JPH05502592A - 形質転換株の選択マーカー系 - Google Patents
形質転換株の選択マーカー系Info
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- JPH05502592A JPH05502592A JP3517460A JP51746091A JPH05502592A JP H05502592 A JPH05502592 A JP H05502592A JP 3517460 A JP3517460 A JP 3517460A JP 51746091 A JP51746091 A JP 51746091A JP H05502592 A JPH05502592 A JP H05502592A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
形質転換株の選択マーカー系
本発明はカビの株、特にペニシリウム クリソゲナム(Penicillium
crysoge−ローの形質転換株の選択系に関する。
更にこの発明は、例えばペニシリウム クリソゲナムから分離されるアセチル及
びペニシリンVの生産に最も応用される生産菌である。ペニシリンGあるいはV
は、それ自体抗生物質として使用されるか、もしくは半合成β−ラクタムに化学
的に転換される。ペニシリウム クリソゲナムは、工業的応用についての長い記
録を有している。第二次世界大戦以来、それは世界中で、ペニシリンを大規模生
産する為に選ばれた微生物である。何年もの間、ペニシリン生産工程の収率にお
いて有意義な改良が、株の改良及び工程開発の両者によって成されてきた。株の
改良は、ペニシリン生合成にかかわる代謝系路中、鍵となる酵素に標的を置いた
変異誘発や化学的物理的方法によるランダムな突然変異を適用し、続いてペニシ
リン力価の増加を伴う株を広く選択することにより行なわれている。総説として
例えばHersbach、 G、J、M、、 Van der Beek、 C
,P、及びvan Dijck、 P、W、M著「ザ・ペニシリン、特性、生合
成及び醗酵J Biotechnology of 1ndustrial A
ntibio−tics、 E、 Van Panvne (編集) 、Mar
cel Dekker社にューヨーク)及cFRowlands。
R,T、 、εnzyme^ficrob、 Technol、6巻1984年
3−10ページ及び29〇−300ページを参照のこと。
組み換えDNA工学の発展に伴い、株を改良する新規な方法が可能になった。
組み換えDNA技術をいかなる生物あるいは細胞株へも適用する為の必要条件は
遺伝子の転移及び選択もしくは検出系が利用できることであり、それによって、
大多数の非形質転換細胞の中で、組み換えDNAを含む通常は少数の形質転換さ
れた細胞の同定が可能である。β−ラクタム生産性工業株、特にベニツリウムク
リソゲナムの為の有効な遺伝子転移及び選択系の開発は2つの主な理由により。
大変困難である。
第一には、β−ラクタム生産性工業株は、野性型あるいは研究室株よりも、はる
かに形質転換しにくいということが共通の認識である(ingojia & Q
ueener。
Med、 Res、 Rev、 9巻、1989年、245−264ページ)。
工業株が形質転換されにくいという特徴は、これらの株の広範な突然変異に関係
している可能性がある。例えば、株の改良計画の途中で細胞膜や細胞壁の組成及
び/あるいは会合状態に影響を及ぼす変異が工業株に増大し、形態に変化を起こ
すであろう。(Lain著・微生物代謝産物の過剰生産、Vanek及nost
alek(編集)1986年Butter−worth出版社、105−139
ページ)これらの形態学的変化は、例えば菌糸体からのプロトプラストの発生、
プロトプラストの安定性、DNAの取り込み能力、菌糸体へのプロトプラストの
再生等に影響するかもしれない。第二に遺伝子転移及び選択過程がペニシリン生
産の水準に悪影響を及ぼさないということがもう1つの要件である。
形質転換株選択系の開発が困難なのは、ペニシリウム クリソゲナムの遺伝子系
が(例えば菌糸体の多核性や育性サイクルがないので偽似有性的な分析しかでき
ない為に(Pontecorvo et al、、 Adv、 Genet、
5巻1953年141−238ページ))研究し難いものであり、知見が限られ
ているという外部DNAの取り込みを阻害する物理的障壁(Peberdy著、
カビにおける細胞壁と膜の生化学; Kuhn。
P、J、 Trinci、 A、P、J、、 Jung、 M、J、、 Gos
sey、 M、W、、 Copping、 L、G、 (!閨@Springe
r−
Verlag 社、ベルリン、1989年、5−30ページ)及び、形質転換す
るDNAの安定な染色体外での複製を可能にするようなりNA成分が欠損してお
り、そのため形質転換するDNAを宿主のゲノム中に組み込まれなければらなず
、形質転換の頻度を非常に低くしてしまうということにも関係している。
今までに、形質転換株選択の為の幾つかの系がベニツリウム クリソゲナムにつ
いて報告されている。しかしながら、これらの選択系の開発は、科学的見地から
みれば、それ自体宵月であるけれども、現在使用されている選択系は、それぞれ
β−ラクタム生産性工業株、特にペニシリウム クリソゲナムの株へのそれらの
応用を難かしくする以下の欠点を1つもしくは数個有している。
第一にいくつかの選択系では、選択される表現型が異種DNAによる、ベニツリ
ウム クリソゲナムであると称されている(EP−A−240250; EP−
A−215539: EP −A−225078; Cantroral et
al、、 Bio/lech−nology 5巻、1987年494−49
7ベーノ: Beri and Turner、 Curr、 Genet。
11巻、1987年639−641ベージ; Kolar et al、、 G
ene 62巻、1988年127−134ページ; 5tah1等、App、
Microbiol、 Biotechnol、26巻1987年237−2
41ベージ; Picknett and 5aunders、 FEMS M
icrobiol。
Lett、60巻、1989年165−168ページ: Whitehead
et al、、 Mo1. Gen。
Genet、216巻、1989年408−411ページ)。一般に組み換えD
NA工学についての公の一般的関心の結果として、異種DNAより相同のDNA
から用が好まれている。更に、実用上の見地からみると、異種選択マーカーより
