JP2000516813A - ポリヒドロキシアルカノエートの産生に有用なｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 脂肪酸のドゥノボ生合成経路のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成が欠失しているが脂肪酸のβ酸化経路のＰＨＡ生合成は阻害されていないＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０突然変異体の表現型相補性を利用して、ｐｈａＧ遺伝子を担持しているゲノムフラグメントをクローニングした。８８５ｂｐのｐｈａＧ遺伝子は、２９５個のアミノ酸から成る分子量３３，８７６Ｄａのタンパク質をコードしている。脂肪酸のドゥノボ生合成経路のＰＨＡ合成条件下でｐｈａＧの転写誘発が観察されたが、β酸化による脂肪酸分解経路のＰＨＡ合成促進条件下で誘発は全く検出されなかった。ｐｈａＧ遺伝子は細菌及び植物にＰＨＡを産生させるために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリヒドロキシアルカノエートの産生に有用なＤＮＡ配列 発明の背景 発明の分野 本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の細胞合成に有用なタンパク 質をコードするＤＮＡ配列に関する。これらのＤＮＡ配列は、形質転換された微 生物及び植物中で発現され、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を産生し 得る。従来技術の説明 ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）として知られたポリマーのクラスに 属する細胞内ポリエステルの産生は、多数の原核生物で観察されている（Ａｎｄ ｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄａｗｅｓ（１９９０）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５ ４：４５０）。このポリエステルを構成するモノマーの長さは、Ｃ４（３−ヒド ロキシブチレート）からＣ１２（３−ヒドロキシドデカノエート）の範囲である （Ｌａｇｅｖｅｅｎら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５ ４：２９２４）。このクラスのポリエステルは、従来の石油化学由来のプラスチ ックに代替し得る有望な材料として大いに注目されている。 ＰＨＡは概して、それらの主鎖を構成するモノマーに従って特性決定されてい る。Ｃ４−Ｃ５単位から構成されたポリマーは短鎖長（ｓｃｌ）のＰＨＡとして 分類され、Ｃ６単位以上のモノマーを含むポリマーは中鎖長（ｍｃｌ）のＰＨＡ として分類されている。ポリマーの一次構造はポリエステルの物理的特性に影響 を与える。 ＰＨＡの形成に導く代謝経路がすべての生物で解明されているのではない。Ａ ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓの生合成経路が最も研究の進んだＰ ＨＡ生合成経路である（Ｐｅｏｐｌｅｓら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ．２６４：１５２９８及びＶａｌｅｎｔｉｎら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．２２７：４３）。この生物は、Ｃ４のホモポリマー（ポリヒドロキシ ブチレート、ＰＨＢ）またはＣ４−Ｃ５のコポリマー（ＰＨＢ−ＰＨＶ、ポリヒ ドロキシブチレート−ポリヒドロキシバレレート）を形成し得る（Ｋｏｙａｍａ ａｎｄ Ｄｏｉ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７：２８１ ）。従って、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓはｓｃｌ ＰＨＡ生物として分類されてい る。同様に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 種は、Ｃ６からＣ１２の範囲の長さをもつモノマーから構成されたポリマーを産 生し（Ｔｉｍｍ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｅｎ ｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：３３６０及びＬａｇｅｖｅｅｎら（１ ９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：２９２４）、 ｍｃｌ ＰＨＡ生物として分類されている。 ヒドロキシアシル−ＣｏＡ基質の重合は、ＰＨＡシンターゼによって行われる 。このクラスの酵素の基質特異性は、ＰＨＡを産生する生物に応じて異なってい る。ＰＨＡシンターゼの基質特異性のこのような多様性はヘテロロガス発現の研 究で観察された間接証拠によって確認されている（Ｌｅｅら（１９９５）Ａｐｐ ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：９０１及びＴｉｍｍら （１９９０）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３３：２９６） 。従って、ポリマーの主鎖の構造は、該ポリマーを形成させるＰＨＡシンターゼ による影響が大きい。 ｒＲＮＡ相同グループＩに属する蛍光性ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｄｓは、炭素原 子数６〜１４の範囲の炭素鎖長をもつ種々の飽和及び不飽和のヒドロキシ脂肪酸 から成るポリヒドロキシアルカン酸 （ＰＨＡ）を大量に合成し蓄積し得る（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ ａｎｄ Ｖａ ｌｅｎｔｉｎ（１９９２）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０３：２ １７）。これらの細菌から単離されたＰＨＡはまた、分枝状、ハロゲン化、芳香 族またはニトリル側鎖のような官能基をもつ成分を含有している（Ｓｔｅｉｎｂ ｕｃｈｅｌ ａｎｄ Ｖａｌｅｎｔｉｎ（１９９５）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ．Ｌｅｔｔ． １２８：２１９）。ＰＨＡの組成は、ＰＨＡポリメラーゼ系 、炭素源及び代謝経路に依存する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄａｗｅｓ（１ ９９０）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５４：４５０；Ｅｇｇｉｎｋら（１９９ ２）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０５：７５９；Ｈｕｉｓｍａｎ ら（１９８９）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．５５： １９４９；Ｌｅｎｚら（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：４３８５ ；Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ ａｎｄ Ｖａｌｅｎｔｉｎ（１９９５）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８：２１９）。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ中では、 ＰＨＡシンターゼの基質となる３−ヒドロキシアシル補酵素Ａチオエステルを合 成するための少なくとも３つの異なる代謝経路が存在する（Ｈｕｉｊｂｅｒｔｓ ら（１９９４）Ｊ．Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ．１７６：１６６１）。即ち、（ｉ）脂肪酸を炭素源として使用す るときの主要経路となるβ−酸化、（ｉｉ）グルコネート、アセテートまたはエ タノールのようなアセチル−ＣｏＡに代謝される炭素源で増殖するときの主要経 路となる脂肪酸のドウノボ生合成、（ｉｉ）アシル−ＣｏＡがアセチル−ＣｏＡ と縮合して２炭素の鎖延長β−ケト生成物を形成し、次いでこれが３−ヒドロキ シアセチル−ＣｏＡに還元される鎖延長反応、の経路が存在する。この最後の経 路は、ヘキサノエートで増殖するときのＰＨＡ合成に関与する。 Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのようなポリヒドロキシ酪酸を 蓄積する細菌中では、ＰＨＡＭＣＬシンターゼの一次構造の相同性がＰＨＡＳＣ Ｌシンターゼに拡大されるので（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌら（１９９２）ＦＥＭ Ｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０３：２１７）、ＰＨＡＭＣＬシンターゼ の基質は（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡであるらしいと考えられる。グ ルコネートのような非近縁基質に由来のＰ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２のポリ エステルの主成分は３−ヒドロキシデカノエートであるが、３−ヒドロキシヘキ サノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシ ドデカノエート、３−ヒドロキシドデセノエート、３−ヒドロキシテトラデカノ エート及び３−ヒドロキシテトラデセノエートが少量成分として生じる（Ｈｕｉ ｊｂｅｒｔｓら（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：１６６１）。従 って、ＰＨＡポリメラーゼの基質として作用できるように、アシルキャリヤータ ンパク質のヒドロキシアシル残基が対応するＣｏＡ誘導体に変換されると考えら れる。これは、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルトランスフェラーゼに介在される １段階反応（ＡＣＰからＣｏＡ）である。あるいは、３−ケトまたは直鎖のよう な異なる官能基レベルでアシル基の転移が生じ、得られたアシル−ＣｏＡが図１ に示すように別の酵素の作用によって３−ヒドロキシレベルに変換されることも 考えられる。また、直接転移に加えて、遊離脂肪酸がチオエステラーゼによって 遊離され次いで活性化されてＣｏＡ誘導体となる二段階プロセスの可能性も考え られる。これは図１に示すようにアシル−ＡＣＰのいずれかのレベルで生じるで あろう。 このような酵素はＰＨＡを産生する組換え生物の代謝操作に有用であり得ると 考えられるので、この変換に関与する（１つまたは複数の）タンパク質の解明は 実用面で重要である。例え ば、油を産生する植物（例えば、キャノーラまたは大豆）の種子中で（Ｒ）−３ −ヒドロキシアシルトランスフェラーゼが発現すると、アシル基が脂質合成（Ａ ＣＰ−結合状態）からポリマー産生（ＣｏＡ−結合状態）に直接転移され得る。 あるいは、同じ反応がチオエステラーゼ及びリガーゼの順次使用によって達成さ れる。 本文中に記載したｐｈａＧの単離は、脂質合成をポリマー産生に関連させる酵 素の単離の一例である。使用された方法はこのような遺伝子を細菌中で単離する モデル方法を提供する。発明の概要 本発明は、脂肪酸生合成とＰＨＡ産生との関連に関与するタンパク質をコード するヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡフラグメントを提供する。このフラグメ ントは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０を単純糖質基質 （例えばグルコネート）で増殖させるときに、この生物中でＰＨＡを産生するた めに必須であることが判明したタンパク質をコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０由来のｐｈａＧ遺伝子を含む。“ｐｈａＧ”と命 名されたこの遺伝子及びこの遺伝子によってコードされたタンパク質ＰｈａＧ、 並びに、これらと生物学的機能の等価物はそれそれ、植物を含む原核性及び真核 性の生物中でＰＨＡの新規なコポリマーを産生するために他のＰＨＡ生合成酵素 と共に使用され得る。ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子を非限定例とする別 のＰＨＡ生合成遺伝子と共にｐｈａＧ遺伝子またはその等価物を含んでおり且つ これらを発現し得る形質転換細菌及びトランスジェニック植物は、脂肪酸のドウ ノボ合成経路で単純炭素源からヒドロキシアシル−ＣｏＡ基質を形成でき、従っ て、石油化学由来のプラスチックと同様の物理的特性を有する新規な生分解性ポ リエステルを産生し得るであろう。 本発明はまた、脂質生合成の中間体をＰＨＡ生合成の中間体に変換するプロセ スに関与するタンパク質をコードする遺伝子を当業者が単離、同定及び特性決定 できるような方法を提供する。特に、ＰＨＡ生合成のためにアシル−ＡＣＰをア シル−ＣｏＡに直接変換させ得るＣｏＡ−ＡＣＰアシルトランスフェラーゼをコ ードする遺伝子を同定する方法が記載されている。 本発明の更に広い応用範囲は以下の詳細な記載から明らかにされるであろう。 しかしながら、以下の詳細な記載及び特定実施例は本発明の好ましい実施態様を 単なる代表例として示した ものであり、本発明の要旨及び範囲内の種々の変更及び修正は以下の詳細な記載 から当業者に明らかであろう。図面の簡単な説明 本発明の上記及びその他の目的、特徴及び利点は添付図面を参照した以下の詳 細な記載からより十分に理解されよう。これらの図面及び記載はすべて本発明の 代表例であり、本発明はこれらに限定されない。 図１は、脂肪酸のドゥノボ生合成経路のＰＨＡ合成中にＰｈａＧによって触媒 されて生じることが可能な反応の概略図である。チオエステラーゼ／リガーゼの 組合せはアシルトランスフェラーゼに関して詳細に図示しているアシル−ＡＣＰ 形態のいずれかに対して活性であり得ると考えられる。 図２は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０ ｐｈａＧ遺伝子の遺伝子座の分子 編成を表しており、 （ａ）は、ｐｈａＧ遺伝子を含むＥ３フラグメントの部分制限地図であり、 （ｂ）は、制限サブフラグメントＥ３、ＳＦ２２及びＢＨ１３を示しており、 （ｃ）は、ｐｈａＧの構造遺伝子の位置を、矢印で示すプロ モーターと共に表す。 配列１は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０ ＰｈａＧタンパク質の推定アミ ノ酸配列を示す。 配列２は、フラグメントＥ３のヌクレオチド配列を示し、ｐｈａＧをコードす るＤＮＡフラグメントのコーディング鎖を９１１位から１７９５位で示す。発明の詳細な説明 当業者が本発明を容易に実施できるように本発明を以下に詳細に記載する。し かしながら、当業者は本発明の要旨及び範囲から逸脱することなく本文に記載の 実施態様を修正及び変更できるので、以下の詳細な記載が本発明を不当に限定す ると理解してはならない。 本文中に引用した参考文献は本発明が属する技術分野の技術レベルの証拠とな る。これらの各参考文献の記載内容全部はそれらに引用されている参考文献と共 に参照によって本発明に含まれるものとする。 Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０ ＰＨＡＧＮ突然変異体は脂肪酸のドゥノボ 生合成経路で生じるＰＨＡ生合成の支流だけで欠失している。発明者らは、この 突然変異体の表現型相補性 検定によってｐｈａＧをＰ．ｐｕｔｉｄａのＰＨＡ生合成に好適な新規な遺伝子 座として同定し特性決定した。ＰＨＡＧＮ突然変異体中のβ−酸化を経由するＰ ＨＡ合成経路は阻害されていなかった。ＰＨＡＧＮ突然変異体はＰ．ａｅｒｕｇ ｉｎｏｓａ ＰＡＯ１のＰＨＡ−シンターゼ遺伝子座及び隣接のゲノム領域で相 補されなかった。対照的に、どの基質においてもＰＨＡ合成が完全に欠損してい たＰ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０の突然変異体はＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの ＰＨＡシンターゼ遺伝子座によって相補された。従って、ＰＨＡＧＮ突然変異体 は、ＰＨＡ−シンターゼ遺伝子座が欠失しているのでなく、ｐｈａＧがＰＨＡシ ンターゼ遺伝子座に密接に関連していない可能性が大きい。