的DNA。
（t）与包含和序列号9所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸的活性的蛋白质的DNA。
（6）一种原儿茶酸的制造方法，其特征在于，在通过（1）～（4）中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇后，使用通过转化法导入有前述（q）、（r）、（s）或（t）所示的DNA而获得的微生物或该培养物的处理物将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸。
（7）一种没食子酸的制造方法，其特征在于，通过（1）～（4）中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇，进而，将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为没食子酸，前述微生物为进一步具有上述（q）、（r）、（s）或（t）所示的DNA及（u）、（v）、（w）或（x）所示的DNA、具有由对苯二甲酸生产没食子酸的能力的微生物。
（u）编码包含序列号12所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA。
（v）包含在序列号12所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1个或多个氨基酸而成的序列且编码具有将原儿茶酸转变为没食子酸的活性的蛋白质的DNA。
（w）包含序列号11所示的碱基序列的DNA。
（x）与包含序列号11所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有将原儿茶酸转变为没食子酸的活性的蛋白质的DNA。
（8）一种没食子酸的制造方法，其特征在于，在通过（1）～（4）中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇后，使用通过转化法导入有前述（q）、（r）、（s）或（t）所示的DNA以及前述的（u）、（v）、（w）或（x）所示的DNA而获得的微生物或该培养物的处理物，将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为没食子酸。
（9）根据（1）～（4）中任一项所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序（A）～（D）获得前述对苯二甲酸盐的工序。
（A）通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的乙二醇反应溶剂、或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的乙二醇反应溶剂中在100～196℃之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、
（B）从工序（A）中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、
（C）从实施了工序（B）的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、
（D）对通过工序（C）回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理从而减少该固态物中的二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
（10）根据（9）所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，回收前述工序（C）中通过固液分离法回收固态物后的乙二醇反应溶剂，将该溶剂作为前述（A）中的乙二醇反应溶剂使用。
（11）根据（5）或（6）所述的原儿茶酸的制造方法，其中，进一步包含通过上述工序（A）～（D）获得前述对苯二甲酸盐的工序。
（12）根据（11）所述的原儿茶酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序（C）中通过固液分离法回收固态物后的乙二醇反应溶剂，将该溶剂作为前述（A）中的乙二醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
（13）根据（7）或（8）所述的没食子酸的制造方法，其中，进一步包含通过上述工序（A）～（D）获得前述对苯二甲酸盐的工序。
（14）根据（13）所述的没食子酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序（C）中通过固液分离法回收固态物后的乙二醇反应溶剂，将该溶剂作为前述（A）中的乙二醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
（15）根据（9）或（10）所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其中，前述（1）或（4）所述的微生物为通过增强乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而将混入前述工序（A）～（D）所获得的对苯二甲酸盐中的乙二醇分解的微生物。
（16）根据（11）或（12）所述的原儿茶酸的制造方法，其中，前述（5）所述的微生物为通过增强乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而将混入前述工序（A）～（D）所获得的对苯二甲酸盐中的乙二醇分解的微生物。
（17）根据（13）或（14）所述的没食子酸的制造方法，其中，前述（7）所述的微生物为通过增强乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而将混入前述工序（A）～（D）所获得的对苯二甲酸盐中的乙二醇分解的微生物。
（18）根据（1）～（4）中任一项所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序（E）～（H）获得前述对苯二甲酸盐的工序。
（E）通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的1-丁醇反应溶剂或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的1-丁醇反应溶剂中在100～116℃之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、
（F）从工序（E）中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、
（G）从实施了工序（F）的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、
（H）对通过工序（G）回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理从而减少该固态物中的1-丁醇及二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
（19）根据（18）所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，回收前述工序（G）中通过固液分离法回收固态物后的1-丁醇反应溶剂，将该溶剂作为前述工序（E）中的1-丁醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
（20）根据（5）或（6）所述的原儿茶酸的制造方法，其中，进一步包含通过上述工序（E）～（H）获得前述对苯二甲酸盐的工序。
（21）根据（20）所述的原儿茶酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序（G）中通过固液分离法回收固态物后的1-丁醇反应溶剂，将该溶剂作为前述工序（E）中的1-丁醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
（22）根据（7）或（8）所述的没食子酸的制造方法，其中，进一步包含通过上述工序（E）～（H）获得前述对苯二甲酸盐的工序。
（23）根据（22）所述的没食子酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序（G）中通过固液分离法回收固态物后的1-丁醇反应溶剂，将该溶剂作为前述工序（E）中的1-丁醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
（24）根据（1）～（23）中任一项所述的制造方法，其特征在于，前述微生物为大肠埃希氏杆菌。
根据本发明，将以摩尔换算相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐作为原料时，可以使用微生物高效地制造TPA-DHD。此外，根据本发明，可以将获得的TPA-DHD高效地变换为原儿茶酸、没食子酸。进而，通过废弃聚酯的解聚，可以高效地制备适合于利用微生物制造作为对苯二甲酸衍生物原料的对苯二甲酸钾盐。
附图说明
图1是表示由对苯二甲酸经由TPA-DHD生产原儿茶酸及没食子酸的途径的图。
图2是表示在氢氧化钾和/或含有氢氧化钾的乙二醇溶剂中将废弃PET解聚时的对苯二甲酸生成速度的图。
图3是表示在颗粒状氢氧化钾或含有氢氧化钾水溶液的乙二醇溶剂中解聚时的对苯二甲酸生成速度的图。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
就作为通过微生物制造化合物的原料而使用的对苯二甲酸的形态而言，由于与对苯二甲酸自身相比对苯二甲酸盐的水溶性更高，因此通常优选对苯二甲酸盐。作为出于这种目的而使用的对苯二甲酸盐，可以列举对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐、对苯二甲酸1-钾4-铵盐、对苯二甲酸二钠盐、对苯二甲酸1-钠4-铵盐、及对苯二甲酸二铵盐。
在这里，对苯二甲酸二钾盐是指，对苯二甲酸的1位和4位的羧基残基与钾离子形成了离子键的盐。
对苯二甲酸1-钾4-钠盐是指，对苯二甲酸的1位的羧基残基与钾离子形成了离子键且对苯二甲酸的4位的羧基残与钠离子形成了离子键的盐。
对苯二甲酸1-钾4-铵盐是指，对苯二甲酸的1位的羧基残基与钾离子形成了离子键，且对苯二甲酸的4位的羧基残基与铵离子形成了离子键的盐。
对苯二甲酸二钠盐是指，对苯二甲酸的1位和4位的羧基残与钠离子形成了离子键的盐。
对苯二甲酸1-钠4-铵盐是指，对苯二甲酸的1位的羧基残与钠离子形成了离子键，且对苯二甲酸的4位的羧基残基与铵离子形成了离子键的盐。
对苯二甲酸二铵是指，对苯二甲酸的1位和4位的羧基残基与铵离子形成了离子键的盐。
关于对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐、对苯二甲酸1-钾4-铵盐、对苯二甲酸二钠盐、对苯二甲酸1-钠4-铵盐、及对苯二甲酸二铵盐，可以通过分别将相对于对苯二甲酸粉末以摩尔比计为2倍量的氢氧化钾、以摩尔比计为1倍量的氢氧化钾和1倍量的氢氧化钠、包含以摩尔比计为1倍量的氢氧化钾和1倍量的氨的氨水溶液、以摩尔比计为2倍量的氢氧化钠、包含以摩尔比计为1倍量的氢氧化钠和1倍量的氨的氨水溶液、及包含以摩尔比计为2倍量的氨的氨水溶液加入适量的水中后，边加热边搅拌，从而获得各对苯二甲酸盐的水溶液。对苯二甲酸盐的粉末可以通过对对苯二甲酸盐的水溶液施加加热干燥处理、减压干燥处理、或结晶处理而获得。
本发明中使用的对苯二甲酸盐是指：相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐。更优选相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.6倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐。
在这里，规定为相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算成0.5倍量以上且2倍量以下的量的钾为源自对苯二甲酸钾盐的钾，即与对苯二甲酸的羧基残基形成离子键的钾的量。即，当使用粗对苯二甲酸盐时，即使其中作为杂质包含源自氢氧化钾等的钾，在计算钾量时也将其排除在外。
反应时，水性溶剂中只要含有相对于全部对苯二甲酸以摩尔换算为0.5倍量以上且2倍量以下的量的源自对苯二甲酸钾盐的钾（离子）即可。
作为对苯二甲酸盐，对苯二甲酸盐的粉末、溶解有对苯二甲酸盐的水溶液、或对苯二甲酸盐的粉末以淤浆状态混杂在该对苯二甲酸盐的水溶液中的对苯二甲酸盐悬浊液的形态均可在本发明中使用。以下，若对对苯二甲酸盐没有特别声明，则均包括任意形态的对苯二甲酸盐。
本发明中优选使用如下的对苯二甲酸盐：包含选自对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐、对苯二甲酸1-钾4-铵盐组成的组中的1种以上的对苯二甲酸钾盐，且相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。
本发明中，也可以使用以选自对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐及对苯二甲酸1-钾4-铵盐中的对苯二甲酸盐作为单一成分的对苯二甲酸盐。
另一方面，本发明中使用的对苯二甲酸盐只要满足上述钾含量即可，除了上述对苯二甲酸钾盐外，还可以包含对苯二甲酸二钠盐、对苯二甲酸1-钠4-铵盐及对苯二甲酸二铵盐等。
例如，当使用对苯二甲酸1-钾4-钠盐和对苯二甲酸二钠盐这2种对苯二甲酸盐的混合物时，可以使用相对于对苯二甲酸二钠盐含有以摩尔比计为1倍量以上的对苯二甲酸1-钾4-钠盐的对苯二甲酸盐。
此外，当使用对苯二甲酸二钾盐和对苯二甲酸二钠盐这2种对苯二甲酸盐的混合物时，可以使用相对于对苯二甲酸二钠盐含有以摩尔比计为1/3倍量以上的对苯二甲酸二钾盐的对苯二甲酸盐。
本发明中，还可以使用3种以上的对苯二甲酸盐的混合物，此时，该混合物相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算需要含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。优选使用包含选自对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐、对苯二甲酸1-钾4-铵盐组成的组中的1种以上的对苯二甲酸钾盐和选自对苯二甲酸二钠盐、对苯二甲酸1-钠4-铵盐及对苯二甲酸二铵盐组成的组中的2种以上对苯二甲酸盐的对苯二甲酸盐。作为其具体例，可以列举将对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸二钠盐及对苯二甲酸二铵盐以摩尔比1：2：1的比例混合制备的水溶液。该水溶液相对于全部对苯二甲酸含有0.5倍量的钾，还可以通过将相对于1摩尔对苯二甲酸为0.5摩尔的氢氧化钾、1.0摩尔的氢氧化钠及0.5摩尔的氨添加在水中、溶解而获得。
本发明中，通过在含有氢氧化钾或氢氧化钾及氢氧化钠的混合物的乙二醇溶剂或1-丁醇溶剂中将废弃聚酯解聚而获得的包含对苯二甲酸二钾盐或对苯二甲酸1-钾4-钠盐的对苯二甲酸盐，可以作为通过微生物制造化合物的原料使用。
此时，由于与氢氧化钾相比，每1摩尔的氢氧化钠、氨水的价格更为低廉，因此相对于废弃聚酯的解聚所获得的对苯二甲酸盐加入高纯度对苯二甲酸以及氢氧化钠或氨水，利用所生成的对苯二甲酸盐的方式，在制造成本上更加低廉。作为其具体例，例如可以列举分别将废弃聚酯的解聚所获得的对苯二甲酸二钾盐、高纯度对苯二甲酸及氨水按照摩尔比6：4：8的比例混合，使用所获得的对苯二甲酸盐的水溶液。这样获得的对苯二甲酸盐的水溶液与将对苯二甲酸二钾盐和对苯二甲酸二铵盐以摩尔比6：4的比例混合制备的水溶液相同。
