DE19935106A1 - DNA-Sequenzen, die Lipopeptidsynthasen kodieren - Google Patents

DNA-Sequenzen, die Lipopeptidsynthasen kodieren

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Abstract

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die Lipopeptidsynthasen kodieren, insbesondere Lipopeptidsynthasen von Bakterien der Gattung Pseudomonas, beispielsweise der Pseudomonas-putida- und Pseudomonas-fluoreszenz-Gruppe.

Description

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die Lipopeptidsynthasen kodieren, insbesondere Lipopeptidsynthasen von Bakterien der Gattung Pseudomonas, beispielsweise der Pseu­ domonas-putida- und Pseudomonas-fluoreszenz-Gruppe.
Einleitung und Stand der Technik
Die Lipopeptidsynthasen der Pseudomonas-putida-Gruppe sowie die von homologen Genen kodierten homologen Proteine in der Pseudomonas-fluoreszenz-Gruppe bilden verschiedene Lipopeptide mit pharmazeutischer, antiviraler, antibakterieller, antifungizi­ der und oberflächenaktiver Wirkung. Einerseits können die durch nicht-ribosomale Pep­ tidsynthese gewonnenen Produkte als Wirkstoffe gegen Viren, Bakterien und Pilze ver­ wandt werden, andererseits ist aufgrund der oberflächenaktiven Wirkung der Verbindun­ gen (Surfactant) eine biotechnologische Anwendung bei der Degradation von hydropho­ ben Substanzen möglich. Aufgrund der Multikomponentenstruktur der Lipopeptidsyn­ thetasen ist eine In-vitro-Kombination einzelner Bausteine mit bereits bekannten Lipo­ peptidsynthetasen (beispielsweise aus Bacillus licheniformis) möglich, um neue oberflä­ chenaktive Verbindungen zu synthetisieren.
Lipopeptidsynthetasen, vornehmlich aus den Gram-positiven Bacillus-Stämmen (Bacillus licheniformis), werden zur Herstellung von biologischen Wirkstoffen eingesetzt. Durch die hohe Oberflächenaktivität dieser Substanzen werden vor allem biologische Membran­ systeme beeinflußt.
Beschreibung der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von DNA-Sequenzen gemäß Patentanspruch 1, die Lipopeptidsynthasen kodieren, insbesondere Lipopeptidsynthasen von Bakterien der Gattung Pseudomonas, beispielsweise der Pseudomonas-putida- oder Pseudomonas- fluoreszenz-Gruppe.
Im folgenden bedeutet die Angabe "ORF" einen offenen Leserahmen (open reading fra­ me).
Durch die Bereitstellung derartiger DNA-Sequenzen lassen sich folgende Vorteile erzie­ len.
Mit Hilfe der natürlichen oder modifizierten Sequenzen und der davon abgeleiteten Ex­ pressionsprodukte können Bakterien der P.-putida- und der P.-fluoreszenz-Gruppe oder andere geeignete Wirte biologisch aktive Lipopeptide synthetisieren. Einzelne Kompo­ nenten des Lipopeptid-Multienzymkomplexes können mit Untereinheiten aus bereits be­ kannten Lipopeptidsynthetasen kombiniert werden, um eine Vielzahl an verschiedenen biologische aktiven Substanzen zu synthetisieren. Diese Substanzen können sowohl eine pharmazeutische Anwendung als auch eine biotechnologische Anwendung im Hinblick auf die Bildung von Emulsionen mit hydrophoben Substanzen (z. B. zur Erhöhung der Bioverfügbarkeit beim mikrobiologischen Schadstoffabbbau oder zur Förderung der ter­ tiären Erdölproduktion) haben sowie als anti-pathogene protektive Agenzien in Pflanzen fungieren.
