CN104093831A - 半合成抗生素生产中的类MbtH蛋白 - Google Patents

半合成抗生素生产中的类MbtH蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN104093831A
CN104093831A CN201380007614.6A CN201380007614A CN104093831A CN 104093831 A CN104093831 A CN 104093831A CN 201380007614 A CN201380007614 A CN 201380007614A CN 104093831 A CN104093831 A CN 104093831A
Authority
CN
China
Prior art keywords
adenylylation
module
mbth
albumen
class
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380007614.6A
Other languages
English (en)
Inventor
乌尔里克·玛丽亚·穆勒尔
瑞蒙·鲍尔
鲁洛夫·阿利·兰斯·伯韦比格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centrient Pharmaceuticals Netherlands BV
Original Assignee
DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands BV filed Critical DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands BV
Publication of CN104093831A publication Critical patent/CN104093831A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y121/00—Oxidoreductases acting on X-H and Y-H to form an X-Y bond (1.21)
    • C12Y121/03—Oxidoreductases acting on X-H and Y-H to form an X-Y bond (1.21) with oxygen as acceptor (1.21.3)
    • C12Y121/03001—Isopenicillin-N synthase (1.21.3.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及制备β-内酰胺抗生素的方法，其中所述方法包括以下步骤：在类MbtH蛋白存在时，将4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸、半胱氨酸和缬氨酸与非核糖体肽合成酶接触，随后使用异青霉素N合成酶环化。本发明还涉及能够完成所述制备的宿主细胞。

