DE19935088A1 - DNA-Sequenzen, die sich zum spezifischen Nachweis von Pseudomonas putida KT2440 eignen - Google Patents

DNA-Sequenzen, die sich zum spezifischen Nachweis von Pseudomonas putida KT2440 eignen

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Abstract

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die sich zum spezifischen Nachweis von Pseudomonas putida KT2440 eignen.

Description

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die sich zum spezifischen Nachweis von Pseu­ domonas putida KT2440 eignen.
Einleitung und Stand der Technik
Das Gram-negative Bodenbakterium Pseudomonas putida Stamm KT2440 ist durch die US-amerikanische Gesundheitsbehörde (NIH [rec]) geprüft und als Sicherheitsstamm deklariert worden. Mit der Zunahme der Bedenken im Hinblick auf sowohl die geschlos­ sene als auch die offene biotechnologische Verwendung von Bakterienstämmen, die mit pflanzen-, tier- oder humanpathogenen Bakterien verwandt sind, erhöht sich die Bedeu­ tung dieses Sicherheitsstammes für verschiedene Anwendungen.
Ein wesentlicher Sicherheitsaspekt von Pseudomonas putida KT2440 ist das Fehlen von potentiell pathogen Eigenschaften.
Zur Zeit ist die Verwendung von drei Bakteriengattungen, nämlich Escherichia coli (Stämme chi-1776, MRC und K12), der asporogenen, thyminabhängigen Mutante des Bacillus-subtilis-Stammes 168 und des oben beschriebenen Pseudomonas-putida- KT2440-Stammes, jeweils mit den entsprechenden genetischen Vektoren, als "biologi­ sche Sicherheitsmaßnahme" anerkannt. Die Verwendung dieser Bakterien für gentechni­ sche Arbeiten gemäß der GenTSV reduziert in beträchtlichem Maße das Gefährdungs­ potential und beeinflußt somit positiv die behördliche Gesamtbewertung der gentechni­ schen Arbeiten in gentechnischen Anlagen.
Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß es zahlreiche Gene gibt, die ausschließlich in die­ sem Organismus vorhanden sind und keine signifikanten Homologien zu Genen aus be­ reits bekannten Organismen aufweisen. Überraschenderweise wurde gefunden, daß diese Gene nicht in dem mit Pseudomonas putida KT2440 nahe verwandten, aber humanpa­ thogen Bakterienstamm Pseudomonas aeruginosa vorhanden sind. Diese für Pseudomo­ nas putida KT2440 charakteristischen Gene und die davon abzuleitenden Funktionen sind für die Sicherheit des Bakteriums maßgeblich.
Aufgabe der Erfindung ist somit die Bereitstellung von DNA-Sequenzen gemäß Patent­ anspruch 1, die sich zum spezifischen Nachweis von Pseudomonas putida KT2440 eig­ nen, und zwar insbesondere in Gegenwart von anderen Bakterien der Gattung Pseudo­ monas, beispielsweise Pseudomonas aeruginosa.
Im folgenden bedeutet die Angabe "ORF" einen offenen Leserahmen (open reading fra­ me).
Durch die Bereitstellung derartiger DNA-Sequenzen lassen sich folgende Vorteile erzie­ len.
Im Gegensatz zu den beiden anderen biologischen Sicherheitsstämmen zeichnet sich Pseudomonas putida KT2440 durch eine sehr hohe katabolische Vielfalt und durch eine hohe Überlebens- und Anpassungsfähigkeit an verschiedene Standorte (Rhizosphäre und Boden) aus. In Kombination mit den anerkannten Vektorsystemen kann dieses Bakterium für Arbeiten mit rekombinierter DNS in den verschiedensten Bereichen der Biotechnolo­ gie (z. B. als mikrobieller Produktionsstamm, für biologische Sanierungsverfahren etc.) und der Biomedizin (z. B. als mikrobieller Impfstoffträger) eingesetzt werden. Die Ver­ wendung der erfindungsgemäß offenbarten Gene bzw. Nucleinsäuresequenzen oder mo­ difizierten Abwandlungen davon und der davon abgeleiteten Expressionsprodukte zum Nachweis sind die Basis für die genetische Sicherheit dieses Stammes.
