PL180565B1 - Sposób wytwarzaniai wydzielania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA) PL PL - Google Patents
Sposób wytwarzaniai wydzielania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA) PL PLInfo
- Publication number
- PL180565B1 PL180565B1 PL94312747A PL31274794A PL180565B1 PL 180565 B1 PL180565 B1 PL 180565B1 PL 94312747 A PL94312747 A PL 94312747A PL 31274794 A PL31274794 A PL 31274794A PL 180565 B1 PL180565 B1 PL 180565B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- adca
- gene
- carboxyethylthio
- propionyl
- chrysogenum
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title description 7
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 claims abstract description 45
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 101710104123 Deacetoxycephalosporin C synthase Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 8
- -1 carboxyethylthio Chemical group 0.000 claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 241000187390 Amycolatopsis lactamdurans Species 0.000 claims description 12
- 241000187433 Streptomyces clavuligerus Species 0.000 claims description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- ODJQKYXPKWQWNK-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Thiobispropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCSCCC(O)=O ODJQKYXPKWQWNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 7beta-aminodeacetoxycephalosporanic acid Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@@H]12 NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 0.000 abstract 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 101150091913 cefE gene Proteins 0.000 description 40
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 37
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 17
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 11
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 6
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 6
- 101150073906 gpdA gene Proteins 0.000 description 6
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 6
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 6
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 5
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 101150069003 amdS gene Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 4
- 101150095733 gpsA gene Proteins 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 210000002500 microbody Anatomy 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 101150022041 penDE gene Proteins 0.000 description 4
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589746 Pseudomonas sp. SE83 Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 101150097026 facA gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 3
- HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 7beta-aminocephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H]12 HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 0.000 description 2
- 241000228431 Acremonium chrysogenum Species 0.000 description 2
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N Cephalosporin C Natural products S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 2
- 240000002228 Cynara humilis Species 0.000 description 2
- 235000005921 Cynara humilis Nutrition 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N L-2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- JLTDJTHDQAWBAV-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylaniline Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=C1 JLTDJTHDQAWBAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-M cephalosporin C(1-) Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-M 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N chlorotrimethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)Cl IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 description 2
- UHZYTMXLRWXGPK-UHFFFAOYSA-N phosphorus pentachloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)(Cl)Cl UHZYTMXLRWXGPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000006049 ring expansion reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- KFYRPLNVJVHZGT-UHFFFAOYSA-N Amitriptyline hydrochloride Chemical compound Cl.C1CC2=CC=CC=C2C(=CCCN(C)C)C2=CC=CC=C21 KFYRPLNVJVHZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100000858 Caenorhabditis elegans act-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 241001670157 Gymnura Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- MIFYHUACUWQUKT-UHFFFAOYSA-N Isopenicillin N Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(NC(=O)CCCC(N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000713102 Mus musculus C-C motif chemokine 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000284696 Penicillium rubens Wisconsin 54-1255 Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000424942 Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 Species 0.000 description 1
- 108010018161 UlTma DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- JSYGRUBHOCKMGQ-UHFFFAOYSA-N dichloramine Chemical group ClNCl JSYGRUBHOCKMGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- YVSCCMNRWFOKDU-UHFFFAOYSA-N hexanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O.OC(=O)CCCCC(O)=O YVSCCMNRWFOKDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 101150029559 hph gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- MIFYHUACUWQUKT-GTQWGBSQSA-N isopenicillin N Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H](NC(=O)CCC[C@H](N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-GTQWGBSQSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- KINULKKPVJYRON-PVNXHVEDSA-N n-[(e)-[10-[(e)-(4,5-dihydro-1h-imidazol-2-ylhydrazinylidene)methyl]anthracen-9-yl]methylideneamino]-4,5-dihydro-1h-imidazol-2-amine;hydron;dichloride Chemical group Cl.Cl.N1CCN=C1N\N=C\C(C1=CC=CC=C11)=C(C=CC=C2)C2=C1\C=N\NC1=NCCN1 KINULKKPVJYRON-PVNXHVEDSA-N 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical class [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 230000001550 time effect Effects 0.000 description 1
- 239000005051 trimethylchlorosilane Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania i wydzielania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA), znamienny tym, ze a) transformuje sie szczep Penicillium chrysogenum genem ekspandazy pod transkry- pcyjna i translacyjna kontrola pedzlakowych sygnalów ekspresji; b) przeprowadza sie fermentacje tego szczepu w osrodku hodowli i dodaje sie do tego osrodka hodowli kwas 3,3'-tiodipropionowy albo jego sól lub ester uzyskujac kwas 3-(karbo- ksyetylotio) propionylo-6-aminopenicylanowy (3-(karboksyetylotio) propionylo-6-APA), który zostaje powiekszony in situ do 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA; c) wydziela sie 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA z bulionu fermentacyjnego; d) odacylowuje sie 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA; oraz e) wydziela sie krystaliczny 7-ADCA. PL PL
Description
Dziedzina wynalazku i krótki opis stanu techniki
Przedmiotem wynalazku jest biosyntetyczny sposób wytwarzania i wydzielania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7 -ADCA).
Antybiotyki β-laktamowe stanowią najważniejszą grupę związków antybiotykowych, o długiej historii zastosowania klinicznego. W grupie tej do najważniejszych należą penicyliny i cefalosporyny. Związki te są wytwarzane w przyrodzie przez pędzlaki, odpowiednio Penicillium chrysogenum i Acremonium chrysogenum.
Dzięki klasycznym technikom usprawniania szczepów poziomy wytwarzania antybiotyków przez Penicillium chrysogenum i Acremonium chrysogenum zdecydowanie wzrosły w ostatnich dziesięcioleciach. Wraz ze wzrostem wiedzy o drogach biologicznych prowadzących do penicylin i cefalosporin oraz opanowaniem technologii zrekombinowanego DNA dostępne stały się nowe narzędzia poprawy wydajności szczepów i derywatyzacji związków in vivo.
Zidentyfikowano większość enzymów biorących udział w biosyntezie β-laktamów, a ich odpowiednie geny zostały sklonowane; patrz np. Ingolia i Queener, Med. Rs. Rev. 9 (1989), 245-264 (przebieg biosyntezy i enzymy) oraz Aharonowitz, Cohen i Martin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461-495 (klonowanie genów).
Pierwsze dwa etapy biosyntezy penicyliny w P. chrysogenum stanowi kondensacja 3 aminokwasów, kwasu L-5-amino-5-karboksypentanowego (kwasu L-a-aminoadypinowego) (A), L-cysteiny (C) i L-waliny (V) do tripeptydu LLD-ACV, a następnie cyklizacja tripeptydu z utworzeniem izopenicyliny N. Związek ten zawiera typową strukturę β-laktamu.
Trzeci etap obejmuje wymianę hydrofilowego łańcucha bocznego kwasu L-5-amino-5-karboksypentanowego na hydrofobowy łańcuch boczny w wyniku działania enzymu acylotransferazy (AT). W przemysłowym procesie wytwarzania penicyliny G wybranym łańcu180 565 chem bocznym jest kwas fenylooctowy (PA), w EP-A-0532341 ujawniono zastosowanie adypinianu (5-karboksypentanianu) jako surowca. Wprowadzenie tego substratu prowadzi do pochodnej penicyliny z 5-karboksypentanoilowym łańcuchem bocznym, czyli do kwasu
5-karboksypentanoilo-6-aminopenicylanowego. Takie wbudowywanie jest możliwe dzięki temu, że, jak to stwierdzono. acylotransferaza wykazuje specyficzność względem wielu substratów (Behrens i inni. J. Biol. Chem. 175 (1948). 751-809; Cole, Process Biochem. 1 (1966), 334-338; Ballio i inni, Nature 185 (1960), 97-99). Enzymatyczna reakcja wymiany z udziałem AT przebiega wewnątrz organelli komórkowych, w mikrociele, jak to opisano w EP-A-0448180.
Cefalosporyny sąo wiele droższe od penicylin. Jednym z powodów jest to, że cefalosporyny (np. cefaleksyna) wytwarza się z penicylin w wyniku szeregu przemian chemicznych. Innym powodem jest to, że jak dotychczas poddawać można fermentacji tylko cefalosporyny z bocznym łańcuchem D-5-amino-5-karboksypentanoilowym. Cefalosporyna C, zdecydowanie najważniejszy materiał wyjściowy stosowany w tym celu dobrze rozpuszcza się w wodzie w pełnym zakresie pH, co wymusza stosowanie długotrwałych i kosztownych sposobów wydzielania z wykorzystaniem skomplikowanej i kosztownej techniki kolumnowej. Uzyskana w ten sposób cefalosporyna C musi być przekształcona w terapeutycznie przydatne cefalosporyny na drodze szeregu przemian chemicznych i enzymatycznych.
