ES2473622T3 - Usos de interferones con estructura espacial alterada - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado que tiene la secuencia mostrada en la Figura 1.

Description

Usos de interferones con estructura espacial alterada.

CAMPO DE LA INVENCI�N

0001 Esta invencion se refiere a un interferon recombinante super-compuesto (rSIFN-co) obtenible mediante un proceso que comprende introducir en E. coli la secuencia de polinucleotido mostrada en la Fig. 1 con configuracion espacial cambiada. Una caracteristica de rSIFN-co en esta invencion es que no solo puede inhibir la duplicacion del ADN (acido desoxiribonucleico) del virus de la hepatitis B sino tambien la secrecion de HBsAG y HBeAG.

ANTECEDENTES DE LA INVENCI�N

0002 rSIFN-co es una nueva molecula de interferon construida con el aminoacido conservador mas popular encontrado en subtipos de IFN-a naturales humanos utilizando metodos de ingenieria genetica. Las patentes US N� 4,695,623 y 4,897,471 lo han descrito. Habia sido demostrado que rSIFN-co tiene actividad de IFN de amplio espectro e inhibicion de virus y tumor y actividad de celulas asesinas naturales. La patente US N� 5,372,808 de Amgen, Inc. aborda el re-tratamiento de rSIFN-co en hepatitis C. La patente China N� 98114663.5 de Shenzhen Jiusheng Bio-engineering Ltd. aborda el tratamiento rSIFN-co para la hepatitis B y C.

0003 La Administration de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) autorizo a Amgen a producir rSIFN-co con E. Coli. para el tratamiento clinico de la hepatitis C a finales de 1997.

0004 Los pacientes con hepatitis B pueden ser identificados al detectar el HBsAg y el HBeAg. a-IFN se usa comunmente en clinicas para el tratamiento de la hepatitis B. IFN se une a receptores de membrana de celulas superficiales, inhibiendo la duplicacion del ADN y ARN (acido ribonucleico), incluyendo la induccion de algunas enzimas para evitar la duplicacion del virus en celulas infectadas con hepatitis. Todos los IFNs pueden inhibir solo la duplicacion del ADN de los virus, no el antigeno e y s.

0005 Esta descripcion describe interferon recombinante super-compuesto, metodo para producir el mismo y sus usos.

0006 Un brote de neumonia atipica, conocida como sindrome respiratorio agudo grave (SARS) e identificado por primera vez en la provincia de Guangdong, China, se ha extendido a varios paises. Casos similares se detectaron en pacientes en Hong Kong, Vietnam y Canada a partir de Febrero y Marzo de 2003. La Organizacion Mundial de la Salud (OMS) emitio una alerta mundial para la enfermedad. A mediados de Marzo de 2003, se reconocio SARS en personal sanitario y personal domestico que habian cuidado de pacientes con enfermedad respiratoria grave en el Lejano Oriente. Muchos de estos casos pudieron ser rastreados a traves de multiples cadenas de transmision hasta un trabajador sanitario de la provincia de Guangdong que visito Hong Kong, donde fue hospitalizado con neumonia y fallecio. A finales de Abril de 2003, se informo de miles de casos de SARS y cientos de muertes relacionadas con SARS a la OMS desde mas de 25 paises del mundo. La mayoria de estos casos se produjeron despues de la exposicion a pacientes con SARS en entornos domesticos o sanitarios. Esta descripcion proporciona un metodo para evitar y/o tratar el SARS.

0007 Otra alarma epidemica actual en Asia es el virus de la gripe aviar (H5N1). La gripe aviar es una enfermedad infecciosa de las aves causada por cepas de tipo A del virus de la gripe. Hay 15 subtipos de virus de la gripe aviar; H5N1 es especialmente preocupante porque muta rapidamente infectando no solo a animales, sino tambien a humanos. El recuento confirmado de muertes humanas por gripe aviar, a 4 de Febrero de 2004, se situo en trece. Laboratorios de la red mundial de gripe de la OMS han estado trabajando para controlar el virus y evitar mas muertes humanas. Sin embargo, para comprender plenamente la magnitud de H5N1 y sus formas de distribucion, es necesario realizar ensayos mas meticulosos. Ademas, los medicamentos antivirales solo son eficaces en el tratamiento o la prevencion de cepas del virus aviar A contra aquellos que tienen una salud aceptable. Ver http://www.who.int/csr/don/ 2004 01 15/en, 15 de Enero de 2004.