相同の選択マーカーを使用する場合の方が、形質転換の頻度は通常は高い。
第2に、いくつかの選択系は、ペニシリウム クリソゲナムの栄養要求変異株の
発生に依存する(EP−A−235951;EP−A−260762;Pick
nett虹虹、’、 Curr、 Genet、12巻1987年449−44
5ページ; Diez et al、。
Curr、 Genet、 12巻1987年、277−282)。概して、特
定の栄養要求変異株の分離は変異株の広範な同定を必要とし、その為にかなり時
間がかかるものである。このことは異なる宿主を(例えば工業株改良計画におい
て)使用する場合には非常に不利益になる。それに加えて、さらに重要なことに
は、ペニシリウム クリソゲナムの工業株に栄養要求性突然変異を導入すると、
ペニシリンの生合成が容認できない程低下してしまうことが多い。この現象は、
所望の栄養要求性突然変異を目的の株に導入する為に必要な突然変異処理の結果
かもしれないし、特定の栄養要求性の欠点それ自体に関係するかもしれない(例
えばO8υl1iyanand Pirt、 J、 Gen、 Microbi
ol、 76巻、1973年、65−75ページ及び5tahleta+、、同
著書を参照のこと)。
それ故に、ペニシリン生産水準を上昇させるような株の開発を目的とするツ丑ン
リウム クリソゲナムの増殖計画においては、突然変異誘発を必要とする遺伝子
マーカーの導入は通常回避される(例えばLein著・微生物代謝産物の過剰生
産、Vanek、 Z、、 Ho5tA1ek、 Z、(り 、 Butter
worths社ボストン、1987年105−140ページを参照のこと)。
結論として、支配的な選択系あるいは自発的な突然変異に対する陽性の選択によ
って得られる宿主を用いる選択系のような、宿主の突然変異を必要としない相同
の選択系が、非常に好まれる。最初の選択系の例は半支配的な相同の射±q選択
系である(EP−A−311272)。しかしながら蛙浅選択系が非常に不利な
のは、形質転換の頻度が大変低く、その為にこの選択系の適用が制限されるから
である。2番目の選択系の例は、塩素酸塩耐性に対する陽性の選択によって得く
の異なる遺伝子座類における自発的な突然変異によって得られるので、この系の
障害となるn1aD変異株を同定する為には特別な生育試験が必要であり、これ
がこの系の欠点となる。堡旦選択系が不利であるもう1つの点は、ベニツリウム
クリソゲナムの大多数の形質転換株が遺伝上不安定である(未成熟)という観
察がなされていることである(Gouka et al、、 J、 Biote
ch、20巻、1991年189−200ページを参照のこと)。
第3に、β−ラクタム生産株の工業株改良計画に組み換えDNA技術を適用する
為には、一度形質転換した株を容易に2度目の形質転換できることが大変重要で
ある。現行の選択系を用いては、継続的な形質転換を存効に行うことができるこ
とは示されていない。この特性は、ペニシリウム クリソゲナム及び他の糸状菌
における遺伝子発現の調節に関する科学的研究にも関連している。
要約すると、β−ラクタム生産微生物、特にペニシリウム クリソゲナムの工業
株への応用に適する、簡便かつ再利用可能な相同の選択マーカーの使用に基づく
、ペニシリウム クリソゲナムに対する形質転換株選択系は利用できない。
特にカビ、更にはカビの中でもβ−ラクタム生産株、特にはペニシリウム クリ
ソゲナムである形質転換株の選択の為の系であって、現行の選択系の欠点が無い
系が現在開発されている。この選択系は、アセチル−CoA合成酵素をコードし
ているペニシリウム クリソゲナム facA遺伝子を用いた形質転換による、
好ましくはβ−ラクタム生産株、特にペニシリウム クリソゲナムのfacA変
異株のfac m補性に基づいている( facはフルオロアセテート(f I
uoroacetate)耐性株を表わす)。
最近では、アスペルギルス ニドゥランス(A、 n1dulans)のfac
Δ遺伝子及びノイロスポーラ クラップCN、 crassa)の対応するac
u−5遺伝子が分離さ札ヌクレオチド配列分析によって特徴づけられている(S
andeman and Hynes、 Mat。
Gen、 Genet、 218巻1989年87−92ベー) ; Thom
asら、Mo1ec、 Micro−biol、2巻、1988年、599−6
06ページ; Connerton et al、、 Mo1ec。
Microbiol 、 4巻1990年、451−460ページ)。トウモロ
コシU病の病原ウスティラボ メイディス(Ustilago maydis)
のfacA遺伝子も分離されている(Hargraaves and Turn
er、 J、 Gen、 Microbiol、135ページ、1989年26
75−2678ページ)。Fac変異株はアセテートを唯一の炭素源として生育
できないという表現型によって特徴づけられる。それ故にFaC”形質転換株は
それらがアセテートの利用性を再取得したことによって選択可能となるべきであ
る。しかしながら、アセテート利用性に基づく有効で直接的な形質転換株選択系
の開発は、アスペルギルス ニドゥランス及びノイロスポーラ クラッサ(Ba
llance and Turner、 Mo1. Gen、 Genet、2
02巻、1986年、271−275ページ; Connerton et a
l、、同車)及びウスティラボ メイデイス(Hargreavesand T
urner、同車)については困難なようである。
これらの変異株に陽性の選択を行なうことによって、驚くほど有効に分離できる
。
(Casselton and Ca5selton、 Mo1. Gen、
Genet、 I 32巻、1974年、255−264ページ)とそれぞれ名
付けられた3つの別個の遺伝子座における突然変異が同定されており、それらは
フルオロアセテート耐性のアセテート非利用表現梨同上)多数のフルオロアセテ
ート耐性でアセテート非利用性変異株の分離が報告されている。この複雑な突然
変異株のセットに対して、ペニシリウム クリソゲはとんどすべてのフルオロア
セテート耐性変異株はアセテート非利用性株であり、を育している。
ことによって確立された。
本明細書において相同の選択マーカー(homologous 5electi
on marker)とは、母子も提供される。本発明には異なるヌクレオチド
配列を含む遺伝子も含ま楳例えばその配列は同じアミノ酸配列をコードするが異
なる塩基を多くとも15%まで有していてもよい保存的突然変異あるいは異なる
塩基は約10%より少なく、更に通常は約5%よりも少なく、そして好ましくは