更にｐｈａＧは一般 には、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０中のＰＨＡ合成に必須ではなく、ＰＨＡ 合成が開始される前にこの生物中でアセチル−ＣｏＡに異化代謝されるグルコネ ートまたはその他の単純炭素源（例えば、グルコース、スクロース、フルクトー スまたはラクトース）からＰＨＡを合成し蓄積するためだけに必要とされる。図 １はＰｈａＧによって触媒されることが考えられる反応を示しており、これらの 反応のいずれかが阻止されると突然変異体の表現型が与えられる。 標識試験、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析及びガスクロマトグラフィー−質量 分光分析（ＧＣ−ＭＳ）の結果から、Ｅｇｇｉｎｋら（１９９２）ＦＥＭＳ Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１０５：７５９並びにＨｕｉｊｂｅｒｔｓら（１９ ９２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：５３６及び（１ ９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：１６６１は、単純炭素源からのＰＨ Ａ生合成の前駆体が主として脂肪酸のドゥノボ生合成経路で生じる（Ｒ）−３− ヒドロキシアシル−ＡＣＰ中間体に由来すると結論した。ＰＨＢ及びＰＨＡの成 分がＲ−配置で存在するので、ＰＨＡＳＣＬ及びＰＨＡＭＣＬのシンターゼは高 度に相同であり、脂肪酸代謝の中間体は重合以前に（Ｒ）−３−ヒドロキシアシ ル−ＣｏＡに変換され易い。しかしながら、別のＰＨＡ合成経路も有り得ると考 えられる。現在では、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステルがＰ ＨＡ合成の直接基質であるという可能性も排除できない。想到される別の代替経 路としては、チオエステラーゼの活性による遊離脂肪酸の放出がある。次いで、 この脂肪酸がリガーゼによって活性化され、対応するヒドロキシアシル−ＣｏＡ チオエステルになる。更に、ＡＣＰからＣｏＡへのアシル転移リン クが３−ヒドロキシチオエステルレベルでなく図１に示す別のアシル官能基レベ ルに存在する可能性も考えられる。 Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０の突然変異誘発は、グルコネートからのＰＨ Ａの生合成が完全に欠損した突然変異体を生じなかった。発明者らは、グルコネ ートで増殖させたときに細胞乾燥重量（ＣＤＷ）のわずか３％のＰＨＡを蓄積し た５つの突然変異体（以後の記載ではサブクラスＩの突然変異体と呼ぶ）及び５ 〜１６％のＣＤＷを蓄積した３つの突然変異体（サブクラス１１）を同定した。 検出可能な範囲では、全部の突然変異体がこの経路の典型的なモノマー組成のポ リエステルを含んでいた。しかしながら、得られた突然変異体の分析、相補性検 定、ｐｈａＧのゲノム編成は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０中で単純炭素源 からＰＨＡを合成するために必須の別のタンパク質が存在するという徴候を全く 示さなかった。従って、グルコネートからＰＨＡを合成するためには、オクタノ エートからのＰＨＡ合成には不要である追加の特異的酵素段階が１つだけ必要で あると考えられる。サブクラスＩの突然変異体によるＰＨＡの蓄積が少ないこと は上記の経路が存在することを証明しており、この経路は極めて低い効率でＰｈ ａＧ依存性経路に 並列に作用する。サブクラスＩＩの突然変異体によるＰＨＡの蓄積が比較的多い ことは、部分的に活性のｐｈａＧ遺伝子産物を残すような漏れ易い（ｌｅａｋｙ ）突然変異の結果であると考えられる。 ｐｈａＧがＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのｒｈｌＡ及びｑｉｎ領域のそれそれに 対して有している高い相同性は、これらのタンパク質の機能に類似の機能を示し ている。“キノリン感受性タンパク質”の正確な機能はまだ記載されたことがな い。ナリジキシン酸のようなキノロンは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのようなグ ラム陰性菌に対して強力な抗菌作用を示す合成抗生物質である。ｒｈｌＡ遺伝子 の産物はＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＰＧ２０１のラムノリピド生合成に関与する 。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａラムノリピド生体界面活性剤は後期対数増殖期及び 定常増殖期中に合成れる。ラムノリピド生合成は、グリコシルの逐次転移反応に よって進行する。各転移反応は特異的ラムノシルトランスフェラーゼによって触 媒され、ＴＤＰ−ラムノースはラムノシルドナーとして作用し、３−ヒドロキシ デカノイル−３−ヒドロキシデカノエートまたはＬ−ラムノシル−３−ヒドロキ シデカノイル−３−ヒドロキシデカノエートはアク セプターとして作用する。このことはＢｕｒｇｅｒら（１９６３）Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．２３８：２５９５及び（１９６６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ ｌ．８：４４１に記載されている。３−ヒドロキシデカノエートはβ−酸化経路 または脂肪酸生合成経路で形成され得る（Ｂｏｕｌｔｏｎ ａｎｄ Ｒａｓｔｌ ｅｄｇｅ（１９８７）Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ ｐ．４７）。２個のヒドロキシデカン酸分子から成る二量体は縮 合によって形成される。しかしながらこの段階の正確なメカニズムは未知である 。ＲｈｌＡは、ラムノシルートランスフェラーゼ（ＲｈｌＢ）と共に同時発現さ れるとき、単離されたｒｈｌＢ遺伝子の発現に比べて、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓ ａ ＰＧ２０１のラムノリピド陰性突然変異体中のラムノリピドのレベルを有意 に増進させる。アミノ酸分析によって、ＲｈｌＡのＮ末端の推定シグナルペプチ ドが判明した。これらの結果から、Ｏｃｈｓｎｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９７８７は、ＲｈｌＲタンパク質がラムノシルトランス フェラーゼ前駆体基質の合成または輸送に関与していること、及び、ＲｈｌＡが 細胞質膜中のＲｈｌＢタンパク質の安定に必要であることが示唆さ れた。ＰｈａＧのＮ−末端領域はまた、極性Ｎ−ドメイン、疎水性Ｈ−ドメイン 及びより低度に疎水性のＣ−ドメインのようなグラム陰性細菌中で見出されるシ グナルペプチドに共通の特性を幾つか有しているが、典型的な第二ターン及びＣ −ドメインの推定リーダーペプチダーゼ開裂部位は欠失している。短いリーダー 配列があるので、ＰｈａＧは最初は別の経路に関与していたが生物の進化中に機 能変化を生じたということも考えられる。 脂肪酸生合成によって生じる３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ中間体は恐らくは 、グルコネートからＰＨＡ及びラムノリピドを生合成する双方の経路に共通の中 間体であろう。ＡＣＰ誘導体がそれ自体ではＰＨＡシンターゼの基質またはラム ノリピド生合成中の２つの３−ヒドロキシデカノイル部分の縮合に関与する酵素 の基質として作用しないとしても、ＡＣＰ誘導体は対応するＣｏＡ誘導体に直接 トランスエステル化されるかまたはチオエステラーゼとリガーゼとの組合せ作用 によってＣｏＡチオエステルに転移されるかもしれない。従って、図１を参照す ると、ＰｈａＧは、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰから（Ｒ）−３−ヒ ドロキシアシル−ＣｏＡ誘導体への変換を触 媒する（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ−ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ であるかもしれない。（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ誘導体は、Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｄｓ中で非近縁の基質からＰＨＡ重合を行う最終前駆体として作 用する。このことは、Ｅｇｇｉｎｋら（１９９２）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ．Ｒｅｖ．１０５：７５９及びｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｉｊ ａｎｄ Ｗｉｔｈ ｏｌｔ（１９９５）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１，Ｓｕｐｐ．１：２ ２に記載されている。あるいは、ＰｈａＧは上記の３−ヒドロキシ官能性以外の アシル基特異性をもつＣｏａ−ＡＣＰアシルトランスフェラーゼであるかもしれ ない。または、ＰｈａＧは特異的チオエステラーゼまたはリガーゼに関連した活 性を有しているかもしれない（図１参照）。更に、ＰｈａＧは触媒酵素でなく、 アシル基転移反応またはチオエステラーゼもしくはリガーゼ活性を触媒する触媒 タンパク質複合体を安定または調節するタンパク質であるかもしれない。定義 本発明の詳細な記載が当業者に理解し易いように本文中に使用した用語を以下 に定義する。 “ＡＣＰ”はアシルキャリヤータンパク質を意味する。 “ＣｏＡ”は補酵素Ａを意味する。 “ＣｏＡ−ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ”または“アシルトランスフェラ ーゼ”は、ＡＣＰとＣｏＡとの間のアシル基転移を触媒する酵素を意味する。 “Ｃ−末端領域”は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質の鎖の中央から遊 離カルボキシル基を有しているアミノ酸を担持する末端までの領域を意味する。 “プロモーター領域にヘテロロガスなＤＮＡセグメント”なる表現は、コーデ ィングＤＮＡセグメントが本来は、該セグメントと結合状態にあるプロモーター と同じ遺伝子中には存在しないことを意味する。 “コーディングＤＮＡ”なる用語は、本文中に記載の酵素のいずれかをコード する染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡを意味する。 細菌に使用されたときの“ゲノム”なる用語は、細菌宿主細胞中の染色体及び プラスミドの双方を包含する。従って、細菌宿主細胞に導入される本発明のコー ディングＤＮＡは染色体に組込まれてもよくまたはプラスミドに局在してもよい 。植物細 胞に使用されたときの“ゲノム”なる用語は、核の内部に見出される染色体ＤＮ Ａだけでなく、細胞レベル以下の細胞成分内部に見出されるオルガネラＤＮＡを 包含する。従って、植物細胞に導入される本発明のＤＮＡは染色体に組込まれて もよくまたはオルガネラに局在してもよい。 “リガーゼ”なる用語は、遊離脂肪酸の活性化を触媒してＣｏＡチオエステル を産生させる触媒を意味する。 “微生物”または“微小動植物”なる用語は、藻類、細菌、真菌類及び原生動 物を意味する。 “ミューテイン（ｍｕｔｅｉｎ）”なる用語は、ペプチド、ポリペプチドまた はタンパク質の突然変異形態を意味する。 “Ｎ−末端領域”は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の鎖の遊離ア ミノ基を有するアミノ酸から鎖の中央までの領域を意味する。 “超発現”なる用語は、宿主細胞に導入されたＤＮＡによってコードされたポ リペプチドまたはタンパク質の発現に関する用語であり、該ポリペプチドまたは タンパク質が通常は宿主細胞中に存在しない場合、または、該ポリペプチドまた はタンパク質がそれらをコードする外因性遺伝子から正常に発現される レベルよりも高いレベルで宿主細胞中に存在する場合を表している。 “プラスチド（色素体）”なる用語は、アミロプラスト、葉緑体、クロモプラ ロスト、エライオプラスト、エオプラスト、エチオプラスト、白色体及びプロプ ラスチド（原色素体）を含む植物細胞オルガネラのクラスを意味する。これらの オルガネラは、自律複製性であり、“葉緑体ゲノム”という通称で呼ばれる環状 ＤＮＡ分子を含む。このＤＮＡ分子は植物の種類次第で約１２０〜約２１７ｋｂ の範囲のサイズを有しており、通常は逆方向末端反復配列を含んでいる。 “ＰＨＡ生合成遺伝子”及び“ＰＧＡ生合成酵素”なる表現は、ＰＨＡ産生経 路の同化反応に導く遺伝子または酵素を意味する。 “ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼ”なる表現は、ヒドロ キシアシル−ＣｏＡをポリヒドロキシアルカノエートと遊離ＣｏＡとに変換する 酵素を意味する。 “単純糖質基質”なる表現は、単糖またはオリゴ糖を意味するが多糖を意味し ない。単純糖質基質は、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトースを 包含する。コーンシロップ、 デンプン及び糖蜜のような媒体中で常用されるより複雑な糖質基質は単純糖質基 質まで分解され得る。 “チオエステラーゼ”なる用語は、アシル−ＡＣＰ基から遊離脂肪酸とＡＣＰ とを生じる加水分解を触媒する酵素を意味する。材料及び方法 細菌の増殖 ： 大腸菌は、ルリア−ベルタニ（ＬＢ）培地で３７℃で増殖させた。Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｄｓは、栄養ブイヨン（ＮＢ；０．８％，ｗｔ／ｖｏｌ）の複合培地 または０．０５％（ｗ／ｖ）のアンモニアを加えた無機塩培地（ＭＭ）（Ｓｃｈ ｌｅｇｅｌら（１９６１）Ａｒｃｈ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．３８：２０９）で３ ０℃で増殖させた。ポリエステル分析 ： 細菌のポリエステル含量を測定するために、３〜５ｍｇの凍結乾燥細胞材料を １５％（ｖ／ｖ）の硫酸の存在下でメタノール分解処理した。得られた３−ヒド ロキシアルカン酸成分のメチルエステルを、Ｂｒａｎｄｔら（１９８８）Ａｐｐ ｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：１９７７のガ スクロマトグラフィー（ＧＣ）を最近詳細に記載された手順（Ｔｉｍｍ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ．５６：３３６０）で行うことによって検定した。ＲＮＡ及びＤＮＡの単離 ： 全ＤＮＡは、Ｏｅｌｍｕｌｌｅｒら（１９９０）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍ ｅｔｈ．１１：７３に記載の手順で単離した。プラスミドＤＮＡは粗溶菌液から アルカリ抽出手順（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ（１９７９）Ｎｕｃｌ ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７：１５１３）によって調製した。全ゲノムＤＮＡはＡ ｕｓｕｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ ，ＵＳＡに従って単離した。ＤＮＡの分析及び操作 ： 単離したプラスミドＤＮＡは、種々の制限エンドヌクレアーゼを用いて、Ｓａ ｍｂｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹまたは製造業者によって記載された条件下で消化した。ＤＮ Ａ制限フラグメントは、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキット（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ ．ａｎｄ Ｄ．Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：６１５）を用いてアガロースゲルから単離した。ＤＮＡの導入 ： 形質転換のためには、２０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＬＢ培地で大腸菌を好気的 に増殖させた。コンピテント細胞を調製し、Ｓａｍｂｏｏｋら（１９８９）Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹによって記載さ れた塩化カルシウム手順を用いて形質転換させた。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４ ４０突然変異体（レシピエント）とハイブリッドドナープラスミドを担持する大 腸菌Ｓ１７−１（ドナー）との交配は、“ミニ相補性検定（ｍｉｎｉｃｏｍｐｌ ｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）”に基づいて行った。