Description

半合成抗生素生产中的类MbtH蛋白
发明领域
本发明涉及制备β-内酰胺抗生素的方法，其中所述方法包括以下步骤：在类MbtH蛋白存在时，将4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸、半胱氨酸和缬氨酸与非核糖体肽合成酶接触，随后使用异青霉素N合成酶环化。本发明还涉及能够完成所述制备的宿主细胞。
发明背景
类MbtH蛋白是类似于来自Mycobacterium tuberculosis的MbtH的小蛋白。虽然最近的研究表明类MbtH蛋白在肽的生物合成中起作用(尤其是促进腺苷酰化反应)，但在很大程度上其功能仍是未知的。Heemstra等人(J.Amer.Chem.Soc.(2009)131，15317-15329)已报道了在类MbtH蛋白VbsG参与时，利用腺苷酰化功能域VbsS腺苷酰化N(5)-((R)-3-羟基丁酰基)-N(5)-羟基-D-鸟氨酸。同样地，Felnagle等人(Biochemistry(2010)49，8815-8817)已报道了分别利用腺苷酰化功能域EntF、CmnO/VioO和CmnA腺苷酰化L-丝氨酸、β-赖氨酸和L-2，3-氨基丙酸。对于L-丝氨酸的腺苷酰化，显示类MbtH蛋白YbdZ的参与；对于β-赖氨酸的腺苷酰化，显示类MbtH蛋白CmnN或VioN的参与，然而还发现CmnN参与L-2，3-氨基丙酸的腺苷酰化。此外，Zhang等人(Biochemistry(2010)49，9946-9947)展示了利用腺苷酰化功能域PacL腺苷酰化m-酪氨酸时，类MbtH蛋白KtzJ、PacJ和GlbE的参与；最后，Boll等人(J.Biol.Chem.(2011)286，36281-36290)证明了利用腺苷酰化功能域CloH、SimH或Pcza361.18腺苷酰化L-酪氨酸时，类MbtH蛋白Cloy、SimY和Orflvan的参与。
编码类MbtH蛋白的基因(类mbtH基因)往往发现于原核微生物的非核糖体肽合成酶(NRPS)基因簇中。GenBank中保藏了许多类mbtH基因。为了鉴定类MbtH蛋白，BLASTP研究展示了由放线菌门、厚壁菌门和变形菌门的成员编码的同系物，但是未发现由古生菌编码的同系物(R.H.Baltz，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.(2011)38，1747-1760)。没有真核生物中类mbtH基因的报道。
微生物产生的许多次级代谢产物都具有重要价值。在这方面重要的一类是β-内酰胺抗生素(尤其是青霉素类和头孢菌素类)。生物合成青霉素的第一步是将三个氨基酸的L-异构体(L-α-氨基己二酸(A)、L-半胱氨酸(C)和L-缬氨酸(V))缩合为一个三肽(δ-(L-α-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰基-D-缬氨酸(ACV))。该步由δ-(L-α-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰基-D-缬氨酸合成酶(ACVS)催化。在第二步，ACV在异青霉素N合成酶(IPNS)作用下被氧化环化。该步反应的产物是异青霉素N，通过将其亲水性的α-氨基己二酰基侧链置换为疏水性侧链可形成青霉素G或青霉素V。在工业生产中通常使用的侧链是产生青霉素G的苯乙酸或产生青霉素V的苯氧基乙酸。置换反应由酰基转移酶催化。尽管研究显示己二酸和己二酸的某些硫代衍生物能够被置换(WO95/04148和WO95/04149)，但由于酰基转移酶的底物特异性，几乎不可能将α-氨基己二酰基侧链置换为感兴趣的任意其它侧链。特别地，工业上重要的青霉素类和头孢菌素类的侧链不能通过酰基转移酶被直接置换。因此，目前使用的大部分β-内酰胺抗生素是通过半合成方法制备的。这些半合成的β-内酰胺抗生素是通过利用一个或多个化学反应和/或酶反应修饰N-取代β-内酰胺产物得到的。这些半合成方法的缺点在于步骤繁多、不环保而且成本高。因此，利用完全发酵方法生产β-内酰胺抗生素(例如羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、依比青霉素、头孢羟氨苄、头孢氨苄和头孢拉定)是相当令人期待的。
对于半合成青霉素类和头孢菌素类的完全发酵方法，有多种选项可供考虑。WO2008/040731中建议改良青霉素生物合成方法的前两步以直接合成和分泌羟氨苄青霉素。例如，对于羟氨苄青霉素，构建包括羟氨苄青霉素侧链的三肽(即D-4-羟苯基甘氨酰基-L-半胱氨酰基-D-缬氨酸)而非ACV，随后用改良的IPNS环化所述三肽。
ACVS是催化形成LLD-ACV三肽的NRPS。在这个三肽中，L-α-氨基己二酸的δ-羧基和L-半胱氨酸的氨基之间形成肽键；此外，缬氨酸的构象从L改变为D。WO2008/040731中公开了经改良的ACVS，其能够催化L-4-羟苯基甘氨酰基-L-半胱氨酰基-D-缬氨酸和L-苯基甘氨酰基-L-半胱氨酰基-D-缬氨酸(氨苄青霉素的前体)的形成并能将第一个氨基酸的L立体化学构型更改为D构型。WO2008/040731中还公开了能够作用于D-4-羟苯基甘氨酰基-L-半胱氨酰基-D-缬氨酸和D-苯基甘氨酰基-L-半胱氨酰基-D-缬氨酸的工程IPNS和天然的IPNS。
优选地，在能够用于工业生产的生物体(例如真核生物，例如曲霉属Aspergillus和青霉菌属Penicillium)中实施上述方法。这种方法的问题在于产量仍然很低，因此需要大力改善。
发明详述
在本发明的语境中，术语“腺苷酰化功能域”是指能够识别和激活特定氨基酸的蛋白质序列。优选的腺苷酰化功能域来源于能够合并各个氨基酸的非核糖体肽合成酶。
术语“N-α-氨基-4-羟苯基乙酰基β-内酰胺抗生素”是指具有4-羟苯基甘氨酸侧链的β-内酰胺抗生素，例如羟氨苄青霉素、头孢羟氨苄、头孢曲秦、头孢哌酮、头孢匹胺、头孢丙烯以及它们的中间体等，优选的是羟氨苄青霉素。
术语“N-α-氨苯基乙酰基β-内酰胺抗生素”是指具有苯基甘氨酸侧链的β-内酰胺抗生素，例如氨苄青霉素、头孢克洛、头孢氨苄、头孢甘氨酸以及它们的中间体等，优选的是氨苄青霉素。
术语“模块”定义了能够将一个肽结构单元(通常是氨基酸)合并至产物(通常是肽)的催化单元，它可以包括用于修饰(如差向异构化和甲基化)的功能域。
术语“异源的”与模块联合使用时，是指所涉及的模块中的功能域(例如腺苷酰化功能域或缩合功能域)源于不同的模块。这些不同的模块可源于相同的酶或不同的酶。
术语“特异于”表示被称为特异于指定氨基酸的模块能够合并该氨基酸。
本发明的第一方面公开了制备N-α-氨基-4-羟苯基乙酰基或N-α-氨苯基乙酰基β-内酰胺抗生素的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)将4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸、半胱氨酸和缬氨酸与非核糖体肽合成酶(NRPS)接触，以分别产生4-羟苯基甘氨酰基-半胱氨酰基-缬氨酸三肽或苯基甘氨酰基-半胱氨酰基-缬氨酸三肽；
(b)将在步骤(a)中得到的三肽与异青霉素N合成酶接触，
其中存在类MbtH蛋白。
R.H.Baltz(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.(2011)38，1747-1760)、Felnagle等人(Biochemistry(2010)49，8815-8817)、Wenjum Zhang等人(Biochemistry(2010)49，9946-9947)和Boll等人(J.Biol.Chem.(2011)286，36281-36290)中暗示了加入类MbtH蛋白以改善原始原核宿主体外和体内的腺苷酰化，然而这些文件既没有指出这种方法可以成功用于真核生物，也没有指示在生产β-内酰胺抗生素时使用类MbtH蛋白。总之，迄今为止还没有类MbtH蛋白参与合并羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸的报道。相反，Stegman等人(FEMS Microbial Letter(2006)262，85-92)中公开了相反情况，即利用Amycolatopsis balhimycina生产糖肽(包括羟苯基甘氨酸)时，并不需要由balhimycin生物合成基因簇的内部基因编码的微小类MbtH蛋白。因此，现有技术没有提供任何关于在制备N-α-氨基-4-羟苯基乙酰基β-内酰胺抗生素或N-α-氨苯基乙酰基β-内酰胺抗生素的过程中使用类MbtH蛋白的教导。出人意料地，我们发现只有在类MbtH蛋白存在时，方可以通过本发明的腺苷酰化功能域合并L-羟苯基甘氨酸或L-苯基甘氨酸。
在第一个实施方式中，优选的类MbtH蛋白在R.H.Baltz(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.(2011)38，1747-1760)中有描述。更优选的类MbtH蛋白是包括不变的氨基酸N17、E19、Q21、S23、W25、P26、P32、G34、W35、L48、W55、T56、D57、R59和P60的那些，也可被适当表示为氨基酸代码NXEXQXSXWP-X5-PXGW-X13-L-X7-WTDXRP。在上述表示法中，字母D、E、G、L、N、P、Q、R、S、T、W和X指的是公知的单字母氨基酸代码(其中X表示1个未指定的氨基酸、X5表示5个未指定的氨基酸、X7表示7个未指定的氨基酸、X13表示13个未指定的氨基酸)。优选地，本发明的类MbtH蛋白存在于如下的生物合成簇中，其中模块M1是从所述生物合成簇中选择的(见下文)。最优选的类MbtH蛋白是在Actinoplanesteichomyceticus的teicoplanin生物合成簇中得到的Tcp13(SEQ ID NO：18)或Tcp17(SEQ ID NO：19)(Sosio等人，Microbiology(2004)150，95-102)，或者在从非培养的土壤细菌中可得到的Veg生物合成簇中鉴定的由GenBank：EU874252的第33826-34035核苷酸编码的类MbtH同系物(SEQID NO：20)(Banik J.J.和Brady S.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2008)105，17273-17277)，或者在从非培养的土壤细菌中可得到的Teg生物合成簇中鉴定的由GenBank：EU874253的第33949-33158核苷酸编码的类MbtH同系物(SEQ ID NO：32)(BanikJ.J.和Brady S.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2008)105，17273-17277)，或者在Actinoplanes balhimycina的balhimycin生物合成簇中鉴定的类MbtH同系物(SEQ ID NO：31)(Recktenwald等人，Microbiology(2002)148，1105-1118，Stegman等人，FEMSMicrobial Lett.(2006)262，85-92)，或者在Streptomyces lavendulae的complestatine生物合成簇中鉴定的类MbtH同系物(SEQ ID NO：30)(Chiu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001)98，8548-8553)，或者含有与所述序列的同一性百分比至少为30％，更优选地至少40％，甚至更优选地至少50％，最优选地至少60％的氨基酸序列的类MbtH蛋白。这些同一性百分比至少为30％的多肽模块也被称为同源序列或同系物。
