DE19934718A1 - DNA-Sequenzen, die Nodulationsfaktoren kodieren - Google Patents

DNA-Sequenzen, die Nodulationsfaktoren kodieren

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Abstract

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die Nodulationsfaktoren kodieren, insbesondere Nodulationsfaktoren von Bakterien der Gattung Pseudomonas, beispielsweise der Pseudomonas-putida- und Pseudomonas-fluoreszenz-Gruppe.

Description

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die Nodulationsfaktoren kodieren, insbesondere Nodu­ lationsfaktoren von Bakterien der Gattung Pseudomonas, beispielsweise der Pseudomonas­ putida- und Psecedomonas-fluoreszenz-Gruppe.
Einleitung und Stand der Technik
Die Nodulationsfaktoren der Pseudomonas-putida-Gruppe sowie homologe Gene und Proteine in der Pseudomonas-fluoreszenz-Gruppe sind für das Nodulationsverhalten dieser Bodenbakteri­ en in der Rhizosphäre verantwortlich. Die von den Genen abgeleiteten Genprodukte fördern die Kolonisationsfähigkeit von Bakterien der P.-putida-Gruppe und der P.-fluoreszenz-Gruppe im Bereich der Pflanzenwurzel, ermöglichen eine Interaktion mit den Wurzelhaaren von Pflanzen und unterstützen dadurch nachhaltig die Wurzelbildung und das Wachstum von Pflanzen. Durch die vielfältigen biodegradativen Eigenschaften von Bakterien der Pseudomonas-putida- und Pseudomonas-fluoreszenz-Gruppe können diese Organismen durch den Abbau von pflanzen­ schädlichen Xenobiotika die Keimung von Saatgut auch in kontaminierten Böden ermöglichen.
Es ist von den Bakteriengattungen Rhizobium, Bradyrhizobium und Azorhizobium bekannt, daß sie durch Nodulation (Wurzelknöllchenbildung) bei Leguminosen nachhaltig das Pflanzen­ wachstum fördern. Die Gensequenzen für die entsprechende Eigenschaften in Pseudomonaden waren bisher unbekannt.
Beschreibung der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung von DNA-Sequenzen gemäß Patentanspruch 1, die Nodulationsfaktoren kodieren, insbesondere Nodulationsfaktoren von Bakterien der Gat­ tung Pseordomonas, beispielsweise der Pseudomonas-putida- und Pseudomonas-fluoreszenz- Gruppe.
Im folgenden bedeutet die Angabe "ORF" einen offenen Leserahmen (open reading frame).
Durch die Bereitstellung derartiger DNA-Sequenzen lassen sich folgende Vorteile erzielen.
Mit Hilfe der natürlichen oder modifizierten Sequenzen und der davon abgeleitenden Expressi­ onsprodukte können Bakterien der P.-putida- und P.-fluoreszenz-Gruppe oder auch andere ge­ eignete Wirte in die Lage versetzt werden, die Wurzelbildung von Pflanzen zu verbessern. Mi­ kroorganismen mit dieser Nodulationseigenschaft können einerseits verwertbare Stoffe zu den Pflanzenzellen transportieren und andererseits für die Pflanzenzellen schädliche Stoffe detoxifi­ zieren. Aus anerkannten biologischen Sicherheitsgründen wird Pseudomonas putida KT2440 als Träger von rekombinierter DNA 1.) zur genetischen Modifikation der Pflanzenzellen oder 2.) zur heterologen Genexpression innerhalb der Pflanzenzellen nach der erfolgten Nodulation einge­ setzt, wodurch das Pflanzenwachstum positiv beeinflußt und eine Ertragserhöhung erzielt wird.