0008 Los investigadores de St. Jude y otros laboratorios principales de gripe estan en una carrera para crear un prototipo de vacuna humana contra el H5N1. Esperan que pueden estar listas vacunas prototipo en tan solo tres semanas. No obstante, hasta que se cree una vacuna, los cientificos estan preocupados de que el virus H5N1 puede convertirse en una supergripe humana. Ver The Wall Street Journal, Scientists Rush to Create Vaccine for Bird Flu - Just in Case, 28 de Enero de 2004.

0009 Esta revelacion describe un interferon recombinante super-compuesto, como se definio anteriormente, metodo para producir el mismo y usos del mismo. En particular, el interferon super-compuesto aqui revelado es capaz de inhibir, evitar y/o tratar los virus de la hepatitis, virus del SARS, o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidas por virus, y el virus de la gripe aviar.

RESUMEN DE LA INVENCI�N

0010 Esta invencion proporciona un metodo para inhibir, evitar o tratar enfermedades virales o tumores en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del interferon super-compuesto obtenible por un proceso que comprende introducir en E. coli la secuencia de polinucleotido que se muestra en la Fig. 1.

0011 Esta invencion proporciona el metodo descrito anteriormente en donde el interferon super-compuesto es administrado oralmente a traves de inyeccion en vena, inyeccion muscular, inyeccion peritoneal, inyeccion subcutanea, administracion nasal o mucosal, o por inhalacion a traves de un inspirador.

0012 Esta invencion proporciona el metodo para evitar o tratar enfermedades virales en el que las enfermedades virales es hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, otros tipos de hepatitis, infecciones de virus causadas por virus de Epstein-Barr, Citomegalovirus, virus de herpes simple, u otros tipos de virus del herpes, papovavirus, poxvirus, picornavirus, adenovirus, rinovirus, virus I de leucemia de celulas T humanas I, o virus II de leucemia de celulas T humanas, o virus III de leucemia de celulas T humanas.

0013 Esta invencion proporciona un metodo para actividades anti-hepatitis. Puede inhibir la replicacion del ADN-VHB, la produccion de HBsAg y HBeAg.

0014 Esta invencion proporciona un metodo para evitar o tratar enfermedades de infeccion del tracto respiratorio superior.

0015 Esta invencion proporciona un metodo para evitar o tratar tumores o canceres en el que el tumor es cancer de piel, carcinoma de celulas basales y melanoma maligno, carcinoma de celulas renales, cancer de higado, cancer de tiroides, cancer rinofaringeo, carcinoma solido, cancer de prostata, cancer de estomago/abdominal, cancer de esofago, cancer de recto, cancer de pancreas, cancer de mama, cancer de ovario, y cancer superficial de vejiga, hemangioma, carcinoma epidermoide, cancer cervical, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de pulmon de celulas pequenas, glioma, leucocitemia, leucocitemia aguda y leucocitemia cronica, leucemia mielocitica cronica, leucemia de celulas pilosas, linfadenoma, mieloma multiple, policitemia vera, o sarcoma de Kaposi.

0016 Esta invencion proporciona un metodo para evitar o tratar el sindrome respiratorio agudo severo (SARS) o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidas por virus en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de interferon recombinante super-compuesto como se define anteriormente.

0017 El interferon super-compuesto puede ser administrado por via oral, a traves de inyeccion en vena, inyeccion muscular, inyeccion peritoneal, inyeccion subcutanea, administracion nasal o mucosal, o por inhalacion a traves de un inspirador.

0018 Esta invencion proporciona un metodo para inhibir el agente causante del Sindrome Respiratorio Agudo Severo, o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidas por virus, que comprende poner en contacto el agente con una cantidad eficaz del interferon super-compuesto.