Półprodukt 7-ADCA wytwarza się obecnie na drodze chemicznej derywatyzacji penicyliny G. Niezbędne etapy procesu wytwarzania 7-ADCA obejmujapowiększenie 5-członowej struktury pierścieniowej penicyliny do 6-członowej struktury pierścieniowej cefalosporyny. Enzym ekspandaza z bakterii włóknistych Streptomyces clavuligerus może przeprowadzić takie powiększenie pierścienia. Po wprowadzeniu do P. chrysogenum może on przekształcić strukturę pierścienia penicyliny w strukturę pierścienia cefalosporyny, jak to zastosowano opisane przez Cantwella i innych, Proc. R. Soc. Lond. B. 248 (1992), 283-289 oraz w EP-A-0532341 i EP-A-0540210. Zarówno enzym ekspandaza, jak i odpowiadający mu gen, zostały dobrze scharakteryzowane (EP-A-0366354), zarówno biochemicznie jak i funkcjonalnie. Przedstawiono zarówno mapy fizyczne genu cefE (EP-A-0233715) jaki sekfencję DNA oraz badania transformacji P chrysogenum za pomocą cefE.
Innym źródłem odpowiedniego enzymu powiększającego pierścień jest bakteria włóknista Nocardia lactamdurans (poprzednio Streptomyces lactamdurans). Opisano zarówno własności biochemiczne enzymu jak i sekwencję DNA genu (odpowiednio Cortes i inni, J. Gen. Mikrobiol. 133 (1987), 3165-3174; oraz Coque i inni, Mol. Gen. Genet. 236 (1993), 453-458).
W szczególności w EP-A-0532341 ujawniono zastosowanie in vivo enzymu ekspandazy w P. chrysogenum w kombinacji z bocznym łańcuchem 5-karboksypentanoilowym jako surowcem stosowanym jako substrat dla enzymu acylotransferazy w P. chryzogenum. Prowadzi to do powstania 5-karboksypentanoilo-6-APA, który przekształcany jest przez enzym ekspandazę wprowadzony do szczepu P. chryzogenum, w 5-karboksypentanoilo-7-ADCA. Na koniec sugeruje się usuwanie bocznego łańcucha 5-karboksypentanoilowego, tak że uzyskuje się jako produkt końcowy 7-ADCA. W zgłoszeniu patentowym EP-A-0540210 opisano podobny sposób wytwarzania 7-ACA, obejmujący dodatkowe etapy przekształcania bocznego łańcucha 3-metylowego przy pierścieniu ADCA w boczny łańcuch 3-acetoksymetylowy występujący w ACA.
Jednakże wyżej wspomniane zgłoszenia patentowe nie ujawniają wydajnego i ekonomicznie opłacalnego sposobu, gdyż przede wszystkim nie został rozwiązany problem czasowy ekspresji enzymu ekspandazy w komórce współtowarzyszący ekspresji enzymu acylotransferazy.
W przeciwieństwie do powyższego niniejszy wynalazek dostarcza wydajnego sposobu wytwarzania 7-ADCA, w przypadku którego ekspresja ekspandazy i acylotransferazy przebiega równocześnie.
Na dodatek wynalazek dotyczy zastosowania nowego prekursora łańcucha bocznego, a mianowicie kwasu 3,3'-tiodipropionowego. Prekursor ten jest z dużą wydajnością wprowadzany przez P. chrysogenum do odpowiednich penicylin, które mają być następnie powiększane w wyniku działania enzymu ekspandazy.
180:565
Ponadto dotychczas nie opisano wydajnego sposobu wydzielania pochodnej 7-ADCA z bulionu fermentacyjnego przed jej odacylowaniem. Wynalazek dostarcza wydajnego sposobu ekstrakcji rozpuszczalnikiem stosowanego do wydzielania pochodnej 7-ADCA.
Wynalazek dostarcza rzeczywistego sposobu wydajnego wytwarzania 7-ADCA, obejmującego etapy reakcji nie ujawnione ani nie sugerowane w znanych rozwiązaniach.
Ponadto wykorzystując wynalazek i w sposób analogiczny do opisu podanego w EP-A-0540210 wytwarzać można 7-ACA z dużą ogólną wydajnością.
Krótki opis rysunków
Figura 1: Mapa funkcyjna plazmidu pMcTNE. Figura 2: Mapa funkcyjna plazmidu pMcTSE. Figura 3 : Mapa funkcyjna plazmidu pMcTNde. Figura 4: Mapa funkcyjna plazmidu p GNETA. Figura 5: Mapa funkcyjna plazmidu pGSETA. Figura 6: Mapa funkcyjna plazmidu p ANETA. Figura 7: Mapa funkcyjna plazmidu p ASETA Figura 8: Sekwencja DNA cefE Nocardia lactamdurans (Coque i inni, wyżej) (dolne linie) nałożone na sekwencję PCRproduktu 1 (górne linie).
Krótki opis zestawienia sekwencji
Sekwencje ID nr 1-13: oligonukleotydy stosowane w konstrukcji kasety ekspresji P. chrysogenum dla genów cefE Streptomyces clavuligerus i Niocardia lactamdurans.
Streszczenie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania i wydzielania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA) charakteryzujący się tym, że
a) transformuje się szczep Penicillium chrysogenum genem ekspandazy pod transkrypcyjmąi translacyjną kontrolnąpędzlakowych sygnałów ekspresji;
b) przeprowadza się fermentację tego szczepu w ośrodku hodowli i dodaje się do tego ośrodka hodowli kwas 3,3'—tiodipropionowy albo jego sól lub ester uzyskując kwas 3-(karboksyetylotio) propionylo-6-aminopenicylanowy (3-(karbaksyetylotio) propionylo-6-APA), który zostaje powiększony in situ do 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA;
c) wydziela się 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA z bulionu fermentacyjnego;
d) odacylowuje się 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA; oraz
e) wydziela się krystaliczny 7-ADCA.
Korzystnie sygnał ekspresji stosowany w etapie (a) pochodzi z genu acylotransferazy (AT);
Korzystnie etap (e) stanowi etap filtracji.
Korzystnie w etapie (c) przeprowadza się filtrację oraz ekstrakcję przesączonego bulionu rozpuszczalnikiem organicznym nie mieszającym się z wodąprzy pH poniżej około 4,5, a następnie ekstrakcję wodąprzy pH 4-10.
Korzystnie stosuje się gen ekspandazy pochodzący ze Streptomyces clavuligerus lub Nocardia lactamdurans.
Szczegółowy opis wynalazku
Wynalazek dotyczy zastosowania funkcyjnych konstruktów genowych w P. chrysogenum w celu powiększania in vivo struktury pierścieniowej penicyliny, w połączeniu z zastosowaniem nowego substratu dla biosyntetycznych enzymów, tak aby wytworzyć pochodną kluczowego półproduktu w biosyntezie cefalosporyny, kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA). Budowa chemiczna tej pochodnej umożliwia przeprowadzenie skutecznej ekstrakcji rozpuszczalnikiem, która stanowi ekonomicznie opłacalny sposób wydzielania. Transformację P. chrysogenum można zasadniczo przeprowadzić doprowadzając DNA w różny sposób, np. przez wychwyt protoplastu z udziałem PEG-Ca, elektroporacja lub techniki wstrzeliwania cząstek, a także dobór transformantów. Patrz np. Van den Hondel en Punt, Gene Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, w: Applied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, redakcja), Cambridge University Press (1991). Opisano zastosowanie dominantowych i niedominantowych selekcyjnych markerów (Van den Hondel, wyżej). Opisano takie selekcyjne markery pochodzenia zarówno homologicznego (pochodzące z P. chrysogenum) jak i heterologicznego (nie pochodzące z P. chrysogenum).
180 565
Zastosowanie różnych markerów selekcji transformantów, homologicznych lub heterologicznych, w obecności lub bez sekwencji wektorowych, fizycznie połączonych lub nie połączonych z nierozróżnialnym DNA, do selekcjonowania transformantów jest dobrze znane.
Korzystnie do selekcjonowania transformantów P chrysogenum stosuje się homologiczny marker selekcji, aby ograniczyć ilość heterologicznego DNA wprowadzonego do P. chrysogenum. Najkorzystniej stosuje się dominantowy marker selekcjonujący, który można selektywnie usunąć z transformowanego szczepu, np. gen amdS z A. nidulans lub innego pędzlaka (zgłoszenie patentowe europejskie nr 94201896.1). Te korzystne charakterystyki markera selekcji transformatorów P. chrysogenum są bardzo przydatne w procesie i procedurach rejestracji produktu, gdyż żadne markery odporności na antybiotyki nie biorą udziału w procesie i nie sąwprowadzane do otoczenia.
Zgodnie z najkorzystniejszym rozwiązaniem marker selekcji amdS, który można selektywnie usunąć ze szczepu, pozwala na wielokrotne powtarzanie transformacji z wykorzystaniem za każdym razem tej samej selekcji dominantowej. Taka cecha uwalniania od markera selekcji nowych szczepów P. chrysogenum wytwarzających w wyniku ekstrakcji ekspandazę ma decydujące znaczenie dla szybkiego opracowania wysokowydajnych szczepów w przemysłowym programie poprawy szczepów.
