JPH11514868A - ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ホスホパンテテイニル基を、ある基質に転移する例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）アシルキャリャータンパク質シンターゼのような単離されたホスホパンテテイニルトランスフェラーゼに関する。この酵素は天然の源から精製するか、組換え的もしくは合成的に産生することができる。従って本発明は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを含む組成物およびキット、ならびにホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを発現する宿主細胞を提供する。本発明は更に、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする核酸およびそのような核酸を含むベクターも提供する。本発明は更に、インビトロもしくはインビボで基質をホスホパンテテイニル化するための方法、およびインビトロもしくはインビボで抗生物質を産生するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよびその使用発明の背景 アシルキャリャータンパク質（ＡＣＰ）は脂肪酸生合成中のアシル基活性化の 役割を担う小型酸性タンパク質（８，８００Ｄａ）である。ＡＣＰをコードする 遺伝子（ａｃｐ^P ）はクローン化および過剰発現されており（Ｒａｗｌｉｎｇｓ ，Ｍ．ａｎｄ Ｃｒｏｎａｎ，Ｊ．Ｅ．、Ｊｒ．（１９９２） Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６７、５７５１−５７５４；Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ ． （１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、２１、２０２Ｓ） 、そしてＡＣＰの溶液構造がＮＭＲ分光法により解析されている（Ｈｏｌａｋ， Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７５：９− １５）。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰの同族体が自然界を通じて２形態で存 在し、それは；より大きい多機能性酵素の内在性（ｉｎｔｅｇｒａｌ）ドメイン （タイプＩ）としてか、あるいは多酵素シンターゼ複合体を構成する数々の他の 酵素と会合することができる個別のタンパク質のいずれかとして存在する。これ ら２形態でＡＣＰは、ポリケチド（Ｓｈｅｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ． １７４：３８１８−３８１２）、非リボソーム性ペ プチド（Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ａｎｔｉｂ ｉｏｔ． ４４：２４１−２４７）、およびデプシペプチドの生合成（Ｒｕｓｎ ａｋ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ ０：２９１６−２９２７）を含む、反復性アシル転移段階に依存する広範囲な他 の生合成経路において、そしてオリゴ糖類（Ｇｅｉｇｅｒ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７３：２８２７−２８７８）およ びタンパク質（Ｉｓｓａｒｔｅｌ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｎａ ｔｕｒｅ ３５１：７５９−７６１）のアシル転移化反応における中心的役割を 担っている。 ＡＣＰの決定的な特徴は４’−ホスホパンテテイン（４’−ＰＰ）補欠分子団 である（Ｍａｊｅｒｕｓ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９６５） Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５３：４１０−４１７）。４’−ＰＰは、 全てのＡＣＰに見いだされる保存されたセリン残基にホスホジエステル結合を通 して連結される。タイプＩおよびタイプＩＩ ＡＣＰにより認識される多くの基 質のアシル基は、４’−ＰＰ部分の末端システアミンチオールに連結されるチオ エステルを通してアシル転移のために活性化される。４’−ＰＰ構造のβ−アラ ニルおよびパントテイン酸部分はホスホジエステル−ＡＣＰ結合と末端チオエス テルとの間のつなぎ目として作用すると考えられ、このことにより４’−ＰＰが 例えば８００ｋＤａのシクロスポリンシンセターゼによる１１アミノ酸の連続付 加の際におけるもののような様々な活性部位の間で成長するアシル鎖を往復する 振り子として機能することがあってよいことが示唆される（Ｌａｗｅｎ，Ａ ａ ｎｄ Ｚｏｃｈｅｒ，Ｒ．（１９９０） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１ １３５５−１１３６０）。 ホロ−ＡＣＰシンターゼ（ホロ−ＡＣＰＳ）はコエンザイム（Ｃｏｅｎｚｙｍ ｅ）Ａ（ＣｏＡ）からの４’−ＰＰ部分をアポ−ＡＣＰのＳｅｒ−３６に転移さ せてＭｇ²⁺依存的反応の際にホロ−ＡＣＰと３’，５ ’−ＡＤＰを産生する。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）からの（アシル輸送シンター ゼタンパク質）ＡＣＰＳは粗精製抽出物から７８０倍部分精製され、（Ｅｌｏｖ ｓｏｎ，Ｊ．ａｎｄ Ｖａｇｅｌｏｓ，Ｐ．Ｒ．（１９６８） Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２４３：３６０３−３６１１）そしてホウレンソウからのＡＣＰＳが 部分精製されている（Ｅｌｈｕｓｓｅｉｎ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８ ） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：３９−４５）が、この翻訳後ホスホパンテテ イニル化過程のメカニズムもしくは特異性についてはそのほとんどが知られてい ないことは明白である。ホロ−ＡＣＰの合成の際に条件付で欠損を示す大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ）の突然変異体が同定されており、そしてその突然変異体の表現 型が変化させられたホロ−ＡＣＰシンターゼ活性の原因とされている（Ｐｏｌａ ｃｃｏ，Ｍ．Ｌ． ａｎｄ Ｃｒｏｎａｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ，（１９８１） Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５６：５７５０−５７５４）。発明の要約 本発明は、真核生物、原核生物、もしくは植物からの、例えばアシルキャリャ ータンパク質シンターゼ（ＡＣＰＳ）のような単離かつ精製された天然および組 換え体のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼに関する。ホスホパンテテイ ニルトランスフェラーゼの活性断片、改変されたホスホパンテテイニルトランス フェラーゼ、およびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの改変された活性 断片も本発明の範囲に含まれる。これらの形態のホスホパンテテイニルトランス フェラーゼは少なくとも約６０％の純度、より好ましくは少なくとも約７０％の 純度、より好ましくは少なくとも約８０％の純度、より好ましくは少なくとも約 ９０％の純度、そして更により好ましくは少なくとも約９５％の純度にまで精製 されることが好ましい。本発明のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、 例えばある宿主細胞内での過剰発現により産生された例えばアシルキャリャータ ンパク質（ＡＣＰ）のような基質のインビトロホスホパンテテイニル化に用いる ことができる。本明細書に記載されるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ を含むキットも本発明の範囲内に含まれる。 本発明は更に、少なくとも一つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼも しくはその活性断片をコードする少なくとも一つの核酸を発現するように改変さ せた宿主細胞も提供する。ある態様では本発明の宿主細胞を、ホスホパンテテイ ニルトランスフェラーゼの少なくとも一つの基質をコードする少なくとも一つの 核酸を発現させるために改変する。このような宿主細胞は更に、ＡＣＰと会合す る他の構成成分をコードする核酸を発現することがあってよい。本発明の改変さ せた宿主細胞を、抗生物質もしくはその合成にＡＣＰを必要とする他の化合物の 産生のために用いることができる。図面の簡単な説明 図１は、Ｍｇ²⁺依存的反応の際にホロ−ＡＣＰおよび３’，５’−ＡＤＰを産 生するためのＡＣＰＳによるアポ−ＡＣＰのＳｅｒ−３６へのＣｏＡからの４’ −ＰＰ部分の転移の概略図である。その後にホロ−ＡＣＰは４’−ＰＰ部分の末 端システアミンへのチオエステル結合を通してアシル転移のためにアシル基を活 性化することができる。 図２パネルＡは、組換えＡＣＰＳを用いるホロ−ＡＣＰのインビトロ形成を示 す天然のままのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す（レーン１、 アポ−ＡＣＰ；レーン２、ＤＴＴで還元したホロ−ＡＣＰ標準（Ｓｉｇｍａ社） ；レーン３、組換えＡＣＰＳを用いてインビトロで形成させ、ＤＴＴで還元した³ Ｈ−ラベル化ホロ−ＡＣＰ；レーン４、ＤＴＴで還元していないホロ−ＡＣＰ 標準；レーン５、ＤＴＴで還元していない組換えＡＣＰＳを用いてインビトロで 形成させた³Ｈ−ラベル化ホロ−ＡＣＰ）。 図２パネルＢは、［³Ｈ］ホスホパンテテインのホロ−ＡＣＰ（Ｉ）、ホロ− ＡＣＰ−ＣｏＡ混合ジスルフィド、（ＩＩ）、および（ホロ−ＡＣＰ）₂ジスル フィド（ＩＩＩ）内への導入を確認する図２パネルＡに示されるゲルのオートラ ジオグラムを表す。 図３は、野生型および組換えＡＣＰＳの精製からの分画のトリス−トリシン（ Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す（レーン１、大 腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｋ−１２の粗精製溶菌物；レーン２、ＤＥ−５２上清； レーン３、ＳＰ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）プール；レーン４、アポ −ＡＣＰ親和性カラムプール（アセトン沈殿により２０倍濃縮させた０．５ｍＬ 試料）；レーン５、ＳＰ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）精製した組換え ＡＣＰＳ）。 図４は、組換え大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳでのインビトロホスホパン テテイニル化反応の際に取り込ませたアポ−Ｄｃｐのｐモル数当たりに形成され たホロ−Ｄｃｐのｐモル数のグラフ表示である。 図５は、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）およびポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ） によるＡＣＰのスルフヒドリル基上へのアシル基の転移、ならびにペプチドシン セターゼによるＡＣＰのスルフヒドリル基上へのアミノ−アシル基の転移の概略 図である。 図６は、イーストの脂肪酸シンターゼ Ｆａｓ２、Ｇｓｐ、Ｌｐａ、Ｓｆｄ、 ＥｎｔＤ、および大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳのアミノ酸配列のアライン メントを表す。保存された残基が四角で囲まれており、かつ星印により示されて いる。 図７は、Ｓ．ケルビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポムベ（Ｓ． ｐｏｍｂｅ）、Ｃ．アルバカンス（Ｃ． ａｌｂａｃａｎｓ）、Ａ．ニデュラ ンス（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）、およびＰ．パトゥルム（Ｐ． ｐａｔｕｌｕ ｍ ）からの脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、Ｓｆｐ、Ｇｓｐ、ＨｅｔＩ、Ｌｙｓ５ 、およびＯ１９５を含むＥｎｔＤホモロジー（ｈｏｍｏｌｇｏｙ）ファミリー、 ならびに大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡｃｐＳであるケトレダクターゼ（ＫＳ）、 ケトシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、エノールレダク ターゼ（ＥＲ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）、およびマロニル／パルミトイルトラ ンスフェラーゼ（ＭＴ／ＰＴ）間での相同領域（影付き部分）の概略図。 図８は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳ、ｅｎｔＤ、ｓｆｐ、ｇｓｐ、お よびイースト脂肪酸シンターゼｆａｓ２のアミノ酸配列のアラインメントを表し 、これはこれらのタンパク質の間のアミノ酸配列の相同性を示す。最強の相同性 を示す２つの領域を四角で囲み、そして影付きにしてある。 図９パネルＡは、真菌脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、Ｓｆｐ／Ｇｓｐ／Ｅｎｔ Ｄ／ｏ１９５ホモロジーファミリー、および大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＳＰＳ における提案されているＰ−ｐａｎｔトランスフェラーゼドメインの位置および 共通配列の位置を示す図である。構成要素ＦＡＳの活性は、ＡＴ、アシルトラン スフェラーゼ；ＥＲ、エノイルレダ クターゼ；ＤＨ、デヒドラターゼ；ＭＴ／ＲＴ、マロニル／パルミトイルトラン スフェラーゼ；ＡＣＰ、アシルキャリャータンパク質；ＫＰ、ケトレダクターゼ ；ＫＳ、ケトシンターゼ、として省略してある。 図９パネルＢは、Ｐ−ｐａｎｔトランスフェラーゼ酵素スーパーファミリーの 共通配列のアミノ酸配列アラインメントを表す。高度に保存されている残基が四 角で囲まれている。 図１０は、基質Ｈｉｓ６−ペプチジルキャリャータンパク質（Ｈｉｓ６−ＰＣ Ｐ）を調製するのに用いられるタンパク質ＴｙｃＡと、ＴｙｃＡからの１１２ア ミノ酸の領域の概略図である。 図１１は、Ｓｆｐ、ＥｎｔＤ、およびｏ１９５により媒介される［３Ｈ］−４ ’−ＰｐａｎｔのＡＣＰおよびＨｉｓ６−ＰＣＰ内への取り込みを示すヒストグ ラムを表す。 図１２は、各々ＥｎｔＦおよびＳｒｆＢ１内への［３Ｈ］−４’−Ｐｐａｎｔ のＥｎｔＤおよびＳｆｐにより媒介される取り込みを表すヒストグラムを表す。 図１３は、１３ｎＭ Ｓｆｐおよび様々な濃度の基質との１５分間の反応中Ｐ ＣＰ−Ｈｉｓ６内に取り込まれた［３Ｈ］−４’−Ｐｐａｎｔの量のグラフ表示 である。 図１４パネルＡは、ＥｎｔＤ、ＡＣＰＳ、もしくはｏ１９５とのアポ−Ｅｎｔ Ｆのインキュベーションの際に時間の関数として形成されるホロ−ＥｎｔＦの量 を表すダイアグラムである。 図１４パネルＢは、ＥｎｔＤ、ＡＣＰＳ、もしくはｏ１９５とのアポ−ＡＣＰ のインキュベーションの際に時間の関数として形成されるホロ−ＡＣＰの量を表 すダイアグラムである。 図１５は、［¹⁴Ｃ］−Ｌ−バリンでの後続のインキュベーションの前のＳｆｐ の非存在下（−Ｓｆｐ＋［１４Ｃ］Ｖａｌ）もしくはＳｆｐの存在下（＋Ｓｆｐ ＋［１４Ｃ］Ｖａｌ）、あるいは［¹⁴Ｃ］−Ｌ−アスパラギン酸とＡＴＰとの後 続のインキュベーションの前のＳｆｐの存在下（＋Ｓｆｐ＋［１４Ｃ］Ａｓｐ） でのＣｏＡとのＳｒｆＢ１のホロ−ＳｒｆＢ１の予備インキュベーションによる ［¹⁴Ｃ］バリン活性化の程度を表すヒストグラムである。発明の詳細な記述 本発明は、単離および精製されたホスホパンテテイニル化酵素を提供し、この 酵素はホスホパンテテニルトランスフェラーゼとも称され、その例はアシルキャ リャータンパク質シンターゼ（ＡＣＰＳ）もしくはその活性断片である。用語「 ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ」および「ホスホパンテテイニルトラ ンスフェラーゼ酵素」および「ホスホパンテテイニル化酵素」は、例えばＣｏＡ のようなドナー化合物からの４’−ホスホパンテテイン基のある基質への転移の 触媒反応を行う、例えば酵素のような分子を含むことが意図される。従ってホス ホパンテテイニルトランスフェラーゼは、ある化合物をホスホパンテテイニル化 することができるもしくはホスホパンテテイニル化する天然の酵素、組換え酵素 、もしくは合成酵素、またはそれらの活性分画を含む。好ましいホスホパンテテ イニルトランスフェラーゼは、アシルキャリャータンパク質（ＡＣＰ）を改変し 、そして恐らくはＡＣＰの活性化をもたらす例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ａ ＣＰＳのような酵素を含む。用語「ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ」 は更に、例えば酵素活性のためには４’−ホスホパンテテイン基を必要とする非 アシルキャリャータ ンパク質を改変する酵素も含む。用語「単離された」および「精製された」は本 明細書では互換的に用いられ、そして天然の状態では会合を生じる宿主生物体の 他の構成成分を実質的には含まないホスホパンテテイニルトランスフェラーゼも しくはその活性分画を意味する。用語「単離された」および「精製された」は更 には、組換えＤＮＡ技術により産生される際には細胞性物質もしくは培養培地を 、あるいは化学的に合成される際には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質 的に含まないホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくは活性断片をも意 味するのに用いられる。 ある態様では、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその活性断 片は例えば原核生物もしくは真核生物の細胞のような、シンターゼを天然の状態 で発現する細胞から精製される。ＡＣＰは脂肪酸生合成に関与するため、脂肪酸 を有する全ての種はそれらの合成のためにホスホパンテテイニルトランスフェラ ーゼを必要とする可能性がある。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを産 生する原核生物細胞は例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のような細菌を含む。