Die DNA-Sequenzen lassen sich mit üblichen molekularbiologischen Methoden (vgl. z. B. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989) in bekannte und optimierte Ex­ pressionsvektoren insertieren, wodurch die entsprechende Transformation, Selektion und Klonierung von Zellen möglich ist, die dann zur Synthese der Expressionsprodukte durch Fermentation in der Lage sind. Wenn ein überproduzierender Zellklon gewählt wird, las­ sen sich die gewünschten Expressionsprodukte leicht in großen Mengen herstellen und gewinnen.
Die Kenntnis der DNA-Sequenzen gestattet die gezielte Mutagenese ("site-directed mutagenesis") mit üblichen gentechnischen Methoden und somit die Konstruktion von optimierten Expressionsprodukten ("protein engineering").
Ferner ist die Modulation der Expression der kodierenden Sequenzen, insbesondere in Bakterien der Gattung Pseudomouas, beispielsweise der Pseudomonas-putida- oder Pseudomonas-fluoreszenz-Gruppe, möglich. Unter Modulation wird allgemein eine Be­ einflußung der Expression verstanden, z. B. das An- und Ausschalten oder die Erhö­ hung/Erniedrigung der Expression.
Die Erfindung betrifft somit ferner einen rekombinierten Expressionsvektor nach Patent­ anspruch 2, damit transformierte Zellen nach Patentanspruch 3, ein Verfahren zur Her­ stellung von Expressionsprodukten nach Patentanspruch 5, Expressionsprodukte- bzw. Teilexpressionsprodukte nach Patentanspruch 6, synthetische Peptide bzw. Proteine nach Patentanspruch 7, poly- bzw. monoklonale Antikörper nach Patentanspruch 8 bzw. 9, Hybridomzellen nach Patentanspruch 10, transgene Pflanzen nach Patentanspruch 13 so­ wie die Verwendung der DNA-Sequenzen als Sonden bzw. PCR-Primer nach Patentan­ spruch 15 und ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Pseudomonas putida KT2440 nach Patentanspruch 16.
Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Verfahren zum Anzüchten beliebiger Zellen, zur Isolierung der DNA daraus sowie zu deren Amplifikation, z. B. durch die Polymerasekettenreaktion, und deren Sequenzierung sind im Stand der Technik bekannt und bedürfen keiner weiteren Erläuterung. Das glei­ che gilt für die Rekombination von DNA-Sequenzen, die Konstruktion/Rekombination von geeigneten Expressionsvektoren und die Transformation/Transfektion von beliebigen Zellen mit molekularbiologischen Techniken, die Identifikation/Selektion von geeigneten Klonen und deren Anzüchtung und die Gewinnung, Reinigung und Charakterisierung der von diesen Klonen produzierten Expressionsprodukte (vgl. beispielsweise das oben zi­ tierte Standardwerk von Maniatis et al.; D. S. T. Nicholl, "Gentechnische Methoden", Spektrum Akademischer Verlag, 1995; C. R. Newton, A. Graham, "PCR", Spektrum Akademischer Verlag, 1994; F. Lotspeich/H. Zorbas (Hrsg.), "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag, 1998). Auch die Herstellung und Markierung von poly- oder monoklonalen Antikörpern bzw. die Herstellung der die letzteren bildenden Hybridome ist seit langem bekannt (vgl. beispielsweise: E. Harlow, D. Lane, "Antibodies, A Labo­ ratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; E. Lidell, I. Weeks, "Antikörper- Techniken", Spektrum Akademischer Verlag, 1996).
Der spezifische Nachweis von Genen oder Nucleinsäuresequenzen oder Proteinen oder von diese enthaltenden oder sezernierenden Zellen zur Identifizierung der Zellen oder diese enthaltenden multizellulären Organismen ist ebenfalls bekannt (vgl. die oben ange­ gebenen Literaturstellen).

