JPH11506025A - ｐｃｌ遺伝子の発現によりペニシリウム・クリソゲヌムにおけるペニシリンＧ（ベンジルペニシリン）の生産性を高めるための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 pcl 遺伝子は酵素フェニルアセチル−CoA リガーゼをコードする。シュードモナス・プチダＵに由来し、且つ配列SEQ ID NO：１を特徴とするpcl 遺伝子を組換DNA 技術により導入して形質転換CECT 20192突然変異体を得る。これは非形質転換コントロール株と比べ、ペニシリンＧの生産性において10％以上の増大を示す。

Description

【発明の詳細な説明】pcl 遺伝子の発現によりペニシリウム・クリソゲヌムにおけるペニシリンＧ（ベ ンジルペニシリン）の生産性を高めるための方法 発明の分野 本発明は、酵素フェニルアセチルCoA リガーゼをコードし、且つ細菌シュード モナス・プチダ （Pseudomonas putida）を起源とする外性遺伝子のコントロール 株における導入及び発現による、優れたペニシリンＧ生産能力を有するペニシリ ウム・クリソゲヌム（Penicillium chrysogenum）株を獲得するための新規の方 法に関する。 従来技術 ペニシリウム・クリソゲヌムにおけるベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）の 生合成のための経路は、一方ではアミノ酸Ｌ−リジンに至る、そして他方では前 記抗生物質に至る線形及び枝分れした代謝経路である（図１参照）。 ペニシリンの特異的な枝分れは、抗菌活性を欠くACV とも呼ばれている線形ト リペプチド（Ｌ−α−アミノアジピル−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリン）を供す る３個のアミノ酸（Ｌ−α−アミノアジピン酸、Ｌ−システイン及びＬ−バリン ）の非リボソーム縮合により開始する（Ref.１）。この変換を触媒する酵素はＬ −α−アミノアジピル−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリンシンセターゼあり、その 略称はACVSである（Ref.２）。後の段階において、トリペプチドACV はＬ−シス テイン及びＤ−バリン残基の環化によりイソペニシリンＮ(IPN)へと変換される （Ref.３）。この反応はβ−ラクタム及びチアゾールの２個の環を有し、そして Ｌ−α−アミノアジピン酸 の残部が側鎖として残っている分子の合成に至る（図１、Ref.３）。IPN はこの 経路における第一分子であり、抗菌活性を有するが、Ｇ−生物に対するその効能 は低い。この化合物の合成を担う酵素はイソペニシリンＮシンセターゼ（IPNS） である（Ref.３）。その後の段階において（図１参照）、ペニシリウム・クリソ ゲヌム はIPN の中に存在しているＬ−α−アミノアジピン酸の残部をフェニル酢 酸に置き換え、β−ラクタム及びチアゾール環は保持しているが、側鎖としてフ ェニル酢酸をもつようになった分子を供する。このペニシリン、いわゆるペニシ リンＧ又はベンジルペニシリンはIPN よりも優れた効能を有し、そしてはるかに 広い抗菌スペクトルを有する。 ペニシリンＧ生合成の最終段階は少なくとも３通りの酵素反応を必要とする。 第一に、フェニル酢酸が培養培地から細胞に組込まれなければならない。この段 階はPTS と略称される特異的な輸送系により触媒される（図１）（Ref.４）。次 に、フェニル酢酸は、よくは理解されていないが、フェニルアセチル−CoA−リ ガーゼ(PCL)の関与を必要とするメカニズムによりフェニルアセチル−CoA(PA−C oA)へと活性化される。最後に、PA−CoA は酵素アシル−CoA : ６−アミノペニ シラン酸（イソペニシリンＮ）アシルトランスフェラーゼ（AT）（Ref.５）によ り、このタンパク質は６−アミノペニシラン酸(６−APA)の６−アミノ基のアシ ル化を触媒する又はそうでなければIPN 分子の中に、存在しているＬ−α−アミ ノアジピン酸の残部とフェニルアセチル−CoA との間での相互変換を触媒するよ うに利用され、第一ケースにおける生成物ペニシリンＧ及びCoA（基質が６−APA 及びフェニルアセチル−CoA のとき）並びに第二ケースにおけるペニシリンＧ 、CoA 及びＬ−α−アミノアジピン酸（基質がIPN 及びPA-CoA のとき）が遊離 される（Ref.