ホ スホパンテテイニルトランスフェラーゼは更には例えば哺乳類細胞、イースト細 胞、および昆虫細胞のような原核生物細胞からも単離することができる。ホスホ パンテテイニル酵素のための他の源は、例えばホウレンソウおよびエンドウの葉 のような植物組織を含む（Ｅｌｈｕｓｓｅｉｎ．ｅｔ ａｌ．上述）。 その酵素を天然に発現する細胞からのホスホパンテテイニルトランスフェラー ゼの精製は標準的技術を用いて達成することができる。しかしながら天然の源か らのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの精製 の過程が例えば実施例の項目にその詳細が更に詳しく記載されるもののようなア ポ−アシルキャリャータンパク質カラムを通す親和性精製段階を含むことが好ま しい。この親和性精製段階の使用により少なくとも約６０％の純度、より好まし くは少なくとも約７０％の純度、そしてより好ましくは少なくとも約８０％の純 度にまでのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの精製が可能になる。この 技術による少なくとも約９０％の純度、９５％の純度、９７％の純度、９８％の 純度、もしくは９８％の純度へのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの精 製が好ましい。それに加え、本明細書に記載される技術による天然の源からのホ スホパンテテイニルトランスフェラーゼの精製により、少なくとも約８００倍も しくは１０００倍、より好ましくは少なくとも約１０，０００倍、より好ましく は少なくとも約５０，０００倍、および更により好ましくは少なくとも約７０， ０００倍のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの濃縮がもたらされること が好ましい。精製されたホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが約２５０ｍ Ｕ／ｍｇタンパク質、より好ましくは約４００ｍＵ／ｍｇタンパク質、および更 により好ましくは約５００ｍＵ／ｍｇタンパク質の比活性を有することが好まし い。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの比活性は例えば実施例の項目に 記載されるインビトロアッセイ中、３７℃で１分あたりに形成される例えばホロ −ＡＣＰのような基質の１μモルに等しいものを１ユニット（Ｕｎｉｔ）として ｍＵ／ｍｇで特定される。 本発明の他の態様は、組換え技術により作成された例えばＡＣＰＳのような単 離および精製されたホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその活性 断片を提供する。組換えホスホパンテテイニルトラン スフェラーゼもしくはその活性断片は、適切な宿主細胞内でシンターゼもしくは その断片をコードする核酸の発現により産生することができる。異種核酸の発現 のための宿主細胞、発現ベクター、および技術は当業者に知られている。例えば 組換え技術を用いることで、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを細胞内 タンパク質、膜に会合したタンパク質として、もしくは分泌されたタンパク質と して発現することができる。本発明のある態様ではホスホパンテテイニルトラン スフェラーゼもしくはその活性断片は例えば細菌細胞、好ましくは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のような原核生物細胞内で発現される。別法では、ホスホパンテテ イニルトランスフェラーゼもしくはその断片を例えばイースト細胞のような真核 生物細胞、例えばＣＨＯもしくはＣＯＳ細胞のような哺乳類細胞、または昆虫細 胞（バキュロウイルス系）内で発現させることができる。ホスホパンテテイニル トランスフェラーゼもしくはその断片は植物細胞内でも発現させることができる 。様々な系内でのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその断片を コードする核酸の発現のために必要とされる核酸調節因子、およびそれらの宿主 細胞内での一つもしくは複数の核酸の組込みのための方法は当該技術分野におい てはよく知られている。このような技術は日常的なものであり、そして例えばＳ ａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））および他の研 究室用ハンドブックに記載されている。 本発明のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが組換え的もしくは合成的 に産生される場合には、その酵素を有意に精製する必要がない ことがあってよい。組換え的に産生されたホスホパンテテイニルトランスフェラ ーゼは、その天然の相対物のものと同一の活性を有することがあってよいか、ま たはその天然の相対物のものから多少異なる活性を有することがあってよい。例 えば、組換え的に産生されるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは触媒作 用の効率が異なることがある。例えばその効率を改善するため、もしくはその基 質特異性を変えるため、またはその両者のためにその酵素のアミノ酸配列を改変 することが可能である。 本明細書に記載される技術を用いてホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ もしくはその活性断片を適切な宿主細胞内で「過剰発現」させることができる。 用語、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの「過剰発現」は、内在性ホス ホパンテテイニルトランスフェラーゼの発現のレベルと比較すると約１００倍高 い、より好ましくは約１，０００倍高い、より好ましくは約１０，０００倍高い 、そして更に一層好ましくは約１００，０００倍高いレベルへのホスホパンテテ イニルトランスフェラーゼをコードする核酸の発現を含むことが意図される。 宿主細胞からの組換えホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその 断片の単離および精製のためには、発現のために用いられる特異的宿主系に適用 することが好ましい様々な方法を用いることができる。ホスホパンテテイニルト ランスフェラーゼもしくはその断片の精製の好ましい方法はアポ−アシルキャリ ャータンパク質親和性精製段階を含む。このような親和性精製段階を含むホスホ パンテテイニルトランスフェラーゼの精製の方法は実施例の項目に記載されてい る。この技術による組換えホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはそ の断片の精製 により、少なくとも約９０％もしくはそれ以上の純度、好ましくは少なくとも約 ９５％の純度、一層好ましくは少なくとも約９７％の純度、一層好ましくは少な くとも約９８％の純度、および更に一層好ましくは少なくとも約９９％の純度を 有するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその活性断片の精製を もたらす。この精製された組換えホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもし くはその断片は、約２００ｍＵ／ｍｇタンパク質、一層好ましくは約２５０ｍＵ ／ｍｇタンパク質、および更に一層好ましくは約３００ｍＵ／ｍｇタンパク質の 比活性を有することが好ましい。 本発明は更に、ある基質をホスホパンテテイニル化することができるホスホパ ンテテイニルトランスフェラーゼの単離もしくは精製された「活性断片」にも関 する。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの「活性断片」は、ある基質を ホスホパンテテイニル化することができるホスホパンテテイニルトランスフェラ ーゼの断片を含むことが意図される。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ の活性断片は、本明細書に用いられる際には用語「ホスホパンテテイニルトラン スフェラーゼ」に含まれ、なぜならホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの 活性断片は、ある基質にホスホパンテテインを転移することができるためである 。活性断片は、既知の技術を用いて精製されたホスホパンテテイニルトランスフ ェラーゼ、組換えホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、もしくは化学的に 合成されたものの調製について本明細書にこれまでに記載された技術を用いて産 生することができる。例えば、適切な宿主細胞内でのホスホパンテテイニルトラ ンスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の核酸断片を発現させ、そして得 られるペプチド断片を既知の技 術を用いて活性についてスクリーニングすることにより、ホスホパンテテイニル トランスフェラーゼのペプチド断片を取得することができる。ホスホパンテテイ ニルトランスフェラーゼの様々な断片を発現するクローンのライブラリーを調製 するための様々な方法が当該技術分野で知られている。その後にこれらのクロー ンを、ある基質をホスホパンテテイニル化することができる活性断片を発現する ものを同定するためにスクリーニングにかけることができる。ある方法では、ホ スホパンテテイニルトランスフェラーゼの断片を、アポ−アシルキャリャータン パク質および放射ラベル化させた４’−ホスホパンテテイン基を有するＣｏＡを 適切な緩衝液中で検査対象のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ断片と共 にインキュベートするインビトロアッセイ内で検査する。そのホロ−アシルキャ リャータンパク質内に取り込まれた放射ラベルの量をその後に測定し、そしてこ の量は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの断片の活性を表す。このイ ンビトロ検査の更に詳しい詳細は実施例の項目に提供される。 本発明の範囲に含まれる他の化合物は、改変されたホスホパンテテイニルトラ ンスフェラーゼもしくは改変されたその活性断片を含む。用語「改変」は、その 酵素のホスホパンテテイニル化活性が保持、増加、もしくは低減されるかのいず れかとなるような、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその活性 断片内の一つもしくは複数のアミノ酸残基の付加、欠失、もしくは置換を含むこ とが意図される。「改変されたホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ」もし くは「改変された活性断片」も、基質特異性が変化させてあるホスホパンテテイ ニルトランスフェラーゼもしくは断片を含む。例えば、改変されたホスホパンテ テイニルトランスフェラーゼもしくは改変されたその活性断片は、改変されてい ないホスホパンテテイニルトランスフェラーゼとは異なるアシルキャリャータン パク質をホスホパンテテイニル化することができてよい。別法では、改変された ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは異なる範囲の特異性を有することが あってよい。特に、その酵素の改変により追加的な基質をホスホパンテテイニル 化することができるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼがもたらされ得る 。一方で、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの改変により、一層限定さ れた範囲の基質を有するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼがもたらされ 得る。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの標的（一つもしくは複数）を 例えば、例えば先に記載されるもしくは実施例におけるインビトロホスホパンテ テイニル化検査を実施し、そして目的の基質で大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）アポ− アシルキャリャータンパク質を置換することにより決定することができる。 改変されたホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその改変された 活性断片は更に、安定性もしくは溶解度、またはその両者が変化させてあるもの を更に含む。他の改変されたホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、例え ばそのタンパク質を産生する宿主細胞からのそのタンパク質の精製を容易にする ために、「標識」がホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその活性 断片につけられているものを含む。そのような標識は当該技術分野ではよく知ら れており、そして特異的抗体により認識されるポリペプチドを含む。 本発明は更に、例えば実施例の項目に記載される大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ａ ＣＰＳを含む本明細書において同定されるもののようなホスホ パンテテイニルトランスフェラーゼの同族体を提供する。用語ホスホパンテテイ ニルトランスフェラーゼの「同族体」は、本明細書に記載される大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）ＡＣＰＳ以外の種からのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼで あって、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳのものと同一もしくはそれとは異な る基質をホスホパンテテイニル化することができるホスホパンテテイニルトラン スフェラーゼを含むことが意図される。従って、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣ ＰＳの同族体は、ある基質をホスホパンテテイニル化することができるいずれか の酵素を含むことが意図される。ホスホパンテテイニル化は、例えば図１に記載 されるもののような例えばＡＣＰへのＣｏＡからのホスホパンテテインの輸送の ような、一つの基質からの別の基質へのホスホパンテテイン基の輸送を含むこと が意図される。例えば、植物組織がホスホパンテテイニルトランスフエラーゼを 有することが示されており、そして真核生物であろうが、もしくは原核生物であ ろうが、たいていの細胞も基質をホスホパンテテイニル化することができる少な くとも一つの酵素を含むことがかなり高い確立で考えられる。大腸菌（Ｅ． ｃ ｏｌｉ ）ＡＣＰＳの同族体は、本明細書で同定される大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＡＣＰＳをコードする核酸を用いて単離することができる。従って、大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳの同族体をコードする核酸を、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）ＡＣＰＳをコードする核酸を用いて単離することができる。従って、大腸菌（Ｅ ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳをコードする核酸もしくは例えばモチーフ１およびモ チーフ２（本明細書に記載されるもの）をコードする部分のような、その断片を 、低緊縮条件もしくは高緊縮条件下での特異的な源からの核酸を含むクローンの ライブラリーへのハイブリダイ ゼーションにより取得することができる。同族体は更には、当該技術分野で知ら れている他の方法により、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳのものに由 来する核酸配列を有する変性オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ法によりクロー ン化することもできる。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳの同族体を単離する ための更に別の方法は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳに特異的な抗体を利 用するものを含む。これらの方法における使用のための抗体は、当該技術分野に 知られる方法に従って精製することができる。 従って、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその断片、または その同族体をコードする核酸も本発明の範囲内に含まれる。 本発明の範囲内に含まれる大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳの同族体は、そ の同族体酵素が基質をホスホパンテテイニル化することができる限りにおいて、 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳのアミノ酸配列（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ． （ １９９２） Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７４：１５５４；Ｔａｋｉｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｂａｃｔｅｔｒｉｏｌ． １７４：１５４４；配列 番号２）とのアミノ酸配列相同性もしくは同一性の程度が変化していることがあ り得る。本発明の範囲内に含まれる大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳの同族体 は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳをコードする核酸（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ ．、上述；Ｔａｋｉｆｆ ｅｔ ａｌ．、上述）とのいずれかの程度の核酸配列 相同性を有する核酸によりコードされることがあり得る。本明細書では「同一性 」としても称される相同性は、２つのタンパク質（ペプチド）の間もしくは２つ の核酸分子の間の配列類似性を意味する。相同性は、比較目的で整列させられる ことがあってよい各配列内の、ある位置 を比較することにより決定することができる。比較されている配列内の、ある位 置が同一のヌクレオチド塩基もしくはアミノ酸で占められている場合には、これ らの分子はその位置においては相同、もしくは同一となる。配列間の相同性の程 度（もしくはパーセンテージ）は、それらの配列に共有される適合性もしくは相 同な位置の数の関数となる。アミノ酸配列の間の「同一性」の程度もしくはパー センテージは、保存されたアミノ酸が類似性の程度もしくはパーセンテージを決 定するための目的については同一であると見なされるアミノ酸配列類似性を意味 する。