Die DNA-Sequenzen lassen sich mit üblichen molekularbiologischen Methoden (vgl. z. B. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989) in bekannte und optimierte Expressionsvektoren insertieren, wodurch die entsprechende Transformation, Selektion und Klonierung von Zellen möglich ist, die dann zur Synthese von Nodulationsfaktoren durch Fermentation in der Lage sind. Wenn ein überproduzierender Zellklon gewählt wird, lassen sich die gewünschten Nodula­ tionsfaktoren leicht in großen Mengen herstellen und gewinnen.
Die Kenntnis der DNA-Sequenzen gestattet die gezielte Mutagenese ("site-directed mutagene­ sis") mit üblichen gentechnischen Methoden und somit die Konstruktion von optimierten Nodu­ lationsfaktoren ("protein engineering").
Ferner ist die Modulation der Expression der kodierenden Sequenzen, insbesondere in Bakterien der Gattung Pseudomonas, beispielsweise der Pseudomonas-putida- oder Pseudomonas- fluoreszenz-Gruppe, möglich. Unter Modulation wird allgemein eine Beeinflußung der Expressi­ on verstanden, z. B. das An- und Ausschalten oder die Erhöhung/Erniedrigung der Expression.
Die Erfindung betrifft somit ferner einen rekombinierten Expressionsvektor nach Patentanspruch 4, damit transformierte Zellen nach Patentanspruch 5, ein Verfahren zur Herstellung von Nodu­ lationsfaktoren nach Patentanspruch 7, Expressions- bzw. Teilexpressionsprodukte nach Patent­ anspruch 8, synthetische Peptide bzw. Proteine nach Patentanspruch 9, poly- bzw. monoklonale Antikörper nach Patentanspruch 10 bzw. 11, Hybridomzellen nach Patentanspruch 12, transgene Pflanzen nach Patentanspruch 15 sowie die Verwendung der DNA-Sequenzen als Sonden bzw. PCR-Primer nach Patentanspruch 17 und die Verwendung der transformierten Zellen nach Pa­ tentanspruch 5 oder der nach dem Verfahren nach Patentanspruch 7 hergestellten Nodulations­ faktoren oder der Expressions- bzw. Teilexpressionsprodukte nach Patentanspruch 8 oder der synthetischen Peptide bzw. Proteine nach Patentanspruch 9 zur Förderung der Wurzelbildung und des Wachstums von Pflanzen nach Patentanspruch 18.
Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Verfahren zum Anzüchten beliebiger Zellen, zur Isolierung der DNA daraus sowie zu deren Amplifikation, z. B. durch die Polymerasekettenreaktion, und deren Sequenzierung sind im Stand der Technik bekannt und bedürfen keiner weiteren Erläuterung. Das gleiche gilt für die Rekombination von DNA-Sequenzen, die Konstruktion/Rekombination von geeigneten Expres­ sionsvektoren und die Transformation/Transfektion von beliebigen Zellen mit molekularbiologi­ schen Techniken, die Identifikation/Selektion von geeigneten Klonen und deren Anzüchtung und die Gewinnung, Reinigung und Charakterisierung der von diesen Klonen produzierten Expressi­ onsprodukte (vgl. beispielsweise das oben zitierte Standardwerk von Maniatis et al.; D. S. T. Nicholl, "Gentechnische Methoden", Spektrum Akademischer Verlag, 1995; C. R. Newton, A. Graham, "PCR", Spektrum Akademischer Verlag, 1994; F. Lotspeich/H. Zorbas (Hrsg.), "Bio­ analytik", Spektrum Akademischer Verlag, 1998). Auch die Herstellung und Markierung von poly- oder monoklonalen Antikörpern bzw. die Herstellung der die letzteren bildenden Hybri­ dome ist seit langem bekannt (vgl. beispielsweise: E. Harlow, D. Lane, "Antibodies, A Laborato­ ry Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; E. Lidell, I. Weeks, "Antikörper-Techniken", Spektrum Akademischer Verlag, 1996).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (20)

