JP7392928B2 - ２－ピロン－４，６－ジカルボン酸の製造方法 - Google Patents

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Description

本発明は、２－ピロン－４，６－ジカルボン酸（ＰＤＣ）を産生する微生物を培養することによりＰＤＣを製造する方法に関する。
植物主要成分であるリグニンは、芳香族高分子化合物として植物細胞壁に普遍的に含まれており、樹木では３０％、イネやトウモロコシ稈の１５％を占めるバイオマス資源である。その他にも植物は多様な芳香族化合物を構成成分として含んでいる。しかしリグニンを主成分とする植物由来の芳香族成分は化学構造が多様な成分で構成されている事や複雑な高分子構造を持つため有効な利用技術が開発されていない。従来の利用技術として挙げられるのは、リグニンを主成分とする植物由来の芳香族成分をアルカリ分解などの化学分解で生成する低分子芳香族分解物から、香料原料であるバニリンを分離製造する実用化技術がある。しかし、化学分解で生成するバニリン以外の多量の低分子芳香族物質の有効な利用方法はないのが現状である。そのため製紙工程で大量に生成するリグニンは有効利用される事無く重油の代替え品として燃焼されている。
今日の石油化学工業の発展を支えたのは、多様な化学成分の混合物である原油を触媒分解と分溜によってベンゼンやエチレンなどの単一な中間物質に一旦変換し、それらを原料に多様な機能性プラスチックスを製造するという原理である。この石油化学工業の発展を支えた基本原理は、化学構造の多様さや複雑な高分子構造を持つリグニンなど植物芳香族成分の利用技術においても適用可能な普遍的原理である。
これまでに、リグニン等の植物芳香族成分は、加水分解や酸化分解、可溶媒分解などの化学的分解法、超臨界水や超臨界有機溶媒による物理化学的分解法などにより、バニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸等を含む低分子混合物に変換されることが見出されており、更に、これら５種類の化合物が微生物Sphingobium sp. SYK-6によって完全に分解代謝され二酸化炭素と水に至ること、その代謝経路においてこれら５種類の化合物が単一の中間物質２－ピロン－４，６－ジカルボン酸を経由して分解されることが明らかとなっている（図１参照）。
２－ピロン－４，６－ジカルボン酸（以下、ＰＤＣと称する）は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂の原料のテレルタル酸（ＴＰＡ）と同様に分子内に２個のカルボキシル基を有し、典型的な重縮合素材で、石油化学にも例のない新しい特性が期待される物質である。
ＰＤＣの製造方法としては、ＰＤＣを発酵生産するための多段階反応プロセスを構成する４種類の酵素（ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ディメチラーゼ、プロトカテク酸４，５－ジオキシゲナーゼ、４－カルボキシ－２－ヒドロキシムコン酸－６－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードする遺伝子を保有する形質転換細胞を用いて、前記５種類の化合物からＰＤＣを製造する方法が報告されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１）。
特許文献１に記載の方法では、発酵液１Ｌ中にＰＤＣが１０～２０ｇ産生され、非特許文献１に記載の方法では、１５ｇ／ＬのＰＤＣが生産されることが開示されている。しかしながら、これらの収率では、高機能な高分子材料が得られても、最終産品が高価格となり産業競争力が低く、実用化には至っていない。
特許文献２は、ＰＤＣの精製方法を開示しており、当該文献の方法では、生成したＰＤＣに金属イオン（例えばナトリウムイオン）と複塩を形成させることで精製の効率化を図っている。
特許文献３には、ＰＤＣを製造するための組換えベクター及びそれを含む形質転換体の作製方法が開示されている。
特開２００５－２７８５４９号公報 特開２００８－０７９６０３号公報 特開２０１１－０６７１３９号公報
大塚他, 環境バイオテクノロジー学会誌, (2006), 6(2): 93-103
前述の特許文献１及び非特許文献１では、出発物質の溶解及びｐＨ調整に水酸化ナトリウムを使用し、培地成分としてもナトリウム塩を含んでおり、これらのナトリウムイオンが生成したＰＤＣと複塩を形成し、不溶化するものであるが、本発明者らはＰＤＣの複塩形成による不溶化を回避すればＰＤＣの生産効率を向上させることができるかについて鋭意検討した。