Die DNA-Sequenzen lassen sich mit üblichen molekularbiologischen Methoden (vgl. z. B. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989) in bekannte und optimierte Ex­ pressionsvektoren insertieren, wodurch die entsprechende Transformation, Selektion und Klonierung von Zellen möglich ist, die dann zur Synthese von Lipopeptidsynthasen durch Fermentation in der Lage sind. Wenn ein überproduzierender Zellklon gewählt wird, lassen sich die gewünschten Lipopeptidsynthasen leicht in großen Mengen herstel­ len und gewinnen.
Die Kenntnis der DNA-Sequenzen gestattet die gezielte Mutagenese ("site-directed mutagenesis") mit üblichen gentechnischen Methoden und somit die Konstruktion von optimierten Lipopeptidsynthasen ("protein engineering").
Ferner ist die Modulation der Expression der kodierenden Sequenzen, insbesondere in Bakterien der Gattung Pseudomonas, beispielsweise der Pseudomonas-putida- oder Pseudomonas-fluoreszenz-Gruppe, möglich. Unter Modulation wird allgemein eine Be­ einflußung der Expression verstanden, z. B. das An- und Ausschalten oder die Erhö­ hung/Erniedrigung der Expression.
Die Erfindung betrifft somit ferner einen rekombinierten Expressionsvektor nach Patent­ anspruch 4, damit transformierte Zellen nach Patentanspruch 5, ein Verfahren zur Her­ stellung von Lipopeptidsynthasen nach Patentanspruch 7, Expressions- bzw. Teilexpres­ sionsprodukte nach Patentanspruch 8, synthetische Peptide bzw. Proteine nach Patentan­ spruch 9, poly- bzw. monoklonale Antikörper nach Patentanspruch 10 bzw. 11, Hybri­ domzellen nach Patentanspruch 12, transgene Pflanzen nach Patentanspruch 15 sowie die Verwendung der DNA-Sequenzen als Sonden bzw. PCR-Primer nach Patentanspruch 17 und die Verwendung der transformierten Zellen nach Patentanspruch 5 oder der nach dem Verfahren nach Patentanspruch 7 hergestellten Lipopeptidsynthasen oder der Ex­ pressions- bzw. Teilexpressionsprodukte nach Patentanspruch 8 oder der synthetischen Peptide bzw. Proteine nach Patentanspruch 9 zur Herstellung von antiviralen, antibakteri­ ellen oder antifungiziden Lipopeptiden nach Patentanspruch 18 oder zur Herstellung von oberflächenaktiven Lipopeptiden nach Patentanspruch 19.
Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Verfahren zum Anzüchten beliebiger Zellen, zur Isolierung der DNA daraus sowie zu deren Amplifikation, z. B. durch die Polymerasekettenreaktion, und deren Sequenzierung sind im Stand der Technik bekannt und bedürfen keiner weiteren Erläuterung. Das glei­ che gilt für die Rekombination von DNA-Sequenzen, die Konstruktion/Rekombination von geeigneten Expressionsvektoren und die Transformation/Transfektion von beliebigen Zellen mit molekularbiologischen Techniken, die Identifikation/Selektion von geeigneten Klonen und deren Anzüchtung und die Gewinnung, Reinigung und Charakterisierung der von diesen Klonen produzierten Expressionsprodukte (vgl. beispielsweise das oben zi­ tierte Standardwerk von Maniatis et al.; D. S. T. Nicholl, "Gentechnische Methoden", Spektrum Akademischer Verlag, 1995; C. R. Newton, A. Graham, "PCR", Spektrum Akademischer Verlag, 1994; F. Lotspeich/H. Zorbas (Hrsg.), "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag, 1998). Auch die Herstellung und Markierung von poly- oder monoklonalen Antikörpern bzw. die Herstellung der die letzteren bildenden Hybridome ist seit langem bekannt (vgl. beispielsweise: E. Harlow, D. Lane, "Antibodies, A Labo­ ratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; E. Lidell, I. Weeks, "Antikörper- Techniken", Spektrum Akademischer Verlag, 1996).