６）。 今日までに実施された生化学的及び遺伝子的研究はペニシリンＧ特異的生合成 経路の酵素の全てを同定し、そしてその遺伝子を特性決定したが、但し精製する ことができず、且つその遺伝子が今まで未知であった酵素フェニルアセチル−Co A リガーゼは除く。更に、ペニシリウム・クリソゲヌムの様々な株（ペニシリン Ｇの生産性が低いもの及び工業的に利用されているその他の株の双方）において 検出される様々な生合成酵素（ACVS，IPNS及びAT）の量は、そのいづれかがペニ シリンＧの生合成における律連段階であると考えられる可能性を否定するには高 すぎる（Ref.７−８）。この理由のため、配列が完全にわかっていないこの経路 における唯一の酵素フェニルアセチル−CoA リガーゼ(PCL)の研究を開始した。 研究されたペニシリウム・クリソゲヌムの全ての株における検出可能な量の酵素 の欠如は、様々な微生物を、唯一の炭素源としてフェニル酢酸（PA）を含む規定 の組成の培地（最少培地、MM）の中で増殖するその能力について選別しなければ ならないこと、そして更にはフェニルアセチル−CoA リガーゼ活性の存在をこの 選定した株全てにおいて評価しなければならないことを意味する。単離した微生 物の全てのうち、シュードモナス・プチダＵの株が選定され、それは新規の酵素 フェニルアセチル−CoA リガーゼ（EC ６，２，１，30）の関与する未知の分解 経路を介してフェニル酢酸を好気的に分解する。この酵素は均質となるまで精製 され、そして生化学的に特性決定されている（Ref.９）。以降我々がPCL と呼ぶ このシュードモナス・プチダＵ酵素はペニシリウム・クリソゲヌムのIPNS及びAT に非常に似た至適生理化学状態を示し、従ってこの３種の酵素はin vitroで一緒 に作用するものと考えられた。シュードモナス・プチダＵのPCL 並びにペニシリ ウム・クリソゲヌム のIPNS及びATはin vitroで結合し得、そして実験室において ペニシリンＧ及びその他のペニシリンの 生産のためにこの形態で利用される（Ref.10）。スペイン国特許第P8902421及び 2016476 A6に記載のこれらの結果は、シュードモナス・プチダＵのPCL がペニシ リウム・クリソゲヌム において発現し得、そしてもしこの酵素が生合成経路にお ける律連段階を担うなら、一層優れたペニシリンＧの生産性が達成し得ることが 示唆される可能性をもたらす。 発明の詳細 １．シュードモナス・プチダＵにおける酵素フェニルアセチル−CoA リガーゼ についてコードする遺伝子の単離 Ref.９に記載のMMにおいて増殖させたときにフェニルアセチル−CoA リガーゼ を有するシュードモナス・プチダＵの株を、図２に示すプロトコールに詳細の通 りにして、トランスポゾンTn５（Ref.11）の挿入により突然変異させた。フェニ ル酢酸を分解できない株を選定した。それはこの芳香化合物の代謝経路に対応す るいづれかの遺伝子又は遺伝子間領域において挿入が施されたことを示唆する。 全ての突然変異体において、PCL 活性はスペイン国特許第P8902421及び関連公開 物（Ref.９）に記載の通りにしてアッセイした。この目的のため、様々な突然変 異体を同じMMであるか、炭素源としてPCL を誘導しない４−ヒドロキシフェニル 酢酸（４−OHPA）及び分解されないがPCL を誘導できるフェニル酢酸を含むもの の中で増殖させた（Ref.12）。このMMにおいて、４−OHPAは細胞増殖を維持する ために細菌により利用され、一方PAは酵素フェニルアセチル−CoA リガーゼのイ ンデューサーとして働く。 この簡単な手順により、２通りの群が樹立されるように様々な突然変異体を特 定決定した： ａ）機能性PCL を有し（いわゆる PCL＋）、且つPCL をコードす る遺伝子の後方にこの経路上の遺伝子自体の中に（又は遺伝子間領域の中に）ト ランスポゾンTn５が挿入されている群；及び ｂ）当該活性が検出できないその他の群（いわゆる PCL−）。 この第２群の突然変異体におけるPCL の欠如は２つの理由に基づきうる： １）それは、トランスポゾンがリガーゼをコードする遺伝子(pcl)の前方に挿 入されたことに基づきうるか（もし、予測通り、PAの分解を司る異化経路の全て が１つのプロモーターのコントロール下にあるなら）、又は ２）Tn５がpcl 遺伝子自体に組込まれた、もしくは調節遺伝子もしくは配列の 中に組込まれたことに基づきうる。 