Dzięki temu reakcja powiększania pierścienia z udziałem enzymu ekspandazy wytwarzanego w wyniku ekspresji w P chrysogenum przebiega w tym organizmie, np. w szczepie Wisconsin 54-1255. Taka reakcja powiększania pierścienia przebiega również w jego mutantach zapewniających zwiększoną wydajność β-laktamu. Zrozumiałe jest, że w takim przypadku warunki hodowli należy nieznacznie zmodyfikować, tak aby uzyskać wydajny wzrost.
Ponadto gen cefE umieszcza się pod transkrypcyjną i translacyjną kontrolą elementów kontrolnych genu pędzlaka, korzystnie pochodzących z genu acylotransferazy (AT) P. chrysogenum, co umożliwia jego ekspresję w optymalnym przedziale czasowym zsynchronizowanym z działaniem samego enzymu acylotransferazy. Cechy te wywierają decydujący wpływ na skuteczność reakcji powiększania pierścienia w cząsteczce penicyliny.
Oprócz zsynchronizowanej ekspresji genów kodujących ekspandazę i acylotransferazę, wewnątrzkomórkowa współlokalizacja części enzymów ekspandazy z acylotransferazą w mikrociałach (wewnątrzkomórkowa lokalizacja acylotransferazy) może ułatwić opracowanie ekonomicznego procesu produkcyjnego. Takie korzystne rozwiązania przyczynią się do zdecydowanego zmniejszenia ilości produktów ubocznych przy wytwarzaniu penicyliny, które nie są tolerowane w końcowym produkcie 7-ADCA przez władze zatwierdzające.
W podsumowaniu można stwierdzić, że wynalazek ujawnia, w jakim sposób aktywność enzymu ekspandazy wprowadzonego do P. chrysogenum wykorzystać można do powiększenia pierścienia penicyliny w warunkach zsynchronizowanej ekspresji.
Według wynalazku β-laktamowe półprodukty, 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA, wytwarzane sąw P. chrysogenum w wyniku dodania kwasu 3,3'-tiodipropionowego albo jego soli lub estru. Do odpowiednich soli należy np. sól sodowa lub potasowa. Związki te 'wydajnie wydziela się z ośrodka na drodze prostej ekstrakcji rozpuszczalnikiem, np. w sposób następujący:
Bulion sączy się i do przesączu dodaje się rozpuszczalnik organiczny nie mieszający się z wodą. Nastawia się pH tak, aby wyekstrahować cefalosporynę z warstwy wodnej. pH powinno być niższe od 4,5; korzystnie wynosi ono od 4 do 1, a jeszcze korzystniej od 2 do 1. W taki sposób cefalosporynę oddziela się od wielu innych zanieczyszczeń obecnych w bulionie fermentacyjnym. Korzystnie dodaje się niewielką objętość rozpuszczalnika organicznego uzyskując stężony roztwór cefalosporyny, dzięki czemu osiąga się zmniejszenie szybkości przepływu objętościowego. Drugą możliwość stanowi ekstrakcja pełnego bulionu przy pH od 4 do 1. Korzystanie bulion ekstrahuje się przy pH od 4 do 1 rozpuszczalnikiem organicznym nie mieszającym się z wodą.
Zastosować można dowolny rozpuszczalnik, który nie oddziaływuje z cząsteczką cefalosporyny. Do odpowiednich rozpuszczalników należy np. octan butylu, octan etylu, metyloizobutyloketon oraz alkohole takie jak butanol itp. Korzystnie stosuje się 1-butanol lub izobutanol.
180 565
Następnie cefalosporynę wyekstrahowuje się wodą przy pH 4-10, korzystnie 6-9. Także w tym przypadku zdecydowanie następuje zmniejszenie ostatecznej objętości. Wydzielanie przeprowadzać można w temperaturze 0-50°C, a korzystnie w temperaturze otoczenia.
Na uzyskany w ten sposób wodny roztwór cefalosporyny działa się odpowiednim enzymem w celu usunięcia bocznego łańcucha 3-(karboksyetylotio)propionylowego, tak aby uzyskać pożądany 7-ADCA.
Korzystnie stosuje się unieruchomiony enzym, tak aby można go było użyć szereg razy. Sposób wytwarzania takich cząstek i unieruchomiania enzymu opisano dokładnie w EP-A-0222462. Przy pH roztworu wodnego wynoszącym np. od 4 do 9 następuje ograniczenie do minimum reakcji degradacji cefalosporyny oraz uzyskuje się optymalny stopień konwersji w reakcji enzymatycznej. I tak enzym dodaje się do wodnego roztworu cefalosporyny, utrzymując pH na odpowiednim poziomie np. w wyniku dodawania odpowiedniej zasady takiej jak roztwór wodorotlenku potasowego, albo stosujążywicę jonowymienną.. Gdy reakcja przebiegnie do końca, unieruchomiony enzym odsącza się. Inną możliwość stanowi zastosowanie unieruchomionego enzymu w kolumnie ze złożem nieruchomym lub fluidalnym, albo stosowanie enzymu w roztworze i usuwanie produktów na drodze filtracji przez membranę. W następnym etapie mieszaninę reakcyjną zakwasza się w obecności rozpuszczalnika organicznego nie mieszającego się z wodą.
Odpowiednie enzymy pochodząnp. z drobnoustrojów Pseudomonas SY77, przy czym wykazują one jedną lub więcej mutacji w pozycjach 62,177,178 i 179. Można także zastosować enzymy z innych drobnoustrojów Psudomonas, korzystnie z Pseudomonas SE83, ewentualnie wykazujące mutację wjednej lub więcej pozycji odpowiadającym pozycjom 62,177,178 i 179 w Pseudomonas SY77.
Po odprowadzeniu pH do około 1,0 -1,5 warstwy rozdziela się i warstwę wodną doprowadza się do pH 2-5. Krystaliczny 7-ADCA odsącza się.
Odacylowanie przeprowadzić można również chemicznie, w znany sposób obejmujący np. wytwarzanie bocznego łańcucha iminochlorkowego w wyniku dodania pentachlorku fosforu w temperaturze poniżej 10°C, a następnie dodanie izobutanolu w temperaturze otoczenia lub niższej.
Poniższe przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając jego istoty.
Przykłady
Przykład 1. Ekspresja genu Streptomyces i Nocardia cefE w Penicillium chrysogenum
A. Ogólne Procedury Klonowania Genu I Transformacji Genu
W zgłoszeniu wykorzystano znane techniki stosowane w procedurach klonowania genów. Do technik tych należą polimerazowe reakcje łańcuchowe (PCR), synteza syntetycznego oligonukleotydu, analiza sekwencji nukleotydów w DNA, enzymatyczne ligowanie i restrykcja DNA, subklonowanie wektora E. coli, transformowanie i selekcja transformantów, wydzielanie i oczyszczanie DNA, charakteryzowanie DNA metodąblottingu Southema oraz sond znaczonych 32p a także przypadkowe znakowanie DNA za pomocą 32p. Techniki takie są dobrze znane i odpowiednio opisane w wielu publikacjach. Patrz np. Sambrook i inni Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA (1989), Innes i inni, PCR protocol, a Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990), oraz McPherson i inni, PCR, a Practical Approach, IRL Press (1991).
Do ogólnych procedur wykorzystywanych przy transformowaniu pędzlaków i selekcji transformantów należy preparowanie protoplastów grzybowych, warunki przenoszenia DNA i regeneracji protoplastu oraz oczyszczanie i charakteryzowanie transformantów. Wszystkie takie procedury są znane i dobrze udokumentowane w pracach: Filkenstein i Ball (red.), Biotechnology ofFilamentous Fungi, technology and projects, Butterworth-Heinemann (1992); Bennett i Lasure (red.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press (1991); Turner, w Puhler (red.), Biotechnology, drugie całkowicie zmienione wydanie, VCH (1992).
W szczególności zastosowanie technologii klonowania genu i transformacji genu w odniesieniu do Penicillium chrysogenum jest bardzo dokładnie opisane w pracach Bennet i Lasure (wyżej) oraz Finkelstein i Ball (wyżej).
180 565
- Syntetyczne oligonukleotydy DNA wytwarzano z wykorzystaniem dostępnego w handlu syntetyzatora (Applied Biosystems, CA, USA), zgodnie z instrukcjami producenta;
- PCR przeprowadzano z wykorzystaniem zautomatyzowanego aparatu PCR (Perkin Elmer, USA) i polimerazę Ultma DNA (Perkin Elmer), zgodnie z instrukcjami producenta.
- Procedurę hGC PCR (Dutton i inni, Nucleic Acids Res. 21 (nr 12) ( 1993), 2953-2954) wykorzystano, aby umożliwić amplifikację regiony kodujące cefE w chromosomowym DNA N. lactamdurans i C. clavuligerus.
