JP2002505107A

JP2002505107A - 植物における脂肪酸代謝の改変

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Publication number: JP2002505107A
Application number: JP2000534653A
Authority: JP
Inventors: オリバーピー．ピープルズ，; ローラボーイントン，; ジャルトダブリュー．フイスマン，; モーリスモロニー，; ニーパターソン，; クリスティスネル，
Original assignee: メタボリックス，インコーポレイテッド
Priority date: 1998-03-06
Filing date: 1999-03-05
Publication date: 2002-02-19
Also published as: CA2322729A1; AU3071499A; CA2322729C; AU750057B2; EP1060250A1; JP2009291204A; WO1999045122A1; MXPA00008674A

Abstract

(57)【要約】新規のポリマーを作製するのために植物における脂肪酸の生合成および酸化を改変するための方法および系を提供する。２つの酵素が必須である：Ｄ特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼのようなヒドラターゼ（例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅから得られるヒドラターゼ）およびβ−酸化酵素系。いくつかの植物は、その植物がこのヒドラターゼを発現するように操作される場合、ポリマー合成を改変するのに十分なβ−酸化酵素系を有する。実施例は、トランスジェニック植物におけるこれらの酵素の発現によるポリマーの生成を実証する。実施例はまた、脂肪酸生合成における改変を使用して植物の表現型を変化させ得、これにより、種子生産を減少させるか無くす、そして緑色植物の生物体量を増加する、ならびにポリヒドロキシアルカノエートを生成することを実証する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）本発明は、一般的に、ポリヒドロキシアルカノエート物質の産生のためのトラ
ンスジェニック植物系、トリグリセリドおよび脂肪酸の改変、ならびに植物での
種子生産を変更するための方法の分野に関する。

【０００２】作物栽培学的な作物についての安定なトランスジェニック植物を産生するため
の方法が、ここ最近１５年にわたって開発されてきた。作物は、投入量および産
出量の両方の形質を改良するために遺伝的に改変された。前者の形質において、
特定の農薬に対する耐性が作物中で操作され、そして特定の天然の殺虫剤（例え
ば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｅｎｅｓｉｓの毒素）が、植物中で直接
発現された。ハイブリッド植物を産生するための、雄性不稔系の開発における有
意な進歩もまた存在する。産出量の形質に関して、作物は、生産物、一般的には
、植物の種子、穀粒または繊維の価値を増すために改変される。重要な代謝標的
としては、デンプン、脂肪酸および油の生合成経路の改変が挙げられる。

【０００３】植物作物における微生物のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）バイオポ
リマーの産生においてかなりの商業的な興味が存在する。例えば、Ｐｅｏｐｌｅ
ｓおよびＳｉｎｓｋｅｙに対する米国特許第５，２４５，０２３号および同第５
，２５０，４３０号；Ｂｒｉｇｈｔらに対する米国特許第５，５０２，２７３号
；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙに対する米国特許第５，５３４，４３２
号；Ｊｏｈｎに対する米国特許第５，６０２，３２１号；Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ
らに対する米国特許第５，６１０，０４１号；ＰＣＴＷＯ９１／００９１７；
ＰＣＴＷＯ９２／１９７４７；ＰＣＴＷＯ９３／０２１８７；ＰＣＴＷＯ
９３／０２１９４；ＰＣＴＷＯ９４／１２０１４；Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２５６：５２０−２３（１９９２）；ｖａｎｄｅｒＬｅｉｊおよ
びＷｉｔｈｏｌｔ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１（補遺）：２２２−
３８（１９９５）；ＮａｗｒａｔｈおよびＰｏｉｒｉｅｒ、ＴｈｅＩｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＢａｃｔｅｒｉａｌＰｏｌｙ
ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ（Ｅｇｇｉｎｋら編）ＤａｖｏｓＳｗｉｔ
ｚｅｒｌａｎｄ（１９９６年８月１８〜２３日）；ならびにＷｉｌｌｉａｍｓお
よびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ２６：３８−４４（１９９６）を参照
のこと。ＰＨＡは、天然の、熱可塑性ポリエステルであり、そして非常に多くの
適用（消費者包装、使い捨てダイアパーの裏地およびごみ袋、食物、ならびに医
療製品を含む）に使用するための伝統的なポリマー技術により加工され得る。

【０００４】実験的な植物系であるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａの葉緑体で
のポリヒドロキシ酪酸の産生における初期研究により、ＰＨＢとして、葉の乾燥
重量で１４％までの蓄積を生じた（Ｎａｗｒａｔｈら、１９９３）。しかし、Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓは、作物栽培学的価値を有さない。さらに、作物栽培学的
作物において経済的にＰＨＡを産生するために、種子におけるＰＨＡの産生が所
望され、その結果、種子の収穫および加工のための現在の基幹施設が利用され得
る。植物の種子からのＰＨＡの回収（ＰＣＴＷＯ９７／１５６８１）および最
終用途の適用（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ２
６：３８−４４（１９９６））の選択肢は、ポリマーの組成によって有意に影響
を受ける。それゆえ、きちんと規定された組成を有するＰＨＡポリマーを産生す
るトランスジェニック植物系を開発することは有利である。

【０００５】それらの基質特異性に基づいたＰＨＡ生合成酵素の慎重な選択は、トランスジ
ェニック系において規定された組成のＰＨＡポリマーの産生を可能にする（米国
特許第５，２２９，２７９号；同第５，２４５，０２３号；同第５，２５０，４
３０号；同第５，４８０，７９４号；同第５，５１２，６６９号；同第５，５３
４，４３２号；同第５，６６１，０２６号；および同第５，６６３，０６３号）
。

【０００６】細菌において、各ＰＨＡ基は、特異的な経路により産生される。短いペンダン
ト基ＰＨＡの場合では、以下の３つの酵素が関与する：β−ケトチオラーゼ、ア
セトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、およびＰＨＡシンターゼ。例えば、ホモポ
リマーＰＨＢは、アセチル補酵素Ａの２つの分子の縮合により産生され、アセト
アセチル補酵素Ａを生じる。次いで、後者は、レダクターゼによりキラル中間体
Ｒ−３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａに還元され、続いて、ＰＨＡシンターゼ酵
素により重合される。ＰＨＡシンターゼは、４−ヒドロキシ酸ユニットおよび５
−ヒドロキシ酸ユニットを両方とも含むＣ３〜Ｃ５ヒドロキシ酸モノマーの重合
化を可能にする比較的広範な基質特異性を特に有する。この生合成経路は、多く
の細菌（例えば、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａ．ｌａｔｕ
ｓ、ＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｌａｎｄｉｉおよびＺｏｏｇｌｏｅａｒ
ａｍｉｇｅｒａ）において見出される。長いペンダント基ＰＨＡは、例えば、多
くの異なるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌により産生される。これらの生合成は、
ヒドロキシアシル補酵素Ａモノマー単位への経路として脂肪酸のβ−酸化および
脂肪酸合成を含む。次いで、後者は、より大きなＣ６〜Ｃ１４モノマー単位に有
利な基質特異性を有するＰＨＡシンターゼにより変換される（Ｐｅｏｐｌｅｓお
よびＳｉｎｓｋｅｙ、１９９０）。

【０００７】脂肪酸での細胞増殖から通常産生されるＰＨＢ−コ−ＨＸコポリマーの場合、
これらの経路の組み合わせは、異なるモノマー単位の形成を担い得る。実際に、
Ａｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅ（これは、コポリマーであるＰＨＢ−コ−３
−ヒドロキシヘキサノエートを産生する）におけるＰＨＡシンターゼ遺伝子をコ
ードするＤＮＡ遺伝子座の分析を使用して、Ｄ−β−ヒドロキシブチリル−Ｃｏ
ＡおよびＤ−β−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ単位の産生を担うＤ特異的エ
ノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子を同定した（Ｆｕｋｕｉおよび
Ｄｏｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０（１９９７）；Ｆｕ
ｋｕｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６６７−７３（１９９８））。こ
のようなヒドラターゼ遺伝子および酵素の他の供給源としては、Ａｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍが挙げ
られる。

【０００８】Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにおいて短いペンダント基ＰＨＡを産生する酵素であ
る、ＰＨＡシンターゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、およびβ−ケト
チオラーゼは、ｐｈｂＣ−ｐｈｂＡ−ｐｈｂＢ遺伝子を含むオペロンによってコ
ードされる（Ｐｅｏｐｌｅｓら、１９８７；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅ
ｙ、１９８９）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ生物において、長いペンダント基ＰＨ
Ａの産生を担うＰＨＡシンターゼは、ｐｈａ遺伝子座上に、特にｐｈａＡ遺伝子
およびｐｈａＣ遺伝子によりコードされることが見出されている（米国特許第５
，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１９１−９８（１９９１））。これらの初期研
究により、ある範囲のＰＨＡ生合成遺伝子が、単離および特徴づけされるか、ま
たはゲノム配列決定プロジェクトから同定された。公知のＰＨＡ生合成遺伝子の
例は、以下の参考文献に開示される：Ａｅｒｏｎｏｍａｓｃａｖｉａｅ（Ｆｕ
ｋｕｉおよびＤｏｉ、１９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−
３０）；Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（米国特許第５，２４５
，０２３号；同第５，２５０，４３０号；同第５，５１２，６６９号；および同
第５，６６１，０２６号；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−０３（１９８９））；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒ（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１８
：１４５−５２（１９９４）；Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍ（Ｌｉｅ
ｂｅｒｇｅｓｅｌｌおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２０９：１３５−５０（１９９２）））；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ（ＶａｌｅｎｔｉｎおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：３０９−１７（
１９９３））；Ｎｏｃａｒｄｉａｃｏｒａｌｌｉｎａ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託
番号ＡＦ０１９９６４；Ｈａｌｌら、１９９８、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．４４：６８７−６９）；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎ
ｓ（Ｕｅｄａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：７７４−７９（１９９６）
；Ｙａｂｕｔａｎｉら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３３：８
５−９０（１９９５））；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｃｉｄｏｐｈｉｌａ（Ｕ
ｍｅｄａら、１９９８、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７０−７２：３４１−５２）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓｓｐ．６１−３（Ｍａｔｓｕｓａｋｉら、１９９８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１８０：６４５９−６７）；Ｎｏｃａｒｄｉａｃｏｒａｌｌｉｎａ；
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＴｉｍｍおよびＳｔｅｉｎｂ
ｕｃｈｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１５−３０（１９９２））
；Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ（米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，
２５０，４３０号；Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（４）
：２１９１−９８（１９９１）；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｅｔｌｉ（Ｃｅｖａｌｌ
ｏｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１６４６−５４（１９９６））；Ｒ
ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４
１：２５５３−５９（１９９５））；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ（Ｐ
ｉｅｐｅｒ−ＦｕｒｓｔおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７５：７３−７９（１９９２））；Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉ
ｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ（Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｌｅｔｔ．９３：２８５−９０（１９９２））；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐ
ｈａｅｒｏｉｄｅｓ（Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅ
ｖ．９：２１７−３０（１９９２））；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５
：７０９−１４（１９９３）；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．（ＤＮＡ
Ｒｅｓ．３：１０９−３６（１９９６））；Ｔｈｉｏｃａｐｓｉａｅｖｉｏｌ
ａｃｅａ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４９
３−５０１（１９９３））およびＺｏｏｇｌｏｅａｒａｍｉｇｅｒａ（Ｐｅｏ
ｐｌｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９７−１０２（１９８７））；
ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ３：３４９−５７（１９８９））。これらの遺伝子または公開されたＤ
ＮＡ配列の利用可能性は、ＰＨＡ産生のためのある範囲の選択肢を提供するはず
である。

【０００９】１〜９９％ＨＨモノマーを含むＰＨＢ−コ−ＨＨコポリマーを産生するための
適切なＰＨＡシンターゼは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ、Ｒｈｏｄｏ
ｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ、Ｔｈｉｏｃａｐｓｉａｅｖｉｏｌａｃｅ
ａ、およびＡｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅのＰＨＡシンターゼ遺伝子により
コードされる。Ｒ−３−ヒドロキシブチレートに加えて、６〜１２の炭素原子の
３−ヒドロキシ酸の取り込みのために有用な（すなわち、化学的に合成されたコ
ポリマー（ＰＣＴＷＯ９５／２０６１４、ＰＣＴＷＯ９５／２０６１５およ
びＰＣＴＷＯ９５／２０６２１に記載される）に等価な生物学的ポリマーを産
生するための）ＰＨＡシンターゼは、多くのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびほか
の細菌において同定されている（ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ、
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：６９１−９７（
１９９２）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．３６：５０７−１４（１９９２）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：７１０−１６（１９９４
）；Ｌｅｅら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：
９０１−０９（１９９５）；Ｋａｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−７０（１９９６）；Ａｂｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１１５−１９（１９９４）；Ｖａｌｅｎｔ
ｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４６：２６１
−６７（１９９６））。そして、それらは、米国特許第５，２４５，０２３号お
よび同第５，２５０，４３０号に記載されるように容易に単離され得る。Ｐ．ｏ
ｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のＰＨＡシンターゼ（米国特許第５，２４５，０２３号
および同第５，２５０，４３０号；Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６６（４）：２１９１−９８（１９９１））は、長いペンダント基ＰＨＡの
産生に適切である。β−ケトチオラーゼをコードする植物遺伝子もまた、同定さ
れている（ＶｏｌｌａｃｋおよびＢａｃｈ、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１
１：１０９７−１０７（１９９６））。