３００μｌの濃縮レシピエント細 胞懸濁液（ＯＤ４３６ｍｍ＝１００）を１．５％のグルコネートまたは０．３％ のオクタノ エートと２５ｍｇ／リットルのテトラサイクリンを補充したＭＭ培地寒天プレー トに流した。５分間のインキュベーション後、異なる５０個のドナー菌株の細胞 をコロニーから楊枝でレシピエント層を含む寒天プレートの各々に移した。プレ ートを３０℃で３６時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの合成 ： Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｐｌｕｓ装置を用い製造業者（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ−ＬＫＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって提供されたプロトコ ルに従ってデオキシヌクレオシドホスホアミジット（Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２： １８５９）から０．２μｌの部分量で合成オリゴヌクレオチドを合成した。オリ ゴヌクレオチドを支持体マトリックスから遊離させ、２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ） アンモニア中、５５℃で１５時間のインキュベーションによって保護基を除去し た。最後に、オリゴヌクレオチドをＮＡＰ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｌ ＫＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に通すことによって精製した。ＤＮＡ配列解析 ： Ｔ７−ポリメラーゼ配列決定キットを製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のプロトコルに従って用い、ｄＧＴＰの代わ りに７−デアザグアノシン５’−三リン酸（Ｍｉｚｕｓａｗａ，Ｓ．ら（１９８ ６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：１３１９）及び〔α３５Ｓ〕−ｄＡ ＴＰを用い、Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３によるジデオキシ−チェーンターミネーション法を 用いることによって、一本鎖または二重鎖のアルカリ変性プラスミドＤＮＡに対 するＤＮＡ配列決定を行った。合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用 し、“プライマー−ホッピング戦略”（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｅ．Ｃ．ら（１９８６ ）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５４：３５３）を使用した。配列決定反応の生 成物を、Ｓ２−配列決定装置（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇ ｅｒｍａｎｙ）中で、１００ｍＭの塩酸塩、８３ｍＭのホウ酸、１ｍＭのＥＤＴ Ａ及び４２％（ｗｔ／ｖｏｌ）の尿素を含有するバッファ（ｐＨ８．３）中の８ ％（ｗ ｔ／ｖｏｌ）のアクリルアミドゲルで分離し、Ｘ線フィルムで可視化した。配列データの分析 ： 配列解析ソフトウェアパッケージ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓ ｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）（Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．２，１９９０年６月 ）を使用し、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７によって、核酸配列データ及び推定アミノ酸配列を分析した。転写開始部位の決定 ： ヌクレアーゼ保護アッセイによって転写開始部位の決定を行った。Ｓ１ヌクレ アーゼ保護アッセイのハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｋ ａｎｄ Ｓｈ ａｒｐ（１９７７）Ｃｅｌｌ １２：７２１及びＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９ ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ ａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに詳細に 記載された条件を用い、Ｓ１ヌクレアーゼ反応はＡｌｄｅａら（１９８８）Ｇｅ ｎｅ ６５：１０１に記載された方法で行った。シグナルのサイズを決めるＤＮ Ａプローブ及びデオキシヌクレオチドの配列決定反応は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔ ＳＫ−ＢＨ１３ ＤＮＡ（表１及び図１）を鋳型として行った。アニーリン グ反応では、それぞれ、８８７〜８７１位に相補的なオリゴヌクレオチド（５’ −ＧＧＧＴＡＴＴＣＧＣＧＴＣＡＣＣＴ−３’）及び９８６〜９７０位に相補的 なオリゴヌクレオチド５’−ＣＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧＣＧＡＴＡＧ−３’を〔³⁵ Ｓ〕標識のために使用した。全部のマッピング実験では、２５μｇのＲＮＡを標 識ＤＮＡフラグメントと混合した。特異的標識率は１μｇのＤＮＡあたり１０７ ｃｐｍを上回っていた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） ： Ｏｍｉｎｇｅｎｅサーモサイクラー（Ｈｙｂａｉｄ Ｌｔｄ.，Ｔｅｄｄｉｎ ｇｔｏｎ，Ｕ．Ｋ．）及びＶｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ ｉｏｌａｂｓ ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、 Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに従って１００μｌ 容量でＰＣＲ増幅を行った。部位特異的突然変異誘発のために、以下のヘテロロ ガスプライマーを（５’から３’の方向で）使用した：人工のＢａｍＨＩ部位及 びＮｄｅＩ部位を含むＴＴＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＧ ＧＣＣＡＧＡＡＡＴＣ、及び、ｐｈａＧの下流に天然型ＨｉｎｄＩＩＩ部位を担 持しているＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＴＣＧＧＣＧ。細胞抽出物の調製 ： 約１ｇ（湿潤重量）の大腸菌細胞を、１ｍｌのバッファＡ（１ｍｌあたり２０ ０μｇのフェニルメチルスルホニルフルオリドを補充した５０ｍＭのトリス塩酸 塩；ｐＨ７．４，０．８％’ｖｏｌ／ｖｏｌ）のトリトン−Ｘ１００、１０ｍＭ の塩化マグネシウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ）に浮遊させ、Ｗ２５０音波処理装置 （Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｃｈａｌｌｋｒａｆｔ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で １４μｍの振幅で１分間音波処理することによって破壊した。４℃、５０，００ ０×ｇで３０分間遠心することによって可溶性細胞画分が上清として得られた。電気泳動法 ： ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びメルカプトエタノールで変性したタン パク質を、トリス−グリシンバッフア（２５ｍＭのトリス、１９０ｍＭのグリシ ン、０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＳＤＳ（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）中の１１ ．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリアクリルアミドゲルで分離した。タンパク質をク ーマシーブリリアントブルー（Ｗｅｂｅｒ ａｎｄ Ｏｓｂｏｒｎ，１９６９） で染色した。化学物質 ： 制限エンドヌタレアーゼ、ＤＮＡ検出キット、ＲＮＡ分子量マーカー、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡ修飾酵素は、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｇ ｍｂＨ（Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ＲＮアーゼ非 含有ＤＮＡアーゼ、アガロースＮＡ及びホスホアミジットは、Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ−ＬＫＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。ホルムアルデヒド は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｇａｕｔｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ ）から入手した。ホルムアミド、臭化エチジウム及びＥＤＴＡは、Ｓｅｒｖａ Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ，Ｇｅ ｒｍａｎｙ）から入手した。複合培地は、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ）から入手した。その他の全部の化学物質は、Ｅ． Ｍｅｒｃｋ ＡＧ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した最高純 度の製品であった。実施例１ 脂肪酸のドゥノボ生合成経路のＰＨＡ合成が欠損した突然変異体の単離 ＰＨＡ代謝が阻害されたＰ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０の突然変異体を得る ために、Ｍｉｌｌｅｒら（１９７２）に従ってニトロソグアニジン突然変異誘発 を行った。１ｍｌあたり２００μｇのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ グアニジンの存在下で細胞を１５分間インキュベートした。適宜希釈した細胞浮 遊液を、０．０５％（ｗ／ｖ）のアンモニアと単独炭素源となる１．５％（ｗ／ ｖ）のグルコン酸ナトリウムとを含む無機塩培地（ＭＭ）−寒天プレートで平板 培養した。コロニーの混濁度の違いに基づいてＰＨＡ蓄積細胞とＰＨＡ非蓄積細 胞とを識別した。ＰＨＡシンターゼ遺伝子座が欠失しておりどの基質からもＰＨ Ａを合成しなかった突然変異体と、脂肪酸のドゥノボ生合成経路のＰＨＡ合成だ けが欠失していた突然変異 体とを識別するために、透明コロニーの細胞もＭＭ−グルコネートプレートから ０．３％のオクタン酸ナトリウムを含むＭＭ−寒天プレートに移した。グルコネ ート寒天プレートでは透明コロニーを形成したがオクタノエート寒天プレートで は不透明コロニーを形成した突然変異体を、ＰＨＡＧＮ表現型突然変異体と命名 した。これらを液体培地で２日間増殖させ、細胞をガスクロマトグラフィーで処 理して、ＰＨＡの含量及び組成を分析した。発明者らは、細胞乾燥重量（ＣＤＷ ）の３％以下の僅かなＰＨＡを蓄積した５つの突然変異体（以後サブクラスＩの 突然変異体と呼ぶ）とグルコネートで増殖させたときに５〜１６％のＣＤＷを蓄 積した３つの突然変異体（サブクラスＩＩ）とを同定した。表１参照。双方のサ ブタラスの代表は、オクタノエートを唯一の炭素源として培養したときには正常 量のＰＨＡ（ＣＤＷ８５％以下）を蓄積した。ポリマーの組成は検出可能な範囲 では変化していなかった。これらの突然変異体はオクタノエートまたはグルコネ ートで細胞増殖が阻害されることはなく野生型と同じ速度で増殖した。これらの 突然変異体に加えて、グルコネート及びオクタノエートからのＰＨＡの合成が欠 損した２つの突然変異体が得られた（表１参照）。従って、これらの突然変異体 は既に 単離されていた突然変異体Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＧｐＰ１０４（Ｈｕｉｓｍａｎら （１９９２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：５３６） と同じ表現型を示した。 本発明では化学的突然変異誘発を使用したが、その他の多くの化学的、生物学 的及び物理学的な突然変異体作製方法（例えば、他の突然変異誘発物質、トラン スポゾンまたはＵＶ光）は当業者に明らかであろう。 表１．この試験で使用した細菌株プラスミド、バクテリオファージ及びＤＮＡフ ラグメント 実施例２ 脂肪酸のドゥノボ生合成経路のＰＨＡ合成が阻害された突然変異体の相補性 ＥｃｏＲＩ消化したＰ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０のゲノムＤＮＡのライブ ラリーを、大腸菌Ｓ１７−１中のコスミドベクターｐＶＫ１００（Ｋｎａｕｆ ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｒ（１９８２）Ｐｌａｓｍｉｄ ８：４５)及びＧｉｇａｐ ａｃｋ ＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆ． ）によって構築した。約５，０００のトランスダクタント（形質導入体）に対し 、ＰＨＡＧＮＩ型突然変異体２：１をレシピエントとして用いてミニ相補性検定 を行った。１．５％のグルコネートを補充したＭＭ−寒天プレートで３０℃で２ 日間インキュベーション後、トランスダクタントコロニーの混濁度によって表現 型の相補性を観察した。ハイブリッドコスミドの１つ（ｐＶＫ１００：：Ｋ１８ ）が３つのＥｃｏＲＩフラグメント（３、６及び９ｋｂ）を担持し、ＰＨＡＧＮ １突然変異体はアセチル−ＣｏＡ経路で異化代謝された炭素源からのＰＨＡの蓄 積を再開していた。これらのフラグメ ントを、ＥｃｏＲＩ消化した広宿主域ベクターｐＭＰ９２（Ｓｐａｉｎｋら（１ ９７８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：２７）にサブクローニングし、次 いで突然変異体２：１に接合的に導入させると、３ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメ ントが相補性であることが判明した。このフラグメントをＥ３（図２）と命名し た。このフラグメントはこの表現型を示す８個の単離フラグメントのすべてに相 補性であった。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１の７． ３ｋｂｐの完全ＰＨＡシンターゼ遺伝子座とこの遺伝子伝座の上流領域の約１３ ｋｐｂとを含むハイブリッドコスミドｐＨＰ１０１６：：ＰＰ２０００、または 、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１のｐｈａＣ２遺伝子と下流隣接領域の約 １６ｋｂｐとから成るハイブリッドコスミドｐＨＰ１０１６：：ＰＰ１８０は相 補性でなかった（Ｔｉｍｍ ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｂｕｃｈｅｌ（１９９２）Ｅｕ ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１５）。この試験に使用したＰＨＡ合成が完 全に欠損していた２つの突然変異体はｐＨＰ１０１６：：ＰＰ２０００ハイブリ ッドコスミドに相補性であったが、ｐｈａＣ２遺伝子の上流の機能性プロモータ ーの欠失したｐＰＨ１０１６：：ＰＰ１８０構築物またはプラスミド ｐＶＫ１００：：Ｋ１８に相補性でなかった。 Ｅ３フラグメントを含むプラスミドを担持している突然変異体ＮＫ２：１は、 １９９５年４月１２日にＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ Ｖｏｎ Ｍｉｋ ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳ Ｍ），ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅΓ Ｗｅｇ．１ｂ，Ｄ−３３００ Ｂｒａｕｎｓｃ ｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託番号ＤＳＭＺ９９２２で寄託した。