その結果として、本発明は、ＰＤＣと金属イオンとの複塩形成を防止することにより、ＰＤＣを発酵生産する微生物の高密度培養法を確立し、より高い収率でＰＤＣを製造する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、さらなる高収率でＰＤＣを製造するための、培地成分についての検討も含む。
本発明者らは、斯かる現状に鑑み鋭意検討した結果、ＰＤＣ産生において出発物質を溶解する緩衝液及びｐＨ調整用緩衝液として、アルカリ金属を含まない緩衝液を用いることにより、複塩の形成を防止し、微生物の高密度培養が可能となり、従って２－ピロン－４，６－ジカルボン酸を高い収率で製造できることを見出し、本発明を完成させた。
さらに、本発明者らは、微生物の培養に使用する培地に関しても、アルカリ金属を含まない本培養培地を使用することにより複塩形成を防止することに成功した。
すなわち、（１）本発明は、２－ピロン－４，６－ジカルボン酸（ＰＤＣ）を産生する微生物を培養することによりＰＤＣを製造する方法であって、
以下：
ＰＤＣの産生のための出発物質をアルカリ金属を含まない緩衝液に溶解すること、及び
アルカリ金属を含まない緩衝液で培養液のｐＨを調整すること、
を含む、方法を提供する。
（２）本発明は、前記ＰＤＣの産生のための出発物質をアルカリ金属を含まない緩衝液に溶解することが、前記出発物質を溶解したアルカリ金属を含まない緩衝液を含む培養液中で、前記微生物を培養すること、を含み、前記アルカリ金属を含まない緩衝液で培養液のｐＨを調整することが、培養中にｐＨが低下した場合に適宜アルカリ金属を含まない緩衝液で培養液のｐＨを調整すること、を含む、（１）に記載の方法を提供する。
（３）本発明は、前記アルカリ金属を含まない緩衝液が、アンモニウム系緩衝液である、（１）又は（２）に記載の方法を提供する。
（４）本発明は、前記アンモニウム系緩衝液が、アンモニア水である、（３）に記載の方法を提供する。
（５）本発明は、アミノ酸混合物を添加することをさらに含む、（１）から（４）のいずれか一つに記載の方法を提供する。
（６）本発明は、前記アミノ酸混合物として酵母エキスが利用される、（５）に記載の方法を提供する。
（７）本発明は、前記酵母エキスが、３ｇ／Ｌ以上の量で培養液に添加される、（６）に記載の方法を提供する。
（８）本発明は、炭素源を添加することをさらに含む、（１）から（７）のいずれか一つに記載の方法を提供する。
（９）本発明は、前記炭素源がグルコースである、（８）に記載の方法を提供する。
（１０）本発明は、前記添加が流下添加である、（８）又は（９）に記載の方法を提供する。
（１１）本発明は、二価金属イオンを添加することをさらに含む、（１）から（１０）のいずれか一つに記載の方法を提供する。
（１２）本発明は、前記二価金属イオンが、ＭｇＳＯ4・７Ｈ２Ｏ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ２Ｏ、ＭｇＯ、ＣａＣＯ3、ＺｎＳＯ4・７Ｈ２Ｏ、ＭｎＳＯ4・４Ｈ２Ｏ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、ＣｏＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及びＨ3ＢＯ3である、（１１）に記載の方法を提供する。
（１３）本発明は、出発物質を流下添加することを含む、（１）から（１２）のいずれか一つに記載の方法を提供する。
（１４）本発明は、前記微生物が、組換えベクターを含むシュードモナス（Pseudomonas）属細菌の形質転換体である、（１）から（１３）のいずれか一つに記載の方法を提供する。
（１５）本発明は、前記シュードモナス属細菌が、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）である、（１４）に記載の方法を提供する。
（１６）本発明は、前記出発物質が、バニリン酸又はバニリンであるか、あるいは、バニリン及び／又はバニリン酸を含む芳香族物質の混合物である、（１）から（１５）のいずれか一つに記載の方法を提供する。
（１７）本発明は、ＰＤＣが、培養液単位用量（Ｌ）あたり４０ｇ以上製造される、（１）から（１６）のいずれか一つに記載の方法を提供する。
（１８）本発明は、ＰＤＣが、培養液単位用量（Ｌ）あたり８０ｇ以上製造される、（１７）に記載の方法を提供する。
（１９）本発明は、ＰＤＣが、培養液単位用量（Ｌ）あたり１００ｇ以上製造される、（１８）に記載の方法を提供する。
本発明によれば、ＰＤＣとアルカリ金属イオンとの複塩形成を防止し、ＰＤＣを産生する微生物を高密度で培養することによりＰＤＣを安価かつ高収率で製造することができる。
