JP4121541B2

JP4121541B2 - 脂肪酸生合成経路からの中間鎖長のポリヒドロキシアルカノエートの産生

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Publication number: JP4121541B2
Application number: JP2007153418A
Authority: JP
Inventors: アクインステファニー; ピー．ピープルスオリバー; ディー．スネルクリスティ
Original assignee: メタボリックス，インコーポレイテッド
Priority date: 2000-11-17
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2008-07-23
Anticipated expiration: 2021-11-16
Also published as: DE60141594D1; ATE461273T1; US7786355B2; WO2002040690A2; WO2002040690A3; CA2428713C; JP2007222185A; US20030017576A1; AU3646402A; JP2004534507A; JP4024676B2; EP1334181B1; WO2002040690A9; JP2008194049A; AU2002236464B2; CA2428713A1; JP2007125043A; ES2340915T3; EP1334181A2

Description

（発明の背景）
多数の微生物は、ポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノエート］（ＰＨＡ）の細胞内貯蔵を蓄積する能力を有する。ＰＨＡは、生分解性および生体適合性の熱可塑性物質であり、再生可能資源から生成され、広範囲の産業的用途および生物医学的用途を有する（非特許文献１）。ＰＨＡ生体高分子は、異なるモノマー組成物および広範囲の物理学的特性を有する、広範なクラスのポリエステルを含む。現在まで、約１００の異なるモノマーが、ＰＨＡポリマーに組み込まれている（非特許文献２）。ＰＨＡは、ＰＨＡの側鎖の長さに従って２つの群に分けられ得る。短い側鎖を有するＰＨＡ（例えば、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）（Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸単位のホモポリマー））は、結晶性熱可塑性物質であり、一方、中間の長さの側鎖を有するＰＨＡ（例えば、ポリヒドロキシオクタン酸またはポリヒドロキシデカン酸）は、より弾性である。

細菌において、各ＰＨＡ群は、特定の経路により産生される。短いペンダント基のＰＨＡの場合、３つの酵素（β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、およびＰＨＡシンターゼ）が、関与する。例えば、ＰＨＢ生合成において、アセチル−補酵素Ａの２つの分子が、β−ケトチオラーゼにより縮合されて、アセトアセチル−補酵素Ａを生じる。次いで、後者は、レダクターゼにより、キラル中間体であるＲ−３−ヒドロキシブチリル−補酵素Ａに還元され、次いで、ＰＨＡシンターゼ酵素により重合される。短い鎖長のＰＨＡシンターゼは、代表的には、４−ヒドロキシ酸単位および５−ヒドロキシ酸単位の両方を含む、Ｃ３〜Ｃ５ヒドロキシ酸モノマーの重合を可能にする。この生合成経路は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｌａｔｕｓ、Ｚｏｏｇｌｏｅａｒａｍｉｇｅｒａなどのような多数の細菌において見出されている（非特許文献３）。

中間鎖長のペンダント基のＰＨＡは、多くの異なるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌により産生される。ヒドロキシアシル−補酵素Ａモノマー単位は、脂肪酸β酸化経路および脂肪酸生合成経路に元々は由来し得る。次いで、このモノマー単位は、より大きなＣ６〜Ｃ１４モノマー単位を好む基質特異性を有する、ＰＨＡシンターゼにより、ポリマーに転換される（非特許文献３）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ生物において、長いペンダント基のＰＨＡの産生を担うＰＨＡシンターゼは、具体的に、ｐｈａＡ遺伝子およびｐｈａＣ遺伝子により、ｐｈａ遺伝子座にコードされることが見出されている（特許文献１、特許文献２；非特許文献４）。

短い鎖長のペンダント基および中間鎖長のペンダント基の両方から構成されるコポリマーもまた、広範な基質特異性を有する、ＰＨＡシンターゼを有する細菌において産生され得る。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．Ａ３３（非特許文献５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．６１−３（非特許文献６）、およびＴｈｉｏｃａｐｓａｐｆｅｎｎｉｇｉｉ（特許文献３）全ては、短い鎖長のモノマー単位および中間鎖長のモノマー単位のコポリマーを産生することが報告されているＰＨＡシンターゼを有する。

ｐｈａＧによりコードされる酵素が、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａの両方において最近同定され、そしてこれらの生物において、脂肪酸生合成と中間鎖長のＰＨＡ形成との間（図１の経路Ａを参照のこと）を結びつけるものであることが報告されている（非特許文献７；特許文献４；特許文献５；非特許文献８）。これらの研究において、ＰｈａＧは、部分的に精製された酵素調製物が、ＡＰＣの存在下で、３−ヒドロキシデカノイルＣｏＡを３−ヒドロキシデカノイルＡＣＰへと転換する能力に基づいて、３−ヒドロキシアシル−アシルキャリアタンパク質−補酵素Ａトランスフェラーゼとして同定された（非特許文献７）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉ（天然では、貯蔵物質としてＰＨＡを産生しない生物）におけるｐｈａＧおよびＰｈａＣの発現は、グルコネートからのＰＨＡの産生を可能にした（非特許文献９）。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、中間鎖長のシンターゼおよびＰｈａＧの発現の際に、ポリマーは観察されなかった（非特許文献７）。Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｐ．ｆｒａｇｉのように、少量の、低分子量のＰＨＢの非顆粒形態を産生し得るが（非特許文献１０）、貯蔵ポリマーの顆粒を産生できない。

特許文献６は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ由来のｐｈａＧ遺伝子が、Ｃ８単位およびＣ１０単位を含むポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）生体高分子の生合成のための（Ｄ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ前駆体を産生するために有用な、３−ヒドロキシアシルＡＣＰ−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性をコードする。しかし、この活性は確認されていない。
米国特許第５，２４５，０２３号明細書米国特許第５，２５０，４３０号明細書米国特許第６，０１１，１４４号明細書国際公開第９８／０６８５４号パンフレット米国特許第５，７５０，８４８号明細書米国特許第５，７５０，８４８号明細書Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９６，ＣＨＥＭＴＥＣＨ２６，３８−４４ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ，１９９５，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８；２１９−２２８Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｌ．Ｌ．およびＨｕｉｓｍａｎ，Ｇ．Ｗ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ１９９９，６３，２１−５３Ｈｕｉｓｍａｎら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１９１−２１９８Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５，４２，９０１−９０９Ｋａｔｏ，Ｍ．，Ｂａｏ，Ｈ．Ｊ．，Ｋａｎｇ，Ｃ．−Ｋ，Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．，Ｄｏｉ，Ｙ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６，４５，３６３−３７０Ｒｅｈｍ，Ｂ．Ｈ．Ａ．，Ｋｒｕｇｅｒ，Ｎ．，Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，２７３，２４０４４−２４０５１Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｎ．，Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．，Ｒｅｈｍ，Ｂ．Ｈ．Ａ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２０００，１８４，２５３−２５９Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｓ．，Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．，Ｒｅｈｍ，Ｂ．Ｈ．Ａ．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２０００，６６，２１１７−２１２４Ｒｅｕｓｃｈ，Ｒ．Ｎ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９５，４１（補遺１），５０−５４

従って、本発明の目的は、ＰＨＡの産生のために、生物においてアシルＣｏＡシンテターゼおよびＰＨＡシンターゼと共に、ＰｈａＧを発現することである。

従って、本発明のさらなる目的は、中間鎖長のＰＨＡの産生のために、生物においてアシルＣｏＡシンテターゼおよびＰＨＡシンターゼと共に、ＰｈａＧを発現することである。

上記課題を解決するために、本発明は、例えば以下の手段を提供する。
（項目１）３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする導入遺伝子を発現する、トランスジェニック生物。
（項目２）アシル−ＣｏＡシンテターゼまたはアシルＣｏＡトランスフェラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする１つ以上の導入遺伝子をさらに含む、項目１に記載の生物。
（項目３）上記アシル−ＣｏＡシンテターゼが３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼである、項目２に記載の生物。
（項目４）上記アシル−ＣｏＡシンテターゼがａｌｋＫである、項目２に記載の生物。
（項目５）ＰＨＡシンターゼをさらに発現する、項目２または３に記載の生物。
（項目６）異種の３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ活性をさらに発現する、項目１または５に記載の生物。
（項目７）上記酵素が改変される、項目１に記載の生物。
（項目８）項目５に記載の生物であって、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、中間鎖長のＰＨＡシンターゼおよび中間鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸アシルＣｏＡシンターゼからなる群より選択される酵素を発現し、ここで、該生物が植物細胞、植物組織または植物全体である、生物。
（項目９）選択マーカー遺伝子をさらに発現する、項目８に記載の生物であって、ここで、該生物は植物全体である、生物。
（項目１０）項目５に記載の生物であって、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、中間鎖長のヒドロキシ酸を組み込むＰＨＡシンターゼおよび中間鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸アシルＣｏＡシンテターゼからなる群より選択される酵素を発現し、ここで、該生物が細菌である、生物。
（項目１１）項目８に記載の生物であって、ここで、上記導入遺伝子の発現が、組織または種子、葉、色素体およびペルオキシソームからなる群より選択されるオルガネラに標的化される、生物。
（項目１２）上記細菌がＥ．ｃｏｌｉであり、ＰＨＡが該細菌内で蓄積する、項目１０に記載の生物。
（項目１３）トランスジェニック生物におけるＰＨＡ生合成経路を操作する方法であって、該方法は、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする導入遺伝子を含む構築物を提供する工程、および該生物を作製する工程を包含する、方法。
（項目１４）項目１３に記載の方法であって、ここで、上記構築物がアシル−ＣｏＡシンテターゼまたはアシルＣｏＡトランスフェラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする１つ以上の導入遺伝子をさらに含む、方法。
（項目１５）上記酵素が、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼの触媒活性を有する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）上記構築物が、ＰＨＡシンターゼをコードする導入遺伝子をさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）上記生物が植物である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）項目１６に記載の方法であって、上記構築物が、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、中間鎖長のＰＨＡシンターゼおよび中間鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸アシルＣｏＡシンターゼからなる群より選択される酵素を発現し、ここで、上記生物が植物細胞、植物組織または植物全体である、方法。
（項目１９）項目１６に記載の方法であって、上記構築物が、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、中間鎖長のヒドロキシ酸を組み込むＰＨＡシンターゼ、および中間鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸アシルＣｏＡシンテターゼからなる群より選択される酵素を発現し、ここで、上記生物が細菌である、方法。
（項目２０）ＰＨＡを作製する方法であって、該方法が、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする導入遺伝子を発現するトランスジェニック生物を成長させる工程を包含する、方法。
（項目２１）項目２０に記載の方法であって、上記生物がさらに、アシル−ＣｏＡシンテターゼまたはアシルＣｏＡトランスフェラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする１つ以上の導入遺伝子を含む、方法。
（項目２２）上記アシル−ＣｏＡシンテターゼが３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）上記生物がＰＨＡシンターゼをさらに発現する、項目２１に記載の方法。
（項目２４）上記生物がＰＨＡシンターゼをさらに発現する、項目２２に記載の方法。
（項目２５）項目２４に記載の方法であって、上記生物が、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、中間鎖長のＰＨＡシンターゼおよび中間鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸アシルＣｏＡシンターゼからなる群より選択される酵素を発現し、ここで、上記生物が植物細胞、植物組織または植物全体である、方法。
（項目２６）項目２４に記載の方法であって、上記生物が、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、中間鎖長のヒドロキシ酸を組み込むＰＨＡシンターゼ、および中間鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸アシルＣｏＡシンテターゼからなる群より選択される酵素を発現し、ここで、上記生物が細菌である、方法。
（項目２７）３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼ活性をコードする酵素についてのスクリーニング方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）ＰＨＡシンターゼおよび３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼまたは３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼを発現する異種の生物において酵素を同時発現させる工程、ならびに
ｂ）ＰＨＡの産生に適切な条件下で該生物を成長させる工程、
を包含する、方法。
（項目２８）植物油組成物のＣ８およびＣ１０のヒドロキシ酸または脂肪酸のレベルを増加させる方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする導入遺伝子を発現させる工程、および
ｂ）植物油組成物の産生にとって最適な条件下で該植物を成長させる工程、
を包含する、方法。
（項目２９）上記細菌がＥ．ｃｏｌｉであり、ここで、３−ヒドロキシ酸が培養培地中に分泌される、項目１０に記載の生物。