在使用本发明公开的方法由废弃聚酯制备对苯二甲酸钾盐时，除了钾离子、钠离子、铵离子以外，有时会混入作为异物的钙离子、锂离子等其它金属离子。此时，对于本发明中使用的对苯二甲酸盐而言，只要是相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐即可，对苯二甲酸钙盐、对苯二甲酸锂盐等对苯二甲酸盐的含有率低的话，混入也无妨。
对本发明中由对苯二甲酸制造TPA-DHD、原儿茶酸及没食子酸的工序进行说明。如图1所示，对苯二甲酸在苯二甲酸1,2-双加氧酶作用下被氧化，转变为TPA-DHD。进而，在TPA-DHD脱氢酶作用下可以将TPA-DHD转变为原儿茶酸。进而，在对羟基苯甲酸羟化酶或改良型对羟基苯甲酸羟化酶（例如，对羟基苯甲酸羟化酶的第199位的亮氨酸或第200位的亮氨酸置换为缬氨酸或甘氨酸且第385位或第386位的酪氨酸置换为苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸的变异体）作用下可以将原儿茶酸转变为没食子酸。
本发明中使用的对苯二甲酸1,2-双加氧酶包含加氧酶组分（oxygenasecomponent）和还原酶组分。此外，加氧酶组分包含大小2个亚基。作为加氧酶大亚基蛋白，可以列举例如具有序列号2所示的源自睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testeroni）72W2株的氨基酸序列的蛋白质。该菌株于2012年1月24日以受领号NITE ABP-1209在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心（NPMD）（日本，邮编292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8）进行了国际保藏，可以受让。此外，作为本发明中使用的加氧酶大亚基蛋白，可以列举包含在序列号2的氨基酸序列中缺失、置换或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与序列号2的氨基酸序列具有75％以上同源性、优选90％以上、特别优选95％以上同源性的氨基酸序列且具有由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能的蛋白质。在这里，“由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能”是指：与对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白和对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质同样地在与对苯二甲酸反应时能够生成TPA-DHD的功能。
作为对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白，可以列举例如具有序列号4所示的源自上述睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的氨基酸序列的蛋白质。此外，作为本发明中使用的对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白，可以列举包含在序列号4的氨基酸序列中缺失、置换或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与序列号4的氨基酸序列具有75％以上同源性、优选90％以上、特别优选95％以上同源性的氨基酸序列且具有由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能的蛋白质。在这里，“由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能”是指：与对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白和对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质同样地在与对苯二甲酸反应时能够生成TPA-DHD的功能。
作为本发明中使用的对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质，可以列举例如具有序列号6所示的源自上述睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的氨基酸序列的蛋白质。此外，作为本发明中使用的对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质，可以列举包含在序列号6的氨基酸序列中缺失、置换或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与序列号6的氨基酸序列具有75％以上同源性、优选90％以上、特别优选95％以上同源性的氨基酸序列且具有由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能的蛋白质。在这里，“由对苯二甲酸向TPA-DHD转变的相关功能”是指：与对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白和对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白同样地在与对苯二甲酸反应时能够生成TPA-DHD的功能。
作为本发明中使用的对苯二甲酸转运蛋白，可以列举例如具有序列号8所示的源自红球菌jostii（Rhodococcus jostii）RHA1株的氨基酸序列的蛋白质。此外，作为本发明中使用的对苯二甲酸转运蛋白，可以列举包含在序列号8的氨基酸序列中缺失、置换或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有对苯二甲酸的细胞内输送能力的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与序列号8的氨基酸序列具有75％以上同源性、优选90％以上、特别优选95％以上同源性的氨基酸序列且具有将对苯二甲酸输送至细胞内的活性的蛋白质。
作为本发明中使用的TPA-DHD脱氢酶蛋白质，可以列举例如具有序列号10所示的源自上述睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的氨基酸序列的蛋白质。此外，作为本发明中使用的TPA-DHD脱氢酶蛋白质，可以列举包含在序列号10的氨基酸序列中缺失、置换或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有将TPA-DHD转变为原儿茶酸的活性的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与序列号10的氨基酸序列具有75％以上同源性、优选90％以上、特别优选95％以上同源性的氨基酸序列且具有将TPA-DHD转变为原儿茶酸的活性的蛋白质。
作为本发明中使用的对羟基苯甲酸羟化酶，可以列举例如绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO株的GenBank（以下GenBank简记为GB）GB登录号AAG03636的蛋白质、或恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440株的GB登录号AAN69138的蛋白质、或具有序列号12所示的源自谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032株的氨基酸序列的蛋白质。此外，作为本发明中使用的对羟基苯甲酸羟化酶蛋白质，可以列举包含在序列号12的氨基酸序列中缺失、置换或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有将原儿茶酸转变为没食子酸的活性的蛋白质。特别优选使用：GB登录号AAG03636的第199位的亮氨酸置换为缬氨酸或甘氨酸且第385位的酪氨酸置换为苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸的变异体，GB登录号AAN69138的第199位的亮氨酸置换为缬氨酸或甘氨酸且第386位的酪氨酸置换为苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸的变异体，或GB登录号BAB98470的第200位的亮氨酸置换为缬氨酸或甘氨酸且第385位的酪氨酸置换为苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸的变异体。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与序列号12的氨基酸序列具有75％以上同源性、优选90％以上、特别优选95％以上同源性的氨基酸序列且具有将原儿茶酸转变为没食子酸的活性的蛋白质。
作为本发明中使用的乳醛还原酶，可以列举例如大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli）K-12株的GB登录号AAB40449的蛋白质。此外，作为本发明中使用的乳醛还原酶蛋白质，可以列举包含在GB登录号AAB40449的氨基酸序列中缺失、置换或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有将乙二醇转变为羟乙醛（Glycoaldehyde）的活性的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与GB登录号AAB40449的氨基酸序列具有75％以上同源性、优选90％以上、特别优选95％以上同源性的氨基酸序列且具有将乙二醇转变为羟乙醛的活性的蛋白质。
作为本发明中使用的乳醛脱氢酶，可以列举例如大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli）K-12株的GB登录号AAC74497的蛋白质。此外，作为本发明中使用的乳醛脱氢酶蛋白质，可以列举包含在GB登录号AAC74497的氨基酸序列中缺失、置换或附加1或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有将羟乙醛转变为乙醇酸的活性的蛋白质。此外，作为该蛋白质，可以列举包含与GB登录号AAC74497的氨基酸序列具有75％以上同源性、优选90％以上、特别优选95％以上同源性的氨基酸序列且具有将羟乙醛转变为乙醇酸的活性的蛋白质。
这些菌株可以由ATCC、独立行政法人制品基盘技术基盘机构生物遗传资源部门（以下简称为NBRC）、独立行政法人理化学研究筑波研究所生物资源中心、国立遗传学研究所国立生物资源课题组（以下简称为NBRP）、或TheColi Genetic Stock Center（以下根据需要有时简称为CGSC）等获得。
关于上述包含在对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白、对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白、对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质、TPA-DHD脱氢酶蛋白质、对苯二甲酸转运蛋白、乳醛还原酶蛋白质、乳醛脱氢酶蛋白质中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列且具有各自的目标酶活性的蛋白质，可以使用Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)（以下简称为分子克隆第2版）、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987-1997)（以下简称为Current Protocols in Molecular Biology）、Nucleic AcidsRes.,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Res.,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,82,488(1985)等所述的位点特异性变异导入法按照在各蛋白质中特定的位置导入缺失、置换或附加的方式在DNA中导入位点特异性变异，从而获得。缺失、置换或附加的1个或数个这样的氨基酸的个数只要能够维持各个酶活性即可，没有特别限定，理想的是为与原氨基酸序列的差异的个数以内，优选1～20个，更优选1～10个，特别优选1～5个。
作为编码本发明中使用的对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白的DNA，可以列举例如具有序列号1所示的碱基序列的DNA。
作为编码本发明中使用的对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白的DNA，可以列举例如具有序列号3所示的碱基序列的DNA。
作为本发明中使用的对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质，可以列举例如具有序列号5所示的碱基序列的DNA。
作为编码本发明中使用的对苯二甲酸转运蛋白的DNA，可以列举例如具有序列号7所示的碱基序列的DNA。
作为本发明中使用的TPA-DHD脱氢酶蛋白质，可以列举例如具有序列号9所示的碱基序列的DNA。
作为本发明中使用的对羟基苯甲酸羟化酶蛋白质，可以列举例如具有序列号11所示的碱基序列的DNA。
作为本发明中使用的乳醛还原酶蛋白质，可以列举例如具有GB登录号U2958的由第13420位至第4571位的碱基序列的DNA。
作为本发明中使用的乳醛脱氢酶蛋白质，可以列举例如具有GB登录号NC_000913的由第1486256位至第1487695位的碱基序列的DNA。
本发明中使用的DNA中还包含如下DNA：将在不使各DNA编码的蛋白质失去目标酶活性的范围内导入了置换变异、缺失变异、插入变异等变异的DNA如序列号1、3、5、7、9或11表示的DNA的全部或一部分作为探针，通过杂交法在严格条件下杂交的DNA。在严格条件下杂交的DNA具体是指：使用固定有DNA的过滤器在0.7～1.0M的NaCl存在下于65℃进行杂交后，通过在浓度为0.1倍浓度～2倍浓度间的SSC溶液（1倍浓度的SSC溶液的组成为150mM NaCl、15mM柠檬酸钠）中、65℃下清洗过滤器能够鉴定的DNA。予以说明，杂交实验方法记载在分子克隆：Molecular Cloning,A laboratorymanual、第2版〔Sambrook、Fritsch、Maniatis编著、Cold Spring HarborLaboratory Press、1989年出版〕中。
作为用于本发明、即以相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐为原料生产TPA-DHD中使用的微生物，只要是具有编码上述对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶大亚基的DNA、编码上述对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基的DNA及编码上述对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶还原酶的DNA且具有由对苯二甲酸生产TPA-DHD的能力的微生物即可，可以使用任意微生物。即，可以使用具有前述（1）所述的DNA且具有由对苯二甲酸生产TPA-DHD的能力的微生物。具有这种性质的微生物也可以是使用重组技术将前述（1）所述的DNA中的1个以上DNA导入宿主细胞而得的转化体。