図１は、Sphingobium sp. SYK-6株の低分子リグニン代謝経路と代謝酵素遺伝子を示す図である。 図２は、バニリン酸からのPDC産生（１）における、各値の経時的変化を示す図である。 図３は、バニリン酸からのPDC産生（１）における、TLCの結果を示す図である。 図４は、バニリン酸からのPDC産生（２）における、各値の経時的変化を示す図である。 図５は、バニリン酸からのPDC産生（２）における、TLCの結果を示す図である。 図６は、バニリンからのPDC産生における、各値の経時的変化を示す図である。 図７は、バニリンからのPDC産生における、TLCの結果を示す図である。
本発明は、２－ピロン－４，６－ジカルボン酸（ＰＤＣ）を産生する微生物を培養することによりＰＤＣを製造する方法であって、以下：ＰＤＣの産生のための出発物質をアルカリ金属を含まない緩衝液に溶解すること、及びアルカリ金属を含まない緩衝液で培養液のｐＨを調整すること、を含む、方法を提供する。
本発明の方法は、培養時にアルカリ金属を含まない緩衝液を使用することにより、ＰＤＣの複塩の形成を防止し、微生物の高密度培養（ＰＤＣ高生産）を可能にする。
本発明で用いられる出発物質については、後に詳述するが、例えばバニリン酸やバニリン等が挙げられる。これら出発物質は緩衝液に溶解させて溶液の状態で培養液に添加することが好ましい。本発明者らはこれまでの研究において、粉末の状態でバニリンを培養液に添加したところ、バニリンの残留、及びバニリン酸の蓄積がみられ、ＰＤＣはほとんど生成しないという結果を得ている。これは、バニリン粉末の添加直後に溶存酸素の急激な上昇がみられたことから、粉末でのバニリンの添加が微生物の生育に悪影響を与えたと考えられる。
培養液のｐＨは、微生物の好適な生育を可能とする範囲、例えばｐＨ４．０～１０．０の範囲に調整される必要がある。ＰＤＣは２個のカルボキシル基を有するため、ＰＤＣの産生に伴い培養液のｐＨが低下する。ｐＨ低下による微生物の生育の阻害を防ぎ、好適なｐＨを維持するために、適宜緩衝液で培養液のｐＨを調整する必要がある。培養液のｐＨは、ｐＨ６．０以上に制御されることが好ましく、ｐＨ６．５～７．５の範囲に制御されることがより好ましい。ｐＨ制御は、例えば、培養装置に備えられた制御機能により、培養液のｐＨの変動に応じた緩衝液の自動添加により行われてもよい。
本発明で出発物質の溶解及びｐＨ調整に使用される緩衝液には、ナトリウムなどのアルカリ金属を含まない緩衝液を使用する。また、培地成分中からも極力アルカリ金属を除外することが好ましく、本培養培地にはアルカリ金属を含まないことが好ましい。これは前述の通り、ＰＤＣとアルカリ金属との複塩の形成を防ぐためであり、例えば、出発物質をバニリン酸として、その中和溶解及びｐＨ調整にＮａＯＨを使用し、かつ本培養培地中にＮａ2ＨＰＯ4を含有した場合、培養液へのバニリン酸の添加量が２０ｇを超えたあたりから培養液中に沈殿が発生し、それ以降培地中にＰＤＣが蓄積されなくなることが本発明者らにより見出されている。この沈殿は、生成したＰＤＣがＮａと複塩を形成し、不溶化したものであることが示唆されている。また、同条件でｐＨ調整のみアンモニア水を使用した場合には、発酵終了後のＰＤＣ精製の過程で、培養液上清をＨＣｌでｐＨ１とした際に不溶性のＰＤＣ－Ｎａ塩と思われる沈殿が生成することがわかっている。従って、本発明における「アルカリ金属を含まない緩衝液」とは、当該緩衝液がＰＤＣの複塩を形成するようなレベルでアルカリ金属を含まないことを意味する。
本発明に使用されるアルカリ金属を含まない緩衝液としては、これらに限定されるものではないが、アンモニウム塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、トリシンなどが挙げられ、その中でもアンモニウム系緩衝液が好ましく、特に、アンモニア水が好ましい。
培養液の溶存酸素（ＤＯ）は、培養される微生物にとって適切な溶存酸素飽和度を維持する必要がある。好ましくは、ＤＯ≧15％sat.となるよう攪拌制御を行う。溶存酸素は、培養装置に備えられた制御機能によってモニタリング及び制御されてもよい。溶存酸素濃度は、微生物の対数増殖期にはグルコースなどの炭素源の消費によって低下し、その後培地中のグルコースが枯渇すると上昇することが認められている。
培養液の温度は、微生物の生育及びＰＤＣ産生を促進する温度に制御される。培養液の温度は、２０～４０℃、好ましくは２５～３０℃の範囲に制御され、２８℃に制御されることがより好ましい。
前述した培養におけるｐＨ調節、溶存酸素測定、通気、攪拌速度調節及び温度調節等は、それらの機能を備えた培養槽を用いることで行われてもよい。
微生物を培養するための培地又は培養液には、微生物が生育及び／又はＰＤＣ産生に利用する栄養源として、炭素源、窒素源、無機栄養源などを添加する必要がある。
本明細書における「培地」には、前培養培地と本培養培地とが含まれる。本明細書において、「前培養培地」とは、出発物質が添加されず、小スケールで微生物を増殖させるための培地を指し、「本培養培地」とは、前培養培地で微生物を増殖させた前培養液が添加され、出発物質が添加されることになる培地であって、微生物によるＰＤＣ産生が行われる培地を指す。