（発明の要旨）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のｐｈａＧ遺伝子およびＰＨＡシンターゼ１遺伝子を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉ系は、中間鎖長のＰＨＡを蓄積しないことが発見された。しかし、培地は、有意なレベルの３−ヒドロキシ酸を含んでいたことが見出された。ここで、ＰｈａＧタンパク質は、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステラーゼとして機能したことが示された。ｐｈａＧ遺伝子、ｐｈａＣ１遺伝子およびａｌｋＫ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ系は、ＰＨＡを産生する。これらの結果は、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の細菌においてＰＨＡを産生するための、新規の代謝操作アプローチを提供するのみならず、他の生物（例えば、作物（ｐｌａｎｔｃｒｏｐ））においてＰＨＡを産生するための、いくつかの新規のアプローチを提供する。

本明細書中で記載される方法は、作物の葉もしくは種子の色素体において、または細菌のような植物以外の生物において、例えば、アシルＣｏＡシンテターゼもしくはＣｏＡトランスフェラーゼ、またはＰＨＡシンターゼ遺伝子と共に（２つのサブユニットのシンターゼの場合、高等植物のペルオキシソーム、細胞質ゾルもしくは色素体において）、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する酵素を発現することを包含する。これは、チオエステラーゼおよびＰＨＡシンターゼの色素体発現のようないくつかの場合では、色素体において、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ活性を有する遺伝子を発現するのにもまた有用である。ＰＨＡシンターゼが、細胞質ゾルにおいて発現される場合、必要に応じて、（Ｄ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼの触媒活性を有する酵素をコードする遺伝子の発現を増加することが有用であり得る。ＰＨＡシンターゼが、ペルオキシソームに対して標的化される場合、このペルオキシソームに対する（Ｄ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼの触媒活性を有する酵素を標的とすることもまた有用であり得る。

３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする導入遺伝子構築物が開発されている。１つの実施形態では、この導入遺伝子構築物は、さらに、アシルＣｏＡシンテターゼまたはＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む。別の実施形態では、この導入遺伝子構築物は、さらに、アシルＣｏＡシンテターゼまたはＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、およびＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子を含む。

この導入遺伝子構築物は、ＰＨＡの産生のために、任意の生物および／またはその細胞において発現され得る。１つの例では、ＰＨＡは、例えば、Ｃ８ヒドロキシ酸単位およびＣ１０ヒドロキシ酸単位を有する、中間鎖長のＰＨＡである。別の例では、この生物は細菌である。別の例では、この生物は、植物である。ＰＨＡは、適切な条件下で、生物またはその細胞を増殖させることにより産生され得る。

本明細書中に記載される方法はまた、植物油組成物の修飾を可能にして、Ｃ８ヒドロキシ酸または脂肪酸およびＣ１０ヒドロキシ酸または脂肪酸のレベルを増大させる。

（発明の詳細な説明）
Ｅ．ｃｏｌｉが、ＰｈａＧおよびＰｈａＣを発現する場合に、グルコースから中間鎖長のＰＨＡを形成することができないことは、この経路が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓではない、非ネイティブのＰＨＡプロデューサー中に操作される場合、さらなる酵素活性が要求され得ることを示唆する。米国特許第５，７５０，８４８号は、ＰＨＡ陰性の細菌において、３−ヒドロキシアシルＡＣＰの３−ヒドロキシアシルＣｏＡへの転換を可能にする、酵素または酵素の組み合わせを単離するためのスクリーニング方法を記載するが、このような酵素は、文献にも特許にも記載されていない。Ｋｌｉｎｋｅら（Ｋｌｉｎｋｅ，Ｓ．，Ｒｅｎ，Ｑ．，Ｗｉｔｈｏｌｔ，Ｂ．，Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｂ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９，６５，５４０−５４８）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、チオエステラーゼおよびＰＨＡシンターゼの同時発現の際のＰＨＡ産生を実証した。この研究に用いられるチオエステラーゼは、３−ヒドロキシアシルＡＣＰを３−ヒドロキシ脂肪酸へ転換しないが、代わりに、アシルＡＣＰを脂肪酸に転換するので、宿主細胞のネイティブのβ−酸化酵素は、ＰＨＡ形成のために３−ヒドロキシアシルＣｏＡを形成することが要求される。従って、このストラテジーは、植物に限定される。なぜならば、β酸化酵素は、ペルオキシソームに主に局在し、これによりＰＨＡが産生され得る場所が制限されるからである。

ＰｈａＧおよびＰｈａＣを発現する異種系における、中間鎖長のＰＨＡ生成に必要な酵素活性としてのアシルＣｏＡシンテターゼが、発見されている。アシルＣｏＡシンテターゼは、遊離脂肪酸、補酵素ＡおよびＡＴＰの、脂肪酸アシルＣｏＡおよびＡＭＰへの転換を触媒する（図１の経路Ｃ；Ｂｌａｃｋ，Ｐ．Ｎ．、ＤｉＲｕｓｓｏ，Ｃ．Ｃ．、Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ａ．Ｋ．、Ｈｅｉｍｅｒｔ，Ｔ．Ｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２、２６７、２５５１３−２５５２０を参照のこと）。ＰｈａＧが、インビボの３−ヒドロキシアシルＡＣＰ−ＣｏＡトランスフェラーゼ反応を完了することを可能にするために、補充的アシルＣｏＡシンテターゼを必要とすることは、ＰｈａＧが、予測とは異なり、３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼ活性のみをコードすることを示唆する（図１の経路Ｂを参照のこと）。アシルＣｏＡシンテターゼの遺伝子は、単離され、そして特徴づけられており、これらとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｆａｄＤ遺伝子（Ｂｌａｃｋ，Ｐ．Ｎ．、ＤｉＲｕｓｓｏ，Ｃ．Ｃ．、Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ａ．Ｋ．、Ｈｅｉｍｅｒｔ，Ｔ．Ｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２、２６７、２５５１３−２５５２０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のａｌｋＫ遺伝子（ｖａｎＢｅｉｌｅｎ，Ｊ．Ｂ．、Ｅｇｇｉｎｋ，Ｇ．、Ｅｎｅｑｕｉｓｔ，Ｈ．、Ｂｏｓ，Ｒ．、Ｗｉｔｈｏｌｔ，Ｂ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１９９２、６、３１２１−３１３６）およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来のＰｆａｃｓ１遺伝子（Ｍａｔｅｓａｎｚ，Ｆ．、Ｄｕｒａｎ−Ｃｈｉｃａ，Ｉ．、Ａｌｃｉｎａ，Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９、２９１、５９−７０）が挙げられる。

アシルＣｏＡシンテターゼのように、ＣｏＡトランスフェラーゼもまた、３−ヒドロキシ脂肪酸を、３−ヒドロキシアシルＣｏＡに転換できる。ＣｏＡトランスフェラーゼは、アシルＣｏＡから遊離脂肪酸への、ＣｏＡの転移を触媒する（図１の経路Ｄを参照のこと）。３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼとＣｏＡトランスフェラーゼとの同時発現は、３−ヒドロキシアシルＡＣＰの、その対応する３−ヒドロキシアシルＣｏＡへの首尾よい転換を可能にするはずである。ＷＯ９８３９４５３は、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性およびＰＨＡシンターゼ活性を利用して、宿主生物において短い鎖長のＰＨＡを生成する方法を記載するが、３−ヒドロキシＡＣＰを３−ヒドロキシアシルＣｏＡに転換するための、３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼおよびＣｏＡトランスフェラーゼの組み合わせた使用を記載していない。宿主生物において、容易に利用可能なＣｏＡチオエステラーゼから、中間鎖長の脂肪酸にＣｏＡを転移し得るＣｏＡトランスフェラーゼを得るために、ゲノムＤＮＡライブラリーが、適切な中間鎖長のＰＨＡシンテターゼおよび３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼを発現する、ＰＨＡマイナス細菌において、構築およびスクリーニングされ得る。あるいは、既存のＣｏＡトランスフェラーゼ（例えば、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍＫｌｕｙｖｅｒｉ由来のｏｒｆＺ遺伝子（Ｓｏｈｌｉｎｇ，Ｂ．およびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｇ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９６、１７８、８７１−８８０））の遺伝子シャッフリングを使用して、宿主生物において容易に利用可能なＣｏＡチオエステラーゼから、中間鎖長の脂肪酸へＣｏＡを転移する能力を有する、新規ＣｏＡトランスフェラーゼを作製し得る。所望の活性を有する新規ＣｏＡトランスフェラーゼは、適切な中間鎖長のＰＨＡシンターゼおよび３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼを発現するＰＨＡマイナス細菌においてスクリーニングされ得る。

植物を操作して、３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼ、中間鎖の３−ヒドロキシ酸を取り込み得るＰＨＡシンターゼ、および（Ｄ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ活性またはＣｏＡトランスフェラーゼ活性のいずれかを有する酵素の触媒活性を有する酵素を発現させることによって、脂肪酸生合成経路から、中間鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシ酸を含むＰＨＡを生成するための方法論が、開発されてきた。本明細書中に記載される方法論は、脂肪種子およびバイオマス作物の両方を操作して、所望のＰＨＡ生体高分子を生成するために有用である。

その存在が、ｐｈａＧおよび中間鎖長のＰＨＡシンターゼ（ＰｈａＣ）を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉにおける脂肪酸生合成経路からのポリマーの生成に必要な酵素活性としての、アシルＣｏＡシンテターゼの同定のための方法および材料もまた、本明細書中に記載される。具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａにおいて、ＰｈａＧ、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ−ＣｏＡトランスフェラーゼとして以前に特徴付けられた酵素（米国特許第５，７５０，８４８号）およびＰｈａＣの同時発現によって、細胞内に含まれたポリマーが得られないことが実証されている。細菌系において、培養物上清への３−ヒドロキシ酸の排出が観察され、このことは、ＰｈａＧが触媒する脂肪酸生合成からの炭素の転換が生じていることを示す。ａｌｋＫ、中間鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸に対する活性を有する、Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のアシルＣｏＡシンテターゼの同時発現は、中間鎖長ポリマーの細胞内蓄積および培養培地中に排出される３−ヒドロキシ酸の量の減少を生じる。ｐｈａＣおよびｐｈａＧを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞が、ａｌｋＫの発現の際にのみポリマーを生成する能力は、ＰｈａＧが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、インビボで、３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼとして作用するが、アシルＡＣＰ−ＣｏＡトランスフェラーゼとしては作用しないことを示唆する。ｐｈａＣおよびｐｈａＧを発現する植物もまた、脂肪酸生合成経路からの首尾よいＰＨＡ生成のために、補充的アシルＣｏＡシンテターゼを必要とする。

ＰＨＡシンテターゼは、当該分野で公知であり、そして、例えば、米国特許第６，１４３，９５２号に記載される公知の技術によって、他のＰＨＡシンテターゼから開発され得る。

本明細書中に記載されるＤＮＡ構築物は、植物へ導入遺伝子を導入し得る形質転換ベクターを含む。多くの利用可能な植物形質転換ベクター選択が存在する（ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｔｏＰｌａｎｔｓ（１９９５）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＮｅｗＹｏｒｋ；「ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓ：ＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＰｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ」（１９９６）、Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｒ．Ｌ．およびＰｅｎ，Ｊ．編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＬｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ、ならびにＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｃｏｕｒｓｅｍａｎｎｕａｌ（１９９５）、Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．、Ｋｌｅｓｓｉｇ，Ｄ．Ｆ．、Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ａ．Ｒ．、Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．およびＶａｒｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）。一般に、植物形質転換ベクターは、５’および３’の調節配列（プロモーター、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルを含む）の転写制御下の１つ以上の目的のコード配列、および選択マーカー遺伝子またはスクリーニングマーカー遺伝子を含む。５’調節配列についての通常の要件としては、プロモーター、転写開始部位およびＲＮＡプロセシングシグナルが挙げられる。３’調節配列としては、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルが挙げられる。