0019 Esta invencion tambien proporciona un metodo para inhibir el virus del Sindrome Respiratorio Agudo Severo, las celulas infectadas por el virus del Sindrome Respiratorio Agudo Severo, o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidas por virus, que comprende poner en contacto una cantidad eficaz del interferon super-compuesto con dicho virus o celulas. Este contacto puede ser directo o indirecto.

0020 Esta invencion proporciona una composicion que comprende una cantidad eficaz del interferon super compuesto capaz de inhibir, evitar o tratar el virus del Sindrome Respiratorio Agudo Severo, las celulas infectadas por el virus del Sindrome Respiratorio Agudo Severo, o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidas por virus, y un portador adecuado.

0021 Esta invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del interferon super-compuesto recombinante como se ha definido anteriormente capaz de inhibir, evitar o tratar el Sindrome Respiratorio Agudo Severo, las celulas infectadas por el virus del Sindrome Respiratorio Agudo Severo, o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidas por virus en un sujeto, y un portador farmaceuticamente aceptable.

0022 Es un objeto adicional de la invencion un polinucleotido aislado que tiene la secuencia que se muestra en la Fig. 1.

0023 Es un objeto adicional de la invencion, el interferon recombinante como se define anteriormente para uso medico.

0024 Es un objeto adicional de la invencion el uso del interferon recombinante como se define anteriormente para la fabricacion de un medicamento.

DESCRIPCI�N DETALLADA DE LAS FIGURAS

Figura 1. Secuencia ADNc rSIFN-co disenada de acuerdo con el uso de codon de E. Coli y la secuencia de aminoacidos rSIFN-co deducida Figura 2. La secuencia de otro interferon super-compuesto Figura 3. Diagrama de vector plasmido de clonacion de Plac T7 Figura 4. Diagrama de vector plasmido de expresion de pH-4 Figura 5. Proceso de construccion de plasmido de expresion pHY-5 Figura 6-A. Espectro de Dicroismo Circular de Infergen� (Ensayado por el Centro de Medicion y Analisis de la Universidad de Sichuan) Rango de espectro: 250nm - 190nm Sensibilidad: 2 mO/cm Trayectoria de haz luminoso: 0.20 cm Equipo: Dicroismo Circular J-500C

Muestras: contiene 30lg/ml IFN-con 1, 5.9 mg/ml de NaCI y 3.8 mg/ml de Na2PO4, pH7.0. Infergen� (interferon alfacon-1) hecho por Amgen Inc., tambien conocido como interferon de consenso, se comercializa para el tratamiento de adultos con infecciones de virus de hepatitis C cronica (VHC). Es actualmente el unico interferon aprobado por la FDA, bio-optimizado, desarrollado a traves de diseno racional de farmacos y el unico interferon con datos en la etiqueta especificamente para pacientes que no responden o refractarios. El equipo de ventas de InterMune relanzo Infergen� en Enero de 2002 con una campana activa para educar a los hepatologos de Estados Unidos sobre el uso seguro y apropiado de Infergen�, que representa una nueva esperanza para mas del 50 por ciento de pacientes con VHC que fracasaron con otras terapias actualmente disponibles. Ver http://www.intermune.com/p/ITMN/Infergen, 8/27/2003

Figura 6-B. Espectro de Dicroismo Circular de Infergen� De Referencia [Journal of Interferon and Cytokine

Research. 16:489-499(1996)] Espectros de dicroismo circular de subformas de interferon de consenso. El interferon de consenso se fracciono utilizando una columna de intercambio de aniones. Las muestras se dializaron en fosfato de sodio 10mM, pH 7,4. Las mediciones se realizaron en espectropolarimetro Jasco J-170, en un termostato de celulas a 15�C. (--------), forma acilada; (--) forma terminal cis; (CCC), forma terminal met. A. Lejos del espectro UV. B. cerca del espectro UV.