本発明では窒素源として、有機窒素源であるアミノ酸混合物を主に使用する。本発明で使用されるアミノ酸混合物としては、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキスなどが挙げられるが、特に、酵母エキスが好ましい。
アミノ酸混合物は、前培養培地及び本培養培地に添加されてもよい。好ましくは、アミノ酸混合物は、本培養培地に３ｇ／Ｌ以上の量で添加され得る。好ましくは、アミノ酸混合物は、本培養培地に４ｇ／Ｌ以上、５ｇ／Ｌ以上、６ｇ／Ｌ以上、より好ましくは、６．４４ｇ／Ｌ以上の量で添加され得る。好ましくは、アミノ酸混合物は、本培養培地に３～７ｇ／Ｌの量で添加され得る。
微生物が増殖し、十分な量のＰＤＣを産生するには炭素源が必要である。本発明で使用される炭素源としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、デンプン等が挙げられるが、特に、グルコースが好ましい。
炭素源は、培養液に流下添加されることが好ましい。本明細書において、「流下添加」とは、例えばペリスタポンプなどを用いて、連続的に添加する添加法を意味する。
炭素源は、本培養培地の調製時に添加した炭素源が、微生物の培養に伴い枯渇する時期に添加されることが好ましい。微生物は、対数増殖期には、盛んに炭素源と酸素を利用し、成長、増殖するが、炭素源が枯渇すると酸素の消費量も低下し、従って培養液中の溶存酸素は上昇する。そのため、炭素源の枯渇は、溶存酸素の上昇により確認することができる。従って、炭素源は、培養開始後、本培養培地中の炭素源が枯渇し、溶存酸素が上昇する時期に培養液に添加されることが好ましい。
無機栄養源も微生物の生育に必要とされる。例えば、カリウム、カルシウム、マグネシウムはいずれも解糖系やＴＣＡ回路における酵素反応での賦活剤として必要である。鉄は好気性生物における呼吸鎖酵素シトクロームの電子伝達を担う。そのほか、コバルト、銅、亜鉛等の微量元素も必要とされる。
本発明では、無機栄養源として二価金属イオンを使用する。本発明で使用される二価金属イオンとしては、マグネシウム、カルシウム、鉄（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、亜鉛、バリウム、コバルト、ニッケル、マンガン、クロム（ＩＩ）、ホウ素等の金属イオンが挙げられる。二価金属イオンは塩の形態で添加されてもよく、二価金属イオンの塩としては、当該金属イオンの塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シアン酸、チオシアン酸等の有機酸塩などが挙げられる。好ましくは、二価金属イオンとして、硫酸マグネシウム・七水和物、硫酸鉄・七水和物、酸化マグネシウム、炭酸カルシウム、硫酸亜鉛・七水和物、硫酸マンガン・四水和物、硫酸銅・五水和物、硫酸コバルト・七水和物、ホウ酸が添加される。
二価金属イオンは、前培養培地及び本培養培地に添加されてもよい。好ましくは、本培養培地１Ｌ中に、７５０ｍｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、７１．２５ｍｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、８０．６２５ｍｇのＭｇＯ、１５ｍｇのＣａＣＯ3、１０．８ｍｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、８．４ｍｇのＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ、１．８７５ｍｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、２．１ｍｇのＣｏＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．４５ｍｇのＨ3ＢＯ3が添加され得る。
培地に添加される上記の栄養源の量、添加方法、添加時期等は、メタボローム解析の結果に基づいて決定されてもよい。
本発明で使用される微生物は、ＰＤＣを産生する微生物であれば特に限定されないが、好ましくは組換えベクターを含むシュードモナス（Pseudomonas）属細菌の形質転換体であり、さらに好ましくは、組換えベクターを含むシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）の形質転換体である。
本発明で使用されるベクターは、好ましくはpDVZ21X又はpKTVPVABCである。これらベクターの作製方法は、例えば、特開２０１１－０６７１３９号公報に開示されており、当該文献中のベクターpVaPoLigVABCと前記ベクターpKTVPVABCは同一である。
本発明で使用されるシュードモナス・プチダは、シュードモナス・プチダPpY1100株であってもよい。