実施例３ アシルトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ及びアシル−ＣｏＡリガーゼの遺 伝子の追加クローニング方法 実施例１及び２で前述したｐｈａＧ突然変異体の単離及び相補によるｐｈａＧ のクローニングは、炭素化合物が脂質生合成からＰＨＡ生合成に転移する際にに 関与する遺伝子を検出する方法を提供する。このプロセスに関与する遺伝子の追 加クローニング方法が必要であることは当業者に明らかであろう。このような方 法は、生化学的方法、遺伝的方法及び分子クローニング方法の組合せから成る。 ｉ．アシルトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ及びアシ ル−ＣｏＡリガーゼの活性に関する酵素アッセイの開発によって、コーディング 遺伝子の新しいクローニング方法が提供されるであろう。 Ｃｏａ−ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ活性を検出するための多数の方法が 存在する。１つの方法では、アシル−ＣｏＡを出発基質として用いてＡＣＰのア シル化を分析し、アシル−ＡＣＰ産物を尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （尿素−ＰＡＧＥ）によって同定する。尿素−ＰＡＧＥは、ＡＣＰプール組成物 の分解に有用であることが証明されている（ｐｏｓｔ−Ｂｅｉｔｔｅｎｍｉｌｌ ｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８５８；Ｋｅａｔｉｎ ｇら（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：２６６２）。ゲルに対する 検出は、クーマシーブルーによって行うか、または、出発アシル−ＣｏＡのアシ ル基が放射性標識されているときはオートラジオグラフィーによって検出する。 あるいは、アシル−放射性標識アシル−ＣｏＡまたはアシル−ＡＣＰを出発基質 として使用するときは、９６ウェルフォーマットで高スループットスクリーニン グを実施し得る。この場合、アシル−ＡＣＰをトリクロロ酢酸水溶液（Ｋｏｐｋ ａら（１９９５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．２２４：５１）で選択的に沈殿させ、市販の９６ウェルのフィルター プレートを用いて分離し、洗浄し、種々のコンパートメントの放射能を定量する 。アシル−ＣｏＡ及びＣｏＡは溶出液捕獲プレートに捕獲されるが、沈殿したＡ ＣＰ及びアシル−ＡＣＰはフィルターにトラップされる。市販の任意のプレート カウンターを用いてカウントする。これらの方法は種々の組成のアシル基に対し て、即ち、直鎖、２，３−エノイル−、３−ヒドロキシ−または３−ケト−のよ うな官能基に対して同等に有効でなければならない。 所望の場合に９６ウェルプレートで行うアシルトランスフェラーゼ分光分析ア ッセイは、アシル基の官能価次第で異なる酵素結合系によってアシル−ＡＣＰか らアシル−ＣｏＡへの変換をモニターするように設計され得る。例えば、アシル 基が３−ヒドロキシのとき、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼに 結合させ、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変換を３４０ｎｍでモニターすることによ って３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの形成を検出し得る。３−ケト官能基は同様 の方法を逆方向にしてモニターできる。直鎖または２，３−エノイルアシル基の 場合には、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼと検 出すべきＮＡＤ＋またはＮＡＤＨとが最終的に得られるように同様にして設計す るが結合反応スキームが延長している。 リガーゼの機能は、典型的にはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を化学的活性 化物質として用いて遊離脂肪酸をＣｏＡチオエステルのレベルまで活性化するこ とである。このプロセスで、ＮＴＰはピロリン酸塩（ＰＰｉ）及びヌクレオチド −リン酸（ＮＭＰ）に変換される。記載のアシルトランスフェラーゼアッセイと 同様にしてリガーゼ活性の検出アッセイを設計し得る。即ち、形成されたアシル −ＣｏＡ産物は（直鎖、２，３−エノイル−、３−ヒドロキシ−または３−ケト −官能基のいずれであるかに関わりなく）直接または延長結合系によって３−ヒ ドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼに結合され得る。検出はやはり分光光 度測定によって３４０ｎｍのＮＡＤＨの産生または消費をモニターすることによ って行う。あるいは、リガーゼが実際にＮＴＰを活性化物質として使用する場合 には、無機のピロホスファターゼを用いてＰＰｉを遊離燐酸塩に変換後に分析し 得る。遊離燐酸塩は標準的な燐酸塩ベースのアッセイを用いて定量され得る。 アシル−ＡＣＰがチオエステラーゼによって加水分解されて 遊離脂肪酸及び遊離ＡＣＰが形成されることは、放射性標識アシル−ＡＣＰを用 いる９６ウェルフォーマット及び上述のフィルタープレート技術で検出できる。 しかしなから、この特定の場合には、溶出液捕獲プレート中に出現する放射性標 識された遊離脂肪酸がモニターされるかまたはフィルタープレート中に残存する 沈殿形態の加水分解されない放射性標識アシル−ＡＣＰがモニターされる。９６ ウェルフォーマットで使用し得る別のアッセイでは、エルマンの試薬５，５’− ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）によって遊離ＡＣＰ中のホス ホパンテテイン基からスルフヒドリル基を検出する。この試薬は遊離スルフヒド リルと反応して、吸光係数１３．６ｍＭ−１ｃｍ^-1（Ｅｌｌｍａｎ，１９５９） の濃い黄色を生じる。 ｉｉ．酵素精製手段である酵素アッセイを使用し、タンパク質配列から得られ た情報を用いて遺伝子を単離し得る。精製されたタンパク質をプロテアーゼで消 化し、フラグメントを精製する。種々のフラグメントを標準技術及びタンパク質 配列に基づいて作製された縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて配列決定す る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。これらのプ ローブを対象生物から作製したゲノムライブラリーにハイブリダイズさせる（Ｓ ａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。プローブにハイブリダイズするクローンを配列決定し、 正しい遺伝子のクローニングを確認するために、ＤＮＡから予測されたアミノ酸 配列をタンパク質から決定されたアミノ酸配列に比較する。 ｉｉｉ．細菌溶解液中の酵素活性を検出することによって、無作為に作製した 突然変異体から活性の欠如した突然変異体をスクリーニングし得る。前述の手段 のいずれかによって突然変異体を作製し、各突然変異誘発反応で得られた数千の クローンを適当な酵素活性に基づいてスクリーニングする。あるいは、精製タン パク質に対して産生させた抗体を用い、酵素の欠如に基づいて突然変異体をスク リーニングする（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）。これらのスクリーニングで同定された突然変異体はいずれもアシルトラ ンスフェラーゼ遺伝子を同定するために前述のように相補性検定する。 ｉｖ．β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰをβ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換 する任意の酵素または酵素の組合せは、ＰＨＡシンターゼを担持するだけのＰＨ Ａ陰性細菌を、所望の活性を有すると予測される生物から構築されたゲノムライ ブラリーで形質転換させることによってクローニングし得るであろう。β−ヒド ロキシアシル−ＣｏＡは、ＰＨＡ合成の基質としてＰＨＡポリメラーゼによって 直接に使用され、従って、前述のような単純炭素源からのＰＨＡの産生をスクリ ーニングし得る。ＰＨＡを作製するいずれの菌株に対しても、ＰＨＡ合成がアシ ルトランスフェラーゼ、チオエステラーゼとリガーゼとの組合せ、またはβ−ケ トチオラーゼとアシル−ＣｏＡレダクターゼとの組合せのクローニングに起因す るか否かを判定する試験を 行う。 ｖ．所望の活性をコードしている遺伝子は、大腸菌に担持されたプラスミドま たはλファージにクローニングした対象生物に由来のＤＮＡの発現ライブラリー を用いて同定できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃ ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃ ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。クローニングした遺伝子から発 現されたタンパク質を、クローンの直接酵素アッセイによってまたは精製タンパ ク質に対して産生された抗体を用いるクローンのスクリーニングによって検定す る。アシルトランスフェラーゼ、チオエステラーゼまたはリガーゼをコードして いることが同定されたクローンの制限地図を作成し、対応する遺伝子を同定する ためにサブクローニングし、遺伝子を配列決定し、遺伝子によって予測されるア ミノ酸配列を精製タンパク質の配列決定から得られたアミノ酸配列に比較する。 ｖｉ．ｐｈａＧの発現は、細胞がグルコネートで増殖するかまたは脂肪酸で増 殖するかに依存しており（実施例６参照）、 ＡＣＰからＣｏＡへのアシル基の転移に関与するタンパク質に関しても、該タン パク質の活性は単純炭素源からＰＨＡを合成するときにだけ必要とされるので、 同様の調節が存在すると予想される。差別的に発現される遺伝子は、削減的（ｓ ｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）なｃＤＮＡプローブを用いて（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１ ９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ ａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ） 、または、削減（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）手順（Ｋｉｍら（１９９３）Ｊ．Ｍ ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３１：９６０）後のｃＤＮＡの直接クローニングによってク ローニングできる。ｃＤＮＡ合成は、ｍＲＮＡのポリ−Ａテールにアニーリング するオリゴ−ｄＴプライマーを用いてプライミングされ得る。ポリ−Ａテールは 多数の原核生物中のｍＲＮＡ分子の少なくとも１つのサブセットに存在し、オリ ゴ−ｄＴプライマーを用いて細菌ｃＤＮＡライブラリーが作製されている（Ｋｕ ｓｈｎｅｒ（１９９６）ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ． ，ｐ．８４９；Ｋｉｍら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２ ３１：９６０；Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａ ａｎｄ Ｓａｋａｒ（１９８２） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２７４７）。代替的なプライミング戦略では 、ｃＤＮＡ合成をプライミングするためにランダムオリゴヌタレオチドを利用す る（Ｋｉｍら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３１：９６０）。ｃＤＮＡ 削減手順の後、対象生物のゲノムライブラリーからクローンを同定するためのハ イブリダイゼーションスクリーニングにプローブを使用する。あるいは、ｃＤＮ Ａを直接にクローニングする。このスクリーニングで同定されたクローンを配列 決定し、予測されるアシルトランスフェラーゼを同定するために種々の公知のア シルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及びｐｈａＧに比較する。これらの クローンはまた、ｃＮＤＡの作製のもとになるｍＲＮＡをコードする完全遺伝子 を含有するゲノムクローンを同定するためのプローブとして使用され得る。更に 、ランダムプライムされたｃＤＮＡ（全遺伝子をコードしてはいないと考えられ る)を自殺ベクターにクローニングし（例えば、Ｌｅｎｚら（１９９４）Ｊ．Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：４３８５によって使用されたベクター）、突然変異 体を産生させるためにソース生物のゲノムに組込み、単純炭素源から ＰＨＡを産生する突然変異体の能力を分析する。ＰＨＡ合成が阻害された突然変 異体は、実施例２で前述したように対象生物のゲノムクローンを用いて相補性検 定し得る。 ｖｉｉ．差別的に発現されたタンパク質は、２次元ポリアクリルアミドゲル電 気泳動を用いて直接検出され得る。この方法は、大腸菌中のレギュロン調節下の タンパク質を研究するためにＮｅｉｄｈａｒｄｔ及び彼の共同研究者によって利 用されて成功した（例えば、ＶａｎＢｏｇｅｌｅｎら（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ．１７８：４３４４）。炭素源に応じて差別的に調節されることが確 認されたタンパク質を精製し配列決定して、これらをコードしている（１つまた は複数の）遺伝子を前述のようにクローニングし分析し得る。実施例４ ｐｈａＧの遺伝子座及びヌクレオチド配列の決定 ３ｋｂｐのＥ３フラグメント（図２）をｐＢｌｕｅｓｋｒｉ ｐｔ ＳＫべク ターにクローニングし、汎用の逆向きの合成オリゴヌクレオチドをプライマーと して用いることによって、ジデオキシ−チェーンターミネーション方法及びプラ イマーホッピング戦略によってヌクレオチド配列を決定した。配列表の配 列１は、フラグメントＥ３のヌクレオチド配列を示す。このフラグメントは、３ つのＯＲＦをもつ３，０６１のヌクレオチドから成る。このフラグメントに局在 するＯＲＦ１及びＯＲＦ３は不完全であり、ＯＲＦＩは５’−領域が欠失し、Ｏ ＲＦ３は３’−領域が欠失している。図２参照。ＯＲＦ１の推定アミノ酸は、Ｈ ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの特性未決定の仮定タンパク質（ Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ，Ｒ．Ｄ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：４ ９６）に有意な相同性を有することが判明した。対照的に、ＯＲＦ３の場合、Ｅ ＭＢＬデータベースから入手できる配列をもつ他のいかなる遺伝子産物に対して も有意な相同性を検出することができなかった。 このフラグメントに局在する唯一の完全なＯＲＦは、８８５のヌクレオチドを もつ中央のＯＲＦ２であり、これをｐｈａＧと命名した。このＯＲＦは９１１位 に起点をもち、１７９５位に終点をもつ。この上流に８個のヌクレオチド離れて 仮のＳ／Ｄ配列が存在した。ｐｈａＧの翻訳終止コドンの約２３０ｂｐ下流に、 因子依存性でない転写ターミネーターが局在すると考えられる。数個の他のＯＲ Ｆが検出された。しかしながら、こ れらはいずれもコーディング領域に関するＢｉｂｂ．Ｍ．Ｊ．ら（１９８４）Ｇ ｅｎｅ ３０：１５７の法則に適合しないかまたは上流に確実なリボソーム結合 部位を有していなかった。実施例５ ｐｈａＧ翻訳産物の特性決定 ３つのＯＲＦ全部に使用されているコドンは、典型的なＰ．ｐｕｔｉｄａの採 択コドンに十分に合致しており、５９．２モル％というｐｈａＧのＧ＋Ｃ含量は 、Ｐ．ｐｕｔｉｄａの全ゲノムＤＮＡで測定された６０．７〜６２．５モル％と いう値（Ｒｏｔｈｍｅｌら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０ ４：４８５及びＳｔａｎｉｅｒら（１９６６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ．４３：１５９）に近似しており、また、ｐｃｈＣ（６２．１モル％）及びｐｃ ｈＦ（５９．６モル％）（Ｋｉｍら（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７ ６：６３４９）及び他のＰ．