【００１０】合成および基質の選択によりモノマー組成を改変する能力にもかかわらず、脂
肪酸代謝に関する生合成のようなポリマー生合成の他の特徴を改変することが望
ましい。

【００１１】従って、本発明の目的は、植物の細胞代謝を操作するための脂肪酸酸化酵素系
を導入するための方法およびＤＮＡ構築物を提供することである。

【００１２】本発明の別の目的は、植物において、好ましくは、その脂肪種子においてＰＨ
Ａの産生を増強するための方法を提供することである。

【００１３】（発明の要旨）新規なポリマーを作製するための、植物において脂肪酸生合成および酸化を改
変するための方法および系が、記載される。２つの酵素が、必須である：Ｄ特異
的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼのようなヒドラターゼ（例えば、Ａｅｒｏｍｏ
ｎａｓｃａｖｉａｅから得られたヒドラターゼ）およびβ−酸化酵素系。いく
つかの植物は、植物が、ヒドラターゼを発現するように操作される場合、ポリマ
ー合成を改変するのに十分なβ−酸化酵素系を有する。

【００１４】実施例は、トランスジェニック植物において、これらの酵素の発現によりポリ
マーの産生を実証する。実施例はまた、脂肪酸生合成における改変を使用して植
物の表現型を変化させ得、これにより種子産生を減少または排除する、および緑
色植物生物体量を増加させる、ならびにＰＨＡを産生することを実証する。

【００１５】（発明の詳細な説明）発生中の脂肪種子または緑色組織の細胞質またはプラスチドに脂肪酸酸化酵素
系を導入することによって植物の細胞性代謝を操作するための方法およびＤＮＡ
構築物が提供される。脂肪酸酸化系は、代表的には、広範囲のβ−ケトアシル−
ＣｏＡ基質を利用するβ−ケトチオラーゼ酵素活性を含むいくつかの酵素活性を
含む。

【００１６】驚くべきことに、豆のファゼオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）プロモーターから
の少なくとも１つのこれらの導入遺伝子の発現が、雄性不稔をもたらすことが見
出された。興味深いことに、これらの植物は、種子をつけず、その代わりに正常
よりも高いレベルの生物体量（例えば、葉、茎、柄）を生成した。それゆえ、本
明細書中に記載される方法および構築物をまた用いて、例えば、ハイブリッド生
成のために雄性不稔植物を作製し得るか、またはまぐさ（例えば、アルファルフ
ァまたはタバコ）の生物体量の生成を増加させ得る。これらの方法およびＤＮＡ
構築物を用いて作製された植物は、ポリヒドロキシアルカノエートバイオポリマ
ーを生成するため、または新規な油組成物を生成するために有用である。

【００１７】本明細書中に記載される方法は、さらなる導入遺伝子、特に、脂肪酸酸化また
はポリイヒドロキシアルカノエート生合成に関与するさらなる酵素をコードする
導入遺伝子のその後の取り込みを含む。ポリヒドロキシアルカノエート生合成に
ついては、この方法は、本明細書中に記載の方法およびＤＮＡ構築物を用いて、
または伝統的な植物育種法によって生成されたトランスジェニック植物の続く形
質転換による、酵素（例えば、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨアセトアセチ
ル−補酵素Ａレダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、アセトアセ
チル−ＣｏＡチオラーゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡエピメラーゼ、δ３−シス
−δ２−トランスエノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナ
ーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ）を
コードする導入遺伝子の取り込みを含む。

【００１８】（Ｉ．植物発現系）好ましい実施態様では、脂肪酸酸化導入遺伝子は、種子特異的プロモーターか
ら発現され、そしてタンパク質は、発生中の脂肪種子の細胞質において発現され
る。別の好ましい実施態様では、脂肪酸酸化導入遺伝子は、種子特異的プロモー
ターから発現され、そして発現されたタンパク質は、プラスチド標的化シグナル
を用いてプラスチドに指向される。別の好ましい実施態様では、脂肪酸酸化導入
遺伝子は、プラスチド染色体から直接発現され、ここで、これらは相同組換えに
よって取り込まれる。脂肪酸酸化導入遺伝子はまた、構成性プロモーターから、
植物組織全体を通して発現され得る。圃場において作物への農薬または他の活性
成分の適用後に活性化され得るプロモーターを用いることにより、これらの導入
遺伝子の発現を制御し得ることもまた有用である。本明細書中に記載される方法
により含まれるこれらの遺伝子の発現のさらなる制御としては、植物染色体の特
異的染色体部位への導入遺伝子の標的化挿入についての組換え酵素技術の使用、
またはこの導入遺伝子の発現の調節が挙げられる。

【００１９】本明細書中に記載される方法としては、以下を含むゲノムを有する植物種子が
挙げられる：（ａ）第１のＤＮＡ配列および３’非翻訳領域に作動可能に連結さ
れたプロモーター（この第１のＤＮＡ配列は、脂肪酸酸化ポリペプチドをコード
する）、そして必要に応じて（ｂ）第２のＤＮＡ配列および３’非翻訳領域に作
動可能に連結されたプロモーター（この第２のＤＮＡ配列は、脂肪酸酸化ポリペ
プチドをコードする）。２つの導入遺伝子の発現は、細胞質、またはペルオキシ
ソームもしくはグリオキシソーム以外のプラスチドにおいて少なくともβ−ケト
チオラーゼ活性、デヒドロゲナーゼ活性、およびヒドラターゼ活性を有する機能
的脂肪酸β酸化系を植物に提供する。第１のＤＮＡ配列および／または第２のＤ
ＮＡ配列は、細菌、酵母、真菌、藻類、植物、または動物から単離され得る。少
なくとも１つのＤＮＡ配列が、少なくとも２つ、そして好ましくは３つの酵素活
性を有するポリペプチドをコードすることが好ましい。

【００２０】（形質転換ベクター）本明細書中に記載される方法において有用なＤＮＡ構築物としては、植物へ導
入遺伝子を導入し得る形質転換ベクターが挙げられる。いくつかの植物形質転換
ベクターの選択肢が利用可能であり、「ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｔｏＰ
ｌａｎｔｓ」（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅ
ｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＮｅｗＹｏｒｋ（１９９５）；「Ｔｒａｎ
ｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓ：ＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏ
ｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｏｔ
ｅｉｎｓ」（Ｏｗｅｎら編）ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．Ｅ
ｎｇｌａｎｄ（１９９６）；および「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅ
Ｍａｎｕａｌ」（Ｍａｌｉｇａら編）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９５）に記載されるベクターが含
まれる。植物形質転換ベクターは、一般に、５’調節配列および３’調節配列（
プロモーター、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルを含む
）の転写制御下の目的の１以上のコード配列、ならびに選択マーカー遺伝子もし
くはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む。５’調節配列についての通常
の必要条件は、プロモーター、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化
シグナルを含む。単一の転写物からの２以上のポリペプチドの発現のために、さ
らなるＲＮＡプロセシングシグナルおよびリボザイム配列が構築物中に操作され
得る（米国特許第５，５１９，１６４号）。このアプローチは、複数の導入遺伝
子を単一の遺伝子座に局在化するという利点を有する。これは、続いての植物育
種の試みにおいて有利である。さらなるアプローチは、相同組換えによって植物
プラスチド染色体を特異的に形質転換するためのベクターを使用すること（米国
特許第５，５４５，８１８号）であり、この場合、プラスチドゲノムの原核生物
の性質を利用し、そして多数の導入遺伝子をオペロンとして挿入することが可能
である。

【００２１】（プロモーター）多数の植物プロモーターが公知であり、そして目的の遺伝子の構成的発現、ま
たは環境によってもしくは発生によって調節される発現のいずれかをもたらす。
植物プロモーターを選択して、異なる植物組織または細胞小器官における導入遺
伝子の発現を制御し得る。これらのための方法は全て、当業者に公知である（Ｇ
ａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２９３−９９（１
９８９））。導入遺伝子の５’末端は、導入遺伝子とインフレームで連結された
、プラスチドまたは他の細胞内小器官標的化ペプチドをコードする配列を含むよ
うに操作され得る。適切な構成性植物プロモーターとしては、カリフラワーモザ
イクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ）および増強されたＣａＭＶプロモ
ーター（Ｏｄｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０（１９８５））、アクチ
ンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙら，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：１６３−７１
（１９９０））、ＡｄｈＩプロモーター（Ｆｒｏｍｍら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ８：８３３−３９（１９９０）；Ｋｙｏｚｕｋａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ
．Ｇｅｎｅｔ．２２８：４０−４８（１９９１））、ユビキチンプロモーター、
ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター、マンノピン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ
）シンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、およびオクトピ
ンシンターゼプロモーターが挙げられる。有用な調節可能なプロモーター系とし
ては、ホウレンソウ硝酸誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、リブロ
ースビスリン酸カルボキシラーゼ（ｒｉｂｕｌｏｓｅｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）プロモーターの小サブユニット、および化学誘導性
プロモーター（Ｈｅｒｓｈｅｙらに対する米国特許第５，３６４，７８０号）が
挙げられる。

【００２２】本明細書中に記載される方法の好ましい実施態様では、導入遺伝子は、発生中
の種子においてのみ発現される。この目的のために適切なプロモーターとしては
、ナピン遺伝子プロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号および同第５，
６０８，１５２号）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼプロモーター（米国特
許第５，４２０，０３４号および同第５，６０８，１５２号）、２Ｓアルブミン
プロモーター、種子貯蔵タンパク質プロモーター、ファゼオリンプロモーター（
Ｓｌｉｇｈｔｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：
１８９７−１９０１（１９８３））、オレオシン（ｏｌｅｏｓｉｎ）プロモータ
ー（Ｐｌａｎｔら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：１９３−２０５（１
９９４）；Ｒｏｗｌｅｙら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３
４５：１−４（１９９７）；米国特許第５，６５０，５５４号；およびＰＣＴ
ＷＯ９３／２０２１６）、ゼインプロモーター、グルテリンプロモーター、デ
ンプンシンターゼプロモーター、およびデンプン分枝酵素プロモーターが挙げら
れる。

【００２３】これらのベクターを用いる適切な作物栽培植物宿主の形質転換は、種々の方法
および植物組織を用いて達成され得る。本明細書中に開示される方法において有
用な代表的な植物としては、ｎａｐｕｓ、ｒａｐｐａ、ｓｐ．ｃａｒｉｎａｔａ
およびｊｕｎｃｅａを含むＢｒａｓｓｉｃａ科；トウモロコシ；ダイズ；ワタの
実；ヒマワリ；ヤシ；ココヤシ；ベニバナ；ラッカセイ；Ｓｉｎａｐｉｓａｌ
ｂａを含むカラシ；およびアマが挙げられる。生物体量（例えば、サイレージト
ウモロコシ、アルファルファ、またはタバコ）として収穫される作物もまた、本
明細書中に開示される方法について有用である。これらのベクターを用いる形質
転換のための代表的な組織としては、プロトプラスト、細胞、カルス組織、リー
フディスク、花粉、および分裂組織が挙げられる。代表的な形質転換手順として
は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、バイオリスチック（ｂｉｏｌｉ
ｓｔｉｃ）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレ
ングリコール媒介プロトプラスト形質転換、リポソーム媒介形質転換、およびケ
イ素繊維媒介形質転換（米国特許第５，４６４，７６５号；「ＧｅｎｅＴｒａ
ｎｓｆｅｒｔｏＰｌａｎｔｓ」（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＮｅｗＹｏｒｋ（１
９９５）；「ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓ：ＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＳｙｓｔｅｍｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｏｗｅｎら編）ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆
ＳｏｎｓＬｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９６）；および「Ｍｅｔｈｏｄｓｉ
ｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ」（Ｍａｌｉｇａら編）ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９５））が
挙げられる。