此外，使用上述微生物以对苯二甲酸盐为原料生产TPA-DHD时，优选使用使该微生物具有编码对苯二甲酸转运体的DNA且对苯二甲酸的输送能力得到增强的微生物。具有这种性质的微生物也可以是使用重组技术将前述（1）所述的DNA中的1个以上DNA以及前述（4）所述的DNA中的1个以上DNA导入宿主细胞而得的转化体。
作为原儿茶酸的生产中使用的本发明所使用的微生物，只要是在上述由对苯二甲酸生产TPA-DHD的能力的基础上包含编码具有TPA-DHD脱氢酶活性的蛋白质的DNA且具有由TPA-DHD生产原儿茶酸的能力的微生物即可，可以使用任意微生物。即，可以使用具有前述（5）所述的DNA且具有由TPA-DHD生产原儿茶酸的能力的前述（1）或（4）所述的微生物。具有这种性质的微生物可以是使用重组技术将前述（1）所述的DNA中的1个以上DNA以及前述（5）所述的DNA中的1个以上DNA导入宿主细胞而得的转化体。此外，在使用上述微生物以对苯二甲酸盐为原料生产原儿茶酸时，优选使用使该微生物具有编码对苯二甲酸转运体的DNA且对苯二甲酸的输送能力得到增强的微生物。具有这种性质的微生物可以利用使用重组技术将前述（1）及（4）所述的DNA以及前述（5）所述的DNA中的1个以上DNA导入宿主细胞而得的转化体。
作为没食子酸的生产中使用的本发明所使用的微生物，只要是在上述由对苯二甲酸生产TPA-DHD的能力的基础上包含编码具有TPA-DHD脱氢酶活性的蛋白质的DNA、及包含编码对羟基苯甲酸羟化酶的蛋白质的DNA且具有由TPA-DHD生产没食子酸的能力的微生物即可，可以使用任意微生物。即，可以使用在前述（5）所述的DNA的基础上具有前述（7）所述的DNA且具有由对苯二甲酸生产没食子酸的能力的微生物。具有这种性质的微生物可以是使用重组技术将前述（1）及（5）所述的DNA中的1个以上DNA以及前述（7）所述的DNA中的1个以上DNA导入宿主细胞而得的转化体。此外，在使用上述微生物以对苯二甲酸盐为原料生产没食子酸时，优选使用使该微生物具有编码对苯二甲酸转运体的DNA且对苯二甲酸的输送能力得到增强的微生物。具有这种性质的微生物可以是使用重组技术将前述（1）及（4）及（5）所述的DNA以及前述（7）所述的DNA中的1个以上DNA导入宿主细胞而得的转化体。
作为分解在乙二醇溶剂中将聚酯解聚时混入到对苯二甲酸盐中的乙二醇的、本发明中使用的微生物，可以使用对上述由对苯二甲酸生产TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的微生物在乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中导入变异、和／或增加乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而增强了乙二醇分解能力的微生物。
以下详细说明DNA的克隆和转化株的构建方法。
将上述大肠埃希氏杆菌K-12株、睾丸酮丛毛单胞菌72W2株、红球菌jostiiRHA1株、谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株等细菌通过上述微生物受让机构推荐的培养条件或通常使用的公知方法进行培养。培养后通过公知方法（例如Current Protocols in Molecular Biology所述的方法）分离精制该微生物的染色体DNA。可以使用合成DNA利用杂交法或PCR法等由该染色体DNA获得包含编码目标蛋白质的DNA的片段。
编码目标蛋白质的DNA也可以通过化学合成而获得。该合成DNA例如可以基于源自睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的编码对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白的DNA即序列号1所示的碱基序列、及源自睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的编码对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白的DNA即序列号3所示的碱基序列、及源自睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的编码对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质的DNA即序列号5所示的碱基序列进行设计。
作为编码对苯二甲酸转运蛋白的合成DNA，可以基于红球菌jostiiRHA1株的编码对苯二甲酸转运蛋白的DNA即序列号7所示的碱基序列进行设计。
作为编码TPA-DHD脱氢酶的合成DNA，可以基于睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的编码TPA-DHD脱氢酶蛋白质的DNA即序列号9所示的碱基序列进行设计。
作为编码对羟基苯甲酸羟化酶的合成DNA，可以基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株的编码对羟基苯甲酸羟化酶蛋白质（第385位的酪氨酸置换为苯丙氨酸的蛋白质）的DNA即序列号11所示的碱基序列进行设计。
作为编码乳醛还原酶的合成DNA，可以基于大肠埃希氏杆菌K-12株的编码乳醛还原酶蛋白质的DNA即GB登录号U2958的第13420位至第4571位的碱基序列进行设计。
作为编码乳醛脱氢酶的合成DNA，可以基于大肠埃希氏杆菌K-12株的编码乳醛脱氢酶蛋白质的DNA即GB登录号NC_000913的第1486256位至第1487695位的碱基序列进行设计。
作为将上述DNA连接的载体，只要是能够在大肠埃希氏杆菌K12株等中自主复制的载体即可，可以使用质粒载体、噬菌体载体等任意载体，具体而言，可以使用pUC19〔Gene,33,103(1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（RocheDiagnostics K.K.制）、ZAP Express〔Stratagene公司制、Strategies,5,58(1992)〕、pBluescript II SK(+)〔Stratagene公司制、Nucleic Acids Res.,17,9494(1989)〕、pUC118（宝生物公司制）等。
作为将上述获得的DNA连接至该载体而获得的重组DNA的宿主而使用的大肠埃希氏杆菌，只要是属于大肠埃希氏杆菌的微生物则可以任意使用，具体可以列举大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli）XL1-Blue MRF'〔Stratagene公司制、Strategies,5,81(1992)〕、大肠埃希氏杆菌C600〔Genetics,39,440(1954)〕、大肠埃希氏杆菌Y1088〔Science,222,778(1983)〕、大肠埃希氏杆菌Y1090〔Science,222,778(1983)〕、大肠埃希氏杆菌NM522〔J.Mol.Biol.,166,1(1983)〕、大肠埃希氏杆菌K802〔J.Mol.Biol.,16,118(1966)〕、大肠埃希氏杆菌JM105〔Gene,38,275(1985)〕、大肠埃希氏杆菌JM109、大肠埃希氏杆菌BL21等。
在将上述DNA导入属于红球菌（Rhodococcus）属、丛毛单胞菌（Comamonas）属、棒状杆菌属（Corynebacterium）属、假单胞菌（Pseudomonas）属、Polaromonas属、雷尔氏菌（Ralstonia）属或伯克氏菌属（Burkholderia属）的微生物中时，可以使用能够在这些微生物中自主复制的载体。可以优选使用能够在该微生物的任一种和大肠埃希氏杆菌K12株两种微生物中自主复制的穿梭载体将重组DNA导入到作为宿主的该微生物中。
作为重组DNA的导入方法，只要是将DNA导入上述宿主细胞的方法则可以任意使用，例如可以列举使用钙离子的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,69,2110(1972)〕、电穿孔法〔Nucleic Acids Res.,16,6127(1988)〕、接合转移（conjugational transfer）法〔J.G.C.Ottow,Ann.Rev.Microbiol.,Vol.29,p.80(1975)〕、细胞融合法〔M.H.Gabor,J.Bacteriol.,Vol.137,p.1346(1979)〕等。
可以从上述获得的转化体选取重组DNA，测定该重组DNA中包含的本发明中使用的DNA的碱基序列。可以使用通常使用的碱基序列解析方法、例如双脱氧法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)〕或3730xl型DNA分析仪（applied biosystems公司制）等碱基序列分析装置进行碱基序列的测定。
此外，也可以基于上述测定的DNA碱基序列使用珀金埃尔默公司（PerSeptive Biosystems）制8905型DNA合成装置等进行化学合成，来制备目标DNA。
关于表达上述对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白、对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白、对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质、对苯二甲酸转运蛋白、TPA-DHD脱氢酶蛋白质、对羟基苯甲酸羟化酶蛋白质、乳醛还原酶蛋白质、和/或乳醛脱氢酶蛋白质的转化体，可以使用下述方法使宿主细胞中表达上述DNA从而获得。
使用编码上述蛋白质的DNA时，可以根据需要制备包含编码本发明中使用的蛋白质的部分的适当长度的DNA片段。此外，也可以对编码该蛋白质的部分的碱基序列进行碱基置换从而使其成为最适合在宿主中表达的密码子，来提高该蛋白质的生产率。关于表达本发明中使用的DNA的转化体，可以通过将上述DNA片段插入适当表达载体的启动子下游而制作重组DNA，将该重组DNA导入至适合该表达载体的宿主细胞，从而获得。
作为表达本发明中使用的蛋白质的宿主，只要是细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等能够表达目标基因的载体即可任意使用。可以优选使用不具有TPA-DHD的代谢能力的微生物。可以更优选列举不具有TPA-DHD的代谢能力的大肠杆菌属的细菌或假单胞菌（Pseudomonas）属的细菌。进而，可以优选列举大肠埃希氏杆菌K-12株或恶臭假单胞菌KT2440株。
作为表达载体，可以使用能够在上述宿主细胞中自主复制或能够整合至染色体中、在能够转录本发明中使用的DNA的位置含有启动子的表达载体。
在使用细菌等原核生物作为宿主细胞时，含有本发明中使用的DNA而成的重组DNA优选为能够在原核生物中自主复制且由启动子、核糖体结合序列、本发明中使用的DNA、转录终止序列构成的重组DNA。也可以包含控制启动子的基因。
作为用于将编码本发明中使用的蛋白质、或该蛋白质和其它蛋白质的融合蛋白的DNA导入大肠埃希氏杆菌等微生物并进行表达的载体，优选所谓的多拷贝型，可以列举具有源自ColE1的复制起点的质粒，例如pUC系质粒、pBR322系质粒或其衍生物。在这里，“衍生物”是指对质粒通过碱基的置换、缺失、插入、附加和/或倒位等施加改变而得的产物。予以说明，这里所称改变也包括利用诱变剂、UV照射等进行的变异处理、或自然变异等产生的改变。更具体而言，作为载体，可以使用例如pUC19〔Gene,33,103(1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（Roche Diagnostics K.K.制）、pKK233-2（安玛西亚生物技术公司制）、pSE280（Invitrogen公司制）、pGEMEX-1（Promega公司制）、pQE-8（Qiagen公司制）、pET-3（Novagen公司制）pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(+)（Stratagene公司制）、pSTV28（宝生物公司制）、pUC118（宝生物公司制）等。
作为启动子，只要是可能够在大肠埃希氏杆菌等宿主细胞中表达的即可，可以为任意启动子。可以使用例如trp启动子（Ptrp）、lac启动子（Plac）、PL启动子、PR启动子等的、T7启动子等源自大肠埃希氏杆菌、噬菌体等启动子及tac启动子、lacT7启动子这类人为设计改变的启动子等、及受恶臭假单胞菌的TOL质粒的XylS蛋白质控制的Pm启动子。
优选使用将作为核糖体结合序列的SD（Shine-Dalgarno）序列和起始密码子之间调节为适当距离（例如5～18个碱基）的质粒。本发明中使用的重组DNA中，虽然对于本发明中使用的DNA的表达而言转录终止序列并非是必需的，但优选紧接着结构基因配置转录终止序列。
可以使用重组DNA技术等构建与母株相比增强了上述任意1种以上蛋白质的生产量的微生物，来提高TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的生产量。具体而言，可以列举：使用转录活性高于天然启动子的启动子作为用于使编码上述任意蛋白质的基因表达的启动子、或使用转录终止活性高于天然的终止子的终止子作为用于终止编码该蛋白质的基因的转录的终止子、或利用高拷贝数载体作为表达载体通过同源重组整合在染色体上等。
通过使用如上获得的表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白、对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白、及对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质的微生物，可以由对苯二甲酸盐制造TPA-DHD。例如，可以在通过液体培养基培养该微生物后，将相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐以0.1mM～1M的浓度添加在该微生物的培养液中，生成、蓄积TPA-DHD，从该培养液收集TPA-DHD。在培养基中培养本发明中使用的微生物的方法可以按照微生物培养中使用的通常方法来进行。
此外，也可以在培养上述微生物后，在包含如下的对苯二甲酸盐的水性介质中添加该微生物的培养菌体或该培养菌体的处理物，从而生成、蓄积TPA-DHD，由该介质收集TPA-DHD，从而制造TPA-DHD，所述对苯二甲酸盐相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。
通过使用表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白、对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白、对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质、及TPA-DHD脱氢酶的微生物，可以由对苯二甲酸盐制造原儿茶酸。例如，可以在通过液体培养基培养该微生物后，将相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐以0.1mM～1M的浓度添加在该微生物的培养液中，生成、蓄积原儿茶酸，从该培养液收集原儿茶酸。在培养基中培养本发明中使用的微生物的方法可以按照微生物培养中使用的通常方法来进行。