置換もしくは脱落しているアミノ酸は1%以下で挿入されたアミノ酸が5%より
も少ない非保存的突然変異を伴う(ここで百分率は天然由来のアミノ酸数に基づ
く)。
他の選択系よりも該facA選択系が有利な他の点は、アセテート含有選択培地
でアセテート利用コロニーが急速に胞子形成することであり、これにより形質転
換株選択方法は著しく改良され促進される。形質転換するDNAがゲノム中に組
や未知のゲノム部位に組み込まれた異なるタイプの形質転換株を産生ずるのに適
する。環状二重鎖DNAを用いた単一コピーFacA”形質転換株の調製は驚く
程選択系のもう1つの大きな利点である。
該facA選択系は、好ましくはペニシリウム クリソゲナムである宿主に選択
不可能なりNAを導入する為に適用可能である。選択不可能なりNAは、例えば
ペニシリン、セファロスポリン、あるいはセファマイシン生合成遺伝子のような
選択不可能なりNAを用いることによって、好ましくはペニシリウム クリソゲ
ナムである宿主においてβ−ラクタム化合物を生産させ、あるいはその生産を促
進させる為に使用され得る(Veenstra et al、、 J、 Bio
techn、17巻、1991年、81−90ページ及びCantwell e
l al、、 Curr、 Genet、 17巻、1990年、213−22
1ページ)。
本発明は、DNAで形質転換された微生物の形質転換体を選択する方法であって
、以下の工程ニ
アセチルCoA合成酵素が作用しないか又は欠損している微生物の変異株を分離
する工程。
該DNA及びペニシリウム クリソゲナムのアセチル−CoA合成酵素の生産に
有効な発現系で、該変異株を同時形質転換(cotransforming)す
る工程、及びアセチル−COA合成酵素活性をその異化(catabolism
)の為に必要とする炭素源を含有する培地で生育能力について該微生物の形質転
換体を選択する工程を含む方法を提供する。
更に本発明は、β−ラクタム化合物を生産させ、又はその生産を促進させる為に
必要な遺伝情報をコードするDNAで該変異株を同時形質転換する工程を含む上
述の選択方法を適用することによって微生物の形質転換体中でβ−ラクタム化合
物を生産させ、あるいはその生産を促進させる方法を提供する。
最後に本発明は、特にペニシリウム クリソゲナムから分離された配列表1に記
載したヌクレオチド配列を有するfacΔと名付けられた遺伝子、及び該遺伝子
を含むベクター及び宿主を提供する。また1つあるいは両方の発現シグナルが、
同じあるいは別の生物から得られる他の発現シグナルによって置き換えられた図
1 ラムダEMBL−3ファージfacA7に含まれるペニシリウム クリソゲ
イブリッドシグナルの強度を泳動したDNAの量を表わす内部標準として使用し
た。DNAサイズ−マーカーの位置を示してあり、PはpPc2−3;wtはペ
ニシリウム クリソゲナム;1−14は異なるFaCA+形質転換株を表わす。
及び対応するアミノ酸配列。
配列番号R2ペニシリウム クリソゲナムのアセチルCoA合成酵素のアミノ酸
配列。
ペニシリウム クリソゲナムの工業株の組み換えDNAによる形質転換は当技術
分野でよく知られている方法を用いて達成できる(Peberdy、 Myco
l、 Res、 93巻、1989年、1−20ページ)。本発明の好ましい懸
様においては、菌糸体を新鮮な培養物から集菌し、浸透圧的に安定な媒体中で、
例えばノボザイム(Novozyme) 234等による酵素的処理によって、
プロトプラストをフィラメント状の該菌糸体から調製する。その後DNAとプロ
トプラストとをCa2+を含む溶液で混合する。通常は、数μgのDNAを10
7−10’個のプロトプラストに加える。その後、プロトプラストによるDNA
取り込みを媒介する為にその混合物にポリエチレングリコール(PEG)を添加
する。最後に、浸透圧的に安定な選択培地上にプロトプラストを置く。探的細胞
中にDNAを導入する他の技術、例えばエレクトロボーシーション(Riche
y et al、、 Phytopathology 79巻、1989年84
4−847ページ)、及びバイオリスティック” (Du Pont粒子伝達系
)法(Armaleo et at、、 Curr、 Genet、 17巻、
1990年、97−1.03ページ)、あるいはリポソーム輸送系(Felge
r and 1(ola Focus I 1巻、1989年21−25ページ
)による形質転換が報告されている。糸状菌へのこれら技術の応用はまだ初期段
階であるが、本発明の範囲内で、ペニシリウム クリソゲナムの形質転換の為に
、いかなる化学的、物理的、あるいは生物学的方法を応用してもよい。
ここに述べた選択系を用いて得られる典型的な結果は、1)lμgのDNAあた
り1−100個の形質転換株という程度での形質転換頻度、及び2)すべての安
定な形質転換株において、組み換えDNAがゲノムに組み込まれていることか、
観察されることである。これらの結果は糸状菌の形質転換系に典型的である(R
ambosekand Leach、 Cr1tical Rev、 Biot
ech、6巻、1987年357−393ベ一ジ2Timberlake an
d Marshall、 5cience244巻、1989年、+313−1
317ページ; Peberdy、 Mycol、 Res、93巻、1989
年1−20ページ)。
形質転換の頻度に関しては、例えばtrpC選択法についてPicknettに
より述へられているように(Picknett、 Br1tish Thesi
s、 DX82490. Br1tish Library。
Document 5upply Centre、 Boston Spa、
Wetherby、 UK) 、形質転換法における反応パラメーターを系統的
に変化させることによってfacA形質転換法の効率が更に増大する可能性があ
る。形質転換の過程で起きる組み込みの性質に関しては、21i鎖の環状DNA
による形質転換が、ベクターの3つの異なる組み込みタイプ、即ち未知のゲノム
部位への組み込み(“タイプ■”組み込み)、内在するfacA遺伝子座への組
み込み(“タイプI”組み込み)、及び遺伝子転換あるいは変異株対立遺伝子の
遺伝子置換による組み込み(“タイプ■“組み込み)という結果となることが観
察されている(Rambosek and Leach、 Cr1tical
Rev、 Biotechn。
6巻、1987年357−393ページ; Temberlake and M
arshall、 5cience244巻、1989年1313−1317ペ
ージ)。
通常は、幾つかの形質転換体は形質転換するDNAを複数コピー含む。これらの