【００２４】（ＩＩ．トランスジェニック植物を作製し、そしてスクリーニングするための
方法）本明細書中に記載される構築物を用いてトランスジェニック植物を作製するた
めに、以下の手順を用いて、形質転換後に導入遺伝子を発現する、形質転換され
た植物を入手し得る：選択培地上で形質転換された植物細胞を選択する；形質転
換された植物細胞を再生して、分化した植物を生成する；所望のポリペプチドが
所望の組織および細胞の位置において得られるようなレベルで導入遺伝子を発現
する、形質転換された植物を選択する。

【００２５】記載された方法を実施するために有用な特定の作物について、形質転換手順が
、例えば、以下に記載されるように、確立されている：「ＧｅｎｅＴｒａｎｓ
ｆｅｒｔｏＰｌａｎｔｓ」（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ
ｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＮｅｗＹｏｒｋ（１９９
５）；「ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓ：ＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳ
ｙｓｔｅｍｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｏｗｅｎら編）ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ，Ｌｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９６）；および「Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
ＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ」（Ｍａｌｉｇａら編）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９５）。

【００２６】Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓは、例えば、米国特許第５，１８８，９５８号
および同第５，４６３，１７４号に記載される通りに形質転換され得る。他のＢ
ｒａｓｓｉｃａ（例えば、ｒａｐｐａ、ｃａｒｉｎａｔａ、およびｊｕｎｃｅａ
）ならびにＳｉｎａｐｉｓａｌｂａは、Ｍｏｌｏｎｅｙら，ＰｌａｎｔＣｅ
ｌｌＲｅｐｏｒｔｓ８：２３８−４２（１９８９）に記載される通りに形質
転換され得る。ダイズは、多数の報告された手順（米国特許第５，０１５，５８
０号；同第５，０１５，９４４号；同第５，０２４，９４４号；同第５，３２２
，７８３号；同第５，４１６，０１１号；および同第５，１６９，７７０号）に
よって形質転換され得る。いくつかの形質転換手順（花粉の形質転換（米国特許
第５，６２９，１８３号）、ケイ素繊維媒介形質転換（米国特許第５，４６４，
７６５号）、プロトプラストのエレクトロポレーション（米国特許第５，２３１
，０１９号；同第５，４７２，８６９号；および同第５，３８４，２５３号）、
遺伝子銃（米国特許第５，５３８，８７７号および同第５，５３８，８８０号）
、ならびにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（ＥＰ０６０４６６
２Ａ１；ＰＣＴＷＯ９４／００９７７）を含む）が、トランスジェニック
トウモロコシ植物の生成について報告されている。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
媒介手順は、特に好ましい。なぜなら、導入遺伝子構築物の単一の組み込み事象
が、この手順を用いて、より容易に得られ、そしてこのことは、その後の植物育
種を大いに容易にするからである。ワタは、粒子ボンバードメント（米国特許第
５，００４，８６３号および同第５，１５９，１３５号）によって形質転換され
得る。ヒマワリは、粒子ボンバードメントとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染と
の組合せを用いて形質転換され得る（ＥＰ０４８６２３３Ａ２；米国特
許第５，０３０，５７２号）。アマは、粒子ボンバードメントまたはＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換のいずれかによって形質転換され得る。組換え酵
素技術としては、ｃｒｅ−ｌｏｘ系、ＦＬＰ／ＦＲＴ系、およびＧｉｎ系が挙げ
られる。これらの技術を利用する方法は、例えば、Ｈｏｄｇｅｓらに対する米国
特許第５，５２７，６９５号；ＤａｌｅおよびＯｗ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０５５８−６２（１９９１）；Ｍｅｄｂｅｒｒ
ｙら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３：４８５−９０（１９９５）
に記載される。

【００２７】（選択マーカー遺伝子）本明細書中に記載される方法を実施する際に有用な選択マーカー遺伝子として
は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子ｎｐｔＩＩ（米国特許第５，
０３４，３２２号および同第５，５３０，１９６号）、ハイグロマイシン耐性遺
伝子（米国特許第５，６６８，２９８号）、ホスフィノトリシンに対する耐性を
コードするｂａｒ遺伝子（米国特許第５，２７６，２６８号）が挙げられる。Ｅ
Ｐ０５３０１２９Ａ１は、増殖培地に添加された不活性な化合物を活性
化する酵素をコードする導入遺伝子を発現することにより、形質転換された植物
が、非形質転換系統から成長して抜け出すのを可能にするポジティブ選択系を記
載する。本明細書中の方法において有用なスクリーニング可能マーカー遺伝子と
しては、β−グルクロニダーゼ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら，ＥＭＢＯＪ．
６：３９０１−０７（１９８７）；米国特許第５，２６８，４６３号）およびネ
イティブなグリーン蛍光タンパク質遺伝子または改変されたグリーン蛍光タンパ
ク質遺伝子（Ｃｕｂｉｔｔら，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ．２０：
４４８−５５（１９９５）；Ｐａｎｇら，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１２
：８９３−９００（１９９６））が挙げられる。これらのマーカーのうちのいく
つかは、形質（例えば、除草剤耐性）を目的の植物に導入し、それによって、投
入側にさらなる作物栽培的価値を提供するという付加的な利点を有する。

【００２８】本明細書中に記載される方法の好ましい実施態様では、１より多くの遺伝子産
物が植物中で発現される。この発現は、以下を含む、多数の異なる方法を介して
達成され得る：（１）単一の形質転換事象においてコードＤＮＡを導入する方法
であって、ここで全ての必要なＤＮＡが単一のベクター上に存在する、方法；（
２）同時形質転換事象においてコードＤＮＡを導入する方法であって、ここで全
ての必要なＤＮＡが別個のベクター上に存在するが、同時に植物細胞に導入され
る、方法；（３）独立した形質転換事象によって連続的に植物細胞にコードＤＮ
Ａを導入する方法（すなわち、さらなるＤＮＡ構築物を用いての１以上のコード
ＤＮＡを発現するトランスジェニック植物細胞の形質転換）；ならびに（４）別
個の形質転換事象による、必要とされるＤＮＡ構築物の各々の形質転換によって
、個々のタンパク質を発現するトランスジェニック植物を得、そして伝統的な植
物育種法を用いて全ての経路を単一の植物に組み込む方法。

【００２９】（ＩＩＩ．β酸化酵素経路）植物の細胞質ゾルにおけるＰＨＡの産生は、Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ
チオエステルをＰＨＡシンターゼについての基質として産生し得る酵素の細胞質
ゾル局在化を必要とする。真核生物および原核生物の両方が、脂肪アシルＣｏＡ
チオエステルをアセチルＣｏＡへと変換する一連の酵素からなる脂肪酸分解につ
いてのβ酸化経路を有する。これらの経路は、中間体３−ヒドロキシアシルＣｏ
Ａを介して進行するが、この中間体の立体配置は生物間で異なる。例えば、細菌
のβ酸化経路および高等真核生物のペルオキシソーム経路は、Ｓ−３−ヒドロキ
シアシルＣｏＡを介して脂肪酸をアセチルＣｏＡへと分解する（Ｓｃｈｕｌｔｚ
，「ＯｘｉｄａｔｉｏｎｏｆＦａｔｔｙＡｃｉｄｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙｏｆＬｉｐｉｄｓ，ＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＭｅｍｂ
ｒａｎｅｓ（Ｖａｎｃｅら編）１０１〜０６頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ１９９１））。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉでは、β酸化多機
能酵素複合体によってコードされるエピメラーゼ活性は、Ｓ−３−ヒドロキシア
シルＣｏＡをＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへと変換し得る。酵母は、中間体
Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを介して進行するペルオキシソームに局在した
脂肪酸分解経路を保有し（ＨｉｌｔｕｎｅｎらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
７：６６４６−５３（１９９２）；ＦｉｌｐｐｕｌａらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：２７４５３−５７（１９９５））、その結果、ＰＨＡを生成するた
めにエピメラーゼ活性は必要とされない。

【００３０】植物は、他の高等真核生物と同様に、ペルオキシソーム中に細胞下に局在した
脂肪酸分解のためのβ酸化経路を有する（Ｇｅｒｈａｒｄｔ，「Ｃａｔａｂｏｌ
ｉｓｍｏｆＦａｔｔｙＡｃｉｄｓ［α ａｎｄ β Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ
］」、ＬｉｐｉｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎＰｌａｎｔｓ（Ｍｏｏｒｅ，
Ｊｒ．編）５２７−６５頁（ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌ
ｏｒｉｄａ１９９３））。それゆえ、植物の細胞質ゾルにおけるＰＨＡの生成
は、正確な鎖長のＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡチオエステルへの脂肪酸の変
換のために、β酸化経路の細胞質ゾルでの発現、ならびにＲ−３−ヒドロキシア
シルＣｏＡをポリマーへと重合させるために適切なＰＨＡシンターゼの細胞質ゾ
ル発現を必要とする。

【００３１】脂肪酸は、植物のプラスチドにおいて飽和アシル−ＡＣＰチオエステルとして
合成される（Ｈａｒｔｗｏｏｄ，「ＰｌａｎｔＬｉｐｉｄＭｅｔａｂｏｌｉ
ｓｍ」、ＰｌａｎｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｄｅｙら編）２３７−７２頁
（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ１９９７））。プラス
チドから細胞質ゾルへの輸送の前に、大多数の脂肪酸は、Δ９デサチュラーゼを
介して脱飽和される。大部分の脂肪種子作物における新たに合成された脂肪酸の
プールは、主に、オレイン酸（シス９−オクタデセン酸）、ステアリン酸（オク
タデカン酸）、およびパルミチン酸（ヘキサデカン酸）からなる。しかし、いく
つかの植物（例えば、ココヤシおよびパーム核）は、より短い鎖の脂肪酸（Ｃ８
〜１４）を合成する。この脂肪酸は、ＡＣＰからチオエステラーゼを介して放出
され、続いてプラスチド膜に局在するアシルＣｏＡシンテターゼを介してアシル
ＣｏＡチオエステルへと変換される（Ａｎｄｒｅｗｓら，「Ｆａｔｔｙａｃｉ
ｄａｎｄｌｉｐｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｄｅｇｒａｄａ
ｔｉｏｎ」ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａ
ｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｄｅｎｎｉｓら編）３４５−４６
頁（ＬｏｎｇｍａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｅｓｓ
ｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ１９９０）；Ｈａｒｗｏｏｄ，「ＰｌａｎｔＬｉｐｉ
ｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ」ＰｌａｎｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｄｅｙら
編）２４６頁（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ１９９７
））。

【００３２】脂肪酸分解経路を介する、新たに合成されたアシルＣｏＡチオエステルのプー
ルの細胞質ゾル変換、およびＰＨＡシンターゼについてのＲ−３−ヒドロキシア
シル−ＣｏＡ基質へのこれらの一連の反応由来の中間体の変換は、図１に概説し
た酵素反応を介して達成され得る。ＰＨＡシンターゼ基質はＣ４〜Ｃ１６Ｒ−
３−ヒドロキシアシルＣｏＡである。飽和脂肪アシルＣｏＡについては、脂肪酸
分解経路を用いてのＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡチオエステルへの変換は、
以下の一連の反応を必要とする：トランス−２−エノイル−ＣｏＡへのアシルＣ
ｏＡチオエステルの変換（反応１）、Ｒ−３−ヒドロキシ（ｈｙｄｄｒｏｘｙ）
アシルＣｏＡへのトランス−２−エノイル−ＣｏＡの水和（反応２ａ、例えば、
酵母系は、この経路を通して作動し、そしてＡｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅ
Ｄ特異的ヒドラターゼはＣ４〜Ｃ７Ｒ−３ヒドロキシアシル−ＣｏＡを生じ
る）、Ｓ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへのトランス−２−エノイル−ＣｏＡの
水和（反応２ｂ）、およびＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへのＳ−３−ヒドロ
キシアシルＣｏＡのエピマー化（反応５、例えば、キュウリ四機能タンパク質、
細菌系）。３−ヒドロキシアシルＣｏＡは、ＰＨＡを形成するＰＨＡシンターゼ
によって重合されない場合、これは、残りのβ酸化経路を通して以下の通りに進
行し得る：β−ケトアシルＣｏＡを形成する、３−ヒドロキシアシルＣｏＡの酸
化（反応３）、続いてアセチルＣｏＡおよび２炭素単位分短い飽和アシルＣｏＡ
チオエステルを生じるＣｏＡ存在下でのチオ開裂（反応４）。反応４において生
成されるアシルＣｏＡチオエステルは、反応１のβ酸化経路に自由に再度侵入し
、そして生成されたアセチルＣｏＡは、β−ケトチオラーゼ（反応７）およびＮ
ＡＤＨアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼまたはＮＡＤＰＨアセトアセチル−
ＣｏＡレダクターゼ（反応６）の作用によってＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ
へと変換され得る。この後者の経路は、Ｒ−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、
Ｒ−３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡ、およびＲ−３−ヒドロキシヘキサノイル
−ＣｏＡを生成するために有用である。この一連の酵素反応によって生成される
４〜１６炭素原子のＲ−３−ヒドロキシ酸は、導入遺伝子（または２つのサブユ
ニットシンターゼ酵素の場合は複数の導入遺伝子）から発現されるＰＨＡシンタ
ーゼによってＰＨＡポリマーへと重合され得る。