此外，也可以在培养上述微生物后，在包含如下的对苯二甲酸盐的水性介质中添加该微生物的培养菌体或该培养菌体的处理物，从而生成、蓄积原儿茶酸，由该介质收集原儿茶酸，从而制造原儿茶酸，所述对苯二甲酸盐相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。
此外，还可以在通过前述（1）～（4）中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成TPA-DHD后，使用通过转化法导入有前述（q）、（r）、（s）或（t）所示的DNA而获得的其它微生物的培养物或该培养物的处理物将TPA-DHD转变为原儿茶酸，从该培养液或该介质收集原儿茶酸，从而制造原儿茶酸。
通过使用表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白、对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白、对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质、TPA-DHD脱氢酶、及对羟基苯甲酸羟化酶的微生物，可以由对苯二甲酸盐制造没食子酸。例如，可以在通过液体培养基培养该微生物后，将相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐以0.1mM～1M的浓度添加在该微生物的培养液中，生成、蓄积没食子酸，从该培养液收集没食子酸。在培养基中培养本发明中使用的微生物的方法可以按照微生物培养中使用的通常方法来进行。
此外，也可以在培养上述微生物后，在包含如下的对苯二甲酸盐的水性介质中添加该微生物的培养菌体或该培养菌体的处理物，从而生成、蓄积没食子酸，由该介质收集没食子酸，从而制造没食子酸，所述对苯二甲酸盐相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。
此外，还可以通过前述（1）～（4）中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成TPA-DHD后，使用通过转化法导入有前述（q）、（r）、（s）或（t）所示的DNA及前述（u）、（v）、（w）或（x）所示的DNA而获得的其它微生物的培养物或该培养物的处理物将TPA-DHD转变为没食子酸，从该培养液或该介质收集没食子酸，从而制造没食子酸。
关于相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐，可以使用包含对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐及对苯二甲酸1-钾4-铵盐等对苯二甲酸钾盐的纯度高的对苯二甲酸盐，也可以由废弃聚酯获得。
以下说明由废弃聚酯获得作为通过微生物制造化合物的原料使用的、相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐的方法。
对于废弃聚酯的形状为容器、薄膜、片材、部件、纤维、粒状粉碎物、粉状粉碎物等任意形状的材料，均可以利用。收集以这些聚酯作为主成分（主成分是指例如含有80％以上的PET和/或PTT和/或PBT）、包含异物成分（主成分可以列举例如聚乙烯、聚丙烯）的聚酯废弃物。根据需要去除金属、聚酯以外的塑料等异物后，利用粉碎机将聚酯废弃物粉碎。作为聚酯废弃物的粉碎物，还可以将PET瓶再利用业者加工处理后的PET瓶碎片作为起始原料。通过比重分选法、利用磁石的金属分离法、利用水的清洗法或用水去除浮游异物的方法等对如此获得的聚酯废弃物的粉碎物进行处理，从而由聚酯破碎物中分离金属、玻璃、石头、食品/饮料的残渣、聚酯以外的塑料、及聚乙烯/聚丙烯的片材等异物·夹杂物。
称量如此获得的聚酯破碎物并测定对苯二甲酸的含量（摩尔数）后，投入金属性反应釜中。进而，将氢氧化钾或氢氧化钾和氢氧化钠的混合物、以及乙二醇或1-丁醇中的任一反应溶剂加入反应釜后，仅加热适当时间，从而进行聚酯破碎物的解聚反应。当解聚反应的溶液中含有适量的水时，反应快速进行且回收到的对苯二甲酸盐的收率也提高。
添加的氢氧化钾或氢氧化钠可以在固态粒子或水溶液的任一形态下添加，优选按照相对于加入到反应釜的聚酯破碎物中的对苯二甲酸的摩尔数为约2倍量的摩尔数、优选共计2～2.2倍的摩尔数的方式添加。更优选碱的添加量相对于聚酯破碎物中的对苯二甲酸的含量共计为2.10倍的摩尔数为宜。
添加的乙二醇或1-丁醇的量优选以相对于该聚酯破碎物的体积为3～10倍量的方式进行添加。更优选溶剂的添加量为共计5倍量为宜。理想的是在该解聚反应的溶液中加入适量的水，该解聚反应的溶液中含有的水的总量相对于聚酯破碎物中的对苯二甲酸的摩尔数为1倍量～5倍量是理想的。
反应釜中的压力优选为大气压附近的压力、例如0.9～1.1大气压（91.193～111.458kPa）。使用乙二醇作为反应溶剂时的反应温度为水蒸发且乙二醇不会蒸发的温度。反应釜中的压力为1大气压时，优选为100～196℃。当在比1大气压低的气压下反应时，在100～196℃的范围内、水蒸发且乙二醇不会蒸发的温度下反应。此外，当在比1大气压高的气压下反应时，在100～196℃的范围内、水蒸发且乙二醇不会蒸发的温度下反应。使用1-丁醇作为反应溶剂时的反应温度为水蒸发且1-丁醇不会蒸发的温度。当反应釜中的压力为1大气压时，优选为100～116℃。当在比1大气压低的气压下反应时，在100～116℃的范围内、水蒸发且1-丁醇不会蒸发的温度下反应。此外，当在比1大气压高的气压下反应时，在100～116℃的范围内、水蒸发且1-丁醇不会蒸发的温度下反应。
加热时间优选为聚酯破碎物完全分解的时间，通常为10～240分钟，由于溶解速度是按照PET、PTT、PBT的顺序减慢，因此当对PTT和PBT解聚时，理想的是延长加热分解时间。加热反应中蒸发的水分等挥发性物质可利用冷凝器进行回收。
解聚反应结束后，除了乙二醇或1-丁醇的溶液和源自对苯二甲酸盐的固态物以外还存在浮游物形式的聚酯以外的异物塑料如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、氯乙烯时，去除该浮游物。然后，使用由过滤、离心处理等的固液分离法将对苯二甲酸盐的固态物从乙二醇溶剂或1-丁醇溶剂中分离。
通过上述固液分离法分离的乙二醇溶剂中溶解有大量的对苯二甲酸盐，因此优选使用该溶剂作为上述PET、PTT或PBT的解聚反应溶剂。此外，虽然对苯二甲酸盐在1-丁醇溶剂中的溶解度低，但将解聚反应中使用的1-丁醇溶剂再次作为上述PET、PTT或PBT的解聚反应溶剂使用时能够降低制造成本，因此是优选的。从而，PET、PTT或PBT的解聚反应中使用的乙二醇溶剂或1-丁醇溶剂可以通过将所生成的对苯二甲酸盐分离而反复用于聚酯的解聚反应中。
接着，当对苯二甲酸盐的固态物中包含的杂质多时，可以利用适量的乙二醇或1-丁醇对获得的对苯二甲酸盐的固态物实施清洗处理。特别是，在对包含PTT、PBT的聚酯废弃物进行解聚时，1,3-丙二醇、1,4-丁二醇会混入该固态物中，因此优选利用乙二醇或1-丁醇实施清洗处理。此外，当在1-丁醇反应溶剂中将PET树脂解聚时，虽然乙二醇混入该固态物中，但该乙二醇可以通过下述的减压干燥而被去除，但也可以通过1-丁醇进行清洗处理去除该乙二醇。
如此获得的对苯二甲酸盐的固态物中包含大量的乙二醇或1-丁醇，因此根据需要使用减压干燥机等进行减少该固态物中的乙二醇或1-丁醇的处理、或使用离心分离机等进行液体状物质的分离。如此获得的相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐可以在TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的制造中使用。
此外，当该对苯二甲酸盐中混入有难水溶性的固态异物时，可以将该对苯二甲酸盐溶解于适量的水后，通过过滤法去除异物，将由此获得的对苯二甲酸盐的水溶液用于利用微生物进行的化合物生产中。
予以说明，为了将通过乙二醇溶剂中的废弃聚酯的解聚而获得的对苯二甲酸盐中所混入的乙二醇分解，还可以在液体培养基中培养使乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量增强的、本发明中使用的微生物后，按照在培养液中达到0.1mM～1M的浓度的方式将其添加到含有乙二醇且相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐中，从而边分解乙二醇边生成TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸。
还可以在培养本发明中使用的微生物后，将该微生物的培养菌体或该培养菌体的处理物添加到包含如下对苯二甲酸盐的水性介质中，从而生成、蓄积TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸，从该介质收集TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸，所述对苯二甲酸盐相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾。
本发明中使用的微生物的培养可以在包含碳源、氮源、无机盐、各种维生素等的通常的营养培养基中进行，作为碳源，可以使用例如葡萄糖、蔗糖、果糖等糖类，乙醇、甲醇等醇类，柠檬酸、苹果酸、琥珀酸等有机酸类，废糖蜜等。作为氮源，可以将例如氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素等各自单独使用或混合使用。此外，作为无机盐，可以使用例如磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸镁等。其它的还可以在培养基中添加蛋白胨、肉浸出物、酵母浸出物、玉米浆、酪蛋白氨基酸（casamino acids）、生物素等各种维生素等营养素。作为用于生产TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的原料，添加如上制备的、相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾的对苯二甲酸盐。
培养通常在通气搅拌、振荡等好氧条件下进行。培养温度只要是本发明中使用的微生物能够生育的温度即可，没有特别限定，此外，对于培养过程中的pH，只要是本发明中使用的微生物能够生育的pH即可，没有特别限定。培养中的pH调节可以通过添加酸或碱来进行。
作为该培养菌体的处理物，可以使用将本发明中使用的微生物固定化在载体上的处理物。此时，可以以由培养物回收的状态使用、或者可以使用用适当缓冲液、例如0.02～0.2M左右的磷酸缓冲液（pH6～10）等清洗后的菌体。此外，在本发明的TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的制造中，还可以使用：将由培养物回收的菌体用超声波、挤压等手段破碎而得的破碎物，用水等对该破碎物进行提取而获得的含有本发明中使用的蛋白质的提取物，将对该提取物进一步进行硫酸铵盐析、柱色谱等处理而获得的本发明中使用的蛋白质的部分精制成分等固定化在载体上的产物。
关于这些菌体、菌体破碎物、提取物或精制酶的固定化，可以按照方法本身已经公知的常用的方法，通过将菌体等固定化在丙烯酰胺单体、藻酸、或角叉菜胶等适当的载体上的方法而进行。
反应中使用的水性介质可以是含有对苯二甲酸盐的水溶液或适当的缓冲液，例如0.02～0.2M左右的磷酸缓冲液（pH6～10）。在需要提高菌体的细胞膜的物质透过性时，可以向该水性介质中添加0.05～2.0％（w/v）的甲苯、二甲苯、非离子性表面活性剂等。
水性介质中的作为反应原料的对苯二甲酸盐的浓度为0.1mM～1M左右是适当的。上述水性介质中的酶反应温度及pH没有特别限定，通常为10～60℃、优选15～50℃是适当的，反应液中的pH可以设为5～10、优选6～9左右。此外，pH的调节可以通过添加酸或碱来进行。
关于发明中使用的酶，可以直接为菌体提取液，或者由菌体提取液通过离心分离、过滤等收集后将其悬浊于水或缓冲液中而获得。如此获得的酶在对苯二甲酸盐的存在下可以反应，但在不抑制酶活性的范围内尽量提高反应液中的对苯二甲酸盐的浓度更为有利。反应可以通过静置、搅拌、振荡中的任意方法进行。此外，还可以利用将酶固定化在适当的支持体上后填充在柱中、使包含对苯二甲酸盐的溶液流过的方法。反应通常在10～60℃、优选15～50℃、pH5～9、优选pH6～9下进行。
此外，如果在反应时向上述水性介质中添加抗氧化剂或还原剂，有时TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的生成收率会进一步提高。作为抗氧化剂／还原剂，可以列举抗坏血酸、异抗坏血酸、半胱氨酸、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠等亚硫酸盐、硫代硫酸钠等硫代硫酸盐。添加浓度根据抗氧化剂／还原剂的种类而不同，理想的是以不阻碍TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的生成的浓度进行添加，通常为0.001～5％（w/v），优选0.005～1％。
此外，如果在反应时向上述水性介质中添加氧化剂，有时TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的生成收率会进一步提高。作为氧化剂，可以列举亚硝酸钠、亚硝酸钾等硝酸盐、氯化铁和硫酸铁等金属盐、卤素、过氧酸等，优选亚硝酸钠、氯化铁、硫酸铁。添加浓度根据氧化剂的种类而不同，理想的是以不阻碍TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸的生成的浓度进行添加，通常为0.001～0.05％（w/v），优选0.005～0.02％。
关于结束培养后的培养液或反应液中的TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸，可以根据需要通过离心分离等从该培养液去除菌体等不溶成分后，通过单独使用或组合使用例如利用乙酸乙酯等有机溶剂的提取法、使用活性炭的方法、使用离子交换树脂的方法、晶析法、盐析等沉淀法、蒸馏法等方法收集TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸。对于TPA-DHD、原儿茶酸或没食子酸，当需要在酸的状态下而非盐的状态下获得化合物时，可以在上述精制工序中通过硫酸、盐酸等的添加来降低pH使形成了盐的羧酸变成游离酸的状态。
以下通过实施例具体说明本发明的方法，但本发明不受其限定。
实施例1.各种对苯二甲酸盐的溶解度的测定
将对苯二甲酸（粉末状，Sigma-Aldrich Japan制；以下没有特别声明时，试剂均使用Sigma-Aldrich Japan制品。）2.99g（0.018mol）和氢氧化钾（颗粒状）0.036mol投入到50mL玻璃烧杯中，用蒸馏水调整为约15mL。用铝箔盖住，边用加热搅拌器（AS ONE Corporation制）搅拌，边在50℃下加热60分钟后，放冷，冷却至30℃。在30℃搅拌120分钟以上，确认溶液中残存有沉淀后，收集溶液1mL，使用微量高速离心机（TOMY SEIKO CO.,LTD.制）离心〔30℃、14000rpm（17800g）、30秒钟〕，从而回收上清。
测定该上清的对苯二甲酸的浓度，作为对苯二甲酸二钾盐的溶解度。关于对苯二甲酸的浓度的测定，用2.5％乙腈水溶液将样品稀释至16000倍，使用高速液相色谱（Water公司，LCT Premier XE）按照表1的分离条件分析后，基于与作为对照的已知浓度的对苯二甲酸水溶液的对苯二甲酸峰的面积之比而算出。