PCL 活性の検出できない突然変異体の一つ、いわゆるＥ₁から、Tn５の末端と 全く同じであり（5' D 3' : ACT TGT GTA TAA GAG TCA G）、且つ放射能ラベル されたオリゴヌクレオチド配列の利用により、Tn５の挿入を同定した。トランス ポゾンに結合したＥ₁突然変異ゲノムのゾーンをプラスミドpUC18 の中にクロー ニングし、そしてエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）株Ｄ５α’を慣用 のプロトコール（Ref.13）に従って形質転換させた。次いでこのインサートを配 列決定し、そして突然変異体Ｅ₁から単離した遺伝子配列とハイブリダイズし、 且つトランスポゾンの隣接ゾーンに対応する遺伝子を、ファージλEMBL４におい て作製したシュードモナス・プチダＵ DNAライブラリーにおいて探した。陽性ハ イブリダイゼーションを示すファージの全てのうち、シュードモナス・プチダの ゲノムDNA の13，15及び18kbのフラグメントを含むものを選別した。そのうちの 一つ、即ち13kbのインサートを含むものからDNA を抽出し（Ref.13）、それを制 限酵素EcoRＩで切断し、そして10kbのフラグメントを選択した。エッシェリヒア ・コリ DH５α’のこのフラ グメントを形質転換ベクターとしてプラスミドpUC18を用いて導入すると、イン サートの存在はこの細菌に唯一の炭素源としてPAを含むMMの中で増殖する能力を 授ける。しかしながら、増殖はシュードモナス・プチダＵにおいて観察されるも のよりも遅く、このことはそれがこの化合物の異化を可能にする遺伝子を含むに もかかわらず、それがエッシェリヒア・コリの中で分解する速度ははるかに遅い ことを示唆する。このことは（ｉ）PAの全分解のために必要な１又は複数の遺伝 子が欠失しているか又はそのフラグメントの中で不完全であるという事実（この ことは、細菌がその遺伝子をそれ自体のゲノムの中に存在する別のものに置き換 え、たとえ遅いとしても、それが蓄積した異化物を使用することを強制する）と いう事実、又は（ii）このフラグメントの中に全ての必須遺伝子が存在している にもかかわらず、PA（又はその分解生成物の一つ）を原因とする毒性がエッシェ リヒア・コリ におけるこの化合物の一層効率的な利用を妨げるという事実のいづ れかに基づきうる。更に、プラスミド pUC18＋インサートを含まない細菌（エッ シェリヒア・コリ DH５α’）又は10kbのインサートのないプラスミドpUC18 しか 有さないその他はMM＋唯一の炭素源としてのPAの中では増殖できないことが示さ れた。このことは、（ｉ）フェニル酢酸の異化が本質的に10kbのフラグメントの 中に含まれている遺伝子の発現に基づくということ、及び（ii）使用したエッシ ェリヒア・コリ 株（DH５’α）が唯一の炭素源としてPAを含むMMの中で増殖でき るようにする任意の機能性酵素を有さないことを明瞭に実証する。その後、有意 な量のフェニルアセチル−CoA リガーゼ活性がエッシェリヒア・コリDH５’αの 無細胞抽出物の中で検出されたため、このフラグメントがpcl 遺伝子を含むこと が確認され、一方、基底レベルでさえその前記活性は pUC18＋インサートのない 同じ細菌又はpUC18 しかもたないその他 では検出されなかった。 その後の研究はより独特なフラグメント（2090塩基対）の獲得を可能にし、そ れはpUC18 の中にクローニングされ、PCL 活性を有するタンパク質をコードし、 そしてその制限分析を図３に詳細する。pcl 遺伝子のヌクレオチド配列をSEQ ID NO : １とする。 この遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列をSEQ ID NO : ２と する。リガーゼ活性の決定はRef.９に記載の通りにして実施されているが、今回 は100μｇ／mlの抗生物質アンピシリンの添加された（プラスミドpUC18 の中に 存在するβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含む細胞を分析する場合）又は 細胞がプラスミドを含まないなら抗生物質の入っていないLB培地(Luria−Bertan i，Ref.13)の中で増殖させたエッシェリヒア・コリの無細胞抽出物で出発した。 