【００３３】 Δ９不飽和脂肪アシルＣｏＡについては、記載される種々の一連の反応が必要
とされる。図１に詳述されるように、３サイクルのβ酸化は、６個の炭素単位を
除去して、３位にシス二重結合を有する不飽和アシルＣｏＡチオエステルを生じ
る。Δ³−シス−Δ²−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼによって触媒され
る、２位でのトランス二重結合への３位でのシス二重結合の変換は、図１に概説
した一連のβ酸化反応が進行するのを可能にする。この酵素活性は、微生物のβ
酸化複合体および植物の四機能タンパク質に存在するが、酵母ｆｏｘ１には存在
しない。

【００３４】アシルＣｏＡチオエステルはまた、分解されてβ−ケトアシルＣｏＡになり、
そしてＮＡＤＨ依存性レダクターゼまたはＮＡＣＰＨ依存性レダクターゼを介し
てＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへと変換され得る（反応６）。

【００３５】Ｓ特異的ヒドラターゼ活性、Ｓ特異的デヒドロゲナーゼ活性、β−ケトチオラ
ーゼ活性、エピメラーゼ活性、およびΔ³−シス−Δ²−トランス−エノイルＣｏ
Ａイソメラーゼ活性をコードする多機能性酵素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉ（Ｓｐｒａｔｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：５３５−４２（１
９８４））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉ（Ｉｍｍｕｒｅら，Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：１８４−８９（１９９０））のような細菌において見
出されている。多機能性酵素複合体は、触媒的に活性なタンパク質がヘテロテト
ラマーを形成するような、２コピーの各々２つのサブユニットからなる。ヒドラ
ターゼ活性、デヒドロゲナーゼ活性、エピメラーゼ活性、およびΔ³−シス−Δ² −トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性は、一方のサブユニット上に存在
し、一方、チオラーゼは別のサブユニットに存在する。生物（例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ（Ｓｐｒａｔｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：５３５−４２（１９
８４））；ＤｉＲｕｓｓｏ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６４５９−６８
（１９９０））およびＰ．ｆｒａｇｉ（Ｓａｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１
１：８−１５（１９９２））由来の酵素をコードする遺伝子は、単離および配列
決定されており、そして本明細書中に記載される方法を実施するために適切であ
る。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ酵素系は、個々の酵素活性に重要なアミノ酸残基を同
定するために部位特異的変異誘発分析に供されている（ＨｅおよびＹａｎｇ，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：９６２５−３０（１９９６）；Ｙａｎｇら，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：６６４１−４７（１９９５）；ＨｅおよびＹａ
ｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３６：１１０４４−４９（１９９７）；Ｈｅ
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３６：２６１−６８（１９９７）；Ｙａｎｇお
よびＥｌｚｉｎｇａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：６５８８−９２（１９
９３））。これらの変異遺伝子はまた、本明細書中に記載される方法のいくつか
の実施態様において用いられ得る。

【００３６】ラットのような哺乳動物は、それらのペルオキシソーム中に、ヒドラターゼ、
デヒドロゲナーゼ、およびΔ³−シス−Δ²−トランス−エノイルＣｏＡイソメラ
ーゼ活性を含む、３機能性のβ−酸化酵素を有する。３機能性の酵素は、ラット
の肝臓から単離され、そして７８ｋＤａの分子量を有する単量体であることが見
出された（Ｐａｌｏｓａａｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２４４６
〜４９（１９９０））。細菌系と異なり、チオラーゼ活性は、多酵素タンパク質
の一部ではない（Ｓｃｈｕｌｔｚ、「ＯｘｉｄａｔｉｏｎｏｆＦａｔｔｙ
Ａｃｉｄｓ」ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＬｉｐｉｄｓ、Ｌｉｐｏｐｒｏ
ｔｅｉｎｓａｎｄＭｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｖａｎｃｅら、編）９５頁、Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９１））。ラットにおけるエピマー化は
、２つの異なるヒドラターゼの活性の組み合わせによって生じ、その１つは、Ｒ
−３ヒドロキシアシルＣｏＡをトランス−２−エノイルＣｏＡに転換し、そして
別の１つは、トランス−２−エノイルＣｏＡをＳ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ
に転換する（Ｓｍｅｌａｎｄら、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ１６０：９
８８〜９２（１９８９））。哺乳動物はまた、中間体Ｓ−３−ヒドロキシアシル
ＣｏＡを介して脂肪酸をアセチルＣｏＡに分解する、β−酸化経路をそれらのミ
トコンドリアに有する（Ｓｃｈｕｌｔｚ、「ＯｘｉｄａｔｉｏｎｏｆＦａｔ
ｔｙＡｃｉｄｓ」ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＬｉｐｉｄｓ，Ｌｉｐｏ
ｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＭｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｖａｎｃｅら、編）９６頁（
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９１）））。ミトコンドリアβ−
酸化活性をコードする遺伝子は、いくつかの動物から単離されており、これらに
は、ラットミトコンドリア長鎖アシルＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシ
ルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｄ１６４７８）およびラッ
トミトコンドリアチオラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｄ１３９２１およびＤ０
０５１１）が含まれる。

【００３７】酵母は、多機能酵素であるＦｏｘ２を有し、これは、Ｓ−３−ヒドロキシアシ
ルＣｏＡの代わりにＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ中間体を介して進行すると
いう点で、細菌および高等真核生物のβ−酸化複合体とは異なる（Ｈｉｌｔｕｎ
ｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６６４６〜５３（１９９２））。Ｆ
ｏｘ２は、Ｒ−特異的ヒドラターゼ酵素活性およびＲ−特異的デヒドロゲナーゼ
酵素活性を有する。この酵素は、Δ⁹−シス−ヒドロキシアシルＣｏＡを分解してＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを形成するのに必要な、Δ³−シス−Δ²−ト
ランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を有さない。ｆｏｘ２をコードする酵
母由来のこの遺伝子は単離され、そして配列決定されており、そして９００アミ
ノ酸タンパク質をコードする。この構造遺伝子のＤＮＡ配列およびコードされた
ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１および配列番号２に示される。

【００３８】植物は、酵母Ｆｏｘ２に類似するがまた、Δ³−シス−Δ²−トランス−エノイ
ルＣｏＡイソメラーゼ活性もコードする、４機能タンパク質を有する（Ｍｕｌｌ
ｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２０４７５〜８１（１９９４））。
このｃＤＮＡのＤＮＡ配列およびコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、
配列番号３および配列番号４に示される。

【００３９】（ＩＶ．脂肪種子作物の細胞質への酵素の標的化）植物の細胞質中のＰＨＡ産生を操作することは、植物の細胞質へのβ−酸化の
発現を指示する工程を必要とする。ｆａｏＡＢのような細菌系においては標的化
シグナルは存在しない。真菌、酵母、植物、および哺乳動物においては、β−酸
化は、細胞下オルガネラにおいて起こる。代表的には、その遺伝子は、核の染色
体において発現され、そして細胞質において合成されるポリペプチドは、特定の
アミノ酸配列の存在によってこれらのオルガネラに指向される。真核生物供給源
から単離された遺伝子（例えば、酵母、真菌、植物、および哺乳動物のような真
核生物供給源由来の脂肪酸酸化酵素）を使用して、本明細書に記載される方法を
実行するために、細胞下標的化シグナルの除去または改変が、この酵素を細胞質
ゾルに指向させるために必要である。タンパク質を小胞体に指向させるためのシ
グナルを付加することが有用であり得る。このプロセスにおいて有用なペプチド
は、当該分野で周知である。一般的なアプローチは、小胞体に標的化するペプチ
ド配列に特定化したＤＮＡ配列を挿入してキメラ遺伝子を形成することによって
、導入遺伝子を改変することである。

【００４０】真核生物アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび他のミトコンドリアタンパク質
は、通常２０〜６０アミノ酸長であるタンパク質のＮ−末端のリーダーペプチド
を介してミトコンドリアに標的化される（Ｈｏｒｗｉｃｈ，ＣｕｒｒｅｎｔＯ
ｐｉｎｉｏｎｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，２：６２５〜３３（１９９０
））。ミトコンドリア移入リーダーペプチドについての明白なコンセンサス配列
の欠如にもかかわらず、リーダー配列において鍵となる残基の変異誘発は、ミト
コンドリアタンパク質の移入を妨害することが実証された。例えば、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＦ１−ＡＴＰａｓｅの移入は、その
リーダー配列の変異誘発によって妨害され、これは、細胞質における改変された
前駆体タンパク質の蓄積を生じた（Ｂｅｄｗｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．９：１０１４〜２５（１９８９））。

【００４１】３つの真核生物ペルオキシソーム標的化シグナルが報告されている（Ｇｏｕｌ
ｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：１６５７〜６４（１９８９）；Ｂｒｉ
ｃｋｎｅｒら、Ｊ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．，１１３：１２１３〜２１（
１９９７））。トリペプチド標的化シグナルＳ／Ａ／Ｃ−Ｋ／Ｈ／Ｒ−Ｌは、多
くのペルオキシソームタンパク質のＣ−末端に生じる（Ｇｏｕｌｄら、Ｊ．Ｃｅ
ｌｌＢｉｏｌ．１０８：１６５７〜６４（１９８９））。この配列の変異誘発
は、ペルオキシソームへのタンパク質の移入を妨害することが示されてきた。い
くつかのペルオキシソームタンパク質は、そのタンパク質のＣ−末端にこのトリ
ペプチドを含まない。これらのタンパク質では、タンパク質配列中の内部の位置
のトリペプチドを介してか（Ｇｏｕｌｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：
１６５７〜６４（１９８９））、または未知の、無関係の配列を介して（Ｂｒｉ
ｃｋｎｅｒら、Ｊ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１３：１２１３〜２１（１
９９７））、標的化が生じることが示唆されている。Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐ
ｉｃａｌｉｓ由来のアシルＣｏＡオキシダーゼのフラグメントを用いる、インビ
トロでのペルオキシダーゼ標的化実験の結果は、後者の理論を支持するようであ
り、そしてポリペプチドの内部アミノ酸配列中に２つの別個の標的化シグナルが
存在することを示唆する（Ｓｍａｌｌら、ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ
７：１１６７〜７３（１９８８））。前述の研究において、標的化シグナルは、
長さにおいて１１８アミノ酸の２つの領域に局在し、そしていずれの領域も標的
化シグナルＳ／Ａ／Ｃ−Ｋ／Ｈ／Ｒ−Ｌを含むことが見出されなかった。少数の
ペルオキシソームのタンパク質は、ペルオキシソームに移入するためのアミノ末
端リーダー配列を含むようである（Ｂｒｉｃｋｎｅｒら、Ｊ．ＰｌａｎｔＰｈ
ｙｓｉｏｌ．１１３：１２１３〜２１（１９９７））。これらの標的化シグナル
は、部位特異的変異誘発によって欠失させ得るか、または変更され得る。

【００４２】（Ｖ．トランスジェニック植物の培養および収穫）トランスジェニック植物は、標準的な培養技術を使用して生育され得る。植物
または植物部分はまた、標準的な装置および方法を使用して回収され得る。ＰＨ
Ａは、植物または植物部分から、公知の技術（例えば、ＰＣＴＷＯ９７／１５
６８１に記載されるような、伝統的な播種プロセス技術と組み合わせた溶媒抽出
）を使用して回収され得るか、または、例えば、動物の食物として、直接的に使
用され得る。ここでは、植物生物体量からのＰＨＡを抽出することは不要である
。