[表1]LCT Premier XE的HPLC分析条件
与上述对苯二甲酸二钾盐的水溶液的制作方法同样地，相对于对苯二甲酸（粉末状）2.99g（0.018mol）加入氢氧化钠（颗粒状）0.036mol、或28%氨水0.036mol、或氢氧化钾0.018mol及氢氧化钠0.018mol、或氢氧化钾0.018mol及28%氨水0.018mol、或氢氧化钠0.018mol及28%氨水0.018mol，从而制作对苯二甲酸二钠盐、对苯二甲酸二铵盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐、对苯二甲酸1-钾4-铵盐、或对苯二甲酸1-钠4-铵盐的水溶液，然后测定各个对苯二甲酸盐的溶解度。
获得的各对苯二甲酸盐的溶解度如表2所示。由表2的结果可知，对苯二甲酸二钾、对苯二甲酸1-钾4-钠、对苯二甲酸1-钾4-铵、对苯二甲酸二钠、对苯二甲酸1-钠4-铵、对苯二甲酸二铵在水中的溶解度是依次升高的，对苯二甲酸的至少1个羧基残基与钾形成了盐的盐溶解度更为优异。
[表2]
对苯二甲酸盐对水的溶解度
实施例2.由对苯二甲酸盐的差异所致的TPA-DHD的生产性差异
基于实施例1的结果，以对苯二甲酸、氢氧化钾、氢氧化钠、28%氨水及蒸馏水为基础，制备0.6M对苯二甲酸二钾水溶液、0.6M对苯二甲酸1-钾4-钠水溶液、0.6M对苯二甲酸1-钾4-铵水溶液、及0.6M对苯二甲酸二钠水溶液各500mL。将这些对苯二甲酸盐溶液30ml和葡萄糖7g混合，作为葡萄糖基质混合液。
通过转化法将参考例3中构建的TPA-DHD生产质粒pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK导入到大肠杆菌M7032株（由Yale大学的CGSC获得）中，获得重组大肠杆菌株M7032(pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK)。
将该转化体在包含终浓度100mg/l氨苄青霉素的1ml的LB液体培养基〔10g/l胰蛋白胨（Difco公司制）、5g/l干燥酵母提取物（Difco公司制）、10g/l氯化钠〕中培养过夜。然后，仅将1%量的该过夜培养液接种在包含终浓度100mg/l氨苄青霉素的10ml的F6.6W/P100/G2培养基中，30℃下培养24小时。予以说明，F6.6W/P100/G2培养基是指，包含磷酸二氢钾13.6g/L、柠檬酸一水合物2.1g/L、硫酸铵9.9g/L、硫酸铁（II）七水合物1.703g/L、葡萄糖20g/L、硫酸镁七水合物246mg/ml、氯化钙二水合物12.9mg/L、硫胺素盐酸盐10mg/L、氧化镁10.75mg/L、碳酸钙2mg/L、硫酸锌七水合物4.5mg/ml、硫酸锰(II)四水合物1.12mg/L、硫酸铜(II)五水合物0.25mg/L、硫酸钴(II)七水合物0.28g/L、及硼酸0.06mg/L〕的水溶液。
然后，为了以该前培养液为基础进行主培养，将作为主培养培养基的F6.6W/P10/G1培养基65ml投入8升小型发酵罐(mini jar fermenter）（ABLEINC.制）中，调节为30.2℃±0.2、pH6.9±0.1。予以说明，F6.6W/P10/G1培养基是指，包含磷酸二氢钾1.36g/L、柠檬酸一水合物2.1g/L、硫酸铵9.9g/L、硫酸铁（II）七水合物1.703g/L、葡萄糖20g/L、硫酸镁七水合物246mg/ml、氯化钙二水合物12.9mg/L、硫胺素10mg/L、氧化镁10.75mg/L、碳酸钙2mg/L、硫酸锌七水合物4.5mg/ml、硫酸锰四水合物1.12mg/L、硫酸铜五水合物0.25mg/L、硫酸钴七水合物0.28g/L、硼酸0.06mg/L的水溶液。
发酵罐培养的通气条件调节为1vvm，培养的pH调节使用氨水和硫酸来进行。此外，关于培养液中的溶解氧，将饱和氧浓度设为100%地进行调节，通过搅拌桨的转速进行控制，使得随着菌体增殖而减少的溶解氧维持在15%。
在主培养培养基中接种0.1%的前培养液，按照上述条件进行培养。菌体浊度在吸光度600nm下为约7时，添加诱导剂间甲基苯甲酸至终浓度为1mM，使其表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶蛋白质、对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质、及对苯二甲酸转运蛋白。经时测定葡萄糖浓度，在葡萄糖浓度达到0时，投与葡萄糖基质混合液。
在主培养开始起48小时后采集样品。将各样品供于利用LC-TOF型质谱仪（Waters公司，LCT Premier XE）进行的表1所示条件下的分析。对苯二甲酸的鉴定通过与对苯二甲酸标准品比较，对上高速液相色谱的保持时间和由质谱仪获得的精密质量值而进行。TPA-DHD是由随着对苯二甲酸的减少而出现的物质中基于TPA-DHD的予想精密质量值而鉴定的。此外，TPA-DHD的定量是基于由对苯二甲酸的减少量和TPA-DHD的峰面积的增加而制作的标准曲线进行的。
其结果是，观察到TPA-DHD随着对苯二甲酸减少而增加。将培养48小时后的来自各对苯二甲酸盐的TPA-DHD生产量作为100%的比率如表3所示。由表3所示的结果可知，3种对苯二甲酸钾盐的TPA-DHD的生产性均比对苯二甲酸二钠盐优异。
[表3]
由对苯二甲酸盐所致的TPA-DHD的生产性差异
实施例3.由对苯二甲酸盐中的钾离子的浓度所致的TPA-DHD的生产性差异
由实施例2的结果表明，以对苯二甲酸钾盐为原料时TPA-DHD的生产性更优异。因此，按照下述研究了对苯二甲酸盐中的钾离子的浓度对TPA-DHD的影响。
首先，将实施例2中制备的0.6M对苯二甲酸二钾水溶液和0.6M对苯二甲酸二钠水溶液分别按照0:100、20:80、25:75、30:70、35:65、50:50的比例混合，制作对苯二甲酸盐的水溶液。将这些对苯二甲酸盐溶液30ml和葡萄糖7g混合，作为葡萄糖基质混合液。
使用这些葡萄糖基质混合液，通过与实施例2的方法同样的方法利用重组大肠杆菌株M7032(pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK)研究TPA-DHD的生产性。其结果如表4所示。
其结果如表4所示，观察到随着对苯二甲酸盐中的钾离子含量的增加，TPA-DHD的生产性也增加的现象，表明：与以对苯二甲酸二钠盐为原料时的生产性相比，使用相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上的钾的对苯二甲酸盐时，TPA-DHD的生产性变高。
[表4]
表4.由对苯二甲酸盐中的钾离子浓度所致的TPA-DHD的生产性差异
实施例4.由对苯二甲酸盐的差异所致的原儿茶酸的生产性差异
通过转化法将参考例2中构建的原儿茶酸生产质粒pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK导入到大肠杆菌M7032株中，获得原儿茶酸生产大肠杆菌株M7032(pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK)。
接着，与实施例2同样制备该原儿茶酸生产菌的前培养液后，仅将2%量的该前培养液接种至主培养培养基，进行主培养。菌体浊度在吸光度600nm下为约7时，添加诱导剂间甲基苯甲酸至终浓度为1mM，使其表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶蛋白质、对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质,对苯二甲酸二羟基二醇脱氢酶蛋白质、及对苯二甲酸转运蛋白。经时测定葡萄糖浓度，在葡萄糖浓度达到0时，投与葡萄糖基质混合液。
在主培养开始起48小时后采集样品。将各样品供于利用LC-TOF型质谱仪（Waters公司，LCT Premier XE）进行的分析。对苯二甲酸及原儿茶酸的鉴定通过与对苯二甲酸及原儿茶酸的标准品进行比较，对上高速液相色谱的保持时间和由质谱仪获得的精密质量值而进行。
其结果是，观察到原儿茶酸随着对苯二甲酸的减少而增加。将培养48小时后的来自各对苯二甲酸盐的原儿茶酸生产量作为100%的比率如表5所示。由表5所示的结果可知，3种对苯二甲酸钾盐的原儿茶酸的生产性均比对苯二甲酸二钠盐优异。
[表5]
由对苯二甲酸盐所致的原儿茶酸的生产性差异
实施例5.由对苯二甲酸盐的差异所致的没食子酸的生产性差异
通过转化法将参考例4中构建的没食子酸质粒pUXPEaLT_HFM145_tphA2A3BA1_tpaK导入到大肠杆菌M7032株中，获得没食子酸生产大肠杆菌株M7032(pUXPEaLT_HFM145_tphA2A3BA1_tpaK)。接着，与实施例2同样制备该没食子酸生产菌的前培养液后，仅将2%量的该前培养液接种至主培养培养基，按照上述条件进行主培养。菌体浊度在吸光度600nm下为约7时，添加诱导剂间甲基苯甲酸至终浓度为1mM，使其表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶蛋白质、对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质,对苯二甲酸二羟基二醇脱氢酶蛋白质、对苯二甲酸转运蛋白及改良型对羟基苯甲酸羟化酶。经时测定葡萄糖浓度，在葡萄糖浓度达到0时投与葡萄糖基质混合液。
在主培养开始起48小时后采集样品。将各样品供于利用LC-TOF型质谱仪（Waters公司，LCT Premier XE）进行的分析。对苯二甲酸及原儿茶酸的鉴定通过与对苯二甲酸及没食子酸的标准品进行比较，对上高速液相色谱的保持时间和由质谱仪获得的精密质量值而进行。
其结果是，观察到没食子酸随着对苯二甲酸的减少而增加。将培养48小时后的来自各对苯二甲酸盐的没食子酸生产量作为100%的比率如表5所示。由表6所示的结果可知，3种对苯二甲酸钾盐的没食子酸的生产性均比对苯二甲酸二钠盐优异。
[表6]
由对苯二甲酸盐所致的没食子酸的生产性差异
实施例6.乙二醇溶剂中的废弃PET的解聚
（1）由碱金属氢氧化物的种类所致的废弃PET的解聚速度和解聚效率的差异
收集废弃PET瓶22kg，分离标签和瓶盖后，进行清洗、风干。委托日本焦炭工业株式会社（NIPPON COKE&ENGINEERING COMPANY）将该清洗后的废弃PET瓶粉碎成能够通过5mm见方的筛子的尺寸的颗粒。将该粉碎物作为废弃PET瓶破碎物用于以下工序。
在200mL的不锈钢制烧杯（由株式会社三商购入）中投入废弃PET瓶破碎物12g和乙二醇60g后，投入氢氧化钾（颗粒状）0.13mol、或氢氧化钠（颗粒状）0.13mol、或氢氧化钾0.066mol及氢氧化钠0.066mol，边使用加热搅拌器强力搅拌，边在160℃下进行120分钟的加热处理。
此时，从溶液的内温达到160℃时起，在经过0分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、120分钟的时刻回收反应液约200μL，测定各时刻中的对苯二甲酸盐的浓度。基于反应经过时间的对苯二甲酸盐的生成浓度如图2所示。
由图2的结果可知，添加氢氧化钾时，来自废弃PET瓶破碎物的对苯二甲酸盐的生成速度快、进而生成效率也优异。此外，仅添加氢氧化钾的情况与等摩尔添加氢氧化钾和氢氧化钠两者的情况，其效果是同等的。
（2）废弃PET解聚反应后的固态物残渣的分析
在500mL的不锈钢制烧杯（由三商购入）中投入废弃PET瓶破碎物30g和乙二醇150g后，投入氢氧化钾（颗粒状）0.33mol、或氢氧化钠（颗粒状）0.33mol、或氢氧化钾0.17mol及氢氧化钠0.17mol，边用加热搅拌器强力搅拌，边在160℃下进行60分钟的加热处理，然后自然冷却，当内温为40℃以下后取出内容物。
将该内容物用滤纸(WATT MANN CO,.LTD.制grade540)过滤分成滤液和残渣后，测定各自的残渣重量和残渣中的对苯二甲酸的总量。其结果如表7所示。
此外，通过与实施例1同样的方法研究对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸二钠盐、及对苯二甲酸1-钾4-钠盐在乙二醇中的溶解度，结果分别为231mM、109mM、205mM。
因此已知，与添加氢氧化钠相比，当添加氢氧化钾时对苯二甲酸盐在乙二醇中的溶解度高，因此对苯二甲酸盐的生成效率优异，添加氢氧化钾时和添加氢氧化钠时回收的对苯二甲酸量（摩尔换算）几乎相同（参照表7）。
[表7]
乙二醇溶剂中的PET解聚中的由碱金属氢氧化物所致的对苯二甲酸的生成量差异
（3）使用以对苯二甲酸盐饱和的乙二醇溶剂的废弃PET解聚反应
在将废弃PET解聚的工序中，将解聚完成后通过分离以对苯二甲酸盐为主成分的固态物残渣而获得的乙二醇溶剂进行再利用是理想的。考虑到供于废弃PET的解聚反应的乙二醇溶剂中各个对苯二甲酸盐以饱和状态溶解，如下进行使用以对苯二甲酸盐饱和的乙二醇溶剂的废弃PET的解聚反应。
在200mL玻璃烧杯中投入对苯二甲酸4.15g（0.025mol）后，投入氢氧化钾（颗粒状）0.050mol、或氢氧化钠（颗粒状）0.050mol、或氢氧化钾0.025mol及氢氧化钠0.025mol，用乙二醇调节为约100mL。用铝箔盖住，边用加热搅拌器搅拌边在100℃下加热60分钟后，放冷，冷却至30℃以下。将这些溶液用滤纸(WATT MANN CO,.LTD.制grade50)进行过滤，作为以对苯二甲酸盐饱和的乙二醇溶剂。
关于各个该溶剂中包含的对苯二甲酸盐的浓度，对苯二甲酸二钾饱和溶液中为0.23M、对苯二甲酸二钠饱和溶液中为0.11M、对苯二甲酸1-钾4-钠饱和溶液中为0.20M。
在200mL的不锈钢制烧杯中投入废弃PET瓶破碎物12g后，投入以对苯二甲酸二钾饱和的乙二醇溶剂65g及氢氧化钾0.13mol、或以对苯二甲酸二钠饱和的乙二醇溶剂65g及氢氧化钠0.13mol、或以对苯二甲酸1-钾4-钠饱和的乙二醇溶剂65g及氢氧化钾0.066mol及氢氧化钠0.066mol，边用加热搅拌器强力搅拌，边在160℃下进行60分钟的加热处理。放冷，在内温为40℃以下后取出内容物。
将该内容物用滤纸过滤分成滤液和残渣后，测定各自的残渣重量和残渣中的对苯二甲酸的总量。由表8所示的结果可知，过滤后的残渣中的对苯二甲酸的总量按照氢氧化钾、氢氧化钾和氢氧化钠的混合物、氢氧化钠的顺序依次增加。
[表8]
用以对苯二甲酸盐饱和的乙二醇溶剂中的PET解聚中的对苯二甲酸的生成量差异
（4）含水溶剂中的废弃PET瓶破碎物的解聚反应
在200mL的不锈钢制烧杯中投入废弃PET瓶破碎物10g及乙二醇50g，进而，投入氢氧化钾（颗粒状）0.083mol、0.090mol或0.11mol，或投入34％氢氧化钾水溶液0.083mol、0.090mol或0.11mol。
接着，边用加热搅拌器强力搅拌，边在160℃下进行60分钟的加热处理。加入了34％氢氧化钾水溶液的解聚反应溶液的水分几乎完全蒸发，结果与添加了氢氧化钾（颗粒状）的解聚反应溶液的液量几乎相同。自然冷却，在内温为40℃以下后取出内容物。将该内容物用滤纸过滤分成滤液和残渣。这些残渣的对苯二甲酸盐含量如图3所示。
由图3所示的结果可知，投入氢氧化钾0.090mol或0.11mol时，含水溶剂中的解聚反应的对苯二甲酸盐的生成效率更为优异。
实施例7.乙二醇溶剂中的PTT的解聚
将PTT制棉（西川产业公司制，finesmooth、SOLOTEX棉补充用袋RC7954）13g、以及实施例6（3）中制备的以对苯二甲酸二钾饱和的乙二醇溶剂130g及氢氧化钾0.13mol、或以对苯二甲酸二钠饱和的溶液130g及氢氧化钠0.13mol、或对苯二甲酸1-钾4-钠饱和溶液130g及氢氧化钾0.066mol及氢氧化钠0.066mol投入到200mL的不锈钢制烧杯中，边用加热搅拌器强力搅拌，边在160℃下加热60分钟将其水解。放冷，在内温为40℃以下后取出内容物。将该内容物用滤纸（WATT MANN CO,.LTD.制、grade540）进行过滤分成滤液和残渣后，测定各自的残渣重量和残渣中的对苯二甲酸的总量。由表9所示的结果可知，过滤后的残渣中的对苯二甲酸的总量按照氢氧化钾、氢氧化钾和氢氧化钠的混合物、氢氧化钠的顺序增加。
