FI111087B - Menetelmä polyhydroksialkanoaattisynteesissä prekursorimolekyyleinä toimivien (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien kontrolloimiseksi geneettisesti modifioiduissa organismeissa - Google Patents

Description

111087

Menetelmä polyhydroksialkanoaattisynteesissä prekursorimolekyyleinä toimivien (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien kontrolloimiseksi geneettisesti modifioiduissa organismeissa 5 Tämä keksintö koskee menetelmää, jolla kontrolloidaan ennalta määrätyn pituisten (3R)- hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien tuottoa isäntäsolussa tai kasvissa patenttivaatimuksen 1 johdannon mukaisesti ja erityisesti menetelmää, jolla tuotetaan polyhydroksi-alkanoaatteja (PHA) patenttivaatimuksen 3 johdannon mukaisesti. Tämä keksintö koskee myös menetelmää, jolla tuotetaan isäntäsolu tai kasvi, joka kykenee tuottamaan PHA:ta 10 patenttivaatimuksen 2 johdannon mukaisesti ja isäntäsolua patenttivaatimuksen 13 joh dannon mukaisesti. Edelleen, tämä keksintö koskee geeniä tai DNA-sekvenssiä patenttivaatimuksen 15 johdannon mukaisesti ja hiivan geeniä tai DNA- sekvenssiä patenttivaatimuksen 23 johdannon mukaisesti. Keksintö koskee myös DNA-konstrukteja, vektoreita ja isäntäsoluja patenttivaatimusten 25,26 ja 27 johdantojen mukaisesti. Keksintö koskee 15 myös patenttivaatimuksen 30 johdannon mukaisesti menetelmää muunnetun 2-enoyyli- koentsyymi-A-hydrataasi2/(3R)-hydroksi-asyylikoentsyymi-A-dehydrogenaasientsyy-min tyypin 2 proteiinia ilmentämään kykenevän isänstäsolun tai kasvin valmistamiseksi ja isäntäsolua patenttivaatimuksen 31 johdannon mukaisesti. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Solussa (3R)-hydroksiasyylimetaboliitit ovat lipidiaineenvaihdunnan välituotteita seka 2 biosynteettisissä että hajottavissa prosesseissa. Esimerkkejä biosynteettisistä tapahtumista 3 ovat polyhydroksialkanoaattien (PHA) muodostuminen (Donadio et ai, 1991; Poirier et 4 ai., 1995) ja rasvahappojen de novo synteesi. Mikrobeissa polyhydroksialkanoaattisyn- 5 taasit käyttävät substraatteinaan (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A -tioestereitä, kun taas 6 rasvahapposyntetaaseilla asyyliryhmien kantajana on asyyliryhmien kantajaproteiini (acyl 7 carrier protein, ACP). Mitä hajottaviin prosesseihin tulee, niin jos rasvahappojen perok- 8 sisomaalinen β-oksidaatio etenee monitoimisen 2-enoyylikoentsyymi- A -hydrataasi 9 2/(3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A -dehydrogenaasi-entsyymin tyyppi 2 (MFE-2) kaut 10 ta, se tapahtuu (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A -välituotteiden kautta (Hiltunen et ai., 11 1992; Dieuaide-Noubhani et ai., 1996; Qin et ai., 1997b). Hiivan peroksisomeissa toimii 12 MFE-2:sta riippuva reaktiotie, kun taas nisäkkäiden peroksisomeissa on lisäksi reaktiotie, 13

joka riippuu monitoimisesta 2-enoyylikoentsyymi-A -hydrataasi 1/enoyyli-koentsyymi-A

14 -isomeraasi/(3S)-hydroksiasyylikoentsyymi-A -dehydrogenaasientsyymistä tyyppi 1 15 (MFE-1), joka käyttää (3 S)-hydroksiasyylikoentsyymi-A -välituotteita samaan tapaan 16 kuin mitokondriaalinen ja bakteerien β-oksidaatio.

2 111087 Tähän mennessä MFE-2 on kloonattuja tunnistettu monesta eri eukaryootista - niiden joukossa hiiva ja monta nisäkäslajia, mm. ihminen - mutta ei prokaryooteista. Kaikki tunnistetut entsyymit ovat kimeerisiä monitoimisia proteiineja, joissa on N-terminaalinen osa, joka kuuluu lyhytketjuisten alkoholien dehydrogenaasi/reduktaasi -suurperheeseen.

5

Hiivan entsyymissä on kaksi dehydrogenaasimaista osaa, mutta ennestään ei ollut tiedossa, ovatko ne molemmat aktiivisia tai ottavatko ne molemmat osaa aineenvaihduntaan. Dehydrogenaasiosan jälkeen entsyymissä on 2-enoyylikoentsyymi-A -hydrataasi 2 -osa, jonka on osoitettu katalysoivan trans-2-enoyylikoentsyymi-A-ja (3R)-hydroksi-10 asyylikoentsyymi-A-esterien hydrataatiota j a dehydraatiota kahdensuuntaisesti. Nisäk käiden entsyymissä, toisin kuin hiivalla, on ylimääräisenä osana C-terminaalinen stero-leja sitovan proteiini 2:n kaltainen osa, jonka fysiologinen merkitys on epäselvä.

Suuri määrä sekä gram-negatiivisia että -positiivisia bakteereja pystyy syntetisoimaan 15 PHA:ta sopivista asyylikoentsyymi-A lähtöaineista PHA-syntaasin avulla. Vaikka PHA:t, jotka kerääntyvät bakteerien solulimaan jyväsinä, ovat lämpöäkestäviä ja veteen liukenemattomia polymeerejä, ne hajoavat täydellisesti bakteerien toimesta. Tämän takia PHA:t ovat herättäneet laajaa bioteknologista kiinnostusta luonnostaan biohajoavien muovien ja elastomeerien lähteenä.

20

Vaikka PHA:n pääasiallinen kaupallinen arvo on niiden potentiaalisissa sovelluksissa biohajoavina muoveina, kaikenpituisista hiiliketjuista muodostuneiden monomeeristen 3-hydroksihappojen epimeerejä voidaan käyttää biolääketieteellisessä tutkimuksessa rea-gensseina. Kuitenkin, puhtaita 3-hydroksirasvahappojen epimeerejä saadaan nykyisel-25 lään työlään orgaanisen synteesin kautta, poikkeuksena (3 S)- ja (3R)-hydroksi-voihappo. Siksi ne ovat kalliita ja niiden saatavuus on rajoitettu.

Parhaiten tunnettuja tutkittu PHA on 3-polyhydroksivoihappo (PHB). PHB:n kaikki hiiliatomit ovat peräisin asetyylikoentsyymi-A:lta. Ensin kaksi asetyylikoentsyymi-A -30 molekyyliä kondensoituu reaktiossa, joka on käänteinen 3-ketoasyylikoentsyymi-A-tio-laasille. Muodostunut asetoasyylikoentsyymi-A pelkistyy NADP:stä riippuvan aseto-asyylikoentsyymi-A-reduktaasin toimesta (3R)-hydroksivoihappokoentsyymi-A:ksi, joka toimii substraattina polyhydroksiasyylikoentsyymi-A-syntetaas(e)ille. Tavallisesti sokerit, kuten glukoosi, voivat toimia asetyylikoentsyymi-A:n tuoton hiililähteenä. Jos mono-35 meerin hiiliketjun pituus ylittää viisi hiiltä, asyyli-osien ajatellaan olevan peräisin β-oksidaatiosta trans-2-enoyylikoentsyymi-A:n, (3S)-hydroksiasyylikoentsyymi-A:n ja 3- 3 111087 ketoasyylikoentsyymi-A:n välituotteiden kautta 3-ketoasyylikoentsyymi-A-reduktaasin katalysoimaan reaktioon kytkettynä. On olemassa todisteita, jotka viittaavat siihen, että PHA:n rakenneosia voidaan myös kanavoida rasvahappojen de novo -synteesitien välituotteista. Tässä reaktiotiessä asyyliryhmän kantajana toimii asyyliä kantava proteiini 5 (ACP), mutta koska PHA-syntaasit käyttävät substraatteinaan hydroksiasyylikoentsyymi-A-estereitä, on koko asyylinsiirron molekulaarinen mekanismi epäselvä.

Biologisesti hajoavien materiaalien kasvava kysyntä on johtanut, muiden muassa, bio-hajoavien muovien kehittämiseen. Jo 1995 markkinoilla oli kaksitoista luonnostaan 10 biohajoavaa muovia (Poirier et ai., 1995) mukaan lukien PHA:t. PHA:n fysikaaliset ominaisuuden vaihtelevat sen mukaan, mistä kemiallisista yksiköistä ne koostuvat, ja ne voivat olla jäykkiä ja hauraita tai joustavia ja kumimaisia. Polyhydroksivoihappo (PHB) on esimerkki edellisestä tyypistä; se koostuu neljähiilisistä osista ja on siis lyhytketjuisten yksiköiden muodostama polymeeri. Yli 40 erilaista PHA:ta on karakterisoitu (Stein-15 buchel, 1991).