Claims (22)

1. DNA-Sequenzen, deren Expressionsprodukte die biologische Funktion von Lipo­ peptidsynthasen haben.
2. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1, wobei die DNA aus Bakterien der Gattung Pseudomonas, insbesondere aus Pseudomonas putida oder Pseudomonas fluoreszenz, stammt.
3. DNA-Sequenzen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die DNA ausgewählt ist unter:
  • a) den folgenden DNA-Sequenzen:
    oder deren komplementären Strängen,
  • b) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen an die Proteine kodierenden Regionen der in (a) definierten DNA-Sequenzen oder an Fragmente davon hybridisieren,
  • c) DNA-Sequenzen, die wegen der Degeneration des genetischen Kodes an die un­ ter (a) und (b) definierten DNA-Sequenzen hybridisieren,
  • d) allele Variationen und durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nucleotiden entstandene Mutanten der unter (a) bis (c) definierten DNA-Sequenzen, die isofunktio­ nelle Expressionsprodukte ergeben.
4. Rekombinierter Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz nach einem der An­ sprüche 1 bis 3 enthält.
5. Prokaryotische oder eukaryotische Zelle, die mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder mit einem rekombinierten Expressionsvektor nach Anspruch 4 transformiert oder transfiziert ist.
6. Zelle nach Anspruch 5, wobei die Zelle von Bakterien, insbesondere der Gattung Pseudomonas, z. B. Pseudomonas putida oder Pseudomonas fluoreszenz, vorzugsweise Pseudomonas putida KT 2440, stammt.
7. Verfahren zur Herstellung von Lipopeptidsynthasen, bei dem eine Zelle nach ei­ nem der Ansprüche 5 oder 6 in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und die Lipo­ peptidsynthasen aus dem Medium isoliert werden.
8. Expressionsprodukt oder Teilexpressionsprodukt einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
9. Synthetisches Peptid oder Protein mit der Aminosäuresequenz eines Expressions­ produktes oder Teilexpressionsproduktes nach Anspruch 8.
10. Polyklonaler Antikörper, der spezifisch gegen ein Expressionsprodukt oder Tei­ lexpressionsprodukt nach Anspruch 8 oder gegen ein synthetisches Peptid oder Protein nach Anspruch 9 gerichtet ist.
11. Monoklonaler Antikörper, der spezifisch gegen ein Expressionsprodukt oder Tei­ lexpressionsprodukt nach Anspruch 8 oder gegen ein synthetisches Peptid oder Protein nach Anspruch 9 gerichtet ist.
12. Hybridomzelle, die einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 11 bildet.
13. Poly- oder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 10 oder 11, der nachweisbar markiert ist.
14. Poly- oder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 13, wobei die Markierung eine oder mehrere radioaktive, farbige oder fluoreszierende Gruppen, Gruppen zur Im­ mobilisierung an einer festen Phase und/oder Gruppen für eine indirekte oder direkte Re­ aktion, insbesondere mit Hilfe von enzymkonjugierten Sekundärantikörpern, des auf Biotin/Avidin (Streptavidin) oder des auf kolloidalem Gold beruhenden Systems umfaßt.
15. Trangene Pflanze, die transformierte oder transfizierte Zellen nach Anspruch 5 enthält.
16. Transgene Pflanze nach Anspruch 15, die zu den Leguminosen gehört.
17. Verwendung von DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder Teilse­ quenzen davon als Sonden zum Nachweis oder zur Isolierung von "Full-length"-cDNA- Sequenzen und/oder als Primer zur Amplifikation derartiger "Full-length"-cDNA- Sequenzen durch die Polymerasekettenreaktion.
18. Verwendung von transformierten Zellen nach Patenanspruch 5 oder von nach dem Verfahren nach Patentanspruch 7 hergestellten Lipopeptidsynthasen oder von Ex­ pressions- oder Teilexpressionsprodukten nach Patentanspruch 8 oder von synthetischen Peptiden oder Proteinen nach Patentanspruch 9 zur Herstellung von antiviralen, antibak­ teriellen oder antifungiziden Lipopeptiden.
19. Verwendung von transformierten Zellen nach Patentanspruch 5 oder von nach dem Verfahren nach Patentanspruch 7 hergestellten Lipopeptidsynthasen oder von Ex­ pressions- oder Teilexpressionsprodukten nach Patentanspruch 8 oder von synthetischen Peptiden oder Proteinen nach Patentanspruch 9 zur Herstellung von oberflächenaktiven Lipopeptiden.
20. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die antiviralen, antibakteriellen oder anti­ fungiziden Lipopeptide auf Pflanzen, insbesondere Leguminosen, angewendet werden.
21. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die oberflächenaktiven Lipopeptide zur Erhöhung der Bioverfügbarkeit beim mikrobiologischen Schadstoffabbau verwendet werden.
22. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die oberflächenaktiven Lipopeptide zur tertiären Erdölproduktion verwendet werden.
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