多数の植物プロモーターが公知であり、そして目的の遺伝子の、構成的発現または環境的もしくは発生的に調節された発現のいずれかを生じる。植物プロモーターは、異なる植物組織または小器官において、導入遺伝子の発現を制御するように選択され得、その全ての方法は、当業者に公知である（ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４；１２９３−１２９９）。適切な構成的植物プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ）および増強されたＣａＭＶプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０）、アクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙら、１９９０、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：１６３−１７１）、ＡｄｈＩプロモーター（Ｆｒｏｍｍら、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３−８３９；Ｋｙｏｚｕｋａら、１９９１、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：４０−４８）、ユビキチンプロモーター、ゴマノハグサ（Ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウイルスプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーターおよびオクトピンシンターゼプロモーターが挙げられる。有用な調節可能なプロモーター系としては、ホウレンソウ硝酸誘導性プロモーター、ヒートショックプロモーター、リブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのプロモーターおよび化学的誘導性プロモーターが挙げられる（米国特許第５，３６４，７８０号；同第５，３６４，７８０号；同第５，７７７，２００号）。

１つの実施形態において、３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼおよびアシルＣｏＡシンテターゼの触媒活性を有する酵素は、３−ヒドロキシアシルＡＣＰを３−ヒドロキシアシルＣｏＡに転換するために利用される。ＰＨＡシンターゼの同時発現は、ＰＨＡ形成を可能にする。１つの実施形態において、十分な量で存在する場合、宿主生物の内因性アシルＣｏＡシンテターゼ活性が利用される。代替の実施形態において、宿主生物のアシルＣｏＡシンテターゼ活性は、アシルＣｏＡシンテターゼをコードする遺伝子（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のａｌｋＫ遺伝子（ｖａｎＢｅｉｌｅｎ，Ｊ．Ｂ．、Ｅｇｇｉｎｋ，Ｇ．、Ｅｎｅｑｕｉｓｔ，Ｈ．、Ｂｏｓ，Ｒ．、Ｗｉｔｈｏｌｔ，Ｂ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１９９２、６、３１２１−３１３６））の過剰発現によって補充される。

別の実施形態において、３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼの酵素活性を有する酵素およびアシルＣｏＡトランスフェラーゼ活性をコードする酵素が利用される。この実施形態において、アシルＣｏＡトランスフェラーゼは、宿主生物において容易に利用可能なアシルＣｏＡから、３−ヒドロキシ脂肪酸へのＣｏＡの転移を触媒し、３−ヒドロキシアシルＣｏＡ形成を生じる。ＰＨＡシンターゼの同時発現は、ＰＨＡ形成を可能にする。

１つの実施形態において、３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼに関連する活性を有する酵素をコードする遺伝子、またはＰｈａＧにいくらか相同な酵素をコードする遺伝子は、分子進化または遺伝子シャッフリング技術によって改変され、中間鎖長の３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する新規酵素が得られる。米国特許第５，７５０，８４８号は、ＰｈａＧの改変体を生成することを記載するが、関連の酵素を改変して、新規の３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を生じることは記載していない。本発明のこの局面の１つの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のｒｈｌＡＢ遺伝子（これは、ラムノシルトランスフェラーゼ活性をコードする（Ｏｃｈｓｎｅｒ，Ｕ．Ａ．、Ｆｉｅｃｈｔｅｒ，Ａ．、Ｒｅｉｓｅｒ，Ｊ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４、２６９、１９７８７−１９７９５））は、遺伝子シャッフリングによって改変される。具体的には、ｒｈｌＡＢ、ｒｈｌＡまたはｒｈｌＢコード領域、あるいは上記のコード領域のいずれかのセグメントは、遺伝子シャッフリングによって改変されて、中間鎖長の３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼ活性をコードする酵素を生じる。シャッフルされた遺伝子のライブラリーは、ｐｈａＧ変異株の補完についてか、または適切なＰＨＡシンターゼおよび３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼを発現する異種細菌において、試験され得る。

１つの実施形態において、導入遺伝子は、葉でのみ発現される。この目的のために適切なプロモーターとしては、３５Ｓエンハンサーの後ろのＣ４ＰＰＤＫプロモーター（Ｓｈｅｅｎ、Ｊ．、ＥＭＢＯ、１９９３、１２、３４９７−３５０５）または葉での発現に有用な他の任意のプロモーターが挙げられる。葉特異的な導入遺伝子の１つの実施形態において、３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼ、ＰＨＡシンターゼおよびアシルＣｏＡシンテターゼ活性の酵素活性を有する酵素をコードする導入遺伝子の５’末端は、導入遺伝子とインフレームで連結された葉緑体標的化ペプチドをコードする配列を含むように操作される。葉緑体標的化配列は、葉緑体または色素体に対してタンパク質を標的化し得る任意のペプチド配列である（例えば、アルファルファのリブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットの一過性（ｔｒａｎｓｉｔ）ペプチド（Ｋｈｏｕｄｉ，Ｈ．、Ｖｅｚｉｎａ，Ｌ．−Ｐ．、Ｍｅｒｃｉｅｒ，Ｊ．、Ｃａｓｔｏｎｇｕａｙ，Ｙ．、Ａｌｌａｒｄ，Ｇ．、Ｌａｂｅｒｇｅ，Ｓ．、Ｇｅｎｅ１９９７，１９７、３４３−３５１）またはｐｅａｒｕｂｉｓｃｏ葉緑体標的化シグナル（Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ａ．Ｒ．（１９８３）、ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｐｌａｎｔｓ、Ｋｏｓｕｇｅ，Ｔ．、Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，Ｃ．Ｐ．およびＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ，Ａ．編（Ｐｌｅｎｕｍ、ＮｅｗＹｏｒｋ）、２９−３８頁；Ｎａｗｒａｔｈ，Ｃ．、Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｙ．およびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｃ．（１９９４）ＰＮＡＳ．９１：１２７６０−１２７６４））。葉緑体への全てのポリペプチドの輸送は、葉緑体中のポリマーの蓄積を生じる。１つの実施形態において、葉緑体標的化ＣｏＡトランスフェラーゼは、アシルＣｏＡシンテターゼの代わりに使用される。この実施形態において、ＣｏＡトランスフェラーゼは、宿主生物に存在するアシルＣｏＡから、３−ヒドロキシ脂肪酸にＣｏＡを転移させ、ＰＨＡシンターゼについてのモノマー単位を形成する。

葉特異的な導入遺伝子の発現の別の実施形態において、ｐｈａＧ導入遺伝子のみが、葉緑体標的化ペプチドをコードする配列を含むように操作される。ＰｈａＣをコードする導入遺伝子は、小器官を標的化せず、細胞質ゾルへのポリペプチドの輸送を可能にする。この実施形態において、中間鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸は、ＰｈａＧによって脂肪酸生合成から誘導され、そして葉緑体から細胞質ゾルへ優先的に輸送され、その結果、これらは、トリアシルグリセロールに取り込まれ得るか、または分解のためにペルオキシソームに指向される。細胞質ゾルＰｈａＣの存在は、それらが分解されるか、または脂質に取り込まれる前に、異常な脂肪酸の一部から、ＰＨＡへの転換を可能にする。１つの実施形態において、植物の内因性アシルＣｏＡシンテターゼは、細胞質ゾルに指向されるアシルＣｏＡシンテターゼをコードする導入遺伝子の発現によって、補充される。本発明の代替の実施形態において、ＣｏＡトランスフェラーゼは、アシルＣｏＡシンテターゼの変わりに利用される。

代替の実施形態において、導入遺伝子は、発生中の種子においてのみ発現される。この目的のために適切なプロモーターとしては、ｎａｐｉｎ遺伝子プロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号；同第５，６０８，１５２号）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼプロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号；同第５，６０８，１５２号）、２Ｓアルブミンプロモーター、種子保存タンパク質プロモーター、ファゼオリンプロモーター（Ｓｌｉｇｈｔｏｍら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：１８９７−１９０１）、オレオシンプロモーター（ｐｌａｎｔら、１９９４、ＰｌａｍｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：１９３−２０５；Ｒｏｗｌｅｙら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３４５：１−４；米国特許第５，６５０，５５４号；ＰＣＴＷＯ９３／２０２１６）、ゼインプロモーター、グルテリンプロモーター、デンプンシンターゼプロモーター、デンプン分枝酵素プロモーターなどが挙げられる。

種子特異的な導入遺伝子発現の１つの実施形態において、３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼ、ＰＨＡシンターゼおよびアシルＣｏＡシンテターゼの触媒活性を有する酵素をコードする導入遺伝子の５’末端は、導入遺伝子とインフレームで連結された、色素体標的化ペプチドをコードする配列を含むように操作される。色素体標的化配列は、葉緑体または色素体にタンパク質を標的化し得る任意のペプチドである。全てのポリペプチドを色素体に指向させることにより、種子の色素体におけるポリマーの優先的な蓄積を生じる。代替の実施形態において、色素体標的化ＣｏＡトランスフェラーゼは、アシルＣｏＡシンテターゼの代わりに利用される。

種子特異的発現の別の実施形態において、ｐｈａＧ導入遺伝子のみが、色素体標的化ペプチドをコードする配列を含むように操作される。ＰｈａＣをコードする導入遺伝子は、小器官に標的化されず、細胞質ゾルへのポリペプチドの輸送を可能にする。この実施形態において、ＰｈａＧによる脂肪酸生合成に由来する３−ヒドロキシアシル脂肪酸は、色素体から輸送されて、細胞質ゾルのＰｈａＣによって、発生中の種子の細胞質ゾル中でＰＨＡに転換される。１つの実施形態において、植物の内因性アシルＣｏＡシンテターゼは、細胞質ゾルに指向されるアシルＣｏＡシンテターゼをコードする導入遺伝子の発現によって補充される。代替の実施形態において、ＣｏＡトランスフェラーゼは、アシルＣｏＡシンテターゼの代わりに利用される。

代替的実施形態において、ＰＨＡ生成は、葉または種子のペルオキシソームに標的化され得る。この実施形態において、ｐｈａＧ導入遺伝子の５’末端は、この導入遺伝子とインフレームで連結した葉緑体標的化ペプチドまたはプラスチド標的化ペプチドをコードする配列を含むように操作される。ｐｈａＣ導入遺伝子は、Ｎ末端またはＣ末端の適切なペルオキシソーム標的化配列とインフレームで連結される。ペルオキシソーム標的化シグナルは、葉または種子のペルオキシソームにタンパク質を標的化し得る任意のペプチド配列（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓイソクエン酸リアーゼのＣ末端の３４アミノ酸）（Ｏｌｓｅｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｗ．Ｆ．，Ｄａｍｓｚ，Ｂ．，Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｋ．，Ｗｅｂｂ，Ｍ．Ａ．，Ｈａｒａｄａ，Ｊ．Ｊ．１９９３，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，５，９４１−９５２）である。ＰｈａＧによる葉緑体またはプラスチドの脂肪酸生合成から転送された３−ヒドロキシアシル脂肪酸は、オルガネラから外に輸送され、そして分解のためにペルオキシソームに輸送されるか、またはトリアシルグリセリドに組み込まれるかのいずれかである。ペルオキシソームに標的化されたＰｈａＣの存在により、ペルオキシソームに入った３−ヒドロキシ脂肪酸がＰＨＡに変換される。中間鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸の種子中のトリアシルグリセリドへの組み込みは、新規な植物油を生成させる。１つの実施形態において、植物の内因性アシルＣｏＡシンテターゼは、ペルオキシソームに方向付けられたアシルＣｏＡシンテターゼをコードする導入遺伝子の発現により補完される。代替的実施形態において、ペルオキシソームに標的化されたＣｏＡトランスフェラーゼが、アシルＣｏＡシンテターゼの代わりに利用される。

各転写物の最も３’側の末端において、ポリアデニル化シグナルが操作され得る。ポリアデニル化シグナルとは、ｍＲＮＡの細胞質ゾルへの輸送の前に、核におけるｍＲＮＡのポリアデニル化を生じ得る任意の配列（例えば、ノパリンシンターゼの３’領域）（Ｂｅｖａｎ，Ｍ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｃｈｉｌｔｏｎ，Ｍ．Ｄ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８３，１１，３６９−３８５）をいう。