複数コピーはゲノム全体に散在しているか、もしくはそれらは単一の遺伝子座に
一列に整列して組織化されている。典型的な複数コピー形質転換体は、形質転換
されたDNAを散在及び整列の組み込みパターンで含んでいる。形質転換された
DNAに再整列が起こることもある。形質転換するDNAのゲノムへの組み込み
による形質転換が慣例であるけれども、形質転換するDNAを安定に染色体外に
維持した安定な形質転換株が得られるかもしれないことにも留意すべきである。
そのように染色体外に安定に維持する状況は、自律的複製(匹)に必要な配列及
び/あるいは安定な染色体外複製に必要な他の配列が、形質転換するDNAの一
部分であるときに得られる。これらの配列は、形質転換工程に先だって普通に用
いられる遺伝子工学技術によって形質転換するDNAに加えられてもよいし、あ
るいはそのかわりに、形質転換工程の間にインヴイポでの挿入及び切断によりゲ
形質転換するDNA (transforming DNA)は、通常ベクター
とよば法典型的には以下の機能的な要素から成る・
血における形質転換体の選択に必要な、ペニシリウム クリソゲナム内で機能す
る選択マーカー。発現シグナルとは、本明細書において転写の効率的な開始と終
結、及び翻訳の効率的な開始と終結に必要かつ十分なシグナルと定義される。
選択マーカーは、好ましくはそれ自身から発現したもので、細胞内シグナルであ
り、もっとも、該マーカーの適切な発現は、他のベニツリウム クリソゲナム遺
伝子の発現シグナル、例えばベニツリウム クリソゲナムホスホグリセレートキ
ナーゼ(pgk )遺伝子(Van Solinger et al、、 Nu
cl、 Ac1d Res、 16巻、1988年11823ページ)あるいは
オロチジン−5′−リン酸−デカルボキシラーゼ(pyrG)遺伝子(EP−A
−260762)の発現シグナルあルイハ、例えばy、<ベルギルス ニドウラ
ンスゲリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gpdA)遺伝子(P
untら、Gene56巻、1987年、117−124ページ)から得られる
異種の非−ペニシリウム クリソゲナム発現シグナルによってもなし得ると考え
られる。
一任意に、ベクターは組み換えDNAのファージ粒子への存効なインヴイトロで
のパッケージングに必要なラムダファージコス配列も含む。
−また別に、ベクターは任意にアスペルギルス ニドウランスのans−1配列
(BaLlance and Turner、 Gene36巻、1985年、
321−331ページ:列も含む。
一更に、ベクターは1以上の所望の非選択可能(non−selectable
)なりNA配列を任意に含む。
非選択可能なりNAのペニシリウム クリソゲナムへの導入は、非選択可能なり
NAか選択可能なマーカーに物理的に連結している時に最も効率的に起こる。
しかしながらこの連結は非選択可能なりNAを形質転換する為の必要条件ではな
い。異なるDNA分子を用いることによって、非選択可能なI)NA及び選択可
能なマーカーをペニシリウム クリソゲナムに導入することも可能である。形質
転換の為に使用される選択系及び異なるDNAのモル分率に依存して異なるDN
A分子についての同時形質転換率は数%からおよそ90%の範囲である(例えば
選択可能なりNAでペニシリウム クリソゲナムを同時形質転換する応用例にも
関する。本出願において同時形質転換は、ベクター配列の存在あるいは非存在下
で、物理的に選択マーカーに連結しているかあるいはしていない非選択可能なり
NAと共に選択マーカーを形質転換することと定義される。
非選択可能なりNAは好ましくはペニシリウム クリソゲナムに由来するが、本
発明の出願においては、非選択可能なりNAはペニシリウム クリソゲナム以外
の起源に由来してもよいと考える。エソエリヒア 三ユにおけるベクターの効従
って、例えば適切な制限酵素での消化及びゲル電気泳動による精製によってさニ
シリウム クリソゲナムの形質転換に先だって、形質転換するDNAからこれら
の配列を除去することができる。
本発明の好ましい態様では、形質転換するDNAは相同のペニシリウム クリア
セテートに自然耐性であることに関して陽性の選択を行なうことによって、突然
変異無しに得られるということがもう1つの好ましい態様である。フルオロアセ
テートに耐性な該アセテート非利用株はアスペルギルス ニドウランスのfac
A。
ことによって得られる。
本発明の更に別の好ましい態様では、facA変異の相補性について形質転換株
をアセテート含有培地での直接選択によって評価するが、もつとも異([、,1
−アセチルCoA合成酵素活性を必要とするエタノールのような他の炭素源等が
FacA′″形質転換株の選択においても使用できる可能性か認められている。
また本発明の好いは取り換えによって得ることができるが、好ましくはフルオロ
アセテートに自然耐性であることについて陽性の選択をすることにより得られる
。
以下の非制限的な実施例により本発明がさらに具体的に示される。
(実施例1) ペニシリウムクリソゲナムのアセテート非利用変異株の分離度、
Vonek and Ho5talek (AI) 1986年Butterw
orth Publishers、l O5−139ベーノ; Barredo
et al、、 Curr、 Genet、 16巻、1989年、453−
459ページ))である。これらの変異株は炭素源としてアセテートを利用でき
ない。
およそ10’−1,0″コの胞子を、次の成分の固体選択培地25mj!上にプ
レートした(l OOOmlにつき、pH6,5)ニゲルコース、5g :Na
N0.、2g +KCA。
]、 g: KHtPOt・3Hz0. 3 g: Mg5O,・7H20,0
,5g+フルオロアセテート(アルドリッチN Og及び寒天(オキソイ聞o3
)、 I 5 g及びI O0Oml当りZnSO4・7+(20、22g
; )IJOi、 l1g : 1.InfJt−4HxO,5g : Fe5
Ot −7H120,5g : Cobf、 −
61(20,1,7g : Cu5O−・5HzO11,6g : Na、Mo
b、−21(so、 1.5g: EDTA、 5gを含むP
mj’の微量元素溶液。
フルオロアセテート耐性(fac)コロニーを選択培地上で精製し、続いて、ア
セテート培地でそれらの生育が不可能であることを調べた。アセテート培地は、
上記の最少培地においてグルコースとフルオロアセテートを100mM濃度の酢
酸カリウムに置き換えるという修正をしたものである。すべての培養は25°C