ｐｕｔｉｄａ遺伝子（Ｈｏｌ１ｏｗａｙ ａｎｄ Ｍｏｒｇａｎ（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：７９ ；Ｍｉｓｒａら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５９７９；Ｎａｋａｉら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８： ２９２３）のＧ＋Ｃ含量に極めて近い値である。 ｐｈａＧ遺伝子は、２９５個のアミノ酸から成る分子量３３，８７６Ｄａのタ ンパク質をコードしている。推定されたアミノ酸配列を配列表の配列１に示す。 配列の位置合せによれば、ｐａｇＧから推定されたアミノ酸はＰｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＧ２０１のｒｈｌＡ遺伝子産物に全体で４４ ％の一致を有することが判明した(Ｏｃｈｓｎｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９７８７)。ＲｈｌＡもまた、２９５個のアミノ酸から 成り、分子量３２．５ｋＤａを有している。この遺伝子は、ｒｈｌａ、ｒｈｌＢ 及びｒｈｌＲから成る遺伝子クラスターの５’−末端の遺伝子を表す。最初の２ つの遺伝子は、ラムノリピド生合成に関与するタンパク質をコードする構造遺伝 子を表し、ＲｈｌＲはσ５４依存性プロモーターに作用する転写アクチベーター を表す。ｒｈｌＢ遺伝子産物は、ラムノシルトランスフェラーゼ活性を示した。 ＲｈｌＡの機能はまだ特性決定されていないが有効なラムノリピド生合成に必要 である（Ｏｃｈｓｎｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９ ７８７）。ＲｈｌＡ及びＰｈａＧのＣ−末端領域は、所謂“キノロン感受性タン パク 質”をコードするＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの遺伝子領域（ｑｉｎ）に高い相同 性を示した（Ｔｏｎｅｌｌｉ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ Ｒ．Ｖ．Ｍｉｌｌｅｒ，未公表 結果（ＧｅｎＥＭＢＬデータライブラリー、アクセス番号Ｌ０２１０５）。この 領域は１５０３個のヌクレオチドから成る。ｑｉｎ遺伝子のアミノ末端は正確に 決定されず、データベースに示されている相同はこの配列のヌクレオチド２０７ 〜５６６の範囲でしかない。しかしながら６個の読み取り枠全部におけるこの配 列の翻訳及びその後のｔＢＬＡＳＴｎの探索の結果として、示唆されたｑｉｎ翻 訳開始コドンの上流領域の異なる読み取り枠にＰｈａＧ及びＲｈｌＡのそれぞれ のＮ−末端領域との相同性が同定された。終止コドンはｑｉｎ遺伝子では他の遺 伝子よりも３８個のアミノ酸だけ遅れて出現する。ｑｉｎ領域のアミノ酸一致は 、２４９個のオーバーラップ残基中でＰｈａＧまたはＲｈｌＡに対してそれぞれ ５０．６％及び４０．１％に達した。 ＰｈａＧは、脂質のようなエステルに対するヒドロラーゼ（例えば、トリアシ ルグリセロールリパーゼ；Ｒａｗａｄｉら（１９９５）Ｇｅｎｅ １５８：１０ ７）またはポリヒドロキシアルカノエート（例えばＰＨＡデポリメラーゼ；Ｔｉ ｍｍ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２ ０９：１５）から主として構成される酵素グループに対してより小さいが追加の 相同領域を有している。この相同領域はＰｈａＧの残基２０９〜２５８の範囲で あり、これらのタンパク質中で高度に保存されるヒスチジン残基（ＰｈａＧの残 基２５１）を含んでいる。これらのデータは、ＰｈａＧの触媒機能が恐らくはエ ステル結合の破壊に関与することを示唆している。このような活性はアシルトラ ンスフェラーゼ、チオキナーゼまたはアシル−ＣｏＡリガーゼ中で予測され得る 。実施例６ プロモーターの同定及び調節 ｐｈａＧの２４４ｂｐ上流で推定σ７０依存性プロモーター構造ＴＴＧＣＧＣ −Ｎ１７−ＴＴＧＡＡＴが同定された。Ｅ３のサブフラグメントでＰＨＡＧＮ１ 突然変異体２：１を相補性検定することによってプロモーターを確認した。上記 のプロモーター配列が欠失した２．２ｋｂｐのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩサブフラグ メント（ＳＦ２２）（図１）は、突然変異体２：１に相補的ではなかったが、Ｅ ３の１．３ｋｂｐのＢａｍＨＩ−Ｈ ｉｎｄＩＩＩサブフラグメント（ＢＨ１３）（図２）はこの突然変異体に単純炭 素源からＰＨＡを合成する能力を回復させた。 更に、この推定プロモーター構造の重要性は、定常増殖期に採取されたＰ．ｐ ｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０のグルコネート増殖細胞及びオクタノエート増殖細胞 から単離した全ＲＮＡによるＳ１ヌクレアーゼ保護によって証明された。転写開 始部位は、推定プロモーターコンセンサス配列から５ヌクレオチド下流の６８３ 位であることが同定された（図２）。 Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０のオクタノエート増殖細胞の場合、極めて弱 いＲＮＡシグナルだけが検出できたか、グルコネートを炭素源として増殖させた Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓＨ１６細胞から単離したＲＮＡでは強力なシグナルが検 出された。この結果は脂肪酸のドゥノボ生合成経路のＰＨＡ合成条件下のｐｈａ Ｇの強力な転写誘発を示している。実施例７ Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧに生物学的に等価の機能をもつペプチド、ポリペプ チド及びタンパク質 本発明は、配列１の９１１位〜１７９５位で示されるヌクレオチド配列によっ てコードされるＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧ タンパク質だけでなく、生物学的に等価の機能をもつペプチド、ポリペプチド及 びタンパク質を包含する。“生物学的に等価の機能をもつペプチド、ポリペプチ ド及びタンパク質”なる表現は、単純糖質基質で増殖する経路でＰＨＡ合成が欠 損したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａのＰｈａＧ欠失突然変異体を利用 する相補性検定によって生物学的に検定したときに、Ｐ．ｐｕｔｉｄａのＰｈａ Ｇと同じまたは類似のＰｈａＧ活性を示すペプチド、ポリペプチド及びタンパク 質を意味する。“同じまたは類似のＰｈａＧ活性”なる表現は、ＰｈａＧと同じ または類似の機能を発揮する能力を意味する。これらのペプチド、ポリペプチド 及びタンパク質は、本文中に配列２として開示されたＰ．ｐｕｔｉｄａ Ｐｈａ Ｇタンパク質の対応する領域または部分に配列類似性を示す領域または部分を含 む。しかしながら、これらのペプチド、ポリペプチド及びタンパク質がＰ．ｐｕ ｔｉｄａ ＰｈａＧタンパク質と同じまたは類似のＰｈａＧ活性を示す限りこれ らの領域または部分は不要である。 ＰｈａＧタンパク質は、ＰＨＡの酵素的合成に有用であるだけでなく、このＰ ｈａＧタンパク質または可能な別のＰｈａｇ様タンパク質を精製または検出する ために使用できる抗体を産 生させる抗原として有用である。 ＰｈａＧタンパク質に生物学的に等価の機能をもつペプチド、ポリペプチド及 びタンパク質は後述するような多様な形態で産生され得る。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのアミノ酸配列中の保存性アミノ酸変化 ＰｈａＧタンパク質に生物学的に等価の機能をもつペプチド、ポリペプチド及 びタンパク質は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧの基本配列中にアミノ酸変化を含 むアミノ酸配列を有している。本発明に包含されるＰｈａＧタンパク質に生物学 的に等価の機能をもつペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、天然産生タン パク質またはその対応する領域もしくは部分に対して、一般には少なくとも約４ ０％の配列類似性、好ましくは少なくとも約６０％の配列類似性、最も好ましく は少なくとも約８０％の配列類似性を有していなければならない。本文中の“配 列類似性”なる用語は、配列解析ソフトウェアパッケージ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉ ｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ ，ＷＩ ５３ ７１１の“ギャップ”プログラムまたは“ベストフィット（最良適合）”プログ ラムによって決定される。このソフトウェアは、相同の程度を種々の付加、欠失 、置換及びその他の修飾に割り当てることによって類似配列の突合せ（マッチン グ）を行う。ベストフィットプログラムは２つの配列間の最良の類似セグメント を最適に位置合せする。Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａ ｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４２８−４８９の局所相同アルゴリズムを用い て一致数を最大にするようにギャップを挿入することによって、最適な位置合せ を見出す。ギャッププログラムは、一致数が最大でキャップ数が最小になるよう な２つの完全配列の位置合せを見出すためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕ ｎｓｃｈのアルゴリズム（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３− ４５３）を使用する。ＰｈａＧのフラグメント及び変異体 Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧと同じまたは類似のＰｈａＧ活性を有しているＰ ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのフラグメント及び変異体も本発明に包含される。ＰｈａＧのフラグメント Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのフラグメントは、天然に生じるＰ．ｐｕｔｉｄ ａ ＰｈａＧと同じまたは類似のＰｈａＧ酵素活性を該フラグメントが有してい る限り、タンパク質またはその組合せのＮ−末端、Ｃ−末端、内部領域から１つ または複数のアミノ酸が欠失した酵素の末端欠失形態でもよい。これらのフラグ メントは天然に生じるＰｈａＧのミューテインでもよく、または、コーディング ヌクレオチド配列の制限エンドヌクレアーゼ処理もしくはエキソヌクレアーゼＩ ＩＩ処理（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９４４）Ｇｅｎｅ ２８：３５１）によって産 生されてもよい。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧの変異体 Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧの変異体は、天然に生じるアミノ酸配列中の１つ または複数のアミノ酸が別のアミノ酸で置換された酵素または天然アミノ酸配列 に１つまたは複数のアミノ酸が挿入された酵素の形態を包含する。本文中で考察 される変異体は、天然に生じるＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧと同じまたは類似の ＰｈａＧ活性を維持している。これらの変異体は天然に生じるＰｈａＧのミュー テインでもよくまたは野生型のコー ディングヌクレオチド配列のランダム突然変異誘発によって産生されてもよく（ Ｇｒｅｅｎｅｒら（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ７：３２−３４）もしく はそのドメインをＰｈａＧの他の対象ドメインで置換することによって産生され てもよい。このような変異体のＰｈａＧ活性は前述のように相補性検定できる。 上記の組合せ、即ち、アミノ酸の付加、欠失及び置換を含むが天然に生じるＰ ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧと同じまたは類似のＰｈａＧ活性を維持しているｐｈ ａＧの形態も本発明に包含される。 本発明に包含されるＰｈａＧのフラグメント及び変異体は、天然のＰ．ｐｕｔ ｉｄａ ＰｈａＧまたは対応するその領域またはその部分に対して好ましくは少 なくとも約４０％の配列類似性、より好ましくは少なくとも約６０％の配列類似 性及び最も好ましくは少なくとも約８０％の配列類似性を有していなければなら ない。配列類似性は、上述の配列解析ソフトウェアパッケージのギャッププログ ラムまたはベストフィットプログラムを用いて決定できる。実施例８ Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧをコードするゲノムＤＮＡに生物学的に等価の機能 をもつヌクレオチド配列 本発明は、配列１に示すＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧゲノムＤＮＡ配列だけで なく、生物学的に等価の機能をもつヌクレオチド配列を包含する。“生物学的に 等価のヌクレオチド配列”なる表現は、酵素アッセイによるかまたは相補性検定 によって試験したときに、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧと同じまたは類似のＰｈ ａＧ酵素活性を示すペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするゲノ ムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むＤＮＡ及 びＲＮＡを意味する。このような生物学的に等価の機能をもつヌクレオチド配列 は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧの対応する領域または部分に配列類似性を示す 領域または部分をコードするペプチド、ポリペプチド及びタンパク質をコードし 得る。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのアミノ酸配列の保存性アミノ酸変化をコードする ヌクレオチド配列 実施例７に示したように、生物学的に等価の機能をもつ本発明のヌクレオチド 配列は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのアミ ノ酸配列の内部の保存性アミノ酸変化をコードするヌクレオチド配列を含み、内 部に沈黙の変化を生じさせる。従って、このようなヌクレオチド配列は、遺伝コ ードに基づいてｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧタンパク質をコードする野生型ヌク レオチド配列に比べたときに対応する塩基置換を含む。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧ中の非保存性アミノ酸置換、付加または欠失をコー ドするヌクレオチド配列 生物学的に等価の機能をもつ本発明のヌクレオチド配列は、天然に生じるＰ． ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧアミノ酸配列の内部の保存性アミノ酸変化をコードする ヌクレオチド配列に加えて、非保存性のアミノ酸置換、付加または欠失をコード するゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡのヌクレオチド配列を含 む。これらのヌクレオチド配列は、配列１のゲノムＰｈａＧ ＤＮＡに含まれて いる遺伝情報と同一の固有遺伝情報を含み、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧの酵素 活性と同じまたは類似のＰｈａＧ酵素活性を示すペプチド、ポリペプチドまたは タンパク質をコードしている核酸を包含する。このようなヌクレオチド配列は、 Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのフラグメントまたは変異体をコードし得る。この ようなフラグメント及び変異 体のＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧ様酵素活性は、前述のような相補性検定または 酵素アッセイによって確認され得る。生物学的に等価の機能をもつこれらのヌク レオチド配列は、天然に生じるＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのゲノムＤＮＡ、ｃ ＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡのそれぞれまたはその対応する領域もしくは部 分に対して、少なくとも４０％の配列一致、好ましくは少なくとも６０％の配列 一致、及び、最も好ましくは少なくとも８０％の配列一致を有し得る。 Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮ Ａまたはその他の核酸に生じた突然変異は好ましくは、コーディング配列の読み 取り枠を保存している。更にこれらの突然変異は好ましくは、ｍＲＮＡの翻訳に 不利な影響を与えるループまたはヘアピンのようなｍＲＮＡ二次構造を形成する ようにハイブリダイズする相補的領域を形成しないのが好ましい。 突然変異部位は予め決定できるが、突然変異自体の性質を予め決定する必要は ない。例えば、所与の部位で最適特性値の突然変異体を選択するために、標的コ ドンで部位特異的突然変異を誘発し（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，（１９８８）Ｂｉｏ ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ ２８：５７３３５）、得られたペプチド、ポリペプチドまたはタン パク質のＰｈａＧ酵素活性を酵素アッセイまたは相補性検定によって測定できる 。 配列１に示すヌクレオチド配列を有するＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのゲノム ＤＮＡに生物学的に等価の機能をもつ核酸としては以下の核酸がある： （１）本明細書でＰ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０を代表例としたＰ．ｐｕｔ ｉｄａに由来のＤＮＡ。これらのＤＮＡの長さは、部分的ヌクレオチドの挿入ま たは欠失のような天然または人工の突然変異によって改変されており、従って、 配列１の９１１位〜１７９５位のコーディング配列の全長を１００％とするとき 、生物学的に等価の機能をもつヌクレオチド配列の長さは概して全長の約６０〜 １２０％、好ましくは約８０〜１１０％である； （２）部分的な（通常は全長の８０％以下、好ましくは６０％以下、より好ま しくは４０％以下の）天然または人工の突然変異を含むヌクレオチド配列。この ような配列は種々のアミノ酸をコードしているが、得られるタンパク質は天然に 生じるＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧの酵素活性と同じまたは類似のＰｈａ Ｇ酵素活性を維持している。このようにして作製された突然変異ＤＮＡは好まし くは、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのアミノ酸配列に、少なくとも約４０％、好 ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％の配列類似性 をもつタンパク質をコードしているのが好ましい。配列類似性は、前述の配列解 析ソフトウェアパッケージのギャッププログラムまたはベストフィットプログラ ムによって評価され得る。 本文中で考察されている人工の核酸突然変異を生じさせるために使用できる方 法は特に限定されないので、当業界で慣用の任意の手段によってこのような突然 変異を生じさせ得る。例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ｐｈａＧ遺伝子、ｃＤＮＡま たは合成ＤＮＡを適当な制限酵素で処理し、適正な核酸読み取り枠が保存される ように所望のＤＮＡフラグメントを挿入または欠失させる。制限エンドヌタレア ーゼによる処理後、消化ＤＮＡを処理してオーバーハングを埋戻し、ＤＮＡを再 結合させる。ＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩＩＩで処理することによってＣ−末 端の欠失が得られる。あるいは、制限酵素を用いて核酸を適宜操作し、次いで結 合させることによって、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧの種々のドメインを別のＰ ｈａＧタンパク質の領域で置 換し得る。 また、天然型Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合 成ＤＮＡ配列のフラグメントに結合可能な隣接制限部位をもつ突然変異配列を含 むオリゴヌクレオチドを合成することによって特定遺伝子座に突然変異を導入し てもよい。結合後に得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換 または欠失を有する生物学的機能の等価物をコードしている。 あるいは、オリゴヌクレオチド特異的、部位特異的またはセグメント特異的な 突然変異の誘発手順を使用して、必要な挿入、置換または欠失に従って改変され た特定コドンを有する改変ＤＮＡ配列を産生してもよい。 上述の改変を作製する代表的な方法は、Ｗａｌｄｅｒら(１９８６)Ｇｅｎｅ ４２：１３３；Ｂａｕｅｒら（１９８５）Ｇｅｎｅ ３７：７３；Ｃｒａｉｋ（ １９８５年１月）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１２−１９；Ｓｍｉｔｈ ら（１９８１）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（ １９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏ ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｆ ｒｉｔｓ Ｅｃｋｓｔｅｉｎら（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓｅａｒｃｈ １０：６４８７−６４９７、及び、Ｏｓｕｎａら（１９９４）Ｃ ｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０：１ ０７−１１６に開示されている。 上記方法のいずれかによって産生された本文中に開示されたゲノムＤＮＡ配列 に生物学的機能の等価物は、得られたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質 の前述のような相補性検定または酵素アッセイによって選択され得る。 あるいは、天然型Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのヌクレオチド配列のフラグメ ントに結合容易な隣接制限部位をもつ突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを 合成することによって特定遺伝子座に突然変異を導入してもよい。結合後に得ら れる再構 築されたヌクレオチド配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を有して おり生物学的に等価の機能をもつ形態のシンターゼをコードしている。このよう にして産生された突然変異形態のＰ．ｐｕｔｉｄａ様ＰｈａＧ活性を相補性検定 または酵素アッセイによってスクリーニングし得る。 配列１のゲノムｐｈａＧ ＤＮＡの生物学的機能の等価物の有用な形態は、対 応する配列１のゲノムｐｈａＧ ＤＮＡの９１１位〜１７９５位の領域または部 分に対して、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約６０％、及びより好 ましくは少なくとも約８０％のレベルの配列一致を示すヌタレオチド配列から成 るＤＮＡを含む。配列一致は前述のベストフィットプログラムまたはギャッププ ログラムを用いて決定できる。遺伝的縮重ヌクレオチド配列 遺伝子コードが縮重性を有するので、即ち、タンパク質中に天然に存在する大 抵のアミノ酸は２つ以上のコドンに対応できるので、本発明のゲノムＤＮＡと本 質的に同じ遺伝情報を含んでおり且つ配列２に示すＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧ のアミノ酸と同じアミノ酸配列をコードする遺伝的縮重ＤＮＡ（及びＲＮＡ）配 列は本発明に包含される。本文中に記載されている任 意の他の核酸の遺伝的縮重形態も本発明に包含される。ハイブリダイゼーションによって検出された生物学的に等価の機能をもつ核酸配 列 Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧをコードするヌクレオチド配列の１つの具体例を 配列１の７１１位〜１７９５位で示しているが、生物学的に等価の機能をもつ別 の形態のＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧをコードする核酸が慣用のＤＮＡ−ＤＮＡ またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術を用いて容易に単離できるこ とは理解されよう。従って、本発明は、配列１の９１１位〜１７９５位及びその 相補的配列にハイブリダイズし、発現されるとＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧの酵 素活性と同じまたは類似の酵素活性を示すペプチド、ポリペプチドまたはタンパ ク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。このようなヌクレオチド配列は 好ましくは、中程度から高程度の緊縮性条件下で配列１の９１１位〜１７９５位 及びその相補的配列にハイブリダイズする（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃ ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。代表的な条件は、６× ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１００ｍｇ／ｍｌの魚精子ＤＮＡ、０．１％のＳ ＤＳ中、５５℃でハイブリダイゼーションの達成に十分な時間（例えば数時間〜 一夜）維持する初期ハイブリダイゼーションと、毎回２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ Ｓを用い、室温で１５分間行う２回の洗浄と、毎回０．５−１×のＳＳＣ、０． １％のＳＤＳを用い、５５℃で１５分間行う２回の洗浄と、オートラジオグラフ ィーとを順次に含む。典型的には、ハイブリダイゼーション混合物を０．１×Ｓ ＳＣ中で５５℃、好ましくは６０℃、より好ましくは６５℃で少なくとも１回洗 浄するときに、核酸分子がハイブリダイズし得る。 遺伝コードが縮重性をもつことに基づいて本発明はまた、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのアミノ酸配列またはその遺伝的縮重形態をコードするゲノムＤＮＡ、 ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ分子に、等価の塩及び温度条件でハイブリダイズでき、 発現されるとＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧの酵素活性と同じまたは類似のＰｈａ Ｇ酵素活性を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするヌク レオチド配列を包含する。 上述のヌクレオチド配列は、ｉｎ ｖｉｖｏの相補性検定に よってＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧの活性に対して約±３０％以下、好ましくは 約±２０％以下、より好ましくは約±１０％以下の違いをもつＰｈａＧ活性を有 するペプチド、ポリペプチドまたはタンパタ質をコードしている場合に、本発明 のＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧ遺伝子に実質的に等価の生物学的機能を有してい ると考えられる。相補性検定によって検出される生物学的に等価の機能をもつ核酸配列 生物学的に等価の機能をもつ推定核酸配列をシス位置に含み、同時に、発現に 必要なすべての調節要素を含む広宿主域プラスミドを担持している大腸菌ドナー 菌株は、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａら（１９８０）Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３４７）を用いる三親交配 によってＰｈａＧ陰性のレシピエント細菌株にプラスミドを接合させるために使 用できる。得られたトランスコンジュガントを適当な抗生物質を補充したポリマ ー伝導性培地で選択できる。種々の炭素基質を含む培地でトランスコンジュガン トを発酵させ、次いで、得られたＰＨＡを分析すると、核酸機能の等価性を判断 する手段が提供される。ゲノムプローブ 別の目的によれば、本発明は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧと同じまたは類似 の酵素活性を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている ＤＮＡ配列をゲノムライブラリー及びその他の核酸ライブラリーからスクリーニ ングするために有用なオリゴヌタレオチドハイブリダイゼーションプローブを提 供する。このプローブは、配列１の９１１位〜１７９５位の配列に基づいて設計 され得る。このようなプローブは約２０〜約６０ヌクレオチドの長さ、一般には 約２０ヌクレオチド、より典型的には約３０ヌクレオチド、好ましくは約４０ヌ クレオチド、より好ましくは約５０〜６０ヌクレオチドの長さを有している。好 ましくはこれらのプローブは、前述のようなハイブリダイゼーション条件下でＰ ．ｐｕｔｉｄａのゲノムｐｈａＧ ＤＮＡ配列、及び、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ Ｐｈ ａＧと同じまたは類似のＰｈａＧ活性を有するペプチド、ポリペプチドまたはタ ンパク質をコードしている他のＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする。この ようなオリゴヌクレオチドプローブは、全自動合成によって合成でき、通常は３ ２Ｐのような放射性核種またはビオチンなどのリポーターによって５’端が標識 され得る。プローブされるライブラリーを、使用するベクター次第でコロニーま たはファージとして平板培養し、組換えＤＮＡをナイロンまたはニトロセルロー スの膜に転移させる。ＤＮＡを変性し、中和し、膜に定着させた後、膜を標識プ ローブと共にハイブリダイズさせる。次いで、膜を洗浄し、リポーター分子を検 出する。次に、ハイブリダイズするＤＮＡを担持しているコロニーまたはファー ジを単離し増殖させる。有望なクローンまたはＰＣＲ増幅フラグメントが、Ｐ． ｐｕｔｉｄａ様ＰｈａＧ活性またはＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧと同じまたは類 似の活性を有する近縁のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードし ているＤＮＡを含むことを種々の方法によって確認し得る。例えば、有望なクロ ーンを重複のない第二のプローブとハイブリダイズさせるかまたはＤＮＡ配列を 解析する。このＤＮＡによってコードされているペプチド、ポリペプチドまたは タンパク質の活性を評価するために、大腸菌のような適当な宿主中でＤＮＡをク ローニングして発現させ、次いでペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を単 離し、その活性のアッセイを行う。このような手段によって、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ 以外の微生物からＰｈａＧタンパク質並びにＰＨＡを産生するた めに有用なＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧに生物学的に等価の機能をもつペプチド 、ポリペプチド及びタンパク質をコードする核酸を単離し得る。縮重オリゴヌクレオチドプライマー 他の微生物に由来の生物学的機能が等価のｐｈａＧ遺伝子または等価のＰｈａ ＧコーディングｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） 法を用いる増幅によって単離できる。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのアミノ酸配 列に基づく縮重オリゴヌクレオチドプライマーを作製し、逆転写酵素を用いるＰ ＣＲ技術（Ｅ．Ｓ．Ｋａｗａｓａｋｉ（１９９０），Ｉｎ Ｉｎｎｉｓら，Ｅｄ ｓ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，ｐ．２１）と共に使用して、他の生物のゲノ ムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから生物学的に等価の機能を有する ＤＮＡを増幅し得る。 