代替的実施形態において、この遺伝子は、１つのプロモーターおよび１つのポリアデニル化シグナルから発現が達成されるように、操作され得る。１つの実施形態において、遺伝子は、ポリプロテインとして発現され得、ウイルスプロテアーゼの作用を介して成熟コード配列へ切断され得る（Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ｓ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｇ．Ｂ．，Ｈｕｎｔ，Ａ．Ｇ．ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，１９９８，１６，１０７−１１６；米国特許第５，８４６，７６７号）。代替的実施形態において、各コード領域は、１つのポリシストロニックｍＲＮＡ上の複数部位における翻訳開始を可能にする、内部リボソーム進入部位に続いている（ＷＯ９８／５４３４２）。

記載された発明の実施において有用な選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子ｎｐｔＩＩ（米国特許第５，０３４，３２２号、同第５，５３０，１９６号）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（米国特許第５，６６８，２９８号）、およびホスフィノスリシンに対する耐性をコードするｂａｒ遺伝子（米国特許第５，２７６，２６８号）が挙げられる。ＥＰ０５３０１２９Ａ１は、増殖培地に添加された不活性化合物を活性化するする酵素をコードする導入遺伝子を発現させることにより、形質転換した植物を、形質転換していない系統より大きく成長させることを可能にするポジティブ選択系を記載する。米国特許第５，７６７，３７８号は、トランスジェニック植物のポジティブ選択のためにマンノースまたはキシロースを用いることを記載する。有用なスクリーニング可能なマーカーとしては、β−グルクロニダーゼ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、１９８７，ＥＭＢＯＪ．６：３９０１−３９０７；米国特許第５，２６８，４６３号）およびネイティブ緑色蛍光タンパク質遺伝子または改変緑色蛍光タンパク質遺伝子（Ｃｕｂｉｔｔら、１９９５，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ．２０：４４８−４５５；Ｐａｎｇら、１９９６，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１２：８９３−９００）が挙げられる。これらのマーカーのいくつかは、形質（例えば、投入側にさらなる作物的価値を提供する、目的の植物への除草剤耐性）を導入する付加された利点を有する。

これらのベクターを用いた適切な作物植物宿主の形質転換は、一定範囲の方法および植物組織により達成され得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：バイオマス作物（例えば、タバコ、アルファルファ、およびアメリカクサキビ（ｓｗｉｔｃｈｇｒａｓｓ））、および脂肪種子作物（例えば、トウモロコシ、ダイズ、綿実、ヒマワリ、ヤシ、ココナツ、ベニバナ、アマ、および落花生）ならびにマスタード（Ｓｉｎａｐｉｓａｌｂａが挙げられる）、およびＢｒａｓｓｉｃａ科（ｎａｐｕｓ、ｒａｐｐａ，ｓｐ．ｃａｒｉｎａｔａおよびｊｕｎｃｅａが挙げられる）。これらのベクターを用いた形質転換に適切な組織としては、以下が挙げられる：プロトプラスト、細胞、カルス組織、リーフディスク、花粉、分裂組織など。適切な形質転換手順としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール媒介プロトプラスト形質転換、リポソーム媒介形質転換、シリコン繊維媒介形質転換（米国特許第５，４６４，７６５号）などが挙げられる。（ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｔｏＰｌａｎｔ（１９９５），Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．編Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＮｅｗＹｏｒｋ；「ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓ：ＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ」（１９９６）、Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｒ．Ｌ．ａｎｄＰｅｎ，Ｊ．編ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＬｔｄ．，ＥｎｇｌａｎｄならびにＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｃｏｕｒｓｅｍａｎｕａｌ（１９９５），Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，Ｋｌｅｓｓｉｇ，Ｄ．Ｆ．，Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ａ．Ｒ．，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．およびＶａｒｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．編，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。トウモロコシのような単子葉植物の形質転換は、米国特許第５，５９１，６１６号に記載される。

構築物を用いてトランスジェニック植物を作製するために、上記の方法にいずれか１つによる形質転換後に、以下の手順が用いられて、導入遺伝子を発現する形質転換植物が得られ得る：形質転換された植物細胞を選択培地上で選択する；この形質転換された植物細胞を再生して、分化した植物を生成する；所望のポリペプチドを所望の組織位置および細胞位置で得るようなレベルで導入遺伝子を発現する形質転換植物を選択する。

特定の有用な作物については、形質転換手順が確立されている（ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｔｏＰｌａｎｔｓ（１９９５），Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．およびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．編Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ；「ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓ：ＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ」（１９９６）、Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｒ．Ｌ．およびＰｅｎ，Ｊ．編，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＬｔｄ．，ＥｎｇｌａｎｄならびにＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｃｏｕｒｓｅｍａｎｕａｌ（１９９５），Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，Ｋｌｅｓｓｉｇ，Ｄ．Ｆ．，Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ａ．Ｒ．，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．ａｎｄＶａｒｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．編ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。

本明細書中に開示される方法はまた、例えば、以下により植物油組成のＣ８およびＣ１０のヒドロキシ酸または脂肪酸のレベルを増大させるために用いられ得る：ａ）３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする導入遺伝子を発現させる、およびｂ）この植物を、植物油組成の生成のために適切な条件下で生長させる。

以下の実施例は、ネイティブでない細菌ＰＨＡプロデューサーの改変、および脂肪酸生合成経路からの中間鎖長ＰＨＡ生成のための植物をさらに例示する。

（実施例１：ＰｈａＧおよびＰｈａＣについてのＥ．ｃｏｌｉ発現カセットの構築）
ＰｈａＧをコードする遺伝子を、プライマーｐｈａＧＦ−ＥｃｏＲＩおよびｐｈａＧＲ−ＫｐｎＩを用いてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａゲノムＤＮＡからＰＣＲにより単離し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＴＲＣＮのＥｃｏＲＩ部位およびＫｐｎＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＭＴＸ−ｐｈａＧを形成した。ｐＭＴＸ−ｐｈａＧにおけるｐｈａＧ挿入物の配列（配列番号９）は、Ｇｅｎｂａｎｋに列挙された配列と同一であることが分かった（登録番号ＡＦ０５２５０７）。

プラスミドｐＳＵ１８−ＫＰＳ１．２Ｎ＃３（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のシンターゼ１を発現する）を、以下のように多工程手順を用いてプラスミドｐＫＰＳ１．２から、構築した。プラスミドｐＫＳ１．２は、ベクターｐＫＫ２２３−３（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）におけるそのネイティブなリボソーム結合部位とともにｐｈａＣを含む。このフラグメントは、ＷＯ９１／００９１７に記載の６．４５９ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントの塩基５３５〜２２４１に等価である。隣接するＢａｍＨＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むｐＫＰＳ１．２のｐｈａＣフラグメントを、ｐＴＲＣＮにサブクローニングして、ｐＴＲＣＮＫＰＳ１．２を形成した。ｐＴＲＣＮ−ＫＰＳ１．２を発現するＥ．ｃｏｌｉの粗溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、検出可能なシンターゼの発現は示されなかった。

さらにシンターゼの発現を最適化するために、最適なＥ．ｃｏｌｉリボソーム結合部位を、ＰＣＲを用いてそのシンターゼの開始コドンの上流に配置した。０．４３ｋｂフラグメントを、プラスミドｐＴＲＣＮ−ＫＰＳ１．２から、プライマーＰｏｓｙｎ１−ＮおよびＰｏｓｙｎ１−ｎｒＳａｃＩＩを用いて増幅し、ベクターｐＴＲＣＮのＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位に、ＥｃｏＲＩ／平滑末端化フラグメントとしてクローニングした。

ＤＮＡ配列決定により、ＰＣＲフラグメントの野生型配列が単離されたことを確認した。インタクトなシンターゼ遺伝子を、ＰＣＲフラグメントの直ぐ後ろにあるＳａｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に、１．２ｋｂＣ末端ＳａｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩシンターゼフラグメントをサブクローニングすることにより再構築して、プラスミドｐＴＲＣＮ−ＫＰＳ１．２Ｎを形成した。プラスミドｐＴＲＣＮ−ＫＰＳ１．２ＮのＤＮＡ配列は、配列番号１０に示される（ｐＫＰＳ１．２Ｎ）。ｐＴＲＣＮ−ＫＰＳ１．２を発現するＥ．ｃｏｌｉの粗溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ベクターｐＴＲＣＮ単独を含むコントロール株の粗溶解物中に存在しない、約６０ｋＤａのバンドの発現が示された。

プラスミドｐＳＵ−ＰｈａＣ_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧ（１つのプラスミドからＰｈａＣおよびＰｈａＧの両方を発現する）を、以下の多工程クローニング手順を用いて作製した。強いＥ．Ｃｏｌｉリボソーム結合部位とシンターゼの完全なコード領域とを含む１．６４ｋｂＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、プラスミドｐＴＲＣＮ−ＫＰＳ１．２Ｎから単離し、ｐＳＵ１８のＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＳＵ１８−ＫＰＳ１．２＃３を形成した。ベクターｐＳＵ１８は、ｐＳＵ２７１８に由来する中間コピー数のプラスミドであり（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｅ．；Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ，Ｂ．；ｄｅｌａＣｒｕｚ，Ｆ．Ｇｅｎｅ１９８８，６８，１５９）、ｐ１５Ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性マーカーを含む。プラスミドｐＭＴＸ−ｐｈａＧに由来するｔｒｃプロモーターおよびｐｈａＧをコードするフラグメントを、以下のようにｐＳＵ１８−ＫＰＳ１．２Ｎ＃３に挿入した。１．００２ｋｂフラグメントを、プライマーｔｒｃ−ｐｈａＧ．ｃ、プライマーｔｒｃ−ｐｈａＧ．ｒおよびテンプレートｐＭＴＸ−ｐｈａＧを用いてＰＣＲにより生成し、ｐＳＵ１８−ＫＰＳ１．２Ｎ＃３のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドｐＳＵ−ＰｈａＣ．_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧは、ｐＳＵ１８のｌａｃプロモーターの後ろにｐｈａＣ、およびｔｒｃプロモーターの後ろにｐｈａＧを含む。プラスミドｐＳＵ−ＰｈａＣ_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧについてのＰｈａＣ．_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧ挿入物の配列を、配列番号１１に示す。

（実施例２：ＰｈａＧおよびＰｈａＣを発現する組換えＥ．ｃｏｌｉ株における３−ヒドロキシオクタン酸および３−ヒドロキシデカン酸の生成）
炭素源としてグルコースを用いてＥ．ｃｏｌｉにおいてＰＨＡを生成する試みにおいて、宿主株ＪＭ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、以下からなる群より選択されるプラスミドを用いて形質転換した：ｐＳＵ−ＰｈａＣ．_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧ（中間鎖長のシンターゼおよびＰｈａＧの発現プラスミド）、ｐＳＵ１８（ｐＳＵ−ＰｈａＣ．_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧについてのコントロールベクター）、およびｐＴＲＣＮ（さらなる遺伝子を挿入することができるプラスミド）。ＪＭ１０９／ｐＴＲＣＮ／ｐＳＵ１８およびＪＭ１０９／ｐＳＵ−ＰｈａＣ．_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧの開始培養物（５ｍＬ）を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）およびクロラムフェニコール（２５ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ）に単一コロニーを用いて接種した。この培養物を３０℃で一晩増殖させた。開始培養物を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地（５ｍＬ）中に希釈し（１：１００）、２５０ＲＰＭで攪拌しながら３０℃で１０時間増殖させた。この培養物を採取し、細胞を２．５ｍＬの培地Ｅ塩（Ｖｏｇｅｌ，Ｊ．Ｈ．およびＢｏｎｎｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５６，２１８，９７−１０６）を用いて２回洗浄した。細胞ペレットを２．５ｍＬの培地Ｅ塩中に再懸濁し、１ｍＬの懸濁液を用いて、遺伝子発現のためにフラスコに接種した。培養を、１００ｍＬの培地Ｅ塩、１．５％グルコース、１ｍｇ／Ｌチアミン、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン、および２５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有する５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中で行った。このフラスコを、６００ｎｍでの吸光度が０．４に達するまで３０℃でインキュベートした。遺伝子発現を０．４ｍＭＩＰＴＧを用いて誘導し、採取する前に、フラスコをさらに４８時間、３０℃でインキュベートした。