【００４３】種子を産生しなかったいくつかの系統は、はるかにより高いレベルの生物体量
を産生した。従って、この表現型は、牧草、飼料、または他の生物体量作物につ
いて、１エーカーあたりに産生される緑の生物体量の量を増加させる手段として
有用であり得る。末端の使用は、動物の餌のための、または電気的な動力を生成
するためのエネルギー作物としての、飼料作物の最もコスト的に効果的な産生、
を含む。他の使用は、工業製品の引き続く回収（例えば、抽出によるＰＨＡ）の
ために、作物（例えば、アルファルファまたはタバコ）の生物体量レベルを増加
させる工程を含む。

【００４４】本明細書中に記載される組成物およびその調製方法およびその使用方法は、以
下の非限定的な実施例によってさらに記載される。

【００４５】（実施例１：ＰｓｅｕｄｏｍｏｎｏｎａｓｐｕｔｉｄａｆａｏＡＢ遺伝子
およびＦａｏ酵素の単離および特徴付け）ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換、およびプラスミド精製を含
む。すべてのＤＮＡ操作を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒ
ｋ（１９８９））に記載されるような標準的な方法を用いて行った。Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ由来のｆａｏＡＢをコードする遺伝子を、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉ由来のｆａｏＢ（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．１１１：８−１５（１９９２））に相同性を有するプライマー１および２を使
用するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によってＰ．ｐｕｔｉｄａゲノムＤＮＡ
から生成されたプローブを用いて単離した。プライマー１：５’−ｇａｔｇｇｇｃｃｇｃｔｃｃａａｇｇｇｔｇｇ−３’（配列
番号５）プライマー２：５’−ｃａａｃｃｃｇａａｇｇｔｇｃｃｇｃｃａｔｔ−３’（配列
番号６）。

【００４６】１．１ｋｂＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ反応から精製し、そしてλＺＡＰ
発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ｐＢＫＣＭＶプラスミドに構築さ
れたＰ．ｐｕｔｉｄａゲノムライブラリーをスクリーニングするためにプローブ
として使用した。プラスミドｐＭＦＸ１を、ポジティブクローンから選択し、そ
してｆａｏＡＢ遺伝子を含むインサートのＤＮＡ配列および隣接配列を決定した
。この配列を配列番号７に示す。以下のように、ｆａｏＡＢを含むフラグメント
を、ネイティブなＰ．ｐｕｔｉｄａリボソーム結合部位を用いてインタクトに、
発現ベクターｐＴＲＣＮにサブクローニングして、プラスミドｐＭＦＸ３を形成
した。プラスミドｐＭＦＸ１を、ＢｓｒＧ１を用いて消化した。得られる突出末
端をクレノウで平滑化した。ＨｉｎｄＩＩＩを用いる消化は、ＦａｏＡＢをコー
ドする、３．３９ｋｂの平滑末端／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを産生した。発
現ベクターｐＴＲＣＮを、ＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、そしてｆ
ａｏＡＢフラグメントを用いて連結し、７．５７ｋｂのプラスミドｐＭＦＸ３を
形成した。

【００４７】ＦａｏＡＢ多酵素複合体の酵素を、以下のようにアッセイした。ヒドラターゼ
活性を、アッセイがＣｏＡの存在下で行われた以外は、以前に記載されたように
（Ｆｉｌｐｐｕｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７４５３〜５７（
１９９５））、カップリング酵素Ｌ−β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナ
ーゼを使用して、ＮＡＤからＮＡＤＨへの転換をモニタリングすることによって
アッセイした。カップリング酵素の激しい生成物阻害が、ＣｏＡの非存在下で観
察された。このアッセイは、（最終容量１ｍＬに）６０μＭクロトニル（ｃｒ
ｏｔｏｎｙｌ）ＣｏＡ、５０μＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ９、５０μｇ／ｍｌの
ウシ血清アルブミン、５０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＮＡＤ、７μｇ／ｍｌブタ
心臓由来Ｌ−特異的β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、および０
．２５ｍＭＣｏＡを含んだ。このアッセイは、アッセイ混合液中へのＦａｏＡ
Ｂの添加で開始された。コントロールアッセイを、生成されるヒドラターゼ産物
、Ｓ−ヒドロキシブチリルＣｏＡの非存在下でＮＡＤの消費速度を決定するため
に、基質なしで行った。活性の１ユニットは、１分間あたりのＮＡＤの１μモル
の消費として定義される（ε₃₄₀＝６２２０Ｍ^-1ｃｍ^-1）。

【００４８】ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼを、基質としてアセトアセチルＣｏ
Ａを用いて、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨからＮＡＤへの転換をモニタリングす
ることにより（Ｂｉｎｓｔｏｃｋら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、７１：４０３（１９８１））、逆方向でアッセイした。このアッセイは、
（最終容量１ｍＬ中に）０．１ＭＫＨ₂ＰＯ₄、ＰＨ７、０．２ｍｇ／ｍＬウ
シ血清アルブミン、０．１ｍＭＮＡＤＨ、および３３μＭアセトアセチルＣ
ｏＡを含んだ。このアッセイを、アッセイ混合液へのＦａｏＡＢの添加で開始し
た。必要な場合、酵素サンプルを、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含む、０
．１ＭＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７中に希釈した。コントロールアッセイを、ヒドロキ
シアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ以外の酵素による粗サンプル中のＮＡＤＨの消
費速度を検出するために、基質アセトアセチルＣｏＡなしで実行した。活性の１
ユニットは、１分間あたりのＮＡＤＨの１μモルの消費として定義される（ε₃₄ ₀ ＝６２２０Ｍ^-1ｃｍ^-1）。

【００４９】ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼを、基質としてクロトニルＣｏＡを
用いて、３４０ｎｍにおけるＮＡＤからＮＡＤＨへの転換をモニタリングするこ
とにより（Ｂｉｎｓｔｏｃｋら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、７１：４０３（１９８１））、正方向でアッセイした。このアッセイ混合液は
、（最終容量１ｍＬ中に）０．１ＭＫＨ₂ＰＯ₄、ＰＨ８、０．３ｍｇ／ｍＬ
ウシ血清アルブミン、２ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．２５ｍＭＣｏ
Ａ、３０μＭクロトニルＣｏＡ、およびＦａｏＡＢのアリコートを含んだ。反
応を、Ｓ−ヒドロキシブチリルＣｏＡのインサイチュでの形成を可能にするため
に数分間プレインキュベーションした。次いで、このアッセイを、ＮＡＤ（０．
４５ｍＭ）の添加によって開始した。コントロールアッセイを、ヒドロキシアシ
ルＣｏＡデヒドロゲナーゼ以外の酵素によるＮＡＤの消費速度を検出するために
、基質なしで実行した。活性の１ユニットは、１分間あたりのＮＡＤの１μモル
の消費として定義される（ε₃₄₀＝６２２０Ｍ^-1ｃｍ^-1）。

【００５０】チオラーゼ活性を、いくつかの改変を伴って、以前に記載されたように（Ｐａ
ｌｍｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１〜７（１９９１））、基質ア
セトアセチルＣｏＡの消費による３０４ｎｍにおける吸収の減少をモニタリング
することによって決定した。アッセイは、（最終容量１ｍＬ中に）６２．４ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．１、４．８ｍＭＭｇＣｌ₂、６２．５μＭＣｏＡ、および６２．５μＭアセトアセチルＣｏＡを含んだ。このアッセイは、ア
ッセイ混合液へのＦａｏＡＢの添加によって開始した。酵素を有さないコントロ
ールサンプルを、酵素の非存在下でｐＨ８．１の基質分解速度を検出するために
、各々のアッセイについて実行した。活性の１ユニットは、１分間あたりの基質
アセトアセチルＣｏＡの１μモルの消費として定義される（ε₃₄₀＝１６９００Ｍ^-1ｃｍ^-1）。

【００５１】エピメラーゼ活性を、Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡチオエステルを、Ｄ，
Ｌ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ混合物の代わりに使用する以外は、以前に記載
されたように（Ｂｉｎｓｔｏｃｋら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、７１：４０３（１９８１））アッセイした。このアッセイは、（最終容量
１ｍＬ中に）３０μＭＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ、１５０ｍＭＫＨ₂ ＰＯ₄（ｐＨ８）、０．３ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、０．５ｍＭＮＡＤ、０．１ｍＭＣｏＡ、および７μｇ／ｍＬブタ心臓由来Ｌ−特異的β−ヒドロキシアシ
ルＣｏＡデヒドロゲナーゼを含んだ。このアッセイは、ＦａｏＡＢの添加によっ
て開始した。

【００５２】ＤＨ５α／ｐＭＦＸ３におけるＦａｏＡＢの発現のために、培養物を２×ＴＹ
培地中で３０℃で増殖させた。２×ＴＹ培地は、（１リットルあたり）１６ｇト
リプトン、１０ｇ酵母、および５ｇＮａＣｌを含む。スターター培養を、一晩増
殖させ、そして新鮮な培地（小規模増殖では２５０ｍＬエルレンマイヤーフラス
コ中に１００ｍＬ；大規模増殖には、２．８Ｌフラスコ中に１．５Ｌ）に接種（
１％接種材料）するために使用した。６００ｎｍにおける吸光度が０．４〜０．
６の範囲に達した場合、細胞を０．４ｍＭＩＰＴＧを用いて誘導した。収穫に
先立ち、細胞をさらに４時間培養した。細胞を超音波処理によって溶菌し、そし
て遠心分離によって不溶性物質を可溶性タンパク質から取り除いた。アシルＣｏ
Ａデヒドロゲナーゼ活性を、ＦａｏＡサブユニット（配列番号３１）の活性を保
証するために逆方向でモニタリングし、そしてチオラーゼ活性をＦａｏサブユニ
ットの活性を決定するためにアッセイした。ＤＨ５α／ｐＭＦＸ３におけるＦａ
ｏＡＢは、それぞれ、４．３Ｕ／ｍｇおよび０．９９Ｕ／ｍｇの値のデヒドロゲ
ナーゼ活性およびチオラーゼ活性を含んだ。これは、コントロール株ＤＨ５α／
ｐＴＲＣＮにおいてデヒドロゲナーゼおよびチオラーゼについて観察された、そ
れぞれ０．００７４Ｕ／ｍｇおよび０．００３３Ｕ／ｍｇよりも顕著に高かった
。

【００５３】ＦａｏＡＢを、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉ由来のＦａｏＡＢの精製
について以前に記載された改変された手順（Ｉｍａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１０７：１８４〜８９（１９９０））を用いて、ＤＨ５α／ｐＭＦＸ３か
ら精製した。チオラーゼ活性（正方向においてアッセイされた）およびデヒドロ
ゲナーゼ活性（逆方向においてアッセイされた）を、精製の全体を通じてモニタ
リングした。３リットルのＤＨ５α／ｐＭＦＸ３細胞（２．８Ｌのエーレンマイ
ヤーフラスコ中２×１．５Ｌアリコート）を、酵素活性分析のために調製された
細胞について以前に記載された細胞増殖手順を用いて、２×ＴＹ培地中で増殖さ
せた。細胞（１５．８ｇ）を、３２ｍＬの１０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７中に再
懸濁し、そして超音波処理によって溶菌した。可溶性タンパク質を、遠心分離（
１８，０００ＲＰＭ、３０分間、４℃）によって不溶性の細胞の破片から除去し
た。可溶性の抽出物を、５０％アセトン中で作製し、そして沈澱したタンパク質
を、遠心分離によって単離し、そして１０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７中に再溶解
した。このサンプルを、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を用いて３３％飽和に調整し、そして可溶性および不溶性のタンパク質を、遠心分離によって分離した。得られた上清
を、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄で５６％飽和に調整し、そして不溶性ペレットを遠心分離によって単離し、そして１０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７中に溶解した。このサン
プルを、５０℃で３０分間加熱し、そして可溶性タンパク質を遠心分離によって
単離し、そして６０００〜８０００分子量カットオフメンブレン中で、１０ｍＭ
ＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７において透析した（２×３Ｌ；２０時間）。このサンプル
を、あらかじめ１０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７で平衡化したＴｏｙｏＪｏｚｏ
ＤＥＡＥＦＰＬＣカラム（３ｃｍ×１４ｃｍ）上にロードした。このタンパ
ク質を、直線勾配（１００ｍＬずつ；１０ＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７中、０〜５００
ｍＭＮａＣｌ）を用いて、流速３ｍＬ／分で溶出した。ＦａｏＡＢは、３００
と３２５ｍＭＮａＣｌとの間に溶出した。このサンプルを、事前に１０ｍＭ
ＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７で平衡化したマクロ−プレップハイドロキシアパタイト１
８／３０（Ｂｉｏｒａｄ）ＦＰＬＣカラム（２ｃｍ×１５ｃｍ）にロードする前
に、５０，０００分子量カットオフメンブレン中で、１０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、ｐ
Ｈ７において透析した（１×２Ｌ；１５時間）。タンパク質を、３ｍＬ／分の流
速で、直線勾配（２５０ｍＬずつ；１０〜５００ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７）を
用いて溶出した。ＦａｏＡＢは、７０と１３０ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄との間に溶出し
た。活性を含む画分を、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ^TM１００，０００分子量カットオフ
濃縮器を用いて９ｍＬまで濃縮した。緩衝液を、２０％ショ糖を含む１０ｍＭ
ＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７を用いて３回交換し、そして−７０℃で凍結した。ハイドロ
キシアパタイト精製画分の酵素活性を、基質の範囲を用いてアッセイした。結果
を、以下の表１に示す。