本発明の方法に使用される出発物質としては、植物成分あるいは石油成分由来、あるいは化学的に合成されたバニリン、バニリン酸、シリンガアルデヒド、シリンガ酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸、プロトカテク酸、p-ヒドロキシベンズアルデヒドなどが挙げられ、好ましくは、バニリン酸又はバニリンであるか、あるいは、バニリン及び／又はバニリン酸を含む芳香族物質の混合物であり、特に好ましくは、バニリン酸又はバニリンである。
出発物質は、実質的にアルカリ金属を含まない緩衝液に溶解される。前述の通り、アルカリ金属を含まないとは、当該緩衝液がＰＤＣの複塩を形成するようなレベルでアルカリ金属を含まないことを意味する。また、出発物質は、培養液に流下添加されることが好ましい。
本発明の方法によれば、ＰＤＣを高い収率で製造することができる。例えば、本発明の方法によれば、ＰＤＣが、培養液単位用量（Ｌ）あたり３０ｇ以上、５０ｇ以上、６０ｇ以上、７０ｇ以上、８０ｇ以上、９０ｇ以上、１１０ｇ以上、又は１２０ｇ以上製造される。好ましくは、ＰＤＣは、培養液単位用量（Ｌ）あたり４０ｇ以上、８０ｇ以上、又は１００ｇ以上製造される。また、本発明の方法によれば、ＰＤＣが、培養液単位用量（Ｌ）あたり３０～１３０ｇ、４０～１３０ｇ、３０～５０ｇ、７０～１３０ｇ、８０～１３０ｇ製造される。なお、本発明の方法では、ＰＤＣの高収率が好ましいが、微生物の生育に悪影響を及ぼさない限り、大量に生産されればよい。
微生物の培養時間は特に限定されないが、微生物が十分に増殖し、かつＰＤＣが生成するのに必要な時間であればよく、例えば３０時間以上、４０時間以上、６０時間以上、８０時間以上、１００時間以上培養され得る。好ましくは、培養時間は、６０～１００時間であり得る。
培養時にアルカリ金属を含まない緩衝液を使用することは、生成したＰＤＣの精製時にも利点を有する。培養終了時、反応を停止させるために、塩酸を用いて培養液をｐＨ１以下とするが、その際に、水酸化ナトリウムのようなアルカリ金属を含む緩衝液を使用した培養液では、不溶性の複塩（ナトリウム塩）が形成し、培養液が白濁する。一度塩形成が起こると、強陽イオン交換クロマトグラフィーなどの手段を用いない限りＰＤＣを分離精製することができない。しかしながら、本願のアルカリ金属を含まない緩衝液を使用する方法では、塩酸処理後も塩形成は起こらず、酢酸エチル抽出のような簡便な手段でＰＤＣを分離することが可能となる。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
以下に記載の使用菌株P. putida（pDVZ21Ｘ／PpY1100）及びP. putida（pKTVPVABC／PpY1100）は、ベクターpDVZ21Ｘ及びpKTVPVABCをそれぞれ含むシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PpY1100株の形質転換体を意味し、これらベクター及び形質転換体は、特開２０１１－０６７１３９号公報に記載の作製方法に従って調製した。
実施例１：バニリン酸からのPDC生産（１）
I-1 使用菌株
P. putida（pDVZ21Ｘ／PpY1100）を、50 μg/mlのカナマイシンを含有するLB培地（10 ml）にて一晩フラスコ培養後、等量の60%グリセロール溶液と混合した。1.5mlずつ分注して-80℃で保存した。
これをワーキングセルバンク（WCB）として本実験に使用した。
I-2 培地原料、試薬
培地原料及び試薬は、以下から入手したものを使用した。
硫酸アンモニウム （Wako）
リン酸二水素カリウム （Wako）
リン酸水素二ナトリウム・12水和物 （Wako）
リン酸水素二アンモニウム （Wako）
Bacto Yeast Extract （B＆D）
硫酸マグネシウム （Wako）
酸化マグネシウム （Wako）
炭酸カルシウム （Wako）
硫酸鉄・七水和物 （Wako）
硫酸亜鉛・七水和物 （Wako）
硫酸マンガン・四水和物 （Alfa Aesar）
硫酸銅・五水和物 （Wako）
硫酸コバルト・七水和物 （Wako）
ほう酸 （Wako）
塩酸 （Nacalai）
カナマイシン硫酸塩 （Wako）
バニリン酸 （Taizhou Zhongda Chemical , China）
消泡剤 アデカノール LG-295S （ADEKA）
アンモニア水 （Wako）
I-3 培養条件（2L培養槽）
I-3-1 使用機器
培養には以下の機器を使用した。
2L培養槽 ： MDL-2 丸菱バイオエンジ（株）
振とう培養器： BR-30LF タイテック（株）（前培養に使用；500 mLバッフル付フラスコ）
I-3-2 前培養
(1)前培養培地調製
まず、以下の溶液及び培地を調製した。