細胞を、１２，０００ｇでの遠心分離によって、培養上清から分離した。細胞ペレットを、２５ｍＬの培地Ｅ塩で２回洗浄し、凍結乾燥器中で一晩乾燥させた。その細胞上清の一部（３ｍＬ）を、液体Ｎ_２中で凍結させ、そして凍結乾燥器中で蒸発させて乾燥させた。細胞ペレット、細胞上清サンプル、および３−ヒドロキシアルカン酸標準（３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシドデカノエート）を、これらを以下のように、対応するブチルエステルに変換することによって、ガスクロマトグラフィーによる分析用に調製した。加ブタノール分解試薬［９部ブタノール：１部ＨＣｌ：１ｍｇ／ｍＬ内部標準メチル安息香酸］のアリコート（２ｍＬ）を、ネジ蓋付きバイアル中のこのサンプルに添加し、そしてこのサンプルを、１１０℃で２時間インキュベートした。このバイアルを冷却し、そして水（３ｍＬ）を添加した。このサンプルをボルテックスにかけ、そして卓上遠心分離器における遠心分離によって、水層および有機層を分離した。その有機相のアリコート（１μＬ）を、ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄガスクロマトグラフに連結したＳＰＢ−１溶融シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ；内径０．３２ｍｍ；０．２５μｍフィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，Ｐａ．）上で、分配比１：５０および流速２ｍＬ／分を使用して分析した。この分析についての温度プロフィールは、以下の通りであった：８０℃、２分；１分につき１０℃で２５０℃まで；２５０℃、２分。

ＰｈａＣおよびＰｈａＧを発現する株ＪＭ１０９／ｐＳＵ−ＰｈａＣ．_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧ／ｐＴＲＣＮおよびコントロールベクターのみを含む株ＪＭ１０９／ｐＳＵ１８／ｐＴＲＣＮの細胞ペレット全体のＧＣ分析は、ＰＨＡモノマー単位のブチルエステルに対応するいかなるピークも生じなかった。しかし、ブチル３−ヒドロキシオクタノエートと同等な保持時間を有するピークおよびブチル３−ヒドロキシデカノエートと同等な保持時間を有するピークが、加ブタノール分解により誘導体化されたＪＭ１０９／ｐＳＵ−ＰｈａＣ．_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧ上清のＧＣクロマトグラムにおいて、観察された。加ブタノール分解により誘導体化された既知量の３−ヒドロキシオクタン酸および３−ヒドロキシデカン酸を含むピークと比較することにより、そのピークは０．１４ｍＭブチル３−ヒドロキシオクタノエートおよび０．３２ｍＭブチル３−ヒドロキシデカノエートを含むことが、見出された（表１）。株ＪＭ１０９／ｐＳＵ１８／ｐＴＲＣＮ由来の培養上清は、３−ヒドロキシ酸のブチルエステルに対応するいかなるピークも含まなかった（表１）。

（実施例３：ＰｈａＧ、ＰｈａＣ、およびアシルＣｏＡシンテターゼ（ＡｌｋＫ）についてのＥ．ｃｏｌｉ発現カセットの構築）
３−ヒドロキシアシルＣｏＡ（図１、経路Ａ）の代わりに３−ヒドロキシアシルＡＣＰから遊離脂肪酸へのＰｈａＧ触媒変換（図１、経路Ｂ）は、ＰｈａＧおよびＰｈａＣを発現するＥ．ｃｏｌｉ株由来の誘導体化培養上清のＧＣクロマトグラムにおいて３−ヒドロキシアシルブチルエステルが観察されることについての、１つの説明を提供し得た。実施例２に記載されるＥ．ｃｏｌｉ蓄積研究において、ネイティブＥ．ｃｏｌｉアシルＣｏＡシンテターゼは、ＦａｄＲ（転写調節因子として機能するＥ．ｃｏｌｉタンパク質）（Ｂｌａｃｋ，Ｐ．Ｎ．、ＤｉＲｕｓｓｏ，Ｃ．Ｃ．、Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ａ．Ｋ．、Ｈｅｉｍｅｒｔ，Ｔ．Ｌ．、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．１９９２、２６７、２５５１３〜２５５２０）によるアシルＣｏＡシンテターゼをコードする遺伝子（ｆａｄＤ）の転写抑制に起因して、使用された最小培地増殖条件において誘導されなかったかもしれない。あるいは、ＦａｄＤは、中間鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸について基質特異性を有さないかもしれない。

アシルＣｏＡシンテターゼの添加によりポリマー形成が促進されるか否かを試験するために、ａｌｋＫによりコードされる細胞質ゾルアシルＣｏＡシンテターゼ（ｖａｎＢｅｉｌｅｎ，Ｊ．Ｂ．；Ｅｇｇｉｎｋ，Ｇ．；Ｅｎｅｑｕｉｓｔ，Ｈ．；Ｂｏｓ，Ｒ．；Ｗｉｔｈｏｌｔ，Ｂ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９２，６，３１２１〜３１３６）を、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓゲノムＤＮＡから、プライマーＰｏｓｙｎｒｂｓ．ｃおよびＰｏｓｙｎｒｂｓ．ｒを使用して増幅した。

そのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして発現ベクターｐＴＲＣＮのＥｃｏＲＩ部位およびＢａｍＨＩ部位中にクローニングして、プラスミドｐＴＲＣＮａｌｋＫを形成させた。この細菌発現構築物ｐＴＲＣＮａｌｋＫ中のａｌｋＫの配列は、配列番号１２に示される。Ｇｅｎｂａｎｋ中のａｌｋＫの配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ６５９３６）に対してこのＰＣＲ産物を比較することによって、２つの差異が明らかとなった。（「ＡＴＧ」の「Ａ」から３４６塩基の）「ｃ」の代わりに「ｔ」が観察され、コード配列中のロイシンの代わりにフェニルアラニンが生じた。（「ＡＴＧ」の「Ａ」から３８６塩基の）「ａ」の代わりに「ｇ」が観察され、コード配列中のヒスチジンの代わりにアルギニンが生じた。６つの別個のＰＣＲ産物が、両方の配列矛盾を含んだ。このことは、これらの矛盾が、ＰＣＲにより導入された変異ではないが、このＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用された遺伝子の真のコード配列を反映することを、示唆する。

ＡｌｋＫのアシルＣｏＡシンテターゼ活性を、以下の手順を使用して評価した。ＤＨ５α／ｐＴＲＣＮおよびＤＨ５α／ｐＴＲＣＮ−ＡｌｋＫの５ｍＬ開始培養物を、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含む２×ＹＴ中に調製した。この培養物を接種し、３０℃で１６時間振盪した。この培養物を、２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中の１００ｍＬの２×ＹＴ中に１：１００希釈した。その細胞を、６００ｎｍでの吸光度が約０．６になるまで、３０℃でインキュベートした。０．４ｍＭＩＰＴＧを用いて遺伝子発現を誘導し、そのフラスコを３０℃に４時間戻した。遠心分離によってその細胞を収集し、１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に再懸濁し、そして超音波処理によって破壊した。エルマン試薬［５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）；ＤＴＮＢ］（Ｅｌｌｍａｎ，Ｇ．Ｌ．、１９５９、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８２
７０〜７７）を使用して４１０ｎｍで補酵素Ａの消費をモニターすることによって、アシルＣｏＡシンテターゼ活性を評価した。このアッセイ混合物（５００μｌ）は、２００ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７）、７．５ｍＭＣｏＡ、３．７５ｍＭＡＴＰ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、４．２ｍＭ脂肪酸酵素を含んだ。オクタン酸および３−ヒドロキシオクタン酸を、この反応における脂肪酸基質として使用した。この反応は室温で実施し、そして酵素の添加によって開始した。アリコート（１０μｌ）を３０秒毎に取り出し、そして１４０μｌの５％トリクロロ酢酸中でクエンチした。微小遠心分離機における１分間の遠心分離によって、沈殿したタンパク質を除去し、そしてその上清のアリコート（１００μｌ）を、６９０μｌの５００ｍＭＫＰｉ（ｐＨ７．４）中に希釈した。ＤＴＮＢストックのアリコート［５００ｍＭＫＰｉ（ｐＨ７．４）中の１０ｍＭストック溶液１０μｌ］を添加し、そしてそのサンプルを、室温で２分間インキュベートした。その反応の各時点で消費されたＣｏＡの量を、４１０ｎｍでの吸光度の値（ε＝１３．７ｍＭ^−１ｃｍ^−１）から定量した（図２および図３）。

株ＤＨ５α／ｐＴＲＣＮ−ＡｌｋＫは、上記の酵素アッセイ手順を使用してオクタン酸存在下でアシルＣｏＡシンテターゼについてアッセイした場合に、０．２２Ｕ／ｍｇの活性を有した。コントロール株であるＤＨ５α／ｐＴＲＣＮは、０．０００８１Ｕ／ｍｇの活性を有した。３−ヒドロキシオクタン酸の存在下でアッセイした場合、コントロール株ＤＨ５α／ｐＴＲＣＮで観察された０．０００６３Ｕ／ｍｇと比較して、ＤＨ５α／ｐＴＲＣＮ−ＡｌｋＫは、０．２１Ｕ／ｍｇを有した。

（実施例４：ＰｈａＣ、ＰｈａＧ、およびＡｌｋＫを発現するＥ．ｃｏｌｉにおける中間鎖長のＰＨＡの生成）
細胞質ゾルアシルＣｏＡシンテターゼの存在によってＰｈａＧおよびＰｈａＣを発現するＥ．ｃｏｌｉ株におけるポリマー生成が可能になる否かを決定するために、実施例２に記載されるポリマー蓄積研究のために株ＪＭ１０９／ｐＳＵ−ＰｈａＣ．_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧ／ｐＴＲＣＮ−ＡｌｋＫを調製した。加ブタノール分解により誘導体化された細胞全体のＧＣクロマトグラムは、２０．１モル％の３−ヒドロキシオクタン酸および７９．９モル％の３−ヒドロキシデカン酸から構成される、２．２乾燥細胞重量％のポリマーを含んだ（表１）。ＪＭ１０９／ｐＳＵ−ＰｈａＣ．_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧ／ｐＴＲＣＮ−ＡｌｋＫ上清のＧＣクロマトグラム中の３−ヒドロキシブチルエステルの存在は、０．１６ｍＭのブチル３−ヒドロキシデカノエートを生じブチル３−ヒドロキシオクタノエートを生じなかったＪＭ１０９／ｐＳＵ−ＰｈａＣ．_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧ細胞上清（表１）のＧＣクロマトグラムと比較して、有意に減少した。ポリマー生成のためにＥ．ｃｏｌｉにおいて補助的アシルＣｏＡシンテターゼ活性が必要なことは、ＰｈａＧが、インビトロでは３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼ活性のみを有する（図１、経路Ｂ）ことを示唆する。