PHA:ta voidaan tuottaa bakteerikasvatuksina. Käytetystä hiililähteestä ja bakteerikannasta riippuen saadaan erityyppisiä PHA:ta. Useimmat tutkitut bakteerit pystyvät tuottamaan vain joko lyhytketjuista PHA:ta (kolmesta viiteen hiiltä pitkiä yksiköitä; C3-C5) 20 tai keskipitkäketjuista PHA:ta (C6-C14) ja ainoastaan muutamat kykenevät tuottamaan molempia tyyppejä (Poirier et ai, 1995). On huomattava, että PHA:n tuottaminen tällä tavoin on kalliimpaa kuin syntetisoimalla vastaavan ominaisuuksisia muoveja kemiallisesti (Poirier et ai, 1995). Yksistään PHB:n tuottaminen bakteereissa, johon tarvitaan hiililähteeksi ainoastaan glukoosia, on liian kallista, puhumattakaan C6-C14 PHA:n tuot-25 tamisesta, johon tarvitaan rasvahappoja - ja ne ovat vielä kalliimpia kuin glukoosi. Lisä-haittana on, että sellainen synteesi johtaa PHA-seokseen, joka koostuu n. 6 -16 hiilen pituisista rakenneyksiköistä. Tämä tosiasia, lisättynä määrätyn pituisten PHA:n puhdistuksessa väistämättömiin hävikkeihin, pienentää suhteellisia saantoja ja korottaa tuotetun yksikön hintaa (Poirier et ai, 1995).

30

Kasveja on tutkittu uusina PHA:n tuottajina sen takia, että niillä on korkea tuottoka-pasiteetti ja saalis voidaan korjata tehokkaasti. Ensimmäinen koe käsitti Alcaligenes eutrophus:n PHB:n biosynteettisten geenien ilmentämisen Arabidopsis thalianassa, jolloin grammasta tuoretta kasvia saatiin 100 pg PHB:tä (Poirier et ai, 1992). Myö-35 hemmin saanto saatiin kasvatettua satakertaiseksi ohjaamalla PHB plastideihin soluliman sijaan; PHB muodosti silloin 14% talteen kerätyn kasvin kuivapainosta (Nawrath et ai, 4 111087 1994). Myöhemmin A. thalianan osoitettiin syntetisoivan C6-C16 PHA:ta, kun PHA-syntaasi ohjattiin peroksisomeihin, ja se pystyi käyttämään PHA:n lähteenä rasvahappojen peroksisomaalisen β-oksidaation välituotteita (Mittendorf et ai, 1998). PHA:n molekyylipainot olivat kuitenkin pienemmät kuin vastaavien PHA:iden, jotka oli tuotettu 5 bakteereissa. Tämä saattaa johtua PHA-syntaasin liiallisesta aktiivisuudesta suhteessa käytettävissä olevaan substraatin määrään.

Jotkut yhtiöt tutkivat PHA:n tuottoa öljykasveissa; yksi rapsissa (Zeneca Seeds (UK)), toinen sekä rapsissa että soijassa (Monsanto (USA)). PHA:n tuoton kustannukset riip-10 puvat monista tekijöistä, kuten tuotetun PHA:n absoluuttisesta määrästä, PHA:n vaikutuksesta tärkkelykseen, kasvien lipidi-ja proteiinisisällöstä sekä PHA:n eristämisestä kasvien solukosta (Poirier et ai, 1995).

PHB:n tuotto fermentaatioteknologialla käyttäen glukoosia hiililähteenä tekee lopputuot-15 teestä kallista (Gemgross, 1999) ja PHB:n fysikaaliset ominaisuudet rajoittavat sen käyttöä biohajoavana muovina. Siirtogeeniset kasvit ovat houkuttelevia vaihtoehtoja PHA:n tuottoon. Kuitenkin, riippumatta bioreaktoreina käytetyistä isäntäeliöistä, sellaisen PHA:n tuotto, jossa spesifioitu monomeerien hiiliketjun pituus on muu kuin C4-C5, ei ole kontrolloitavissa aikaisemmalla teknologialla.

20

Esitetyn keksinnön tarkoitus on eliminoida tekniikan tasoon liittyvät ongelmat ja taijota menetelmä polyhydroksialkanoaattien tai muun tyyppisten (3R)-hydroksiasyyliryhmiä tai niiden johdannaisia sisältävien polymeerien (kutsutaan tässä yhteydessä PHArksi) tuoton kontrolloimiseen valitussa tuottoisäntäsolussa tai organismissa. Isäntäsolu tai organismi 25 voi olla valittu bakteerien, hiivojen, muiden sienien tai kasvien joukosta.

Tämän keksinnön tarkoituksena on lisäksi tarjota menetelmä, jolla voidaan tuottaa isäntä-solussa tai organismissa PHA:ta, joka koostuu ketjultaan ennalta määrätyn pituisista rakenneosista.

30 Käsiteltävä keksintö perustuu havaintoon, jonka mukaan solun (3R)-hydroksiasyylipoolia voidaan kontrolloida isäntäsolussa tai organismissa geneettisin keinoin. Esillä olevan keksinnön mukaisesti on mahdollista geneettisesti muuttaa monitoimisen 2-enoyyli-koentsyymi-A -hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A -dehydrogenaasient-35 syymin tyyppi 2 (MFE-2) proteiinin substraattispesifisyyttä ja täten kontrolloida (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-johdannaisten ketjun pituuksia solun (3R)-hydroksiasyy- 5 111087 lipoolissa. Tuottoisännässä läsnäoleva PHA-syntaasi käyttää halutun pituisista ketjuista koostuvia (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-johdannaisia syntetisoidakseen PHA:ta, jolla on halutut ketjun pituudet ja halutut ominaisuudet. Monet bakteerit kykenevät tuottamaan PHA-syntaasia, ja jos halutaan, tämä kyky voidaan siirtää hiivaan tai muu-5 hun sieneen, korkeampaan eukaryoottiin tai, mieluummin, kasviin.

Keksinnön perustan muodostavassa tutkimustyössä voitiin osoittaa, että dehydrogenaasi-domainilla tai dehydrogenaasidomaineilla ja hydrataasidomainilla on erilaiset substraatti-spesifisyydet. Hiivan MFE tyypin 2 geenin koodaama proteiini, jolla on kaksi kopiota 10 dehydrogenaasidomainista, prosessoi eri ketjunpituuksisia rasvahappoja domainilla A

kuin domainilla B: domaini A:lla on korkein katalyyttinen aktiivisuus keskipitkä- ja pitkäketjuisten 2-enoyylikoentsyymi-A:n suhteen, kun taas domaini B:llä on laajempi substraattispesifisyys ja korkeammat tum-over -luvut ly hy tketj ui si 1 la substraateilla. Tämä saatiin selville inaktivoimalla jompi kumpi domaini tai molemmat, ja testaamalla puh-15 distetun entsyymin aktiivisuutta erilaisten rasvahappojen β-oksidaatiossa (in vitro -testi) sekä kasvattamalla hiivaa rasvahapot ainoana hiililähteenä (in vivo -testi).

Tämän keksinnön yhden suoritusmuodon mukaan MFE-2 -proteiinia koodaavaa geeniä on modifioitu muuttamalla geneettisesti geenin sitä aluetta, joka koodaa dehydrogenaasi-20 domainia tai -domaineja. Jos domaini, joka on vastuussa keskipitkä- ja pitkäketjuisten 2-enoyylikoentsyymi-A:n oksidaatiosta inaktivoidaan ja geeni ilmennetään valitussa isännässä, johtaa se keskipitkä-ja pitkäketjuisten 2-enoyylikoentsyymi-A:n kerääntymiseen. Toisaalta, kun domaini, joka on vastuussa lyhytketjuisten 2-enoyylikoentsyymi-A:n oksidaatiosta inaktivoidaan, johtaa se lyhytketjuisten 2-enoyylikoentsyymi-A:n kerään-25 tymiseen.

Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaan MFE-2:ta koodaava geeni on peräisin hiivasta ja käsittää kaksi dehydrogenaasidomainia koodaavaa geenin osaaja yhden hydra-taasia koodaavan geenin osan. Jos hiivan se domaini, jolla on korkeampi katalyyttinen 30 aktiivisuus keskipitkä- ja pitkäketjuisten 2-enoyylikoentsyymi-A:n suhteen, inaktivoidaan ja geeni ilmennetään valitussa isännässä, johtaa se C8-C12 pituisten 2-enoyylikoentsyy-mi-A:n kerääntymiseen. Toisaalta, kun hiivan se domaini, jolla on korkein turaover-luku lyhytketjuisilla substraateilla, inaktivoidaan, johtaa se n. C6-C8 pituisten 2-enoyyliko-entsyymi-A:n kerääntymiseen.

35 Jos valitussa geenissä on vain yksi dehydrogenaasidomaini, hydrataasidomaini on vastuussa (3R)-hydroksiasyylimetaboliiteista. Jos ihmisen dehydrogenaasidomaini inakti- 6 111087 voidaan ihmisen MFE-2:ta koodaavassa geenissä ja geeni ilmennetään valitussa isännässä, johtaa se (3R)- hydroksiasyylivälituotteiden poolin kontrollointiin hydrataasi-2 -do-mainin kineettisten ominaisuuksien ansiosta. Nisäkäsentsyymin tapauksessa syntetisoidaan pääasiallisesti keskipitkäketjuisia, ja jossain määrin pitempiä, (3R)-hydroksiasyy-5 limetaboliitteja.

Käsiteltävä keksintö antaa siten mahdollisuuden kontrolloida solun (3R)-hydroksiasyyli-metaboliittien synteesiä ja ohjata synteesi välituotteisiin, joilla on halutut ketjun pituudet. Modifioitava geeni on peräisin ensisijaisesti hiivasta, muusta sienestä tai nisäkkäästä.

10 Hiivan MFE-2 -geenissä yksi kahdesta dehydrogenaasista voi olla inaktivoitu tai molem mat dehydrogenaasit voivat olla inaktivoitu. Jos MFE-2 -geeni on peräisin nisäkkäältä, yksi dehydrogenaasidomaini voi olla inaktivoitu.