全ケースにおいて、細菌は１／10に希釈した培養物の吸収（Abs540nm）が 0.2の ときに回収した。このような条件下で、pcl 遺伝子を担持するインサートを含ま ない細胞のない抽出物の中に存在するPCL の比率は全タンパク質に対して23％で あった。シュードモナス・プチダＵから予め精製したタンパク質のアミノ末端の 分析により得られたオリゴペプチドの全てがこの配列の中、及び同じ酵素のトリ プシン酒化物により得られるその他の中に見い出された。このタンパク質はAMP 結合部位に対応する共通配列（SSGTTGKP）を示した（Ref.14−15）。更に、この 酵素を pUC18＋図３に表示のインサートで形質転換したエッシェリヒア・コリDH ５α’株から精製し、（ｉ）発現されたそのタンパク質はシュードモナス・プチ ダ Ｕから得られるものと同じ分子量を有する；及び（ii）この酵素はペニシリウ ム・クリソゲヌム のIPNS及びATにも連結し得、ペニシリンＧのin vitro合成を供 する；ことが示される。 しかしながら、ベクターとしてプラスミドpUC19 を用いてエッシ ェリヒア・コリ DH５α’において発現させると、PCL 活性は検出できなかった。 このことは、シュードモナス・プチダＵプロモーターがエッシェリヒア・コリの 中で発現されないか、又はDNA フラグメントにおいて有用なプロモーター配列が ないことを示唆する。 その後の研究は、図３に示すフラグメントを酵素エキソヌクレアーゼIII／ヌ クレアーゼＳ１によりそれを消化することにより短くするように実施され(PROME GA社より供給された Erase−ａ−ベースシステムを用い)（Ref.16）、クローンB al116（SEQ ID NO : ８）が得られ、これは(PCLをコードするものの前方におい て)配列フラグメントを失っているが、シュードモナス・プチダＵから精製したP CL と同じアミノ末端配列(MNMYH)を保持していた。2090塩基対のフラグメントを 様々な時間にわたってエキソヌクレアーゼIII／ヌクレアーゼＳ１(Erase−ａ− ベースシステム)（Ref.16）により消化して得られる様々な遺伝子配列の分析は エッシェリヒア・コリの中のこのようなDNA フラグメントの発現がアミノ末端配 列のみの変化した種々のPCL をもたらすことを示唆した。エッシェリヒア・コリ において発現したPCL 活性の分析（表１）は、シュードモナス・プチダＵから精 製したもの及びクローンBal116によりコードされるものの双方に対応する天然タ ンパク質のアミノ末端(MNMYH)が酵素活性の任意の有意な変化抜きで変えられう ることを示した。即ち、長めのアミノ末端（MTMITNSSNSSEAMNM）を有するPCL を コードするクローンBal112（SEQ ID NO : ７）はクローンBal116から発現された ものと同じ活性を保持していた。同じことがクローンBal142（SEQ ID NO : 10） 及びBal101（SEQ ID NO : ３）により発現されたタンパク質の活性についての研 究で起こり、それらのアミノ末端はかなり短くなった（MTMITNSRYH及びMTMITNSS DAのそれぞれ）。クローンBal110（SEQ ID NO : ６）から、アミノ末端(MTMITNS SWRAAYKNNSSEAM NMYH）が内部WRAAYKN 配列の存在に基づきBal112に対応する構築体によりコード されるものよりも長いタンパク質が得られた。このタンパク質は任意のPCL 活性 を示さなかった。それは活性を変えることなくタンパク質のアミノ末端に一定の 修飾を導入することが可能ではあるが、その他、例えば上記のものは、天然タン パク質の完全配列を保つにもかかわらず非機能的な酵素をもたらすことを示す。 この結果は極めて興味深く、なぜならpUC18 ポリリンカーに属するMTM 配列が存 在していることを条件に、エッシェリヒア・コリにおいてクローニングされたPC L はそれ自体のATG から発現されないことを示すからである。ポリリンカー(MTM )の中に存在している２個のメチオニンの重要性を確立する狙いで、プラスミド の２組のATG の間に位置する２個のシトシンの一方の欠失が生じており、その結 果停止シグナルができているpUC18 の変異体を利用した。この突然変異プラスミ ドにおける配列をSEQ ID NO : 11とする。