JP5596271B2 - 複素環含有ペプチド化合物の製造方法及びゴードスポリンの類縁体 - Google Patents
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H. Onaka, H. Tabata, Y. Igarashi, Y. Sato and T. Furumai, Goadsporin, a chemical substance which promotes secondary metabolism and morphogenesis in streptomycetes. I. Purification and Characterization, The Journal of Antibiotics, 54, 1036-1044, (2001) H. Onaka, M. Nakaho, K. Hayashi, Y. Igarashi, T. Furumai, Cloning and characterization of goadsporin biosynthetic gene cluster from Streptomyces sp. TP-A0584.Microbiology, 151: 3923-3933 (2005)
(godA)蛋白のC末端側19残基に相当する部分のゴッドエー(godA)遺伝子塩基配列を変更することによって,ゴードスポリン類縁体の化合物を生合成することができると考えられる。
前記ペプチド化合物の前記生合成遺伝子群がゴードスポリン生合成遺伝子群であり,前記遺伝子組換え可能な放線菌がストレプトマイセス エスピーTP−A0584株(受託番号NITE P−518)もしくは前記ゴードスポリン生合成遺伝子群で形質転換されているストレプトマイセス属放線菌であり,godA遺伝子配列の塩基の1又は複数個を置換,欠失,又は挿入することによって製造されるゴードスポリンの類縁体であって,
転写活性化因子godR遺伝子で形質転換することにより,形質転換前と比較して, godR 遺伝子の発現が増強されたストレプトマイセス エスピーTP−A0584株(受託番号NITE P−518)もしくは前記ゴードスポリン生合成遺伝子群で形質転換されているストレプトマイセス属放線菌を培養する, 下記化学式2−47のいずれか1つの式の構造式で表わされるゴードスポリン類縁体を製造することを特徴とする複素環含有ペプチド化合物の製造方法に関する。
この発明による複素環含有ペプチド化合物の製造方法は,非特許文献1に記載されている従来のゴードスポリン類縁体生産株に比べて14.6倍の生産量が増大したゴードスポリン高生産株ゴッドエーアールツー(godA-R2) 株を使用することにより,ゴードスポリン類縁体の生産量を飛躍的に増大させることができる。ゴッドエーアールツー(godA-R2) 株は,実施例に示したようにピーティーワイエム1イーピーゴッドアール (pTYM1epgodR)プラスミドをゴードスポリン生産菌に導入することにより作製することができる。ここで,ゴッドエー(godA)遺伝子及びその周辺塩基配列を,配列番号1及び2に示す。ここで,ゴッドエー(godA)遺伝子は,101番目〜250番目の塩基である。
ゴードスポリン類縁体を製造するためには,上記のように,ゴッドアール(godR)遺伝子発現が増大したゴードスポリン高生産株のゴッドエー(godA)遺伝子を破壊した株に新たに変異ゴッドエー(godA)遺伝子を導入することによって,変異ゴッドエー(godA)遺伝子を高発現させることができる。この結果,ゴッドエー(godA)遺伝子の変異に従ったゴードスポリン類縁体を製造できる。新たに変異ゴッドエー(godA)遺伝子を導入するには,実施例に示したようなピーティーワイエム19ゴッドエー(pTYM19godA) に部位特異的塩基置換法を用いて,塩基変異を導入したプラスミドを用いることができる。ゴードスポリン類縁体を製造するためには上記ピーティーワイエム19ゴッドエー(pTYM19godA) に部位特異的塩基置換法を用いて,塩基変異を導入したプラスミド以外でも,変異ゴッドエー(godA)遺伝子を生産菌に導入できれば特にベクターの種類は問わない。変異ゴッドエー(godA)遺伝子を用いれば,ゴードスポリン類縁体は,後述の化学式(2)〜式(47)に示した構造式以外のゴードスポリン類縁体を製造することができることは勿論である。