【００５４】

【表１】（実施例２：ＦａｏＡＢおよびＦａｏＡＢポリペプチドに対する抗体の産生）実施例１に記載されるようなＦａｏＡＢタンパク質の精製後、サンプルをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによって分離した。ＦａｏＡ（配列番号３１）およびＦａｏＢ（配
列番号２６）に対応するタンパク質バンドを切り出し、そしてフロイント完全ア
ジュバントを用いてニュージーランド白ウサギを免疫した。追加免疫を、フロイ
ント不完全アジュバントを用いて３週間間隔で行った。抗体を、血清からプロテ
インＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のアフィニティークロマトグラフィーによ
って回収し、ウェスタンブロッティング手順によって抗原に対して試験した。Ｂ
ｒａｓｓｉｃａ種子のコントロール抽出物を使用して、植物タンパク質に対する
交差反応について試験した。交差反応は検出されなかった。

【００５５】（実施例３：トランスジェニック脂肪種子におけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄｏｆａｏＡＢ遺伝子の発現のためのプラスミドの構築）（ｐＳＢＳ２０２４の構築）マメのファゼオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）プロモーター（配列番号１０；Ｓ
ｌｉｇｈｔｏｍら、１９８３）の５’−および３’−末端（下線を付した）それ
ぞれに隣接する配列に相同な、オリゴヌクレオチドプライマーＧＶＲ４７１

【００５６】

【化１】およびＧＶＲ４７２

【００５７】

【化２】を、それぞれ、ＧＶＲ４７１およびＧＶＲ４７２の５’−末端にＫｐｎＩ（斜字
体、配列番号８のヌクレオチド１〜７）およびＳｗａＩ（斜字体、配列番号９の
ヌクレオチド１〜９）を付加するように設計した。これらの制限部位を、クロー
ニングを容易にするために組み込んだ。これらのプライマーを使用して、１．４
ｋｂファゼオリンプロモーターを増幅した。このプロモーターを、平滑末端連結
によってｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローニングした。命名されたプラスミド
、ｐＣＰＰＩ（図２を参照のこと）を、ＳａｌＩおよびＳｗａＩを用いて切断し
、そしてＳａｌＩ／ＳｗａＩファゼオリンターミネーター（配列番号２７）に連
結した。ポリアデニル化シグナルを含むマメのファゼオリンターミネーター配列
を、以下のＰＣＲプライマーを使用して増幅した：ＧＶＲ３９６：５’−ＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＴＡＡＧＴＡＴＧＡＡＣＴＡ
ＡＡＡＴＧＣ−３’（配列番号２２）およびＧＶＲ３９７５’−ＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＴＴＧＧＴＡＧＧＧＴＧＣＴＡ−３’（配列番号
２３）そして１．２ｋｂフラグメント（配列番号２７）をｐＣＣＰ１のＳａｌＩ−Ｓａ
ｌＩ部位にクローニングして、ｐＳＢＳ２０２４を得た（図２）。クローニング
のための独特のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む、得られるプラスミドを、ｐＳＢＳ２
０２４と命名した（図２）。

【００５８】（ｐＳＢＳ２０２４の構築）ダイズオレオシンプロモーターフラグメント（配列番号１１；Ｒｏｗｌｅｙら
、１９９７）を、ＤＮＡ配列に隣接するプライマーを用いて簡易化した。

【００５９】プライマーＪＡ４０８

【００６０】

【化３】は、５’末端（下線を付した）に相補的な配列を含む。プライマーｎｐ１

【００６１】

【化４】は、プロモーターフラグメントの３’末端（下線を付した）に相同な配列を含む
。制限部位ＸｂａＩ（斜字体）およびＳｗａＩ（斜字体）を、クローニングを容
易にするために、ＪＡ４０８およびｎｐＩの５’末端にそれぞれ組み込んだ。プ
ライマーを、９７５ｂｐプロモーターフラグメントを増幅するために使用し、次
いでｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローニングした（図２を参照のこと）。得ら
れるプラスミド、ｐＣＳＰＩを、ＳａｌＩおよびＳｗａＩを用いて切断し、そし
てダイズターミネーター（配列番号２８）に連結した。ダイズオレオシンターミ
ネーターを、以下のプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した：ＪＡ４１０：５’−ＡＡＧＣＴＴＡＣＧＴＧＡＴＧＡＧＴＡＴＴＡＡＴＧＴＧＴＴＧＴＴＡＴ
Ｇ−３’（配列番号２９）およびＪＡ４１１：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＡＡＡＴＣＡＣＡＴＴＧＣ
Ｃ−３’（配列番号３０）そして、２２５ｂｐフラグメントをｐＣＳＰＩのＳａｌＩ−ＳｗａＩ部位にクロ
ーニングして、プラスミドｐＳＢＳ２０２５（図６）を得た。命名されたプラス
ミド、ｐＳＢＳ２０２５は、クローニングのための独特のＨｉｎｄＩＩＩ部位を
有する（図２）。

【００６２】（プロモーターコード配列融合体の構築）以下の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：プラスミドｐｍｆｘ３のｍｆｌ（ｆａｏＡ、配列番号２４）の５’隣接配列のヌ
クレオチド５５３〜５５７に相同なｎｐ２

【００６３】

【化５】および３’末端に隣接するヌクレオチド２７００〜２６８３に相補的なｎｐ３

【００６４】

【化６】クローニングを容易にするために、ＨｉｎｄＩＩＩ（イタリック体）部位を、プ
ライマーｎｐ２およびｎｐ３の５’末端に導入した。さらに、植物の翻訳開始コ
ドンを包囲するより有利な配列を得るために、３ｂｐのＡＡＡ配列（太字）を組
み込んだ。プライマーｎｐ２およびｎｐ３を使用して、フラグメントを増幅し、
そしてｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローニングした。生じたプラスミドをｐＣ
ｍｆＩ（図３Ａおよび３Ｂ）と称した。プラスミドｐＢｍｆ２を、同様のプロセ
スで構築した（図５Ａおよび５Ｂ）。クローニングのために、ｍｆ２（ｆａｏＢ
）遺伝子（配列番号２５）の５’および３’末端で、ＨｉｎｄＩＩＩ（イタリッ
ク体）を生じるために、合成プライマーの第二のセットを設計した。

【００６５】プラスミドｐｍｆｘ３のｍｆ２（ｆａｏＢ、配列番号２５）の５’（ヌクレオ
チド２７３２〜２７５２ｂｐ）に相補的なプライマーｎｐ４

【００６６】

【化７】および３’（ヌクレオチド３９０７〜３８８６ｂｐ）配列に相同なプライマーｎ
ｐ５

【００６７】

【化８】をＰＣＲ反応に使用して、１．１７ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅した。生じ
たＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶにクローニングした。この
プラスミドを、ｐＢｍｆ２と称した。

【００６８】両方のプラスミドを個々にＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてそれらの挿入体を
、同じ制限酵素で予め直線化したプラスミドｐＳＢＳ２０２４およびｐＳＢＳ２
０２５にクローニングした。その結果、以下のプラスミドを生成した：ｐｍｆ１
２４およびｐｍｆ１２５（図３Ａおよび３Ｂ）ならびにｐｍｆ２２４およびｐｍ
ｆ２２５（図５Ａおよび５Ｂ）。これらは、ファゼオリンまたはダイズプロモー
ターのいずれかで融合されたＦａｏ遺伝子（ｍｆ１およびｍｆ２）を含む。ＤＮ
Ａ配列分析により、ｐｍｆ１２４、ｐｍｆ１２５、ｐｍｆ２２４、およびｐｍｆ
２２５について正しいプロモーター−コード配列−終結配列融合体が確認された
。

【００６９】（実施例４：プロモーター−コード配列融合体の植物形質転換ベクターへのア
センブリ）プラスミドｐｍｆ１２４、ｐｍｆ１２５、ｐｍｆ２２４、およびｐｍｆ２２５
を得た後に、プロモーター−コード配列融合体を、二成分ベクターｐＣＧＮ１５
５９（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、１９９０）（これは、ＮＰ
ＴＩＩ遺伝子（抗生物質カナマイシンに対する耐性を与える）の発現を駆動する
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含む）およびｐＳＢＳ２００４（これは、除草剤
フォスフィノスリシンに対する耐性を与えるＰＰＴ遺伝子を駆動するパセリユビ
キチンプロモーターを含む）に別々にクローニングした。種々の選択マーカーを
有するこの目的に適した二成分ベクターは、いくつかの供給源から入手され得る
。

【００７０】ファゼオリン−ｍｆ２１融合カセットを、ＸｂａＩで親プラスミドから放出し
、そして同じ制限酵素で直線化したｐＣＧＮ１５５９と連結した。得られたプラ
スミドをｐＣＧｍｆ１２４と命名した（図３Ａおよび３Ｂ）。ダイズ−ｍｆ１融
合体を含むプラスミドｐＣＧｍｆ１２５を、ｐｍｆ１２５およびｐＣＧＮ１５５
９の両方を連結前にＢａｍＨＩで切断したことを除き、同様の方法で構築した（
図３Ａおよび３Ｂ）。

【００７１】（ｐｍｆ１２４９およびｐｍｆ１２５４の構築）プラスミドｐＳＢＳ２００４を、ダイズ−ｍｆ１融合体を含むＢａｍＨＩフラ
グメントと共に直線化した。このプラスミドをｐｍｆ１２５４と命名した（図４
Ａおよび４Ｂ）。同様に、ＸｂａＩファゼオリン−ｍｆ１融合フラグメントを、
同じ制限酵素で直線化したｐＳＢＳ２００４と連結した。得られたプラスミドを
ｐｍｆ１２４９と命名した（図４Ａおよび４Ｂ）。

【００７２】（ｐＣＧｍｆ２２４およびｐＣＧｍｆ２２５の構築）ファゼオリン−ｍｆ２およびダイズ−ｍｆ２融合体を、ＢａｍＨＩまたはＸｂ
ａＩのいずれかで切断することによってベクターから融合体を切り出すことによ
り構築し、そしていずれかの制限酵素で直線化しておいたｐＣＧＮ１５５９にク
ローニングした（図５Ａおよび５Ｂ）。

【００７３】（ｐＣＧｍｆ１Ｐ２ＳおよびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓの構築）プロモーター−コード配列融合体を含む２つの発現カセットを、以下のように
同じ二成分ベクター上でアセンブルした。：ファゼオリン−ｍｆ１融合体を含む
プラスミドｐｍｆ１２４をＢａｍＨＩで切断し、そしてｐＣＧＮ１５５９のＢａ
ｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＣＧｍｆＢ１２４を作製した。次いで、この
プラスミドをＸｂａＩで直線化し、そしてダイズ−ｍｆ２融合体を含むｐｍｆ２
２５のＸｂａＩフラグメントに連結した。最終プラスミドを、ｐＣＧｍｆ１Ｐ２
Ｓと命名した（図６Ａおよび６Ｂ）。プラスミドｐＣＧｍＦ２Ｐ１Ｓを、同様の
様式でアセンブルした。ファゼオリン−ｍｆ２融合体をＢａｍＨＩで切断するこ
とによりｐｍｆ２２４から放出し、そしてｐＣＧＮ１５５９のＢａｍＨＩ部位で
クローニングした。得られたプラスミドｐＣＧｍｆＢ２２４をＸｂａＩで直線化
し、そしてダイズ−ｍｆ１融合体を含むｐｍｆ１２５のＸｂａＩフラグメントに
連結した（図６Ａおよび６Ｂ）。