このＣの欠失はリーディングフレーム シフトを及ぼし、従ってタンパク質は第２メチオンでしか出発できなくなってし まう。このベクターを用い、天然PCL のアミノ末端の中に存在する２個のメチオ ニンをコードするヌクレオチド配列も有さない構築体の発現についての研究を行 った（この場合、構築体Bal142）。発現されたPCL の分析は機能性タンパク質が できたことを示し、ポリリンカーの第二ATG がクローニングされたPCL の出発点 を占めることを示す。 オリジナルのプラスミドpUC18 において作り上げたその他の構築体において（ それにおいては３つのリーディングフレームの中に停止シグナルがある）、天然 タンパク質のアミノ末端から種々のPCL が合成し始めた（これはクローンBal106 ではSEQ ID NO : ４−，Bal107ではSEQ ID NO : ５−，Bal116及びBal117ではSE Q ID NO : ９−）。 これらのデーターは全て下記の所見がまとめられるようにする： ａ）クローニングした遺伝子がシュードモナス・プチダＵの中の酵素PCL をコ ードするものに対応する； ｂ）エッシェリヒア・コリDH５α’におけるこのタンパク質の発現はプラスミ ドpUC18 の中に存在するβ−ガラクトシダーゼのプロモーターにより支配されて いる；及び ｃ）アミノ末端配列への個々の修飾は機能性PCL を供し、一方アミノ酸配列WR AAYKN(Bal112)の導入はフェニルアセチル−CoA リガーゼ活性の完全消失を供す る。 ２．糸状菌ペニシリウム・クリソゲヌムにおけるシュードモナス・プチダＵ遺 伝子の発現 シュードモナス・プチダＵのpcl 遺伝子が特性決定できたら、次の課題はこの 糸状菌におけるその発現が一層大量のペニシリンＧの生産性を直接もたらすかを 狙いとして、それをペニシリウム・クリソゲヌムの中に導入することである。 ペニシリウム・クリソゲヌムWis 54−1255をコントロール株として選定した。 Sanchez ら（Ref.17−18）記載の手順を利用し、最少培地の中で増殖させた菌糸 体からプロトプラストを得た。このプロトプラストをpBC 由来のプラスミド（St ratagene）で形質転換させた。このプラスミドは抗生物質フレオマイシンに対し て耐性な遺伝子（Ref.19）、遺伝子pcbAB のプロモーター、ペニシリウム・クリ ソゲヌム のACVS（Ref.19）、シュードモナス・プチダＵのpcl 遺伝子（Bal101と 表示の構築体から出発）及びペニシリウム・クリソゲヌムのtrpC遺伝子のターミ ネーターを含む。構築体pALPs９（図４）は以下の通りにして作った：末端をフ レノウ（Ref.13）で補完した 1.2kbのフラグメント NcoＩを、二方向プロモータ ーpcbAB−pcbC（P pcbAB,Ref.19参照）を含む2316bpのフラグメントBamHＩを担 持するプラスミドpALP498 から単離した。このフラグメントを、EcoRＩで予め消 化し、フレノウで補完し、そして脱リン酸したBal101に結合させ、両方向におい て挿入を施した pALPs１及び pALPs２を得た。クローン pALPs１はpcl 遺伝子を プロモーターpcbAB のコントロール下に含む。XbaＩによるこのプラスミドの消 化、クレノウによる末端の補完及びHindIIIによるその後の消化により、romo−H indIII末端を有する 2.8KBのフラグメントが得られ、これはpcbAB プロモーター −pcl 遺伝子複合体を含んだ。このフラグメントを、XhoＩで消化し、クレノウ で補完し、そして最後にHindIIIで消化した菌類形質転換ベクターpAL fleoの中 にサブクローンした。フレオマイシン耐性カセット(ble^r)と同一方向においてpc bAB プロモーター−pcl 複合体の挿入された得られるプラスミドを pALPs８と称 する。最後に、pcl 遺伝子とフレオマイシン耐性カセットとの間に位置する pAL Ps８のEcoRＶ部位の中にペニシリウム・クリソゲヌムのtrpC遺伝子(TtrpC)のタ ーミネーターを含む725bp のフラグメントを導入した。適正な方向においてtrpC ターミネーターを抱える構築体を pALPs９と称し、そしてペニシリウム・クリソ ゲヌム の種々の株の中でのpcl 遺伝子の発現のために用いた。この構築体を図４ に示す。 フレオマイシン耐性遺伝子(ble^r)を発現するペニシリウム・クリソゲヌムの形 質転換株を選別し（Ref.19）、そして分析した。