保存されるアミノ酸置換は、例えば陰性側鎖を有する別のアミノ酸に代わ る、陰性側鎖を有する、あるアミノ酸の置換である。 ある具体的な態様では、好ましい大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳ同族体も しくはホスホパンテテイニルトランスフェラーゼファミリーのメンバーは、配列 番号２に示されるアミノ酸配列、あるいはホスホパンテテイニル化酵素および／ または本明細書に記載される保存されるアミノ酸モチーフを有する酵素のアミノ 酸配列との少なくとも約５０％、一層好ましくは少なくとも約６０％、より好ま しくは少なくとも約７０％、一層好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好 ましくは少なくとも約９０％の総体的アミノ酸配列同一性もしくは類似性を有す る。配列番号２に示される配列、あるいはホスホパンテテイニル化酵素および／ または本明細書に記載される保存されるアミノ酸モチーフを有する酵素の配列と の少なくとも約９３％、一層好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好まし くは少なくとも約９８〜９９％の総体的アミノ酸配列同一性もしくは類似性を有 するペプチドも本発明の範囲内に含まれる。 本発明の更に別の態様では大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳ同族体 は、配列番号２に示されるアミノ酸配列との約５０％を下回る総体的アミノ酸配 列同一性もしくは類似性を有する。本明細書に記載されるように、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳとの限定された総体的アミノ酸配列相同性を有する特異的 タンパク質もしくはペプチドが基質をホスホパンテテイニル化することができる ということが実際に示されている。事実、本明細書に、環状リポペプチド抗生物 質であるスルファクチンの生合成にかかわるＢ．スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉ ｌｉｓ ）タンパク質Ｓｆｐがホスホパンテテイニルトランスフェラーゼであるこ とが示されている。分泌される鉄捕捉性ジヒドロキシベンゾイル−セリン トリ アセトンであるエンテロバクチンの生合成にかかわる、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）からのＥｎｔＤという別のタンパク質も基質をホスホパンテテイニル化するこ とができる。更に、機能がまだ知られていない大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）タンパ ク質ｏ１９５も本明細書では基質をホスホパンテテイニル化することが見いださ れた。ＥｎｔＤ、Ｓｆｐ、およびｏ１９５が大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳ と限られた総体的アミノ酸配列相同性のみを有するに過ぎないとしても、Ｅｎｔ ＤとＳｆｐのＣ−末端は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳの持つ保存されたア ミノ酸残基からなる２つの領域を有する。これらのアミノ酸配列間にある相同性 領域が図６および８に表されている。更に詳細に配列比較を行ったところ、保存 されたアミノ酸残基からなるこれらの領域は以下のタンパク質内にも存在するこ とが明らかになった：脂肪酸合成にかかわる、Ｓ．ケレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ ）を含む様々な生物体からのＦａｓ２タンパク質、ペプチド抗生 物質グラミシジンの合成にかかわる、Ｂ．ブレビス（Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ）から のＧｓｐタンパク質、および Ｂ．スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのＬｐａタンパク質（図９）。 図９に列挙される追加的ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ同族体は、例 えば青緑色細菌の異型細胞形成およびイーストで内でのリシン生合成にかかわる ことが見いだされた。これらのアミノ酸配列相同性の少なくとも幾分か基づくと 、Ｆａｓ２、Ｇｓｐ、およびＬｐａもホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ でありそうである。突然変異誘発調査により更に、これらの保存された領域が基 質のホスホパンテテイニル化にとって必要であるという証拠が提供されている。 従って本発明の好ましいホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、例えば 図６に示される星印がつけられているアミノ酸のような一つもしくは複数の保存 されたアミノ酸、または図９に示される領域、または図６、８、および９におい て四角で囲まれたアミノ酸領域のような保存されたアミノ酸からなる領域を少な くとも有する。本発明の更に一層好ましいホスホパンテテイニルトランスフェラ ーゼは、以下のアミノ酸配列モチーフの内の一つもしくは複数を有する（このモ チーフ中、Ｎはいずれかのアミノ酸残基を表し、そして「／」により分かたれて いる２つのアミノ酸はそのいずれかのアミノ酸であることができる残基を表す） ： Ｇ−Ｎ−Ｄ−Ｎ−Ｎ−Ｅ （モチーフ１ａ） （配列番号３） Ｇ−Ｎ−Ｄ （モチーフ１ｂ） （配列番号４） Ｗ−Ｓ−Ａ−Ｋ−Ｅ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｋ−Ｎ−Ｎ−Ｇ （モチーフ２ ａ） （配列番号５） Ｆ／Ｗ−Ｎ−Ｎ−Ｋ／Ｒ−Ｅ−Ｓ／Ａ−Ｎ−Ｎ−Ｋ （モチーフ２ ｂ） （配列番号６） 更に一層好ましい態様では、本発明のホスホパンテテイニルトランスフェラー ゼは少なくとも一つのモチーフ１（ａもしくはｂ）および少なくとも一つのモチ ーフ２（ａもしくはｂ）を含む。本発明の更に一層好ましいホスホパンテテイニ ルトランスフェラーゼは少なくとも約５、好ましくは少なくとも約１０、一層好 ましくは少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、およ び５５のアミノ酸残基により分かたれる一つのモチーフ１（ａもしくはｂ）とモ チーフ２（ａもしくはｂ）を含む。ある好ましい態様では、この２つのモチーフ は少なくとも約３０〜４５のアミノ酸残基により分かたれる。本発明の他の好ま しいホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、モチーフ１ａ、１ｂ、２ａ、 もしくは２ｂのアミノ酸配列に有意に相同もしくは類似するアミノ酸配列を含む ものを含む。アミノ酸置換、欠失、もしくは添加を含む一つのモチーフ１と一つ のモチーフ２とを含むホスホパンテテイニルトランスフェラーゼも本発明の範囲 内に含まれる。好ましいアミノ酸置換は、例えば類似する特性を有する別のアミ ノ酸に代わる一つのアミノ酸の置換のような保存されたアミノ酸置換である。 本発明の範囲内の他のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、以下のア ミノ酸配列を有するか、またはそれらの配列内に一つもしくは複数の保存された アミノ酸置換、すなわち類似のアミノ酸での一つのアミノ酸の置換を有するか、 または一つもしくは複数のアミノ酸の欠失を有する一つもしくは複数のモチーフ １および２を含む： モチーフ１配列： ＧＴＤＩＶＥＩＡＲＩ （配列番号５） ＧＩＤＩＥＥＩＦＳＶ （配列番号６） ＧＩＤＩＥＫＴＫＰＩ （配列番号７） ＧＩＤＩＥＲＩＳＥＴ （配列番号８） ＧＶＤＶＥＬＩＴＳＩ （配列番号９） モチーフ２配列： ＦＡＶＫＥＡＡＡＫＡＦＧ （配列番号１０） ＦＳＡＫＥＳＡＦＫＡＳＥ （配列番号１１） ＷＳＭＫＥＳＦＩＫＱＥＧ （配列番号１２） ＷＴＩＫＥＳＹＩＫＡＩＧ （配列番号１３） ＷＳＡＫＥＡＶＦＫＳＬＧ （配列番号１４） 先に列挙されるかもしくは図９の左のカラムに示されるアミノ酸配列を有する 一つのモチーフ１、および先に列挙されるかもしくは図９の右のカラムに示され るアミノ酸配列を有する一つのモチーフ２を含むホスホパンテテイニルトランス フェラーゼも本発明の範囲内に含まれる。例えば保存的な置換、欠失、もしくは アミノ酸のようなアミノ酸置換を有するホスホパンテテイニルトランスフェラー ゼも本発明の範囲内に含まれる。改変されたもしくは改変されていないモチーフ １および２配列を有するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼがホスホパン テテイニルトランスフェラーゼ活性を有することを確認するためには幾つかのア ッセイを用いることができ、そしてそれらは例えば実施例に記載されている。こ のようなアッセイは様々な基質について実施することが好ましく、なぜなら所定 のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが基質特異性を示すためである。 好ましいホスホパンテテイニル化酵素は、先に示されるか、もしくはいずれか の図にあるモチーフ１およびモチーフ２のアミノ酸配列との少 なくとも約５０％、一層好ましくは少なくとも約６０％、一層好ましくは少なく とも約７０％、一層好ましくは少なくとも約８０％、および最も好ましくは少な くとも約９０％のアミノ酸配列同一性もしくは類似性を有する。先に示されるか 、もしくはいずれかの図にあるモチーフ１およびモチーフ２のアミノ酸配列との 少なくとも約９３％、一層好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましく は少なくとも約９８〜９９％のアミノ酸配列同一性もしくは類似性を有するペプ チドも本発明の範囲内に含まれる。 ホスホパンテテイニル化酵素間のアミノ酸配列相同性の存在に基づいて追加的 なホスホパンテテイニル化酵素を同定することが可能である。このようなホスホ パンテテイニル化酵素も本発明の範囲内に含まれる。追加的なホスホパンテテイ ニル化酵素を同定するには数々の方法を用いることができ、それらは：本明細書 に記載されるアミノ酸もしくは核酸の配列の比較、ならびにインビトロアッセイ である。 本発明に従ってホスホパンテテイニル化された酵素は、求核性試薬として作用 するホスホパンテテイン配合団の新規に取り込まれたスルフヒドリル（ＳＨ）基 上への様々な基の転移に関与することがあってよい。アシル−ＣｏＡは脂肪酸合 成（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＦＡＳ）および全てのポリケチドシンターゼ（ＰＫ Ｓ）のために用いることができる一方で、アミノアシル−ＡＭＰはペプチドシン セターゼのために用いることができる（図５）。ＰＫＳ複合体の場合にはアシル −ＡＣＰはポリケチド構築の際に炭素骨格組み立てのためのカルバニオン求核性 試薬による捕獲を受ける一方で、ペプチドとデプシペプチドのシンセターゼの場 合には、アミノアシル−Ｓ−ＡＣＰはアミドおよびエステル結合形成段 階において窒素求核性試薬および酸素求核性試薬による攻撃を受ける。 そして例えば本発明に記載される技術に従って天然の源から精製されるかもし くは組換えタンパク質として産生されるホスホパンテテイニルトランスフェラー ゼタンパク質、その活性断片、改変させたホスホパンテテイニルトランスフェラ ーゼもしくは改変させた活性断片、およびホスホパンテテイニルトランスフェラ ーゼ同族体を、例えばアシルキャリャータンパク質のような基質のインビトロホ スホパンテテイニル化に用いることができる。ある具体的な態様では基質は「異 種」基質、すなわちそのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを取得してく る種とは異なる種からの基質である。実際に、ある種からのホスホパンテテイニ ルトランスフェラーゼは他の種からの基質をホスホパンテテイニル化することが できることが示されている。例えば、様々な植物酵素は植物ＡＣＰと同様の効率 で大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰのホスホパンテテイニル化を行った（Ｅｌｈ ｕｓｓｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．上述）。それに加え、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ａ ＣＰＳは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰ以外のアシルキャリャータンパク質の ホスホパンテテイニル化を行うことができ、その例は：（１）細胞壁構成成分の リポテイコイン酸の生合成の際に活性を示すラクトバキルス（Ｌａｃｔｏｂａｃ ｉｌｌｕｓ ）Ｄ−アラニルキャリャータンパク質（Ｄ−Ａｌａｎｙｌ Ｃａｒｒ ｉｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＤＣＰ）、（２）マメ科の野菜の根粒着生の際に活 性を示すリゾビアル（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌ）ＮｏｄＦ、および（３）アクチノル ホジン、グラナチシン、テトラセノマイシン、フレノリシン、オキシテトラサイ クリン、およびテトラセノマイシンポリケチド抗生物質生合成にかかわるストレ プトミセテ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ） ＡＣＰである。 ある態様では、本発明の範囲内に含まれるホスホパンテテイニル化酵素は主に 単一基質のホスホパンテテイニル化を行うことができる。本発明の他の態様では 例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳのようなホスホパンテテイニル化酵素 は限られた数の基質のホスホパンテテイニル化を行うことができる。更に別の態 様ではホスホパンテテイニル化酵素は広域にわたる基質を有する。 本発明は更に、基質タンパク質のインビトロホスホパンテテイニル化のための キットを提供する。このようなキットは、本明細書に記載される単離もしくは精 製されたホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその活性断片、およ び使用のための説明書を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしく はその活性断片は組換え技術により産生するか、化学的に合成するか、もしくは 天然の源から精製することができる。このようなホスホパンテテイニルトランス フェラーゼもしくはその断片が少なくとも２５０ｍＵ／ｍｇの比活性を有するこ とが好ましい。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその断片は、 少なくとも１カ月、好ましくは少なくとも２カ月、より一層好ましくは少なくと も３カ月の間ホスホパンテテイニル化活性の全てを実質的に保持するように梱包 することができる。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが少なくとも６カ 月、および最も好ましくは少なくとも１年間安定であることが更に一層好ましい 。例えば、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその断片を、マグ ネシウムおよび約２０％のグリセロールを含むトリス（Ｔｒｉｓ）を基にする緩 衝液中、−２０℃に保持することができる。別法では、ホスホパンテテイニルト ランスフェ ラーゼもしくはその断片を凍結乾燥させた粉末として提供することができる。こ のキットは更に、例えばコエンザイムＡ（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ）のような４’ −ホスホパンテテイニレート基を提供する試薬を含むことができる。それに加え 、好ましくは濃縮された形態をとる、ホスホパンテテイニル化反応のための適切 な反応用緩衝液がそのキット内に含まれ得る。この反応用緩衝液はマグネシウム イオンとトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液を含むことが好ましい。 ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよび適切な緩衝液を含む組成物も 本発明の範囲内に含まれる。この緩衝液は、このトランスフェラーゼの安定性を 維持もしくは増加させる緩衝液であるか、あるいはトランスフェラーゼをその酵 素がその活性を保持する形態に保持されることを可能にする緩衝液であるか、あ るいはいったんそのトランスフェラーゼが適切な条件でインキュベートされれば 酵素の活性を回復することができる緩衝液であることができる。例えば、その緩 衝液は適切な量のグリセロール、もしくはその酵素を凍結することおよびそのト ランスフェラーゼの解凍の際にその酵素が活性を示すようになることを可能にす るいずれかの他の溶液を含むことができる。ホスホパンテテイニルトランスフェ ラーゼは凍結乾燥状態をとることもできる。 本発明の他の態様は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその 断片をコードする少なくとも一つの核酸を発現するように改変させた宿主細胞を 提供する。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを発現もしくは過剰発現す る宿主細胞は本明細書に記載されている。それに加え、本発明は、非発現形態の ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼもしくはその断片、および少なくとも 一つのポリペプチドをコー ドする少なくとも一つの追加的核酸で形質転換させた宿主細胞を提供する。ある 好ましい態様では、少なくとも一つのポリペプチドがホスホパンテテイニルトラ ンスフェラーゼの基質の構成成分である。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中での異種 ４’−ホスホパンテテインシンターゼの発現は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）がイン ビボで過剰発現された大量のタンパク質をホスホパンテテイニル化する能力によ り制約される。従って、ある態様では本発明は、同一の宿主細胞内でその酵素と ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの両方を発現もしくは過剰発現するこ とにより、４’−ホスホパンテテイン基を必要とする活性な組換え形態の酵素を 発現するための方法を提供する。その宿主細胞内で同時に発現される酵素は、反 応中に活性を示すためにはホスホパンテテイニル化を必要とするいずれかの酵素 であることができる。