実施例1及び実施例5において,ゴードスポリン生合成遺伝子群内に存在する転写因子・ゴッドアール(godR)が転写アクチベーターであることが明らかとなり,ゴッドアール(godR)を複数個,遺伝子操作によって染色体上に組み込んだ株のゴードスポリン生産が増大することを明らかにした。
ゴッドエー(godA)及び周辺部位の塩基配列を配列番号1及び2に示す。また,ゴッドエー(godR)遺伝子及び周辺部位の塩基配列を配列番号3及び4に示す。
ゴードスポリン生合成遺伝子の中でゴッドアイ(godI)が耐性遺伝子,ゴッドアール
godR) が転写調節遺伝子であるとDNA配列情報より推定された。一般的に生産物量を増大するためには,その物質に対する宿主菌株の薬剤耐性度を上げること,又は生合成遺伝子群の転写量を増大する操作による増大法が考えられる。そこで,どちらがゴードスポリン生産において有効な手段であるかを明らかにするために,ゴードスポリン生産菌の染色体にゴッドアイ(godI),ゴッドアール(godR)をそれぞれ1コピー導入した株を作製し,ゴッドアイ(godI)の2倍化株,ゴッドアール(godR)の2倍化株のゴードスポリン生産量を測定した。ゴッドアイ(godI)の2倍化株については,耐性遺伝子の増加により宿主のゴードスポリンへの耐性度が増加することが考えられた。また,ゴッドアール(godR)の2倍化株については転写調節遺伝子の増加によりゴードスポリン生合成遺伝子群の転写量が増大して生産量が増大することを期待した。ゴッドアール(godR)においては,転写因子であることまではDNA配列情報より推定できたが,転写活性化因子であるか転写阻害因子であるかまでは推定できなかったので,本実験によって転写活性化因子であることも初めて明らかになった。
材料・試薬
・ピーティーワイエム1イーピー(pTYM1ep) (図2)
・PCRプライマー
ゴッドアイ(godI)クローニング用プライマー
godI-C 5'-TGGAAGCTTCTGCTTGCGGTCACCGGATC-3'(配列番号93)
godI-N 5'-GCGACCCATATGTTCGACACTCTCTCCGA-3'(配列番号94)
ゴードスポリン(goadsporin)生合成遺伝子上でゴッドアイ(godI)遺伝子のC末側,N末側の配列を基に,デザインしたプライマーを用いて,PCR により増幅してインサート断片(約1.6 kb)を得た。これをピーティーワイエム1イーピー(pTYM1ep) のマルチクローニングサイトにNde I ,Hind IIIでクローニングしてピーティーワイエム1イーピーゴッドアイ(pTYM1epgodI) を作製した。
構築したプラスミドピーティーワイエム1イーピーゴッドアイ(pTYM1epgodI) を,接合性大腸菌S17−1を用いてTP−A0584の染色体上に組み込ませ,形質転換体
(godI2倍化株)を取得した(大腸菌の形質転換,放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい)。
1−1:材料・試薬
・ピーティーワイエム1イーピー(pTYM1ep) (図2)
・PCRプライマー
ゴッドアール(godR)遺伝子クローニング用プライマー
godR-C-Hind 5'-GCGAAGCTTCAATCGCTATTTAGCGGCGAA-3'(配列番号95)
godR-N-Nde 5'-CGCCATATGCGTGAAGGCAGCATCATAGCT-3'(配列番号96)
ゴードスポリン(goadsporin)生合成遺伝子上でgodR遺伝子を含む配列を基にデザインしたプライマーを用いて,PCRにより増幅してインサート断片(約0.7kb)を得た。これをpTYM1ep のマルチクローニングサイトにNde I ,Hind IIIでクローニングしてピーティーワイエム1イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) を作製した(図3)。
構築したプラスミドピーティーワイエム1イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) を,接合性大腸菌S17−1を用いてTP−A0584の染色体上に組み込ませ,形質転換体