Claims (19)

1. DNA-Sequenzen, die ausgewählt sind unter:
  • a) den folgenden DNA-Sequenzen:
    oder deren komplementären Strängen,
  • b) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen an die Proteine kodierenden Regionen der in (a) definierten DNA-Sequenzen oder an Fragmente davon hybridisieren,
  • c) DNA-Sequenzen, die wegen der Degeneration des genetischen Kodes an die un­ ter (a) und/oder (b) definierten DNA-Sequenzen hybridisieren,
  • d) alle Variationen und durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nucleotiden entstandene Mutanten der unter (a) bis (c) definierten DNA-Sequenzen, die isofunktio­ nelle Expressionsprodukte ergeben.
2. Rekombinierter Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 ent­ hält.
3. Prokaryotische oder eukaryotische Zelle, die mit einer DNA-Sequenz nach An­ spruch 1 oder mit einem rekombinierten Expressionsvektor nach Anspruch 2 transfor­ miert oder transfiziert ist.
4. Zelle nach Anspruch 3, wobei die Zelle von Bakterien, insbesondere der Gattung Pseudomonas, z. B. Pseudomonas putida oder Pseudomonas fiuoreszenz, vorzugsweise Pseudomonas putida KT2440, stammt.
5. Verfahren zur Herstellung von Expressionsprodukten, bei dem eine Zelle nach Anspruch 3 oder 4 in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und die Expressionspro­ dukte aus dem Medium isoliert werden.
6. Expressionsprodukt oder Teilexpressionsprodukt einer DNA-Sequenz nach An­ spruch 1.
7. Synthetisches Peptid oder Protein mit der Aminosäuresequenz eines Expressions­ produktes oder Teilexpressionsproduktes nach Anspruch 6.
8. Polyklonaler Antikörper, der spezifisch gegen ein Expressionsprodukt oder Tei­ lexpressionsprodukt nach Anspruch 6 oder gegen ein synthetisches Peptid oder Protein nach Anspruch 7 gerichtet ist.
9. Monoklonaler Antikörper, der spezifisch gegen ein Expressionsprodukt oder Tei­ lexpressionsprodukt nach Anspruch 6 oder gegen ein synthetisches Peptid oder Protein nach Anspruch 7 gerichtet ist.
10. Hybridomzelle, die einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 9 bildet.
11. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder poly- oder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 8 bzw. 9, die/der nachweisbar markiert ist.
12. DNA-Sequenz oder poly- oder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 11, wobei die Markierung eine oder mehrere radioaktive, farbige oder fluoreszierende Gruppen, Gruppen zur Immobilisierung an einer festen Phase und/oder Gruppen für eine indirekte oder direkte Reaktion, insbesondere durch Konjugation mit einem Hapten, insbesondere Biotin, Digoxigenin, Fluorescein oder 2,4-Dinitrophenol, bzw. im Falle von Antikörpern insbesondere mit Hilfe von enzymkonjugierten Sekundärantikörpern, des auf Biotin/Avi­ din(Streptavidin) oder des auf kolloidalem Gold beruhenden Systems, umfaßt.
13. Transgene Pflanze, die transformierte oder transfizierte Zellen nach Anspruch 3 enthält.
14. Transgene Pflanze nach Anspruch 13, die zu den Leguminosen gehört.
15. Verwendung von DNA-Sequenzen nach Anspruch 1 oder Teilsequenzen davon als Sonden zum Nachweis oder zur Isolierung von "Full-length"-cDNA-Sequenzen und/oder als Primer zur Amplifikation derartiger "Full-length"-cDNA-Sequenzen durch die Poly­ merasekettenreaktion.
16. Verfahren zum spezifischen Nachweis von Pseudomonas putida KT2440, bei dem als Sonde eine DNA-Sequenz oder ein poly- oder monoklonaler Antikörper nach An­ spruch 11 oder 12 verwendet wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Sonde an einem festen Träger immobili­ siert ist.
18. Verwendung einer oder mehrerer DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von DNA-Chips.
19. DNA-Chips, erhältlich unter Verwendung einer oder mehrerer DNA- Sequenzen gemäß Anspruch 1.
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