あるいは、例えばλ Ｚａｐ．ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなλファ ージベクター中でｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブと して縮重オリゴヌクレオチドを使用できる。実施例９ 大腸菌中のｐｈａＧのヘテロロガス超発現 大腸菌中のＰｈａＧのヘテロロガス発現を確保するために、Ｔ７−ポリメラー ゼ発現ベクターｐＴ７−７（Ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９ ９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１０７４）を使 用した。ｐｈａＧ遺伝子をｐＴ７−７の転写／翻訳開始領域に結合させるために 、ＰＣＲ増幅によってｐｈａＧの開始コドンにＮｄｅＩ部位を作製した。０．９ ７ｋｂｐのＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に消化した ベクターに結合させた。ｐＴ７−Ｇ１と命名したこの構築物の配列を確認し、Ｉ ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラタトピラノシド）誘発ｌａｃＵＶ５プ ロモーターのコントロール下にＴ７ポリメラーゼ遺伝子を担持している大腸菌Ｂ Ｌ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｕｄｉｅｒ ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔｔ（１９８６）Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３）を形質転換した。ｐＴ７−Ｇ１を担持して いる細胞及びｐＴ７−７（陰性対照）を担持している細胞を、１ｍｌあたり１０ ０μｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地で培養した。ＩＰＴＧを最終濃度０． ４ｍＭまで添加する ことによって光学密度１．０〜５００ｎｍでＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を 誘発した。４時間のインキュベーション後、細胞を採集し、音波処理によって溶 菌した。ｐＴ７−Ｇ１を担持する細胞は誘発中に大量の顆粒画分を産生した。そ れそれ５，０００×ｇ及び３，０００×ｇの分別遠心、及び水洗を順次行うこと によって顆粒画分を粗抽出物から部分的に分離した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動の電気泳動図は、プラスミドｐＴ７−Ｇ１を含む大腸菌ＢＬ２１ （ＤＥ３）の培養物から得られた粗抽出物、ペレット画分及び顆粒画分調製物中 に推定分子量３４ｋＤａの１つの主要バンドが存在することを示した。このバン ドは、ｐＴ７−Ｇ１を担持する大腸菌細胞の可溶性画分中、及び、インサート非 含有のｐＴ７−７を担持する大腸菌ＢＬ２１の対照調製物中には存在しなかった 。ＰｈａＧの強力な超発現は不溶性タンパク質の集塊中でだけ観察されるという 結果が得られた。 Ｔ７発現系によって超発現されたＰｈａＧは多数の用途に使用できる。例えば 、産生されたタンパク質は、抗体産生、Ｘ線結晶学検査、ＰｈａＧ活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析に使用でき、また、適当な酵素活性と組合せてＰＨＡのｉｎ ｖ ｉｔｒｏ合 成に使用できる。別の発現系はまた、組換え系でＰｈａＧを超発現させるために 使用し得る。例えば、大脳菌のｔａｃプロモーターは、大腸菌及び別の細菌中で ＰｈａＧを発現させるために有用なプロモーターである。組換え宿主中でＰｈａ Ｇを発現させるために有用な他のプロモーターは当業者に公知である。ｔａｃプ ロモーターから発現されたタンパク質は、適当な宿主生物中で適当なＰＨＡ生合 成酵素と組合せると、例えばグルコースのような単純炭素源からＰＨＡをｉｎ ｖｉｖｏ産生するために好適である。ＰｈａＧを認識する抗体は、ＰｈａＧタン パク質またはＰｈａＧ様タンパタ質を含む生物をスタリーニングするために使用 し得る。抗体はまた、粗抽出物からＰｈａＧタンパク質及びＰｈａＧ様タンパク 質を免疫精製するために有効であろう。実施例１０ Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧタンパク質を発現する細菌及び植物によるポリヒド ロキシアルカノエートの産生 Ｐ．ｐｕｔｉｄａのＰｈａＧコーディングＤＮＡを異なる種々の真核細胞及び 原核細胞、例えば細菌及び植物のような体内でＰＨＡを容易に産生する宿主細胞 に導入して発現させ得る。 本文中で言及するＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧ及びこれをコードするゲノムＤＮ Ａはそれそれ上述のような生物学的な機能の等価物を包含することを理解された い。このようなＰＨＡ産生方法の利点は、石油由来のモノマー依存度を低減でき ること、並びに、細菌及び植物の大規模育成が容易なことである。 細菌及び植物による脂肪酸のドゥノボ生合成経路の最適ＰＨＡ合成には少なく とも２つの遺伝子、即ち、ＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）とｐｈａＧ（本文中に 開示）とが関与する。ＰＨＡシンターゼと他のＰＨＡ遺伝子（ｐｈａＡ（β−ケ トチオラーゼ）及びｐｈａＢ（Ｄ−レダクターゼ））を形質転換及び発現のため のベクター構築物に組込む方法、これらの構築物を細菌及び植物の宿主細胞に導 人してこのような細胞中でＰＨＡを産生させる方法は当業界で公知である。最近 になってＰｏｉｒｉｅｒら((１９９５)Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３： １４２−１５０)はこの領域の進歩を概説した論文を発表した。一般的に、この ようなベクター構築物は内包する構造ＤＮＡ配列の発現を刺激するように機能的 に作用可能に連結されたＤＮＡフラグメントの集合から成る。これらのベクター 構築物は通常は、選択された宿主細胞中で機能するプロモーターを、互い に作用可能に連結されたリボソーム結合部位、転写ターミネーター、３’非翻訳 ポリアデニル化シグナルのような必要な他の任意の調節領域並びに選択可能マー カーと共に含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１ ９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ ｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌら （１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）。 このようなベクターは、例えば、塩化カルシウム／熱ショック処理または電気 穿孔によって細菌細胞に導入され得る。形質転換された宿主を次に、選択培地で 選択し、適当な培地中でＰＨＡの産生に導く条件下で培養し、次いでＰＨＡを細 胞から回収する。代表的な方法はＳ１ａｔｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ．１７０：４４３１−４４３６；Ｓｌａｔｅｒら（１９９２）Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：１０８９−１０９４；Ｚｈａｎｇ ら（１９９４）Ａ ｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１１９８−１２０５；及 びＫｉｄｗｅｌｌら（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ．６１：１３９１−１３９８によって記載されている。 ＰｈａＧを用いるＰＨＡポリマー産生に有用な宿主は、放線菌類Ａｃｔｉｎｏ ｍｙｃｅｔｅｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種及びＮｏｃａｒｄｉａ種 ）；他の細菌（例えば、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（例えばＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕ ｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂ．ｌｉｃｈ ｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ ｌｉ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種（例えばＫ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ及びＫ．ｏｘｙ ｔｏｃａ），Ｌａｃｔｏｂａｃｃｉｌｌｕｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ，Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ及びＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｎｓ），Ｎｏｃａｒｄｉａ種（例えばＮ．ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、Ｒｈｏｄｏｓ ｐｉｒｉｌｌｕｍ種（例えばＲ．ｒｕｂｒｕｍ）；真菌類（例えばＡｓｐｅｒｇ ｉｌｌｕｓ，Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）；並び に酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｒｈ ｏｄｏｔｏｒｕｌａ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ及びｐｉｃｈｉａ） である。 その他の有用な細菌株としては、脂質を大量に蓄積し得る菌株、及び単純炭素 源を高い変換率でアセチル−ＣｏＡに変換し得る菌株がある。 ＰＨＡ生合成に関与する細菌遺伝子を植物体内に導入し得る形質転換ベクター を設計し得る。一般には、このようなベクターは、プロモーター及び選択可能マ ーカーを含む５’及び３’の調節配列の転写コントロール下に１つまたは複数の 対象コーディング配列を含む。典型的な調節配列としては、転写開始起点部位、 ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、及び／または、ポリアデニル化シ グナルかある。植物プロモーターは誘導性または構成性、環境調節型または発生 調節型、細胞特異的または組織特異的のいずれでもよい。頻用されるプロモータ ーとしては、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔ ｕｒｅ ３１３：８１０），促進されたＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ゴマノ ハグサモザイクウイルス（Ｆｉｇｗｏｒｔ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ，ＦＭＶ ）のプロモーター（Ｒｉｃｈｉｎｓら（１９８７）ＮＡＲ ２０：８４５ １）、マンノパインシンターゼ（ｍａｓ）のプロモーター、ノパリンシンターゼ （ｎｏｓ）のプロモーター及びオクトパインシンターゼ（ｏｃｓ）のプロモータ ーがある。有用な誘導性プロモーターとしては、熱ショックプロモーター（Ｏｕ −Ｌｅｅら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３ ：６８１５；ホウレンソウの亜硝酸レダクターゼ遺伝子に由来の硝酸塩誘導プロ モーター（Ｂａｃｋら（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７：９） ；ホルモン誘導プロモーター（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｏｎｏｚａｋｉら（１ ９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：９０５；Ｋａｒｅｓら（１９９ ０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：９０５）；及びＲｕＢＰカルボキシ ラーゼ及びＬＨＣＰ遺伝子ファミリーの小サブユニットに関連した光誘導プロモ ーター（Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒら（１９８９）Ｐ１ａｎｔ Ｃｅｌｌ １：４７ １：Ｆｅｉｎｂａｕｍら，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２６： ４４９；Ｗｅｉｓｓｈａａｒら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０：１７７７；Ｌ ａｍ ａｎｄ Ｃｈｕａ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４７１；Ｃａｓ ｔｒｅｓａｎａら（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．７：１９２９； Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔら（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：６５１）があ る。発生的に調節された有用な組織特異的プロモーターの例としては、β−コン グリシニン７Ｓプロモーター（Ｄｏｙｌｅら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．２６１：９２２８；Ｓ１ｉｇｈｔｏｎ ａｎｄ Ｂｅａｃｈｙ（１９８７） Ｐｌａｎｔａ １７２：３５６）、種子特異的プロモーター（Ｋｎｕｔｚｏｎら （１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２６２４ ；Ｂｕｓｔｏｓら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０：１４６９；Ｌａｍ ａｎｄ Ｃｈｕａ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４７１）；Ｓｔａｙｔｏｎら （１９９１）Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８：５０７）があ る。種子プラスチド中の優先的発現に有用な植物機能性プロモーターとしては、 植物の貯蔵タンパク質遺伝子及び脂肪種子中の脂肪酸生合成に関与する遺伝子に 由来のプロモーターがある。このようなプロモーターの例は、ナピン（Ｋｒｉｄ ｌら（１９９１）Ｓｅｅｄ Ｓｃｉ．Ｒｅｓ．１：２０９）、ファセオリン、ゼ イン、大豆トリプシン阻害物質、ＡＣＰ、ステアロイル−ＡＣＰのデサチュラー ゼ及びオレオシンなどの遺伝子に由来の５’調節領域である。種子 特異的遺伝子調節は欧州特許第０，２５５，３７８号で検討されている。また、 転写活性を促進するため（Ｈｏｆｆｍａｎ，米国特許第５，１０６，７３９号） 、または、所望の転写活性と組織特異性とを組合せるために、プロモーターハイ ブリッドも構築できる。代表的なベクターはしばしば、植物体内で下流のヘテロ ロガス構造ＤＮＡの転写を指令するプロモーター配列と、任意の非翻訳リーダー 配列と、対象タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、植物細胞内で転写を 終結させ該タンパク質をコードするｍＲＮＡの３’端にポリアデニレートヌクレ オチドを付加すべく機能するポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領 域とから成り、これらは５’から３’の方向で作用可能に連結されている。更に 、考察すべき要因は、ＰｈａＧ ＰＨＡの生合成に必要な他の酵素の発現のタイ ミング及び細胞内局在位置である。例えば、キャノーラのような脂肪種子植物で 脂肪酸生合成経路が利用されている場合には、ＰｈａＧ発現は種子の白色体また は葉の葉緑体をターゲットとして脂肪酸生合成と同時に生じるであろう。 このようなベクターを植物の原形質体、細胞、カルス組織、葉のディスク、分 裂組織、などに導入してトランスジェニック 植物を作製するために異なる種々の方法を使用し得る。