(godR2倍化株)を取得した(大腸菌の形質転換,放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい)。
ゴッドアイ(godI)2倍化株,ゴッドアール(godR)2倍化株のゴードスポリン生産パターンを図7に示した(それぞれ2個体ずつ解析)。
図7から分かるように,野生型と比較して,ゴッドアイ(godI)2倍化株ではゴードスポリン生産量は大きく変化しないが,野生型に比べてゴードスポリン生産が早い時期に起こることが示された。一方,ゴッドアール(godR)2倍化株では,ゴードスポリン生産量が大きく増加した。更に,野生型よりも早期にゴードスポリン生産量が増加し始めることが示された。
ゴッドアール(godR)遺伝子2倍体株〔TP−A0584ΔgodA−R2〕の作製
1−1:材料・試薬
・ピーティーワイエム1イーピー(pTYM1ep)
・ピーティーワイエム19(pTYM19)
・PCRプライマー
ゴッドアール(godR)遺伝子クローニング用プライマー
godR-C-Hind 5'-GCGAAGCTTCAATCGCTATTTAGCGGCGAA-3' (配列番号95)
godR-N-Nde 5'-CGCCATATGCGTGAAGGCAGCATCATAGCT-3' (配列番号96)
aphII遺伝子特異的プライマー
aph-C 5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3'(配列番号97)
aph-N 5'-ATGATTGAACAAGATGGATTGCAC-3'(配列番号98)
tsr遺伝子特異的プライマー
tsr-C 5'-CTTCATATGCGGGGATCGACCGCGC-3' (配列番号99)
tsr-N 5'-GACGAATCGAGGTCGAGGAACCGAG-3' (配列番号100)
・KOD−plus−DNAポリメラーゼ(TOYOBO)
ゴードスポリン生合成遺伝子上でゴッドエー(godA)遺伝子を含むBamHI断片(約1.2kb)をpTYM19にクローニングし,図5に示すピーティーワイエム19ゴッドエー(pTYM19epgodA) を作製した。
構築したプラスミドピーティーワイエム1イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) を,接合性大腸菌S17−1を用いて,ゴッドエー(godA)遺伝子破壊株の染色体上に組み込ませ,形質転換体ゴッドエーアールツー(ΔgodA-R2 )を取得した(大腸菌の形質転換,放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい)。
得られた形質転換体から染色体を回収し(CTAB法など),aph II 遺伝子特異的プライマーを用いたPCRにより形質転換が確実に行われたことを確認した(図4)。
次に,生産量が増加することを確認するため構築したプラスミドピーティーワイエム19ゴッドエー(pTYM19godA)を同様の方法でΔgodA-R2 株の染色体上に組み込ませ,ゴードスポリン高生産復帰株(godA-R2)を取得した。得られた形質転換体から染色体を回収し,tsr遺伝子特異的プライマーを用いたPCRにより形質転換が確実に行われたことを確認した(図4)。
ゴードスポリンの定量法
2−1:材料・試薬
・V−22
0.1% Starch ,0.5% Glucose, 0.3% NZ-case, 0.2% Yeast extract, 0.5% tryptone,0.1%K2 HPO4 ,0.5%MgSO4 ・7H2 O,
0.3%CaCO3 ,pH:7.0
・ゴードスポリン生産培地
6.0% Maltose, 4.0% Pharmamedia, 1.0% Yeast extract,
1.0% Diaion HP20(脱気してpH調整後に混合), pH7.0
得られた形質転換体を選択薬剤カナマイシン,チオストレプトンを20μg/ml添加した10ml V−22培地に植菌した。30℃で2日間振とう培養後,100mlのゴードスポリン生産培地に前培養液を3%植菌し,さらに5日間培養した。