Figura 6-C. Espectro de Dicroismo Circular de rSIFN-co Rango de espectro: 320nm - 250nm Sensibilidad: 2 m�/cm Trayectoria de haz luminoso: 2 cm Equipo: Dicroismo Circular J-500C Muestras: contiene 0.5mg/ml rSIFN-co, 5.9 mg/ml de NaCI y 3.8 mg/ml de Na2PO4, pH7.0. Figura 6-D. Espectro de Dicroismo Circular de rSIFN-co Rango de espectro: 250nm - 190nm Sensibilidad: 2 m�/cm Trayectoria de haz luminoso: 0.20 cm Equipo: Dicroismo Circular J-500C Muestras: contiene 30lg/ml rSIFN-co, 5.9 mg/ml de NaCI y 3.8 mg/ml de Na2PO4, pH7.0.

Claramente, como se evidencia por los espectros anteriores, la estructura secundaria o incluso terciaria de rSIFN-co es diferente de Infergen�. Figura 7A-C. Interferon recombinante super-compuesto en Aerosol Altura: 90 mm Anchura: 25mm (abajo), 6mm (arriba) Peso: 9g

Volumen de entrega: 0.1 ml Figura 7D. El Interferon Super Compuesto Recombinante en Aerosol. Cuando se usa el aerosol por primera vez, quite la tapa y descargue en el aire varias veces hasta que se expulse algo de liquido. No es necesario probar el aerosol para usos posteriores. Para su uso, siga las ilustraciones que se muestran en la figura, es decir: (1) Prerociar y (2) Presionar hacia abajo la boquilla para liberar el medicamento.

Figura 8. Comparacion de efectos de inhibicion de diferentes Interferones sobre la expresion del gen HBV Figura 9A-1. Curvas de cambios de la temperatura corporal en el Grupo A (5 pacientes) Esta figura es el registro de los cambios de temperatura corporal de 5 pacientes en el Grupo A. Figura 9A-2. Curvas de cambios de la temperatura corporal en el Grupo A (6 pacientes) Esta figura es el registro de los cambios de temperatura corporal de los otros 6 pacientes en el Grupo A. Figura 9B-1. Curvas de cambios de la temperatura corporal en el grupo B (5 pacientes) Esta figura es el registro de los cambios de temperatura corporal de 5 pacientes en el Grupo B. Figura 9B-2. Curvas de cambios de la temperatura corporal en el grupo B (5 pacientes) Esta figura es el registro de los cambios de temperatura corporal de los otros 5 pacientes en el Grupo B. Figura 10. rsIFN-co Cristal I Figura 11. rsIFN-co Cristal II Figura 12. La difraccion de rayos X de rsIFN-co Cristal DESCRIPCI�N DETALLADA DE LA INVENCI�N

0026 Esta invencion proporciona un metodo para producir un interferon super compuesto recombinante con configuracion espacial cambiada y actividad antiviral mejorada que comprende las etapas de:

(a)

Introducir la molecula de acido nucleico como se muestra en la Fig. 1 que codifica para dicho interferon con codones preferidos para la expresion a un huesped E. coli; y

(b)

Colocar el huesped introducido en condiciones que permitan la expresion de dicho interferon.

0027 Esta invencion proporciona el metodo para la produccion de interferon, que comprende ademas la recuperacion del interferon expresado.

0028 Esta invencion proporciona un interferon recombinante super-compuesto como se ha descrito anteriormente con configuracion espacial cambiada. Esta invencion revela que proteinas con la misma secuencia primaria pueden tener diferentes actividades biologicas. Como se ilustra en el siguiente ejemplo, esta invencion revela dos proteinas con secuencias de aminoacidos identicas pero con diferentes actividades. La eficacia de esta actividad puede a veces ser mejorada y, a veces, la proteina con configuracion espacial cambiada revelaria una nueva funcion.

0029 Tambien se describen equivalentes o mimicos del interferon recombinante como se describe anteriormente.

0030 Un equivalente es una molecula que es similar en funcion al compuesto interferon. Un equivalente podria ser una delecion, sustitucion, o mutante de sustitucion de la secuencia original. Mimicos podrian ser un peptido, polipeptido o una entidad quimica pequena.

0031 El interferon aqui descrito incluye pero no se limita a interferon a, �, o w. En una realizacion, es IFN-1a, IFN-2b u otros mutantes.