選定した全ての形質転換体は、 種々の形質転換体のDNA 及びpcl 遺伝子に対応する２本の内部オリゴヌクレオチ ド（その対応の配列は：5' D 3' : ATC TGG GEC GGG AAC AC 及びGGC GCA AGG GEG ACA A である）を利用するPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)による増幅を実施し たときに全てのケースにおいて予測のものと同等のサイズ(651塩基対)の対応の 配列が得られたことの事実により示される通り、pc l 遺伝子を担持していた（図８）。しかしながら、非形質転換コントロール株又 はpcl 遺伝子を失った構築体（図５）のいづれにおいても増幅は観察されず、こ のことは（ｉ）この遺伝子がペニシリウム・クリソゲヌムのゲノムの中には存在 しないこと及び（ii）増幅できる任意の類似配列がないことを示す。分析したフ レオマイシン−耐性形質転換体の98％がpcl インサートを含んでいた。 この研究を完了するため、４種の形質転換体及び非形質転換コントロールを選 別し、そして遺伝子の発現（無細胞抽出物中のフェニルアセチル−CoA リガーゼ 活性の出現）及びそのベンジルペニシリン生産に対する作用の双方を分析した。 このタイプの研究のため、コントロール及び選別した形質転換体を完全生産培地 のプレートに接種した。そのｇ／ｌでの組成は下記の通りである：コーンスティ ープ固形物30、ラクトース30、フェニル酢酸１、寒天20ｇ及び蒸留水１ｌに至る まで。pHをNaOH（30％ｗ／ｖ）で 6.5に調整し、そして10ｇのCaCO₃を加えた。 調製後、その培地を 121℃で30分滅菌し、そして直径９cmのペトリ皿当り30mlの 割合で分注した。その皿に種々のコロニーから集めた胞子を接種し、そして25℃ で９日間インキュベーションした。この時点で皿当り10mlの滅菌H₂O を加え、そ して各形質転換体の胞子を集めた。これらの株をｇ／ｌ表示でコーンスティープ 20、スクロース20及び可溶性トウモロコシ蒸留物(DDS)20を含む接種培地に接種 した。この培地のpHを 5.7に調整し、そして５ｇのCaCO₃を加えた。この培地を5 0mlの上記の培地を含む 250mlのエーレンマイヤーフラスコに分注した。このフ ラスコをオートクレーブの中で 121℃で30分滅菌し、そして冷却後、それらに10⁹ 個の胞子／mlを含む胞子培地１mlを接種した。このフラスコをGallenkampオー ビタルシェーカーの中で25℃にて230rpmで24ｈインキュベーションした。この培 養物のアリコート 2.5mlを先に記載の通 りに調製した30mlの完全生産培地（寒天抜き）を含む 250mlのエーレンマイヤー フラスコそれぞれを接種するのに用いた。発酵は56ｈにわたり実施し、研究した 種々の株における生産されたペニシリンの量、乾燥重量（mg／ml）及びPCL の有 無を決定するために種々の時間においてアリコートを取った。菌糸体を濾過によ り集め、2000容量の滅菌蒸留H₂Oで洗い、そして濾紙で乾かし、そして 1.5ｇの アリコートのウェスト菌糸体(600mg乾燥重量に相当)を１mMのフェニルメチルス ルホニルフルオリド（PMSF）を含む 0.5Ｍのリン酸バッファー溶液pH 8.0の中に 再懸濁し、そしてそれを直ちに音波処理により破砕した。その抽出物を破壊され ていない細胞及び細胞壁を排除するために遠心分離し、そしてその上清液をフェ ニルアセチル−CoA リガーゼ活性を評価するために使用した。この手順は、先に 述べた通り、シュードモナス・プチダの分析のために採用したものに従った（Re f.９及びスペイン国特許第P8902421号）参照）。フェニルアセチル−CoA(PA−Co A)の形成はWaters 600ポンプ、Waters 481検出器、10μｍのNucleosil C18 カラ ム(250×4.6mm)、Wisp 717自動インジェクター及びWatersコンピューターシステ ム（Millenium 2010）より成る高圧液体クロマトグラフィーを利用するHPLCによ りモニターした。注入容量は50μｌとした。移動相として 0.2Ｍのリン酸カリウ ムpH 4.5／イソプロパノール(90：10 vol／vol)を利用した。流速は１ml／min とし、そして選定した波長は 254nmとした。これらの条件下で、PA−CoA は 19. 