培養液と等量のn−BuOHを加えて60分間激しく振とう撹拌した。これを遠心分離(6000〜10000rpm,5分間) してBuOHを回収し,減圧濃縮した。
MeOHで溶解後,フィルター濾過したものをHPLCサンプルとした。HPLC(
HP1100,Hewlett Packard )は,C18Cadenza カラム(Φ4.6×75mm)を使用し,カラム温度40℃移動相:0.1%CH3 CN−0.1% HCOOH buffer ,流速0.8ml/minで溶出し,UV吸収スペクトルは254nmで検出した。
ゴードスポリン類縁体生産株の作製法
3−1:材料・試薬
・ピーティーワイエム19ゴッドエー(pTYM19godA)
・PfuUltraT M high fidelity DNA polymerase
・Dpn I
アミノ酸置換用の配列表を,配列番号5〜74に示す。
また,アミノ酸挿入・欠失用の配列表を,配列番号75〜92に示す。
pTYM19ゴッドエー(godA)を鋳型プラスミドとして,QuikChange(登録商標)IIXL Site −Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いてプロトコールに従って変異導入を行った。取得した変異導入プラスミドは,ABI PRISM 310を用いてシーケンスし,目的の変異が導入されているかを確認した。
宿主にΔゴッドエーアールツー(ΔgodA-R2)株を用いて,1−3と同様の方法により各ゴッドエー(godA)変異株を取得した。
3−4:ゴッドエー(godA)変異株による生産物の確認
ゴードスポリンの定量法と同様に分析を行った。コントロールであるゴットエーアールツー(godA-R2 )株のHPLCデータと比較して,類縁体と思われる各ピークをHPLCの廃液配管から直接(手動で)採取した。採取した各ピークを Positive ESI-MS にかけ,予想される分子量を参考にして構造を決定した(図10)。
ゴードスポリンのバイオアッセイ法
4−1:材料・試薬
・Bennett’s glucose培地
0.1% Yeast extract, 0.1%肉エキス(エルリッヒ),
0.2%NZ Amine Type A,1% D(+)−Glucose,2%Agar, pH:7.2
・NBソフトアガー
0.8% Nutrient broth (Wako), 0.5% Agar
図6に示すように,滅菌済みのペーパーディスク(直径10mm)に,2−3の方法で調製した試料をHPLC分析の結果からゴードスポリン約10μgになるようにしみ込ませて乾燥させた。3mlのNBソフトアガー( 溶かして40℃くらいに冷ましたもの) にS.lividans TK23 の胞子液を加え,Bennett's glucose 培地に均一に撒いた。アガーが乾いたら,ペーパーディスクを中央にのせ,32℃で3 日間培養した。
godR2倍体株(godA-R2 株)のゴードスポリン生産量
HPLC分析結果を図9に示した。
野生株godA-R2 株のゴードスポリンの生産量は,野生型と比較して1.15倍,ゴッドエー(godA)復帰株と比較して14.6倍であった。
ゴッドアール(godR)遺伝子を2倍にすることで,ゴッドエー(godA)復帰株においても野生型と同等のゴードスポリンを生産する株を取得できた。
取得したゴードスポリン類縁体
ゴードスポリン類縁体の構造は,置換したアミノ酸から予想できるため,その分子量をMSで測定することによって構造を決定した(図10)。
これにより47種類のゴードスポリン類縁体を取得した。表1に,それぞれ配列を示した。
これらの結果から以下のことが明らかになった。
(1)アミノ酸を置換,挿入,欠失させても環形成するアミノ酸は変わらない。
(2)ゴードスポリン生合成酵素は,アミノ酸を1 ,2 個挿入してもゴードスポリン前駆体として認識する。ただし,10A11などの中央に挿入した類縁体に比べ,3A4,6A7などの中央から外れたところに挿入すると生産量は減少する。
(3)ゴードスポリンを構成するアミノ酸は8種類であるが,それ以外のアミノ酸に置換しても生合成酵素は認識する。
ゴードスポリン類縁体のバイオアッセイ法の結果
ゴードスポリン類縁体のうち,ゴードスポリンと同様に色素生産,胞子形成を誘導したものは9種類であった。それを表3に示す。