実施例２に記載される実験において、アシルＣｏＡシンテターゼの発現をアシルＣｏＡシンテターゼ転写のＦａｄＲ調節が妨げるか否かを決定するために、ＦａｄＲ⁻株ＬＳ５２１８［ｆａｄＲ６０１，ａｔｏＣ５１２（ｃｏｎ）；ＣＧＳＣ株＃６９６６；Ｅ．ｃｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ、ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ］を、ポリマー蓄積研究のための宿主株として使用した。株ＬＳ５２１８／ｐＳＵ１８（コントロール株）およびＬＳ５２１８／ｐＳＵ−ＰｈａＣ．_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧ（ＰｈａＣおよびＰｈａＧの発現株）を、実施例２に記載されるように調製して培養した。但し、ＬＳ５２１８に関するすべての実験において、０．４％グルコースを炭素源として使用した。株ＬＳ５２１８／ｐＳＵ−ＰｈａＣ．_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧ（ＰｈａＣおよびＰｈａＧの発現株）は、９．９モル％の３−ヒドロキシオクタン酸および９０．１モル％の３−ヒドロキシデカン酸からなる、４．５乾燥細胞重量％のポリマーを含んだ（表１）。その培養上清において、中間鎖長の３−ヒドロキシ酸は観察されなかった（表１）。株ＬＳ５２１８／ｐＳＵ１８（コントロール株）は、ポリマーの細胞内蓄積を生じず、そして中間鎖長ヒドロキシ酸を培養上清中に排出しなかった（表１）。これらの結果は、アシルＣｏＡシンテターゼ転写のＦａｄＲ調節は、株ＪＭ１０９／ｐＳＵ−ＰｈａＣ．_Ｐ．ｏ．ｔｒｃ．ＰｈａＧにおけるネイティブアシルＣｏＡシンテターゼの発現を妨げ（実施例２）、ポリマー形成を妨げたかもしれないことを、示唆する。

表１．観察された３−ヒドロキシアシルブチルエステルの濃度^ａ

^ａ誘導体化された培養上清および細胞サンプルにおいてガスクロマトグラフィーによって観察された。上清サンプルは、凍結乾燥し、加ブタノール分解試薬で誘導体化し、そしてガスクロマトグラフに注入した。そのサンプル中の３−ヒドロキシアシルブチルエステルを、既知量の標準サンプル３−ヒドロキシ脂肪酸の加ブタノール分解誘導体化によって定量した。

^ｂ少量の化合物が検出されたが、定量不能である。

（実施例５：ＰｈａＧおよびＰｈａＣの葉緑体特異的発現のための植物ベクターの構築、ならびにＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａの形質転換）
ＰｈａＧ発現用構築物およびＰｈａＣ発現用構築物を、植物の葉緑体中のＰｈａＧおよびＰｈａＣがＰＨＡ生成をもたらすか否かを決定するための形質転換用に調製した（図４Ａおよび図４Ｂ）。

プラスミドｐＣａｍｂｉａ−Ｒｂｃ．ＰｈａＧ．ＰｈａＣ１（図４Ａ）は、植物形質転換ベクターであるｐＣａｍｂｉａ２３００（ＣｅｎｔｅｒｆｏｒｔｈｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
ｔｏＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の誘導体であり、アルファルファｒｕｂｉｓｃｏプロモーター（Ｋｈｏｕｄｉ，Ｈ．，Ｖｅｚｉｎａ，Ｌ．Ｐ．，Ｍｅｒｃｉｅｒ，Ｊ．，Ｃａｓｔｏｎｇｕａｙ，Ｙ．，Ａｌｌａｒｄ，Ｇ．，Ｌａｂｅｒｇｅ，Ｓ．、１９９７、Ｇｅｎｅ１９７：３４３〜３５１）、アルファルファｒｕｂｉｓｃｏ葉緑体標的化シグナル（Ｋｈｏｕｄｉ，Ｈ．，Ｖｅｚｉｎａ，Ｌ．Ｐ．，Ｍｅｒｃｉｅｒ，Ｊ．，Ｃａｓｔｏｎｇｕａｙ，Ｙ．，Ａｌｌａｒｄ，Ｇ．，Ｌａｂｅｒｇｅ，Ｓ．、１９９７、Ｇｅｎｅ１９７：３４３〜３５１）、ＰｈａＧコード遺伝子、およびアルファルファｒｕｂｉｓｃｏ終結配列（Ｋｈｏｕｄｉ，Ｈ．，Ｖｅｚｉｎａ，Ｌ．Ｐ．，Ｍｅｒｃｉｅｒ，Ｊ．，Ｃａｓｔｏｎｇｕａｙ，Ｙ．，Ａｌｌａｒｄ，Ｇ．，Ｌａｂｅｒｇｅ，Ｓ．、１９９７、Ｇｅｎｅ１９７：３４３〜３５１）をコードする発現カセットと、その後に続く、アルファルファｒｕｂｉｓｃｏプロモーター、アルファルファｒｕｂｉｓｃｏ葉緑体標的化シグナル、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｏｇｉｎｏｓａ由来のＰｈａＣ１コード遺伝子（Ｔｉｍｍ，Ａ．およびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９２，２０９，１５〜３０）、およびアルファルファｒｕｂｉｓｃｏ終結配列をコードする発現カセットと、を含む。

プラスミドｐＢＩ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＰｈａＧ．Ｒｂｃ．ＰｈａＣ（図４Ｂ）は、植物形質転換ベクターであるｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の誘導体であり、３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター（Ｓｈｅｅｎ，Ｊ．ＥＭＢＯ１９９３，１２，３４９７〜３５０５）、エンドウマメｒｕｂｉｓｃｏ葉緑体標的化シグナル（エンドウマメｒｕｂｉｓｃｏタンパク質のＮ末端の２４アミノ酸をコードするＤＮＡを含む）（Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ａ．Ｒ．，１９８３、ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＰｌａｎｔｓ、Ｋｏｓｕｇｅ，Ｔ．，Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，Ｃ．Ｐ．およびＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ，Ａ．編（Ｐｌｅｎｕｍ，ＮｅｗＹｏｒｋ）、ｐ２９〜３８；Ｎａｗｒａｔｈ，Ｃ．，Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｙ．およびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｃ．，１９９４、ＰＮＡＳ．９１：１２７６０〜１２７６４）、およびＮｏｓ終結配列（Ｂｅｖａｎ，Ｍ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｃｈｉｌｔｏｎ，Ｍ．Ｄ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９８３，１１，３６９〜３８５）をコードする発現カセットと、その後に続く、アルファルファｒｕｂｉｓｃｏプロモーター、アルファルファｒｕｂｉｓｃｏ葉緑体標的化シグナル、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｏｇｉｎｏｓａ由来のＰｈａＣ１コード遺伝子、およびアルファルファｒｕｂｉｓｃｏ終結配列をコードする発現カセットと、を含む。

プラスミドを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１／ｐＭＰ９０（Ｋｏｎｚ，Ｃ．およびＳｃｈｅｌｌ，Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９８６，２０４，３８３〜３９６）を用いて、ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性花浸漬（ｆｌｏｒａｌｄｉｐ）手順（Ｃｌｏｕｇｈ，Ｓ．Ｊ．およびＢｅｎｔ，Ａ．Ｆ．、ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，１９９８，１６，７３５〜７４３）を使用して形質転換した。成熟長角果から種子を単離し、そしてその種子を、１／２×ムラシゲ最小有機培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、０．７％寒天、１×ガンボーグＢ５ビタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む選択培地上に、プレーティングした。７日後、カナマイシン選択耐性である緑色実生と、カナマイシン選択感受性である白色実生が、プレート上に出現した。この緑色実生を、土壌に移し、そして成熟させた。

ポリマー分析のために、成熟植物（約６週齢）由来の葉を、回収しそして凍結乾燥させた。乾燥組織（３０〜１５０ｍｇ）を挽いて、そしてヘキサンのアリコート（２〜５ｍＬ）を各チューブに添加した。サンプルを、時折ボルテックスに供しながら、７０℃にて４時間加熱した。ヘキサン画分を、遠心分離によって固形の細胞材料から分離し、そしてきれいなチューブに移した。チューブ中の残った細胞細片を、さらなるヘキサンのアリコート（１ｍＬ）で洗浄し、そしてこのヘキサン洗浄液を、先の工程由来のヘキサン画分と共にプールした。

このヘキサン画分を、１容量のＮａＨＣＯ_３の飽和溶液での抽出（２回）、その後の１容量のＨ_２Ｏでの抽出によって、さらに精製した。ヘキサン画分（フラクションＡ）を、フード中７０℃にて、エバポレートして乾燥させた。先の工程由来の炭酸水素塩溶液相を、プールし、ＨＣｌでｐＨ２までに酸性化し、１容量のヘキサンで抽出し、そして得られたヘキサン層（フラクションＢ）を、フード中７０℃にて、エバポレートして乾燥させた。

フラクションＡおよびＢ由来のサンプルならびに３−ヒドロキシアルカン酸標準（３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシドデカノエート）のサンプルを調製し、実施例２において先に記載したように、これらを対応するブチルエステルに変換することによって、ガスクロマトグラフィーで分析した。ｐＣａｍｂｉａ−Ｒｂｃ．ＰｈａＧ．ＰｈａＣ１で形質転換した６６個のトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物およびｐＢＩ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＰｈａＧ．Ｒｂｃ．ＰｈａＣで形質転換した９個のトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物から調製されたフラクションＡおよびＢのＧＣクロマトグラムは、微量のポリマーおよびモノマーのいずれをも含まなかった。ポリマーは、存在する場合、フラクションＡ中に予測され、一方、モノマーは、存在する場合、フラクションＢ中に予測された。ｐＢＩ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＰｈａＧ．Ｒｂｃ．ＰｈａＣで形質転換した１２個のトランスジェニック植物およびｐＣａｍｂｉａ−Ｒｂｃ．ＰｈａＧ．ＰｈａＣ１で形質転換した８個のトランスジェニック植物由来の葉のＲＴ−ＰＣＲを、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応のためのＰｒｏＳＴＡＲＨＦＳｉｎｇｌｅ−ＴｕｂｅＲＴ−ＰＣＲキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して行った。１２個のｐＢＩ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＰｈａＧ．Ｒｂｃ．ＰｈａＣ植物のうち４個が、ｐｈａＧおよびｐｈａＣの両方について予測されたサイズの転写物を含んだ（表２）。分析した８個のｐＣａｍｂｉａ−Ｒｂｃ．ＰｈａＧ．ＰｈａＣ１植物のうち、ｐｈａＧおよびｐｈａＣの両方について予測されたサイズの産物を含むのは０個であったが、いくつかの植物が、ｐｈａＧまたはｐｈａＣのいずれかの転写物を含んだ（表２）。
表２．コントロール植物由来のＲＮＡサンプルに対して行ったＲＴ−ＰＣＲ反応の結果

（実施例６：ＰｈａＧ、ＰｈａＣおよびＡｌｋＫを使用する葉の葉緑体または種子の色素体におけるＰＨＡ産生のための植物発現カセット）
ｐｈａＧおよびｐｈａＣのＲＮＡ転写物の首尾よい産生にもかかわらず、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａが葉緑体中でＰＨＡを産生し得ないことは、植物の葉緑体が、その葉緑体においてＰｈａＧが発現される場合に、３−ヒドロキシアシルＡＣＰ−ＣｏＡトランスフェラーゼ反応を首尾よく完了し得ないかもしれないことを示唆する。中間鎖長の３−ヒドロキシ酸に対して活性を有するアシルＣｏＡシンテターゼと共にＰｈａＧの３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を補充することは、ＰＨＡ合成のための３−ヒドロキシアシルＣｏＡの首尾よい形成を可能にし得る。

植物発現構築物ｐＵＣ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＴＳ．ＡｌｋＫにおけるａｌｋＫの配列を、配列番号１３に示す。配列「ｔｃｔａｇａ」（配列番号１４）および「ｇｇｔａｃｃ」（配列番号１５）は、クローニング目的のために導入される、それぞれ、ＸｂａＩ制限酵素部位およびＫｐｎＩ制限酵素部位である。開始コドン「ＡＴＧ」および終止コドン「ＴＧＡ」を、大文字で示す。ＰＣＲ産物で観察された２つの配列の差を、太字のイタリックの大文字で示す。プラスミドｐＵＣ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＴＳ．ＡｌｋＫを開始プラスミドとして使用して、ａｌｋＫを含む他の植物発現構築物を作製した。