- Enzymy restrykcyjne i inne enzymy modyfikujące DNA otrzymano z BRL (MD, USA), stosując je zgodnie instrukcjami producenta.
- wektor pBluescript® z E. coli otrzymano ze Statagene (CA, USA).
- wszystkie inne stosowane chemikalia były odczynnikami o czystości analitycznej, otrzymanymi od różnych dostawców.
- Analizę sekwencji nukleotydów DNA wykonywano za pomocą zautomatyzowanego aparatu do analizy sekwencji DNA (Applied Biosystems), którego działanie opiera się na wykrywaniu specyficznego w stosunku do sekwencji znakowania fluorescencyjnego, zgodnie z instrukcjami producenta.
B. Hodowla Drobnoustrojów
Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 hodowano w tryptynowym bulionie sojowym (Difco). Chromosomowy DNA z tego szczepu zastosowano do wydzielania genu cefE (Kovacevic i inni, J. Bacteriol. (1989), 754-760).
Nocardia lactamdurans ATCC 27382 również hodowano w tryptynowym bulionie sojowym (Difco). Chromosomowy DNA z tego szczepu zastosowano do wydzielania genu cefE (Coque i inni, wyżej).
Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) hodowano w pełnym ośrodku YPD (YPD: 1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% glukozy). Chromosomowy DNA z tego szczepu zastosowano do wydzielania obszarów regulacyjnych 5' i 3' genu penDE, niezbędnych w ekstrakcji genu cefE. Penicillium chrysogenum ATCC 28089 stosowano także jako gospodarza w eksperymentach transformacji genu cefE. Przydatne są również inne szczepy Penicillium chrysogenum, w tym mutanty szczepu Wisconsin 54-1255, o zwiększonej wydajności β-laktamu. W zależności od stosowanego markera selekcji transformatorów wykorzystać można szczepy P chrysogenum zawierające mutacje w genach pyrG, niaD lub facA. Takie szczepy mutantowe otrzymać można powszechnie znanymi sposobami (Cantoral, Bio/Technol. 5 (1987), 494-497; Gouka i inni, J. Biotechn. 20 (1991), 189-200; oraz Gouka i inni, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1993), 514-519).
Hodowlę P. chrysogenum w celu wytworzenia protoplastów stosowanych w transformacjach prowadzono również w ośrodku YPD.
Wiadomo, że procedury wytwarzania protoplastów i regeneracji mogąróżnić się nieznacznie, zależnie od konkretnego stosowanego szczepu Penicillium chrysogenum oraz od zastosowanego sposobu selekcji transformantów.
Szczepy E. coli WK6 (Zell i Fritz, EMBO J. 6 (1987), 1809-1815), XLI-Blue (Stratagene) i HB101 (Boyer i Roulland-Dussoix,, J. Mol. Biol., 41 (1969), 459; Bolivar i Backman, Messages Enzymol. 68 (1979), 2040) utrzymywano i hodowano z wykorzystaniem standardowych ośrodków hodowli E. coli (Sambrook wyżej).
C. Konstrukcja Kaset Ekspresji Cefe
Kasety ekspresji cefE zestawiono w tabeli I, w której wyjaśniono także nomenklaturę wykorzystywaną w odniesieniu do tych plazmidów.
180 565
Tabela
Zestawienie skonstruowanych kaset ekspresji cefE
| Plazmid | Promotor | Gen | Docelowe mikrociało | Terminator |
| pMCTSE | tac1 | S.cla cefE | FdT | |
| pMCTNE | tac | N. lac cefE | FdT | |
| pGSE | gpd2 | S. cla cefE | - | |
| pGNE | gpd | N. lac cefE | - | |
| pGNETA | gpd | N. lac. cefE | + + cel | AT3 |
| pGNEWA | gpd | N. lac cefE | Wt | AT |
| pANETA | AT4 | N. lac cefE | + cel | AT |
| pANEWA | AT | N. lac cefE | Wt | AT |
| pGSETA | gpd | S. cla cefE | + cel | AT |
| pGSEWA | gpd | S. cla cefE | Wt | AT |
| pASETA | AT | S. cla cefE | + cel | AT |
| pASEWA | AT | S. cla cefE | Wt | AT |
Legenda
1. tac = promotor hybrydowy trp-lac
2. gpd = koniec 5' genu gpdA A. nidulans
3. AT = koniec 3' genu penDE P. chrysogenum
4. AT = koniec 5' genu penDE p. chrysogenum
Do konstruowania syntetycznych oligonukleotydów zestawionych w tablicy II wykorzystano opublikowane sekwencje nukleotydowe genu cefE S. clavuligerus (Kovacevic, wyżej); genu cefEN. lactamdurans (Coque, wyżej); genu gpdA A. nidulans (Punt i inni, Gene 69 (1988), 49-57) oraz genu penDE P. chrysogenum (Barredo i inni, Gene 83 (1989), 291-300; Diez i inni, Mol. Gen. Genet. 218 (1989), 572-576).
Tabela II
Sekwencję ligonukleotydów stosowane w konstrukcji kaset ekspresji P. chrysogenum dla genu cefE N. lactamdurans i S. clavuligerus
| 1. | 5' - GCT GAA GGA GCT GAG CAT ATG ACG GAC GCG CCG ACC-3' |
| 2. | 5' - CCC GGG TCT AGA TCT AGA TCA CCG GGC GGC GGC GGT CTT CCG GAT GTT-3' |
| 3. | 5' - GAT CAG TGA GAG TTG CAT ATG GAC ACG ACG GTG CCC ACC TTC AGC ACT-3' |
| 4. | 5' - CCC GGG TCT AGA TCT AGA CTA TGC CTT GGA TGT GCG GCG GAT GTT-3' |
| 5. | 5' - GAG CTC TGT GAA TTC ACA GTG ACC GGT GAC TCT TTC-3' |
| 6. | 5' - GGG AGC CAT ATG GAT GTC TGC TCA AGC GGG GTA GTC-3' |
| 7. | 5' - AGA ACG GAT TAG TTA GTC TGA ATT CAA CAA GAA CGG CCA GAC-3' |
| 8. | 5' - GAC AGA GGA TGT GAA GCA TAT GTG CTG CGG GTC GGA AGA TGG-3' |
| 9. | 5' - ACA TCA ACA TCC GGA AGA CCG CCG CCG CCC GGT GAA GGC TCT TCA TGA-3' |
| 10. | 5' - GGA CTA GTG TCG ACC CTG TCC ATC CTG AAA GAG TTG-3' |
| 11. | 5' - ACA TCA ACA TCC GGA AGA CCG CCG CCG CCC GGC TTT GAA GGC TCT TCA-3' |
| 12. | 5' - TTC GAT GTC AGC CTG GAC GGC GAG ACC GCC ACG TTC CAG GAT TGG ATC GGG GGC AAC TAC GTG AAC ATC CGC CGC ACA TCC AAG GCA TGA AGG CTC TTC ATG ACG-3' |
| 13. | 5' - GAT GTC AGC CTG GAC GGC GAG ACC GCC ACG TTC CAG GAT TGG ATC GGG GGC AAC TAC GTG AAC ATC CGC CGC ACA TCC AAG CTA TGA AGG CTC TTC ATG ACG-3' |
180 565
C1. Konstrukcja Plazmidów Ekspresji Pmctse I Pmctne Genu Cefe E. Coli
W pierwszej PCR z wykorzystaniem chromosomowego DNAN. lactamdurans oraz oligonukleotydów 1 i 2 otrzymano otwartą ramkę odczytu cefE N. lactamdurans w postaci produktu PCR o 0,9 kb, zawierającego unikatowe miejsce restrykcyjne Ndel przy końcu 5' oraz unikatowe miejsce XbaI przy kocu 3'.
PCR, 2: cefE S. clavuligerus
W drugiej PCR z wykorzystaniem chromosomowego DNA S. clavuligerus oraz oligenukleotydów 3 i 4 otrzymano otwartą ramkę odczytu cefE S. clavoligerus w postaci produktu PCR o 0,9 kb, zawierającego unikatowe miejsce restrykcyjne NdeI przy końcu 5' oraz unikatowe miejsce XbaI przy końcu 3'.
Aby doprowadzić do ekstrakcji genów cefE w E. coli i scharakteryzować produkty PCR metodą analizy sekwencji DNA, przeprowadzono klonowanie produktów PCR 1 i 2 w wektorze pMCTNde, pochodnej pMC-5 (Stranssens i inni, Nucleic Acids Res. 17 (1989), 4441). Plazmid pMCTNde otrzymano z pMC5-8 (zgłoszenie patentowe europejskie nr 0351029) przez insercję fragmentu kodującego promotor tac za miejscem RBS i miejscem klonowania NdeI (Fig. 3).