[1] SSS溶液 組成：100 mL分
MgO 1.075g
CaCO3 0.20g
FeSO4・7H2O 0.45g
ZnSO4・7H2O 0.144g
MnSO4・4H2O 0.112g
CuSO4・5H2O 0.025g
CoSO4・7H2O 0.028g
H3BO3 0.006g
12N HCl 5.136ml

[2] W.stock sol.II組成：1 L分
MgSO4・7H2O 10g
FeSO4・7H2O 0.5g
上記成分を900 mLの脱イオン水に溶解し、[1]に記載のSSS溶液100 mLを添加して、0.2 mmフィルター濾過滅菌した。

[3] 前培養基礎培地
(NH4)2SO4 5.6g
KH2PO4 3.6g
Na2HPO4・12H2O 20.6g
Bacto Yeast Extract 4.2g
水道水 890mL
上記の溶液及び培地を用いて、前培養培地を以下の通り調製した。
＜前培養培地（W改変培地）1L分＞
500mlのバッフル付フラスコに[3]に記載の前培養基礎培地を89mL入れ、オートクレーブにかけた。冷却後に以下の3種類の溶液を添加した。
・グルコース溶液18g/100mL（121℃で20分間滅菌）を10mL。
・カナマイシン硫酸塩溶液10mg/mL（0.2μmフィルターろ過）を0.25mL。
・[2]に記載のW.stock sol. IIを1mL
(2)前培養条件
WCBグリセロールストック1mlを前培養用培地を入れたバッフル付フラスコに植菌した。次いで、それを28℃、150～160 rpm/分で8～11時間振とう培養し、前培養液とした。
I-3-3 本培養
(1)本培養培地調製
まず、以下の溶液及び培地を調製した。

[1] 50％グルコース溶液
グルコース 150ｇを水150ｇに溶解し、121℃で20分間滅菌した。

[2] W.stock sol.II（本培養用）組成：1L分
MgSO4・7H2O 25g
FeSO4・7H2O 1.25g
SSS 溶液（前記I-3-2 [1]参照） 250ml

[3] 本培養基礎培地
(NH4)2SO4 6.70g
KH2PO4 4.31g
(NH4)2HPO4 9.10g
Bacto Yeast Extract 3.22g
水道水（0.95L）に溶解