30分の保持時間を有し、そしてフェニル酢酸（PA）は10.8分の保持時間を有した 。様々な形質転換体の分析はフェニルアセチル−CoA リガーゼ活性がその全てに おいて検出されることを示し、一方これはコントロールにおいては出現せず（表 II参照）、このことはシュードモナス・プチダＵのpcl 遺伝子がペニシリウム・ クリソゲヌム において発現されることを 示す。このようにして得られた形質転換体はスペイン国Standard Cultures Coll ectionに寄託され、登録番号CECT20192 が付与されている。 培養培地の中に蓄積したペニシリンＧの量はWaters510 ポンプ、Varian2050検 出器、５μｍのHyperil ODS カラム(100×4.6mm)及びWisp 717自動インジェクタ ーより成る設備を用いるHPLCにより評価した。注射容量は20μｌとした。移動相 として0.05Ｍの酢酸アンモニウムpH 6.8／メタノール(60：40 vol／vol)を使用 した。流速は 0.8ml／分とし、そして選定した波長は235nm とした。これらの条 件下で、ペニシリンＧの保持時間は 4.5分であった。表IIからわかる通り、全て の形質転換体がコントロール株よりも84％〜121％多くペニシリンＧを生産し、 このことはペニシリウム・クリソゲヌムにおけるシュードモナス・プチダＩのpc l の発現がこの糸状菌でのペニシリンＧの合成を著しく高めるのに役立つことを 間違いなく実証する。 図面の詳細な説明 図１ ペニシリウム・クリソゲヌムにおけるペニシリンＧＣベンジ ルペニシリンの生合成のための経路。 ACVS：ACVシンテターゼ Ｐ．クリソゲヌム：424kDa Ａ．クリソゲヌム：415kDa PM Ａ．ニドゥランス：422kDa Ｓ．クラブリゲルス：283kDa リソバクター・ランタムゲヌス：411kDa ノカルディア・ラクタムドゥランス：404kDa pH ： 7.5−8.2 Ｔ ：24−26℃ IPNS：イソペニシリンＮシンターゼ 図２ トランスポゾンTn５による突然変異誘発のプロトコールの図式。 Rif ：リファンピシン20μｇ／ml；Km：カナマイシン25μｇ／ml； PA ：フェニル酢酸；Fru ：フルクトース；Ma：Ref.13記載 の組成を有する最少培地。 １ 混合段階 ２ 12000rpmで３分の遠心 ３ エッシェリヒア・コリ＋シュードモナス・プチダの沈殿 物。その40μｌを集め、そしてLB培地（Ref.13）を有す る皿上のフィルターに載せる。 ４ 希釈 ５ 選別 Ａ 突然変異体 図３ インタクトシュードモナスのpcl 遺伝子 図４ ペニシリウム・クリソゲヌムのpcbAB 遺伝子のプロモーター のコントロール下で発現するシュードモナスのpcl 遺伝子 図５ 開始剤として表示のオリゴヌクレオチドを用いる、pcl 遺伝 子の配列の一部の増幅。 （１）シュードモナス・プチダＵ；（２）エッシェリヒア・ コリ＋pUC18＋2090pbインサート； （３）エッシェリヒア・コリ＋pUC18(インサートなし)； （４）ペニシリウム・クリソゲヌムWis 54−1255コントロール； （５）〜（８）構築体 pALPs９の中にpcl 遺伝子を含むペニ シリウム・クリソゲヌムの種々のCECT20192 形質転換体； （９）pcl遺伝子のないpALPs９に類似の構築体を含むペニ シリウム・クリソゲヌムの形質転換体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:82） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:40） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ロドリゲス オリベラ，エリアス スペイン国，エー−24006 レオン，カリ ェ レイェス カトリコス，21 (72)発明者 ガルシア アロンソ，ベレン スペイン国，エー−24007 レオン，カリ ェ ヤルディン ドゥ サン フランシス コ，13 (72)発明者 フェルナンデス カニョン，ホセ マニュ エル スペイン国，エー−28002 マドリッド, カリェ ベラスケス，146 (72)発明者 バーレド フエンテ，ホセ ルイス スペイン国，エー−24003 レオン，カリ ェ モイセス ドゥ レオン，ボルケ 15 (72)発明者 デエス ガルシア，ブルーノ スペイン国，エー−24003 