Tämän keksinnön yksi tarkoitus on tarjota menetelmä, jolla kontrolloidaan ennalta mää-15 rätyn pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien tuottoa isäntäsolussa tai kas vissa, ja joka menetelmä käsittää vaiheet: - siirretään isäntäsoluun tai kasviin geeni tai DNA-sekvenssi, DNA-konstrukti tai vektori, joka koodaa monitoimista 2-enoyylikoentsyymi-A-hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyyliko-entsyymi-A-dehydrogenaasientsyymin tyypin 2 proteiinia (MFE-2), joka käsittää ainakin 20 yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodaa hydrataasidomainia ja ainakin yhden geeni-tai DNA-alueen, joka koodaa dehydrogenaasidomainia, ja jossa on tehty ainakin yksi geneettinen muutos dehydrogenaasidomainia koodaavaan geeni- tai DNA-alueeseen, mikä johtaa ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa, kun geeni tai DNA-sekvenssi siirretään ja ilmennetään isäntäso-25 lussa tai kasvissa, joka hapettaa eksogeenisiä tai endogeenisiä β-rasvahappoja; ja - kasvatetaan isäntäsolua tai kasvia sopivissa kasvuolosuhteissa, joissa on mukana hiililähde, j oka käsittää endogeenisestä lähteestä peräisin olevia tai eksogeenisesti lisättyjä rasvahappoja, mikä johtaa ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyyliko-entsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa.

30

Erityisesti, keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

Tämän keksinnön toinen tarkoitus on tarjota menetelmä, jolla valmistetaan isäntäsolu tai 35 kasvi, joka kykenee PHA-aineiden tuottoon, ja joka isäntäsolu tai kasvi ilmentää endo- geenistä tai vierasta geeniä tai geenejä tai DNA-sekvenssiä tai DNA-sekvenssejä, jotka 7 111087 koodaavat (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-estereitä polymerisoivaa entsyymiä tai entsyymejä, ja joka menetelmä koostuu seuraavista vaiheista: - siirretään isäntäsoluun tai kasviin geeni tai DNA-sekvenssi, DNA-konstrukti tai vektori, joka koodaa monitoimista 2-enoyylikoentsyymi-A-hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyyliko- 5 entsyymi-A-dehydrogenaasientsyymin tyypin 2 proteiinia (MFE-2), joka käsittää ainakin yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodittaa hydrataasidomainia ja ainakin yhden geeni-tai DNA-alueen, joka koodittaa dehydrogenaasidomainia, ja jossa on tehty ainakin yksi geneettinen muutos dehydrogenaasidomainia koodaavaan geeni- tai DNA-alueeseen, mikä johtaa ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien 10 rikastumiseen solussa, kun geeni tai DNA-sekvenssi siirretään ja ilmennetään isäntäsolus- sa tai kasvissa, joka hapettaa eksogeenisiä tai endogeenisiä β- rasvahappoja; ja - kasvatetaan isäntäsolua tai kasvia sopivissa kasvuolosuhteissa, joissa on mukana hiili-lähde, joka käsittää endogeenisestä lähteestä peräisin olevia tai eksogeenisesti lisättyjä rasvahappoja.

15

Erityisesti, keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 2 tunnusmerkkiosassa.

Tämän keksinnön kolmas tarkoitus on taijota menetelmä PHA-aineiden tuottamiseen 20 isäntäsolussa tai kasvissa, jotka ilmentävät endogeenistä tai vierasta geeniä tai geenejä tai DNA-sekvenssiä tai DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-estereitä polymerisoivaa entsyymiä tai entsyymejä, ja joka menetelmä koostuu seuraavista vaiheista: - siirretään isäntäsoluun tai kasviin geeni tai DNA-sekvenssi, DNA-konstrukti tai vektori, 25 joka koodaa monitoimista 2-enoyylikoentsyymi-A-hydrataasi 2/(3 R)-hydroksiasyyliko- entsyymi-A-dehydrogenaasientsyymin tyypin 2 proteiinia (MFE-2), joka käsittää ainakin yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodittaa hydrataasidomainia ja ainakin yhden geeni-tai DNA-alueen, joka koodittaa dehydrogenaasidomainia, ja jossa on tehty ainakin yksi geneettinen muutos dehydrogenaasidomainia koodaavaan geeni- tai DNA-alueeseen, 30 mikä johtaa ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa, kun geeni tai DNA-sekvenssi siirretään ja ilmennetään isäntäsolussa tai kasvissa, joka hapettaa eksogeenisiä tai endogeenisiä β-rasvahappoja; - kasvatetaan isäntäsolua tai kasvia sopivissa kasvuolosuhteissa, joissa on mukana hiili-lähde, joka käsittää endogeenisestä lähteestä peräisin olevia tai eksogeenisesti lisättyjä 35 rasvahappoja; ja - otetaan talteen PHA-aineet tai niiden hydrolyysituotteet.

8 111087

Erityisesti, keksinnön mukainen menetelmälle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 3 tunnusmerkkiosassa.

5 Tämän keksinnön vielä yksi tarkoitus on taijota isäntäsolu, joka on valmistettu keksinnön mukaisella menetelmällä kuten on esitetty patenttivaatimuksen 13 tunnusmerkkiosassa.

Tämän keksinnön vielä yksi tarkoitus on taijota geeni tai DNA-sekvenssi, joka koodaa monitoimista 2-enoyylikoentsyymi-A-hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-10 dehydrogenaasientsyymin tyypin 2 proteiinia (MFE-2), joka käsittää ainakin yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodittaa hydrataasidomainia ja ainakin yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodittaa dehydrogenaasidomainia, johon on tehty ainakin yksi geneettinen muutos dehydrogenaasidomainia koodaavaan geeni- tai DNA-alueeseen, mikä johtaa ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien 15 rikastumiseen solussa, kun geeni tai DNA-sekvenssi siirretään ja ilmennetään isäntä- solussa, joka hapettaa eksogeenisiä tai endogeenisiä β-rasvahappoja, lukuunottamatta ihmisgeeniä vastaavaa cDNA.ta, jossa on mutaatio G->A emäksessä 46, joka aiheuttaa aminohapposekvenssissä asemassa 16 muutoksen Gly —> Ser. Viimeksimainittu mutaatio on kuvattu julkaisussa Van Grunsven et ai. 1998.

20

Erityisesti, keksinnön mukaiselle geenille tai DNA-sekvenssille on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 15 tunnusmerkkiosassa.

Tämän keksinnön vielä yksi tarkoitus on tarjota hiivan geeni tai DNA-sekvenssi, joka 25 koodaa monitoimista 2-enoyylikoentsyymi-A-hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyyliko- entsyymi-A-dehydrogenaasientsyymin tyypin 2 proteiinia, joka käsittää yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodittaa hydrataasidomainia ja kaksi geeni- tai DNA-aluetta, jotka koodittavat dehydrogenaasidomaineja, ja jossa molemmat dehydrogenaasidomaineja koodaavat geeni- tai DNA-alueet on inaktivoitu, mikä johtaa hiiliketjun pituudeltaan noin 30 C4 - C20 kokoisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa, kun geeni tai DNA-sekvenssi on siirretty ja ilmennetään isäntäsolussa, joka kykenee hapettamaan rasvahappoja β-oksidaatiolla.

Erityisesti, keksinnön mukaiselle hiivan geenille tai DNA-sekvenssille on tunnusomaista 35 se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 23 tunnusmerkkiosassa.

9 111087 Tämän keksinnön tarkoituksena on taijota myös DNA-konstruktit, vektorit ja isäntäsolut, jotka sisältävät keksinnön mukaisen geenin tai DNA-sekvenssin patenttivaatimusten 25, 26 ja 27 tunnusmerkkiosissa esitetyn mukaisesti sekä monitoiminen entsyymi patenttivaatimuksen 29 tunnusmerkkiosassa esitetyn mukaisesti.

5

Keksinnön tarkoituksena on lisäksi taijota menetelmä muunnetun MFE-2:ta ilmentämään kykenevän isäntäsolun tai kasvin valmistamiseksi patenttivaatimuksen 30 tunnusmerkki-osassa esitetyn mukaisesti sekä isäntäsolu patenttivaatimuksen 31 tunnusmerkkiosassa esitetyn mukaisesti.

10

Esitetty keksintö johtaa moniin etuihin. Voidaan tuottaa PHA:ta, joka koostuu mono-meereista, joissa on määrätyt ketjun pituudet ja joilla on halutut fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet, mikä ei ollut mahdollista olemassa olevalla teknologialla. Tarvitaan vähemmän puhdistusvaiheita, koska eri ketjunpituuksisten PHA:n yhdistelmiä voidaan 15 kontrolloida.

PHA:n tuotto ei ole rajoittunut PHB:n tuottoon, jolla ei ole hyödyllisiä ominaisuuksia käytettäväksi biohajoavan muovin tuottamisessa. Biohajoavan muovin valmistamiseen voidaan suunnitella PHA:ta, jolla on halutut ominaisuudet. Monomeerisiä 3-hydroksi-20 happoja, joissa on määrätyt ketjun pituudet, voidaan käyttää reagensseina biolääketieteellisessä tutkimuksessa. Työlästä ja kallista orgaanista synteesiä ei tarvita.

Seuraavassa keksintöä kuvataan tarkemmin yksityiskohtaisten kuvausten avulla sekä esitetään käyttökelpoisia esimerkkejä. Keksintö ei ole millään muotoa rajoittunut näihin 25 esimerkkeihin.

Kuvassa 1 on rasvahappojen β-oksidaation ja polyhydroksialkanoaattien biosynteesin yhteys. PHA-synteesin kannalta reaktiotien oleelliset entsyymit ovat monitoiminen entsyymi tyyppi 2 (MFE-2) ja PHA-syntaasi. MFE-2:n hydrataasi-2 -osa (MFE-2-h) 30 valmistaa substraatin PHA-syntaasille sen jälkeen kun MFE-2:n dehydrogenaasi- aktiivisuus (MFE-2-d) on muunneltu. Substraatin (S)-isomeeria hyödyntävä reaktiotien haara tarvitaan energian tuottoon. Kuvan oikeassa puoliskossa PHA-synteesireaktiotie on esitetty siten kuin se toimii bakteereissa.