(1)菌体内ではゴードスポリン前駆体蛋白遺伝子であるgodAが転写翻訳され,godA蛋白が発現する。
(2)godB,godC蛋白によってgodA蛋白は細胞膜へ係留される。
(3)godD,godE,godF,godG蛋白が,godA蛋白内のセリン,スレオニン,システイン残基をそれぞれオキサゾール,メチルオキサゾール,チアゾールに変換する。このように翻訳後修飾されたゴッドエー(GodA)蛋白は,次にN末端から30番目のアラニンと31番目のアラニンの間でプロテアーゼ酵素によって切断され,C末端側19残基が遊離する。
(4)遊離したC末端側19残基のN末端がゴッドエイチ(GodH)酵素によってアセチル化修飾を受けて,ゴードスポリンが完成する。
godA遺伝子とgodR遺伝子を組み込んだ株,即ち,godA−R2株染色体上のゴードスポリン生合成遺伝子群が示されている。
(1)DNAサイズマーカー
(2)TP−A0584(WT)ゲノムDNA
(3)ΔgodA株ゲノムDNA
(4)ΔgodA+godR株ゲノムDNA
(5)ΔgodA+godA株ゲノムDNA
(6)ΔgodA+godA+godR株ゲノムDNA
図6に示すように,まず,NBソフトアガーを完全に溶かし,S.lividans の胞子液を加え,Bennet's glucose 培地上に均一に蒔く。次いで,NBソフトアガーが乾いたら,ゴードスポリンを染み込ませたペーパーディスクをプレートの中央に載せる。最後に,32℃で3日間培養すると,色素生産と胞子形成が確認できる。
上段が野生株(TP-A0584)であり,中段がゴッドエー(godA)復帰株であり,下段がゴッドエーアールツー株(godA-R2)である。
MSのデータからm/zは1658.6510(〔M+H〕+ )の分子量が確認されたことから,これはG10Cであると決定した。
Claims (5)
- リボゾーム翻訳系を用いて生合成され且つ翻訳後修飾によって全て又は1部のシステイン残基がチアゾール環,セリン残基がオキサゾール環,又はスレオニン残基がメチルオキサゾール環に変換される様式で生合成されるペプチド化合物の生合成遺伝子群を,遺伝子組換え可能な放線菌内で発現させることによって複素環含有ペプチド化合物を製造する方法において,
前記ペプチド化合物の前記生合成遺伝子群がゴードスポリン生合成遺伝子群であり,前記遺伝子組換え可能な放線菌がストレプトマイセス エスピーTP−A0584株(受託番号NITE P−518)もしくは前記ゴードスポリン生合成遺伝子群で形質転換されているストレプトマイセス属放線菌であり,godA遺伝子配列の塩基の1又は複数個を置換,欠失,又は挿入することによって製造されるゴードスポリンの類縁体であって,
転写活性化因子godR遺伝子で形質転換することにより,形質転換前と比較して, godR 遺伝子の発現が増強されたストレプトマイセス エスピーTP−A0584株(受託番号NITE P−518)もしくは前記ゴードスポリン生合成遺伝子群で形質転換されているストレプトマイセス属放線菌を培養する, 下記化学式2−47のいずれか1つの式の構造式で表わされるゴードスポリン類縁体を製造することを特徴とする複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
- 前記転写活性化因子godR遺伝子を前記ペプチド化合物の生産放線菌の染色体DNA上に1個又は複数個組み込むことによって,前記ペプチド化合物の生産量を増大することを特徴とする請求項1に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
- 前記ゴードスポリン生合成遺伝子群は,ゴッドエー(godA),ゴッドビー(godB),ゴッドシー(godC),ゴッドディー(godD),ゴッドイー(godE),ゴッドエフ(godF),ゴッドジー(godG),ゴッドエッチ(godH),ゴッドアイ(godI),及びゴッドアール(godR)の10個の遺伝子からなることを特徴とする請求項1又は2に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
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