[4] 流加用バニリン酸溶液
バニリン酸100gを水443ｇに懸濁後、28％アンモニア水を滴下しながら溶解した（pH7～7.5）（28%アンモニア水 40～45mL）。次いで0.2μmフィルターで滅菌した。
上記の溶液及び培地を用いて本培養培地を以下の通り調製した。
＜本培養培地（W改変培地） 1L分＞
[3]に記載の本培養基礎培地を培養槽に移し、消泡剤アデカノールLG295Sを0.22g添加した。121℃で20分間滅菌し、冷却後に以下の2種類の溶液を添加した。
・[1]に記載のグルコース溶液68ｇ
・[2]に記載のW.stock sol.II（本培養用）（0.2μmフィルターろ過）を15mL
(2)本培養条件
1)本培養培地0.4Lを2L培養槽に入れ、前培養液を0.05％（OD660nm＝5）植菌した。
2)次いで、28℃、200～800rpmで、溶存酸素（DO）≧15％sat.で撹拌制御し、通気量1v.v.mで培養した。
3)その培養液に、pH6.5以上を維持するために、14%のアンモニア水を自動添加した。
4)本培養培地に添加したグルコースが消費され、溶存酸素が上昇した後（培養開始から約2時間後）、50％グルコース液の培養液への流下添加を0.08g/分で開始した。
5)同時期に[4]に記載のバニリン酸溶液を0.11～0.17g/分で流下添加開始した。
6)発泡時（培養20～40時間）に消泡剤を間欠添加した。
7)随時にサンプリング及び菌濃度測定（OD660nm）を行った。
8)反応終了後、遠心分離により菌体を除去した培養液にHClを添加して酸性化（約pＨ1）し、酢酸エチル抽出後、ＴＬＣにてバニリン酸変換を確認した。
9)さらに、培養液をメタノールで希釈（1/10～200）し、上清をHPLCにてPDC生成量等測定を行った。
I-4 結果
培養開始後73時間に生成PDC濃度は110ｇ/Ｌとなった。培養80時間前後からバニリン酸とグルコースの残留が始まり、培養99時間にバニリン酸流加量は140ｇに達し生成PDCが123ｇ/Ｌとなったが、その後PDC濃度は低下し、反応はほぼ停止した。培養時に測定した各値の経時的変化を図２に示し、培養73時間及び培養145時間におけるTLCの結果を図３に示す。
実施例２：バニリン酸からのPDC生産（２）
上記「I-3-3 本培養」において、以下の点を変更した他は上記Iと同様の方法を行って、ＰＤＣを生成した：
・本培養基礎培地に添加するBacto Yeast Extractの量を3.22gから6.44gに増加し；
・本培養培地に添加するW.stock sol.II（本培養用）の量を15mLから30mLに増加し；
・「(2)本培養条件」のステップ1)で2L培養槽に入れる本培養培地の量を0.4Lから0.5Lとした。
II-4 結果
培養85時間で、バニリン酸100gを完全変換し、PDCの生成量は、80g/Lであった。培養時に測定した各値の経時的変化を図４に示し、TLCの結果を図５に示す。
実施例３：バニリンからのPDC生産
III-1 使用菌株
P. putida（pKTVPVABC／PpY1100）を、50 μg/mlのカナマイシンを含有するLB培地（10 ml）にて一晩フラスコ培養後、等量の60%グリセロール溶液と混合した。1.5mlずつ分注して-80℃で保存した。これをWCBとして本検討に使用した。
III-2
・培地原料、試薬
バニリン （Wako）
※他は前記Ｉと同じ
III-3 培養条件（2L培養槽）
III-3-1 使用機器
前記Ｉと同じ
III-3-2 前培養
前記Ｉと同じ
III-3-3 本培養
(1)本培養培地調製
まず、以下の溶液及び培地を調製した。

[1] 50％グルコース溶液
グルコース150ｇを水150ｇに溶解し、121℃で2分間滅菌した。

[2] W.stock sol.II（本培養用）組成：1 L分
MgSO4・7H2O 25g
FeSO4・7H2O 1.25g
SSS（前記I-3-2 [1]参照） 250ml