【００７４】（実施例５：Ｂｒａｓｓｉｃａの形質転換）Ｂｒａｓｓｉｃａ種子を、１０％の市販の漂白剤（Ｊａｖｅｘ，Ｃｏｌｇａｔ
ｅ−Ｐａｌｍｏｌｉｖｅ）中で３０分間、穏やかに振盪して、表面滅菌した。そ
の種子を滅菌蒸留水中で３回洗浄した。種子を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏ
ｇ（ＭＳ）塩およびビタミン、３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．７％（ｗ／
ｖ）フィトアガー（ｐｈｙｔｏａｇａｒ）を含む発芽培地（ｐＨ５．８）中に、
プレートあたり２０個の密度で配置し、そして２４℃で、かつ６０〜８０μＥｍ ^-2 ｓ^-1の光強度での１６時間の明期／８時間の暗期の光周期で、４〜５日間維持
した。

【００７５】各々の構築物、ｐＣＧｍｆ１２４、ｐＣＧｍｆ１２５、ｐＣＧｍｆ２２４、ｐ
ＣＧｍｆ１Ｐ２Ｓ、およびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉａｎｓＥＨＡ１０１株（Ｈｏｏｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６））内にエレクトロポレーションに
より導入した。子葉の葉柄の形質転換前に、各々の構築物を有するＥＨＡ１０１
株の単一コロニーを、１００ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび１００ｍｇ／ｌのゲ
ンタマイシンを補充した５ｍｌの最小培地中、２８℃で４８時間増殖させた。１
ｍｌの細菌懸濁液を微量遠心管中で１分間の遠心分離によりペレット化した。そ
のペレットを１ｍｌの最小培地中に再懸濁した。

【００７６】形質転換のために、子葉を、その基部に約２ｍｍの葉柄を含むように、４日齢
（いくつかの場合においては、５日齢）の実生から切り取った。それらの葉柄の
切断表面を有する個々の子葉を、希釈した細菌懸濁液に１秒間浸けて、そしてた
だちに同時培養培地（３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．７％（ｗ／ｖ）フィ
トアガーを含み、そして２０μＭのベンジルアデニンを富化したＭＳ培地）中に
約２ｍｍの深さに包理した。接種した子葉を、プレートあたり１０個の密度で配
置し、そして同じ生長条件下で４８時間インキュベートした。同時培養後、次い
で子葉を、３％（ｗ／ｖ）スクロース、２０μＭベンジルアデニン、０．７％（
ｗ／ｖ）フィトアガー（ｐＨ５．８）、３００ｍｇ／ｌのチメンチニン（ｔｉｍ
ｅｎｔｉｎｉｎ）、および２０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンを補充したＭＳ培地
を含む再生培地に移した。

【００７７】２〜３週間後、得られた再生苗条を切断し、そしてＭａｇｅｎｔａジャー中の
「苗条伸長」培地（３％スクロース、３００ｍｇ／ｌのチメンチン（ｔｉｍｅｎ
ｔｉｎ）、０．７％（ｗ／ｖ）フィトアガー、３００ｍｇ／ｌのチメンチニン、
および２０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンを含むＭＳ培地（ｐＨ５．８））上で維
持した。伸長した苗条を、「発根」培地（ＭＳ培地、３％スクロース、２ｍｇ／
ｌのインドール酪酸、０．７％フィトアガー、および５００ｍｇ／ｌのカルベニ
シリンを含む）に移した。根が出現した後、小植物をポッティングミックス（Ｒ
ｅｄｉＥａｒｔｈ，Ｗ．Ｒ．ＧｒａｃｅａｎｄＣｏ．）に移した。植物を
、噴霧チャンバー（７５％の相対湿度）中で同じ生長条件下で維持した。生長２
〜３週間後、葉のサンプルを、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ
ＩＩ）アッセイ（Ｍｏｌｏｎｅｙら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ
８：２３８−４２（１９８９））のために採取した。

【００７８】ＦａｏＡおよびＦａｏＢトランスジェニック系統由来の種子を、抗ＦａｏＡ抗
体および抗ＦａｏＢ抗体を使用するウェスタンブロッティングによって、脂肪酸
酸化ポリペプチドの発現について分析し得る。ＦａｏＢポリペプチド（配列番号
２６）は、ＦａｏＡ遺伝子産物の非存在下で機能的でない；しかしＦａｏＡＢ遺
伝子産物は酵素活性を有する。

【００７９】ＦａｏＡおよびＦａｏＢ複合体を発現するトランスジェニック系統を、個々の
ポリペプチドを発現するＦａｏＡトランスジェニック系統およびＦａｏＢトラン
スジェニック系統を交雑して獲得し、そして種子を、記載されるようなウエスタ
ンブロッティングおよび酵素アッセイにより分析する。

【００８０】（実施例６：Ｂ．ｎａｐｕｓｃｖ．Ｗｅｓｔａｒの形質転換およびトランス
ジェニック系統の分析）（形質転換）使用するプロトコルは、Ｍｏｌｏｎｅｙら（１９８９）に記載される手順から
採用した。Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓｃｖ．Ｗｅｓｔａｒの種子を、１０
％の市販の漂白剤（Ｊａｖｅｘ，Ｃｏｌｇａｔｅ−ＰａｌｍｏｌｉｖｅＣａｎ
ａｄａＩｎｃ．）中で３０分間、穏やかに振盪して、表面滅菌した。その種子
を滅菌蒸留水中で３回洗浄した。種子を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（Ｍ
Ｓ）塩およびビタミン、３％スクロースおよび０．７％フィトアガーを含む発芽
培地（ｐＨ５．８）中に、プレートあたり２０個の密度で配置し、そして２４℃
で、かつ６０〜８０μＥｍ^-2ｓ^-1の光強度での１６時間の明期／８時間の暗期の
光周期で、４〜５日間維持した。

【００８１】各々の構築物、ｐＣＧｍｆ１２４、ｐＣＧｍｆ１２５、ｐＣＧｍｆ２２４、ｐ
ＣＧｍｆ２２５、ｐＣＧｍｆ１Ｐ２Ｓ、およびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓを、Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０１株（Ｈｏｏｄら、１
９８６）内にエレクトロポレーションにより導入した。子葉の葉柄の形質転換前
に、各々の構築物を有する株ＥＨＡ１０１の単一コロニーを、１００ｍｇ／ｌの
カナマイシンおよび１００ｍｇ／ｌのゲンタマイシンを補充した５ｍｌの最小培
地中、２８℃で４８時間増殖させた。１ｍｌの細菌懸濁液を微量遠心管中で１分
間の遠心分離によりペレット化した。そのペレットを１ｍｌの最小培地で再懸濁
した。

【００８２】形質転換のために、子葉を、その基部に約２ｍｍの葉柄を含むように、４日齢
（いくつかの場合においては、５日齢）の実生から切り取った。それらの葉柄の
切断表面を有する個々の子葉を、希釈した細菌懸濁液に１秒間浸けて、そしてた
だちに同時培養培地（３％スクロースおよび０．７％フィトアガーを含み、そし
て２０μｌＭのベンジルアデニンを富化したＭＳ培地）中に約２ｍｍの深さに包
理した。接種した子葉を、プレートあたり１０個の密度で配置し、そして同じ生
長条件下で４８時間インキュベートした。同時培養後、次いで子葉を、３％スク
ロース、２０μＭベンジルアデニン、０．７％フィトアガー（ｐＨ５．８）、３
００ｍｇ／ｌのチメンチニン、および２０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンで補充し
たＭＳ培地を含む再生培地に移した。

【００８３】２〜３週間後、再生苗条を獲得し、切断し、そしてＭａｇｅｎｔａジャー中の
「苗条伸長」培地（３％スクロース、３００ｍｇ／ｌのチメンチン、０．７％フ
ィトアガー、および２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＭＳ培地（ｐＨ５．８）
）上で維持した。次いで、伸長した苗条を、「発根」培地（３％スクロース、２
ｍｇ／ｌのインドール酪酸、０．７％フィトアガー、および５００ｍｇ／ｌのカ
ルベニシリンを含むＭＳ培地）に移した。根が出現した後、小植物をポッティン
グミックス（ＲｅｄｉＥａｒｔｈ，Ｗ．Ｒ．ＧｒａｃｅａｎｄＣｏ．Ｃａ
ｎａｄａＬｔｄ．）に移した。植物を、噴霧チャンバー（７５％のＲＨ）中で
同じ生長条件下で維持した。生長２〜３週間後、葉のサンプルを、ネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）アッセイ（Ｍｏｌｏｎｅｙら、１９８
９）のために採取した。結果を以下の表２に示す。データは形質転換されたこと
が確認された植物の数を示す。

【００８４】

【表２】形質転換ＤＮＡの発生運命を１６の無作為に選択したトランスジェニック系統
について調査した。サザンＤＮＡハイブリダイゼーション分析により、ＦａｏＡ
および／またはＦａｏＢが、試験したトランスジェニック系統のゲノムに組込ま
れたことが示された。

【００８５】ＦａｏＡ遺伝子が強力なマメファゼオリンプロモーターから発現される、約８
０％のｐｍｆ１２４のトランスジェニック植物は、雄性不稔であることが観察さ
れた。このプロモーターからのＦａｏＡ遺伝子の明らかな高レベルの発現は、Ｆ
ａｏＡ遺伝子産物の機能的発現を生じ、これは種子および／または花粉の発達を
障害する。この結果は、非常に予想外のことであった。なぜなら、その植物細胞
は、細胞質ゾル中のβ−酸化経路の第一段階を行うことが可能であることが予測
されなかったからである。しかし、この結果は、ハイブリッド産生のための雄性
不稔のために、または種子の産生を妨げるために、植物におけるβ−酸化遺伝子
の発現のためのさらなる適用を提供する。正常なトランスジェニック系統との並
行した比較において、ｐｍｆ１２４株は、おそらく種子発達の排除に起因して、
さらに高いレベルの生物体量を生成することもまた留意された。従って、この表
現型は、サイレージ、飼料、または他の生物体量作物についての１エーカーあた
りに産生される緑色の生物体量の量を増加するための手段として有用であり得る
。ここで、誘導性プロモーター系またはリコンビナーゼ技術の使用が定植のため
の種子を生成するために使用され得る。これら不稔植物の７つが、ｐｍｆ２２５
トランスジェニック系統由来の花粉で首尾良く他家受粉され、そして種子を生じ
た。

【００８６】ファゼオリンプロモーター−ＦａｏＢ構築物を含むｐｍｆ２２４株からの種子
由来のＲＮＡについてのノーザン分析により、コントロールを除く試験した全て
のサンプルにおいて、予期された１．２ｋｂの転写物を示すシグナルが示された
。弱いダイズオレオシン（ｏｌｅｏｌｓｉｎ）プロモーター−ＦａｏＡ構築物を
含むｐｍｆ１２５株からの種子由来のＲＮＡについてのノーザン分析により、２
．１ｋｂの予期された大きさの転写物が明らかにされた。ＦａｏＡ遺伝子が比較
的弱いダイズオレオシンプロモーターから発現される、ｐｍｆ１２５植物の約８
０％の種子由来の３００〜５００μｇのタンパク質についてのウエスタンブロッ
ティングは、結論付けには到らなかったが、弱いシグナルが１つのトランスジェ
ニック系統において検出された。

【００８７】（脂肪酸分析）種子において強力なマメファゼオリンプロモーターからＦａｏＡ遺伝子を発現
することの強力な代謝効果を示した予想外の結果が与えられたため、弱いダイズ
オレオシンプロモーターからＦａｏＡ遺伝子を発現するトランスジェニック系統
からの種子の脂肪酸プロフィールを分析した。マメファゼオリンプロモーターか
らＦａｏＡ遺伝子のみを発現する種子またはＦａｏＢ遺伝子も発現する種子を試
験した。分析は、Ｍｉｌｌａｒら、ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ１１：１８
８９−９０２（１９９８）に記載されるように行った。種子の脂肪酸メチルエス
テル（ＦＡＭＥＳ）を、Ｂ．ｎａｐｕｓの１０個の種子を１５×４５−ｍｍねじ
口ガラス管に配置し、そして０．７５ｍＬの１Ｎメタノール性（ｍｅｔｈａｎｏ
ｌｉｃ）ＨＣｌ試薬（Ｓｕｐｅｌｃｏ，ＰＡ）および１０μＬの１ｍｇ／ｍＬの
１７:０メチルエステル（内部標準）中、８０℃で一晩加熱することによって調製した。そのサンプルを冷却後、ＦＡＭＥＳを、０．３ｍＬのヘキサンおよび０
．５ｍＬの０．９％ＮａＣｌで激しくボルテックスすることにより抽出した。そ
のサンプルを、相を分離するために静置させ、そして３００μＬの有機相を抽出
し、そしてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄガスクロマトグラフィー上で分析し
た。