1. DNA-Sequenzen, deren Expressionsprodukte die biologische Funktion von Nodulations­ faktoren haben.
2. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1, wobei die DNA aus Bakterien der Gattung Pseudo­ monas, insbesondere aus Pseudomonas putida oder Pseudomonas fluoreszenz, stammt.
3. DNA-Sequenzen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die DNA ausge­ wählt ist unter:
  • a) den folgenden DNA-Sequenzen:
    oder deren komplementären Strängen,
  • b) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen an die Proteine kodierenden Regio­ nen der in (a) definierten DNA-Sequenzen oder an Fragmente davon hybridisieren,
  • c) DNA-Sequenzen, die wegen der Degeneration des genetischen Kodes an die unter (a) und (b) definierten DNA-Sequenzen hybridisieren,
  • d) allele Variationen und durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nucleotiden ent­ standene Mutanten der unter (a) bis (c) definierten DNA-Sequenzen, die isofunktionelle Expres­ sionsprodukte ergeben.
4. Rekombinierter Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.
5. Prokaryotische oder eukaryotische Zelle, die mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder mit einem rekombinierten Expressionsvektor nach Anspruch 4 transfor­ miert oder transfiziert ist.
6. Zelle nach Anspruch 5, wobei die Zelle von Bakterien, insbesondere der Gattung Pseu­ domonas, z. B. Pseudomonas putida oder Pseudomonas fluoreszenz, vorzugsweise Pseudomonas putida KT 2440, stammt.
7. Verfahren zur Herstellung von Nodulationsfaktoren, bei dem eine Zelle nach einem der Ansprüche 5 oder 6 in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und die Nodulationsfaktoren aus dem Medium isoliert werden.
8. Expressionsprodukte oder Teilexpressionsprodukt einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
9. Synthetisches Peptid oder Protein mit der Aminosäuresequenz eines Expressionsproduk­ tes oder Teilexpressionsproduktes nach Anspruch 8.
10. Polyklonaler Antikörper, der spezifisch gegen ein Expressionsprodukt oder Teilexpressi­ onsprodukt nach Anspruch 8 oder gegen ein synthetisches Peptid oder Protein nach Anspruch 9 gerichtet ist.
11. Monoklonaler Antikörper, der spezifisch gegen ein Expressionsprodukt oder Teilexpressi­ onsprodukt nach Anspruch 8 oder gegen ein synthetisches Peptid oder Protein nach Anspruch 9 gerichtet ist.
12. Hybridomzelle, die einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 11 bildet.
13. Poly- oder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 10 oder 11, der nachweisbar mar­ kiert ist.
14. Poly- oder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 13, wobei die Markierung eine oder mehrere radioaktive, farbige oder fluoreszierende Gruppen, Gruppen zur Immobilisierung an einer festen Phase und/oder Gruppen für eine indirekte oder direkte Reaktion, insbesondere mit Hilfe von enzymkonjugierten Sekundärantikörpern, des auf Biotin/Avidin(Streptavidin) oder des auf kolloidalem Gold beruhenden Systems umfaßt.
15. Trangene Pflanze, die transformierte oder transfizierte Zellen nach Anspruch 5 enthält.
16. Transgene Pflanze nach Anspruch 15, die zu den Leguminosen gehört.
17. Verwendung von DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder Teilsequenzen davon als Sonden zum Nachweis oder zur Isolierung von "Full-length"-cDNA-Sequenzen und/oder als Primer zur Amplifikation derartiger "Full-length"-cDNA-Sequenzen durch die Po­ lymerasekettenreaktion.
18. Verwendung von transformierten Zellen nach Patentanspruch 5 oder von nach dem Ver­ fahren nach Patentanspruch 7 hergestellten Nodulationsfaktoren oder von Expressions- oder Teilexpressionsprodukten nach Patentanspruch 8 oder von synthetischen Peptiden oder Proteinen nach Patentanspruch 9 zur Förderung der Wurzelbildung und des Wachstums von Pflanzen.
19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Pflanze zu den Leguminosen gehört.
20. Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Pflanze auf mit pflanzenschädlichen Xenobiotika kontaminierten Böden wächst.
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