[表9]
用以对苯二甲酸盐饱和的乙二醇溶剂中的PTT解聚中的对苯二甲酸的生成量差异
实施例8.乙二醇溶剂中的PBT的解聚
在200mL的不锈钢制烧杯中，加入PBT制汤匙〔从亚马逊公司购入PBT汤匙103TW白（RLVH001）〕的破碎物15g后，进而，投入实施例6（3）中制备的以对苯二甲酸二钾盐饱和的乙二醇溶剂75g及氢氧化钾0.15mol、或以对苯二甲酸二钠盐饱和的乙二醇溶剂75g及氢氧化钠0.15mol、或以对苯二甲酸1-钾2-钠盐饱和的乙二醇溶剂75g及氢氧化钾0.075mol及氢氧化钠0.075mol。
接着，边用加热搅拌器强力搅拌，边在160℃下加热120分钟将其水解。放冷，在内温为40℃以下后取出内容物。
将该内容物用滤纸过滤分成滤液和残渣后，测定各自的残渣重量和残渣中的对苯二甲酸的总量。由表10所示的结果可知，过滤后的残渣中的对苯二甲酸的总量按照氢氧化钾、氢氧化钾和氢氧化钠的混合物、氢氧化钠的顺序增加。
[表10]
用以对苯二甲酸盐饱和的乙二醇溶剂中的PBT解聚中的对苯二甲酸的生成量差异
实施例9.1-丁醇中的废弃PET解聚中的氢氧化钾和氢氧化钠的差异
与实施例1同样地研究了对苯二甲酸二钾盐和对苯二甲酸二钠盐在1-丁醇中的溶解度，结果分别为0.2mM和1.9mM。从而可知，与在乙二醇中的溶解不同的是，相对于1-丁醇极难溶解。
因此，使用新品1-丁醇的解聚反应用溶剂和已经进行过一次废弃PET的解聚反应的1-丁醇溶剂之间，由于对于在解聚反应所生成的对苯二甲酸盐的回收效率方面没有大的差异，因此在使用1-丁醇的以下实施例中，仅示出了使用新品1-丁醇的例子。
在200mL的不锈钢制烧杯中，投入废弃PET瓶破碎物13g和1‐丁醇80g后，投入氢氧化钾（颗粒状）0.14mol或氢氧化钠（颗粒状）0.14mol，边用加热搅拌器强力搅拌，边分别在100℃下进行60分钟或90分钟的加热处理。将这些溶液自然冷却，在内温为40℃以下后，用滤纸（WATT MANN CO,.LTD.公司制grade540）过滤分成滤液和残渣。将残渣在漏斗上用甲醇50 mL清洗后，使用真空干燥机（AS ONE Corporation制）干燥至60℃下的重量减少低于0.1g／小时。残渣重量和残渣中的对苯二甲酸含量如表11所示。如表11所示，可知与氢氧化钠相比，使用氢氧化钾时，对苯二甲酸盐的生成效率也优异。
[表11]
1-丁醇溶剂中的PET解聚中的由碱金属氢氧化物所致的对苯二甲酸的生成量差异
实施例10.1-丁醇中的PTT解聚中的氢氧化钾和氢氧化钠的差异
在200mL的不锈钢制烧杯中，投入PTT制棉（西川产业公司制、finesmooth、SOLOTEX棉补充用袋RC7954）13g及1-丁醇130g后，投入氢氧化钾（颗粒状）0.13mol、或氢氧化钠（颗粒状）0.13mol。边用加热搅拌器强力搅拌，对于氢氧化钾的情况边在100℃下进行90分钟的加热处理，以及对于氢氧化钠的情况边在100℃下进行120分钟的加热处理。
加热处理后，自然冷却，在内温为40℃以下后取出内容物。将该内容物用滤纸（WATT MANN CO,.LTD.制、grade540）过滤分成滤液和残渣后，测定各自的残渣重量和残渣中的对苯二甲酸的总量。
由表12所示的结果可知，与氢氧化钠相比，使用氢氧化钾时，虽然加热时间短，但残渣中的对苯二甲酸的总量更多。
[表12]
在1-丁醇溶剂中的PTT解聚中的由碱金属氢氧化物所致的对苯二甲酸的生成量差异
实施例11.1-丁醇中的PBT解聚中的氢氧化钾和氢氧化钠的差异
在200mL的不锈钢制烧杯中，加入实施例7中制备的废弃PBT制汤匙的破碎物15g及1‐丁醇75g后，投入氢氧化钾（颗粒状）0.15mol、或氢氧化钠（颗粒状）0.15mol，边用加热搅拌器强力搅拌，边在100℃下进行240分钟的加热处理，然后自然冷却，在内温为40℃以下后取出内容物。
将该内容物用滤纸过滤分成滤液和残渣后，测定各自的残渣重量和残渣中的对苯二甲酸的总量。
如表13所示，与氢氧化钠相比，使用氢氧化钾时，残渣中的对苯二甲酸的总量更多。
[表13]
1-丁醇溶剂中的PBT解聚中的由碱金属氢氧化物所致的对苯二甲酸的生成量差异
实施例12.由含有乙二醇的对苯二甲酸盐生产TPA-DHD时的乙二醇的分解
作为具有乙二醇分解能力的TPA-DHD生产菌，通过转化法将参考例3中构建的pUXPEaLT_tpaA_tpaK_Pm_fucO_I7L_aldA导入到大肠杆菌K-12M7032株中，构建了大肠杆菌M7032(pUXPEaLT_tpaA_tpaK_Pm_fucO_I7L_aldA)株。
接着，与实施例1同样地，在小型发酵罐中培养大肠杆菌M7032(pUXPEaLT_tpaA_tpaK_Pm_fucO_I7L_aldA)株和作为对照的大肠杆菌K-12M7032株。在投入作为原料的对苯二甲酸二钾盐的同时，投入乙二醇0.278ml（终浓度72mM）。
在主培养开始起48小时后采集样品。将各样品供于利用LC-TOF型质谱仪（Waters公司，LCT Premier XE）进行的表1所示条件的分析。对苯二甲酸的鉴定通过与对苯二甲酸标准品比较，对上高速液相色谱的保持时间和由质谱仪获得的精密质量值而进行。TPA-DHD是由随着对苯二甲酸的减少而出现的物质中基于TPA-DHD的予想精密质量值而鉴定的。此外，TPA-DHD的定量是基于由对苯二甲酸的减少量和TPA-DHD的峰面积的增加而制作的标准曲线进行的。
其结果是，观察到TPA-DHD随着对苯二甲酸减少而增加。关于培养48小时后的TPA-DHD生产量，大肠杆菌M7032(pUXPEaLT_tpaA_tpaK_Pm_fucO_I7L_aldA)株和大肠杆菌K-12M7032株的培养48时间后的TPA-DHD生产量分别为10.5g/L、11.1g/L。此外，随之观察到TPA-DHD的增加。
接着，使用气相色谱（GC）质谱仪（GC：安捷伦公司7890A、质谱仪：安捷伦公司5975C）按照表14所示的条件对培养48小时后的培养液中的乙二醇量进行分析。乙二醇的鉴定是与乙二醇标准品进行比较、对上气相色谱的保持时间的测定和将来自质谱仪的m/z62作为靶离子的测定而鉴定的。其结果可知，大肠杆菌M7032(pUXPEaLT_tpaA_tpaK_Pm_fucO_I7L_aldA)株和大肠杆菌M7032株的培养48小时后的乙二醇的浓度分别为37.1mM、0.0mM，可知通过使乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量增强，可以将对苯二甲酸盐中包含的乙二醇分解。
[表14]
气相色谱质谱仪的分析条件
实施例13.由通过PET解聚获得的对苯二甲酸盐生产原儿茶酸
使用参考例2中构建的原儿茶酸生产大肠杆菌株M7032(pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK)，与实施例2同样制备该原儿茶酸生产菌的前培养液后，仅将2%量的该前培养液接种在主培养培养基中，进行主培养。菌体浊度在吸光度600nm下为约7时，添加诱导剂间甲基苯甲酸至终浓度为1mM，使其表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶蛋白质、对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质,对苯二甲酸二羟基二醇脱氢酶蛋白质、及对苯二甲酸转运蛋白。经时测定葡萄糖浓度，在葡萄糖浓度达到0时，将实施例6中制作的源自PET的对苯二甲酸盐溶解为0.6M，与葡萄糖混合，投入到培养装置中。
从主培养开始起52小时后采集样品。将各样品供于利用LC-TOF型质谱仪（Waters公司，LCT Premier XE）进行的分析。对苯二甲酸及原儿茶酸的鉴定通过与对苯二甲酸及原儿茶酸的标准品进行比较，对上高速液相色谱的保持时间和由质谱仪获得的精密质量值而进行。
其结果是，观察到原儿茶酸随着对苯二甲酸的减少而增加。将培养52小时后的来自各对苯二甲酸盐的原儿茶酸生产量作为100%的比率示于表15中。由表15所示的结果可知，2种对苯二甲酸钾盐的原儿茶酸的生产性均比对苯二甲酸二钠盐优异。
[表15]
由通过PET解聚获得的对苯二甲酸盐生产原儿茶酸
实施例14.由通过PTT的解聚获得的对苯二甲酸盐生产TPA-DHD
使用参考例2中构建的TPA-DHD生产重组大肠杆菌株M7032(pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK)，与实施例2同样制备该TPA-DHD生产菌的前培养液后，仅将2%量的该前培养液接种在主培养培养基中，进行主培养。菌体浊度在吸光度600nm下为约7时，添加诱导剂间甲基苯甲酸至终浓度为1mM，使其表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶蛋白质、对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质、及对苯二甲酸转运蛋白。经时测定葡萄糖浓度，在葡萄糖浓度达到0时，将实施例7中制作的源自PTT的对苯二甲酸盐溶解为0.6M，与葡萄糖混合，投入到培养装置中。
在主培养开始起48小时后采集样品。将各样品供于利用LC-TOF型质谱仪（Waters公司，LCT Premier XE）进行的表1所示条件的分析。对苯二甲酸的鉴定通过与对苯二甲酸标准品比较，对上高速液相色谱的保持时间和由质谱仪获得的精密质量值而进行。TPA-DHD是由随着对苯二甲酸的减少而出现的物质中基于TPA-DHD的予想精密质量值而鉴定的。此外，TPA-DHD的定量是基于由对苯二甲酸的减少量和TPA-DHD的峰面积的增加制作的标准曲线进行的。
其结果是，观察到TPA-DHD随着对苯二甲酸减少而增加。将培养48小时后的来自各对苯二甲酸盐的TPA-DHD生产量作为100%的比率示于表16。由表16所示的结果可知，2种对苯二甲酸钾盐的TPA-DHD的生产性均比对苯二甲酸二钠盐优异。
[表16]
由通过PTT解聚获得的对苯二甲酸盐生产TPA-DHD
实施例15.由通过PTT的解聚获得的对苯二甲酸盐生产原儿茶酸
使用参考例2中构建的原儿茶酸生产大肠杆菌株M7032(pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK)，与实施例2同样制备该原儿茶酸生产菌的前培养液后，仅将2%量的该前培养液接种在主培养培养基中，进行主培养。菌体浊度在吸光度600nm下为约7时，添加诱导剂间甲基苯甲酸至终浓度为1mM，使其表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶蛋白质、对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质,对苯二甲酸二羟基二醇脱氢酶蛋白质、及对苯二甲酸转运蛋白。经时测定葡萄糖浓度，在葡萄糖浓度达到0时，将实施例8中制作的源自PBT的对苯二甲酸盐溶解为0.6M，与葡萄糖混合，投入到培养装置中。
在主培养开始起48小时后采集样品。将各样品供于利用LC-TOF型质谱仪（Waters公司，LCT Premier XE）进行的分析。对苯二甲酸及原儿茶酸的鉴定通过与对苯二甲酸及原儿茶酸的标准品进行比较，对上高速液相色谱的保持时间和由质谱仪获得的精密质量值而进行。
其结果是，观察到原儿茶酸随着对苯二甲酸的减少而增加。将培养48小时后的来自各对苯二甲酸盐的原儿茶酸生产量作为100%的比率示于表17中。由表17所示的结果可知，2种对苯二甲酸钾盐的原儿茶酸的生产性均比对苯二甲酸二钠盐优异。
[表17]
由通过PBT解聚获得的对苯二甲酸盐生产原儿茶酸
实施例16.由通过1-丁醇溶剂中的PET解聚获得的对苯二甲酸盐生产TPA-DHD
使用参考例2中构建的TPA-DHD生产重组大肠杆菌株M7032(pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK)，与实施例2同样制备该TPA-DHD生产菌的前培养液后，仅将2%量的该前培养液接种在主培养培养基中，进行主培养。菌体浊度在吸光度600nm下为约7时，添加诱导剂间甲基苯甲酸至终浓度为1mM，使其表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶蛋白质、对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质、及对苯二甲酸转运蛋白。经时测定葡萄糖浓度，在葡萄糖浓度达到0时，将实施例9中制作的在1-丁醇中的解聚获得的源自PET的对苯二甲酸盐溶解为0.6M，与葡萄糖混合，投入到培养装置中。
从主培养开始起35小时后采集样品。将各样品供于利用LC-TOF型质谱仪（Waters公司，LCT Premier XE）进行的表1所示条件的分析。对苯二甲酸的鉴定通过与对苯二甲酸标准品比较，对上高速液相色谱的保持时间和由质谱仪获得的精密质量值而进行。TPA-DHD是由随着对苯二甲酸的减少而出现的物质中基于TPA-DHD的予想精密质量值而鉴定的。此外，TPA-DHD的定量是基于由对苯二甲酸的减少量和TPA-DHD的峰面积的增加制作的标准曲线进行的。
其结果是，观察到TPA-DHD随着对苯二甲酸减少而增加。将培养35小时后的来自各对苯二甲酸盐的TPA-DHD生产量作为100%的比率示于表18中。由表18所示的结果可知，2种对苯二甲酸钾盐的TPA-DHD的生产性均比对苯二甲酸二钠盐优异。
[表18]
由通过1-丁醇中的PET解聚获得的对苯二甲酸盐生产TPA-DHD
参考例1.表达载体pUXPEaLT19的构建
为了使用大肠杆菌进行不依赖于基因的转录翻译效率的高效率表达，构建了使目标基因的转录依赖于疑似基因、在维持疑似基因的翻译效率的状态下目标基因也被翻译的表达体系。更具体而言，在pUC19（宝生物公司制）中插入终止子序列，从而合成了序列号13～18所示的6条合成DNA。
将这些合成DNA插入pUC19的KpnI位点和EcoRI位点之间，构建质粒pUC1LT1。接着，构建将pUC1LT1的PvuII位点和HindIII位点之间删除的pULTDL1。在pULTDL1中插入用于连接T7启动子序列、疑似基因及目标基因的PacI位点，从而合成了序列号19～24所示的6条合成DNA。将这些合成DNA插入pULTDL1的SphI位点和SalI位点之间，构成表达质粒pUTPELT19。接着，通过使用PrimeSTAR DNA聚合酶（宝生物制；以下如无特别声明，则PCR反应中所用的DNA扩增酶使用该酶。）的PCR法构建将pUTPELT19的BglII位点和PacI位点之间置换为序列号25所示的序列的表达质粒pUTPEaLT19。
进而，为了构建利用了XylS-Pm启动子的诱导表达体系，获取XylS-Pm启动子区域的DNA。XylS-Pm启动子区域是以由国立遗传学研究所获得的质粒pJB866为模板、通过使用2种DNA引物（序列号26和27）的PCR反应进行扩增而获得的。利用Taq DNA聚合酶在扩增DNA片段的3’末端连接A残基后，将该扩增DNA片段通过凝胶电泳法进行精制，重组到pT7Blue-T载体（Novagen公司制）中，从而构建了保持了XylS-Pm启动子的完整区域的质粒pT7-xylS_Pm。
通过限制酶SbfI和限制酶BamHI从质粒pT7-xylS_Pm切出XylS-Pm启动子的区域，重组到pUTPEaLT19的SbfI位点和BglII位点之间，从而构建了表达载体pUXPEaLT19。
参考例2.原儿茶酸生产质粒的构建
（1）从自然界中分离睾丸酮丛毛单胞菌72W2株
睾丸酮丛毛单胞菌72W2株是由东京都板桥区收集的土壤中获得的以对苯二甲酸为唯一碳源进行生育的菌株。