例えば、ある宿主細胞を、その宿主細胞が各々活性な大腸 菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）アシルキャリャータンパク質、ＮｏｄＦ、もしくはＤ−ア ラニルキャリャータンパク質（Ｄ−Ａｌａｎｙｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｒｏｔｅ ｉｎ）を産生するように改変させて、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰＳと、大 腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）アシルキャリャータンパク質または例えばＮｏｄＦもし くはＤ−アラニルキャリャータンパク質（Ｄ−Ａｌａｎｙｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）との両方を発現するようにさせることができる。 本発明の好ましい態様では、例えばホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ もしくはその断片のようなホスホパンテテイニル化酵素を発現もしくは過剰発現 する宿主細胞が、その合成がホスホパンテテイニル化酵素を必要とする少なくと も一つの段階を有する化合物の産生のために用いられる。このような化合物は、 ポリケチド（芳香族性およびマクロラ イド系の両方）、ならびにデプシペプチド、リポペプチド、およびグリコペプチ ドを含むリボソームでは産生されないペプチドを含む。本発明のホスホパンテテ イニルトランスフェラーゼで改変することができる生合成経路は脂肪酸、リポペ プチド界面活性剤（ｓｕｆａｃｔａｎｔｓ）、および抗生物質を含む。好ましい 抗生物質は、チオテンプレート機構により合成され得る、リボソームでは産生さ れないペプチドである。リボソームでは産生されない一層好ましいペプチド抗生 物質は、（ａ）例えばエデイン、ＡＣＶ、グラマシジン、およびアラメシキネサ イクリックペプチドのような直線ペプチド、（ｂ）例えばシクロペプチン、エン テロケリン、フェリクローム、グラマシジン Ｓ、チロシジン、およびミコバキ リンのような環状ペプチド、（ｃ）例えばデストルキシン、アクチノマイシン、 エタマイシン、およびエキノマイシンのようなラクトン、（ｄ）例えばポリミキ シンおよびバキトラシンのような分岐鎖状シクロペプチド、ならびに（ｅ）例え ばエンニアチンおよびビューベリシンのようなデプシペプチドを含む（Ｋｌｅｉ ｎｌａｕｆ ａｎｄ ｖｏｎ Ｄｏｅｈｒｅｎ （１９９０） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ． １９２：１）。本発明の範囲に含まれる他の抗生物質は、エリ スロマイシン、クラリスロマイシン、オキシテトラサイクリン、バキトラシン、 シクロスポリン、ペニシリン、セファロスポリン、バンコマイシンを含む。本発 明の範囲に含まれる追加的抗生物質は、例えば薬理学便覧などで見いだすことが できる当業者にはよく知られているものを含む。 例えば抗生物質のような本発明の化合物の合成は、ポリケチドシンターゼ（こ れは例えばエリスロマイシンやテトラマイシンの合成に関与する）、非リボソー ム性ペプチドシンセターゼ、およびデプシペプチドシ ンセターゼを含む酵素による触媒反応を受けることができる。これらの酵素は、 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＣＰの同族体であるアシルキャリャータンパク質の ファミリーに属し、そしてそれらの活性のためには４’−ホスホパンテテイン基 を必要とする。ＡＣＰは、タイプＩもしくはタイプＩＩのいずれかのアシルキャ リャータンパク質である。従って本発明は、その合成がタイプＩもしくはタイプ ＩＩのいずれかのＡＣＰによる触媒反応を受ける例えば抗生物質のような化合物 を産生するための方法を提供する。 タイプＩ ＡＣＰ（タイプＩシンターゼとも称される）は多機能酵素であり、 「多酵素ポリペプチド」とも称され、基質をホスホパンテテイニル化することが できるドメインに加え、ペプチドの形成および活性化に必要な少なくとも幾つか の、もしくは全ての触媒活性を含む。タイプＩ ＡＣＰはエリスロマイシン、ラ パマイシン、シクロスポリン、アベルネクチン、およびテトラサイクリンのシン ターゼを含む。従って本発明は、タイプＩ ＡＣＰを発現するように改変されて いる宿主細胞、およびタイプＩ ＡＣＰを活性化させるためのホスホパンテテイ ニルトランスフェラーゼの使用により、その合成がタイプＩ ＡＣＰによる触媒 反応を受ける例えば抗生物質のような化合物を産生する方法を提供する。この改 変させた宿主細胞は多酵素ポリペプチドに必要とされる基質を含む培地中でイン キュベートされる。別法では、これらの合成のためにタイプＩ ＡＣＰを必要と する化合物を、精製された酵素、もしくは組換え的に産生された酵素を用いてイ ンビトロで産生することができる。 タイプＩＩ ＡＣＰ（タイプＩＩシンターゼとも称される）は幾つかの他の酵 素と会合して多酵素シンターゼ複合体を形成することができる 分離タンパク質である。タイプＩＩ ＡＣＰは、テトラサイクリン、グラミシジ ン、チロシジン、アンスロサイクリン、およびバキトラシンのシンセターゼの構 成成分である。従って本発明は、その多酵素複合体の少なくとも幾つかもしくは 全てのサブユニットをコードする核酸およびホスホパンテテイニルトランスフェ ラーゼをコードする核酸を、ある宿主細胞内に組み込ませ、そして発現させ、そ してそのような改変させた宿主細胞をその酵素に適切な基質を含む培地内でイン キュベートすることによる、その合成がタイプＩＩ ＡＣＰによる触媒反応を受 ける抗生物質を産生するための方法を提供する。別法では、その合成の際にタイ プＩＩ ＡＣＰを必要とする化合物を、精製されたホスホパンテテイニルトラン スフェラーゼ（一つもしくは複数）と、その化合物の合成に必要な適切な酵素と を適切な緩衝液中で接触させることによりインビトロで産生することができる。 抗生物質を産生するための好ましい宿主は、抗生物質が毒性とはならない細胞 を含む。別法では、その細胞にとっては毒性とならない改変させた形態の抗生物 質を発現させることができ、そしてその改変させた形態をインビトロもしくはイ ンビボで変化させて活性形態の抗生物質を取得することができる。 天然の状態で抗生物質を産生する生物体、およびホスホパンテテイニルトラン スフェラーゼを発現もしくは過剰発現するように改変させてある生物体も本発明 の範囲に含まれる。このような改変させた生物体は、それらの合成に必要とされ るタイプＩもしくはタイプＩＩ ＡＣＰが確実に活性化された形態を取るように することにより追加的量の抗生物質を産生することがあってよい。 タイプＩおよびタイプＩＩ ＡＣＰでは、多構成成分系は成長するアシル鎖の ためのキャリャータンパク質として機能する小さな（例えば約８０〜１００アミ ノ酸）タンパク質サブユニットもしくはドメインを含む。保存される配列シグニ チャーモチーフ Ｄ（Ｎ，Ｄ）ＦＦＸ（Ｌ，Ｉ）ＧＧ（Ｈ，Ｄ）Ｓ（Ｌ，Ｉ）Ｘ （Ａ，Ｇ，Ｃ）ＸＸ（Ｌ，Ｖ，Ｍ）（配列番号１５）（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：４６３３）もしくは（Ｌ ，Ｖ）（Ｇ，Ｌ）（Ｇ，Ａ，Ｆ，Ｙ）（Ｄ，Ｈ，Ｋ，Ｅ）Ｓ（Ｌ，Ｑ）（Ｄ，Ａ ，Ｇ）（Ｓｃｈｌｕｍｂｏｈｍ，Ｗ． ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：２３１３５（配列番号 ）により認識することができ るこれらのアシルキャリャータンパク質は、ＣｏＡのピロリン酸結合上の保存さ れたセリンβ−ＣＨ₂ＯＨ側鎖の攻撃を必要とし、ＣｏＡの４−ホスホパンテテ イン部分の攻撃用セリン上への転移をもたらす翻訳後改変により不活性アポ形態 から機能性ホロ形態へ変換される。ホスホパンテテイン（Ｐ−ｐａｎｔ）配合団 の新規に導入された−ＳＨはここで、特異的基質、すなわち脂肪酸シンセターゼ およびポリケチドシンセターゼ（ＰＫＳ）についてはアシル−ＣｏＡおよびマロ ニル−ＣｏＡ誘導体、そしてペプチドシンセターゼおよびデプシペプチドシンセ ターゼについてはアミノアシル−ＡＭＰによるアシル化のための求核試薬として 作用する。ＰＫＳ複合体の場合には、カルボキシにより活性化されたマロニル− ＡＣＰ誘導体はその後に脱カルボキシル化を受け、第二のアシルチオエステルを 攻撃して新規の炭素−炭素結合ポリケチド生合成を生じる求核的カルバニオン種 を形成する。ペプチドとデプシペプチドのシンセターゼの場合には、アミノアシ ル−ＡＣＰもしくはヒドロキシ アシル−ＡＣＰが各々アミド結合およびエステル結合の形成段階の際の求核性試 薬として作用する。従って、アポ−ＡＣＰドメインのホスホパンテテイン化は広 域にわたる天然産物の生合成の原因となる多酵素シンターゼの活性化の際に中心 的役割を担っている。 タイプＩおよびタイプＩＩ ＡＣＰ、ならびにそれらに会合している構成成分 をコードする核酸が単離されており、そして例えば以下の引用文献に記載されて いる：Ｄｏｎａｄｉｏ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ５２：６７５；Ｇｏｃｈｔ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｊ．Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ．１７６：２６５４；ＭａｃＣａｂｅ，Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９１ ） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：１２６４６；Ｓｃｈｗｅｋｅ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７８３９；Ｙｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ． １７６：６２７０；およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：４００９。 特定の態様では、本発明は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、例え ばこの酵素活性がその酵素の主な機能である酵素を提供する。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃ ｏｌｉ ）ＡＣＰＳは、多分、そのような酵素であろう。その他の態様では、本発 明は、付加的な酵素活性をもつホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ分子、 例えばホスホパンテテイニルトランスフェラーゼとＡＣＰ活性の両方をもつ分子 を提供する。例えば、酵母の脂肪酸シンターゼサブユニットＩＩ（ＦＡＳ ＩＩ ）は、この中にＥ．コリＡＣＰＳおよびＳｆｐに相同のドメインをもつことが分 かっており、この酵素が、Ｓｅｒ−１８０、このポリタンパク質の推定ＡＣＰド メイ ンに、ホスホパンテテイニルユニットを付加するために分子内で働くことができ るであろうと示唆される。したがって、本発明は、種々の酵素機能の１つとして 、ホスホパンテテイニル基を転移する能力を含む多機能的または多酵素的タンパ ク質を提供する。そのような転移は、同じ分子かまたはその他の分子へも可能で ある。 さらに、本発明は、通常は、ホスホパンテテイニル化する能力を保持しないが 、この酵素活性を得るように改変できるタンパク質を提供する。例えば、ホスホ パンテテイニル基を転移できるペプチドが、例えば化学的架橋または組み換え法 によって、その他のタンパク質上に融合（ｇｒａｆｔ）されるか、またはそれに 結合することができる。好適な実施態様では、少なくとも１つのホスホパンテテ イニルトランスフェラーゼもしくはそれの活性フラグメントが、ＡＣＰであるタ ンパク質に結合される。融合されるトランスフェラーゼ活性は、Ｅ．コリＡＣＰ Ｓ由来でも、Ｓｆｐ由来でも、またはそのような触媒活性をもついかなる他のタ ンパク質であってもよい。 合成のために、タイプＩおよびタイプＩＩＡＣＰ（また、それぞれ、タイプＩ およびタイプＩＩシンターゼとも呼ばれる）を必要とし、かくして、ホスホパン テテイニトランスフェラーゼによるホスホパンテテイニル化を必要とする他の化 合物は、免疫抑制剤（例えばＦＫ５０６）、抗菌・抗カビ剤（例えばアンホテリ シン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ））、抗寄生虫剤、心臓血管薬（例えばロボス タチン（ｌｏｖｏｓｔａｔｉｎ））および抗腫瘍剤（例えばアントラシリン（ａ ｎｔｈｒａｃｙｌｉｎｅ））その他を包含する。かくしてまた、ホスホパンテテ イニルトランスフェラーゼ、それの活性フラグメントおよび本明細書に記載の発 現 系を用いてそのような化合物を生産する方法も、本発明の範囲内である。 また、精製ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを生産する方法も、本発 明の範囲内である。１つの実施態様では、ホスホパンテテイニルトランスフェラ ーゼもしくはそれの活性フラグメントは、酵素を天然に産生している細胞、例え ばＥ．コリから単離され、そして少なくとも約１，０００倍、より好ましくは少 なくとも約１０，０００倍、さらにより好ましくは少なくとも約５０，０００倍 のファクターで精製される。酵素を単離する方法は、好ましくは、アポ−アシル キャリヤータンパク質を含有するカラムにおけるアフィニティー精製段階を含む 。そのような方法は、さらに、本明細書で詳細に記述される。好ましくは、精製 ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、比活性２５０ｍＵ／ｍｇタンパク 質、より好ましくは４００ｍＵ／ｍｇ、さらにより好ましくは５００ｍＵ／ｍｇ タンパク質をもつ。また、本発明は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ の組み換え形を作成する方法を提供する。そのような方法は、そのタンパク質の 発現に好適な条件下で、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードして いる核酸を用いて宿主細胞を形質転換し、そして宿主細胞および培養培地からシ ンターゼを単離することを含む。好ましくは、精製された組み換えホスホパンテ テイニルトランスフェラーゼは、比活性２００ｍＵ／ｍｇ、より好ましくは２５ ０ｍＵ／ｍｇをもつ。 また、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの阻害剤を同定する方法も、 本発明の範囲内である。阻害化合物は、ホスホパンテテイニルトランスフェラー ゼによる基質のホスホパンテテイニル化を低下するか阻害する化合物として定義 される。ホスホパンテテイニルトランスフェ ラーゼの阻害剤は、イン・ビトロもしくはイン・ビボ試験を用いることによって 同定できる。１つの実施態様では、潜在的な阻害化合物は、イン・ビトロのホス ホパンテテイニル化アッセイ、例えば実施例の部に記述されるアッセイにおいて スクリーニングされる。その他の実施態様では、潜在的な阻害化合物は、ホスホ パンテテイニルトランスフェラーゼをもつ微生物と接触され、そして基質のホス ホパンテテイニル化がモニターされる。阻害化合物は、例えば、微生物における ホスホパンテテイニル化を必要とする特定の経路、例えばＡＣＰ依存経路を遮断 するために使用できる。ＡＣＰは、例えば、溶血素、Ｅ．コリの病原性因子のよ うなタンパク質のトランスアシル化に関与している。ホスホパンテテイニル化酵 素として、主要なリジン生合成経路に関与している酵母タンパク質Ｌｙｓ２の同 定は、酵母を殺傷する方法を提供する。したがって、ホスホパンテテイニル化酵 素の阻害剤は、抗菌・抗カビ剤として使用できる。さらにまた、多くの膜会合タ ンパク質はアシル化されるが、微生物においてこれらのタンパク質のアシル化を 阻止するか低下させることは、潜在的に、微生物の生存率に影響を与えることが できる。また、ＡＣＰは、一般的な治療上の標的である細胞壁成分のトランスア シル化に関与している。ＡＣＰを伴う他の反応は、例えば、リゾビウム（Ｒｈｉ ｚｏｂｉｕｍ）属の根粒化（ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ）因子に関与しているオリゴ 糖類のトランスアシル化を含む。オリゴ糖類のトランスアシル化は、窒素固定植 物における根粒形成の必須段階であり、そして農業上の応用をもつ。 本発明の範囲内のなお他の実施態様は、新規抗生物質を発掘するスクリーニン グ法を含む。本発明の１つの実施態様では、新規抗生物質は、 種々の形のタイプＩまたはタイプＩＩ ＡＣＰ、例えばランダム変異誘発によっ て得られる改変ＡＣＰのライブラリー、および／またはホスホパンテテイニル化 とその結果のＡＣＰ活性化に必要とされるホスホパンテテイニルトランスフェラ ーゼ、またはその変異型を、宿主細胞で同時に発現することによって同定される 。同様に、本発明は、新規な免疫抑制剤、抗菌・抗カビ剤、抗蠕虫剤、抗寄生虫 剤および抗腫瘍剤を単離する方法を提供する。 鉄のキレーティングと輸送分子エンテロバクチン（Ｅｎｔ）の合成に必要な生 産物をコードするＥ．コリＥｎｔＤ遺伝子が、ホスホパンテテイニルトランスフ ェラーゼ、Ｅ．コリＡＣＰＳおよびＳｆｐとの有意なアミノ酸配列相同性を示す こと、そしてそれが、少なくとも２種の基質、ＡＣＰおよびＰＣＰをホスホパン テテイニル化することが、本明細書において示された。したがって、本発明は、 細菌による鉄取り込みを調節する方法を提供する。１つの実施態様では、本発明 は、例えば細菌において遺伝子ＥｎｔＤを発現することによって、細菌の鉄取り 込みを改良する方法を提供する。改良された鉄取り込みは、より効率的な細菌の 増殖をもたらし、細菌が有益な化合物の生産のために増殖される場合には有用で あろう。また、本発明は、例えばホスホパンテテイニル化の阻害剤の存在下で細 菌を増殖させることによって、細菌による鉄取り込みを低下させる方法を提供す る。そのような阻害剤は、先に、そして実施例の部で述べられるようにして単離 できる。したがって、本発明は、鉄の剥奪によって、細菌の増殖を阻害したり、 また細菌を殺傷する方法を提供する。 また、本発明は、例えば「非天然」の天然産物の組み合わせ生合成に おいて、機能性ポリケチドおよびポリペプチドシンテターゼの異種生産のための 戦略設計に有用であろう。例えば、新しい薬物分子は、ポリケチドを合成するス トレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のような微生物において遺伝子ク ラスターを遺伝的に変化させることによって作成できる。次いで、例えばＥ．コ リで作成された改変遺伝子は、新しいポリケチドが発現されるストレプトミセス に再挿入することができる。そのような方法は、ポリケチド抗生物質に加えて、 種々の化合物の合成に応用できる。かくして、改変、例えば変異されたホスホパ ンテテイニル化酵素を用いることによって、宿主またはイン・ビトロで新化合物 を生産する方法は、本発明の範囲内である。この方法によって改変できる好適な 生合成経路は、エリスロマイシン、抗ガン薬ダウノルビシン、および免疫抑制剤 、ラパマイシンの生合成に関与する経路を含む。 本発明は、次に示す実施例によってさらに具体的に説明されるが、それは、限 定するものとして解釈されてはならない。