葉の葉緑体におけるＰＨＡ産生のために、プラスミドｐＣａｍｂｉａ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＴＳ．ＰｈａＧ．ＴＳ．ＡｌｋＫ．ＴＳ．ＰｈａＣ_Ｐ．ｏ．（図５Ａ）を設計した。プラスミドｐＣａｍｂｉａ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＴＳ．ＰｈａＧ．ＴＳ．ＡｌｋＫ．ＴＳ．ＰｈａＣ_Ｐ．ｏ．は、以下を含む：３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター、エンドウｒｕｂｉｓｃｏ葉緑体標的化シグナル（エンドウｒｕｂｉｓｃｏタンパク質のＮ末端２４アミノ酸をコードするＤＮＡを含む）、ＰｈａＧをコードするフラグメント、Ｎｏｓ終結配列、３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター、エンドウｒｕｂｉｓｃｏ葉緑体標的化シグナル（エンドウｒｕｂｉｓｃｏタンパク質のＮ末端２４アミノ酸をコードするＤＮＡを含む）、ＡｌｋＫをコードするフラグメント、Ｎｏｓ終結配列、３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター、エンドウｒｕｂｉｓｃｏ葉緑体標的化シグナル（エンドウｒｕｂｉｓｃｏタンパク質のＮ末端２４アミノ酸をコードするＤＮＡを含む）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のＰｈａＣをコードするフラグメントおよびＮｏｓ終結配列。

プラスミドｐＣａｍｂｉａ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＴＳ．ＰｈａＧ．ＴＳ．ＡｌｋＫ．ＴＳ．ＰｈａＣ_Ｐ．ｏ．を、実施例５において先に記載されるように、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに形質転換し得るか、または以下の手順に記載されるように、Ｔｏｂａｃｃｏに形質転換し得る。無菌条件下での層流中で、タバコ植物由来の葉を、１０％ブリーチおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の溶液を含む１リットルのビーカー中で１５分間滅菌する。滅菌した葉を、１リットルの水中で１０分間洗浄し、そして水をデカントし、そしてこの洗浄工程をさらに２回繰り返す。葉のインタクトな部分を、小刀で小片に切断し、葉の任意の損傷領域を排除する。ＭＳ懸濁液のアリコート（２０ｍＬ）を、形質転換される構築物を保持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１／ｐＭＰ９０（Ｋｏｎｚ，Ｃ．およびＳｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９８６，２０４，３８３−３９６）の５ｍＬの一晩培養物と混合する［ＭＳ懸濁液は、（１Ｌあたり）４．３ｇのＭＳ塩、１ｍＬのＢ５ビタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、３０ｇのスクロース、２ｍｇのｐ−クロロフェノキシ酢酸、および０．０５ｍｇのキネチンを含む（ｐＨ５．８）］。タバコの葉の小片を、この溶液に導入し、そして数秒ボルテックスする。葉を取り出し、滅菌濾紙で拭き取り、そしてペトリ皿に置いて過剰のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ溶液を除去する。タバコ細胞培養物のアリコート（１ｍＬ）を、ペトリ皿中の凝固ＭＳ−１０４の培地の表面に添加し、滅菌した濾紙の小片を、その培養物の表面上に直接置く［ＭＳ−１０４培地（ｐＨ５．８）は、（１Ｌあたり）４．３ｇのＭＳ塩、１ｍＬのＢ５ビタミン、３０ｇのスクロース、１ｍｇのベンジルアミノプリン、０．１ｍｇのナフタレン酢酸、および８ｇのフィトアガー（ｐｈｙｔａｇａｒ）を含む］。これらのタバコの葉の小片を、濾紙の表面上に置き、そして２５℃で２日間インキュベートする。葉の小片を、表面を表にして、ＭＳ選択培地を含むペトリ皿に移し、そして培地内に穏やかに押し込む［ＭＳ選択培地（ｐＨ５．８）は、（１Ｌあたり）４．３ｇのＭＳ塩、１ｍＬのＢ５ビタミン、３０ｇのスクロース、１ｍｇのベンジルアミノプリン、０．１ｍｇのナフタレン酢酸、５００ｍｇのカルベニシリン、５０ｍｇのカナマイシン、および６．５ｇのフィトアガーを含む］。皿をパラフィルムでラップし、２５℃で３週間インキュベートする。葉を、新鮮なＭＳ選択培地に移し、そして２５℃でのインキュベーションを、小植物（ｐｌａｎｔｌｅｔ）が現れるまで継続する。小植物をカルスから分離し、そして１０ｍＬのＭＳ発根培地を含む試験管（２４×３ｃｍ）に置く［ＭＳ発根培地（ｐＨ５．８）は、（１Ｌあたり）４．３ｇのＭＳ塩、１ｍＬのＢ５ビタミン、３０ｇのスクロース、および６．５ｇのフィトアガーを含む］。根が１ｃｍの長さに達した場合、その形質転換した植物を、土に移し、そして逆さにした透明なプラスチックカップ（底に穴を開けておく）でカバーする。４日後または５日後に、カップを取り外し、そして形質転換したタバコ植物を、ＰｅｒｃｉｖａｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ成長チャンバ中で成長させた（２３℃、７０％湿度、１６時間（明）、８時間（暗））。トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物について実施例５において先に記載した抽出手順を使用して、ポリマーについて分析し得る。

種子特異的な、色素体に基づくＰＨＡ産生のために、以下を含むプラスミドを構築し得る（図６Ａ）：種子特異的プロモーター、ＰｈａＧに融合された色素体標的化シグナル、ポリアデニル化シグナル、種子特異的プロモーター、ＡｌｋＫに融合された色素体標的化シグナル、ポリアデニル化シグナル、種子特異的プロモーター、ＰｈａＣに融合された色素体標的化シグナル、ポリアデニル化シグナル。以下のような種子特異的プロモーターが、種子特異的な、色素体に基づくＰＨＡ産生構築物を構築するために、有用である：ナピン（ｎａｐｉｎ）遺伝子プロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号；米国特許第５，６０８，１５２号）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼプロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号；米国特許第５，６０８，１５２号）、２Ｓアルブミンプロモーター、種子貯蔵タンパク質プロモーター、ファゼオリンプロモーター（Ｓｌｉｇｈｔｏｍら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８０：１８９７−１９０１）、オレオシンプロモーター（ｐｌａｎｔら、１９９４、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：１９３−２０５；Ｒｏｗｌｅｙら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３４５：１−４；米国特許第５，６５０，５５４号；ＰＣＴＷＯ９３／２０２１６）、ゼインプロモーター、グルテリンプロモーター、デンプンシンターゼプロモーター、デンプン分枝化酵素プロモーターなど。

種子特異的な、色素体に基づくＰＨＡ産生構築物を、実施例５に記載されるように、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに形質転換し得る。あるいは、この構築物を、以下の手順を（ＭｏｌｏｎｅｙＭ．Ｍ．、ＷａｌｋｅｒＪ．Ｍ．、ＳｈａｒｍａＫ．Ｋ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ、１９８９、８、２３８−２４２）を使用して、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓに形質転換し得る。Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓｃｖ．Ｗｅｓｔａｒの種子を、１０％の市販のブリーチ（Ｊａｖｅｘ，Ｃｏｌｇａｔｅ−ＰａｌｍｏｌｉｖｅＣａｎａｄａＩｎｃ．）中で、３０分間、ゆっくりと振盪しながら、浮遊させて滅菌する。種子を、滅菌蒸留水中で３回洗浄する。種子を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）塩およびビタミン、３％スクロースおよび０．７％フィトアガーを含む発芽培地（ｐＨ５．８）に、１プレートあたり２０個の密度で置き、そして６０〜８０μＥｍ^−２ｓ^−１の光強度での１６時間の明／８時間の暗の光周期に、２４℃にて４〜５日間維持する。構築物を、エレクトロポレーションを使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＥＨＡ１０１（ＨｏｏｄＥＥ、ＨｅｌｍｅｒＧＬ、ＦｒａｌｅｙＲ．Ｔ．、ＣｈｉｌｔｏｎＭ．Ｄ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８６、１６８、１２９１−１３０１）に導入する。子葉の葉柄の形質転換の前に、各構築物を有する株ＥＨＡ１０１の単一コロニーを、５ｍＬの最小培地（形質転換ベクターについての適切な選択抗生物質を補充した）中で、２８℃にて４８時間成長させる。１ｍＬの細菌懸濁物を、微量遠心管における１分間の遠心分離によってペレット化する。ペレットを、１ｍＬの最小培地中に再懸濁する。

形質転換のために、子葉を、その基部に約２ｍｍの葉柄を含むように、４〜５週齢の実生から切り取る。それらの葉柄の切断表面を有する個々の子葉を、希釈細菌懸濁物に１秒間浸し、そして即座に、共培養培地（２０μＭのベンジルアデニンを補充した、３％スクロースおよび０．７％フィトアガーを含むＭＳ培地）中に約２ｍｍの深さに包埋する。播種した子葉を、１プレートあたり１０個の密度でプレートし、そして同じ成長条件下で４８時間インキュベートする。共培養後、子葉を、３％スクロース、２０μＭベンジルアデニン、０．７％フィトアガー（ｐＨ５．８）、３００ｍｇ／Ｌチメンチニン（ｔｉｍｅｎｔｉｎｉｎ）および植物形質転換ベクターの選択のための適切な抗生物質を補充したＭＳ培地を含む、再生培地に移す。

２〜３週間後、再生苗条を得て、切断し、そしてＭａｇｅｎｔａジャー中の「苗条伸長」培地（３％スクロース、３００ｍｇ／Ｌチメンチニン、０．７％
フィトアガーおよび適切な抗生物質を含むＭＳ培地）に維持する。伸長した苗条を、「発根」培地（ＭＳ培地、３％スクロース、２ｍｇ／Ｌインドール酪酸、０．７％フィトアガーおよび５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含む）に移す。根の発生後、小植物を、栽培用ミックス（ＲｅｄｉＥａｒｔｈ，Ｗ．Ｒ．ＧｒａｃｅａｎｄＣｏ．ＣａｎａｄａＬｔｄ．）に移した。植物を、同じ成長条件下で霧チャンバ（７５％相対湿度）中で維持する。

（実施例７：ＰｈａＧ、ＰｈａＣおよびＡｌｋＫを使用する葉または種子の細胞質ゾルにおけるＰＨＡ産生のための植物発現カセット）
葉緑体または色素体における３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼ活性の発現は、３−ヒドロキシ脂肪酸を産生する脂肪酸生合成からの炭素の流れを導くはずである。葉緑体および色素体は、通常、３−ヒドロキシ脂肪酸を蓄積しないので、これらの分子は、オルガネラから搬出され、そしてトリアシルグリセリドに組み込まれるか、またはペルオキシソームに輸送されて分解されるかの、いずれかであるはずである。脂肪種子穀物の種子におけるトリアシルグリセリドへの中間鎖長の３−ヒドロキシ酸の組み込みは、新規な種子脂肪を産生する。細胞質ゾルアシルＣｏＡシンテターゼおよび細胞質ゾルＰＨＡシンターゼの存在は、細胞質ゾル中の中鎖３−ヒドロキシ脂肪酸を中間鎖長のＰＨＡに変換し得る。

プラスミドｐＣａｍｂｉａ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＴＳ．ＰｈａＧ．ＡｌｋＫ．ＰｈａＣ_Ｐ．ｏ．（図５Ｂ）は、細胞質ゾルＰＨＡ産生のために設計された植物形質転換ベクターである。これは、葉緑体におけるＰｈａＧの葉特異的発現のための配列、および細胞質ゾルにおけるＡｌｋＫおよびＰｈａＣの葉特異的発現のための配列をコードする。プラスミドｐＣａｍｂｉａ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＴＳ．ＰｈａＧ．ＡｌｋＫ．ＰｈａＣ_Ｐ．ｏ．は、以下を含む：３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター、エンドウｒｕｂｉｓｃｏ葉緑体標的化シグナル（エンドウｒｕｂｉｓｃｏタンパク質のＮ末端２４アミノ酸をコードするＤＮＡを含む）、ＰｈａＧをコードするフラグメント、Ｎｏｓ終結配列、３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター、ＡｌｋＫをコードするフラグメント、Ｎｏｓ終結配列、３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のＰｈａＣをコードするフラグメントおよびＮｏｓ終結配列。プラスミドｐＣａｍｂｉａ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＴＳ．ＰｈａＧ．ＡｌｋＫ．ＰｈａＣ_Ｐ．ｏ．を、先の実施例に記載されるように、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓまたはＴｏｂａｃｃｏに形質転換し得る。