Kuvassa 2 esitetään Saccharomyces cerevisiaen MFE-2:n aminohapposekvenssi, (SEQ 35 ID No. 15) 10 111087

Kuvassa 3 esitetään Saccharomyces cerevisiaen MFE-2:n mutantti A:n aminohapposekvenssi (mutaatio Gly - Ser asemassa 16), (SEQ ID No. 16)

Kuvassa 4 esitetään Saccharomyces cerevisiaen MFE-2:n mutantti B:n aminohapposekvenssi (mutaatio Gly - Ser asemassa 329), (SEQ ID No. 17) 5 Kuvassa 5 esitetään Saccharomyces cerevisiaen MFE-2:n mutantti A+B:n aminohappo-sekvenssi (mutaatio Gly - Ser asemissa 16 ja 329), (SEQ ID No. IS)

Kuvassa 6 esitetään Candida tropicalis 'n MFE-2:n aminohapposekvenssi, (SEQ ID No. 19)

Kuvassa 7 esitetään Candida tropicalis'n MFE-2:n mutantti A:n aminohapposekvenssi 10 (mutaatio Gly - Ser asemassa 15), (SEQ ID No. 20)

Kuvassa 8 esitetään Candida tropicalis'n MFE-2:n mutantti B:n aminohapposekvenssi (mutaatio Gly - Ser asemassa 329), (SEQ ID No. 21)

Kuvassa 9 esitetään Candida tropicalis'n MFE-2:n mutantti A+B:n aminohapposekvenssi (mutaatio Gly - Ser asemissa 15 ja 329), (SEQ ID No. 22) 15 Kuvassa 10 esitetään ihmisen MFE-2:n aminohapposekvenssi (SEQ ID No. 23)

Kuvassa 11 esitetään ihmisen MFE-2:n mutantin aminohapposekvenssi (mutaatio Gly -Ser asemassa 16), (SEQ ID No. 24) Määritelmiä 20 MFE-2 on lyhenne, jota käytetään tässä tarkoittamaan monitoimista 2-enoyylikoentsyy-mi-A-hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-dehydrogenaasientsyymin tyypin 2 proteiinia, joka käsittää ainakin yhden dehydrogenaasidomainin ja ainakin yhden hydra-taasidomainin. Ilmaisu käsittää MFE-2 -proteiinit hiivoista, muista sienistä ja nisäkkäistä, 25 sekä muista organismeista, joilla on proteiini, jolla on ekvivalenttiset ominaisuudet.

Geeni, joka koodaa MFE-2 -proteiinia, viittaa DNA-sekvenssiin, joka koodaa MFE-2 -entsyymiä eri organismeissa. DNA-sekvenssi voi olla peräisin organismeista, jotka luonnostaan ilmentävät MFE-2 -entsyymiä, kuten hiivat, muut sienet, tai nisäkkäät ml.

30 ihmiset tai rotat, tai DNA-sekvenssi voi olla ainakin osaksi synteettisesti tuotettu.

"Lyhytketjuiset" (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterit tarkoittaa tässä (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-estereitä C2-C6, tyypillisesti C4-C6.

35 "Keskipitkäketjuiset" (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterit tarkoittaa tässä (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-estereitä C6-C14, tyypillisesti C8-C12.

11 111087 "Pitkäketjuiset" (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterit tarkoittaa tässä (3R)-hydrok-siasyylikoentsyymi-A-estereitä C14-C20, tyypillisesti C16.

"Geneettisellä muutoksella" tarkoitetaan tässä geneettisiä menetelmiä kuten poistoja, 5 korvaamisia, lisäyksiä ja muita mutaatioita, joilla ainakin yksi MFE-2 -proteiinia koodaa- van geenin dehydrogenaasidomaini voidaan muuttaa, ja joka johtaa haluttujen, ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa, kun modifioitu geeni ilmennetään valitussa isäntäsolussa tai organismissa. Geneettinen muutos voi käsittää myös sen, että ainakin yksi hydrataasidomaini tai sekä ainakin yksi 10 dehydrogenaasidomaini että ainakin yksi hydrataasidomaini muutetaan, joka johtaa haluttujen, ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen, kun modifioitu geeni ilmennetään isäntäsolussa tai organismissa. Geneettinen muutos käsittää edullisesti geenialueen inaktivaation, ja viittaa molekyylibiologian menetelmiin, kuten kohdistettu mutageneesi tai poisto, joka johtaa siihen, että valittu geenialue ei 15 toimi. Nämä molemmat menetelmät on esitetty esimerkeissä.

"Domainilla" tarkoitetaan geenialuetta, joka vastaa tietystä toiminnosta monitoimisessa entsyymissä. MFE-2 -proteiinissa on dehydrogenaasidomaineja ja hydrataasidomaineja. Hiivan MFE-2 -geenissä on kaksi dehydrogenaasidomainia, domainit A ja B. Domainilla 20 A on suurin katalyyttinen aktiivisuus keskipitkä- ja pitkäketjuisiin 2-enoyylikoentsyymi- A:han, kun taas domainilla B on korkeimmat tum-over -luvut lyhytketjuisilla substraateilla. Nisäkkäiden MFE-2:lla on ainoastaan yksi dehydrogenaasidomaini ja yksi hydrataasidomaini. Hiivan ja nisäkkäiden MFE-2:n ominaisuudet ja domainien spesifisyydet on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

25

Taulukko 1. Hiivan ja nisäkkäiden MFE-2:n ominaisuudet

Muuttuja_hiiva_nisäkkäät_ , 30 Dehydrogenaasidomaini kaksi yksi

Spesifisyys 12 111087

DomainiA keskipitkä- ja pitkäketjuiset yleinen

Domaini B lyhytketjuiset

Hvdrataasi 2 domaini yksi yksi

Spesifisyys yleinen keskipitkäketjuiset 5 SCP-2:n kaltainen domaini - yksi

Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti MFE-2:ta koodaava geeni on peräisin hiivasta. Jos hiivan se domaini, jolla on korkeampi katalyyttinen aktiivisuus keskipitkä-ja pitkäketjuisten 2-enoyylikoentsyymi-A:n suhteen, inaktivoidaan ja geeni ilmennetään 10 valitussa isännässä, johtaa se keskipitkä- ja pitkäketjuisten 2-enoyylikoentsyymi-A:n (tyypillisesti C8-C12) kerääntymiseen. Toisaalta, kun hiivan se domaini, jolla on korkein tum-over -luku lyhytketjuisilla substraateilla, inaktivoidaan, johtaa se lyhytketjuisten 2-enoyylikoentsyymi-A:n (tyypillisesti C6-C8) kerääntymiseen.

15 Jos geeni on peräisin hiivasta ja molemmat dehydrogenaasidomainit on inaktivoitu ja geeni ilmennetään hiivassa, hiiva tarvitsee vaihtoehtoisen energialähteen. Peroksiso-maalinen monitoiminen entsyymi tyyppi 1 voidaan siirtää isäntähiivaan, joka johtaa (3S)-hydroksiasyylikoentsyymi-A -spesifisen β-oksidaatioreaktiotien toimintaan, joka tuottaa energiaa hiivalle. Jos isäntähiiva on metylotrooppinen hiiva, energia voi tulla metanolin 20 hapetuksesta. Kasveissa endogeeninen metabolia tuottaa riittävästi energiaa isäntäkasville.

Jos nisäkkään dehydrogenaasidomaini inaktivoidaan, (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A:n hapetus estyy, ja kerääntyvän (3R)-hydroksiasyylivälituotteen hiiliketjun pituutta 25 kontrolloivat hydrataasi 2:n kineettiset ominaisuudet. Nisäkkäiden hydrataasi 2 on lähes täysin inaktiivinen lyhytketjuisilla substraateilla ja siten kerääntyvät (3R)-hydroksiasyyli-koentsyymi-A-esterit ovat C8 tai pitempiä (Cl8 asti).

Jotta modifioitu geeni voitaisiin ilmentää valitussa isännässä, geeni pitäisi mieluummin 30 olla toiminnallisesti yhdistetty säätelysekvenssiin, eritoten oikeaan promoottoriin, joka toimii isännässä. DNA-konstrukti, joka käsittää modifioidun geenin ja säätelysekvenssit, 111C87 13 viedään isäntäsoluun tai organismiin. DNA-konstrukti voi olla liitettynä vektoriin, joka kykenee siirtämään modifioidun geenin tai DNA-konstruktin isäntäsoluun.

Transformoitu isäntäsolu kasvatetaan sopivissa kasvatusolosuhteissa. Jos isäntä on 5 mikrobi, kuten bakteeri tai hiiva tai muu sieni, kasvualusta saattaa sisältää hiililähteenä glukoosia, joka mahdollistaa mikrobin syntetisoivan rasvahappoja, jotka myöhemmin kulkevat β-oksidaatioreaktiotien läpi. Vaihtoehtoisesti, rasvahappoja saatetaan lisätä kasvualustaan. Kasveissa rasvahappoja ei tarvitse lisätä eksogeenisesti, koska kasvit kykenevät tuottamaan rasvahappoja endogeenisellä metaboliallaan.

10

Jos isännällä on toimiva MFE-2 -geeni, se voidaan poistaa tai muuten inaktivoida ennen modifioidun geenin siirtoa ja ilmentämistä isännässä.