本出願を通して引用されるすべての引 用文献、特許および公開特許出願の内容は、引用によって本明細書に組み入れら れる。 実施例１：エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ホロ−アシルキャリヤータンパク質シンターゼのクローニ ングおよび過剰生産 材料および方法： ［³Ｈ］コエンザイムＡの調製 ＣｏＡ（２２０ｍｇ）をトリチウムガス（New England Nuclear）曝露により 標識して、粗材料６００ｍＣｉを得た。この材料を無標識ＣｏＡに添加し、そし て混合物をアシル化し、Elovson and Vagelos（前出） 記載のように精製した。この方式で、比活性７ｘ１０¹⁴ｄｐｍ／ｍｏｌをもち、 ホスホパンテテイン部分に³Ｈ−標識７０％をもつ［³Ｈ］ＣｏＡを調製した。 ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性のアッセイ。 典型的なアッセイでは、最終容量１００μｌ中、１００μＭ［³Ｈ］ＣｏＡ、 ５０μＭアポ−ＡＣＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．８およびＡＣＰＳを、１．５ｍｌ容ミクロ遠心チューブ中で３７℃３０分間 インキュベートした。反応は、１０％ＴＣＡ８００μｌにより失活させた。次い で、ＢＳＡ（２５ｍｇ／ｍｌ溶液２０μｌ）を、放射能標識タンパク質の沈殿を 容易にするために添加した。１．５ｍｌ容チューブを１２，０００ｘｇで５分間 遠心した。上澄液を除去し、そのペレットを１０％ＴＣＡ ３ｘ９００μｌで洗 浄した。残ＴＣＡを遠心で収集し、そのペレットを１ＭＴｒｉｓ塩基１５０μｌ に再懸濁した。再懸濁したペレットをシンチレーションバイアルに移し、シンチ レーションカクテル（Packard）２．５ｍｌを添加し、そして形成された³Ｈ−標 識ホロ−ＡＣＰの量を液体シンチレーションカウンターによって定量した。 未変性（ｎａｔｉｖｅ）−ＰＡＧＥ、オートラジオグラフィーおよび質量分光 測定によるイン・ビトロのホロ−ＡＣＰ形成の確認。 ＡＣＰＳアッセイは、３７℃で１２時間インキュベートした。対照アッセイを 通常方式で行い、そしてホロ−ＡＣＰの形成を液体シンチレーションカウンター によって確認した。未変性−ＰＡＧＥ用のアッセイ混合液は、１０％ＴＣＡでは 失活されなかった。ＡＣＰＳアッセイ混合液を２等分量に分けた。１つの５０μ ｌ分量には、ＤＴＴを含有する５ｘ未変 性−ＰＡＧＥサンプルバッファー（Ausubel，F.M.，et al.(1992)Short Protoco ls in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York）２０μｌを添加し、 一方他のサンプルは、ＤＴＴにより還元しなかった。これらのサンプルを、２０ ％未変性ゲル電気泳動に続いてクマッシー染色によって分析した。染色ゲルを、 真空乾燥前にＡｍｐｌｉｆｙ（Amersham）中で１５分間浸した。乾燥ゲルを、− ８０℃でオートラジオグラフィーし、続いて写真現像を行った（図２）。ホロ− ＡＣＰ−ＳＨは、２０％未変性ゲル上では、アポ−ＡＣＰよりも早く泳動するが 、ホロ−ＡＣＰ二量体は、かなり遅く泳動する（Rock，C.O．and Cronan，J.J. ，Jr.(1981)Methods Enzymol．71:341-351）。 アポ−ＡＣＰの過剰発現および精製 Ｅ．コリＤＫ５５４、アポ−ＡＣＰ過剰生産株は、John E．Cronan,Jr.教授（ Department of Microbiology nd Biochemistry，University of Illinois at Ur bana-Champaign）により提供された。５０ｍＭグルコース、２５μＭパントテン 酸塩および５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補足したＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔ ｈ中で増殖した培養物に、Ｏ．Ｄ．０．８において１ｍＭ ＩＰＴＧを導入した 。細胞を、１０，０００ｐｓｉでフレンチプレス細胞破砕器により２回処理して 溶菌した。過剰生産されたＡＣＰの大部分はアポ形で存在した。少量のホロ−Ａ ＣＰを、内生ホロ−ＡＣＰ加水分解酵素を用いて溶菌液を１０ｍＭＭｇＣｌ₂お よび２ｍＭＭｎＣｌ₂とともに、２５℃で６０分間撹拌しつつインキュベートす ることによってアポ−ＡＣＰに転化した（Fischl，A.S．and Kennedy，E.P．（1 990）J．Bacteriol．172:5445-5449）。次いで、アポ−ＡＣＰを、Rock and Cro nan(前出)の操作にしたがって精製して培養 液１Ｌ当たり６０ｍｇを得た。 Ｅ．コリＫ−１２からのＡＣＰＳの精製 ３／４対数期まで増殖したＥ．コリＫ−１２細胞（ＡＴＣＣ１４９４８）（Un iversity of Alabama Fermentation Facility）の凍結ブロック５００ｇを、木 づちで小片に砕き、１Ｍ ＭＥＳでｐＨ８．１に滴定された、５０ｍＭＴｒｉｓ ，１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１ｍＭベンズアミ ジン、５０μＭＣｏＡおよび５％（ｗ／ｖ）グリセロールの溶液１Ｌに添加した 。細胞を、Ａｍｉｃｏｎフレンチプレス細胞破砕器により８，０００〜１６，０ ００ｐｓｉで１回処理して溶菌した。細胞の破片を８，０００ｘｇで３０分間遠 心して除去し、粗抽出液１．５Ｌを得た。上澄液を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ 、ｐＨ８．０におけるＤＥ−５２スラリー（Whatman）１５０ｇに添加し、４℃ で１５分間弱く混合した。ＤＥ−５２を遠心によって除去し、そして上澄液を、 ＤＥ−５２、ｐＨ８．０の１５０ｇとともに再び１回処理した。ＤＥ−５２樹脂 の除去後、上澄液をさらに１６，０００ｘｇで３０分間遠心して清澄にした。 清澄抽出液（１．３Ｌ）を、飽和ＭＥＳ溶液でｐＨ６．５に滴定し、次いで、 ５０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５％（ｗ／ｖ）グリセロール、ｐＨ６ ．１（バッファーＡ）で予め平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Phar macia）３ｘ３０ｃｍ上に、流速１０ｍｌ／ｍｉｎで負荷した。抽出液を負荷後 、カラムをバッファーＡ７５０ｍｌで洗浄し、その間２５ｍｌ画分づつ回収した 。次いで、カラムを、バッファーＡ中０〜１ＭＮａＣｌの直線濃度勾配液で溶出 した。活性画分をプールして１９０ｍｌを得た。この１９０ｍｌのＳＰ−Ｓｅｐ ｈａｒｏ ｓｅ精製材料を、次ぎに、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １５ アポ−ＡＣＰアフィニティ ーカラム（BioRad．Hercules，CA，製造者の指示にしたがって調製）２．５ｘ４ ．０ｃｍ上に、流速２ｍｌ／ｍｉｎで負荷し、その間２５ｍｌ画分づつ回収した 。カラムを、バッファーＡ１００ｍｌで洗浄し、次いで、ＡＣＰＳを、５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．１中６Ｍグアニジニウム・ＨＣｌ ５０ｍｌで溶出し、８ｍ ｌづつ画分を回収した。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性は、グア ニジニウム・ＨＣｌをアッセイ混合液中最終濃度＜２Ｍまで希釈することによっ て回復された。活性画分をプールして１６ｍｌを得たが、それを、次にバッファ ーＡ２ｘ１Ｌに対して透析して、見かけ上７０，０００倍純度のタンパク質約０ ．２ｍｇを得た（表１）。Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（ Schagger，H．and von Jagow，G．（1987）Annal．Biochem．166:368-379）によ り、数本の主バンドのみの存在が明らかになった（図３）。以前の精製では、１ ４ｋＤａバンドがホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性とともに精製さ れることが示されていた（データ未掲載）。アフィニティー精製タンパク質の一 定分量（５００μｌ）をアセトン沈殿によって濃縮した。沈殿したタンパク質を 、１６％Ｔ、６％Ｃ Ｔｒｉｓ・Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分 解し、次いで、製造者の指示にしたがってＰｒｏ−Ｂｌｏｔメンブラン（Applie d Biosystems Inc.，Foster City，CA）にエレクトロブロットした。タンパク質 を１％酢酸中０．１％アミドブラックで簡単に染色することによって現像した。 １４ｋＤａタンパク質を切り取り、Ｎ末端配列決定にかけた。 ｄｐｊ遺伝子のクローニングおよび過発現 ｄｐｊ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において鋳型としてＥ．コ リＢＷ１３７１１株の新しく増殖したシングルコロニーを用いて増幅した。Ｅ． コリＢＷ１３７１１株（Purdue UniversityのProfessor Barry Wannerからの贈 与）は、完全ｌａｃオペロンのｌａｃＸ７４欠失をもつが、他方、λおよびＦ因 子をキュアーされている野生型Ｅ．コリＫ−１２が存在する。正プライマーは、 開始コドンにおいてＮｄｅＩ制限部位を組み込んだ： 5'-TGTACCTCAGACCATATGGCAATATTAGGTTTAGGCACGG-3' （配列番号１６）逆プライマーは、終止コドンの後にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を 組み込んだ： 5'-TGATGTCAGTCAAGCTTAACTTTCAATAATTACCGTGGCA-3' （配列番号１７）得られるＰＣＲ生成物を、標準の分子生物学操作を用いてｐＥ Ｔ２２ｂ発現プラスミド（Novagen）のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位中にサブ クローニングし、そしてｐＤＰＪと命名した（Asubel，F.M.，et al.，前出）。 Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）をスーパーコイ ルｐＤＰＪで形質転換した。 ５０μｇ／ｍｌアンピシリンを補足した２ｘＹＴ培地におけるＥ．コリＢＬ２ １（ＤＥ３）ｐＤＰＪの１Ｌ培養液３本を、３７℃、２５０ｒｐｍにおいてＯ． Ｄ．０．８〜１．０まで増殖させ、その後、培養液を３０℃、２５０ｒｐｍに移 し、そして１００μＭＩＰＴＧにより誘導した。培養液をさらに３時間３０℃で 増殖させ、次いで、遠心によって集菌した。細胞を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ 、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５％グリセロール、ｐＨ８．０（バッファーＢ）中に再 懸濁し、フレンチプレス細胞破砕器により１０，０００〜１５，０００ｐｓｉで ２回処理して溶菌した。細胞破片を１６，０００ｘｇで３０分間遠心して除去し た。次いで、細胞不含の抽出液を、等容量のＤＥ−５２スラリー（ｐＨ８．０） により２回処理した。ＤＥ−５２上澄液を、飽和ＭＥＳ溶液でｐＨ６．５に調整 し、そしてバッファーＡで予め平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム３ｘ ３０ｃｍ上に負荷した。カラムをバッファーＡ２５０ｍｌで洗浄した。次いで、 ＡＣＰＳを、０〜１ＭＮａＣｌ直線濃度勾配液５００ｍｌで溶出した。 結果： ＡＣＰＳの精製を開始するために、精製工程を通じてホスホパンテテイニルト ランスフェラーゼ活性をモニターする迅速な信頼できるアッセイを探した。ホス ホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性のイン・ビトロ測定のために記載され た数種の方法（Elovson，J．and Vagelos，P．R．前出； Elhussein et al.，前 出；Polacco，M.L．and Cronan，J.E.，Jr．前出）のうち、［³Ｈ］−（パンテ テイニル）−ＣｏＡおよびアポ−ＡＣＰを用いる直接不連続ラジオアッセイを選 んだ。ホスホパンテテ イニルトランスフェラーゼ活性量は、放射能標識されたパンテテインがホロ−Ａ ＣＰ中に取り込まれる速度をモニターすることによって測定される。放射能標識 ホロ−ＡＣＰは、１０％ＴＣＡを用いるＢＳＡとの共沈殿と、続くそのタンパク 質ペレットの液体シンチレーションカウントによって定量される。³Ｈ−標識ホ ロ−ＡＣＰの形成は、２０％未変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラ フィーによって確認された。 初期の報告は、ＡＣＰＳが、アニオン交換樹脂には結合しない塩基性タンパク 質であることを示した（Elovson，J．and Vagelos，P.R．前出）。それによって ３倍精製が、バッチのＤＥ−５２処理によって迅速に達成された。次いで、ＤＥ −５２上澄液がカチオン交換樹脂ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上に吸着された。十 分な洗浄に続いて、カラムは、ＮａＣｌ直線勾配液（０〜１Ｍ）を用いて溶出さ れた。ＡＣＰＳ活性は約０．３５ＭＮａＣｌにおいて溶出した。７８０倍精製酵 素により以前に測定されたアポ−ＡＣＰに対するＡＣＰＳのサブミクロモルＫｍ （Elovson，J．and Vagelos，P.R．前出）は、アフィニティークロマトグラフィ ーのために適切な非常に強い結合相互作用を示唆した。アポ−ＡＣＰが、Ａｆｆ ｉ−Ｇｅｌ １５骨格に結合され、そして、ホスホパンテテイニルトランスフェ ラーゼ活性が、アポ−ＡＣＰアフィニティーカラムによって実に強固に保持され 、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性は、アポ−ＡＣＰでは溶出する けれども、高い塩でも低いｐＨでも溶出しないことが分かった。不幸にも、アポ −ＡＣＰ溶出は、ＡＣＰＳからのアポ−ＡＣＰの分離が困難であり、アポ−ＡＣ Ｐ標品中の痕跡の混入物が、少量のＡＣＰＳタンパク質の同定を妨げるので、続 く精製段階のために適切ではなかった。変性条件下でのｃｈａｏｔｒｏｐｅによ る溶 出後、続いての変性物の希釈によってＡＣＰＳが再生でき、その活性が回復する ことが分かった時に、溶出の必要条件が満足された。尿素およびグアニジニウム ・ＨＣｌの両方がこの目的のために適切であると証明されたが、グアニジニウム ・ＨＣｌ（６Ｍ）が、標的タンパク質のＮ末端カルバミル化の危険性を最小にす る好適な溶離液として選ばれた。アポ−ＡＣＰアフィニティーカラムからのＡＣ ＰＳ活性のグアニジニウム・ＨＣｌ溶出は、見かけ上７０，０００倍の精製標品 を生成した。Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Schagger，H ．and von Jagow，G．前出）は、数本の主バンドのみの存在を明らかにした（図 ３）。以前の精製では、１４ｋＤａバンドがＡＣＰＳ活性とともに精製されるこ とを示した（データ未掲載）。標準のＴｒｉｓ・グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 を用いると、１４ｋＤａタンパク質は、バッファーフロントとともに泳動し、Ｎ 末端配列解析のための候補バンドの最初の検出を非常に妨げた。 Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、低分子量タンパク質を非 常によく分解し、それ故、ＡＣＰＳ含有画分のあらゆるその後の分析のために使 用された。ＡＣＰＳ標品のＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲル濾過クロマトグラフィーは 、未変性分子量約３０，０００を示し、未変性の酵素がホモ二量体であることを 示唆した（データ未掲載）。１４ｋＤａタンパク質は、エレクトロブロットされ 、そしてＮ末端配列決定にかけられた。Ｎ末端配列決定の２５サイクルにより、 AILGLGTDIVEIARIEAVIARSGDR （配列番号１８） の１次配列を得た。非重複タンパク質データベースのＢＬＡＳＴ検索（Altschul ，S.F.，et al．（1990）J．Mol．Biol．215:403-410）により、 １４ｋＤａタンパク質が、ｄｐｊ（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ Ｐｙｒｉｄｏ ｘａｌ Ｊ）、ｐｄｘＪオペロン中の第２遺伝子（Takiff，H.E.，et al．（199 2）J．Bacteriol．174:1544-1553）によってコードされていることが分かった。 ｄｐｊ遺伝子は、Ｅ．コリのゲノムからＰＣＲによって増幅され、ｐＥＴ２２ ｂベクター（Novagen）のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位中にサブクローニ ングされた。Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＤＰＪの形質導入およびホスホパン テテイニルトランスフェラーゼ活性の精製により、純度＞９５％および比活性３ ２０ｍＵ／ｍｇをもつタンパク質５０ｍｇを得た（表２）。これは、部分精製野 生型標品の少なくとも２分の１の比活性に相当する。この差異は、多分、Ｂｒａ ｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いる希薄な野生型タンパク質標品の定量に関 連する誤差によるものであろう。組み換え配列を確認されたｐＤＰＪ構築物のＤ ＮＡ配列決定は正確であった（Dana-Farber Molecular Biology Core Facillity ，Boston，MA）。１４ｋＤａの過剰生産された組み換えタンパク質はブロットさ れ、ｄｐｊ遺伝子産物として最初の１０残基を確定するＮ末端配列決定にかけら れた。質量分光分析は、計算質量１３，９２２の０．２％以内の分子質量１３， ９５０を示した。組み換え酵素によるアポ−ＡＣＰ中への［³Ｈ］ホスホパンテ テイン部分が、２０％未変性ゲル電気泳動に続くオートラジオグラフィーによっ て再び確認された（図２）。ホロ−ＡＣＰは、２０％未変性−ＰＡＧＥにおいて アポ−ＡＣＰよりも若干早く移動した（１４）。さらにまた、無標識の酵素的ホ ロ−ＡＣＰ産物の質量分光分析は、アポ−ＡＣＰ基質に関して観察されたＭＷ８ ５１８（計算値８５０８）に対して、ＭＷ８８４１（計算値８ ８４７）を示した。［³Ｈ］ＣｏＡ放射能アッセイを用いる組み換えＡＣＰＳに ついての定常状態速度論により、ＣｏＡに対するＫｍ値５０μＭを得た。部分精 製ＡＣＰＳに関して既に報告された（１１）ように、２μＭを超えるアポ−ＡＣ Ｐ濃度において基質阻害を観察した。しかしながら、アポ−ＡＣＰに対するＫｍ 値について上限〜１μＭを指定することができた。見かけのｋ_cat値約１０ｍｉ ｎ^-1は、飽和しているＣｏＡおよび５０μＭアポ−ＡＣＰにおいて測定された。 同一Ｋｍ値が、同じアッセイ条件下で野生型ＡＣＰＳについてアポ−ＡＣＰおよ びＣｏＡに対して得られた。