因为模块的腺苷酰化功能域负责识别和激活专门的氨基酸，并将正确的氨基酸装载至其下游相邻的搭档-硫醇化功能域，所以它决定了对特定氨基酸的特异性。腺苷酰化功能域催化下述腺苷酰化反应：
ATP、Mg2+和氨基酸依次可逆结合至腺苷酰化功能域。随后，由氨基酸介导，ATP被腺苷酰化功能域可逆裂解为AMP。在这后一步骤中，释放焦磷酸。判断腺苷酰化特异性的一些合适方法是本领域已知的。
经典的放射性ATP-[32P]焦磷酸(PPi)置换试验(Santi等人(Meth.Enzymol.(1974)29，620-627))是判断腺苷酰化功能域特异性的常见方法。该方法利用AMP至ATP的可逆反应量化腺苷酰化功能域与各底物之间的反应。它利用[32P]PPi被合并至AMP时形成的被同位素标记的ATP。检测增加的被标记的ATP以探测腺苷酰化反应(例如Recktenwald等人(2002)Microbiology148，1105-1118)。为了本发明的目的，使用更新近研发的试验分析焦磷酸的形成，该试验无需使用放射性磷酸盐即可测定焦磷酸的释放。这些试验利用无机焦磷酸酶将在氨酰基-AMP形成过程中产生的焦磷酸转化为正磷酸(Pi)。为了测量正磷酸的浓度，一部分这些试验利用钼酸盐/孔雀绿试剂进行比色检验(McQuade等人2008)或者利用7-甲基-6-硫鸟苷(MESG)被嘌呤核苷磷酸化酶转换时最大吸光度的变化(如本发明的语境中所使用的)(Ehmann D.E.等人(Proc.Natl.Acad Sci.(2000)97，2509-2514)或Daniel&Aldrich(Anal.Biochem.(2010)404，56-63))。
为了完成这些试验，相应的酶优选地是纯化过的蛋白。技术人员可利用一些方法获得这些纯化过的蛋白。这些方法包括在合适的宿主生物体(例如Escherichia coli或Streptomyces lividans)内，异源过表达包括腺苷酰化功能域的整个模块或者模块的单一腺苷酰化功能域，如例如Recktenwald等人(Microbiology(2002)148，1105-1118)中所公开的。优选地，这些功能域或模块带有一个标签，可利用该标签通过亲和层析进行纯化。如本领域的技术人员所知，这些标签对于酶的表征是有用的，但对于它们在合适宿主中的性能则是不需要的。
在第二个实施方式中，本发明的NRPS构建体包括三个模块：特异于4-羟苯基甘氨酸和/或苯基甘氨酸的第一模块M1、特异于半胱氨酸的第二模块M2和特异于缬氨酸的第三模块M3。第一模块M1能够合并第一个氨基酸L-4-羟苯基甘氨酸或L-苯基甘氨酸，并优选地将其转换为相应的D-氨基酸。当被4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸结合时，第二模块M2能够合并L-半胱氨酸。特别地，当4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸是D-型时，特异于半胱氨酸的第二模块包括特异于D-供体和L-受体的缩合功能域(DCL)，该功能域与异源的腺苷酰化功能域融合。第三模块M3能够合并L-缬氨酸并将其转换为相应的D-氨基酸。NRPS以这种方式催化从L-氨基酸前体到DLD-三肽(D-4-羟苯基甘氨酰基-L-半胱氨酰基-D-缬氨酸或者D-苯基甘氨酰基-L-半胱氨酰基-D-缬氨酸)的形成。
每个NRPS模块都由所谓的“功能域”组成，每个功能域负责合并一个多肽结构单元的过程中特定的反应步骤。每个模块至少含有一个负责识别和激活氨基酸的腺苷酰化功能域和一个负责将中间体转运至催化中心的硫醇化功能域。第二模块和其它模块另外包含负责肽键形成的缩合功能域，最后一个模块进一步包含负责释放肽的终止功能域。任选地，模块可包含例如负责将被合并氨基酸的L-型转换为D-型的差向异构化功能域。NRPS的模块化结构的综述请参见Sieber等人(Chem.Rev.(2005)105，715-738)。
在第三个实施方式中，本发明所述的杂交肽合成酶的M1模块的合适来源是催化形成包括4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸的肽的NRPS，其中4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸作为所述肽的第一个氨基酸被合并。因此，选择合适的M1模块时要考虑到作为三肽的第一个氨基酸被合并的氨基酸的性质。特别地，模块的腺苷酰化功能域决定了对于特定氨基酸的选择性。因此，可基于腺苷酰化功能域对被合并氨基酸的特异性选择M1模块。可根据腺苷酰化功能域的决定特异性的特征性基序(如Stachelhaus等人(Chem.&Biol.(1999)6，493-505)和Rausch等人(Nucleic Acids Res.(2005)，33，5799-5808)中所解释的)进行选择。因为M1模块是NRPS的第一个模块，所以它不需要包含缩合功能域或终止功能域。因此，如果源模块中存在缩合和/或终止功能域，可将其适当移除以获得不含所述功能域的第一模块M1。如果L-氨基酸需要被转换为D-氨基酸，那么除含腺苷酰化功能域和硫醇化功能域之外，NRPS的M1模块还应该含有差向异构化功能域。因此，如果源模块中不存在差向异构化功能域，则将其融合至源模块的硫醇化功能域以获得含有腺苷酰化功能域、差向异构化功能域和终止功能域的第一模块M1。
优选地，从参与形成糖肽抗生素vancomycin或vancomycin类化合物(chloroeremomycin或balhimycin)的合成酶、vancomycin合成酶、chloroeremomycin合成酶或者balhimycin合成酶的特异于4-羟苯基甘氨酸的模块中可得到具有4-羟苯基甘氨酸特异性的第一模块M1。优选的模块是vancomycin合成酶、chloroeremomycin合成酶、balhimycin合成酶或者Veg合成酶的第四和第五模块(和Veg合成酶的第一和第三模块)。优选的来源是从Amycolatopsis orientalis中可得到的chloroeremomycin合成酶(Trauger等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(2000)97，3112-3117)、从Amycolatopsis balhimycina(原名Amycolatopsis mediterranei)的Blp簇中可得到的balhimycin合成酶(Recktenwald等人，Microbiology(2002)148，1105-1118)和从非培养的土壤细菌的Veg簇中可得到的Veg合成酶(BanikJ.J.和Brady S.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2008)105，17273-17277)。或者，可以从参与形成脂糖肽类抗生素teicoplanin或teicoplanin类抗生素(如A47934、A40926或Teg)的合成酶、teicoplanin合成酶、A47934合成酶、A40926合成酶或者Teg合成酶中获得特异于4-羟苯基甘氨酸的模块。优选的模块是teicoplanin合成酶、A47934合成酶、A40926合成酶或者Teg合成酶的第一、第四和第五模块。优选地，从源于Actinoplanesteichomyceticus的Tcp簇的teicoplanin合成酶(Sosio等人，Microbiology(2004)150，95-102)、从Streptomyces toyocaensis NRRL15009的Sta簇中可得到的A47934合成酶、从Nanomurea sp.ATCC39727的Dbv簇中可得到的A40926合成酶(Sosio等人，Chem.Biol.(2003)10，541-549)或者从非培养的土壤细菌的的Teg簇中可得到的Teg合成酶(Banik J.J.和Brady S.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2008)105，17273-17277)获得这些模块。或者，可以从complestatin合成酶(优选地是从Streptomyces lavendulae可以得到的complestatin合成酶)，特别是complestatin合成酶的第七模块得到特异于4-羟苯基甘氨酸的模块(Chiu等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(2001)98，8548-8553)；或者，从CDA(钙离子依赖的抗生素)合成酶，特别是CDA合成酶的第六模块(利用如Hojati等人(Chem.&Biol.(2002)9，1175-1187)所公布的CDA合成酶模块的编号)中得到具有4-羟苯基甘氨酸特异性的第一模块M1。优选地，从Streptomyces coelicolor中获得CDA合成酶。
或者，为了制备N-α-氨苯基乙酰基β-内酰胺抗生素，可以从pristinamycin合成酶，特别是pristinamycin合成酶的SnbD蛋白的羧基末端模块获得具有苯基甘氨酸特异性的第一模块M1，如Thibaut等人(J.Bact.(1997)179，697-704)所公布的。优选地，从Streptomyces pristinaspiralis中可获得pristinamycin合成酶。源于pristinamycin合成酶的羧基末端源模块含有终止功能域，但不含差向异构化功能域。为了制备作为本发明的肽合成酶的第一模块的模块，适当移除羧基末端源模块中的终止功能域并将差向异构化功能域融合至被如此修饰后的羧基末端模块的硫醇化功能域。可以从任意合适的NRPS，例如相同NRPS酶的另一个模块或者具有相似(例如4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸)或不同的腺苷酰化功能域的氨基酸特异性的不同NRPS酶的的模块获得差向异构化功能域。优选地，从Streptomyces coelicolor的CDA合成酶，优选地从所述酶第六模块(如上所详述)可获得差向异构化功能域。因此，在这个实施方式中，NRPS的模块M1是杂交的模块。上述差向异构化功能域还可以被融合至那些具有4-羟苯基甘氨酸特异性但缺少差向异构化功能域的模块M1(如第一个实施方式中所述)。
出人意料地，我们发现：在类MbtH蛋白存在时，一些具有4-羟苯基甘氨酸特异性的模块M1(如第一个实施方式中所述)能够激活L-苯基甘氨酸，因此它们适合作为第一模块M1用于构建生产N-α-氨苯基乙酰基β-内酰胺抗生素的NRPS构建体。这些模块的实例有teicoplanin合成酶、A47934合成酶或A40926合成酶的第一模块。优选地，从源于Actinoplanes teichomyceticus的Tcp簇的teicoplanin合成酶(Sosio等人，Microbiology(2004)150，95-102)、从Streptomyces toyocaensis NRRL15009的Sta簇可获得的A47934合成酶或者从Nanomurea sp.ATCC39727的Dbv簇可获得的A40926合成酶(Sosio等人，Chem.Biol.(2003)10，541-549)中获得这些第一模块。更进一步，这些模块是teicoplanin合成酶或Veg合成酶的第三模块。优选地，从源于Actinoplanes teichomyceticus的Tcp簇的teicoplanin合成酶(Sosio等人，Microbiology(2004)150，95-102)或者从非培养的土壤细菌的Veg簇中可获得的Veg合成酶(Banik J.J.和Brady S.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2008)105，17273-17277)中获得这些第一模块。更进一步，这些模块是chloroeremomycin合成酶或balhimycin合成酶的第五模块。优选的第五模块的来源是从Amycolatopsis orientalis可获得的chloroeremomycin合成酶(Trauger等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(2000)97，3112-3117)和从Amycolatopsis balhimycina(原名Amycolatopsis mediterranei)的Blp簇中可获得的balhimycin合成酶(Recktenwald等人，Microbiology(2002)148，1105-1118)。