Produkty PCR 1 i 2 strawiono za pomocą NdeI i XbaI, a następnie zligowano z wektorem pMCTNde strawionym za pomocą NdeI-XbaI. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania E. coli WK6. Przeprowadzono selekcję transformantów pod względem odporności na chloramfenikol. Transformanty te użyto do wydzielania plazmidowego DNA. Insert kasety ekspresji cefE zanalizowano najpierw przeprowadzając trawienie enzymami restrykcyjnymi na przewidywaną generację fragmentów restrykcyjnych. Plazmidy zawierające przewidywane miejsca dla enzymów restrykcyjnych zanalizowano na koniec w zautomatyzowanym analizatorze sekwencji DNA.
Sekwencja DNA otwartej ramki odczytu cefE S. clavuligerus w plazmidzie pMCTSE (Fig. 2) była w 100% identyczna z sekwencją opublikowaną (Kovacevic, wyżej).
Sekwencja DNA (Fig. 8) wszystkich zanalizowanych klonów zawierających otwartą ramkę odczytu cefE N. lactamdurans różniła się od sekwencji opublikowanej (Coque, wyżej).
Pochodna sekwencja aminokwasów opublikowanego genu cefE N. lactamdurans zawierała prolinę w pozycj i aminokwasu 41. Prolina ta opuszczona jest w klonach uzyskanych w PCR 1. Plazmidowi temu nadano nazwę pMCTNE (Fig. 1).
C2. Konstrukcja Plazmidów Ekspresji Cefe P. Chrysogenum Per 3: Promotor gpDA
W trzeciej PCR stosując plazmidowy DNA pAN7-1 (Punt i inni, Gene 56(1987),117-124) zawierający gen hph E. coli pod kontrolą promotora gpdA A. nidulans oraz oligonukleotydy i 6 otrzymano promotor gpdA w postaci produktu o 0,9 kb zawierającego unikatowe miejsce restrykcyjne EcoRI przy końcu 5' oraz unikatowe miejsce NdeI przy końcu 3'.
PCR 4: Promotor AT
W czwartej PCR chromosomowy DNA z P. chrysogenum oraz oligonukleotydy 7 i 8 zastosowano w celu otrzymania fragmentu promotora AT o 1,5 kb, który również zawierał unikatowe miejsce restrykcyjne EcoRI przy końcu 5' oraz unikatowe miejsce NdeI przy końcu 3'.
PCR 5: Terminator AT i koniec 3' genu cefE N. lactamdurans
W piątej PCR otrzymano obszar terminatora pen (DE) o 0,5 kb stosując chromosomowy DNA z P chrysogenum oraz odpowiednio oligonukleotydy 9 i 10 oraz 11 i 10. Uzyskane w ten sposób produkty PCR zawierały 3'-końcową sekwencję genu cefE wraz z sygnałem ukierunkowującym na mikrociało lub bez tego sygnału, obejmując sekwencję ARL C-końcowego aminokwasu (Muller i inni, Biochimica et Biophysica Acta 1116 (1992), 210-213).
Oligonukleotydy skonstruowano w taki sposób, że unikatowe miejsce BspEI wprowadzono na końcu 5' produktu PCR, a unikatowe miejsce SpeI wprowadzono na końcu 3' produktu PCR.
PCR 6: Terminator AT i koniec 3' genu cefE S. clavuligerus
W piątej PCR otrzymano, obszar terminatora pen (DE) o 0,5 kb stosując chromosomowy DNA z P. chrysogenum oraz odpowiednio oligonukleotydy 12 i 10 oraz 13 i 10. Uzyskane w ten sposób produkty PCR zawierały 3'-końcową sekwencję genu cefE S. clavuligerus wraz z syg10
180 565 nałem ukierunkowującym na mikrociało lub bez tego sygnału, obejmując sekwencję SKL C-końcowego aminokwasu (De Hoop i inni, Biochem. J. 286 (1992), 657-669).
Oligonukleotydy skonstruowano w taki sposób, że unikatowe miejsce BglI wprowadzono na końcu 5' produktu PCR, a unikatowe miejsce SpeI wprowadzono na końcu 3' produktu PCR.
W celu osiągnięcia ekspresji genów cefE w P. chrysogenum promotor gpdA i fragment promotora AT zligowano z fragmentami cefE z plazmidów pMCTNE i pMCTSE. Następnie przeprowadzono klonowanie tych zligowanych fragmentów w wektorze pBluescript IIKS.
PCR 3 strawiono za pomocą EcoRI i NdeI. pMCTNE i pMCTSE strawiono za pomocą NdeI i XbaI. Fragmenty restrykcyjne rozdzielono metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Z żelu agarozowego wydzielono oczyszczone fragmenty 0,9 kb kodujące cefE. Fragment EcoRINdel promotora zligowano wraz z fragmentami NdeI-XbaI z cefE w strawionym EcoRI-XbaI wektorze pBluescript II KS. Uzyskano w ten sposób plazmidy pGSE i pGNE.
W celu uzyskania optymalnej ekspresji genów cefE w P. chrysogenum wybrano do klonowania sekwencję sygnałową terminacji AT poza genami cefE w plazmidach ekspresji P. chrysogenum wspomnianych powyżej.
pGNETA-pGNEWA
Produkty PCR 5 strawiono BspEI i SpeI, a następnie zligowano ze strawionym za pomocą BspEI i SpeI wektorem pGNE. Mieszaniny ligacyjne zastosowano do transformowania E. coli HB101. Przeprowadzono selekcję transformantów pod względem odporności na ampicylinę. Plazmidy wydzielone z tych transformantów scharakteryzowano przeprowadzając analizę fragmentów restrykcji, a następnie analizę sekwencji DNA. Uzyskano w ten sposób plazmidy pGNEWA i pGNETA (Fig. 4).
pGSETA-pGSEWA
Produkty PCR 6 strawiono BglI i SpeI, a następnie zligowano ze strawionym za pomocą BglI i SpeI, wektorem pGSE. Mieszaniny ligacyjne zastosowano do transformowania E. coli HB101. Przeprowadzono selekcję transformantów pod względem odporności na ampicylinę. Plazmidy wydzielone z tych transformantów również scharakteryzowano przeprowadzając analizę fragmentów restrykcji, a następnie analizę sekwencji DNA. Uzyskano w ten sposób plazmidy pGSEWA i pGSETA (Fig. 5).
pANETA, pANEWA, pASETA i pASEWA
Plazmidy pGNETA, pGNEWA, pGSETA i pGSEWA strawiono EcoRI i NdeI. Fragmenty restrykcyjne rozdzielono metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Z żelu agarozowego wydzielono oczyszczone fragmenty 4,5 kb.
Produkt PCR 4 strawiono EcoRI i NdeI, po czym zligowano z oczyszczonymi fragmentami wspomnianymi powyżej. Po przeprowadzeniu transformowania mieszanin ligacyjnych w E. coli HB101 przeprowadzono selekcję transformantów pod względem odporności na ampicylinę. Transformanty hodowano, a ich plazmidy wydzielono i scharakteryzowano przeprowadzając analizę fragmentów restrykcji, a następnie analizę sekwencji DNA. Uzyskano w ten sposób pożądane konstrukty, a mianowicie pANETA (Fig. 6), pANEWA, pASETA (Fig. 7) i pASEWA.
D. Transformowanie P. Chrysogenum
Zastosowano procedurę transformacji protoplastów z udziałem Ca-PEG
Zgodnie z procedurami, które opisali Cantoral (wyżej), Gouka i inni (J. Biotechn., wyżej), oraz Gouka i inni (Appl. Microbiol. Biotechnol., wyżej), pełny plazmid lub oczyszczoną kasetę ekspresji cefE (pozbawioną sekwencji wektora E. coli) zastosowano do transformowania szczepów P. chrysogenum odpowiednio z genami pyrG, niaD, facA lub amdS (Beri i inni, Curr. Genet. 11 (1987), 639-641) jako markerami selekcyjnymi.
Stosując homologiczne markery selekcyjne pyrG,niaD lub facA w oczyszczonej formie, pozbawione sekwencji wektora E. coli, otrzymano transformowane szczepy P. chrysogenum nie zawierające bakteryjnych genów odporności.
W zgłoszeniu patentowym europejskim nr 94201896.1 opisano sposób otrzymywania zrekombinowanych szczepów pozbawionych genu markera selekcyjnego. Sposób ten z powo180 565 dzeniem wykorzystano w odniesieniu do transformantów P. chrysogenum zawierających gen amdS A. nidulans jako dominujący marker selekcyjny.
Jedyne elementy o charakterze heterologicznym stanowi wówczas obszar kodujący cefE o 0,9 kb i ewentualnie obszar promotora gpdA o 0,9 kb.