Jos isäntä on bakteeri, sillä saattaa olla toimiva PHA-syntaasigeeni. Mutta jos isäntä on 15 hiiva tai muu sieni tai korkeampi eukaryootti, kuten kasvi, toimiva bakteeriperäinen PHA -syntaasigeeni voidaan siirtää isäntään. PHA-syntaasigeeni siirretään ja mieluummin ohjataan kasvin peroksisomeihin, kuten Mittendorf et ai. (1998) on kuvannut.

Ilmaisu "kasvi” käsittää minkä tahansa kasvin tai sen jälkeläisen. Ilmaisu käsittää myös 20 kasvin osat mukaan lukien esim. siemenet, pistokkaat, silmut, sipulit, somaattiset idut jne. Kasvi voi olla yksineuvoinen tai kaksineuvoinen kasvi. Edullisesti se voi olla öljykasvi, kuten rapsi, auringonkukka tai soija.

Öljykasveja on ehdotettu potentiaalisiksi kohdekasveiksi PHA:n tuottoon, koska näillä 25 kasveilla on luonnostaan vilkas hiilen kierto asetyylikoentsyymi-A -välituotteiden kautta. Rapsia, auringonkukkaa ja soijaa on jo transformoitu vierailla geeneillä, joten ne ovat potentiaalisia teknologian kannalta (Poirier et ai., 1995). Alcaligenes eutrophus n ja Pseudomonas aeruginosan PHA-syntaasigeeni on transformoitu puuvillaan ja Arabi-dopsis thalianaan, tässä järjestyksessä, ja molemmissa tapauksissa PHB kerääntyi kasviin 30 (Mittendorf et ai., 1998). Nämä tutkimukset osoittavat, että tulevaisuudessa PHA:n tuotto kasveissa on todennäköinen vaihtoehto.

14 111087

On olemassa suuri määrä kloonausvektoreita, joilla voidaan valmistaa vieraiden geenien siirto korkeampiin kasveihin, jotka sisältävät esim. E. colin replikaatiosignaalin ja merk-kigeenin transformoitujen bakteerisolujen valikoimiseksi. Esimerkkejä tällaisista vek-5 toreista ovat pBR322, pUC-saija ja M13-saqa.

Saatavilla on lukuisasti tekniikoita DNA:n siirtämiseksi kasvisoluun. Nämä tekniikat sisältävät kasvisolujen transformoimisen T-DNA:lla käyttämällä Agrobacterium tume-faciensia tai Agrobacterium rhizogenesiä transformaatiovälineenä, injektion, DNA:n 10 elektroporaation, DNA:n siirtämisen käyttämällä bioballistista menetelmää tai muita mahdollisuuksia. Nämä kaikki tekniikat tunnetaan alalla hyvin.

Menetelmiä PHA:n uuttamiseksi erilaisista tuottoisännistä on kuvattu (Mittendorf et ai., 1998; Gemgross, 1999; U.S. Patent No. 5,213,976). Bakteerien tapauksessa soluseinä 15 täytyy rikkoa käyttäen mitä tahansa jokapäiväisistä laboratoriotekniikoista, kun taas kasvit täytyy fyysisesti jauhaa joko tuoreena tai jäädytettynä. Vapautunut PHA:ta sisältävä biomassa kylmäkuivataan, jonka jälkeen PHA uutetaan peräkkäisillä metanoli-ja kloroformiuutoilla. Lopputuote voidaan konsentroida pyöröhaihduttajalla tavallisesti ainakin pitoisuuteen 100 g PHA:ta litrassa ja saostaa metanolilla. Nämä kemiallisen 20 käsittelyn perusmenetelmät ovat suoraviivaisesti korotettavissa isompiin ainemääriin.

Hiivan MFE-2:n (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-dehydrogenaasiaktiivisuudet

Hiivan MFE-2 proteiinilla on kaksi N-terminaalista domainia, jotka ovat keskenään noin 25 45% samankaltaisia aminohapposekvenssinsä suhteen ja jotka kuuluvat lyhytketjuisten alkoholidehydrogenaasi/reduktaasi suurperheeseen. Tämän keksinnön taustalla oli se mielenkiintoinen kysymys, mitkä fysiologiset toiminnot nämä kaksi domainia omaavat ja jopa että ovatko ne molemmat entsymaattisesti aktiivisia. Näiden domainien, jotka on tässä nimetty A ja B, toimintojen tutkimiseksi otettiin mallisysteemiksi Saccharomyces 30 cerevisiaen fox-2 solut (joissa ei ole endogeenistä MFE-2 :ta), kuten on selitetty esimerkeissä. S. cerevisiaen A ja B domainien Glyl6 ja Gly329, jotka sijaitsevat ennustetussa 15 111087 nukleotidin sitomiskohdassa, mutatoitiin seniiliksi ja kloonattiin hiivan ekspressio-plasmidiin pYE352 (Hiltunen et ai., 1992). Öljyhappokasvualustassa fox-2 solut, jotka oli transformoitu p YE352: :sMFE-2(a )\Wa. (mutaatio domainissa A) ja pYE352: :sMFE-2(b~ ):llä (mutaatio domainissa B) kasvoivat hitaammin kuin solut, jotka oli transformoitu 5 pYE352::sMFE-2(villi tyyppi):llä, kun taas solut, jotka oli transformoitu pYE352::sMFE- 2(ab'):\la (mutaatio sekä domainissa A että domainissa B) eivät kasvaneet lainkaan. Candida tropicalis'n MFE-2, josta oli poistettu hydrataasi 2 domaini [iMFE-2(h2Ä)], ja Aja B domainien mutatoidut variantit [iMFE-2(h2Aa"), /MFE-2(h2Ab) ja MFE-2(h2Aa‘ b')] ylituotettiin ja karakterisoitiin. Kaikki proteiinit olivat dimeerejä ja niillä oli saman-10 kaltaiset sekundäärirakenne-elementit. Molemmat villityyppiset domainit olivat entsy maattisesti aktiivisia, mutta yllättäen domainilla B oli korkein aktiivisuus lyhytketjuisilla ja domainilla A keskipitkä-ja pitkäketjuisilla (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A -substraateilla.

15 Kaksi domainia yhdessä polypeptidissä ketjun pituuden suhteen erilaisilla spesifisyyksillä on lipidejä sitovien proteiinien joukossa uusi strategia niiden ongelmien selvittämiseksi, jotka aiheutuvat suuren substraattikiqon metaboloimisesta. Aikaisemmin kuvattuihin strategioihin kuuluu geenin kahdentuminen, joka johtaa erillisten entsyymien syntyyn, kuten nisäkkäiden asyylikoentsyymi-A-dehydrogenaasit, joista on useita paralogeja 20 (Tanaka et ai., 1990). Mukautuminen voi myös tapahtua mukautuvien substraatinsito-mistaskujen kautta, kuten tapahtuu sekä 2-enoyylikoentsyymi-A-hydrataasi 1 :llä (krotonaasi) että asyylikoentsyymi-A:ta sitovilla proteiineilla (Rosendal et ai., 1993;

Engel et ai., 1996; Engel et ai., 1998).

25 Kokeet hiivan kasvatuksesta nestemäisessä kasvualustassa osoittivat, että sekä domaini A

että B tarvitaan hiivasolujen optimaaliseen kasvuun rasvahappo ainoana hiililähteenä. Hiivan peroksisomaalinen MFE-2 taqoaa jännittävän esimerkin yhdestä polypeptidistä, joka on hankkinut kaksi entsymaattisesti aktiivista dehydrogenaasidomainia, joilla on ketjun pituuden suhteen erilaiset spesifisyydet. Täten esillä olevassa keksinnössä huo-30 mattiin, että tämä taqoaa uuden työkalun kontrolloida (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien poolia kohdistetun mutageneesin avulla siirtogeenisissä organismeissa.

16 111087

Nisäkkäiden MFE-2 voi metaboloida suoraketjuisia rasvahappoja in vivo olosuhteissa ja täten mukauttaa 3-hydroksiasyylikoentsyymi-A poolia solussa 5 Esimerkkinä nisäkkäiden MFE-2:sta, ihmisen MFE-2:n cDNA:n avoin lukukehys eristettiin ihmisen fibroblastien totaali-RNArsta käänteisellä transkriptiolla ja monistettiin PCRrllä. Tuote kloonattiin öljyhapolla indusoituvan hiivan katalaasi AI promoottorin perään pYE352 vektoriin ja siirrettiin Saccharomyces cerevisiaen fox-2 soluihin (joissa ei ole endogeenistä MFE-2:ta). Transformoitu kanta tuli uudelleen kykeneväksi kasvamaan 10 rasvahapot ainoana hiililähteenä. Vaikka tämän hetkisen kiqallisuuden mukaan nisäkkäiden MFE-2:n fysiologinen tehtävä on ottaa osaa a-metyyliasyylikoentsyymi-A-esterien metaboliaan, tulokset osoittivat yllättäen, että nisäkkäiden MFE-2 voi myös metaboloida suoraketjuisia asyylisubstraatteja in vivo. Jos ihmisen MFE-2:een aiheutettiin kohdennetulla mutageneesillä mutaatio GlylöAla, mutatoitu variantti ei komple-15 mentoinut hiivan endogeenistä MFE-2:ta fox-2 soluissa.

Rasvahappojen β-oksidaatio ja PHA-synteesi siirtogeenisissä korkeammissa eukaryooteissa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Monet bakteerit voivat syntetisoida keskipitkäketjuista PHA:ta käyttämällä rasvahap 2 pojen β-oksidaation välituotteita. Koska bakteereista on kuvattu ainoastaan (3S)- 3 hydroksiasyylikoentsyymi-A dehydrogenaasispesifinen β-oksidaatioreaktiotie, ne 4 tarvitsevat myös NADPH-välitteisen 3-ketoasyylikoentsyymi-A-reduktaasin osal 5 listumista. Äskettäin Poirier ja työtoverit kohdensivat P. aeruginosan phaCl :n siirto- 6 geenisen Arabidopsiksen peroksisomeihin ja osoittivat lehtiin kerääntyvät jyväset, jotka 7 sisälsivät PHA:ta suunnilleen 4 mg grammassa kuivapainoa (Mittendorf et ai., 1998).