在第四个实施方式中，肽合成酶的第二模块M2应该能够合并三肽DLD-XCV的第二个氨基酸-半胱氨酸，其中X是4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸。如Stachelhaus等人(Chem.&Biol.(1999)8，493-505)中所公布的，可基于腺苷酰化功能域的决定特异性的特征性基序选择该模块。第二模块M2的一个实例是肽合成酶Ecm7的第一模块，通过突变除去Ecm7的N-甲基化活性(如Watanabe等人(Curr.Opin.Chem.Biol.(2009)13，189-196)中所述)，使所述模块在利用Streptomyces lasaliensis生物合成echninomycin(一种醌霉素抗生素)时天然地合并N-Me-L-Cys-N-Me-L-Val(Watanabe等人在Nat.Chem.Biol.(2006)2，423-428)。
为了将L-半胱氨酰受体连接至D-X-氨酰基供体，M2模块的缩合功能域是DCL功能域(如上文所概述以及Clugston等人(Biochemistry(2003)42，12095-12104)中所解释的)。该DCL功能域被融合至异源的腺苷酰化功能域。包括这种DCL-腺苷酰化功能域构型的杂交M2模块能够合并半胱氨酸。在一个优选的实施方式中，从本发明的肽合成酶的第一模块M1的源模块的紧邻下游模块中可获得M2模块的DCL功能域。例如，肽合成酶的M2模块的DCL功能域是CDA合成酶(第一模块M1的来源)的第七模块的DCL功能域。在另一个实施方式中，肽合成酶的M2模块的DCL功能域是Bacillus subtilisRB14的Iturin合成酶(蛋白质ItuC)的第二模块的DCL功能域，如Tsuge等人(J.Bacteriol.(2001)183，6265-6273)中所解释的。在本发明的一个优选实施方式中，至少可以从肽合成酶的第三模块M3的来源酶中获得部分肽合成酶的第二模块M2。特别地，从本发明的肽合成酶的第三模块的源模块的紧邻上游模块中可获得肽合成酶的M2模块的腺苷酰化功能域和硫醇功能域。例如，肽合成酶的M2模块的腺苷酰化功能域和硫醇功能域可以是ACVS的第二模块的腺苷酰化功能域和硫醇功能域。
在第五个实施方式中，肽合成酶的第三模块M3能够合并三肽的第三个氨基酸-缬氨酸并将其转换为D-型，以产生三肽DLD-XCV。第三模块M3的一个实例是肽合成酶Ecm7的第二模块，通过突变除去Ecm7的N-甲基化活性(如Watanabe等人(Curr.Opin.Chem.Biol.(2009)13，189-196)中所述)并将差向异构化功能域融合至硫醇化功能域，使所述模块能够天然地将N-Me-L-Cys-N-Me-L-Val合并至Streptomyces lasaliensis的echninomycin(Watanabe等人在Nat.Chem.Biol.(2006)2，423-428)。可以从任意合适的NRPS，例如相同NRPS酶的另一个模块或者不同NRPS酶的具有相似(例如L-缬氨酸)或不同的腺苷酰化功能域的氨基酸特异性的不同的模块获得差向异构化功能域。在本发明的一个优选实施方式中，可以从ACVS，优选地从ACVS的第三模块中获得肽合成酶的第三模块。如上所述的ACVS优选地是细菌或真菌的ACVS，更优选地是从Nocardia lactamdurans可得到的细菌ACVS或者从丝状真菌(例如Penicillium chrysogenum、Acremoniumchrysogenum和Aspergillus nidulans)可得到的真菌ACVS。
肽合成酶的模块M1、M2和M3可以含有如WO2008/040731中所公开的氨基酸序列。因此，肽合成酶的M1模块含有，例如根据WO2008/040731的SEQ ID NO：2或4或者本发明的SEQ ID NO：1-9的氨基酸序列，或者与所述序列的同一性百分比至少30％，更优选地至少40％，甚至更优选地至少50％，最优选地至少60％的氨基酸序列。同一性百分比至少30％的这种多肽模块也被称为同源序列或同系物。同样地，肽合成酶的M2模块含有，例如根据WO2008/040731的SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列或者与所述序列的同一性百分比至少30％，更优选地至少40％，甚至更优选地至少50％，最优选地至少60％的氨基酸序列。最后，肽合成酶的M3模块含有，例如根据WO2008/040731的SEQ ID NO：10的氨基酸序列或者与所述序列的同一性百分比至少30％，更优选地至少40％，甚至更优选地至少50％，最优选地至少60％的氨基酸序列。
可以通过如WO2008/040731中所公开的方法获得本发明的NRPS构建体的模块。通常，模块的腺苷酰化功能域决定了对特定氨基酸的特异性，但差向异构化功能域和缩合功能域可从选择的任意模块中获得。可以通过以适当的顺序融合适当的功能域和/或模块来构建工程NRPS。也可以将一种酶的模块或功能域置换为合适的另一种酶的模块或功能域。可以使用本领域公知的基因工程技术实现这种功能域和/或模块的融合或置换。通常可在模块或功能域之间的连接区域完成两种不同模块或功能域的融合。请参见例如公开这些构建方法的EP1255816和Mootz等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(2000)97，5848-5853)。也可以通过定制合成适当的多核苷酸序列以获得部分或全部序列。
例如，可以在连接位置(更具体地，如果是羧基末端模块，则在缩合功能域和特异于4-羟苯基甘氨酸模块的腺苷酰化功能域之间；如果是内部延伸模块，则在缩合功能域和特异于4-羟苯基甘氨酸模块的腺苷酰化功能域之间以及差向异构化功能域和随后的功能域(缩合功能域或终止功能域)中间)利用限制性内切酶消化相应NRPS基因进行分离，从而将源于特异于4-羟苯基甘氨酸的NRPS模块的腺苷酰化-硫醇化-差向异构化三功能域片段融合至ACVS的二模块的特异于半胱氨酸-缬氨酸的片段。可通过以下步骤获得ACVS的二模块的特异于半胱氨酸-缬氨酸的片段：1)保留羧基末端的完整，和2)将特异于半胱氨酸的模块2的缩合功能域置换为具有DCL特异性的缩合功能域。类似于腺苷酰化-硫醇化-差向异构化片段的分离，可分离包括邻近下游模块的缩合功能域的腺苷酰化-硫醇化-差向异构化-缩合化四功能域片段。后者被融合至ACVS的二模块的特异于半胱氨酸-缬氨酸的片段(不含上游缩合功能域)。
在第六个实施方式中，可以使用基因突变技术适当处理本文所述的NRPS酶，例如用以改善酶的催化性能。可以通过合成的方法生产本文所述的多肽，但通常通过在合适的宿主生物体中表达编码多肽的多核苷酸序列重组产生。使用如WO2008/040731中所述的方法获得编码本发明的NRPS构建体的多核苷酸、具有改善活性的多肽和包括所述多核苷酸的载体。
本发明的第二方面提供宿主细胞，其中用如WO2008/040731中所述的多核苷酸(或载体)和根据本发明所述的允许表达类MbtH蛋白的多核苷酸转化所述宿主细胞或者所述宿主细胞包括上述多核苷酸(或载体)和多核苷酸。合适的宿主细胞能够使感兴趣的多肽高水平表达。如果需要产生并进一步使用多肽(例如在体外反应中)，则可使用这种宿主细胞。如果生产的本发明的多肽实质上不含具有与本发明的多肽相似的活性的其它多肽，那么可以选择异源宿主。这可以通过选择通常不产生具有相似活性的这种多肽的宿主实现。能够产生β-内酰胺化合物的细胞也是合适的宿主细胞，优选能够高水平产生β-内酰胺化合物的细胞。可基于生产青霉素或头孢菌素化合物的选项来选择宿主。
在一个实施方式中，合适的宿主细胞中编码ACVS和/或IPNS酶的原生基因被灭活，例如通过插入失活。还可以删除包括编码ACVS、IPNS和AT的基因的完整青霉素生物合成簇。用这种方法可以在生产感兴趣的β-内酰胺化合物的同时不产生天然β-内酰胺。可使用如上所述的编码NRPS和/或IPNS的基因实现插入失活。在含有多拷贝的β-内酰胺基因簇的宿主细胞中，可选择天然缺失这些基因簇的宿主细胞。例如，WO2007/122249中描述了β-内酰胺基因簇的缺失。
另一个合适的宿主细胞能够合成前体氨基酸-4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸。WO2002/034921中公开了产生4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸的生物合成通路基因的异源表达。通过下述步骤实现4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸的生物合成：首先从芳香族氨基酸通路中分别回收4-羟基苯丙酮酸或苯丙酮酸，接着所述成分被分别转换为4-羟基扁桃酸或扁桃酸，然后被分别转换为4-羟苯基乙醛酸或苯基乙醛酸，最后被分别转换为D-4-羟苯基甘氨酸或D-苯基甘氨酸。
另一个合适的宿主细胞(过)表达4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶。4’-磷酸泛酰巯基乙胺(4'-phosphopantetheine)是脂肪酸合成酶和聚酮合成酶的酰基载体蛋白以及NRPS的肽基载体蛋白的基本辅基(prosthetic group)。
在单体前体的多步骤组装过程中，4’-磷酸泛酰巯基乙胺的游离硫醇部分与酰基反应中间体(通常是乙酰基、丙二酰基和氨酰基)共价结合为硫酯。4’-磷酸泛酰巯基乙胺部分来源于辅酶A，翻译后被转移至不变的丝氨酸侧链。4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶催化脱辅基蛋白(apoprotein)转换为全蛋白，该过程依赖Mg2+。(过)表达具有广泛底物特异性的4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶是有益的。例如，Bacillus brevis的gsp基因编码这种4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(如Borchert等人(J.Bacteriol.(1994)176，2458-2462)中所述)。
宿主可适当地包括一种或多种上述修饰。优选的宿主是能够用于工业生产的微生物，例如真核生物，如青霉菌属(例如Penicilliumchrysogenum)、支项孢属(例如Acremonium chrysogenum)和曲霉属(例如Aspergillus nidulans)。
附图说明
图1-图4描述了焦磷酸释放试验中，对于底物L-苯基丙氨酸(□)、D-苯基丙氨酸(■)、L-羟苯基甘氨酸(●)和D-羟苯基甘氨酸(▲)的腺苷酰化活性测定值，其中使用无底物的孵化以使测定值标准化。X-轴：
时间(min)；Y-轴：吸收值(360nm)。
图1：使用控制蛋白TycA
图2：使用StaA_M1_A
图3：使用Veg8_M1_A
图4：使用Veg8_M1_A和Tcp13
实施例
通用材料和方法
分子和遗传技术