E. Analiza Transformantów
Transformanty P. chrysogenum oczyszczono przeprowadzając kolejne hodowle na selektywnej pożywce. Pojedyncze trwałe kolonie zastosowano do przygotowywania stoków agarowych w celu otrzymania spor, które selekcjonowano tak, aby uzyskać transformanty zawierające kasetę ekspresji cefE. Gotowanie fragmentu świeżej grzybni z transformantów na płytce agarowej zastosowano w celu uzyskania takiej ilości matrycowego DNA, aby przeprowadzić skuteczną selekcję setek transformantów pod względem obecności genu cefE, z wykorzystaniem techniki PCR (Patrz Fungal Genetics Conference, Asilomar (1991), skrót w Fungal Genetics Newsletter 38, 55). W ten sposób oszacowano wydajność transformacji.
Przeprowadzono także selekcjonowanie transformantów z wykorzystaniem testów biologicznych. Transformanty hodowano na pożywce agarowej zawierającej wybrany prekursor bocznego łańcucha. E. coli ESS2231 zastosowano jako bakterię wskaźnikową w przykryciu agarowym zawierającym również penazę Bacto, tak aby można było rozróżnić wytwarzanie penicyliny i cefalosporyny, zgodnie ze znanymi metodami opisanymi np. przez Guttiereza i innych, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 46-64).
Spory zastosowano do zaszczepiania ośrodka hodowli P. chrysogenum w sposób opisany w części d. Po hodowaniu przez 72 godziny w 25°C z grzybni wydzielono chromosomowy DNA. DNA strawiono enzymem restrykcyjnym z sekwencją rozpoznawania o 6 bp, takim jak EcoRi lub Pstl.
Fragmenty DNA rozdzielono metodą elektroforezy na żelu agarozowym i naniesiono na membrany Gene z siatki nylonowej (New EnglandNuclear). Bioty Southernazhybrydyzowano z produktem PCR 2 znaczonym 23P jako sondą dla sekwencji genu cefE. Oczyszczony produkt PCR 2 znaczony 32p otrzymano przeprowadzając przypadkowe znakowanie w obecności a32P dCTP, z wykorzystaniem dostępnego w handlu zestawu do znakowania (Boehringer Mannheim).
Transformanty zawierające sekwencję kodującą cefE zbadano pod względem zdolności do ekspresji genu cefE, określanej w opisie jako aktywność ekspandazowa.
Wybrane transformanty hodowano w ośrodku do wytwarzania penicyliny (patrz przykład 2).
W doświadczeniu, w którym badano wpływ czasu, próbki grzybni zbierano po 48,72 i 96 godzinach fermentacji. Wykonywano ekstrakty grzybniowe i w surowych ekstraktach oznaczano aktywność ekspandazową w sposób opisany przez Rollinsa i innych, Can. J. Microbiol. 34 (1988), 1196-1202. W przypadku transformantów z aktywnością ekspandazową oznaczano również aktywność acylotransferazową sposobami opisanymi przez Alvareza i innych, Antimicrob. Agent Chem. 31 (1987), 1675-1682).
Na podstawie tych analiz transformanty o różnych poziomach enzymatycznej aktywności acylotransferazowej i ekspandazowej wybrano do wytwarzania pochodnych 7-ADCA na drodze fermentacji.
Przykład 2. Wytwarzanie na drodze fermentacji 3-(karboksyetylotio)prpIonylo-7-ADCA i jego wydzielanie
Szczep P. chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) transformowany jednym z konstruktów DNA w sposób opisany w przykładzie 1 zastosowano do zaszczepienia w ilości 2 x 106 konidiów/ml ośrodka zaczynowego zawierającego (w g/litr): glukozę - 30; (NH4)2SO4 - 10; KH2PO4 - 10; roztwór pierwiastków śladowych I MgSO4-7H20 - 25; FeSO4-7H2O - 10; CuSCĘ-SI-CO - 0,5; ZnSO4-7H2O - 2; Na2SO4 - 50; MnSO^O - 2; CaCl^O - 5) -10 (pHprzed sterylizacją 6,5).
Hodowlę zaczyno wąinkubowano przez 48-72 godziny w 25-30°C, po czym zastosowano ją do zaszczepienia 10-20 objętości ośrodka produkcyjnego zawierającego (w g/litr): laktozę 80; maltozę - 20; CaSO4- 4; mocznik - 3; MgSO47H2O - 2; KH2PO4 - 7; NaCl - 0,5; (NH4ĘSO4 6; FeSO4-7H2O - 0,1; kwas 3,3' - tiodipropionowy - 5; roztwór pierwiastków śladowych II
180 565 (CuSO4-5H2O - 0,5; ZnSO4-7H2O - '2; MnSO4H2O - 2; Na2SO4 - 50) - 10 (pH przed sterylizacją
5,5-6,0). Inkubowanie prowadzono następnie przez 96-120 godzin.
Po zakończeniu fermentacji produkcyjnej grzybnię oddzielono przez odwirowanie lub filtrację i zawartość 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA oznaczono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w kolumnie z odwróceniem faz. Zastosowano aparat HPLC Beckman System Gold, w którego skład wchodzi programowalny układ rozpuszczalników model 126, autopróbnik model 507, detektor diodowo-matrycowy model 168 i układ danych System Gold (5.11). Jako fazę stacjonarną zastosowano dwie kolumny Chromsphere C18 (100 x 3 mm, Chrompack) w połączeni szeregowym. Fazę ruchomą stanowił układ z liniowym gadientem od 100% 0,07M buforu fosforanowego o pH 4,8 do 25% acetonitrylu/75% buforu fosforanowego o pH 4,8, w ciągu 15 minut przy szybkości przepływu 0,5 ml/minutę. Powstawanie
3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA oznaczano ilościowo przy 260 nm stosując syntetyczny 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA jako substancję wzorcową.
Piki identyfikowano przez bezpośrednie porównanie widm UV i NMR.
Po przesączeniu bulionu do przesączu dodano około 0,1 objętości 1-butanolu. pH doprowadzono do 2 rozcieńczonym kwasem solnym i mieszaninę mieszano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po oddzieleniu warstwę organiczną odparowano i poddano odacylowaniu chemicznemu (przykład 3) lub wyekstrahowano 0,33 objętości wody przy pH 8 i poddano odacylowaniu enzymatycznemu (przykłady 4 i 5).
Przykład 3. Odacylowanie 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA
Do mieszaniny 3 g (8 mmoli) 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA, 3,5 ml (36 mmoli) N,N-dimetyloaniliny, 13 ml chlorku metylenu dodano 2,6 ml (21 mmoli) trimetylochlorosilanu w temperaturze otoczenia. Po mieszaniu przez 30 minut mieszaninę reakcyjną schłodzono do około -50°C i dodano w jednej porcji 1,8 g (8,5 mmola) pentachlorku fosforu. Temperaturę -40°C utrzymywano przez 2 godziny, po czym mieszaninę reakcyjną schłodzono do -65°C. Dodano 12 ml (137 mmoli) izobutanolu z taką szybkością, aby temperatura nie wrosła powyżej -40°C. Po dodatkowym mieszaniu przez 2 godziny roztwór wylano do 15 ml wody i natychmiast dodano 5 ml 4,5N amoniaku. pH doprowadzono do 4 powoli dodając stały wodorowęglan amonowy. Po schłodzeniu do 5°C mieszaninę przesączono, a uzyskany krystaliczny 7-ADCA przemyto 5 ml mieszaniny woda/aceton (1:1) i oddzielono.
Przykład 4. Enzymatyczne odacylowanie 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA z wykorzystaniem mutantowej acylazy z Pseudomonas SY77
Konwersję 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA przeprowadzono jednoetapowo w procesie enzymatycznym stosując specyficznąacylazę otrzymanąz acylazy Pseudomonas SY77 na drodze miejscowo ukierunkowanej mutagenezy. Konstrukcję i identyfikcję mutantowej acylazy Pseudomonas SY77 o zwiększonej aktywności w odniesieniu do bocznych łańcuchów 3-(karboksyetylotio)propionylowych podano w EP-A-045304. W mutancie tyrozyna w pozycji 178 α-podjednostki acylazy Pseudomonas SY77 została zastąpi ona histydyną. Mutantowa acylaza wytwarzana jest w E. coli. Komórki zbiera się przez odwirowanie i ponownie zawiesza się w 10 mM buforze fosforanowym o pH 7,4, zawierającym 140 raM NaCl. Następnie komórki rozbija się przez obróbkę ultradźwiękami. Po usunięciu szczątków komórek zebrano supematanty z aktywną acylazą. Acylazę oczyszczano przeprowadzając szereg etapów chromatografowania: (1) chromatgrafię jonowyrwennana Q-Sepharose z szybkim przepływem przy pH 8,8; (2) hydrofobową chromatografię interakcyjną na Phenyl-Sepharose; oraz (3) chromatografię żelową w kolumnie Sephacryl S200HR.
Oczyszczoną acylazę unieruchomiono na cząstkach z mieszaniny żelatyny i chitozanu. Cząstki poddano obróbce aldhydem glutarowym tuż przed dodaniem enzymu.