で行なった。
安定なアセテート非利用変異株(復帰突然変異の頻度は酢酸塩培地で調べた場の
頻度で得られた。
(実施例2) ペニシリウム クリソゲナムのアセテート非利用株におけるアセ
チル−CoA合成酵素活性
フルオロアセテート耐性のアセテート非利用ペニシリウム クリソゲナム株P2
をアセチル−CoA合成酵素活性の測定によって生化学的に更に特徴づけた。E
P−A−357119で述べられている標準的な生産培地で、48時間振盪フラ
スコ中でこの株を生育させた。その後菌糸体を集菌し、凍結乾燥して乳鉢で、粉
砕した。粉砕されたおよそ0.4gの菌糸体を、100mMトリス−塩酸pH7
,3:0.4mMのEDTA:0.1 mMのDTT及びO,1mMのPMSF
を含む10m1の緩衝液で、4°Cで45分間抽出した。該抽出物を12.00
0gで25分間遠心分離して、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液を調製後、直
ちにタカオによって述べられている方法(TakaoらAgric、 Biol
、 Chem、 51巻、1987年145−152ページ)に基本的に従い、
CoAのアセテート依存性の消耗をEl1man試薬(5,5’ジチオ−ビス−
(2−ニトロ安息香酸))(DTNB)で測定することによって、アセチル−C
oA合成酵素活性を決定した。トリス−塩酸(200mM、pH8,0) 、K
CI!(100mM)及びMgC1t (20mM)を含む750μlの混合物
Aに、ATP (40mM) 、LiCoA (15mM)及びアセテート(2
0mM)を含む150μlの混合物Bを添加した。この混合物に600μノの無
細胞抽出液を添加することにより測定を開始した。測定は30°Cで行なった。
異なる時間間隔で反応混合物から試料の一部(150μl)を採取した。その試
料を100μjl’のTCA(10%w/v)に添加した。その後100μfの
0.6N NaOHで溶液を中和し、1.2mj!のリン酸塩(0,2M、pH
7,4)で緩衝化した。その後100μmのDTNB溶液(0,2Mリン酸緩衝
液pH7,4中に4 mg/ml’)を添加した。試料を3000rpmで5分
間遠心分離した後呈色反応の吸光度を分光光度計(LKB)を用いて413nm
で測定した(Heraeus labofuge M)。
表1に提示した典型的な結果から、アセテート非利用変異株の大部分にアセチル
−CoA合成酵素活性が欠失しているか、あるいはこの酵素活性が非常に低下し
ていることかわかる。
一分間につきmg蛋白当りの任意ユニットで表わしたペニシリウムクリソゲナム
P2及びいくつかのアセテート非利用性P2亜株におけるアセチル−CoA合成
酵素の相対活性P−酢酸塩非利用体1 nd
(実施例3) ペニシリウムクリソゲナムfacA遺伝子の分離と特徴づけ化学
合成されたハルオリゴヌクレオチドプローブを、ペニシリウム クリソゲナムP
2の染色体DNAの制限酵素消化物を含むサザーンプロットで調べた(図示せず
)。標準的な方法に従い、γ−(−32P)−ATP及びT4−ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5′末端をラベルした(Alan
1a−tiS et al、著:分子クローニング、研究室マニュアル、Co1
d Spring I(arbor La−boratary、1982年及び
1989年(第2版))。
該オリゴヌクレオチド配列はアスベルギルスニドウランス 魚釣遺伝子及び相4
5+−460ページ)。
該プロットのハイブリダイゼーション及び洗浄を56°Cで行ない、最終回の洗
浄には6XSSC(0,9M塩化ナトリウム、0.09Mクエン酸ナトリウム)
を使イブリッドシグナルを生じさせ、その後、当技術分野でよく知られている方
法(λ1aniatisら、同著書)でペニシリウム クリソゲナムのゲノムラ
イブラリーのスクリーニングに用いた。
ベニツリウム クリソゲナムのfacA遺伝子を、Maniatisらによって
述べられているような(同上)標準的な方法を用いて分離及び特徴付けを行なっ
た。
ハイブリダイズ陽性のいくつかのファージのDNAを精製した。このDNAを制
限酵素分析により更に特徴付けた。これらのファージ内でクローン化されたさニ
ソリウム クリソゲナムDNA上のfacA遺伝子の位置をfacA特異的オリ
ゴヌクレオチドプローブによる制限酵素消化物のサザーンプロット分析により決
定した。
対照実験では、ハイブリダイズしている同一の断片を、ペニシリウム クリソゲ
+Aの染色体DNAにおいて検出した。これらの方法によって、ファージfac
A7−中に存在する6、5にbPstl断片(図1)が、ベクターp Blue
script@ I[(Strata−gene、 La Jolla)に該f
acA遺伝子をサブクローニングするのに適する断片であると同定した。得られ
たプラスミドをpPC2−3と命名した。
該facA遺伝子をヌクレオチド配列分析によって更に特徴付けた、配列表の配
列1を参照のこと。これらのヌクレオチド配列をアスペルギルス ニトロランス
の(保存的なアミノ酸の変化を含む)。相同性は、Micro Gen1e”バ
ージョン7.0配列分析ソフトウェア(Beckman)を用いて決定した。
lの完全培地(YPD;1%酵母エキス、2%ペプトン、2%グルコース)で、
1mj!当り2.10’の胞子を培地に接種し、その後25℃、300 rpr
nの回転培養器で18時間培養することによって、生育させた。この培養後、ミ
ラクロス濾過ラップ(Calbiochem)で培地を濾過することによって菌
糸体を集菌した。0.63M NaCf及び0.27 M CaCI xを蒸留
水中に含む50m1の滅菌した洗浄緩衝液で菌糸体を洗浄し、菌糸体を含むフィ
ルターをタオルの間でしみ込ませることによって、過剰の緩衝液を除去した。滅
菌チューブ内で菌糸体の重さを量り、500m1 コニカルフラスコに移し、そ
こへ100mgノボザイム234 (NOVONordisk)を含む緩衝液(
0,53MNaCj!、0.27 M CaC12)を菌糸体1グラムにつき2
0m1添加した。30−60分分間中かな振盪(80rpm)をしながら25℃
でインキュベートすることによって、ブ0ドブラストが形成され、その過程を顕
微鏡で追った。懸濁液をグラスウールで濾過し、等量の冷却した5TC10,6
3M NaC1緩衝液(1,2ソルビトール、10mMトリス/pH7,5,5
0mM CaCf 2)で洗浄し、その後50m1のコニカルチューブに人ね、
スウィングローターを用いて4°CC250Orpで遠心分離して、遊離プロト