8

Vaikkakaan PHA:t eivät ole korkeampien eukaryoottien luonnollisia metaboliitteja, tämä 9 työ osoitti, että kasvisoluja voidaan käyttää bioreaktoreina PHA:n tuottamiseen. PHA- 10 syntaasigeenin siirtoja PHA:n tuotto siirtogeenisissä kasveissa on kuvattu U.S. paten- 11 teissä No. 5650555 ja No. 5750848. Vastaava teknologia on kuvattu myös U.S. patentissa No. 5213976.

17 111087

Seuraavat esimerkit on esitetty käsillä olevan keksinnön havainnollistamiseksi, eikä niitä pidä tulkita mitenkään esillä olevaa keksintöä rajaaviksi.

5 ESIMERKIT

Esimerkki 1

Hiivan kahden domainin, jotka on tässä nimetty A ja B, toimintojen tutkimiseksi otettiin mallisysteemiksi Saccharomyces cerevisiaen fox-2 solut (joissa ei ole sMFE-2:ta) (Hil-10 tunen et ai., 1992). sMFE-2:ta koodaava cDNA saatiin S. cerevisiaen genomisesta DNA:sta PCR:lläpfu high fidelity-polymeraasilla (Stratagene, La Jolla, CA, USA) käyttämällä 5 '-aluketta 5' tctagaagATG CCT GGA AAT TTA TCC TTC AAA G 3' (SEQ ID No. 1) ja 3'-aluketta 5' ctcgagaTTA TAG TTT AGA TTT TGC CTG CGA TAG 3' (SEQ ID No. 2), jotka sisältävätXbaljaXhoI-katkaisukohdat, tässä jäjjes-15 tyksessä (pienet kirjaimet ilmoittavat epäsopivuuskohdat sMFE-2 geeniin nähden). Monistettu PCR-fragmentti kloonattiin pUC18-vektoriin ja digestoitiin XbaLMä. ja XhoI:llä pYE352:een kloonaamista varten (Filppula et ai., 1995), jolloin saatiin pYE352::sMFE-2. pYE352::sMFE-2 transformoitiin/ox-2 -soluihin (Gietz & Schiestl, 1995) ja selektoitiin SD/urasiili-maljoilla.

20 S. cerevisiaen Aja B domainien Glyl6 ja Gly329, jotka sijaitsevat ennustetussa nukleotidin sitomiskohdassa, ja vastaavat Glyl6:ta, joka on mutatoitunut ihmisen MFE-2 -puutoksessa (Van Grunsven et ai., 1998), mutatoitiin seriineiksi. Kohdistettu mutageneesi tehtiin QuickChange™ kohdistun mutageneesikitin ohjeiden mukaan (Stratagene, La 25 Jolla, CA, USA). pUCl 8:ssa oleva sMFE-2 -insertti otettiin templaatiksi, jotta saatiin pUCl8::sMFE-2(a’) japUC 1 %::sMFE-2(b~). Suunnitellut alukkeet Gly 16Ser-mutaation tekemiseksi sMFE-2 (a ):een olivat 5' GTT GTA ATC ACG TCT GCT GGA GGG GG 3' (5'-aluke) (SEQ ID No. 3) ja 5' CC CCC TCC AGC AGA CGT GAT TAC AAC 3' (3 '-aluke) (SEQ ID No. 4). Alukkeita 5' GTA GTA GTT ACG TCT GCA GGA GGT 30 GGT C 3' (5 '-aluke) (SEQ ID No. 5) ja 5' G ACC TCC TGC AGA CGT AAC TAC ATC 3' (3 '-aluke) (SEQ ID No. 6) käytettiin Gly329Ser-mutaation tekemiseksi sMFE- 18 111087 2(b~):een. pUC 1 %::sMFE-2(a):ta käytettiin PCR-templaattina Gly329Ser-mutaatioon suunniteltujen alukkeiden kanssa pUC 18; :sMFE-2(ab~) :n saamiseksi. Kaikki mutatoidut DNA-insertit kloonattiin pYE352:een (Hiltunen et ai., 1992), jolloin saatiin pYE352::sMFE-2(a), pYE352::sMFE-2(F) ja pYE352::sMFE-2(ab'). Öljyhappo-5 kasvualustassa fox-2 solut, jotka oli transformoitu pYE352::sMFE-2(a):11a (mutaatio domainissa A; SEQ ID No. 16) ja pYE352::sMFE-2(b~):llä (mutaatio domainissa B; SEQ ID No. 17) kasvoivat hitaammin kuin solut, jotka oli transformoitu pYE352:;.s,MF.E-2(villi tyyppi):\Vi, kun taas solut, jotka oli transformoitu ^>YE352: :sMFE-2(db'y\\a. (mutaatio sekä domainissa A että domainissa B; SEQ ID No. 18) eivät kasvaneet lain-10 kaan.

Hiivan MFE-2:n eri varianttien in vitro karakterisointi suoritettiin ko. proteiinilla ja sen varianteilla Candida tropicaliksesta. cDNA-alue, joka koodaa C. tropicaliksen peroksi-somaalisen MFE-2:n aminohappotähteitä 1-612 monistettiin plasmidista pMK22/ 15 HDE50 (Aitchison & Rachubinski, 1990) PCRrlläpfu-polymeraasilla käyttämällä 5 aluketta 5' catATG TCT CC A GTT GAT TTT AAA 3' (SEQ ID No. 7) ja 3'-aluketta 3' ggatccttaTTC GTC TTC GTC ATC ATC A 3' (SEQ ID No. 8), jotka sisältävät Ndelja BamHI -katkaisukohdat, tässä jäijestyksessä. Saatu 1839 emäsparin kokoinen PCR-ffagmentti kloonattiin pUC18:een. Ndelja. BamHI-digcstioiden jälkeen fragmentti 20 kloonattiin pET3a-ekspressiovektoriin (Novagen Inc., Madison, WI, USA), jolloin saatiin pET3a::tMFE-2(h2A),ja. dehydrogenaasidomainia koodaava nukleotidisekvenssi verifioitiin. Kohdistettu mutageneesi tehtiin vastaavalla tavalla kuin pYE352-sMFE-2 -varianteille käyttämällä iMFE-2 -spesifisiä alukkeita. Käyttämällä pET3a;:iMF£-2(h2A):n PCR-templaattina pET3a::tMFE-2(h2Aa) saatiin 5'-alukkeella 5' GTG ATC 25 ATT ACC AGT GCC GGT GGT G 3' (SEQ ID No. 9) ja 3 '-alukkeella 5' C ACC ACC GGC ACT GGT AAT GAT CAC 3' (SEQ ID No. 10), japET3a::tMFE-2(h2Ab') saatiin 5'-alukkeella 5' GTT TTG ATC ACC AGT GCC GGT GCT GG 3' (SEQ ID No. 11) ja 3'-alukkeella 5' CC AGC ACC GGC ACT GGT GAT CAA AAC 3' (SEQ ID No. 12). pETia::tMFE-2(h2Aa'b') tehtiin $ET3&::tMFE-2(h2Ab~):\le suunnitelluilla alukkeilla 30 käyttämällä pET3a::tMFE-2(h2Aa):a. templaattina. pEY3a::tMFE-2(h2A) ja sen mutatoidut variantit transformoitiin E. coli BL21 (DE3) plysS -soluihin ja ilmennettiin, 19 111087 rekombinanttiproteiinit puhdistettiin kromatografisesti bakteerisolulysaateista ilmeiseen puhtauteen ja karakterisoitiin. Kaikki proteiinit olivat dimeerejä (kuten osoitettiin geeli-suodatuskromatografialla) ja niillä oli samankaltaiset sekundäärirakenne-elementit (kuten osoitettiin lyhytaaltopituisella UV CD-spektropolarimetrialla).

5

Kineettiset parametrit määritettiin puhdistetulle QMFE-2(h2A):lle ja sen mutatoiduille varianteille (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A:n hapetuksen suhteen (Qin et ai., 1997a). Kineettinen data siirrettiin Lineweaver-Burk-kuvaajiksi GraFit-tietokoneohjelmalla (Sigma Chemicals).

10 fMFE-2(h2A) osoitti suurinta katalyyttistä tehokkuutta (WKm) substraatilla (3R)-hydroksidekanoyylikoentsyymi-A (CIO). Km-arvo oli pienin C10-substraatille ollen noin viidesosa ja kymmenesosa C16 ja C4 -substraattien arvoista, tässä jäqestyksessä. Kiinnostavaa on, että iMFE-2(h2A):n (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-dehydro-15 genaasiaktiivisuus jakaantui kahteen profiiliin analysoitaessa mutatoituja variantteja.

tMFE-2(h2Aa; SEQ ID No. 20):n nopeusvakio (A^at) C4:lle oli sama kuin tMFE-2(h2A):n (29 ±1 s'1 vs 31 +2 s’1), kun taas tMFE-2(h2Ab~; SEQ ID No. 21):llä se oli alle totea-misrajan. tMFE-2(h2Aa'):n kcit -arvot C10:lle ja C16:lle olivat 17 ± 1 s'1 ja 12 ± 1 s'1. Mielenkiintoista on, että tMFE-2(h2Ab~)\n ^at -arvot olivat 33 ± 2 s'1 ja 36 ± 6 s'1, mikä 20 viittaa siihen, että domaini A osallistuu domaini B:tä enemmän keskipitkä- ja pitkä-ketjuisten substraattien metaboliaan. tMFE-2(h2Aab'; SEQ ID No. 22) :n aktiivisuus testattujen substraattien suhteen ei ollut havaittavaa.