具体而言，将收集的土壤试样加入到装入15ml Falcon管中的含有10mM对苯二甲酸的W液体培养基5ml中后，30℃下进行振荡培养。予以说明，W液体培养基的组成为：磷酸二氢钾0.85g/L、磷酸氢二钠4.9g/L、硫酸铵0.5g/L、硫酸镁七水合物9.5mg/L、硫酸铁（II）七水合物9.5mg/L、氧化镁10.75mg/L,碳酸钙2mg/L、硫酸锌七水合物4.5mg/ml、硫酸锰(II)四水合物1.12mg/L、硫酸铜(II)五水合物0.25mg/L、硫酸钴(II)七水合物0.28g/L、硼酸0.06mg/L。
将培养液涂布在含有10mM对苯二甲酸的W液体培养基的琼脂平板，30℃下培养，由此选择出以对苯二甲酸作为唯一碳源进行生育的菌株。将琼脂平板上的菌落用含有10mM对苯二甲酸的W液体培养基5ml培养3天。通过测定该菌株的16S rDNA序列，鉴定该菌株为睾丸酮丛毛单胞菌，命名为72W2株。
（2）由睾丸酮丛毛单胞菌72W2株分离基因
培养睾丸酮丛毛单胞菌72W2株，收集菌体后，使用illustra bacteriagenomicPrep Mini Spin Kit（由通用电气医疗日本株式会社购入）提取基因组DNA。
然后，从美国国立生物技术信息中心（以下简记为NCBI）的GB数据库中，获得GB登录号AY923836的睾丸酮丛毛单胞菌YZW-D株的编码对苯二甲酸代谢基因群的操纵子的碱基序列。此外，从NCBI的GB数据库获得丛毛单胞菌属E6株具有的编码对苯二甲酸代谢基因群的2个操纵子的碱基序列。具体而言，关于睾丸酮丛毛单胞菌YZW-D株，使用GB登录号AY923836中的碱基序号8242～11908作为对苯二甲酸代谢基因群的操纵子的碱基序列。丛毛单胞菌属细菌E6株由于具有2个对苯二甲酸代谢基因群的操纵子，因此分别使用GB登录号AB238678.1中的碱基序号3260～6926和GB登录号AB238679.1中的碱基序号4911～8577作为对苯二甲酸代谢基因群的操纵子的碱基序列。
为了以这些序列为基础克隆睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的编码对苯二甲酸代谢基因群的DNA，设计了简并引物。该简并引物中，5’引物(序列号28)上连接有PacI识别位点，3’引物(序列号29)上连接有SgfI识别位点和NotI识别位点。
使用上述2种简并引物，以睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增对苯二甲酸代谢基因群（tphA2基因-tphA3基因-tphB基因-tphA1基因；以下简记为tphA2A3BA1基因）的操纵子区域。使用QIAquickPCR精制试剂盒（凯杰公司制；以下如果没有特别声明则PCR精制试剂盒均使用该试剂盒。）回收扩增DNA片段。测定了该扩增DNA片段的碱基序列，结果确认了该DNA编码：编码对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白的tphA2基因（序列号1）、编码对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白的tphA3基因（序列号3）、编码TPA-DHD脱氢酶蛋白质的tphB基因（序列号9）、编码对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质的tphA1基因（序列号5）。
利用限制酶PacI和限制酶NotI从PCR产物切出tphA2A3BA1基因的操纵子（序列号30），重组到参考例1所述的表达载体pUXPEaLT19的PacI位点和NotI位点之间，从而构建了表达由对苯二甲酸转变为原儿茶酸的相关酶群的质粒pUXPEaLT_tphA2A3BA1。
（4）对苯二甲酸转运体的克隆和原儿茶酸生产质粒的构建
由于已知大肠杆菌K-12株的对苯二甲酸摄取能力弱，因此尝试通过表达用于促进对苯二甲酸的摄取的对苯二甲酸转运体，来强化对苯二甲酸摄取能力。
具体而言，获得了具有促进由对苯二甲酸向菌体内的对苯二甲酸的摄取效果的红球菌jostiiRHA1株的编码对苯二甲酸转运体tpaK的DNA。关于tpaK基因的碱基序列，从NCBI的GB数据库获得了登录号CP000432中的碱基序号175046～176425的序列（序列号7）。以从长冈技术科学大学福田雅夫教授获得的红球菌jostiiRHA1株的染色体DNA（100ng）为模板，使用2种DNA引物（序列号31和序列号32），通过PCR反应扩增编码对苯二甲酸转运蛋白（序列号8）的tpaK基因的完整区域。
使用PCR精制试剂盒回收扩增DNA片段。利用限制酶PacI和限制酶NotI从PCR产物切出tpaK基因，重组到上述质粒pUXPEaLT_tphA2A3BA1的SgfI位点和NotI位点之间，从而构建了原儿茶酸生产质粒pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK。
参考例3.TPA-DHD生产质粒的构建
以参考例2（4）中构建的pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK（100ng）为模板，使用2种DNA引物（序列号28和序列号33）通过PCR反应扩增tphA2基因-tphA3基因区域。此外，使用2种DNA引物（序列号29和序列号34）通过PCR反应扩增tphA1基因区域。使用PCR精制试剂盒回收这些扩增DNA片段。接着，以回收的tphA2基因-tphA3基因区域的扩增片段和tphA1基因扩增片段为模板，使用2种DNA引物（序列号28和序列号29），通过PCR反应扩增tphA2-tphA3-tphA1基因区域。使用PCR精制试剂盒回收扩增DNA片段。将扩增片段通过限制酶PacI和限制酶HindIII消化后，重组到参考例2（3）中构建的表达载体pUXPEaLT_tphA2A3BA1的PacI位点和HindIII位点之间，从而构建了pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK。
参考例4,没食子酸生产质粒的构建
为了更高效地将原儿茶酸变换为没食子酸，如下构建了使对羟基苯甲酸羟化酶基因随着原儿茶酸生产基因群一起表达的质粒。具体而言，以公开专利公报（公开号：日本特开2009-213392）中公开的编码对羟基苯甲酸羟化酶（序列号12）的DNA（序列号11）为模板，使用2种DNA引物（序列号35和序列号36），通过PCR反应扩增编码对羟基苯甲酸羟化酶蛋白质的DNA。使用PCR精制试剂盒回收扩增DNA片段。将该DNA利用限制酶PacI和限制酶SgfI消化后，重组到上述构建的pUXPEaLT_tphA2A3BA1_tpaK的PacI位点，从而构建了没食子酸生产质粒pUXPEaLT_HFM145_tphA2A3BA1_tpaK。
参考例5.乙二醇分解菌的构建
（1）大肠杆菌K-12株的fucO基因的克隆
从NCBI通过网络途径获得的碱基序列（GB登录号U29581）的第13420～14571位的序列，作为源自大肠杆菌K-12MG1655株的编码乳醛还原酶蛋白质的fucO基因的碱基序列。使用基于该序列合成的2种DNA引物（序列号37序列号38），以由NBRP获得的大肠杆菌K-12MG1655株的染色体DNA（100ng）为模板，通过PCR反应扩增fucO基因的完整区域。利用限制酶PacI位点和限制酶NotI从PCR产物切出该扩增DNA片段，重组到参考例1中构建的表达载体pUXPEaLT19中，从而构建了质粒pUXPEaLT_fucO_I7L。
（2）大肠杆菌K-12株的aldA基因的克隆
从NCBI通过网络途径获得的碱基序列（GB登录号U00096.2）的第1486256～1487695位的序列，作为编码源自大肠杆菌K-12MG1655株的乳醛脱氢酶蛋白质的aldA基因的碱基序列。使用基于该序列合成的2种DNA引物（序列号39和序列号40），以大肠杆菌K-12MG1655株的染色体DNA（100ng）为模板，通过PCR反应扩增aldA基因的完整区域。利用限制酶SwaI和限制酶NotI从PCR产物切出该扩增DNA片段，重组到质粒pUXPEaLT_fucO_I7L中，从而构建了质粒pUXPEaLT_fucO_I7L_aldA。
利用限制酶NotI和限制酶AscI从具有序列号41所示的序列的合成DNA中将其切出，重组到质粒pUEPEaLT_fucO_I7L_aldA的NotI位点和AscI位点之间，从而构建了质粒pUXPEaLTEk_fucO_I7L_aldA。
接着，由质粒pUXPEaLTEX_fucO_I7L_aldA使用2种DNA引物（序列号42和序列号43）通过PCR反应扩增包含fucO基因和aldA基因的表达单元（以下简记为fucO-aldA表达单元）。利用限制酶AscI位点从PCR产物切出后，重组到上述（参考例3）中构建的表达载体pUXPEaLT_tphA2A3A1_tpaK中，从而构建了质粒pUXPEaLT_tpaA_tpaK_PmfucO_I7L_aldA。
产业上的利用可能性
根据本发明，可以提供以对苯二甲酸钾盐为原料、使用表达对苯二甲酸1,2-双加氧酶的微生物制造对苯二甲酸-1,2-顺式-二羟基二醇的方法，进而提供将TPA-DHD转变为原儿茶酸、没食子酸等酚酸的方法、以及通过废弃聚酯的解聚获得作为原料的对苯二甲酸钾盐的方法。
序列表的说明
序列号1：编码对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白的DNA
序列号2：对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶大亚基蛋白
序列号3：编码对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白的DNA
序列号4：对苯二甲酸1,2-双加氧酶加氧酶小亚基蛋白
序列号5：编码对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质的DNA
序列号6：对苯二甲酸1,2-双加氧酶还原酶蛋白质
序列号7：编码对苯二甲酸转运蛋白的DNA
序列号8：对苯二甲酸转运蛋白
序列号9：编码TPA-DHD脱氢酶蛋白质的DNA
序列号10：TPA-DHD脱氢酶蛋白质
序列号11：编码对羟基苯甲酸羟化酶蛋白质的DNA
序列号12：对羟基苯甲酸羟化酶蛋白质
序列号13：终止子构建用合成DNA
序列号14：终止子构建用合成DNA
序列号15：终止子构建用合成DNA
序列号16：终止子构建用合成DNA
序列号17：终止子构建用合成DNA
序列号18：终止子构建用合成DNA
序列号19：T7启动子和疑似基因的构建用合成DNA
序列号20：T7启动子和疑似基因的构建用合成DNA
序列号21：T7启动子和疑似基因的构建用合成DNA
序列号22：T7启动子和疑似基因的构建用合成DNA
序列号23：T7启动子和疑似基因的构建用合成DNA
序列号24：T7启动子和疑似基因的构建用合成DNA
序列号25：质粒pUTPELT19的限制酶BglII位点和限酶PacI位点之间的序列
序列号26：XylS-Pm启动子区域的DNA的获取用PCR引物
序列号27：XylS-Pm启动子区域的DNA的获取用PCR引物
序列号28：睾丸酮丛毛单胞菌的对苯二甲酸代谢基因群的克隆用简并PCR引物
序列号29：睾丸酮丛毛单胞菌的对苯二甲酸代谢基因群的克隆用简并PCR引物
序列号30：睾丸酮丛毛单胞菌72W2株的编码对苯二甲酸代谢基因群的DNA
序列号31：对苯二甲酸转运体克隆用PCR引物
序列号32：对苯二甲酸转运体克隆用PCR引物
序列号33：tphA2基因-tphA3基因区域克隆用PCR引物
序列号34：tphA1基因区域克隆用PCR引物
序列号35：改良型对羟基苯甲酸羟化酶克隆用PCR引物
序列号36：改良型对羟基苯甲酸羟化酶克隆用PCR引物
序列号37：大肠杆菌乳醛还原酶克隆用PCR引物
序列号38：大肠杆菌乳醛还原酶克隆用PCR引物
序列号39：大肠杆菌乳醛脱氢酶克隆用PCR引物
序列号40：大肠杆菌乳醛脱氢酶克隆用PCR引物
序列号41：质粒pUXPEaLTEk_fucO_I7L_aldA的NotI位点和AscI位点之间的序列
序列号42：包含fucO基因和aldA基因的表达单元克隆用PCR引物
序列号43：包含fucO基因和aldA基因的表达单元克隆用PCR引物
Claims (24)
1.一种对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，使具有以下的（a）、（b）、（c）或（d）所示的DNA、以下的（e）、（f）、（g）或（h）所示的DNA、以及以下的（i）、（j）、（k）或（l）所示的DNA且具有由对苯二甲酸生产对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的能力的微生物或该培养物的处理物，在包含对苯二甲酸盐的水性介质中与对苯二甲酸反应，生成对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇，前述对苯二甲酸盐相对于对苯二甲酸盐中包含的全部对苯二甲酸以摩尔比换算含有0.5倍量以上且2倍量以下的钾，
（a）编码包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA；
（b）包含在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1个或多个氨基酸而成的序列且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA；
（c）包含序列号1所示的碱基序列的DNA；
（d）与包含和序列号1所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA；
（e）编码包含序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA；
（f）包含在序列号4所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1个或多个氨基酸而成的序列且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA；
（g）包含序列号3所示的碱基序列的DNA；
（h）与包含和序列号3所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA；
（i）编码包含序列号6所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA；
（j）包含在序列号6所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1个或多个氨基酸而成的序列且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA；
（k）包含序列号5所示的碱基序列的DNA；
（l）与包含和序列号5所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有由对苯二甲酸向对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变的相关功能的蛋白质的DNA。
2.根据权利要求1所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，前述包含对苯二甲酸盐的水性介质为包含选自由对苯二甲酸二钾盐、对苯二甲酸1-钾4-钠盐、对苯二甲酸1-钾4-铵盐组成的组中的1种以上对苯二甲酸钾盐的水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，前述对苯二甲酸盐以水溶液的形态、粉末的形态或悬浊液的形态添加在前述微生物、或该培养物的处理物中，使前述微生物或处理物与对苯二甲酸反应。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，权利要求1所述的微生物为进一步通过导入下述（m）、（n）、（o）或（p）所示的DNA从而增强对苯二甲酸的细胞内输送能力的微生物，