プラストを集めた。そのプロトプラストを50a+1’の5TC10,63MN
aCf緩衝液に2回再懸濁し、遠心分離した。その後プロトプラストを少量の0
.7M KCj7緩衝液で再懸濁し、プロトプラストの濃度を血球計算盤を用い
て決定した、最後にこのプロトプラストを5TC10、53M NaCj!で1
0’/m!!の濃度に希釈し、氷上で保存した。
lOμgの線状あるいは環状pPC2−3DNAを含む滅菌した丸底プラスチッ
クチューブに、プロトプラスト懸濁液を100μlずつ分注添加した。穏やかに
混合した後、プロトプラスト及びDNAの懸濁液を25分間室温に放置した後、
全容量1250μlのポリエチレングリコール(PEG)溶液を添加した(60
%PEG4000 (BDH)、IOmM)リス/pH7,5,50mM Ca
Cj7 x’)。
PEG溶液を200μβずつ2回と、850μ!を1回に分けて添加し、各々添
加する間、穏やかにかつ充分に混合した。この後室温で20分間放置した。放置
後チューブを0.7MKCf緩衝液で満たし、プロトプラストを4”CC125
0Orpで遠心沈降させた。その後、0.9MKCf、50 mM KAc、0
.001%グルコース及び最少培地塩を含む寒天プレートに、プロトプラストを
プレートした。
典型的な実験の結果を表2に示す。ベクターpBluescriptを陰性対照
として使用した。
表2: pPcl3で得られるFacA”形質転換株数pBIuescript
IQ 0
法では、使用される特定のペニシリウム クリソゲナム株に応じてわずかな調整
か必要となることが当業者にはよく知られていることである。
形質転換株は、上述の培地で25°Cで培養すると通常7日以内に胞子を形成す
る。
pPC2−3形質転換株におけるアセチル−CoA合成酵素活性(実施例2に従
って決定した)は、野性タイプの水準あるいはそれ以上に保存された。(表3)
。
表31分にっき■蛋白当りの任意ユニットで表した2つのFaCA”形質転換株
及びP2におけるアセチル−CoA合成酵素の相対活性P2 100
FaCA”形質転換株1 200
(実施例5) 得られた形質転換株のDNA分析得られたFaCA”コロニーの
染色体DNAにおける完全なベクター配列の存在を確かめる為、及び組み込まれ
たベクターのコピーをただ1つしか存していない形質転換株を同定する為に、1
4の異なるコロニーのDNAを精製し、サザーンハイプリダイゼーションによっ
て分析した。コロニーのDNAは、次のようにして分離した。実施例4で述べた
完全培地(それらの50mfを250mj!コニカルフラスコに入れたもの)に
、唯一の炭素源としてI OOmM KAcを含む最少培地プレートに胞子の単
接種(single 5pore 1noculations)を2回繰り返し
た後得られる各コロニーの10’コの胞子を接種した。その培地を回転振盪器で
、30Orpm25°Cで48時間保温し、その後ミラクロス濾過ラップを使用
して菌糸体を集菌し、0.9%NaCl!溶液25mI!で洗浄した。その後菌
糸体の重さを測定し、直ちに液体窒素で凍結した。その後菌糸体の一部分を、液
体窒素をくり返し加えなから乳鉢及び乳棒を用いて細かな粉末が得られるまで粉
砕した。菌糸体g当り10ml!の抽出緩衝液を添加したDNA分解酵素を含ま
ない試験管にその粉末を添加した。抽出緩衝液は次のように調製した 40m1
!の氷冷した5XRNB緩衝液(]、]OMトリスー塩酸pH8,5,1,25
MNaCj!、0.25M EDTA、オートクレーブ滅菌したもの)を80m
1の氷冷したTNS(トリーイソプロピルナフタレンスルホン酸、ナトリウム塩
:20g/l;イーストマンコタック)を加えた80m7の氷冷p−アミノサリ
チル酸(123g/l ;シグマ)に添加した。混合後、氷の上に沈殿物が形成
さね、その上部の液体を菌糸体の抽出に使用した。
凍結した菌糸体の粉末を抽出緩衝液に添加した後、攪拌混合することによって菌
糸体を溶かし、1/2容量のフェノール溶液1を直ちに添加した。フェノール溶
液1はフェノール結晶を脱イオン水で希釈し、そのNaOH溶液でpHを8.0
に合わせて調製した。フェノール溶液lを添加後、菌糸体懸濁液を充分に混合し
、最後の菌糸体試料が粉砕されるまで氷上で保持した。その後1/2容量のクロ
ロホルムを各試験管に添加し、試験管を再び混合しtも一一−次に、スイングロ
ーターを用いて12000rpm、4°Cで1o分間、−管を遠心分離にかけた
。DNAを含む」を、10ml!のフェノール溶液2を添かルだ新しい試験管に
移した。フェノール溶液2は、25 + 1 (V/V)のクロロポルムイソア
ミルアルコール100m1で10’Ogのフェノールを希釈して調製した。その
後1.6■の8−ハイドロキシキノリンを添加し、その溶液をS T E (0
,3MNaC1、IOmM)リス/pH7,5,0,1mM EDTA)で飽和
させた。
攪拌後、DNAを含む試験管を再度遠心分離にがけ、上層を別の試験管に移した
。その後3倍容量の96%エタノール(−20″C保存)を添加し、−70″C
で30分間保持するとDNAが沈殿した。試験管を4℃2000Orpmで15
分間遠心分離にかけ、DNAペレットを70%エタノール(−20”C保存)で
洗浄した。ペレットを真空乾燥器で乾燥させ、ペレットの大きさによって、0.
5−1.0mlのSTEに再懸濁し、エソベンドルフチューブに移した。各チュ
ーブに20mg/mAのRNNaOH溶液10μl添加し、チューブを37℃で
15分間保温した。DNA溶液をフェノール溶液2で2〜3回再抽出して、DN
Aを上述のように沈殿させた。最後に、洗浄したペレットをTE緩衝液(10m
Mhリス/pH7,5;0.1 mM EDTA)に溶解した。
その後サザーンハイプリダイゼイションにより染色体DNAを分析する方法は、
本質的にManiatisら(1982年)に述べられた方法により行なった。
DNAをPst Iで消化し、続いて0.6%のアガロースゲル上の断片を分離
してからニトロセルロースシートに移した。これらのプロットを、pPcl−1
の3!P標識化さイブリダイゼーション及びプロットの洗浄は65°Cで行ない
、最後の洗浄には0.2xsscを使用した。プロットをX線感受性フィルムに
さらした後、得られたハイブリパターンを分析した(図2、B)。この分析から
2つの形質転換株以外のすべてにベクター断片か含まれることがわかった。これ
らの2つの形質転換株(No、7及び11)のパターンは、野性タイプのパター
ンと区別できないものであり、多分変異株対立遺伝子の置き換えあるいは転換の
後にそれらが起こったことを示唆している。6つの形質転換株(No、L 2.