[3] 本培養基礎培地
(NH4)2SO4 6.70g
KH2PO4 4.31g
(NH4)2HPO4 9.10g
Bacto Yeast Extract 3.22g
水道水（0.95L）に溶解

[4] 流加用バニリン溶液
バニリン50gを水500ｇに懸濁後、28％アンモニア水を滴下しながら溶解した（pH7.5～8.2）（28%アンモニア水 20～25mL）。次いで0.2μmフィルターで滅菌した。

[5] 添加用酵母エキス溶液
酵母エキス13ｇを水94ｇに溶解し、121℃で20分滅菌した。
上記の溶液及び培地を用いて本培養培地を以下の通り調製した。
＜本培養培地（W改変培地） 1L分＞
[3]に記載の本培養基礎培地を培養槽に移し、消泡剤アデカノールLG295Sを0.22g添加した。121℃で20分間滅菌し、冷却後に下記の2種類の溶液を添加した。
・[1]に記載の50%グルコース溶液68ｇ
・[2]に記載のW.stock sol.II（0.2μフィルターろ過）を15mL
(2)本培養条件
1)本培養培地0.6Lを2L培養槽に入れ、前培養液を2％（OD660nm＝10）植菌した。
2)次いで、28℃、200～800rpm（DO≧15％sat.で撹拌制御）、通気量1v.v.mで培養した。
3)その培養液に、14%のアンモニア水を自動添加してpH6.5に制御した。
4)本培養培地に添加したグルコースを消費（DO上昇）後、グルコース液の培養液への流下添加を開始（0.10g/分）した。
5)同時期に[4]のバニリン溶液を流下添加開始（0.12～0.14g/L/分）した。
6)[5]の酵母エキス溶液10ｍL＋W.stock sol.II（本培養用）6mLを31時間、81時間に添加した。
7)消泡剤は発泡時（培養20～70時間）に間欠添加した。
8)随時にサンプリング及び菌濃度測定（OD660nm）を行った。
9)反応終了後、培養液をpH酸性（約pH1）とし、酢酸エチル抽出後、TLCにてバニリン変換を確認した。
10)さらに培養液をメタノールで希釈（1/10～200）し、上清をHPLCにてPDC生成量等測定を行った。
III-4 結果
培養80時間で、PDCの生成量は、40g/Lであった。

Claims (17)

  1. ２－ピロン－４，６－ジカルボン酸（ＰＤＣ）を産生する微生物を培養することによりＰＤＣを製造する方法であって、
    以下：
    ＰＤＣの産生のための出発物質であるバニリン酸をアンモニウム系緩衝液であるアルカリ金属を含まない緩衝液に流下添加して溶解すること、及び
    前記アルカリ金属を含まない緩衝液で培養液のｐＨを調整すること、
    を含み、ここで前記微生物の培養はアルカリ金属を含まない培養培地で行う、
    方法。
  2. 前記流下添加を0.11～0.17g/分の速度で行う、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＰＤＣの産生のための出発物質をアルカリ金属を含まない緩衝液に溶解することが、前記出発物質を溶解したアルカリ金属を含まない緩衝液を含む培養液中で、前記微生物を培養すること、を含み、前記アルカリ金属を含まない緩衝液で培養液のｐＨを調整することが、培養中にｐＨが低下した場合に適宜アルカリ金属を含まない緩衝液で培養液のｐＨを調整すること、を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記アンモニウム系緩衝液が、アンモニア水である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. アミノ酸混合物を添加することをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記アミノ酸混合物として酵母エキスが利用される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記酵母エキスが、３ｇ／Ｌ以上の量で培養液に添加される、請求項６に記載の方法。
  8. 炭素源を添加することをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記炭素源がグルコースである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記添加が流下添加である、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 二価金属イオンを添加することをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記二価金属イオンが、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＭｇＯ、ＣａＣＯ3、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、ＣｏＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及びＨ3ＢＯ3である、請求項１１に記載の方法。
  13. 出発物質を流下添加することを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記微生物が、組換えベクターを含むシュードモナス（Pseudomonas）属細菌の形質転換体である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記シュードモナス属細菌が、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）である、請求項１４に記載の方法。
  16. ＰＤＣが、培養液単位用量（Ｌ）あたり８０ｇ以上製造される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ＰＤＣが、培養液単位用量（Ｌ）あたり１００ｇ以上製造される、請求項１６に記載の方法。
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