例えば、Ａｇｒｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍに介在される形質転換、粒子ガンによるデリバリー、マイクロイン ジェクション、電気穿孔、ポリエチレングリコールに介在される原形質体の形質 転換、リポソームに介在される形質転換、などがある（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（１９ ９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｙｈｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．４２：２０５−２２５参照）。一般に、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧ のコーディングＤＮＡを含有及び発現する細胞を含むトランスジェニック植物は 、前述の方法のいずれかを用いて上述のＤＮＡ構築物によって植物細胞を形質転 換させ、形質転換した植物細胞を選択培地で選択し、分化した植物を産生するよ うに形質転換された植物細胞を再生し、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｈａＧのコーディ ングヌクレオチド配列を発現する形質転換植物を選択することによって産生され 得る。 コーディングＤＮＡは、単一形質転換イベント（必要な全部のＤＮＡが同一ベ クターに存在する）、同時形質転換イベント（必要な全部のＤＮＡが植物または 植物細胞に同時に導入される別々のベクターに存在する）、独立形質転換イベン ト（必要 な全部のＤＮＡが植物または植物細胞に独立に導入される別々のベクターに存在 する）、または再形質転換イベント（単一形質転換、同時形質転換または独立形 質転換イベントによって得られた形質転換細胞系を形質転換させる）によって導 入できる。次いで、従来の繁殖方法を必要に応じて適宜使用し、単一植物に完全 経路を組込む。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの細胞中でＰＨＡポリヒドロキシブチレ ートの産生に成功したことはＰｏｉｒｉｅｒら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ５６：５２０−５２３によって報告されており、そのプラスチド内部で産生に成 功したことはＮａｗｒａｔｈら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ ９１：１２７６０−１２７６４によって報告されている。 多様な種類の双子葉類を形質転換してトランスジェニック植物を作製する特定 の方法は文献に十分に記載されている（Ｇａｓｓｅｒ ａｎｄ Ｆｒａｌｅｙ（ １９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２９３；Ｆｉｓｋ ａｎｄ Ｄａｎｄｅ ｋａｒ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ ５５：５ −３６；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ（１９９４）Ａｇｒｏ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｈｉ Ｔｅｃｈ（１９９４年，３月 ／４月）ｐ．１７及び該文献に引用された参考文献）。 単子葉類では以下の植物で形質転換及び植物再生の成功が得られたと報告され ている：アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ；Ｂｙｔ ｅｂｉｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８ ４：５３４５）；大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒａｅ；Ｗａｎ ａｎｄ Ｌｅｍａｕｘ（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：３７）；トウ モロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ；Ｒｈｏｄｅｓら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ４０：２０４；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３；Ｆｒｏｍｍら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８ ３３；Ｋｏｚｉｅｌら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１９ ４）；エンバク(Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ；Ｓｏｍｅｒｓら（１９９２）Ｂｉ ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１５８９);カモガヤ(Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇ ｌｏｍｅｒａｔａ；Ｈｏｒｎら（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７ ：４６９)；米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ，インディカ種及びジャポニカ種を 含む;Ｔｏｒｉｙａｍａら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１ ０；Ｚｈａｎ ｇら（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７：３７９；Ｌｕｏ ａｎｄ Ｗｕ（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．６：１６５；Ｚｈ ａｎｇ ａｎｄ Ｗｕ（１９８８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７６： ８３５；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：９ ５７);ライ麦(Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ；Ｄｅ ｌａ Ｐｅｎａら（１９ ８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２５：２７４)；モロコシ類（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃ ｏｌｏｒ；Ｃａｓｓａｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ９０：１１２１２）；サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ種；Ｂｏｗｅ ｒ ａｎｄ Ｂｉｒｃｈ（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：４０９）；ウシノケ グサ（Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ；Ｗａｎｇら（１９９２）Ｂｉ ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６９１）；芝草（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｐｕｌ ｕｓｔｒｉｓ；Ｚｈｏｎｇら（１９９３）Ｐ１ａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３ ：１）；及び小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ；Ｖａｓｉｌら（１９ ９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６６７；Ｔｒｏｙ Ｗｅｅｋｓら （１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０７７；Ｂｅｃｋｅ ｒら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊ．５：２９９）。 ＰＨＡポリマーの産生に特に有用な植物としては、ＰＨＡ生合成に使用できる 炭素基質を産生するジャガイモ及びテンサイのような植物がある。トウモロコシ 、コムギ及びイネのような穀物も好ましい。他の有用な植物としては、タバコ、 及び、タイズ、キャノーラ、ナタネ、Ａｒａｂｉｏｄｏｐｓｉｓ種及び落花生の ような高脂肪種子植物がある。砂漠及び鉱物質土壌で生育する稙物もＰＨＡ産生 に使用できる。このようにして産生され得るポリマーの非限定例としては、ＰＨ Ｂ、及び、ＰＨＢ−ＰＨＣコポリマー、ＰＨＣ−ＰＨＯコポリマー、ＰＨＯ−Ｐ ＨＤコポリマーのような短鎖長モノマーと中鎖長モノマーとを組合せたコポリマ ーがある。 上記の記載から、本発明の多様な変更が可能であることは明らかであろう。こ のような変更は本発明の要旨及び範囲から逸脱しないと考えられるべきであり、 当業者に自明のこの種の変更のすべてが請求の範囲に包含されると理解されたい 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/00 9/00 Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列１の９１１位から１７９５位に示すコーディング鎖またはその相 補鎖のヌクレオチド配列、 （ｂ）５５〜６５℃で０．５×ＳＳＣから２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに等価の 洗浄緊縮性条件下で前記（ａ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズでき且つポ リヒドロキシアルカノエート産生に好適な活性を有しているタンパク質をコード するヌクレオチド配列、 （ｃ）前記（ａ）のヌクレオチド配列に少なくとも約４０％の相同性を有してお り且つポリヒドロキシアルカノエート産生に好適な活性を有しているタンパク質 をコードするヌクレオチド配列、 （ｄ）前記（ａ）のヌクレオチド配列と同じ遺伝情報をコードしているが遺伝コ ードの縮重性に従って縮重しているヌクレオチド配列、 （ｅ）前記（ｂ）のヌクレオチド配列と同じ遺伝情報をコードしているが遺伝コ ードの縮重性に従って縮重しているヌクレオチド配列、 から成るグループから選択されたヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子 。 ２．配列１の９１１位から１７９５位までのＤＮＡ配列を有することを特徴とす る請求項１に記載のＤＮＡセグメント。 ３．宿主細胞中でＲＮＡ配列を産生させるべく機能するプロモーター領域と前記 プロモーターに作用可能に連結された請求項１に記載のＤＮＡ配列とを含んで成 る組換えＤＮＡセグメント。 ４．配列１の９１１位から１７９５位までのＤＮＡ配列を有することを特徴とす る請求項３に記載の組換えＤＮＡセグメント。 ５．請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡセグメントを含む組換えベク ター。 ６．請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡセグメントを含んでおり、前 記ＤＮＡセグメントがプロモーター領域にヘテロロガスであることを特徴とする 組換え宿主細胞。 ７．微生物または植物の細胞であることを特徴とする請求項６に記載の組換え細 胞。 ８．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｒＲＮＡ相同グループ Ｉの細菌であることを特徴とする請求項６に記載の組換え細胞。 ９．少なくとも２０ヌクレオチドの長さを有しており少なくとも２０個の連続す る請求項１に記載のヌクレオチドに対応する配列を有することを特徴とする単離 されたＤＮＡセグメント。 １０．ポリヒドロキシアルカノエートを産生させるために有用な細胞を形質転換 させる方法であって、 機能性ＰＨＡシンターゼ遺伝子を有する宿主細胞を選択する段階と、 宿主細胞中でＲＮＡ配列を産生するために機能するプロモーター領域と前記プ ロモーターに作用可能に連結されており前記プロモーター領域にヘテロロガスな 請求項１に記載のＤＮＡ配列とを含む組換えベクターを作製する段階と、 選択された宿主細胞を形質転換させる段階と、 形質転換細胞を再生する段階と、 から成る細胞の形質転換方法。 １１．組換えベクターが配列１の９１１位から１７９５位までのＤＮＡ配列を含 むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。 １２．宿主細胞が微生物または植物の細胞であることを特徴とする請求項１０に 記載の方法。 １３．宿主細胞がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃ ｅｎｓ ｒＲＮＡ相同グループＩの細菌から選択されることを特徴とする請求項 １０に記載の方法。 １４．３〜１４個の炭素原子を有する反復単位から成るポリヒドロキシアルカノ エート（ＰＨＡ）の産生方法であって、 請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法で作製した形質転換細胞をフ ァージ遺伝子の発現が得られるように培養する段階と、 細胞からＰＨＡを回収する段階とから成る方法。 １５．形質転換した微生物細胞を単純糖質基質を含む培地で培養することを特徴 とする請求項１４に記載の方法。 １６．培地がグルコネート、グルコース、スクロース、フルクトースまたはラク トースから成ることを特徴とする請求項１５に記載の方法。 １７．形質転換細胞をコーンシロップまたは糖蜜から成る培地で培養することを 特徴とする請求項１４に記載の方法。 １８．配列２のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたタンパク質。 １９．ＰｈａＧを発現する遺伝的に形質転換された植物を産生する方法であって 、 （ｉ）植物細胞にＲＮＡ配列を産生させる機能を有しているプロモーターと、 （ｉｉ）前記プロモーターに作用可能に連結された請求項１に記載のＰｈａＧ ＤＮＡ配列と、 を含んで成る組換え二重鎖ＤＮＡ分子を宿主植物細胞のゲノムに挿入する段階と 、 形質転換植物細胞を作製する段階と、 形質転換植物細胞を再生させる段階と、 から成る方法。 ２０．ＰｈａＧ ＤＮＡ配列が配列１の９１１位から１７９５位までの配列であ ることを特徴とする請求項１９に記載の方法。 ２１．宿主植物細胞のゲノムが更に機能性ＰＨＡシンターゼ遺伝子を含むことを 特徴とする請求項１９に記載の方法。 ２２．更に、形質転換された植物または植物の部分を採取する段階を含む請求項 １９に記載の方法。 ２３．採取した植物の部分が葉、根、種子または塊茎であることを特徴とする請 求項２１に記載の方法。 ２４．宿主植物が、トウモロコシ、ジャガイモ、テンサイ、タバコ、小麦、また は、大豆、キャノーラ、ナタネ、ヒマワリ、 亜麻、落花生及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから成るグループから選択された高脂 肪種子植物であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。 ２５．請求項１８から２３のいずれか一項に記載の方法によって産生される植物 。 ２６．グルコネートからＰＨＡを合成する能力を有していないがオクタン酸から ＰＨＡを合成する能力を有している突然変異微生物。 ２７．微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａの突然変異体であること を特徴とする請求項２６に記載の突然変異体。 ２８．微生物が細菌または真菌の突然変異体であることを特徴とする請求項２６ に記載の突然変異体。 ２９．微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｌｃａｌｉ ｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ ａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｅｐｈ ａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ、 Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｃａｎｄｉ ｄａ、ＨａｎｓｅｎｕｌａまたはＰｉｃｈｉａの突然変異体であることを特徴と する請求項２６に記載の突然変異体。 ３０．グルコネートからＰＨＡを合成する表現型の能力が配列１のＤＮＡ配列と の相補性によって回復することを特徴とする請求項２６に記載の突然変異体。 ３１．微生物が放線菌類Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓまたは酵母の突然変異体で あることを特徴とする請求項２８に記載の突然変異体。