标准的遗传和分子生物学技术是本领域已知的(例如Maniatis等人”Molecular cloning：a laboratory manual”(1982)Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；Miller”Experiments in moleculargenetics”(1972)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；Sambrook和Russell”Molecular cloning：a laboratory manual”(3rdedition)”(2001)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel“Current protocols in molecular biology”(1987)Green Publishing andWiley Interscience，New York)。
质粒和菌株
pMAL-c5x从New England Biolabs Inc.获得，pACYCtac在先前已有描述(M.“Untersuchungen zumEinflussBereitstellung vanErythrose-4-Phosphat und Phosphoenolpyruvat auf den Kohlesrofffluss in denAromatenbiosyntheseweg von Escherichia coli”，Berichte desForschungszentrums Jülich，3824，ISSN0944-2952(PhD Thesis，Universityof Düsseldorf))。使用Escherichia coli菌株Top10(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)或DH10b(Grant等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87，4645-4649)进行克隆和表达蛋白。如Mootz，H.D.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97，5848-53)以及Mootz H.D.和Marahiel，M.A.(JBacteriol.(1997)179，6843-6850)中所述的Escherichia coli菌株M15pQE60-tycA pRep4由Prof.M.Marahiel，Philipps University Marburg，Marburg，Germany提供。
培养基
Escherichia coli生长于2×PY培养基(16g/l BD BBLTM PhytoneTMPeptone，10g/l酵母提取物，5g/l NaCl)。补充抗生素(取决于所用质粒，使用100μg/ml氨苄青霉素，或50μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml氯霉素，或100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml新霉素)以维持质粒。使用终浓度为0.03-0.5mM的IPTG以诱导基因表达。
鉴定质粒
利用本领域公知的遗传、生化和/或表型方法(例如转化株对抗生素的抗性、质粒DNA的纯化、纯化质粒DNA的限制性酶切分析或DNA序列分析)鉴定带有不同基因的质粒。
从Uniprot/NCBI-ENV-PAT数据库中现有的NRPS序列中收集的推定的 HPG腺苷酰化功能域
表1
从UniRef100和NCBI env_nr以及蛋白数据库中收集同时含有腺苷酰化功能域(Pfam标示为AMP-结合)、磷酸泛酰巯基乙胺基-结合功能域(Pfam标示为PP-结合)和缩合功能域(Pfam标示为缩合)这些Pfam轮廓特征的所有蛋白质。这些蛋白质是推定的NRPS蛋白。推定的NRPS蛋白序列选自UniRef100和NCBI env_nr以及专利蛋白数据库。推定的HPG腺苷酰化功能域选自NRPS蛋白序列。除了使用NRPSpredictor程序(Rausch等人(Nucleic Acids Res.(2005)，33，5799-5808))预测之外，还使用所谓的Stachelhaus代码(距离底物结合的活性位置最近的10个氨基酸(Stachelhaus等人(Chem.&Biol.(1999)６，493-505)))预测与鉴定的NRPS的腺苷酰化功能域结合的优选氨基酸。在被预测为偏好4-羟苯基甘氨酸的腺苷酰化功能域中，根据腺苷酰化特异性的生化特征做出如下选择(表1)。
实施例1
在Escherichia coli中合成设计、克隆、表达和纯化被预测为特异于L-羟苯基甘氨酸的NRPS腺苷酰化功能域
表达构建体
设计其密码子针对Escherichia coli被优化的腺苷酰化功能域(具有如上所示的SEQ ID NO：2-9、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27)合成构建体，即核苷酸SEQ ID NO：10-17、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，然后在DNA2.0订购。所有合成构建体(重组蛋白)的羧基末端都带有用于后续亲和层析的羧基末端6*组蛋白-标签(6*His-tag)(附加的编码氨基酸序列GSRSHHHHHH的核苷酸序列)，其侧翼是限制性内切酶克隆位点Ndel/Sbfl，用于后续在表达载体pMAL-c5x的Ndel/Sbfl位点进行克隆。将合成DNA片段克隆至该载体导致融合蛋白(单独的A-功能域和氨基端麦芽糖结合蛋白)的表达，从而使Escherichia coli高水平表达可溶性蛋白。将由DNA2.0提供的合成构建体的Ndel/Sbfl片段克隆至表达载体pMAL-c5x的Ndel/Sbfl位点以构建能够过表达腺苷酰化功能域的最终质粒，这些质粒被命名为pMAL-Dbv25_M1_A、pMAL-StaA_M1_A、pMAL-CepB_M2_A、pMAL-BpsB_M2_A、pMAL-Veg8_M1_A、pMAL-Tcp11_M1_A、pMAL-StaC_M2_A、pMAL-ComB_M1_A、pMAL-BpsB_M1_A、pMAL-Teg7_M1_A。在构建质粒pMAL-StaA_M1_A时，因为订购的片段错误地包含额外的Sfbl位点，所以需要用Sbfl局部消化合成构建体SEQ ID NO：11以便于克隆。
在Escherichia coli中表达蛋白质
含有质粒pMAL-Dbv25_M1_A、pMAL-StaA_M1_A、pMAL-CepB_M2_A、pMAL-BpsB_M2_A、pMAL-Veg8_M1_A、pMAL-Tcp11_M1_A、pMAL-StaC_M2_A、pMAL-ComB_M1_A、pMAL-BpsB_M1_A或pMAL-Teg7_M1_A的Escherichia coli起始培养物(starterculture)在3ml的具有100μg/ml氨苄青霉素的2*PY培养基中于37℃生长过夜。第二天，用预培养物接种装有100ml的具有100μg/ml氨苄青霉素的2*PY培养基的0.5升摇瓶至OD600nm为0.015，然后在30℃、280rpm下生长。当OD600nm达到0.4-0.6时，在18℃、280rpm下培养摇瓶1小时。随着这种温度(预)变化，加入3μl1M IPTG，然后使培养物在18℃、220rpm下生长过夜。
无细胞提取物的制备和组蛋白-标签的纯化：
离心(5000rpm，10分钟，4℃)50ml在前面段落中所述的培养物获得细胞，然后在1ml提取缓冲液(50mM Hepes pH8.0，5mM DTT，100mM NaCl，1x无EDTA完全蛋白酶抑制剂混合物(EDTA-free Completeprotease inhibitor cocktail，Roche))中重悬细胞团块。利用超声处理(9×10秒工作/15秒停止)裂解细胞，期间保持细胞在冰上。离心(14000rpm，15分钟，4℃)超声后的样品以除去细胞碎片，然后将含有可溶蛋白的上清液(无细胞提取物)转移至新的小瓶并置于冰上直至进一步使用。使用Metal Affinity Resin，依照制造商的操作流程(ClontechLaboratories，Inc.US；Protocol No.PTl320-1，Version No.PR6Z2142，第30页；VIII B Bach/Gravity-Flow Column Purification)纯化带有组蛋白标签的蛋白。用50mM Hepes pH8.0平衡和洗涤柱子。用50mM HepespH8.0+150mM咪唑洗脱。收集1ml洗脱部分并维持置于冰上。纯化后的蛋白被指定为Dbv25_M1_A、StaA_M1_A、CepB_M2_A、BpsB_M2_A、Veg8_M1_A、Tcp11_M1_A、StaC_M2_A、ComB_M1_A、BpsB_M1_A或Teg7_M1_A。
分析纯化后的蛋白
利用SDS-PAGE分析方法(使用根据制造商操作流程的NuPAGE胶)分析无细胞提取物和组蛋白-标签纯化过程中收集到的不同洗脱部分中腺苷酰化功能域所对应的蛋白质和正确尺寸的存在。对于所有过表达的腺苷酰化功能域，各种尺寸的蛋白的纯化均被证实。使用Coomassie PlusTM(Bradford)Assay Reagent(Thermo Scientific，PIERCE)，依照制造商的操作流程测定不同样品的蛋白浓度。
实施例2
表达和纯化包括特异于苯丙氨酸的腺苷酰化功能域的TycA(腺苷酰化活性试验的内控)
使用Escherichia coli菌株M15 pQE60-tycA pRep4(参见“质粒和菌株”)过表达和纯化TycA，其中TycA是利用Bacillus brevis合成短杆菌酪肽(tyrocidine)过程中的第一个单模块的肽合成酶。用实施例1中所述的方法表达和纯化TycA，其中做如下变化：培养基中使用的抗生素为100μg/ml的氨苄青霉素和25μg/ml的新霉素；当主培养物在30℃、280rpm下生长至OD600nm为0.4-0.6时，加入50μl1M IPTG以完成诱导；诱导后，细胞在30℃、280rpm下额外生长3小时再收获。用实施例1中所述的方法制备细胞裂解物和纯化蛋白。
实施例3
合成设计和克隆源于teicoplanin簇的类MbtH蛋白Tcp11、Tcp13和源于Veg簇的类MbtH蛋白VMbtH
选择三种不同的类MbtH蛋白，其中有两个来源于teicoplanin生物合成簇，分别被注释为tcp13(SEQ ID NO：18，GenBank：AJ605139Genomic DNA；Translation：CAE53354.1)和tcp17(SEQ ID NO：19，GenBank：AJ605139Genomic DNA；Translation：CAE53358.1)，还有一个来源于Veg生物合成簇。因为最后一个类MbtH蛋白在公共数据库中还没有被注释，并且是通过在Veg簇(SEQ ID NO：20，GenBank：EU874252，核苷酸33826-34035，位于veg9和veg10之间)中搜索同源的类MbtH蛋白序列而被鉴定的，因此它被命名为VMbtH。通过合成构建(DNA2.0)编码所选蛋白的目标基因，即核苷酸SEQ ID NO：21-23，然后在DNA2.0订购。选择编码Tcp13和Tcp17的基因作为野生型序列，但对编码VMbtH的基因进行密码子优化以在Escherichia coli中表达。每个开放阅读框(OFR)的前面是保守的核糖体结合位点，侧翼是BamHI和SbfI的限制性位点(用于在表达质粒pACYCtac中进行最终克隆)。将由DNA2.0提供的合成构建体的BamHI/Sbfl片段克隆至表达载体pACYCtac的BamHI/Sbfl位点以构建能够过表达类MbtH蛋白的最终质粒，这种质粒被命名为pACYCtac-Tcp13、pACYCtac-Tcp17和pACYCtac-VMbtH。