本発明者らの反応速度定数と既に報告されたもの、 それぞれＫｍ（アポ−ＡＣＰ）およびＫｍ（ＣｏＡ）に関して０．４μＭおよび １５０μＭ（Elovson，J．and Vagelos，P.R．前出）との差は、多分に、アポ− ＡＣＰおよびＣｏＡ基質調製物と、使用されたアッセイ条件によるものであろう 。 組み換えＥ．コリＡＣＰＳによるＮｏｄＦのイン・ビトロのホスホパンテテイ ニル化 この実施例は、Ｅ．コリＡＣＰＳが、異種の基質リゾビウムＮｏｄＦをホスホ パンテテイニル化することを示す。 この実施例で使用されるイン・ビトロのホスホパンテテイニル化アッセイの条 件は、基質としてＥ．コリＡＣＰを用いる先の記述のものと同じである。Ｅ．コ リＡＣＰＳによる野生型ＮｏｄＦ、ＡＣＰ−ＮｏｄＦキメラおよび野生型ＡＣＰ のホスホパンテテイニル化の効率は、以下に提示される： 値は、３並列アッセイの平均である。随伴（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）誤差は、 それぞれ、ＡＣＰ、ＡＣＰ：：ＮｏｄＦおよびＮｏｄＦアッセイについて５％、 ２０％および１０％であった。転化％は、４．８Ｘ１０⁸ｄｐｍ／ｕｍｏｌであ る放射能標識ＣｏＡのパンテテイン部分についての比活性を用いて計算された。 組み換えＥ．コリＡＣＰＳによるＤ−アラニルキャリヤータンパク質のイン・ ビトロのホスホパンテテイニル化 この実施例は、Ｅ．コリＡＣＰＳが、Ｄ−アラニルキャリヤータンパク質（Ｄ ｃｐ）、例えばラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓ ｅｉ ）Ｄｃｐを，イン・ビトロでホスホパンテテイニル化できることを示す。 イン・ビトロのホスホパンテテイニル化反応の条件は、３６時間のインキュベ ーション時間および初発ＣｏＡ濃度における増加を除けば、本質的に、前の実施 例に記述のものと同じである。再び、全アッセイは、３７℃において３並列で実 施された。反応は、１０％ＴＣＡ８００μｌにより失活され、そしてＢＳＡ５０ ０μｌが添加された。１．５ｍｌのエッペンドルフチューブは、逆転によって徹 底的に混合され、そしてタンパク質は、１２，０００ｘｇの遠心によって沈降さ れた。ペレットは、１０％ＴＣＡ９００μｌで３回洗浄され、次いで、１ＭＴｒ ｉｓ塩基１５０μｌ中に再溶解された。次に、再溶解されたタンパク質は、Ｐａ ｃｋａｒｄ液体シンチレーションカクテル３ｍｌに添加され、そしてタンパク質 画分中に組み入れられた放射能の量が定量された。 Ｄｃｐ：ＡＣＰＳアッセイ（ＡＣＰＳで３回、ＡＣＰＳなしで３回） ＡＣＰ：ＡＣＰＳアッセイ（ＡＣＰＳで３回、ＡＣＰＳなしで３回） 結果は表ＩＩＩに提示される： かくして、これらの結果は、Ｅ．コリＡＣＰＳがＤｃｐをホスホパンテテイニ ル化できることを示している。 その他の実施例では、種々の濃度のアポ−Ｄｃｐを、ＡＣＰＳとともに３７℃ でインキュベートして、ホスホパンテテイニル化の程度を決定した。 アッセイは３７℃で一夜インキュベートされた。 形成された［³Ｈ］ホロ−Ｄｃｐは、４．８３Ｘ１０¹⁴ｄｍｐ／ｍｏｌに等し いＣｏＡのパンテテイニル部分の比活性によってｄｐｍを割ることによって定量 化された。これらの結果は、形成されたホロ−Ｄｃｐ量が、反応においてアポ− Ｄｃｐ量とともに直線的に増加することを示している。 また、Ｅ．コリＡＣＰＳが、フレノリシン、グラナチシン、オキシテトラサイ クリンおよびテトラセノマイシン ポリケチド抗生物質生合成に関与しているス トレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＡＣＰのアポ型を修飾することが 分かった。考察 野生型ホロ−ＡＣＰシンターゼ（ＡＣＰＳ）を大腸菌から均質性にまで精製し 、そしてＮ−末端ペプチド配列を使用して、ｄｐｊをＡＣＰＳをコードする遺伝 子と同定した。ＡＣＰＳは２８，０００の生分子量を持つ同質二量体であるよう である。ｄｐｊの過発現によって、１０ｍｇ以上の活性組換え体ＡＣＰＳの単離 が可能になった。驚くべきことに、最近報告されたヘモフィルス・インフルエン ザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のゲノム（Ｆｌｅｉｓｃ ｈｍａｎｎ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：４ ９６−５１２）を含むＧｅｎｂａｎｋデーターベースの一次検索によって、ｄｐ ｊと顕著な相同性を共有する既知の遺伝子は全くないことが明らかになった。ｄ ｐｊは他のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼのクローニングに有用であ り、そしてＰｈｂＣ（Ｇｅｍｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：９３１１−９３２０）、Ｄｃｐ（Ｈｅａｔｏｎ ，Ｍ．Ｐ．ａｎｄ Ｎｅｕｈａｕｓ，Ｆ．Ｃ．（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏ ｌ．１７６：６８１；Ｐｅｒｅｇｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５５９８−１５６０６）、ＴｃｍＭ（Ｓｈｅｎ，Ｂ ．ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ）、およびＮｏｄＦ（Ｇｅｉｇｅｒ，Ｏ．ｅｔ ａｌ ．ｓｕｐｒａ）のようなほぼ修飾された４′−ＰＰ要求酵素の不均質な過産生を 助成し、マクロライド、ポリケチド、デプシペプチド、および非リボソームペプ チドぼ生合成並びにＡＣＰ依存性トランスアシラーゼ活性に関与するアシル活性 化酵素の産生を大いに促進するようである。実施例２： 追加のホスホパンテテイニル化酵素の同定 １２５ａａ大腸菌ＡＣＰＳタンパク質配列についてのＢＬＡＳＴ探求（基本遺 伝子座アライメント探求方法）（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９ ９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）によって、５種の真菌 脂肪酸シンターゼのＣ−末端領域との限界類似性が明らかになり、ホスホパンテ テイニル化活性がこれらのポリ酵素中のドメインとして包含されてもよいことを 示唆している（図６および図７）。特に、３種の真菌脂肪酸シンターゼのＣ−末 端領域と１２０残基に亙って１５−２２％の類似性が見出された。遺伝学的証拠 は、ＦＡＳ２−サブユニットのＣ−末端がＦＡＳ２ Ｎ−末端ＡＣＰドメインの 自己ホスホアンテテイニル化の原因であり得ることを支持する（Ｋｕｈｎ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：４９２−４９７ ；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．３９：３５３−３６２；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｅ．（１９７７）Ｎａｔｕ ｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ６４：３６６−３７０；ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ ，Ｅ．（１９８７）Ｆａｔ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８９：５７０−５７７： Ｗｅｒｋｍｅｉｓｔｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．９６：４８３−４９０）。例えば、１８９４ア ミノ酸（ａａ）酵母脂肪酸シンターゼサブユニットＩＩ（ｙＦＡＳＩＩ）のＣ− 末端１２１アミノ酸は分子内的に作用して、Ｐ−パントユニットをＳｅｒ−１８ ０、このポリタンパク質の推定上のＡＣＰドメイン、に添加することができた。 Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒのグループは既に、それら自体は不活性であり、この提言と 一致する、一つはＳ１８０およ び一つはＧ１７７７、変異体ＦＡＳの対立遺伝子内相補性および体外再活性化を 報告した（Ｋｕｈｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．２４：４９２；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｅｕｒ ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：３５３；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｅ．（１９７７） Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ６４：３６６；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｆａｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ ８９：５７０；Ｗｅｒｋｍｅｉｓｔｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂ ｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９６：４８３；Ｓｃｈ ｏｒｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４ ３：４０７）。 真菌ＦＡＳ２ Ｃ−末端とＡＣＰＳとの間の相同性から、さらに配列を比較し て、大腸菌ＡＣＰＳと３種の細菌タンパク質、ＥｎｔＤ（大腸菌）（Ｅ．ｃｏｌ ｉ），Ｓｆｐ（枯草菌）（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびＧｓｐ（Ｂ．ブレビ ス）（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）との相同性が明らかになった（図６および図８）。ｅ ｎｔＤ、ｓｆｐおよびｓｐの特異的生化学的機能は未知であった。ＥｎｔＤは、 大腸菌中のＦｅ^III−キレート化親鉄剤エンテロバクチンの産生に必要であるこ とが示された（Ｃｏｄｅｒｒｅ，Ｐ．Ｅ．ａｎｄ Ｅａｒｈａｒｔ，Ｃ．Ｆ．（ １９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：３０４３−３０５５）。 Ｓｆｐは枯草菌中のリポペプチド抗生物質スルファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ ）の産生に必要な遺伝子座として単離された（Ｎａｇａｎｏ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３２：３１３−３２１）。 Ｇｓｐは、多重ドメイン性グラミシジンシンター ゼ複合体ＧｒｓＡＢによるグラミシジン（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ）の合成に必要 なタンパク質である（Ｂｏｒｃｈｅｒｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：２４５８）。ＥｎｔＤ、ＳｆｐおよびＧｓｐの外に 、さらなるＢＬＡＳＴ探求によって、ｏ１９５と指定された機能が未知の第三の 大腸菌ＯＲＦ（ＡＣＰＳおよびＥｎｔＤの外に）もまたＡＣＰＳと相同性である ことが明らかなった。 ＥｎｔＤ、Ｓｆｐ、およびＧｓｐは既に高い３ウエイ相同性のオーソロジー（ ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）と同定された（Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｔ．Ｈ．ｅｔ ａｌ． （１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：６２０３）。実際に、大腸菌Ｅ ｎｔＤは、等価官能価と一致するｓｆｐ変異体を補足することができる（Ｇｒｏ ｓｓｍａｎ，Ｔ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ；Ｂｏｒｃｈｅｒｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：２４５８）。 図６、および図８は、酵母脂肪酸シンターゼ、大腸菌ＡＣＰＳ、ＥｎｔＤ、Ｓ ｆｐ、Ｇｓｐ、およびＬｐａのアミノ酸配列のアライメントを示す。これらのア ライメントはこれらのタンパク質中の保存的アミノ酸の２つの領域を示す。Ｅｎ ｔＤ、Ｓｆｐ、Ｇｓｐ、およびＬｐａの外に、ＢＬＡＳＴ探求によって、ＡＣＰ Ｓと潜在的相同性を共有する数種類の他のタンパク質が明らかになり（図９）、 それらの内にはｏ１９５と指定された機能が未知の第三の大腸菌ＯＲＦ（ＡＣＰ ＳおよびＥｎｔＤの外に）並びにラン菌門の異質細胞分化および真菌のリジン生 合成に関与するタンパク質があった。推定上のＰ−ｐａｎｔトランスフェラーゼ ドメインの局所配列アライメントは、数個の高保存的残基を含有する２つの配列 モチーフを明らかにする。相同性のこれらの領域中の高保存的残 基は図９中で線で囲まれている。これらの領域はホスホパンテテイン基の転移に 関与している可能性が高い。このドメインの突然変異誘発の研究によって、保存 的領域がホスホパンテテイニルの転移に関与していることを確認される。実施例３： Ｓｆｐ、ＥｎｔＤ、およびｏ１９５は生体外で基質をホスホパンテ テイニル化する この実施例は、大腸菌ＡＣＰＳに配列相同性を有することが示されたＳｆｐ、 ＥｎｔＤ、およびｏ１９５が生体外の一種またはそれ以上の基質をホスホパンテ テイニル化できることを示す。これらのタンパク質の各々は過産生され、そして 精製され、そしてトランスフェラーゼに依存して、トリチウム標識４′−Ｐｐａ ｎｔをＣｏＡから、多機能ペプチドシンターゼからの大腸菌ＦＡＳ ａｐｏ−Ａ ＣＰ、ａｐｏ−ＡＣＰドメイン、ＴｙｃＡ、ＥｎｔＦ、および／またはＳｒｆＢ １に転移することができることが示された。 Ｓｆｐ、ＥｎｔＤ、およびｏ１９５の過産生および精製は以下のように行った 。Ａｆｐ（２６．１Ｋｄ）を既に公表された操作法に従って過産生し精製した（ Ｎａｋａｎｏ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ ．２３２）。 ＥｎｔＤ（２３．６ＫＤ）は既にクローンされたが、その過産生は、多分微量 コドンおよび異常ＵＵＧ出発コドンの頻度のために、困難であることが分かった （Ｃｏｄｅｒｒｅ，Ｐ．Ｅ．＆ Ｅａｒｈａｒｔ，Ｃ．Ｆ．（１９８９）Ｊ．Ｇ ｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：３０４３）。それ故、ＵＵＧ出発コドンは ＡＵＧに変化し、そして最初の６個の残基のためのコドン用法が最適化された。 ＥｎｔＤを、野生型大腸菌Ｋ− １２から、順方向プライマー 5'-ATTATATCCATGGgtTCcTCcGTtTCcAAcATGGTCGATATGAAAACT ACGCA-3' （配列番号：１９）および逆方向プライマー 5'-GATGTCAAGCTTATTAATCGTG TTGGCACAGCGTTAT-3' （配列番号：２０）（ＩＤＴ）を使用するコロニーＰＣＲによってＰＣＲ増幅し た。順方向プライマーは、ＴＴＧ出発のＡＴＧ出発への変異を可能にするＮｃｏ Ｉ制限部位（下線）を導入し、そしてＧｌｙコドン（ＧＧＴ）をＭｅｔイニシエ ーターの後に挿入した。さらに、順方向プライマーは、ｅｎｔＤ遺伝子の最初の ６個のコドンのためのコドン用法を最適化した（低い場合に示された修飾塩基） 。逆方向プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（下線）を取り込んだ。ＮｃｏＩ ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたＰＣＲ生成物をｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中 にクローンし、そしてコンピテント大腸菌ＤＨ５α中に導入した。次いで、過産 生菌株大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテント細胞を超コイルｐＥＴ２８ｂ− ｅｎｔＤプラスミドで形質転換した。２ｌ培養ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２８− ｅｎｔＤを１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した後、２５℃で５時間増殖させて、優性的 に封入結合したＥｎｔＤを得たが、過産生タンパク質の適量は可溶性であった。 誘導細胞ペーストを５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール、ｐ Ｈ８．０（４０ｍｌ）中に再懸濁させ、１５，０００ｐｓｉでＦｒｅｎｃｈプレ スを２回通過させて溶菌した。細胞破砕物および封入結合タンパク質を８，００ ０×ｇで３０分間遠心分離することによって除去した、粉末硫酸アルミニウムを ３５％、６５％および８０％飽和まで添加した。ＥｎｔＤの最大フラクションを 含有する３５％フラクションを、２．５×１１５ｃｍのＳｅｐｈａ ｃｒｙｌ Ｓ−１００カラムに付した。カラムを、１ｍｌ／分の流速で上記と同 一の緩衝液を使用し８ｍｌのフラクションを収集して溶出して、均質的に純粋な ＥｎｔＤを得た。 同様に、ｏ１９５（Ｓｏｆｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：２５７６−２５８６）を、野生型大腸菌 Ｋ−１２から、順方向プライマー ５’− ATTATATCCATGGgtTAcCGGATAGTTCTGGGGAAAGTT-3' （配列番号：２１）および逆方向プライマー ５’−TGATGTCAAGCTTATCAGTTAACTGAATCGATCCATTG-3' （配列番号：２２）（ＩＤＴ）を使用するコロニーＰＣＲを使用してＰＣＲ増幅 した。そのＮｃｏＩ制限部位（下線）を持つ順方向プライマーは、ｏ１９５配列 のＭｅｔイニシエーターコドン後のＧｌｙコドン（ＧＧＴ）の挿入を与えた。後 続コドンのためのコドン用法もまた最適化した（低い場合に示された塩基変化） 。逆方向プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（下線）を取り込んだ。ＮｃｏＩ ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたＰＣＲ生成物をｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中 にクローンし、そしてコンピテント大腸菌ＤＨ５α中に導入した。次いで、過産 生菌株大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテント細胞を超コイルｐＥＴ２８ｂ− ｏ１９５プラスミドで形質転換した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ２８−ｏ１９５ の２ｌ培養液（２×ＹＴ培地）を１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した後、３７℃で３． ５時間増殖させて、優性的に封入結合したｏ１９５タンパク質を得た。