3.6.10及び12)は内在するfacA遺伝子座にベクターのコピーを1つ
しか含まないが、4つの形質転換株(No、4.8.13及び14)は未知のゲ
ノム部位にベクターのコピーを1つしか含まない。2つの形質転換株(No、5
及び9)はベクターの複数のコピー子鹿における組み込み、あるいは未知のゲノ
ム部位における組み込み等の異なる応用に適することが示された。
(実施例6) ペニシリウム クリソゲナムのfacA変異株のペニシリン生産
ペニシリン生産におけるフルオロアセテート選択法の効果を、実施例1で述べた
ような、およそ3.10’胞子から得られる3つの安定なfacA変異株で決定
した。
EPA−357119で以前に述べられている方法を用いて、振盪フラスコによ
る実験、即ち2つの異なる実験でペニシリンの生産量を決定した。表4に結果を
要約する。
表4 ペニシリウムクリソゲナムのfacA変異株のペニシリン生産ペニシリン
の量は任意ユニットで表わす。P2によって生産される任意ユニット数を、任意
に100に合わせる。
P2 facAl 103
P2 FacA5 91
P2 FacA7 109
この実験は、ペニシリン生産性の変わらないfacA変異株が容易に得られるこ
とを示す。親株P2に比べて変わらぬ水準のペニシリン生産を存するFacA”
形質した。そのような形質転換株を第2回目の(1)アセテート非利用faCA
変異株の選択及び(2)実施例4で述べたようにpPC2−3での第2の形質転
換に付した。アセテート非利用変異株が、実施例1で述べたようなフルオロアセ
テートを含む最少培地での陽性選択によって得られた。フルオロアセテート耐性
でアセテ実施例2で述べたように同定した第2世代のfacA変異株は、初代f
acA変異株について述べたような形質転換実験、安定性試験及びベニノリン生
産試験(実施例4.5及び6)を参照のこと)において同様に挙動した。ここで
述べた実験は、facA形質転換系の有効な反復利用が可能であることを例証し
ている。
(実施例8) 相同形質転換
pPC2−3の6.5Kb Pst r制限断片を用いて完全な相同形質転換の
可能性を示す。
プラスミドpPc2−3をエンエリヒアコリ株JM 109 (Yanish−
Perron etal、、 Gene 33巻、1985年103−109ペ
ージ)を使用して増殖させ、半技術分野でよく知られている方法(Maniat
is et al、、同著書)に従って精製した。
精製したプラスミドpPc2〜3をその後制限酵素Pstlにューイングランド
バイオラブズ)で消化し、pBluescriptベクター配列からペニシリウ
ム クリソゲナム由来の配列を遊離させた。ペニシリウム クリソゲナム由来の
配列を含み長さ6.5に1]の断片を、アガロースゲル電気泳動し、さらにアガ
ロースゲルから電気溶出することによってpBluescriptベクター配列
から精製した(Bio−trap丁−1Schle4cher and 5ch
uell)。
完全なプラスミドpPC2−3の使用により得られる頻度と同様であった(表5
)。
表5 : FacA”形質転換株の数
DNA μg 形質転換株の数
p−ブルースクリプト(pBluescript) 10 −pPC2−310
40
その後、感度の高いコロニーハイブリダイゼーション法(Kinsey、 Fu
ngalGenetics、 Newslett、36巻、1989年45−4
7ページ)を用い、かつプローブとして無作為にラベルしたpBluescri
pt(Maniatisら同著書)を用いてpBluesCriptベクター配
列か無いことを確認した。
(実施例9) FacA媒介同時形質転換を含む3Kbのペニシリウム クリソ
ゲナム由来Sal I制限断片と一緒に、実施例8で述べた6、5KbのPst
l制限断片で形質転換した。その様なol ic遺伝子は詳細に述べられている
方法(Bull et al、、 Curr、 Genet、I 988年13
巻、377−382ページ)によって、ペニシリウム クリソゲナムから得るこ
とができる。
最初に実施例4で述べたアセテート含有培地での生育について形質転換株を選択
した。その後、ひき続いてアセテート含有培地上で形質転換株を精製し、3μg
/mfのオリゴマイノン(Sigma社製)を含む固体培地での生育により、形
質転換株のすリボマイシン耐性について試験した。オリゴマイノン耐性形質転換
結論できる。選択マーカーの非選択可能なりNAへの物理的結合は、同時形質転
換には必要ではない。
(実施例10) エタノール含有培地での選択得た。形質転換混合物を、50m
Mの酢酸カリウムの代わりに0.1%、0.3%あるいは1%エタノールを含む
選択培地にプレートした。それ以外はこの実施例で使用した選択培地は実施例4
で述べた培地と同一のものである。
25°Cでおよそ2−3週間インキュベートした後に、形質転換株を明らかに同
定することができた。エタ7ノール含有選択培地の使用により、形質転換の頻度
はDNA1μg当りおよそ0.5−1形質転換株に低下した。
この実施例は、異化にアセチル−CoA合成酵素活性を必要とするアセテート以
外の他の炭素源を用いる可能性を示すものである。
配列表
配列番号 1の情報
(i)配列の特徴。
(Δ)長さ 4652 塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数 2!!鎖
(D)トポロジー・直鎖状
(ii)分子の型−DNA (ゲノム性)(iii)ハイボセティカル 否
(iv)アンチ−センス:否
(剰)起源−
(A)生物名 ペニシリウム クリソゲナム(vi)直接の起源。
(B)クローン pPC2−3
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号、エクソン
(B)存在位置・+781. 、1819(ix)配列の特徴
(A)名称/記号:イントロン
(B)存在位置: 1820. 、1904(ix)配列の特徴・
(A)名称/記号、エクソン
(B)存在位置: 1905. 、3149(ix)配列の特徴・
(A)名称/記号:イントロン
(B)存在位置: 3150. 、3207(ix)配列の特徴。
(A)名称/記号:エクソン
(B)存在位置: 3208. 、3468(ix)配列の特徴。
(A)名称/記号−イントロン
(B)存在位置: 3469. 、3519(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号 エクソン
(B)存在位置: 35201.3648(ix)配列の特@:
(A)名称/記号、イントロン
(B)存在位置 3649. 、3709(ix)配列の特徴
(A)名称/記号・エクソン
(B)存在位置 3710. 、3981(IX)配列の特徴
(A)名称/記号 イントロン
(B)存在位置: 3982. 、4057(ix)配列の特徴
(A)名称/記号:エクソン
(B)存在位置 4058. 、4117(ix)配列の特徴・
(A)名称/記号 CD5
(B)存在位置 join (1781,,1819,+905..3129.