種子特異的な、細胞質ゾルＰＨＡ産生のために、以下を含むプラスミドを構築し得る（図６Ｂ）：種子特異的プロモーター、ＰｈａＧに融合された色素体標的化シグナル、ポリアデニル化シグナル、種子特異的プロモーター、ＡｌｋＫをコードするフラグメント、ポリアデニル化シグナル、種子特異的プロモーター、ＰｈａＣをコードするフラグメントおよびポリアデニル化シグナル。種子特異的な、細胞質ゾルＰＨＡ産生構築物を、先の実施例に記載したように、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓまたは脂肪種子穀物（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）中に形質転換し得る。

（実施例８：ＰｈａＧ、ＰｈａＣおよびＡｌｋＫを用いる、葉または種子のペルオキシソームにおけるＰＨＡ産生のための植物発現カセット）
葉緑体または色素体から搬出された中間鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸の一部分は、分解のためにペルオキシソーム中に進入し得るので、アシルＣｏＡシンテターゼおよびＰＨＡシンターゼの葉または種子のペルオキシソームへの標的化は、ＰＨＡを生じ得る。プラスミドｐＣａｍｂｉａ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＴＳ．ＰｈａＧ．ＡｌｋＫ．ｐｅｒｏｘ．ＰｈａＣ_ｐ．ｏ．ｐｅｒｏｘ（図５Ｂ）は、葉に基づくペルオキシソームＰＨＡ蓄積について設計された植物形質転換ベクターである。この構築物は、以下を含む：３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター、エンドウｒｕｂｉｓｃｏ葉緑体標的化シグナル（エンドウｒｕｂｉｓｃｏタンパク質のＮ末端２４アミノ酸をコードするＤＮＡを含む）、ＰｈａＧをコードするフラグメント、Ｎｏｓ終結配列、３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター、ＡｌｋＫ（ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓイソシトレートリアーゼのＣ末端３４アミノ酸から構成されるＣ末端ペルオキシソーム標的化シグナル（Ｏｌｓｅｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｗ．Ｆ．，Ｄａｍｓｚ，Ｂ．，Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｋ．，Ｗｅｂｂ，Ｍ．Ａ．，Ｈａｒａｄａ，Ｊ．Ｊ．１９９３，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，５，９４１−９５２）に融合される）をコードするフラグメント、Ｎｏｓ終結配列、３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓに由来するＰｈａＣ（ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓイソシトレートリアーゼのＣ末端３４アミノ酸から構成されるＣ末端ペルオキシソーム標的化シグナルに融合された）をコードするフラグメント、およびＮｏｓ終結配列。プラスミドｐＣａｍｂｉａ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＴＳ．ＰｈａＧ．ＡｌｋＫ．ｐｅｒｏｘ．ＰｈａＣ_ｐ．ｏ．ｐｅｒｏｘを、先の実施例に記載するように、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓまたはＴｏｂａｃｃｏ中に形質転換し得る。

種子特異的な、ペルオキシソームＰＨＡ産生のために、以下を含むプラスミドを構築し得る（図６Ｃ）：種子特異的プロモーター、ＰｈａＧに融合された色素体標的化シグナル、ポリアデニル化シグナル、種子特異的プロモーター、ペルオキシソーム標的化シグナルに融合されたＡｌｋＫをコードするフラグメント、ポリアデニル化シグナル、種子特異的プロモーター、ペルオキシソーム標的化シグナルに融合されたＰｈａＣをコードするフラグメントおよびポリアデニル化シグナル。種子特異的な、ペルオキシソームＰＨＡ産生構築物を、先の実施例に記載したように、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓまたは脂肪種子穀物（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）中に形質転換し得る。

（実施例９：短い鎖長および中間鎖長のモノマーユニットから構成されるコポリマーの産生）
ポリヒドロキシブチレートおよび中間鎖長のモノマーユニットから構成されるコポリマーを、細菌または植物において、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡおよび中間鎖長の３−ヒドロキシアシルＣｏＡ形成のための経路を同時発現させることよって産生し得る（図１）。短い鎖長のモノマーユニット形成のために、β−ケトチオラーゼ（ｐｈａＡ）およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ｐｈａＢ）からなる経路は、２ユニットのアセチルＣｏＡをＲ−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換する（図１）。中間鎖長のモノマーユニットを形成するために、３−ヒドロキシアシルＡＣＰ−チオエステラーゼ（例えば、ＰｈａＧ）およびアシルＣｏＡシンテターゼ（例えば、ＡｌｋＫ）からなる経路は、脂肪酸生合成に由来する中間鎖長の３−ヒドロキシアシルＡＣＰを、３−ヒドロキシアシルＣｏＡに転換する（図１）。短いかまたは中間鎖長のモノマーユニットのコポリマーへの重合は、広範な基質特異性を有するＰＨＡシンターゼ（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．Ａ３３（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５，４２，９０１−９０９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．６１−３（Ｋａｔｏ，Ｍ．，Ｂａｏ，Ｈ．Ｊ．，Ｋａｎｇ，Ｃ．−Ｋ，Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．，Ｄｏｉ，Ｙ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６，４５，３６３−３７０）またはＴｈｉｏｃａｐｓａｐｆｅｎｎｉｇｉｉ（米国特許第６，０１１，１４４号）由来のシンターゼ）を用いて達成される。

ＰＨＢおよび中間鎖長のモノマーユニットから構成されるコポリマーを、葉の葉緑体または種子の色素体において生産するために、β−ケトチオラーゼ（ｐｈａＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ｐｈａＢ）、広範な基質特異性を有するＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）、３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼおよびアシルＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子を、葉緑体または色素体の標的化シグナルに融合し、ポリマー産生のために、これらのポリペプチドを葉緑体または色素体に指向させる。

ＰＨＢおよび中間鎖長のモノマーユニットから構成されるコポリマーを、葉または種子の細胞質ゾルにおいて生産するために、３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする導入遺伝子を、葉緑体または色素体の標的化シグナルに融合し、このポリペプチドを、葉緑体または色素体に指向させる。全ての他のポリペプチド（β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、広範な基質特異性ＰＨＡシンターゼおよびアシルＣｏＡシンテターゼを含む）を細胞質ゾルに標的化し、細胞質ゾル中にポリマー蓄積を得る。

ＰＨＢおよび中間鎖長のモノマーユニットから構成されるコポリマーを、葉または種子のペルオキシソームにおいて生産するために、３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする導入遺伝子を、葉緑体または色素体の標的化シグナルに融合し、このポリペプチドを、葉緑体または色素体に指向させる。全ての他のポリペプチド（β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、広範な基質特異性ＰＨＡシンターゼおよびアシルＣｏＡシンターゼを含む）を、ペルオキシソーム標的化シグナルに融合し、ポリマー生産のために、これらのポリペプチドをペルオキシソームに指向させる。

図１は、脂肪酸生合成からの、中間鎖長のポリヒドロキシアルカノエート形成ならびに短い鎖長および中間鎖長のポリヒドロキシアルカノエートコポリマー形成について提唱される経路である。図２は、ＤＨ５α／ｐＴＲＣＮａｌｋＫ株およびＤＨ５α／ｐＴＲＣＮ株から調製した粗抽出物における、オクタン酸の存在下での、ＣｏＡの消費を経時的に示すグラフである。図３は、ＤＨ５α／ＴＲＣＮａｌｋＫ株およびＤＨ５α／ｐＴＲＣＮ株から調製した粗抽出物における、３−ヒドロキシオクタン酸の存在下での、ＣｏＡの消費を経時的に示すグラフである。図４Ａは、ｐＣａｍｂｉａ−Ｒｂｃ．ＰｈａＧ．ＰｈａＣにおける挿入地図を示す。ｐＣａｍｂｉａ−Ｒｂｃ．ＰｈａＧ．ＰｈａＣは、アルファルファ葉緑体標的化シグナルに融合されたａｌｆａｌｆａｒｕｂｉｓｃｏプロモーター、ＰｈａＧをコードするフラグメント、ａｌｆａｌｆａｒｕｂｉｓｃｏ終止配列をコードするフラグメント、アルファルファ葉緑体標的化シグナルに融合されたａｌｆａｌｆａｒｕｂｉｓｃｏプロモーター、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｏｇｉｎｏｓａ由来のＰｈａＣをコードするフラグメント、およびａｌｆａｌｆａｒｕｂｉｓｃｏ終止配列をコードするフラグメントを含む。図４Ｂは、ｐＢＩ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＰｈａＧ．Ｒｂｃ．ＰｈａＣにおける挿入地図を示す。このｐＢＩ−Ｃ４ＰＰＤＫ．ＰｈａＧ．Ｒｂｃ．ＰｈａＣは、３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター、ｐｅａｒｕｂｉｓｃｏタンパク質のＮ−末端の２４アミノ酸をコードするＤＮＡを含むｐｅａｒｕｂｉｓｃｏ葉緑体標的化シグナル、ＰｈａＧをコードするフラグメント、Ｎｏｓ終止配列、アルファルファ葉緑体標的化シグナルに融合されたａｌｆａｌｆａｒｕｂｉｓｃｏプロモーター、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｏｇｉｎｏｓａ由来のＰｈａＣをコードするフラグメント、およびａｌｆａｌｆａｒｕｂｉｓｃｏ終止配列をコードするフラグメントを含む。図５Ａは、葉の葉緑体におけるポリマーの蓄積のためのｐｈａＧ、ａｌｋＫおよびｐｈａＣの葉特異的発現のための、植物形質転換ベクターにおける挿入地図である。図５Ｂは、葉の細胞質ゾルにおけるポリマーの蓄積のためのｐｈａＧ、ａｌｋＫおよびｐｈａＣの葉特異的発現のための、植物形質転換ベクターにおける挿入地図である。図５Ｃは、葉のペルオキシソームにおけるポリマーの蓄積のためのｐｈａＧ、ａｌｋＫおよびｐｈａＣの葉特異的発現のための、植物形質転換ベクターにおける挿入地図である。図６Ａは、種子の色素体におけるポリマーの蓄積のためのｐｈａＧ、ａｌｋＫおよびｐｈａＣの種子特異的発現のための、植物形質転換ベクターにおける挿入地図である。図６Ｂは、種子の細胞質ゾルにおけるポリマーの蓄積のためのｐｈａＧ、ａｌｋＫおよびｐｈａＣの種子特異的発現のための、植物形質転換ベクターにおける挿入地図である。図６Ｃは、種子のペルオキシソームにおけるポリマーの蓄積のためのｐｈａＧ、ａｌｋＫおよびｐｈａＣの種子特異的発現のための、植物形質転換ベクターにおける挿入地図である。

Claims

３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を有する生物を選択するための方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）候補生物において導入遺伝子を導入し、共発現させる工程であって、該導入遺伝子は、該候補生物に対して異種性であり、そして該導入された導入遺伝子は、（ｉ）ＰＨＡシンターゼ酵素および（ｉｉ）３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ酵素または３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素のいずれかをコードする、工程、ならびに
ｂ）中鎖ＰＨＡの産生に適切な条件下で該候補生物を成長させる工程であって、該ＰＨＡの産生は、該生物が３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を有することを示す、工程
を包含する、方法。
前記生物が、導入遺伝子をさらに発現し、そして該導入遺伝子が３−ヒドロキシアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする否かを決定する、請求項１に記載の方法。
前記生物が、植物細胞、植物組織または植物全体である、請求項１または２に記載の方法。
前記生物が、植物細胞、植物組織または植物全体であり、そして前記導入遺伝子の発現が、種子、葉、色素体およびペルオキシソームからなる群より選択される組織またはオルガネラに標的化される、請求項３に記載の方法。
前記生物が細菌である、請求項１または２に記載の方法。
前記細菌が、Ｅ．ｃｏｌｉであり、ＰＨＡが該細菌内で蓄積する、請求項５に記載の方法。
前記生物が細菌である、請求項２に記載の方法。
前記３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼがａｌｋＫである、請求項１に記載の方法。
前記生物が、選択マーカー遺伝子をさらに発現する、請求項１に記載の方法。