細胞ペー ストを５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール、ｐＨ８．０（４ ０ｍｌ）中に再懸濁させ、１５，０００ｐｓｉでＦｒｅｎｃｈプレスを２回通過 させて溶菌した。細胞破砕 物および封入結合タンパク質を２７，０００×ｇで３０分間遠心分離することに よってペレット化した。封入−結合タンパク質ペレットを３０ｍｌの５０ｍＭト リス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および５％グリセロール中に再 懸濁させ、そして１０ｍｇリゾチームおよび３０ｍｇのデオキシコレートと室温 で３０分間インキュベートした。２７，０００×ｇで１５分間の遠心分離によっ てペレットを再び得て、３０ｍｌの８Ｍ尿素、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８ ．０、１０ｍＭ ＤＴＴ中に溶解させた。残留固体物質を２７，０００×ｇで１ ５分間の遠心分離によって除去した。次いで、尿素可溶化溶液（３０ｍｌ）を、 ８Ｍ尿素、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡させた２．５×１０ｃｍ のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに付した。カラムを、５０ｍｌの平衡緩衝液で 洗浄し、次いで８Ｍ尿素、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の０〜０．２ ５Ｍ ＮａＣｌの２５０ｍｌ次いで同一緩衝液中の０．２５〜１Ｍ ＮａＣｌの ２００ｍｌの勾配を適用した。ｏ１９５タンパク質は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ によって決定して約２００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。精製ｏ１９５を、８Ｍ尿 素、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＤＴＴ中に、その１部を １０倍に希釈することによって復元し、１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、 １ｍＭＤＴＴに対して４℃一晩透析した。２×ＹＴ培地中に増殖した２リットル の培養液は３．１ｇの細胞を与え、それから約８０ｍｇのｏ１９５タンパク質を 得た。 基質を過発現しそして以下のように精製した。大腸菌脂肪酸シンターゼＡＣＰ を過産生させ、そして大腸菌株ＤＫ５５４（Ｃｒｏｓｂｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（ １９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙ ｓｉｃａ Ａｃｔａ １２５１：３２）からＲｏｃｋ ａｎｄ Ｃｒｏｎａｎの 操作法（Ｒｏｃｋ Ｃ．Ｏ．＆ Ｃｒｏｎａｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ．（１９８１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，７１：３４１−３５１）に従ってそのアポ型 に精製し、例外として、細胞破裂および遠心分離（２８，０００×ｇで３０分間 ）の後、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および１０ｍＭ ＭｎＣｌ₂を含有する粗抽出物を 室温で６０分間インキュベートした。この方式で、少量のホロ−ＡＣＰを大腸菌 ＡＣＰホスホジエステラーゼを使用してアポ型に加水分解した（Ｆｉｓｃｈ Ａ ．Ｓ．＆ Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｅ．Ｐ．（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１ ７２，５４４５−５４４９）。 ＴｙｃＡのペプチジルキャリャータンパク質（ＰＣＰ）ドメイン（図１０）を 、ヘキサ−ヒスチジンタッグを用いて、大腸菌株ＡＧ１３００９（ｐＲＥＰ４） ／ｐＱＥ６０−ＰＣＰを使用して過産生した（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，印刷中）。誘導 培養物の溶菌後、Ｈｉｓ₆タッグ付きタンパク質をニッケル−キレート・クロマ トグラフィーによって精製した。 アポ−ＳｒｆＢ１をプラスミドｐ１２０−２ １Ｅからクローンした（Ｎａｋａｎｏ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：１７７０−１７７８）。要約すれば、ｐ１２０− ２１ＥをＥｃｏＲｖで消化して、ＳｒｆＢ１をコードしている３，６４８塩基対 断片、スルファクチンシンターゼのバリン活性化ドメインを放出させた。この断 片をＳｔｕＩ−開裂ｐＰＲＯＥＸ−１（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ｅｎｃｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に挿入して、Ｎ末端ヘキサ−ヒスチ ジン−タッグＳｒｆＢ１ドメイン（１ ４２．７ｋＤ）をコードするプラスミドｐＭＬ１１８を得た。Ｈｉｓ６−Ｓｒｆ Ｂ１を大腸菌株ＡＧ１５７４を使用して過産生した（Ｆｒｉｓｂｙ，Ｄ．＆ Ｚ ｕｂｅｒ，Ｐ．（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：７５５７−７５ ６４）。細胞を、２×ＹＴ培地（２Ｌ）中で２５℃で０．４のＯ．Ｄ．まで増殖 させ、その点でそれらを１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、さらに追加の４時間増殖さ せた。細胞を遠心分離によって収穫し（３ｇ）、３５ｍｌの５ｍＭイミダゾール 、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．９中に再懸濁し、 Ｆｒｅｎｃｈ加圧セルを２回通過させて溶菌した。この粗抽出物を２７，０００ ×ｇで３０分間の遠心分離によって静澄化した。５０％を超える過発現ＳｒｆＢ １を、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されて可溶性フラクション中に得た。 ヘキサ−ヒスチジンタッグ付きＳｒｆＢ１を、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ樹脂（Ｎｏｖａ ｇｅｎ）で、製造業者の推奨規準に従って精製した。 ＥｎｔＦを過産生しそしてＫｅａｔｉｎｇ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９５ ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２２２９およびＲｅｉｃｈｅｒｔ，Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．１：５４９の記載の通りに精製し た。 基質に対するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を、［³Ｈ］−（ パンテテニル）−ＣｏＡＳＨから［³Ｈ］−４′−ホスホパンテテインの転移を 、推定上のＰ−ｐａｎｔトランスフェラーゼ酵素の存在下で放射線検定法によっ て監視することによって検定した。酵素試料を、７５ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ ８．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＤＴＴ、１６０μＭ［３Ｈ］−（パン テテイニル）−ＣｏＡ、２ ５μＭ ＡＣＰまたはＨｉｓ６−ＰＣＰと、１００μＬの最終容積中で３７℃で ６０分間インキュベートした。インキュベートを１０％ＴＣＡで停止し、５００ μｇのＢＳＡを担体として添加した。タンパク質を遠心分離で沈殿させ、１０％ ＴＣＡで３回洗浄し、タンパク質ペレットを１５０μＬ １Ｍトリス塩基で可溶 化した。再懸濁タンパク質を３ｍｌの液体シンチレーションカクテルに添加し、 基質タンパク質中に取り込まれた［３Ｈ］−ホスホパンテテインの量を液体シン チレーション計測によって定量した。 ４′−ＰｐａｎｔのＡＣＰおよびＨｉｓ６−ＰＣＰへの特異的共有結合はオー トラジオグラフィーによって確認された。これらの検定は、２０μＭ［³Ｈ］− （パンテテニル）−ＣｏＡＳＨ（２．６×１０⁶ｄｐｍ全活性）を検定に使用し 、ＢＳＡをＴＣＡ沈殿物に添加せず、そしてペレットはＳＤＳまたは１Ｍトリス 塩基で滴定されたＰＡＧＥ試料緩衝液中で可溶化された以外は、上記の通りに行 った。基質そしてアポ−ＰＣＰを使用する検定は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ て解決され、大腸菌ＡＣＰを使用する検定は２０％生ＰＡＧＥによって解決され 、そしてＳｒｆＢ１もしくはＥｎｔＦを使用する検定は８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに よって解決された。ゲルをクマシー染色し、Ａｍｐｌｉｆｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ）中に３０分間浸漬し、８０℃真空下で乾燥し、−７０℃で２４〜１５０時間Ｘ 線フィルムに暴露した。オートラジオグラフィーをデジタルスキャナーを使用し て走査し、放射能標識結合の相対強度をＮＩＨ Ｉｍａｇｅｌ．５９ソフトウエ アー（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ．ＵＳＡ ）を使用して定量した。 Ｓｆｐ、ＥｎｔＤ、またはｏ１９５の存在下で行ったホスホパンテテ イニル化検定の結果を図１１に示す。これらの結果は、Ｓｆｐ、ＥｎｔＤ、また はｏ１９５がホスホパンテテイン基をＡＣＰおよびＨｉｓ６−ＰＣＰのような基 質に転移することができることを示している。さらに、［³Ｈ］−ホスホパンテ テインは実際に、Ｓｆｐ、ＥｎｔＤ、またはｏ１９５によって仲介されたホスホ パンテテニル化反応を従って、ＡＣＰおよびＨｉｓ６−ＰＣＰに特異的および共 有的に結合することを示した。 図１２は、ＥｎｔＤはＥｎｔＤ断片をホスホパンテテイニル化することができ 、そしてＳｆｔはＡｆｒＢ１断片をホスホパンテテイニル化することができるこ とを示している。 アポ−タンパク質中に取り込まれたトリチウム放射能は無傷のホスホパンテテ イニル基の転移を示すことのさらなる確認は、質量分析法によって査定された（ Ｌａｍｂａｌｏｔ，Ｒ．Ｈ．ａｎｄ Ｗａｌｓｈ，Ｃ．Ｔ．（１９９５）Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４６５８）。非標識酵素的ホロ−ＰＣＰの質量分 析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、アポ−ＰＣＰ基質について、１３，１３０（計 算値１３，１２０）の実測分子量とは対照的に、１３，４３１（計算値１３，４ ５９）の分子量を示した。従って、これらのデータは、Ｓｆｐ、ＥｎｔＤ、およ びｏ１９５はＰ−ｐａｎｔのアシルキャリャータンパク質のセリン側鎖への転移 を触媒する酵素であることを確立する。 Ｓｆｐを使用するアポ−ＡＣＰおよびＨｉｓ６−ＰＣＰについてＫｍの決定の ために、検定の線形範囲を、上記の放射能検定を使用して種々の酵素濃度での、 時間に対するアポ−基質のホロ−基質へのパーセント転化率を監視することによ って決定した。検定の線形範囲を決定した後、ホスホパンテテイニル転移の初速 度を、固定濃度のＳｆｐおよび種々の 濃度の基質（ＡＣＰまたはＨｉｓ６−ＰＣＰ）を使用して測定した。 結果を図１３に示す。これらは、Ｓｆｐは、ＰＣＰのような基質を広範囲の濃 度でホスホパンテテイニル化することができることを示している。 ＥｎｒＦ中への放射能標識のＥｎｔＤ−触媒取込みの時間経過を行った。図１ ４Ａに示されるように、ＥｎｔＦはＥｎｔＤ（１００ｎＭ）によって効果的に修 飾され、他方ＥｎｔＦは１５倍の高濃度のＡＣＰおよびｏ１９５の存在下では殆 ど修飾を受けず、このことは明らかにＥｎｔＦについてのＥｎｔＤの特異性を示 している。反対に、図１４Ｂは、アポ−ＡＣＰの殆ど排他的な修飾を示し、この ことは、ＡＣＰがＩＩ型脂肪酸シンターゼを活性化するＰ−ｐａｎｔトランスフ ェラーゼでありそしてＥｎｔＤが大腸菌中のＩ型エンテロバクチンシンターゼを 活性化するＰ−ｐａｎｔトランスフェラーゼであることを確認する。 従って、この分析は、大腸菌内で起こる少なくとも２種のパートナー特異性Ｐ −ｐａｎｔ転移反応の証拠を提供する。ＡＣＰはＰ−ｐａｎｔのアポ−ＡＣＰへ の転移を特異的に触媒し、他方ＥｎｔＤはＥｎｔＦのためのパートナートランス フェラーゼである。ｏ１９５は、大腸菌中の第三の未知の基質について独特の特 異性を有するようである。この未知のタンパク質はｏ１９５によってのみ効率的 に触媒されそしてＡＣＰＳまたはＥｎｔＤによっては触媒されないようでなる。 ｏ１９５のための一つの可能なパートナーは、生体内で［³Ｈ］β−アラニンを 取り込むことが観察された大腸菌中の３５ｋＤａタンパク質である（Ｇｅｒｎｇ ｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３ ：９３１１）。 他方、Ｓｆｐは、２種のバチルス由来Ｉ型ペプチドシンターゼドメイン、ＰＣ ＰおよびＡｒｆＢ１、並びに大腸菌ＩＩ型脂肪酸シンターゼＡＣＰサブユニット に関して非特異性であるようである。上記に示されたように、Ｓｆｐは３種のす べての基質の修飾を効率的に触媒し、さらにＥｎｔＦの修飾を触媒することがで きる。この証拠に基づいて、ＳｆｐはＩ型ペプチドシンターゼドメインとＩＩ型 脂肪酸サブユニットとの間を識別しないようであり、このことは少なくとも大腸 菌中で発現される場合Ｓｆｐと脂肪酸シンターゼとの間に混線があってもよいこ とを示す。 本明細書に記載の研究におけるＳｆｐのためのホスホパンテテイニル転移活性 の確立は明らかに、バリン活性化の原因であるＳｒｆＢの第一サブサイト中の保 存的セリンの翻訳後修飾のために、Ｓｆｐに触媒的負荷機能をの与える。ｓｒｆ のオペロンは、ｓｒｆＡ、ＡｒｆＢ、およびａｒｆＣが、スルガクチンの７個の 成分アミノ酸および側鎖β−ヒドロキシ脂肪酸を活性化しそして組立てる活性を コードする４つの転写解読枠よりなる。Ｓｆｐは、ＳｒｆＡＢＣ中のすべての７ アミノ酸活性化部位中のコンセンサスセリン残基を修飾することができるようで ある。 拡大すると、Ｇｓｐは、ＧｒｓＢおよびＧｒｓＢ中の５アミノ酸活性化部位の 翻訳後修飾の原因であり、非リボソームペプチド結合組立てのためのチオテンプ レート機構中のアミノ酸の逐次活性化および重合を可能にする。 同様に、ＥｎｔＤ中の４′−ホスホパンテテイニル（４′−Ｐｐａｎｔ）トラ ンスフェラーゼ活性の証明はＥｎｔＤに生化学的機能を与える。経路中のＥｎｔ Ｆ、１４０ｋＤａ成分は、既にクローンされ、配列決定され、精製され、そして Ｌ−セリンを活性化しかつ一定のホスホパンテ テインを含有することが示された（Ｒｕｓｎａｋ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９１ ）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：７７４０）。ＥｎｔＤが生体内でのエンテ ロバクチン生合成に必要であり、そして上記のように、純粋なアポ−ＥｎｔＤの 生体外Ｐ−パンテテイニル化のための高い活性を示す場合、ＥｎｔＤは、生体内 のアポ−ＥｎｔＦから活性ホロ−ＥｎｔＦを産生する特異的ｐ−ｐａｎｔトラン スフェラーゼと規定することができる。純粋な純大腸菌ＡＣＰＳは、顕著にはＥ ｎｔＦを翻訳後的に修飾せず、このことは、タンパク質−タンパク質認識が生体 内のホスホパンテテイニル化の特異性を調節するという仮説と一致する。Ｅｎｔ Ｄおよびエンテロバクチンシンターゼ成分のＣｏＡＳＨ、Ｌ−セリンおよびジヒ ドロキシベンゾアートとのインキュベートは生体外エンテロバクチン産生を再構 成するようである。１４０ｋＤａで、ＥｎｔＦは多重ドメインポリペプチドシン テターゼ中の典型的な大きさのａａ−活性化モジュールである（Ｓｔａｃｈｅｌ ｈａｕｓ，Ｔ．＆ Ｍａｒａｈｉｅｌ，Ｍ．Ａ．（１９９５）ＦＥＭＳ Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２５：３）。ＥｎｔＤ中のその効率的な修飾は、Ｐ −ｐａｎｔ添加が、アポ−タンパク質のその生構造への折り畳みの前に排他的に 翻訳時的よりも、アポ−タンパク質の翻訳後に起こることができることを示す。 大腸菌アポ−ＡＣＰのＮＭＲ構造は、求核的Ｓｅｒ−３６が接近可能なβ−ター ン中にあり（Ｈｏｌａｋ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．１７５：９）、多分Ｐ−ｐａｎｔトランスフェラーゼによる認識に 役割を演じてもよいポリケチドおよびポリペプチドシンターゼ中のＡＣＰドメイ ンのための共通構築的骨格であることを示す。 遺伝学は、一定の翻訳後修飾酵素による特異的パートナーペプチドシンテター ゼ認識について強く弁護し、そしてこれは多分、非リボソームペプチド抗生物質 の生合成での一般的な主題であろう。既に、純粋な大腸菌ＡＣＰシンターゼがＥ ｎｔＦを翻訳後的には修飾しないことは観察され、このことは特異性を調節する タンパク質−タンパク質認識と一致した。実施例４： ホロ−ＳｒｆＢ１はそのコグネートアミノ酸、Ｌ−バリンの活性化 にコンピテントである。 この実施例は、Ｓｆｐによるアポ−ＳｒｆＢ１の修飾から生体外で産生したホ ロ−ＳｒｆＢ１はそのコグネートアミノ酸、Ｌ−バリンの活性化にコンピテント であることを示す。 反応は以下のように行った。アポ−ＳｒｆＢ１（２μＭ）を、２００μＭのＣ ｏＡＳＨ、７５ｍＭのトリス・ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、２ ５ｍＭのＤＴＴおよび１．３μＭのＳｆｐと、３７℃で１５分間インキュベート して、ホロ−ＳｒｆＢ１を生成した。ＳｒｆＢ１−Ｓｆｐ反応混合物に、非標識 アミノ酸（バリンまたはアスパラギン酸）を９０μＭの最終濃度まで添加した。 ＡＴＰを２ｍＭの最終濃度まで添加した後、０．５μＣｉの［¹⁴Ｃ］Ｖａｌ（２ ８１Ｃｉ／モル）または［¹⁴Ｃ］Ａｓｐ（２０７Ｃｉ／モル）を添加した。反応 物（１１５μＬ）を３７℃で１５分間インキュベートし、対で担体として１５μ Ｌの２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ溶液と共に８００μＬの１０％ＴＣＡを添加した。沈 殿物を遠心分離によって収集し、１０％ＴＣＡで洗浄し、１５０μＬのトリス塩 基中に溶解し、次いで液体シンチレーションによって計測した。 結果を図１５に示す。この図で示されたヒストグラムは、アポ−ＳｒｆＢ１は ［¹⁴Ｃ］−Ｌ−Ｖａｌとインキュベートされた場合、あまりアシル化を受けず、 ホロ−ＳｒｆＢ１による少量の混入を示すことを示す。