实施例4
合成设计和克隆源于complestatine簇、balhimycin簇和Teg簇的类MbtH蛋白
选择三种附加的类MbtH蛋白，其中一个是来源于complestatine生物合成簇(被注释为假定蛋白(SEQ ID NO：30，GenBank：AF386507Genomic DNA；Translation：AAK81828.1)的CMbtH，一个是来源于balhimycin生物合成簇(被注释为假定蛋白(SEQ ID NO：31，GenBank：Y16952.3Genomic DNA；Translation：CAC48363.1)的BMbtH，另外一个来源于Teg生物合成簇。最后一个类MbtH蛋白在公共数据库中还没有被注释，其是通过在Teg簇(SEQ ID NO：32，GenBank：EU874253，nt33826-34035，位于teg8和teg9之间)中搜索同源的类MbtH蛋白序列而被鉴定的，它被称为TMbtH。通过合成构建(DNA2.0)编码所选蛋白的目标基因，即核苷酸SEQ ID NO：33-35，然后在DNA2.0订购，进行密码子优化以在Escherichia coli中表达。所述构建体(重组蛋白)的羧基末端都带有可用于亲和层析的羧基末端6*组蛋白-标签(附加的编码氨基酸序列PGGHHHHHH的核苷酸序列)。每个开放阅读框的前面是保守的核糖体结合位点，其侧翼是BamHI和SbfI的限制性位点(用于在表达质粒pACYCtac中进行最终克隆)。将由DNA2.0提供的合成构建体的BamHI/Sbfl片段克隆至表达载体pACYCtac的BamHI/Sbfl位点以构建能够过表达类MbtH蛋白的最终质粒，这种质粒被命名为pACYCtac-BMbtH、pACYCtac-CMbtH和pACYCtac-TMbtH。
实施例5
腺苷酰化功能域和类MbtH蛋白的共表达和共纯化
使用含有能够过表达腺苷酰化功能域的pMAL质粒(如实施例1所述)和能够过表达类MbtH蛋白的pACYCtac质粒(如实施例3和实施例4所述)的Escherichia coli菌株以共表达和共纯化这两个蛋白。使用如实施例1中所述的方法表达和纯化腺苷酰化功能域和类MbtH蛋白，不同之处在于在培养基中使用的抗生素是50μg/ml的氨苄青霉素和20μg/ml的氯霉素。用如实施例1中所述的方法对洗脱部分进行SDS page分析，证实了这两个单独蛋白的纯化，其中一个具有单独的腺苷酰化功能域的尺寸，另一个具有类MbtH蛋白的尺寸。尽管类MbtH蛋白Tcp13、Tcp17和VMbtH不携带组蛋白-标签，但由于它们与共表达的腺苷酰化功能域紧密结合，因此能够被共纯化。
实施例6
在类MbtH蛋白存在或不存在时，合成设计、克隆、表达和纯化NRPS的腺苷酰化-硫醇化二功能域
表达构建体
设计用于腺苷酰化-硫醇化二功能域的合成构建体，其中腺苷酰化-硫醇化二功能域包括野生型核苷酸序列编码的SEQ ID NO：1和其邻近的硫醇功能域(存在于Tcp9编码蛋白)。所述构建体(重组蛋白)的羧基末端带有用于后续亲和层析的羧基末端6*组蛋白-标签(附加的编码氨基酸序列GSRSHHHHHH的核苷酸序列)，其侧翼是限制性内切酶克隆位点Ndel/Sbfl(用于后续在表达载体pMAL-c5x的Ndel/Sbfl位点进行克隆)。将合成DNA片段克隆至该载体导致融合蛋白(单独的AT-二功能域和氨基端的麦芽糖结合蛋白)的表达，从而使Escherichia coli高水平表达可溶性蛋白。将由DNA2.0提供的合成构建体SEQ ID NO：24的Ndel/Sbfl片段克隆至表达载体pMAL-c5x的Ndel/Sbfl位点以构建能够过表达腺苷酰化-硫醇化二功能域的最终质粒，这种质粒被命名为pMAL-Tcp9_M1_AT。
用实施例1中所述的方法表达和纯化单独的腺苷酰化-硫醇化二功能域，纯化后的蛋白被指定为Tcp9_M1_AT。用实施例5中所述的方法共表达和共纯化腺苷酰化-硫醇化二功能域和类MbtH蛋白。用如实施例1中所述的方法对洗脱部分进行SDS page分析，证实了单独的腺苷酰化-硫醇化二功能域或者两个单独蛋白质的纯化，其中一个蛋白具有单独的腺苷酰化-硫醇化二功能域的尺寸，另一个蛋白具有类MbtH蛋白的尺寸。尽管类MbtH蛋白Tcp13、Tcp17和VMbtH不携带组蛋白-标签，但由于它们与共表达的腺苷酰化-硫醇化二功能域紧密结合，因此能够被共纯化。
实施例7
在类MbtH蛋白存在或不存在时，合成设计、克隆、表达和纯化NRPS的腺苷酰化-硫醇化-差向异构化三功能域
表达构建体
设计其密码子针对Escherichia coli被优化的合成构建体，其包括具有SEQ ID NO：6的腺苷酰化功能域、其邻近的硫醇功能域和存在于Veg8编码蛋白的差向异构化功能域。所述构建体(重组蛋白)的羧基末端带有用于后续亲和层析的羧基末端6*组蛋白-标签(附加的编码氨基酸序列GSRSHHHHHH的核苷酸序列)，其侧翼是限制性内切酶克隆位点Ndel/Sbfl(用于后续在表达载体pMAL-c5x的Ndel/Sbfl位点进行克隆)。将合成DNA片段克隆至该载体导致融合蛋白(单独的ATE-三功能域和氨基端的麦芽糖结合蛋白)的表达，从而使Escherichia coli高水平表达可溶性蛋白。将由DNA2.0提供的合成构建体SEQ ID NO：25的Ndel/Sfbl片段克隆至表达载体pMAL-c5x的Ndel/Sbfl位点以构建能够过表达腺苷酰化-硫醇化二功能域的最终质粒，这种质粒被命名为pMAL-Veg8_M1_ATE。
用实施例1中所述的方法表达和纯化单独的腺苷酰化-硫醇化-差向异构化三功能域，纯化后的蛋白被指定为Veg8_M1_ATE。用实施例5中所述的方法共表达和共纯化腺苷酰化-硫醇化-差向异构化三功能域和类MbtH蛋白。
用如实施例1中所述的方法对洗脱部分进行SDS page分析，证实了单独的腺苷酰化-硫醇化二功能域或者两个单独蛋白的纯化，其中一个蛋白具有单独腺苷酰化-硫醇化二功能域的尺寸，另一个蛋白具有类MbtH蛋白的尺寸。尽管类MbtH蛋白Tcp13、Tcp17和VMbtH被预测为不携带组蛋白-标签，但由于它们与腺苷酰化-硫醇化-差向异构化三功能域紧密结合，因此能够被一起纯化。
实施例8
利用焦磷酸释放试验测定推定的L-羟苯基甘氨酸腺苷酰化功能域、腺苷酰化-硫醇化二功能域和腺苷酰化-硫醇化-差向异构化三功能域的腺苷酰化活性
用稍作修改的Ehmann D.E.等人(Proc Nat Acad Science(2000)97，2509-2514)中所述的方法，使用焦磷酸实验套件(LifeTechnologies)测定这些腺苷酰化功能域的腺苷酰化活性。在96孔UV/Vis透明板(BD Falcon)中完成反应。体积为70ul的反应混合物包括50mMHEPES pH8.0、10mM MgCl2、5mM ATP、75mM DTT、0.03U无机焦磷酸酶(IP)、1U嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和0.2mM MESG。接着加入20μl(终浓度约为0.5-2μM)纯化后的A(T)功能域，加入或不加入被共纯化的类MbtH助蛋白。然后在常温下预孵化反应物15分钟以减少磷酸污染。预孵化之后，加入10ul 10mM或1mM适当的氨基酸溶液(取决于实施的特异性测定)以起始腺苷酰化反应，然后使用TECAN I Control分光光度计测定在360nm的吸收值。在最多240分钟内，每5-10分钟测定一次吸收值。使用10ul MilliQ水代替反应物以测定并减去背景吸收值。使用下列氨基酸作为底物：D-或L-苯丙氨酸、D-或L-羟苯基甘氨酸、D-或L-苯基甘氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸和L-亮氨酸。
图1展示了使用TycA作为控制蛋白时，焦磷酸释放试验的吸收测定曲线图。尽管L-和D-苯丙氨酸可以被接受作为底物，检测不到对L-和D-羟苯基甘氨酸的腺苷酰化活性。除L-和D-苯丙氨酸之外，L-色氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸也显示出相似的被TycA识别和腺苷酰化的活性(数据未被展示)，但检测不到对L-半胱氨酸的腺苷酰化活性(数据未被展示)，这与Villiers和Hollfelder(ChemBioChem(2009)10，671-682)的发现一致。
图2展示了使用源于StaA_M1_A的单一腺苷酰化功能域时，焦磷酸释放试验的吸收测定曲线图。既没有检测到对L-或D-羟苯基甘氨酸的腺苷酰化活性，也没有检测到对L-或D-苯基丙氨酸的腺苷酰化活性。腺苷酰化功能域Dbv25_M1_A、CepB_M2_A、BpsB_M2_A、Tcp11_M1_A、StaC_M2_A、ComB_M1_A、BpsB_M1_A、Teg7_M1_A或者Tcp9_M1_AT的腺苷酰化-硫醇化二功能域的曲线图提供了相同的结果(数据未被展示)。能够证实对L-或D-羟苯基甘氨酸没有腺苷酰化活性。
图3展示了使用源于VegA_M1_A的单一腺苷酰化功能域时，焦磷酸释放试验的吸收测定曲线图。对于L-羟苯基甘氨酸，检测到了非常微弱的腺苷酰化活性；但没有检测到对D-羟苯基甘氨酸、D-和L-苯丙氨酸的腺苷酰化活性。
图4展示了使用源于VegA_M1_A的单一腺苷酰化功能域时，焦磷酸释放试验的吸收测定曲线图，其中VegA_M1_A与类MbtH蛋白Tcp13一起被共纯化。对于L-和D-羟苯基甘氨酸，检测到了明显的腺苷酰化活性；但没有检测到对L-或D-苯基丙氨酸的腺苷酰化活性。与类MbtH蛋白Tcp13一起被共纯化的CepB_M2_A、BpsB_M2_A、Tcp11_M1_A、StaC_M2_A或者Tcp9_M1_AT的腺苷酰化-硫醇化二功能域或者Veg8_M1_ATE的腺苷酰化-硫醇化-差向异构化三功能域的腺苷酰化活性测定曲线展示了相同的结果(数据展示于表3)。与类MbtH蛋白VMbtH一起被共纯化的StaA_M1_A和Dbv25_M1_A的腺苷酰化活性测定曲线展示了相同的结果(数据展示于表3)。
表2概括了与类MbtH蛋白Tcp13或Tcp17或VMbtH一起被共纯化的单一腺苷酰化功能域Tcp11_M1_A和VegA_M1_A、Tcp9_M1_AT的腺苷酰化-硫醇化二功能域或者Veg8_M1_ATE的腺苷酰化-硫醇化-差向异构化三功能域的腺苷酰化活性测定值，表示为每mM蛋白质每分钟形成的焦磷酸的量。在测定均与类MbtH蛋白Tcp13或Tcp17或VMbtH一起被共纯化的Comb_M1_A、BpsB_M1_A和Teg7_M1_A的腺苷酰化活性时，没有检测到对D-或L-羟苯基甘氨酸、D-或L-苯基甘氨酸或者对D-或L-苯基丙氨酸的腺苷酰化活性(数据未展示于表3)。与类MbtH蛋白CMbtH(和A功能域源于相同的生物合成簇)一起被共纯化的ComB_M1_A的腺苷酰化活性测定值证实了其对L-或D-羟苯基甘氨酸的活性；与类MbtH蛋白BMbtH(和A功能域源于相同的生物合成簇)一起被共纯化的BspB_M1_A的腺苷酰化活性测定值证实了其对L-羟苯基甘氨酸的活性，与类MbtH蛋白TMbtH一起被共纯化的Teg7_M1_A的腺苷酰化活性测定值确定了相同的特异性。
表3综合概括了对于不同氨基酸底物，单一腺苷酰化功能域或Tcp9_M1_AT的腺苷酰化-硫醇化二功能域或Veg8_M1_ATE的腺苷酰化-硫醇化-差向异构化三功能域和被共纯化的类MbtH蛋白(Tcp13或Tcp17或VMbtH或CMbtH或BMbtH或TMbtH)的不同组合的腺苷酰化活性测定值(相对腺苷酰化活性)。
表2：焦磷酸释放试验中，与类MbtH助蛋白Tcp13、Tcp17或VMbtH组合的Tcp11_M1_A、Veg8M1_A、Tcp9_M1_AT和Veg8_M1_ATE的腺苷酰化活性测定值。
表3