Konwersję 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA prowadzono w reaktorze z mieszadłem. Najpierw do reaktora dodano wodny roztwór cefalosporyny. Następnie temperaturę roztworu doprowadzono do 30°C przy stałym mieszaniu i pH doprowadzono do 8 za pomocą wodorotlenku potasowego. Dodano wówczas unieruchomiony enzym, tak że rozpoczęła się konwersja. W czasie konwersji pH w reaktorze rejestrowano w sposób ciągły i utrzymywano na po180 565 ziomie 8. Kwas 3,3'-tiodipropionowy uwolniony w czasie reakcji zobojętniano KOH. Ilość dodanego KOH sumowano i rejestrowano za pomocąrejestratora wstępnego. Konwersję śledzono pobierając próbki z reaktora i oznaczając w nich 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA oraz 7-ADCA, metodą HPLC w sposób opisany w przykładzie 2.
Po zakończeniu reakcji unieruchomiony enzym odsączano, do przesączu dodano octan butylu i pH doprowadzono do 1. Warstwy rozdzielono i pH fazy wodnej zawierającej 7-ADCA doprowadzono do 3. Krystaliczny 7-ADCA odsączono.
Przykład 5. Enzymatyczne odacylowanie 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA z wykorzystaniem acylazy z Pseudomonas SE83
Konwersję 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA prowadzono jak w przykładzie 4, ale z zastosowaniem acylazy Pseudomonas SE83, osiągając taki sam rezultat.
fiG. 2
(D o
tt <D cn
180 565 rlG.3
3920. Aba I
«I m
π σι
Μ
180 565
F‘<S ,q
Sjo 1,239?
<s cn
180 565
Τϊ<3. 5
5302 ,£coRl
180 565
Hs.G
I οο'δ'ΧΒΒΕ [l ’iW'£00E
180 565
<D (N
180 565
| l I | atgaccgacccgaccctgcccaccttcgatctggcccagctccctcacggcttgcaccag ATCACGCACCCCACCGTGCCGACCTrCCATCTCGCCGAGCTGCGTGACGGCTTCCACCAG |
| Ó1 61 | GAiSGAGTTCCGCCACTGCCTGCGCGAGAAGGCCGTGrrCTACCTCAAGGGCACCGCGCT GACCAGTTCCCCCACTCCCTCCGCCACAAGCGCGTGTTCTACCTCAAGGGCACCCCCCTC |
| 120 121 | C G CCCACCCCCACCACGCCTCGGCCCGCGACATCCCCGTGCACrrCTTCGACCACCCC CCGGCCGAGGCGGACCACGCCTCGCGCCCGGACATCCCGCTGGACTTCTTCGACCACGCC |
| 173 331 | ACCCAGGCCCACAACAAGGCCC7CA7GACGC7CAT7CCSACCA77CCCCGCCGC7ACCCC ACCCAC^KCCAGAACAAGG^GCTCATGACGCCCATCCCGACCATCCGGCGCGGC^ACCCG |
| 222 24 i | GCO27GGAG7CCGAGAGCACCGCCCAGA7CACGAACAC7GC-7AAGTAC£CG7AC7AC7CG GCCCTCCAGTCCCAGAGCACCGCCCAGATCACGAACACCGGCAACiACACCGACTACTCG |
| 301 | ATCTCGTACTCCAT0GCCACCGCGGACAACC7G7TCCCCACCGCCCAG7TCGAGAAGGCG A7G7CG7AC7CGA7GGG7AC7GG7GACAAGG7G77G7CCAG2GCCGAG7TGGAGAAGGGC |
| 2se 361 | i AGTAG . λ m — wjnTG i AC7G*^«i*« t 4 ·—A*«r jAC·^ 4 «.‘J1-» 4 >jC . *«» 7CCGACCAC7ACT7CCCGCGCATC7ACCCCCC7773CACCACC7CGCGCGGCAGGTCCTG |
| 418 4*1 | AC77CGGTCGCC0CGGAACCCGAGGT7GGCAT0GACGCCT7CCTCGACTGCGAACCC.77G ACC7CGGTCCCCGCGGAACCCGAGCTCGCCATGGACGCGTTGCTCGACTC*7CAACCCCTG |
| 472 431 | (37GCGCCTCCGCTAGTTCCCCGAGGTGCCCGAGGA7CCCGTGGCCGAGGAGCAG-2CGC7G CTGCCCC7GCGC7AC77CCCCGA0G7CCC7CACGA7CGCG7GGCCGAGOAGCAGCCCCTC |
| C ’Ό | G'3GATGGCCCCGCAC7ACGACC7CTCCA7CGTCAGCC7GATCCACCAGACC7G7TGGG7G |
| 541 | GGGATCCCCCCCCACTACGACCTCTCGATCSTCACCCTCATCCACCAGACCCCTTGCGCO |
| 596 601 | AACGCGT7CGTCAGCCTGCAGCTCGAGGTCGACGGCTCCTATGTCGACATCCCCGCGCAG AACGG077CG7CACCCTGCACGTCCAGC7GCACGGC7CCTArC7GGAC£7C2CCCCGCAG |
| 6SS 661 | CCGGGCGCCG7CCTCC7GTTCTCCCCCCCCCTCCCGACCCTCG7CGCCCACGCCCCCAT7 CCGCGCCCCCTCC7GG7G77CTCCGCCCCCCTGCCCACCCTCC7CGCCCACGCCCCGATC |
| 713 721 | AACCCCCCCAAGCACCACCTCCCCCCGCCCCCCCCCCACAACCCCCTCCCGACCAGCCCC aaggcgcccaagcaccacgtggccgcccccgccgccgacaagcgggtgggcaccaccccc |
| 77Q 781 | ACCTCCACCCTCrrCTTCCTGCCCCCCAACCCGCACTTCCGCTTCTCCCTGCCCCCCCCC ACCTCCACCCTCTTCrrCCTCCGCCCCAACCCGCACTTCCGCTTCTCCGTCCCGCGGCCC |
| 836 841 | AGGCAGTGCGCGTTCGACC7CACCATCCCCCCCGACACCCCCACCTTCGACGACTGCATC ACCCAGTCCCCCTTCCACGTCACCATCCCGGCCGACACCCCCACCrrCGACCACTCCATC |
| 698 901 | CGCCCCAACTACATCAACATCCCGAACACCGCCCCCCCCCGG 939 ·£'/- 5 CGCGCCAACTACATCAACATCCGGAACACCGCCGCCGCCCCG 942 FIG.8 |
| Zgodne | = 937 Długość » 942 Zgoane/długość - 99.5% |
180 565
FiG. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (5)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania i wydzielania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA), znamienny tym, żea) transformuje się szczep Penicillium chrysogenum genem ekspandazy pod transkrypcyjnąi translacyjną kontrolą pędzlakowych sygnałów ekspresji;b) przeprowadza się fermentację tego szczepu w ośrodku hodowli i dodaje się do tego ośrodka hodowli kwas 3,3'-tiodipropionowy albojego sól lub ester uzyskując kwas 3-(karboksyetylotio) propionylo-6-aminopenicylanowy (3-(karboksyetylotio) propionylo-6-APA), który zostaje powiększony in situ do 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA;c) wydziela się 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA z bulionu fermentacyjnego;d) odacylowuje się 3-(karboksyetylotio)propionylo-7-ADCA; oraze) wydziela się krystaliczny 7-ADCA.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sygnał ekspresji stosowany w etapie (a) pochodzi z genu acylotransferazy (AT).