レオン，カリ ェ ヘネラリシモ，７ (72)発明者 スレイスナー サンチェス，カルメン スペイン国，エー−24010 レオン，カリ ェ エスラ，10 (72)発明者 モレノ バリェ，ミゲル アンゲル スペイン国，エー−24009 レオン，カリ ェ ユアン ドゥ ラ コサ，３ (72)発明者 サルト マルドナド，フランシスコ スぺイン国，エー−28023 マドリッド, プラド ドゥ ソモサグアス，カリェ デ ル アグレゴ，33 (72)発明者 ルエンゴ ロドリゲス，ホセ マリア スペイン国，エー−24003 レオン，カリ ェ ヘネラリシモ，３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ペニシリウム・クリソゲヌムにおけるペニシリンＧ（ベンジルペニシリン ）の生産性を高めるための方法であって、酵素フェニルアセチル−CoA リガーゼ をコードするpcl 遺伝子のこの糸状菌における発現を特徴とする方法。 ２．前記pcl 遺伝子が細菌シュードモナス・プチダＵより獲得したものである ことを特徴とする、請求項１記載の方法。 ３．ペニシリンＧ（ベンジルペニシリン）の生産性が、非形質転換コントロー ル生物と比べ、形質転換された生物において10％以上高まっていることを特徴と する、請求項１又は２記載の方法。 ４．SEQ ID NO : １に記載のヌクレオチド配列を特徴とする、シュードモナス ・プチダ Ｕのpcl 遺伝子。 ５．図３の制限地図により規定される、請求項４記載の組換DNA。 ６．シュードモナス・プチダＵの酵素フェニルアセチル−CoA リガーゼに対応 する、SEQ ID NO : ２として特定されるアミノ酸配列。 ７．請求項４もしくは５記載のDNA 化合物又はそのフラグメントを担持するベ クター。 ８．pcl 遺伝子自体のそれとは異なる発現シグナルのコントロール下にある、 請求項７記載のベクター。 ９．前記発現シグナルがペニシリウム・クリソゲヌムから得られるものである ことを特徴とする、請求項８記載のベクター。 10．プラスミドより成ることを特徴とする、請求項７〜９のいづれか１項記載 のベクター。 11． pALPs９より成ることを特徴とする、請求項10記載のプラス ミド。 12．制限条件下で請求項４又は５記載のDNA 化合物とハイブリダイズできるこ とを特徴とするヌクレオチド配列。 13．請求項７〜11のベクター内に全体的に又は部分的に組込まれている請求項 ４又は５記載のDNA 配列が導入されていることを特徴とする、形質転換宿主生物 。 14．原核細胞、好ましくはエッシェリヒア・コリ又は放線菌より成ることを特 徴とする、請求項13記載の形質転換宿主生物。 15．原核細胞、好ましくはペニシリウム・アスペルギルス・アクレモニウム又 はサッカロマイセス属の原核細胞より成ることを特徴とする、請求項13記載の形 質転換宿主生物。 16．ペニシリウム・クリソゲヌム、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergil lus nidulans ）、アクレモニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）又 はサッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisae)より好適に成るこ とを特徴とする、請求項15記載の形質転換宿主生物。 17．CECT 20192又はその突然変異体もしくは形質転換誘導体の純株より成るこ とを特徴とする、請求項16記載の形質転換宿主生物。 18．ペニシリンＧ（ベンジルペニシリン）の生産性の高まった形質転換生物を 獲得するための方法であって、下記の操作 ａ）SEQ ID NO : １又はそれに由来する組換DNA の化合物を全体的に又は部分 的に担持するベクターを構築する、 ｂ）前記ベクターを宿主生物に導入し、SEQ ID NO : ２を発現する形質転換生 物を得る、 ｃ）非形質転換コントロール生物と比べ、ペニシリンＧ（ベンジルペニシリン ）の生産性が80％以上高まった形質転換生物を選別する； を含んで成ることを特徴とする方法。 19．構築したベクターが請求項７〜11に記載のものであることを特徴とする、 請求項18記載の形質転換生物を獲得するための方法。 20．前記形質転換宿主生物が請求項13〜17に記載のものである、請求項18記載 の方法。