Esimerkki 2 25 Nisäkkäiden MFE-2 voi metaboloida suoraketjuisia rasvahappoja in vivo -olosuhteissa ja täten mukauttaa 3-hydroksiasyylikoentsyymi-A poolia solussa

Esimerkkinä nisäkkäiden MFE-2:sta, ihmisen MFE-2:n cDNA:n avoin lukukehys (ORF) eristettiin ihmisen fibroblastien totaali-RNArsta käänteisellä transkriptiolla, monistettiin 30 PCRrllä käyttäen ihmisen MFE-2-Mc spesifisiä alukkeita 5 '-aluke 5gagctctagaagAT G GGC TCA CCC CTG AGG TTC GA -3' (SEQ ID No. 13) ja 3’-aluke 5'- ctcgagTCA

20 111087 GAG CTT GGC GTA GTC TTT AAG AA -3' (SEQ ID No. 14) (pienet kirjaimet ilmoittavat epäsopivuuskohdat HuMFE-2 geeniin nähden). Alukkeet sisälsivät Saclja XhoI-katkaisukohdat, jotta ne voitaisiin kloonata pUCl 8-vektoriin käyttäen Sure Clone Ligation-kittiä (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Ruotsi). Saclja XhoI -diges-5 tioiden jälkeen HuMFE-2-insertti (SEQ ID No. 23) liitettiin vastaavasti digestoituun pYE352:een katalaasi AI -promoottorin taakse (Filppula et ai., 1995), jolloin saatiin pYE352::HuMFE-2. Glyl6Ser-mutaatio siirrettiin ihmisen MFE-2:een (SEQ ID NO. 24) (pYE352::HuMFE-2(dhA)) kohdistetulla mutageneesillä noudattaen menetelmää, joka esitettiin hiivan MFE-2 dehydrogenaasivarianteille. Kun pYE352::HuMFE-2 siirrettiin S. 10 cerevisiae fox-2 -soluihin (joissa ei ole endogeenistä MFE-2:ta), transformoitu kanta sai takaisin kyvyn kasvaa rasvahapoilla. Sen sijaan rasvahappojen kulutusta ei havaittu, jos fox-2 -solut transformoitiin pYE352: :HuMFE-2(dhAfA\a. Kun MFE-2:n entsyymiaktiivisuuksia mitattiin transformoitujen fox-2 -solujen liukoisista uutteista, havaittiin villi-tyyppiä vastaava hydrataasi 2 -aktiivisuus, kun taas (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-15 dehydrogenaasiaktiivisuus oli hävinnyt Glyl6Ser-mutaation johdosta.

Kirjallisuus

Literature

Aitchison, J. D., and Rachubinski, R. A. (1990) Curr. Genet. 17,481-486 20 Anderson, A.J. & Dawes, E.A. (1990) Microbiol. Rev. 54:450-472.

Dieuaide-Noubhani, M., Novikov, D., Baumgart, E., Vanhooren, J.C.T., Franzen, M., Goethals, M., Vandekerkhove, J., Van Veldhoven, P.P. & Mannerts, G.P. (1996Q Eur. J. Biochem. 240,660-666

Donadio, S., Staver, MJ., McAlpine, J.B., Swanson, S.J. & Katz, L. (1991) Science 252, 25 675-679

Engel, C. K., Mathieu, M., Zeelen, J. P., Hiltunen, J. K., and Wierenga, R. K. (1996) EMBOJ. 15,5135-5145

Engel, C. K., Kiema, T. R., Hiltunen, J. K., and Wierenga, R. K. (1998) J. Mol. Biol. 275, 847-859 30 Filppula, S.A., Sormunen, R.T., Hartig, A., Kunau, W.-H, & Hiltunen, J.K. (1995) J. Biol. Chem. 270,27453-27457 21 111087

Gemgross, T.U. (1999) Nature Biotechnology 17, 541-544

Gietz, R. D., and Schiestl, R. H. (1995) Methods Mol Cell Biol 5,255-269.

Van Grunsven, E.G., van Berkel, E., Ijlst, L., Vreken, P., de Klerk, Adamski, J., Lemonde, H., Clayton, P.T., Cuebas, D.A. & RJ.A. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5 95,2128-2133

Van Grunsven, E.G., van Berkel, E., Mooijer, P.A., Watkins, P.A., Moser, H.W., Suzuki, Y., Jiang, L.L., Hashimoto, T., Hoefler, G., Adamski, J. & Wanders, R.J. (1999) Am. J. Hum. Genet. 64,99-107

Hiltunen, J.K., Wenzel, B., Beyer, A., Erdmann, R., Fossa, A. 8c Kunau, W.-H. (1992) / 10 Biol. Chem. 267,6646-6653.

John, M.E. & Keller, G. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12768-12773.

Malila, L.H., Mäkelä, MJ., Jalonen, J.E., Latipää, P.M., Kunau, W.-H. & Hiltunen, J.K. (1993)/. Biol. Chem. 268, 21578-21585

Mittendorf, V., Robertson, E.J., Leecj, R.M., Kruger, N., Steinbuchel, A. & Poirier, Y. 15 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13397-13402

Nawrath, C., Poirier, Y. & Somerville, C. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12760-12764.

Poirier, Y., Dennis, D.E., Klomparens, K. & Somerville, C. (1992) Science 256: 520-523. Poirier, Y., Nawrath, C. & Somerville, C. (1995) BIO/TECHNOLOGY13:142-150 20 Qin, Y.-M., Haapalainen, A. M., Conry, D., Cuebas, D. A., Hiltunen, J. K., and Novikov, D. K. (1997a) Biochem. J. 328,377-382

Qin, Y.-M., Poutanen, M.H., Helander, H.M., Kvist, A.-P., Siivari, K.M., Schmitz, W., Conzelman E., Helmann, U. & Hiltunen, J.K. (1997b). Biochem. /., 321,21-28 Steinbuchel, A. (1991) In: Novel Biomaterials from Biological Sources (D. Byrom, Ed.), 25 MacMillan, New York.

Tanaka, K., Matsubara, Y., Indo, Y., Naito, E., Kraus, J. & Ozasa, H. (1990) Ann. N. Y. Acad. Sci. 321,577-598.

22 111087

PATENTTIVAATIMUKSET

1. Menetelmä ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien soluissa tapahtuvan tuoton kontrolloimiseksi isäntäsolussa tai kasvissa tunnettu siitä, että menetelmä koostuu seuraavista vaiheista: 5 - siirretään isäntäsoluun tai kasviin geeni tai DNA-sekvenssi, DNA-konstrukti tai vektori, joka koodaa monitoimista 2-enoyylikoentsyymi-A-hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyyliko-entsyymi-A-dehydrogenaasientsyymin tyypin 2 proteiinia (MFE-2), joka käsittää ainakin yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodaa hydrataasidomainia ja ainakin yhden geeni-tai DNA-alueen, j oka koodaa dehydrogenaasidomainia, j a j ossa on tehty ainakin yksi 10 geneettinen muutos dehydrogenaasidomainia koodaavaan geeni- tai DNA-alueeseen, mikä johtaa ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa, kun geeni tai DNA-sekvenssi siirretään ja ilmennetään isäntäsolussa tai kasvissa, joka hapettaa eksogeenisiä tai endogeenisiä β- rasvahappoja; ja - kasvatetaan isäntäsolua tai kasvia sopivissa kasvuolosuhteissa, joissa on mukana 15 hiililähde, joka käsittää endogeenisestä lähteestä peräisin olevia tai eksogeenisesti lisättyjä rasvahappoja, mikä johtaa ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyyliko-entsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa.

2. Menetelmä PHA-aineiden tuottoon kykenevän isäntäsolun tai kasvin tuottamiseen, 20 tunnettu siitä, että mainittu isäntäsolu tai kasvi ilmentää endogeenistä tai vierasta geeniä tai geenejä tai DNA-sekvenssiä tai DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat (3R)-hydroksiasyyli-koentsyymi-A-estereitä polymerisoivaa entsyymiä tai entsyymejä ja että menetelmä koostuu seuraavista vaiheista: - siirretään isäntäsoluun tai kasviin geeni tai DNA-sekvenssi, DNA-konstrukti tai vektori, 25 joka koodaa monitoimista 2-enoyylikoentsyymi-A-hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyyliko- entsyymi-A-dehydrogenaasientsyymin tyypin 2 proteiinia (MFE-2), joka käsittää ainakin yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodittaa hydrataasidomainia ja ainakin yhden geeni-tai DNA-alueen, joka koodittaa dehydrogenaasidomainia, ja jossa on tehty ainakin yksi geneettinen muutos dehydrogenaasidomainia koodaavaan geeni- tai DNA-alueeseen, 30 mikä johtaa ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa, kun geeni tai DNA-sekvenssi siirretään ja ilmennetään isäntäsolussa tai kasvissa, joka hapettaa eksogeenisiä tai endogeenisiä β- rasvahappoja; ja 23 111087 - kasvatetaan isäntäsolua tai kasvia sopivissa kasvuolosuhteissa, joissa on mukana hiililähde, joka käsittää endogeenisestä lähteestä peräisin olevia tai eksogeenisesti lisättyjä rasvahappoja.