（m）编码包含序列号8所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA；
（n）包含在序列号8所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1个或多个氨基酸而成的序列且编码具有对苯二甲酸转运体活性的蛋白质的DNA；
（o）包含序列号7所示的碱基序列的DNA；
（p）与包含和序列号7所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有对苯二甲酸转运体活性的蛋白质的DNA。
5.一种原儿茶酸的制造方法，其特征在于，通过权利要求1～4中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇、进而将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸，前述微生物为进一步具有以下的（q）、（r）、（s）或（t）所示的DNA、具有由对苯二甲酸生产原儿茶酸的能力的微生物，
（q）编码包含序列号10所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA；
（r）包含在序列号10所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1个或多个氨基酸而成的序列且编码具有将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸的活性的蛋白质的DNA；
（s）包含序列号9所示的碱基序列的DNA；
（t）与包含和序列号9所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸的活性的蛋白质的DNA。
6.一种原儿茶酸的制造方法，其特征在于，在通过权利要求1～4中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇后，使用通过转化法导入有前述（q）、（r）、（s）或（t）所示的DNA而获得的微生物或该培养物的处理物将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸。
7.一种没食子酸的制造方法，其特征在于，通过权利要求1～4中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇，进而，将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为没食子酸，前述微生物为进一步具有上述（q）、（r）、（s）或（t）所示的DNA及（u）、（v）、（w）或（x）所示的DNA、具有由对苯二甲酸生产没食子酸的能力的微生物，
（q）编码包含序列号10所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA；
（r）包含在序列号10所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1个或多个氨基酸而成的序列且编码具有将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸的活性的蛋白质的DNA；
（s）包含序列号9所示的碱基序列的DNA；
（t）与包含和序列号9所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为原儿茶酸的活性的蛋白质的DNA；
（u）编码包含序列号12所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA；
（v）包含在序列号12所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1个或多个氨基酸而成的序列且编码具有将原儿茶酸转变为没食子酸的活性的蛋白质的DNA；
（w）包含序列号11所示的碱基序列的DNA；
（x）与包含序列号11所示的碱基序列的全部或一部分序列互补的序列的DNA在严格条件下杂交且编码具有将原儿茶酸转变为没食子酸的活性的蛋白质的DNA。
8.一种没食子酸的制造方法，其特征在于，在通过权利要求1～4中任一项所述的方法由对苯二甲酸盐生成对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇后，使用通过转化法导入有前述（q）、（r）、（s）或（t）所示的DNA以及前述的（u）、（v）、（w）或（x）所示的DNA而获得的微生物或该培养物的处理物，将对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇转变为没食子酸。
9.根据权利要求1～4中任一项所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序（A）～（D）获得前述对苯二甲酸盐的工序，
（A）通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的乙二醇反应溶剂、或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的乙二醇反应溶剂中在100～196℃之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、
（B）从工序（A）中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、
（C）从实施了工序（B）的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、
（D）对通过工序（C）回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理，从而减少该固态物中的二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
10.根据权利要求9所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，回收前述工序（C）中通过固液分离法回收固态物后的乙二醇反应溶剂，将该溶剂作为前述（A）中的乙二醇反应溶剂使用。
11.根据权利要求5或6所述的原儿茶酸的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序（A）～（D）获得前述对苯二甲酸盐的工序，
（A）通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的乙二醇反应溶剂、或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的乙二醇反应溶剂中在100～196℃之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、
（B）从工序（A）中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、
（C）从实施了工序（B）的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、
（D）对通过工序（C）回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理，从而减少该固态物中的二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
12.根据权利要求11所述的原儿茶酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序（C）中通过固液分离法回收固态物后的乙二醇反应溶剂，将该溶剂作为前述（A）中的乙二醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
13.根据权利要求7或8所述的没食子酸的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序（A）～（D）获得前述对苯二甲酸盐的工序，
（A）通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的乙二醇反应溶剂、或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的乙二醇反应溶剂中在100～196℃之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、
（B）从工序（A）中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、
（C）从实施了工序（B）的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、
（D）对通过工序（C）回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理，从而减少该固态物中的二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
14.根据权利要求13所述的没食子酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序（C）中通过固液分离法回收固态物后的乙二醇反应溶剂，将该溶剂作为前述（A）中的乙二醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
15.根据权利要求9或10所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其中，前述权利要求1或4所述的微生物为通过增强乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而将混入前述工序（A）～（D）所获得的对苯二甲酸盐中的乙二醇分解的微生物。
16.根据权利要求11或12所述的原儿茶酸的制造方法，其中，前述权利要求5所述的微生物为通过增强乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而将混入前述工序（A）～（D）所获得的对苯二甲酸盐中的乙二醇分解的微生物。
17.根据权利要求13或14所述的没食子酸的制造方法，其中，前述权利要求7所述的微生物为通过增强乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的表达量从而将混入前述工序（A）～（D）所获得的对苯二甲酸盐中的乙二醇分解的微生物。
18.根据权利要求1～4中任一项所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序（E）～（H）获得前述对苯二甲酸盐的工序，
（E）通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的1-丁醇反应溶剂或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的1-丁醇反应溶剂中在100～116℃之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、
（F）从工序（E）中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、
（G）从实施了工序（F）的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、
（H）对通过工序（G）回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理，从而减少该固态物中的1-丁醇及二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
19.根据权利要求18所述的对苯二甲酸1,2-顺式-二羟基二醇的制造方法，其特征在于，回收前述工序（G）中通过固液分离法回收固态物后的1-丁醇反应溶剂，将该溶剂作为前述工序（E）中的1-丁醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
20.根据权利要求5或6所述的原儿茶酸的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序（E）～（H）获得前述对苯二甲酸盐的工序，
（E）通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的1-丁醇反应溶剂或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的1-丁醇反应溶剂中在100～116℃之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、
（F）从工序（E）中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、
（G）从实施了工序（F）的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、
（H）对通过工序（G）回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理，从而减少该固态物中的1-丁醇及二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
21.根据权利要求20所述的原儿茶酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序（G）中通过固液分离法回收固态物后的1-丁醇反应溶剂，将该溶剂作为前述工序（E）中的1-丁醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
22.根据权利要求7或8所述的没食子酸的制造方法，其中，进一步包含通过下述工序（E）～（H）获得前述对苯二甲酸盐的工序，
（E）通过将以聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯作为主成分、包含异物成分的聚酯废弃物在含有氢氧化钾的1-丁醇反应溶剂或含有氢氧化钾及氢氧化钠两者的1-丁醇反应溶剂中在100～116℃之间加热10分钟以上，将反应液中的水分蒸发并将该废弃物中包含的聚对苯二甲酸丙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯解聚的工序、
（F）从工序（E）中获得的该废弃物的解聚反应溶液中包含的固态异物中，通过浮游分选法去除漂浮在该溶液中的固态异物的工序、
（G）从实施了工序（F）的处理的该溶液中，通过固液分离法回收浮游固态异物以外的该溶液中的固态物的工序、
（H）对通过工序（G）回收的固态物实施加热干燥处理、减压干燥处理或离心分离处理，从而减少该固态物中的1-丁醇及二醇类的含量、获得残存的固态物即对苯二甲酸盐的工序。
23.根据权利要求22所述的没食子酸的制造方法，其特征在于，回收前述工序（G）中通过固液分离法回收固态物后的1-丁醇反应溶剂，将该溶剂作为前述工序（E）中的1-丁醇反应溶剂使用，由此使用不废弃乙二醇反应溶剂而将其反复利用获得的对苯二甲酸盐。
24.根据权利要求1～23中任一项所述的制造方法，其特征在于，前述微生物为大肠埃希氏杆菌。
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