3208..3468゜3520、.3648.3710..3981.405
8..4117)(D)他の情報・/コドン開始=1781/遺伝子=“fac
A”
(xl)配列の記述 配列番号 1
α込a工!Aロスa℃式スQa端Cロ刀GN詰C駈フゴ石0℃〕工C仄πα工O
コ占:、< 13Qm m m CIGαmAIズff直G! 240GACG
AG GGCAAG C!l;CGGr GGCMG A]CATrα;CAC
TMGAAGATI’(TG 2531c’rc’xαI: CCr CTA
TTG Crr GGCTGCGCCACCGI’CGrG TIE GAG
AGT 2915ACCαI: GCCTACCCT MCTTCW (r;C
TAC′rGG(& GICATT GACAAG 2963σコ工コr仄工℃
OコーλOズ:TOコ(℃rロゴCGMαλNコー℃−リσTrコ℃Gに罠1σ
じ6 3207GGT ATCACCCCCACCMG CCCGGCr GC
CTCCCTA CCC丁TCTICGGr コ303ATCGAG CCT
GCCATT 71! CACCo: GrCTo:αaGAG(:J6ATr
GrCGGC:1351MT (aT GTCGX; GGr GIT TrG
GQ: TTCAAG GiG CCG TGGα:CffATG 3399
GIII: CGCACCGrG TGG GGr GCCCACMG CGT
TACATG GACACr TACTTG 3447AACGTG TAC
MGαπThCTACσ]いGkズχTつズXhぶχゴam¥刀G 3498T
■;dλCTAA C■ン工にコdλG TTCACCGCA GATGGr
GCT GGCα:T (& CAC3549GACGGC’rw ’x ’r
cc ATCccc ccr cc’r GTT CACGAT cTCc’r
c八ACGITへ 359V
TCr GGA CAC(IT CrG TC’CACCGCr GAG AT
CGAG GCCGCT Crr fi GAG 3645HユS
Cひヱ;憔CM: Cr TCCGIT GCCGAG GCr GCr Gr
CGrT GGT ATr GCCCAC3747(2)翫jり番号 2の情報
(i)I茫?クリの1シトセ蜜2
(A)長さ・ 669アミノ酸
(B)型アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:タンパク
(xl)配タリの記述 配列番号 2
Arg Glu Leu LauThr Pne Asp Lys Asp P
ha Glu ’Ihr ’Ihr His His Gl■
Lys Glu Arg Gly V&l Lys Lys Gly Asp
Thr Val Gly He Tyr Lau Pr。
’Ihr Gly Ala Glu Val Pro Trp Thr Ala
Gly Arg Asp 工1eTrp Trp HisF工GURE 1
国際il[:4報牛
、Tl+lA+Lml+N+ PCT/NL 91100203
Claims (16)
- 1.DNAで形質転換された微生物の形質転換体の選択法であって、以下に示す 工程: アセチル−CoA合成酵素が作用しないかもしくは欠失している微生物の変異株 を分離する工程; 該DNA及びペニシリウムクリソゲナムのアセチル−CoA合成酵素生産に有効 な発現系で、該変異株を同時形質転換工程;及びアセチル−CoA合成酵素活性 をその異化のために必要とする炭素源を含む培地での生育能力について該微生物 の形質転換体を選択する工程を含む方法。
- 2.請求の範囲1記載の方法によって得ることができる微生物の形質転換体を用 いてβ−ラクタム化合物を生産させ、あるいはその生産を促進させる方法であっ て、β−ラクタム化合物を生産させあるいはその生産を促進させる為に必要な遺 伝情報をコードするDNAで該変異株を同時形質転換する工程を含む方法。
- 3.該微生物が相同DNAで形質転換されたペニシリウムクリソゲナムである請 求の範囲1あるいは2に記載の方法。
- 4.該炭素源がアセテートである上記請求の範囲のいずれか1項に記載の方法。
- 5.該同時形質転換が、同一DNA分子上にある該DNA及び該発現を導入する ことによって行なわれる上記請求の範囲のいずれか1項に記載の方法。
- 6.該微生物がカビの株、好ましくはβ−ラクタム生産性株、さらに好ましくは 、ペニシリウムクリソゲナム、アルペルギルスニドウランスあるいはアクリモニ ウムクリソゲナムである上記請求の範囲のいずれか1項に記載の方法。
- 7.該β−ラクタム生産株がペニシリン生産性株である請求の範囲6に記載の方 法。
- 8.該変異株がフルオロアセテート耐性であると同定された自然突然変異株であ る上記請求の範囲のいずれか1項に記載の方法。
- 9.該形質転換変異株からアセチル−CoA合成酵素活性を欠失する変異株を分 離する工程をさらに含む上記請求の範囲のいずれか1項に記載の方法。
- 10.ペニシリウムクリソゲナムから分離可能なfacA遺伝子。
- 11.配列番号1に記載のヌクレオチド配列を有する請求の範囲10項に記載の facA遺伝子。
- 12.請求の範囲10又は11に記載のfacA遺伝子の発現シグナル。
- 13.1以上の該発現シグナルが、同一かあるいは他の生物から得られる他の発 現シグナルによって置きかえられた請求の範囲10又は11に記載の遺伝子。
- 14.請求の範囲10、11、又は13に記載のfacA遺伝子を含むベクター 。
- 15.請求の範囲10、11、又は13に記載のfacA遺伝子を含む形質転換 された宿主。
- 16.請求の範囲15に記載の形質転換された宿主のβ−ラクタム化合物生産の 為の使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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NL90202754.9 | 1990-10-15 | ||
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