しかし、Ｓｆｐとのイン キュベーションの後、完全なインキュベーション混合物中に生成した［¹⁴Ｃ］− Ｌ−Ｖａｌ−ホロ−ＳｒｆＢ１共有複合体の水準は約１４倍に上昇し、存在する ホロ−ＳｒｆＢ１の量の増加と一致する。これは、ホロ−ＳｒｆＢ１のアミノ酸 −活性化ドメインによるバリル−ＡＭＰ生成から起こり、隣接ＰＣＰドメイン中 のＰ−ｐａｎｔ部分のＳＨ基への分子内アシル転移が起こる。最後に、ホロ−Ｓ ｒｆＢ１は、非コグネトＬ−アスパラギン酸残基、ＳｒｆＡＢＣによって活性化 される第５番のアミノ酸によって共有結合的にアシル化されることはできず、こ のことはＳｒｆＢ１上のアスパルテート特異性アデニル化ドメインの不在と一致 する。 従って、この実施例は、ＳｆｐおよびＣｏＡＳＨとのインキュベーションの後 に生成したホロ−ＳｒｆＢ１は活性アデニル化ドメインおよび機能的ホロ−ペプ チジルキャリャータンパク質ドメインの両方を有することを示す。さらに、それ は、アポからホロ形態への転化における１４３ｋＤのＳｒｆＢ１断片へのＳｆｐ の作用は、アミノ酸Ｌ−バリン、スルファクチン中の残基４による特異的認識お よびアシル化を受けるのにコンピーテントなホスホパンテテイニル化ＳｒｆＢ１ を生成することを示す。それ故、Ｓｆｐおよび他のホスホパンテテイニルトラン スフェラーゼは、例えば、多酵素、多重チオテンペレートシンターゼの隣接部位 間のペプチド結合生成ステップを探査する有用な試薬であるべきである。実施例５： 追加のホスホパンテテイニル化酵素の同定 さらなるデータベース検索のために塩基としてＥｎｔＤ／Ｓｆｐ／Ｇｓｐファ ミリーを使用することによって、多分４′−Ｐ−ｐａｎｔトランスフェラーゼフ ァミリー員である数種の追加の候補体を同定することができる（表ＩＶおよび図 ９）。Ｈ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）中の仮説上のタンパク 質、ＨＩＯ１５２は推定上のＰ−ｐａｎｔトランスフェラーゼと同定され、ヘモ フィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）ゲノム中のＰ−ｐａｎｔトランスフェラ ーゼの顕性の欠落（ＡＣＰに基づく探求法を使用して）を確信させる。ＨＩＯ１ ５２は、Ｈ．インフルエンザ脂肪酸シンターゼ遺伝子クラスターの直ぐ上流に位 置し、脂肪酸生合成中のそのタンパク質生成物のための機能と一致する。また、 表ＩＶおよび図９中では、ラン菌門中および酵母中に２種の追加のタンパク質が 同定され、遺伝学的証拠の前に、本明細書で提案された推定上の機能と一致する 。アナバエナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）では、遺伝子Ｈｅｔｌ、ＨｅｔＭ、および ＨｅｔＮは、異種細胞の分化を阻害する提案された二次代謝産物の産生に関係し ていて、工程は、ラン菌門細胞のサブセットが窒素を固定する能力を有する特化 異種細胞に分化する低固定化窒素条件下で起こる（Ｂｌａｃｋ．Ｔ．Ａ．＆ Ｗ ｏｌｋ，Ｃ．Ｐ．（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：２２８２）。 配列分性は、ＨｅｔＮが、ポリケチドおよび脂肪酸の生合成に関与するもののよ うなＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性オキシドレダクターゼであり、一方ＨｅｔＭはＡＣＰ ドメインを有することを示唆する。Ｈｅｔｌは、Ｓｆｐ／Ｇｓｐ／ＥｎｔＤに対 するその類似性で、仮説二次代謝産物の合成中のＨｅｔＭ特異性ホスホパンテテ イニルトランスフェラーゼであるようである。 ホスホパンテテイニル化ファミリーの酵素の他の候補体は、酵母リジン生合成 経路に関与している２７２アミノ酸Ｌｙｓ５タンパク質である。酵母および他の 真菌は、独自なα−アミノアジピン酸経路、ホモクエン酸から始まりそしてα− アミノアジピン酸を経てサッカロピンを経てリジンに至る８ステップ経路を経由 してリジンを合成する（Ｂｈａｔｔａｃｈａｊｅｅ，Ｊ．Ｋ．（１９８５）ＣＲ Ｃ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｙ １２ ：１３１）。遺伝子分析は、相補性によって、Ｌｙｓ２およびＬｙｓ５がこの経 路中の同一ステップ、α−アミノアジピン酸のアミノアジピン酸セミアルデヒド への還元に関与していると関係させた（Ｓｔｏｒｔｓ，Ｄ．Ｒ．＆ Ｂｈａｔｔ ａｃｈａｊｅｅ，Ｊ．Ｋ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６１：１８２）。この反応は、標識ピロリン酸交換実験に よって示されたように、α−アミノアジポイル−ＡＭＰ中間体を経て進行するよ うである（Ｓａｇｉｓａｋａ，Ｓ．＆ Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｋ．（１９６０）Ｎａ ｔｕｒｅ １８８：１１９１；Ｓｈｉｈａ，Ａ．Ｋ．＆ Ｂｈａｔｔａｃｈａｊ ｅｅ，Ｊ．Ｋ．（１９７１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１２５；７４３）。最近の配 列分析（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ｅ．＆ Ｊｉｎｋｓ−Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｓ．（ １９９１）Ｇｅｎｅ ９８：１４１）は、Ｌｙｓ２が、ＴｙｃＡ、ＧｒｓＡＢお よびＳｒｆＡを含むアミノ酸活性化ペプチドシンテターゼと相同性を持つ１５５ ｋＤａタンパク質であることを示す。これらのペプチドシンテターゼと同様に、 Ｌｙｓ２は、ＡＴＰをＡＭＰおよびＰＰｉに開裂し、α−アミノアジペートをα −アミノアシル−ＡＭＰｔとして活性化し、次いでＮＡＤＰＨによってアルデヒ ドに還元すると考えられる。 Ｌｙｓ２中のコンセンサスＰ−ｐａｎｔ結合についての探求はＳｅｒ−８８０周 りのシグニチュアー・モチーフＬＧＧＨＳを明らかにした。それ故、Ｌｙｓ２お よびＬｙｓ５は２つのサブユニット酵素を生成するようであり（Ｓｔｏｒｔｓ， Ｄ．Ｒ．ａｎｄ Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ，Ｊ．Ｋ．（１９８９）Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６１：１８２）、２７２ａ ａＬｙｓ５はＬｙｓ２中のＳｅｒ−８８０に特異的ホスホパンテテイニルトラン スフェラーゼであるようである。Ｌｙｓ２上の新しく導入されたｐ−ｐａｎｔ補 欠分子族のチオールは、アミノアジポリ−ＡＭＰに攻撃してアミノアジポリ−Ｓ −ｐａｎｔ−Ｌｙｓ２を与え、相同チロシジンシンテターゼＡサブユニット中で のアミノアシル−ＡＭＰのアミノアシル−Ｓ−ｐａｎｔ−ＴｙｃＡへの逐次生成 に極めて類似している。この点で、アシル−Ｓ−ｐａｎｔ−Ｌｙｓ２への水素化 物添加は、容易にアルデヒド生成物およびＨＳ−ｐａｎｔ−Ｌｙｓ２に分解する チオヘミアセタールを与える。この連鎖は、逆方向で、ＧＡＰデヒドロゲナーゼ 触媒作用でシステイニル−Ｓ−酵素ヘミチオアセタールを経る、グリセルアルデ ヒド−３−Ｐのアシル−Ｓ−酵素へに酸化で、先例を有する（Ｗａｌｓｈ，Ｃ． Ｔ．（１９７９）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。 ｂｌｉおよびｌｐａ−１４遺伝子生成物はおそらく、均等な役割、それぞれＢ ．リヘニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）バシトラシンシンテタ ーゼ（Ｇａｉｄｅｎｋｏ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｉａ１３）および枯草菌（Ｂ．ｓｕ ｂｔｉｌｉｓ）イツリンＳシンテターゼ（Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（ １９９３）Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．７６：４４５）上の各ａａ−活 性化ドメインの反復性Ｐ−パンテテイニル化を演じる。 従って、これらの結果は、触媒的は音訳後修飾活性をもつ一ダースを超えるタ ンパク質のファミリーの存在についての証拠を提供する。共通の基質としてＣｏ ＡＳＨを有するｐ−パンテテイニルトランスフェラーゼがあるが、それらは、タ ンパク質−タンパク質相互作用によって指示された、特異的パートナータンパク 質中の保存的セリンモチーフのための特異性を示すようである。さらに、多重チ オテンペレート骨格を使用してペプチド抗生物質を非リボソーム的に産生する多 酵素ペプチドシンテターゼのすべてではない場合は大多数は、特異的翻訳後修飾 酵素が、アシル転移を可能にするのに必要なスウインギング腕チオール基に共有 結合的に装備するこのパラダイムに従うようである。ＡＣＰＳの１２６アミノ酸 大腸菌サブユニットと比較すると、図６、８および９に示されたホスホパンテテ イニルトランスフェラーゼ相同体は、パートナータンパク質のための特異性付与 領域であってもよい特別な５０−１５０アミノ酸残基を有する。均等物 当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識 するか、またはせいぜい日常実験法を使用して確認することができる。かかる均 等物は以下の請求の範囲を包含することが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/70 ６１３ Ａ６１Ｋ 31/70 ６１３ ６１４ ６１４ 38/00 45/00 45/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/10 9/10 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 ランバロツト，ラルフ・エイチ アメリカ合衆国マサチユセツツ州02093レ ンサム・ポンドストリート５ (72)発明者 ゲーリング，エイミー・エム アメリカ合衆国マサチユセツツ州02115ボ ストン・ロングウツドアベニユー240・ハ ーバード・メデイカル・スクール・デパー トメント・オブ・バイオロジカル・ケミス トリー・アンド・モレキユラー・フアーマ コロジー (72)発明者 レイド，ラルフ アメリカ合衆国カリフオルニア州94143サ ンフランシスコ・サージ104−ボツクス 0541・ユニバーシテイ・オブ・カリフオル ニア，サンフランシスコ・バイオモレキユ ラー・リソース・センター (72)発明者 ウオルシユ，クリストフアー・テイ アメリカ合衆国マサチユセツツ州02181ウ エルズリー・ワシントンストリート735・ ウエルズリー・カレツジ・プレジデンツハ ウス

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 適切な緩衝液および基質をホスホパンテテイニル化するのに十分な量で 単離されたホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを含む組成物。 ２． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが原核生物のホスホパンテテ イニルトランスフェラーゼである請求の範囲１の組成物。 ３． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼである請求の範囲２の組成物。 ４． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが真核生物のホスホパンテテ イニルトランスフェラーゼである請求の範囲１の組成物。 ５． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが少なくとも２５０ｍＵ／ｍ ｇの比活性を有する請求の範囲１の組成物。 ６． 緩衝液が、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの活性に有意に影 響を及ぼすことなく組成物を凍結するのに十分な量のグリセロールを含む請求の 範囲１の組成物。 ７． 凍結乾燥させた形態をとる単離されたホスホパンテテイニルトランスフ ェラーゼ。 ８． 単離されたホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよび使用のため の説明書を含む、基質のインビトロホスホパンテテイニル化のためのキット。 ９． 更に基質のインビトロホスホパンテテイニル化に必要な少なくとも一つ の試薬を含む請求の範囲８のキット。 １０． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが凍結乾燥されてい る請求の範囲９のキット。 １１． 配列番号２のアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）アシル輸 送蛋白質シンターゼのアミノ酸配列との少なくとも約５０％のアミノ酸配列同一 性を有するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む 組換え発現ベクター。 １２． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが配列番号２のアミノ酸配列 を有する請求の範囲１１の組換え発現ベクター。 １３． 請求の範囲１１の組換え発現ベクターで形質転換させた宿主細胞。 １４． 請求の範囲１２の組換え発現ベクターで形質転換させた宿主細胞。 １５． 更にホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質をコードする発現 形態の少なくとも一つの遺伝子で形質転換させた請求の範囲１３の宿主細胞。 １６． ある抗生物質の生合成にかかわる多酵素複合体の構成成分をコードする 発現形態の少なくとも一つの遺伝子で形質転換させた請求の範囲１５の宿主細胞 。 １７． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする発現形態の遺伝 子で形質転換させた真核生物細胞。 １８． ある基質をインビトロでホスホパンテテイニル化するための、単離され たホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをその基質と接触させ、そのことに よりその基質をホスホパンテテイニル化することを含む方法。 １９． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが少なくとも約８０ ０倍精製される請求の範囲１８の方法。 ２０． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが原核生物のホスホパンテテ イニルトランスフェラーゼである請求の範囲１９の方法。 ２１． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） からのものである請求の範囲２０の方法。 ２２． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが少なくともアミノ酸配列Ｇ ＮＤおよび（Ｗ／Ｆ）ＮＮＫＥ（Ａ／Ｓ）ＮＮＫ（配列中、Ｎはいずれかのアミ ノ酸である）を含むアミノ酸配列を有する請求の範囲１９の方法。 ２３． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが配列番号２のアミノ酸配列 を有する大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）アシル輸送蛋白質シンターゼのアミノ酸配列 と少なくとも約５０％のアミノ酸配列同一性を有する請求の範囲２２の方法。 ２４． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが配列番号２のアミノ酸配列 を有する請求の範囲２３の方法。 ２５． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが、Ｓｆｐ、ＥｎｔＤ、ｏ１ ９５、およびそれらの活性断片からなる群より選択される請求の範囲１８の方法 。 ２６． 基質がタイプＩアシル輸送蛋白質である請求の範囲１８の方法。 ２７． 基質がタイプＩＩアシル輸送蛋白質である請求の範囲１９の方法。 ２８． 基質が、脂肪酸、ポリケチド、およびリボソームによっては産生されな いペプチドの生合成に関与する請求の範囲１８の方法。 ２９． 基質が抗生物質の生合成に関与する請求の範囲２８の方法。 ３０． 更に、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼとその基質とを、脂肪 酸、ポリケチド、およびリボソームによっては産生されないペプチドの生合成に 関与する少なくとも一つの追加的構成成分と接触させることを含む請求の範囲２ ８の方法。 ３１． ある細胞中でのある基質のホスホパンテテイニル化のため、もしくはあ る細胞中でのある基質のホスホパンテテイニル化を増加させるための、その基質 がホスホパンテテイニル化されるか、もしくは形質転換させていない細胞と比較 した場合にその細胞内でのその基質のホスホパンテテイニル化が増加しているよ うに、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする発現形態の遺伝子 でその細胞を形質転換することを含む方法。 ３２． ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが、Ｓｆｐ、ＥｎｔＤ、ｏ１ ９５、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）アシル輸送蛋白質シンターゼ、およびそれらの 活性断片からなる群から選択される請求の範囲３１の方法。 ３３． 更に、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質をコードする発 現可能形態の遺伝子でその細胞を形質転換することを含む請求の範囲３１の方法 。 ３４． 基質がタイプＩアシル輸送蛋白質である請求の範囲３３の方法。 ３５． 基質がタイプＩＩアシル輸送蛋白質である請求の範囲３３の方法。 ３６． インビトロで抗生物質を産生するための、その抗生物質がインビトロで 産生されるように、単離されたホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを、抗 生物質の合成に関与する基質と、適切な緩衝液および 適切な試薬の存在下で接触させることを含む方法。 ３７． ある細胞内で抗生物質を産生させるための、その抗生物質がその細胞中 で産生されるように、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする発 現可能形態の第一遺伝子およびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質 をコードする発現可能形態の第二遺伝子で、ある細胞を形質転換することを含む 方法。 ３８． 更に、その細胞内でのその抗生物質の合成に必要な蛋白質をコードする 発現形態の少なくとも第三遺伝子でその細胞を形質転換することを含む請求の範 囲３７の方法。 ３９． 抗生物質が、エリスロマイシン、カリスロマイシン、オキシテトラサイ クリン、バキトラシン、シクロスポリン、ペニシリン、セファロスポリン、およ びバンコマイシンからなる群より選択される請求の範囲３６の方法。