【００８８】脂肪酸プロフィール分析により、その脂質プロフィールにおけるさらなる成分
または増強された成分の存在が、ＦａｏＡ遺伝子（配列番号２４）を発現する全
てのトランスジェニック植物において示され、これらはコントロール植物には存
在しなかった。この結果はまた、ＦａｏＡ遺伝子が転写されて、そして翻訳され
たこと、およびＦａｏＡポリペプチド（配列番号２７）が、触媒活性を有するこ
とを結論的に証明する。このピークはまた、ＳｏｙＰ−ＦａｏＡ遺伝子、Ｐｈａ
Ｐ−ＦａｏＡ−ＳｏｙＰ−ＦａｏＢ遺伝子、ＳｏｙＰ−ＦａｏＡ−ＰｈａＰ−Ｆ
ａｏＢ遺伝子を有するさらなる１１のトランスジェニック植物およびＳｏｙＰ−
ＦａｏＢで他家受粉された不稔（ＰｈａＰ−ＦａｏＡ）植物において観察された
。これらのデータは、ＦａｏＡ遺伝子の機能的発現、およびたとえ非常に低レベ
ルの発現でもその種子の脂質プロフィールを変化するのに十分であることを明ら
かに実証する。本明細書中で記載される方法を適応することにより、当業者は、
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｏｌｅｏｓｉｎプロモーター、ナピン（ｎａｐｉｎ）
プロモーター、またはクルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）プロモーターの
ような他のプロモーターを使用して、ファゼオリンプロモーターとダイズオレオ
シンプロモーターとの間で得られるレベルの中間のレベルでこれらの遺伝子を発
現し得、そして誘導性プロモーター系またはリコンビナーゼ技術を使用して、脂
肪酸酸化の導入遺伝子が発現される時期を制御し得る。

【００８９】（実施例７：酵母のβ−酸化の多機能酵素複合体）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、細菌および高等真核生物において観察されるＳ
−３−ヒドロキシアシルＣｏＡよりもむしろＲ−ヒドロキシアシルＣｏＡを経て
進行するβ−酸化経路を含む。酵母由来のｆｏｘ２遺伝子は、ヒドラターゼ（こ
れはトランス−２−エノイル−ＣｏＡからＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを生
成する）およびデヒドロゲナーゼ（これは、Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを
利用してβ−ケトアシルＣｏＡを生成する）をコードする。

【００９０】ｆｏｘ２遺伝子（配列番号１に示される配列）を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ゲノムＤＮＡからＰＣＲにより２つの小片で単離した。プライマーＮ−ｆｏｘ２
ｂおよびＮ−ｂａｍｆｏｘ２ｂを利用して、Ｆｏｘ２のＮ末端領域をコードする
１．１ｋｂのＳｍａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをＰＣＲし、そしてプライマー
Ｃ−ｆｏｘ２およびＣ−ｂａｍｆｏｘ２を利用して、Ｃ末端Ｆｏｘ２領域をコー
ドする１．６ｋｂのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩフラグメントをＰＣＲした。全長ｆｏ
ｘ２遺伝子を、ベクターｐＴＲＣＮへのサブクローニングを経て再構築した。

【００９１】

【化９】しかし、ｆｏｘ１遺伝子は、β−ケトチオラーゼ活性を保持せず、そしてこの活
性は第二の導入遺伝子により供給されなければならない。このような遺伝子の代
表的な供給源としては、藻類、細菌、酵母、植物および哺乳動物が挙げられる。
細菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓは、本明細書中に記載される
方法における使用に適切な広い特異性のβ−ケトチオラーゼ遺伝子を有する。そ
れは、Ｐｅｏｐｌｅｓらに対する米国特許第５，６６１，０２６号に記載のよう
に、ハイブリダイゼーションプローブとしてアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ
遺伝子を使用して容易に単離され得る。この酵素はまた精製されており（Ｈａｙ
ｗｏｏｄら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔ．５２：９１（１９８８））、そ
してその精製酵素は、抗体の調製または遺伝子単離のための基礎としてのタンパ
ク質配列情報を決定するために有用である。

【００９２】（実施例８：植物のβ−酸化遺伝子） β−酸化の４官能性タンパク質をコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号
４に示される）は、Ｐｒｅｉｓｉｇ−Ｍｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６９：２０４７５−８１（１９９４）に記載されるように単離され得る。等
価な遺伝子は、類似の手順を使用するか、またはゲノムライブラリー（これらの
多くは、例えば、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．，Ｐ
ａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ．から市販されている）をス
クリーニングすることにより、他の植物種（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｒａｓ
ｓｉｃａ、ダイズ、ヒマワリ、およびトウモロコシを含む）から単離され得る。
ペルオキシソーム標的配列Ｐ−Ｒ−Ｍは、このタンパク質のカルボキシ末端で同
定された。植物の細胞質ゾル中での発現に適切な構築物は、この配列を欠失する
よう設計されたプライマーを使用する、この遺伝子のＰＣＲ増幅により調製され
得る。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーを産生するための、脂肪酸β
−酸化経路の模式図である。

【図２】図２は、プラスミド構築物ｐＳＢＳ２０２４およびｐＳＢＳ２０２５を示す模
式図である。

【図３Ａ】図３Ａは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ１２４およびｐＣＧｍｆ１２５を示す
模式図である。

【図３Ｂ】図３Ｂは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ１２４およびｐＣＧｍｆ１２５を示す
模式図である。

【図４Ａ】図４Ａは、プラスミド構築物ｐｍｆ１２４９およびｐｍｆ１２５４を示す模式
図である。

【図４Ｂ】図４Ｂは、プラスミド構築物ｐｍｆ１２４９およびｐｍｆ１２５４を示す模式
図である。

【図５Ａ】図５Ａは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ２２４およびｐＣＧｍｆ２２５を示す
模式図である。

【図５Ｂ】図５Ｂは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ２２４およびｐＣＧｍｆ２２５を示す
模式図である。

【図６Ａ】図６Ａは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ１Ｐ２ＳおよびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓを
示す模式図である。

【図６Ｂ】図６Ｂは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ１Ｐ２ＳおよびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓを
示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｎ 9/00 5/00 ＣＢ (72)発明者フイスマン，ジャルトダブリュー．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02113，ボストン，セイレムストリート 52，アパートメントナンバー１エフ (72)発明者モロニー，モーリスカナダ国ティー３エイ５エヌ５アルバータ，カルガリー，エヌ．ダブリュー．，エッジブルックカバー 34 (72)発明者パターソン，ニーカナダ国ティー２エル１エル７アルバータ，カルガリー，エヌ．ダブリュー．，ブラキストンドライブ 3017，アパートメント 301 (72)発明者スネル，クリスティアメリカ合衆国マサチューセッツ 02178，ベルモント，ゴーハムロード 15 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD13 CD21 4B024 AA08 BA07 CA04 DA01 DA05 EA04 FA15 GA14 HA01 4B050 CC03 DD02 LL10 4B065 AA11X AA44Y AA89X AB01 AC14 BA02 BA03 BB34 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】植物の代謝を操作するための方法であって、該植物の細胞質
ゾル、ペルオキシソームまたはグリオキシソーム以外のプラスチド、あるいはミ
トコンドリアにおいて脂肪酸β−酸化酵素活性をコードする導入遺伝子を発現す
る工程を含む、方法。
【請求項２】前記脂肪酸β−酸化酵素が、細菌、酵母、真菌、植物および
哺乳動物からなる群から選択される遺伝子から発現される、請求項１に記載の方
法。
【請求項３】前記脂肪酸β−酸化酵素が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓおよびＣｏｒｙｎｅｆｏｒｍから
なる群から選択される細菌由来の遺伝子から発現される、請求項１に記載の方法
。
【請求項４】前記遺伝子が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａｆ
ａｏＡＢである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、アセトアセチル
−ＣｏＡレダクターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、およびエノイル−
ＣｏＡヒドラターゼからなる群から選択される酵素をコードする、細菌、真菌、
酵母、植物、または動物起源の遺伝子を発現する工程をさらに含み、ここで、こ
れらの遺伝子によってコードされる該酵素が、前記植物の細胞質ゾル、ペルオキ
シソームまたはグリオキシソーム以外のプラスチド、あるいはミトコンドリアに
対して指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】植物細胞の代謝を操作する方法において使用するためのＤＮ
Ａ構築物であって、（ａ）植物において機能的なプロモーター領域；（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸β−酸化酵素活性をコードする構造的ＤＮＡ配
列；および（ｃ）植物において天然に発現される遺伝子の３’非翻訳領域であって、該非
翻訳領域が、ｍＲＮＡのポリアデニル化についてのシグナル配列をコードする、
３’非翻訳領域、を同じ相で含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項７】前記プロモーターが、種子特異的プロモーターである、請求
項６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項８】前記種子特異的プロモーターが、ナピンプロモーター、ファ
ゼオリンプロモーター、オレオシンプロモーター、２Ｓアルブミンプロモーター
、ゼインプロモーター、β−コングリシニンプロモーター、アシルキャリアタン
パク質プロモーター、および脂肪酸デサチュラーゼプロモーターからなる群から
選択される、請求項７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項９】前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項６
に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１０】前記プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、増
強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびユビキチンプロモーターからなる
群から選択される、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１１】トランスジェニック植物において、ポリヒドロキシアルカ
ノエートの生物学的生成を増強するための方法であって、該植物の細胞質ゾル、
ペルオキシソームまたはグリオキシソーム以外のプラスチド、あるいはミトコン
ドリアにおいて異種の脂肪酸β−酸化酵素をコードする遺伝子を発現する工程を
含む、方法。
【請求項１２】前記トランスジェニック植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ、トウ
モロコシ、ダイズ、綿実、ヒマワリ、ヤシ、ココヤシ、ベニバナ、ラッカセイ、
カラシ、アマ、タバコ、およびアルファルファからなる群から選択される、請求
項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記植物の細胞質ゾル、ペルオキシソームまたはグリオキ
シソーム以外のプラスチド、あるいはミトコンドリアにおいて脂肪酸β−酸化酵
素をコードする異種の遺伝子を含む、トランスジェニック植物またはその一部。
【請求項１４】前記脂肪酸β−酸化酵素が、細菌、酵母、真菌、植物、お
よび哺乳動物からなる群から選択される遺伝子から発現される、請求項１３に記
載の植物またはその一部。
【請求項１５】前記脂肪酸酸化酵素が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、およびＣｏｒｙｎｅｆｏｒｍから
なる群から選択される細菌由来の遺伝子から発現される、請求項１４に記載の植
物またはその一部。
【請求項１６】前記遺伝子が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ
ｆａｏＡＢである、請求項１５に記載の植物またはその一部。
【請求項１７】ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、アセトアセチ
ル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、およびエノ
イル−ＣｏＡヒドラターゼからなる群から選択される酵素をコードする遺伝子
をさらに含む、請求項１３に記載の植物またはその一部。
【請求項１８】前記植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ、トウモロコシ、ダイズ、
綿実、ヒマワリ、ヤシ、ココヤシ、ベニバナ、ラッカセイ、カラシ、アマ、タバ
コ、およびアルファルファからなる群から選択される、請求項１３に記載の植物
またはその一部。
【請求項１９】（ａ）植物において機能的なプロモーター領域；（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸β−酸化酵素活性をコードする構造的ＤＮＡ配
列；および（ｃ）植物において天然に発現される遺伝子の３’非翻訳領域であって、ここ
で該非翻訳領域が、ｍＲＮＡのポリアデニル化についてのシグナル配列をコード
する、３’非翻訳領域、を同じ相で含むＤＮＡ構築物を含む、請求項１３に記載の植物またはその一部。
【請求項２０】前記プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求
項１９に記載の植物またはその一部。
【請求項２１】前記種子特異的プロモーターが、ナピンプロモーター、フ
ァゼオリンプロモーター、オレオシンプロモーター、２Ｓアルブミンプロモータ
ー、ゼインプロモーター、β−コングリシニンプロモーター、アシルキャリアタ
ンパク質プロモーター、および脂肪酸デサチュラーゼプロモーターからなる群か
ら選択される、請求項２０に記載の植物またはその一部。
【請求項２２】前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項
１９に記載の植物またはその一部。
【請求項２３】前記プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、増
強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびユビキチンプロモーターからなる
群から選択される、請求項２０に記載の植物またはその一部。
【請求項２４】植物における種子生産を、予防または抑制する方法であっ
て、該植物の細胞質ゾル、またはペルオキシソーム、グリオキシソーム以外のプ
ラスチド、またはミトコンドリアにおいて脂肪酸β−酸化酵素をコードする異種
の遺伝子を発現する工程を含む、方法。