- 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że etap (e) stanowi etap filtracji.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (c) przeprowadza się filtrację oraz ekstrakcję przesączonego bulionu rozpuszczalnikiem organicznym nie mieszającym się z wodą przy pH poniżej około 4,5, a następnie ekstrakcję wodą przy pH 4-10.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się gen ekspandazy pochodzący ze Streptomyces clavuligerus lub Nocardia lactamdurans.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93202260 | 1993-07-30 | ||
| EP93203695 | 1993-12-24 | ||
| PCT/EP1994/002544 WO1995004149A1 (en) | 1993-07-30 | 1994-07-29 | Process for the efficient production of 7-adca via 3-(carboxyethylthio)propionyl-7-adca |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL312747A1 PL312747A1 (en) | 1996-05-13 |
| PL180565B1 true PL180565B1 (pl) | 2001-02-28 |
Family
ID=26133941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94312747A PL180565B1 (pl) | 1993-07-30 | 1994-07-29 | Sposób wytwarzaniai wydzielania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA) PL PL |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5795733A (pl) |
| EP (1) | EP0711348B1 (pl) |
| JP (1) | JP3574453B2 (pl) |
| KR (1) | KR100327881B1 (pl) |
| CN (1) | CN1087780C (pl) |
| AT (1) | ATE234926T1 (pl) |
| BR (1) | BR9407104A (pl) |
| CA (1) | CA2168004A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ285622B6 (pl) |
| DE (1) | DE69432303D1 (pl) |
| ES (1) | ES2194873T3 (pl) |
| HU (1) | HU219265B (pl) |
| PL (1) | PL180565B1 (pl) |
| PT (1) | PT711348E (pl) |
| SI (1) | SI0711348T1 (pl) |
| SK (1) | SK282617B6 (pl) |
| WO (1) | WO1995004149A1 (pl) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0233715B1 (en) * | 1986-01-31 | 1994-05-25 | BEECHAM GROUP plc | Isolation and expression of genes involved in the biosynthesis of beta-lactams |
| US6709859B1 (en) | 1986-01-31 | 2004-03-23 | Beecham Group P.L.C. | Chromosomal DNA Fragments Encoding Enzymes for Encoding B-Lactam Biosynthesis Enzymes, and Vector and Transformants for Their Expression |
| US5731165A (en) * | 1995-06-02 | 1998-03-24 | Gist-Brocades, B.V. | Process for the production of 7-ADCA via expandase activity on penicillin G |
| US6020151A (en) * | 1995-06-02 | 2000-02-01 | Dsm N.V. | Process for the production of 7-ADCA via expandase activity on penicillin G |
| US5919680A (en) * | 1995-11-27 | 1999-07-06 | Isis Innovation Limited | Process for the production of SSC's via expandase activity on penicillin G |
| ZA983394B (en) | 1997-04-22 | 1998-10-30 | Gist Brocades Bv | Process for the fermentative production of deacylated cephalosporins |
| PL330760A1 (en) | 1997-04-22 | 1999-05-24 | Gist Brocades Bv | Method of obatining decylated cephalosporins by fermentation process |
| KR100648480B1 (ko) | 1998-05-19 | 2006-11-24 | 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. | 세팔로스포린의 개선된 생체내 생산 |
| US6455603B1 (en) | 1998-06-30 | 2002-09-24 | Dow Global Technologies Inc. | Polymer polyols and a process for the production thereof |
| WO2000037671A2 (en) * | 1998-12-22 | 2000-06-29 | Dsm N.V. | Improved in vivo production of cephalosporins |
| EP2851423B1 (en) | 2005-12-28 | 2016-03-02 | DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Mutant type II beta-lactam acylases |
| EP2123772A1 (en) | 2008-04-29 | 2009-11-25 | DSM IP Assets B.V. | Beta-lactam antibiotic producing strains |
| EP2310489A1 (en) * | 2008-08-05 | 2011-04-20 | DSM IP Assets B.V. | Adipoyl-7-adca producing strains |
| WO2010015627A2 (en) | 2008-08-05 | 2010-02-11 | Dsm Ip Assets B.V. | Adipoyl-7-adca producing strains |
| EP2414530A1 (en) | 2009-04-03 | 2012-02-08 | DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Fermentation process |
| CN103003439A (zh) | 2010-06-22 | 2013-03-27 | 中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司 | 气泡发酵工艺 |
| CN103108879B (zh) * | 2010-09-07 | 2016-08-17 | 中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司 | 用于生产头孢菌素类的方法 |
| ES2590488T3 (es) | 2011-03-03 | 2016-11-22 | Dsm Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Degradación de compuestos de penicilina |
| EP2809777B1 (en) | 2012-01-31 | 2019-05-29 | Centrient Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Mbth-like proteins in the production of semi synthetic antibiotics |
| WO2015091455A1 (en) | 2013-12-17 | 2015-06-25 | Dpx Holdings B.V. | Bioreactor |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5070020A (en) * | 1988-05-09 | 1991-12-03 | Eli Lilly And Company | Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode deacetoxycephalosporin c synthetase |
| US5082772A (en) * | 1988-10-24 | 1992-01-21 | Eli Lilly And Company | Process for preparing deacetylcephalosporin c |
| US5318896A (en) * | 1991-09-11 | 1994-06-07 | Merck & Co., Inc. | Recombinant expandase bioprocess for preparing 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA) |
| UA47385C2 (uk) * | 1991-10-15 | 2002-07-15 | Гіст-Брокейдс Б.В. | Спосіб одержання 7-амінодеацетилцефалоспоранової кислоти, спосіб одержання 7-аміноцефалоспоранової кислоти, вектор експресії рекомбінантної днк (варіанти), клітина-хазяїн penicillium chrysogenum (варіанти), спосіб культивування рекомбінантної клітини-хазяїна penicillium chrysogenum (варіанти) |
-
1994
- 1994-07-29 BR BR9407104A patent/BR9407104A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-07-29 HU HU9600195A patent/HU219265B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-07-29 PL PL94312747A patent/PL180565B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-07-29 CN CN94192932A patent/CN1087780C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-29 ES ES94926136T patent/ES2194873T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-29 JP JP50558495A patent/JP3574453B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-29 CZ CZ96157A patent/CZ285622B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-07-29 KR KR1019960700485A patent/KR100327881B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-29 US US08/591,501 patent/US5795733A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-29 DE DE69432303T patent/DE69432303D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-29 PT PT94926136T patent/PT711348E/pt unknown
- 1994-07-29 EP EP94926136A patent/EP0711348B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-29 CA CA002168004A patent/CA2168004A1/en not_active Abandoned
- 1994-07-29 WO PCT/EP1994/002544 patent/WO1995004149A1/en not_active Ceased
- 1994-07-29 AT AT94926136T patent/ATE234926T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-07-29 SI SI9430443T patent/SI0711348T1/xx unknown
- 1994-07-29 SK SK98-96A patent/SK282617B6/sk unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU9600195D0 (en) | 1996-03-28 |
| JPH09503908A (ja) | 1997-04-22 |
| WO1995004149A1 (en) | 1995-02-09 |
| PL312747A1 (en) | 1996-05-13 |
| ATE234926T1 (de) | 2003-04-15 |
| DE69432303D1 (de) | 2003-04-24 |
| SI0711348T1 (en) | 2003-08-31 |
| KR960704048A (ko) | 1996-08-31 |
| BR9407104A (pt) | 1996-08-27 |
| CN1128545A (zh) | 1996-08-07 |
| ES2194873T3 (es) | 2003-12-01 |
| EP0711348A1 (en) | 1996-05-15 |
| PT711348E (pt) | 2003-08-29 |
| CN1087780C (zh) | 2002-07-17 |
| CZ285622B6 (cs) | 1999-10-13 |
| HU219265B (en) | 2001-03-28 |
| CZ15796A3 (en) | 1996-07-17 |
| JP3574453B2 (ja) | 2004-10-06 |
| KR100327881B1 (ko) | 2002-07-02 |
| HUT75367A (en) | 1997-05-28 |
| CA2168004A1 (en) | 1995-02-09 |
| US5795733A (en) | 1998-08-18 |
| SK282617B6 (sk) | 2002-10-08 |
| EP0711348B1 (en) | 2003-03-19 |
| SK9896A3 (en) | 1996-09-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5726032A (en) | Process for the efficient production of 7-ADCA via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-ADCA and 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-ADCA | |
| PL180565B1 (pl) | Sposób wytwarzaniai wydzielania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (7-ADCA) PL PL | |
| CN100390285C (zh) | 体内生产头孢菌素的改良 | |
| CZ88494A3 (en) | Biological process for preparing 7-aminodeacetylcephalosporanic acid, method of growing recombinant cells penicillium chrysogenum and a vector for expression of recombinant dna | |
| Cantwell et al. | Cloning and expression of a hybrid Streptomyces clavuligerus cef E gene in Penicillium chrysogenum | |
| JP2000342289A (ja) | ペニシリン生合成遺伝子の単離法 | |
| US5919680A (en) | Process for the production of SSC's via expandase activity on penicillin G | |
| MX2007006780A (es) | Produccion de beta-lactamas en celulas individuales. | |
| WO1998002551A2 (en) | Process for the production of adipoyl cephalosporins | |
| EP0716698B1 (en) | Process for the efficient production of 7-ADCA via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-ADCA and 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-ADCA | |
| RU2139350C1 (ru) | Способ эффективного производства 7-адцк через 3-(карбоксиэтилтио)пропионил-7-адцк | |
| RU2139349C1 (ru) | Способ эффективного производства 7-адцк через 2-(карбоксиэтилтио) ацетил-7-адцк и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-адцк | |
| US6368820B1 (en) | Process for the preparation of cephalosporins using acremonium chrysogenum | |
| EP0444758A1 (en) | Method for modification of ACV synthetase and use of the modified enzyme for production of beta-lactam antibiotics | |
| Adrio et al. | Extracellular production of biologically active deacetoxycephalosporin C synthase from Streptomyces clavuligerus in Pichia pastoris | |
| JPH09503907A (ja) | ２−（カルボキシエチルチオ）アセチル−７−ａｄｃａ及び３−（カルボキシメチルチオ）プロピオニル−７−ａｄｃａを経由した７−ａｄｃａの効果的な製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20050729 |