Claims (11)

1.制备N-α-氨基-4-羟苯基乙酰基β-内酰胺抗生素或N-α-氨苯基乙酰基β-内酰胺抗生素的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)将4-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸、半胱氨酸和缬氨酸与非核糖体肽合成酶接触，以分别产生4-羟苯基甘氨酰基-半胱氨酰基-缬氨酸三肽或苯基甘氨酰基-半胱氨酰基-缬氨酸三肽；
(b)将在步骤(a)中得到的三肽与异青霉素N合成酶接触，
其特征在于类MbtH蛋白的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述类MbtH蛋白具有SEQ ID NO：18、19、20、30、31或32或者至少50％同源于SEQ ID NO：18、19或20、30、31或32的序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述类MbtH蛋白具有氨基酸代码NXEXQXSXWP-X5-PXGW-X13-L-X7-WTDXRP。
4.根据权利要求1-3中的任意一项所述的方法，其中所述非核糖体肽合成酶包括特异于4-羟苯基甘氨酸和/或苯基甘氨酸的第一模块M1、特异于半胱氨酸的第二模块M2和特异于缬氨酸的第三模块M3。
5.根据权利要求1-4中的任意一项所述的方法，其中在真核微生物中进行所述方法。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述真核微生物是青霉菌属。
7.根据权利要求4-6中的任意一项所述的方法，其中所述β-内酰胺抗生素是N-α-氨苯基乙酰基β-内酰胺抗生素，所述第一模块M1包括一个腺苷酰化功能域，其中所述腺苷酰化功能域选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和至少50％同源于SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6或7的序列。
8.一种真核宿主细胞，其中所述宿主细胞包括非核糖体肽合成酶、异青霉素N合成酶和能够表达类MbtH蛋白的多核苷酸。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述类MbtH蛋白具有SEQ IDNO：18、19、20、30、31或32或者至少50％同源于SEQ ID NO：18、19或20、30、31或32的序列。
10.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述类MbtH蛋白具有氨基酸代码NXEXQXSXWP-X5-PXGW-X13-L-X7-WTDXRP。
11.根据权利要求8-10中的任意一项所述的宿主细胞，其是Penicilliumchrysogenum、Acremonium chrysogenum或Aspergillus nidulans。
CN201380007614.6A 2012-01-31 2013-01-28 半合成抗生素生产中的类MbtH蛋白 Pending CN104093831A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12153225 2012-01-31
EP12153225.3 2012-01-31
PCT/EP2013/051544 WO2013113646A1 (en) 2012-01-31 2013-01-28 Mbth-like proteins in the production of semi synthetic antibiotics