5 3. Menetelmä PHA-aineiden tuottamiseen isäntäsolussa tai kasvissa, tunnettu siitä, että isäntäsolu tai kasvi ilmentää endogeenistä tai vierasta geeniä tai geenejä tai DNA-sekvenssiä tai DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-estereitä polymerisoivaa entsyymiä tai entsyymejä ja että menetelmä koostuu seuraavista vaiheista: 10 - siirretään isäntäsoluun tai kasviin geeni tai DNA-sekvenssi, DNA-konstrukti tai vektori, joka koodaa monitoimista 2-enoyylikoentsyymi-A-hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyyliko-entsyymi-A-dehydrogenaasientsyymin tyypin 2 proteiinia (MFE-2), joka käsittää ainakin yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodittaa hydrataasidomainia ja ainakin yhden geeni-tai DNA-alueen, joka koodittaa dehydrogenaasidomainia, ja jossa on tehty ainakin yksi 15 geneettinen muutos dehydrogenaasidomainia koodaavaan geeni- tai DNA-alueeseen, mikä johtaa ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa, kun geeni tai DNA-sekvenssi siirretään ja ilmennetään isäntäsolussa tai kasvissa, joka hapettaa eksogeenisiä tai endogeenisiä β- rasvahappoja; - kasvatetaan isäntäsolua tai kasvia sopivissa kasvuolosuhteissa, joissa on mukana hiili- 20 lähde, joka käsittää endogeenisestä lähteestä peräisin olevia tai eksogeenisesti lisättyjä rasvahappoja; ja - otetaan talteen PHA-aineet tai niiden hydrolyysituotteet.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että endo-25 geenistä MFE-2:ta koodaava geeni tai DNA-sekvenssi on inaktivoitu isäntäsolussa tai kasvissa.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että MFE-2:ta koodittava geeni tai DNA-sekvenssi on peräisin hiivasta.

30 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1 -5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muutos käsittää solun lyhytketjuisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien hapetuksesta vastaavaa domai-nia koodittavan geeni- tai DNA-alueen inaktivoimisen, mikä johtaa 24 111087 hiiliketjim pituudeltaan C4 - C8 kokoisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muutos 5 käsittää solun hiiliketjultaan C8 - C16 pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-este-rien hapetuksesta vastaavaa domainia koodaavan geeni- tai DNA-alueen inaktivoimisen, mikä johtaa C8 - C16 pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa.

10 8. Jonkin patenttivaatimuksen 1 -5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geeni tai DNA-sekvenssi on peräisin nisäkkäästä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muutos käsittää dehydrogenaasidomainia koodattavan geeni- tai DNA-alueen inaktivoimisen, mikä johtaa 15 solun C8 - C18 pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien kerääntymiseen soluun.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geeni tai DNA-sekvenssi on peräisin hiivasta ja koodittaa monitoimista 2-enoyylikoentsyymi- 20 A-hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-dehydrogenaasientsyymin tyypin 2 proteiinia, joka käsittää yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodittaa hydrataasidomainia ja kaksi geeni- tai DNA-aluetta, jotka koodittavat dehydrogenaasidomaineja, ja jossa molemmat dehydrogenaasidomaineja koodittavat geeni- tai DNA-alueet on inaktivoitu, mikä johtaa pituudeltaan noin C4 - C20 pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-25 esterien rikastumiseen solussa, kun geeni tai DNA-sekvenssi on siirrettyjä ilmennetään isäntäsolussa, joka kykenee hapettamaan rasvahappoja β-oksidaatiolla.

11. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on bakteeri, hiiva, home tai kasvisolu.

30 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on kasvisoluja että menetelmä käsittää transformoidun kasvisolun kasvattamisen siirtogeeniseksi kasviksi.

25 111087 13. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että isäntäsolu on valmistettu vaatimuksen 2 menetelmällä.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on kasvisolu 5 tai sen jälkeläinen.

15. Geeni tai DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa monitoimista 2-enoyy-likoentsyymi-A-hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-dehydrogenaasi-entsyymin tyypin 2 proteiinia (MFE-2), joka käsittää ainakin yhden geeni- tai DNA- 10 alueen, joka koodittaa hydrataasidomainia ja ainakin yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodittaa dehydrogenaasidomainia, johon on tehty ainakin yksi geneettinen muutos dehydrogenaasidomainia koodaavaan geeni- tai DNA-alueeseen, mikä johtaa ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa, kun geeni tai DNA-sekvenssi siirretään ja ilmennetään isäntäsolussa, joka hapettaa ekso-15 geenisiä tai endogeenisiä β-rasvahappoja, lukuunottamatta ihmisgeeniä vastaavaa cDNAita, jossa on mutaatio G-»A emäksessä 46, joka aiheuttaa aminohapposekvenssissä asemassa 16 muutoksen Gly -» Ser.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen geeni tai DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että 20 geeni tai DNA-sekvenssi on peräisin hiivasta.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen geeni tai DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että geneettinen muutos käsittää solun lyhytketjuisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien hapetuksesta vastaavaa domainia koodaavan geeni- tai DNA-alueen inaktivoi- 25 misen, mikä johtaa C4 - C8 pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa. 1 2

Patenttivaatimuksen 17 mukainen geeni tai DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että geeni tai DNA-sekvenssi koodaa SEQ ID NO. 17 tai 21 mukaista aminohapposekvenssiä.

30 2

Patenttivaatimuksen 16 mukainen geeni tai DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että geneettinen muutos käsittää solun hiiliketjultaan C8 - Cl6 pituisten (3R)-hydroksiasyyli-koentsyymi-A-esterien hapetuksesta vastaavaa domainia koodaavan geeni- tai DNA- 26 111087 alueen inaktivoimisen, mikä johtaa C8 - C16 pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa.

20. Patenttivaatimuksen 16 mukainen geeni tai DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että 5 geeni tai DNA-sekvenssi koodaa SEQ ID NO. 16 tai 20 mukaista aminohapposekvenssiä.

21. Patenttivaatimuksen 15 mukainen geeni tai DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että geeni tai DNA-sekvenssi on peräisin nisäkkäästä.

10 22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen geeni tai DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että geneettinen muutos käsittää dehydrogenaasidomainia koodaavan geeni- tai DNA-alueen inaktivoimisen, mikä johtaa hiiliketjultaan C8 - C18 pituisten (3R)-hydroksiasyyliko-entsyymi-A-esterien kerääntymiseen soluun.

15 23. Hiivan geeni tai DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa monitoimista 2- enoyylikoentsyymi-A-hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-dehydrogenaasi-entsyymin tyypin 2 proteiinia, joka käsittää yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodittaa hydrataasi-domainia ja kaksi geeni- tai DNA-aluetta, jotka koodittavat dehydrogenaasi-domaineja, ja jossa molemmat dehydrogenaasidomaineja koodaavat geeni- tai DNA-20 alueet on inaktivoitu, mikä johtaa hiiliketjun pituudeltaan noin C4 - C20 kokoisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa, kun geeni tai DNA-sekvenssi on siirrettyjä ilmennetään isäntäsolussa, joka kykenee hapettamaan rasvahappoja β-oksidaatiolla.

25 24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen geeni tai DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että geeni tai DNA-sekvenssi koodaa SEQ ID NO. 18 tai 22 mukaista aminohapposekvenssiä.

25. DNA-konstrukti, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksissa 15-24 kuvatun geenin tai DNA-sekvenssin.

30 26. Vektori, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimusten 15-24 geenin tai DNA-sekvenssin tai patenttivaatimuksen 25 DNA-konstruktin.

27 111087 27. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimusten 15 - 24 geenin tai DNA-sekvenssi tai patenttivaatimuksen 25 DNA-konstruktin tai patenttivaatimuksen 26 vektorin.

5 28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että isäntäsolu on bakteeri, hiiva, home tai kasvisolu.

29. Monitoiminen entsyymi, tunnettu siitä, että sitä koodaa mikä tahansa patenttivaatimusten 15-24 geeni tai DNA-sekvenssi tai patenttivaatimuksen 25 DNA-konstrukti 10 tai patenttivaatimuksen 26 vektori, joka sisältää kyseisen geenin tai DNA-sekvenssin.

30. Menetelmä muunnetun 2-enoyylikoentsyymi-A-hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyyliko-entsyymi-A-dehydrogenaasientsyymin tyypin 2 proteiinia ilmentämään kykenevän isäntäsolun tai kasvin valmistamiseksi tunnettu siitä, että menetelmä käsittää 15 seuraavat vaiheet: - siirretään geeni tai DNA-sekvenssi, joka koodaa monitoimista 2-enoyylikoentsyymi-A-hydrataasi 2/(3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-dehydrogenaasientsyymin tyypin 2 proteiinia (MFE-2), joka käsittää ainakin yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodittaa hydrataasidomainia ja ainakin yhden geeni- tai DNA-alueen, joka koodittaa dehydro- 20 genaasidomainia, johon on tehty ainakin yksi geneettinen muutos dehydrogenaasi- domainia koodaavaan geeni- tai DNA-alueeseen, mikä johtaa ennalta määrätyn pituisten (3R)-hydroksiasyylikoentsyymi-A-esterien rikastumiseen solussa, kun geeni tai DNA-sekvenssi siirretään ja ilmennetään isäntäsolussa tai kasvissa, joka hapettaa eksogeenisiä tai endogeenisiä β-rasvahappoja, tai DNA-konstrukti tai vektori, joka sisältää tämän 25 geenin tai DNA-sekvenssin, tai siirretään minkä tahansa vaatimusten 15-24 geeni tai DNA-sekvenssi, vaatimuksen 25 DNA-konstrukti tai vaatimuksen 26 vektori isäntäsoluun tai kasviin; ja - kasvatetaan isäntäsolua tai kasvia sopivissa olosuhteissa.

30 31. Isäntäsolu tunnettu siitä, että se on valmistettu patenttivaatimuksen 30 mukai sesti ja että se on valikoitu ryhmästä, joka käsittää bakteerit, hiivat, homeet ja kasvisolut.