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104093831A true CN104093831A (zh) 2014-10-08

Family

ID=47630333

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380007614.6A Pending CN104093831A (zh) 2012-01-31 2013-01-28 半合成抗生素生产中的类MbtH蛋白

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20140349340A1 (zh)
EP (1) EP2809777B1 (zh)
CN (1) CN104093831A (zh)
HK (1) HK1201877A1 (zh)
WO (1) WO2013113646A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109563528A (zh) * 2016-04-14 2019-04-02 中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司 真核nrps催化过程中的mbth样蛋白

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101631853A (zh) * 2006-10-05 2010-01-20 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 β-内酰胺抗生素的生产

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69434023D1 (de) 1993-07-30 2004-10-28 Dsm Ip Assets Bv Verfahren zur effizienten Herstellung von 7-ADCA via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-ADCA und 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-ADCA
JP3574453B2 (ja) 1993-07-30 2004-10-06 ギスト ブロカデス ベスローテン フェンノートシャップ ３‐（カルボキシエチルチオ）プロピオニル‐７‐ａｄｃａを経由した７‐ａｄｃａの効果的な製造法
DE19951196A1 (de) 1999-10-22 2001-05-10 Mohamed A Marahiel Massgeschneiderte Peptidsynthetasen und ihre Verwendung
MXPA03003680A (es) 2000-10-27 2005-02-14 Dsm Biotech Gmbh Produccion fermentativa de d-f-hidroxifenilglicina y d-fenilglicina.
EP1460085A1 (en) * 2003-03-20 2004-09-22 Vicuron Pharmaceuticals, Inc. Genes and proteins for the biosynthesis of the glycopeptide antibiotic teicoplanin
US20090233287A1 (en) 2006-04-25 2009-09-17 Roelof Ary Lans Bovenberg Production of compounds in a recombinant host
BRPI0719263A2 (pt) 2006-10-05 2014-07-15 Dsm Ip Assets Bv Produção de antibióticos de beta-lactama

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101631853A (zh) * 2006-10-05 2010-01-20 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 β-内酰胺抗生素的生产

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
E. A. FELNAGLE ET AL.: "MbtH-like proteins as integral components of bacterial nonribosomal peptide synthesis", 《BIOCHEMISTRY》 *
RICHARD H. B. ET AL.: "Function of MbtH homologs in nonribosomal peptide biosynthesis and applications in secondary metabolite discovery", 《JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY & BIOTECHNOLOGY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109563528A (zh) * 2016-04-14 2019-04-02 中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司 真核nrps催化过程中的mbth样蛋白
CN109563528B (zh) * 2016-04-14 2022-10-18 灿盛制药荷兰公司 真核nrps催化过程中的mbth样蛋白

Also Published As

Publication number Publication date
HK1201877A1 (zh) 2015-09-11
WO2013113646A1 (en) 2013-08-08
US20160362715A1 (en) 2016-12-15
EP2809777A1 (en) 2014-12-10
EP2809777B1 (en) 2019-05-29
US20140349340A1 (en) 2014-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Stachelhaus et al. Modular structure of genes encoding multifunctional peptide synthetases required for non-ribosomal peptide synthesis
von Döhren et al. Multifunctional peptide synthetases
Kleinkauf et al. A nonribosomal system of peptide biosynthesis
Kevany et al. Characterization of the complete zwittermicin A biosynthesis gene cluster from Bacillus cereus
Marahiel Multidomain enzymes involved in peptide synthesis
Weber et al. Biosynthetic concepts for the production of β‐lactam antibiotics in Penicillium chrysogenum
Reimer et al. A natural prodrug activation mechanism in the biosynthesis of nonribosomal peptides
JPH11514868A (ja) ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよびその使用
Cohen et al. Microbial isopenicillin N synthase genes: structure, function, diversity and evolution
EP1957639B1 (en) Microginin producing proteins and nucleic acids encoding a microginin gene cluster as well as methods for creating microginins
MARTIN α-Aminoadipyl-cysteinyl-valine Synthetases in β-Lactam Producing Organisms From ABRAHAM'S Discoveries to Novel Concepts of Non-Ribosomal Peptide Synthesis
von Döhren Biochemistry and general genetics of nonribosomal peptide synthetases in fungi
Lavollay et al. The β‐lactam‐sensitive d, d‐carboxypeptidase activity of Pbp4 controls the l, d and d, d transpeptidation pathways in Corynebacterium jeikeium
Anderson et al. On the substrate specificity of bacterial DD-peptidases: evidence from two series of peptidoglycan-mimetic peptides
Lütticke et al. E. coli LoiP (YggG), a metalloprotease hydrolyzing Phe–Phe bonds
Martín et al. Insights into the structure and molecular mechanisms of β-lactam synthesizing enzymes in fungi
EP2084270B1 (en) Production of beta-lactam antibiotics
CN104093831A (zh) 半合成抗生素生产中的类MbtH蛋白
Wessels et al. Biosynthesis of acylpeptidolactones of the daptomycin type: a comparative analysis of peptide synthetases forming A21978C and A54145
KR20020069509A (ko) 맞춤형 펩타이드 신테타제, 이의 제조 방법 및 이의 용도
Shu et al. Amino acids activated by fengycin synthetase FenE
Ghuysen et al. Bacterial wall peptidoglycan, DD-peptidases and beta-lactam antibiotics
CN101631853B (zh) β-内酰胺抗生素的生产
Ogasawara New enzymes for peptide biosynthesis in microorganisms
Kim et al. Isolation of peptide ligands that inhibit glutamate racemase activity from a random phage display library

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20141008