0032 En una realizacion, el interferon super-compuesto revelado tiene una mayor eficacia que el interferon descrito en las patentes US 4,695,623 o 4,897,471. Se cree que este interferon super-compuesto tiene estructura secundaria

o terciaria unica. (Ver, p. ej. Figura 6.)

0033 El super compuesto interferon descrito aqui tiene cambio(s) de estructura espacial como resultado de los cambios de su proceso de produccion.

0034 El interferon super-compuesto descrito anteriormente puede ser producido por un sistema de expresion de alta eficiencia que utiliza un promotor especial. En una realizacion, el promotor es PBAD. Como puede facilmente apreciarse por otros artesanos expertos ordinarios. Otros promotores inducibles, tales como promotores de choque termico o promotores inducibles de metales pesados, pueden ser utilizados en esta invencion.

0035 El interferon super-compuesto tambien puede ser producido con su gen como ADNc artificialmente sintetizado con ajuste de su secuencia desde el tipo salvaje de acuerdo a la preferencia de codones de E. Coli. Discusion amplia de dicho uso de codones (preferencia) se puede encontrar en la patente US 4,695,623. Ver, por ejemplo columna 6, linea 41-columna 7, linea 35.

0036 El interferon super-compuesto descrito anteriormente posee actividad anti-viral o anti-tumoral, y, por lo tanto, es util en la inhibicion, presentacion y tratamiento de enfermedades virales, tumores o canceres.

0037 Como aqui se usa, enfermedades virales incluyen, pero no se limitan a, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, otros tipos de hepatitis, infecciones causadas por virus de Epstein-Barr, Citomegalovirus, virus del herpes simplex, otros virus del herpes, papovavirus, poxvirus, picornavirus, adenovirus, rinovirus, virus I de leucemia de celulas T humanas, virus II de leucemia de celulas T humanas, o virus III de leucemia de celulas T humanas.

0038 Infeccion respiratoria viral, nombres alternativos resfriado comun, resfriados. Esta es una infeccion viral contagiosa del tracto respiratorio superior que se caracteriza por la inflamacion de las membranas mucosas, estornudos y dolor de garganta. Generalmente es causada por mas de 200 virus diferentes, conocidos como rinovirus. Los resfriados no son causados por los mismos virus responsables de la gripe. Los resfriados se propagan a traves de gotitas de la tos o los estornudos de otras personas con un resfriado o por contacto de las manos con objetos contaminados por una persona resfriada. La incidencia de los resfriados es mas alta entre los ninos, y la incidencia disminuye con la edad porque tras la enfermedad ocurre inmunidad al virus que causa el resfriado. Gradualmente, se desarrolla en adultos inmunidad a una amplia variedad de virus que causan los resfriados. Los ninos pueden tener 10 resfriados al ano, y los adultos pueden tener 3 resfriados al ano.

0039 Los Centros para Control y Prevencion de Enfermedades de E.E.U.U. han estimado que la incidencia media anual de infecciones del tracto respiratorio superior (URIs) en los Estados Unidos es de 429 millones de episodios, resultando en mas de $ 2.5 mil millones en costos sanitarios directos e indirectos.

0040 El resfriado comun es mas frecuentemente causado por uno de varios cientos de rinovirus (52%), pero los coronavirus (8%) o el virus sincitial respiratorio (7%) tambien pueden dar lugar a infeccion. Otros virus, como la gripe (6%), parainfluenza y adenovirus, pueden producir sintomas respiratorios, pero estos se asocian a menudo con neumonia, fiebre o escalofrios.

0041 Los resfriados se producen en un patron estacional que suele comenzar a mediados de Septiembre y concluye a finales de Abril hasta principios de Mayo. El resfriado comun es muy contagioso y se puede transmitir por contacto de persona a persona o por gotitas aerotransportadas. Los sintomas del tracto respiratorio superior comienzan generalmente 1 a 2 dias tras la exposicion y generalmente duran 1 o 2 semanas, aunque la diseminacion del virus y el contagio pueden continuar durante 2 a 3 semanas mas. Pueden persistir sintomas con aparicion de complicaciones como sinusitis o afectacion del tracto respiratorio inferior, como bronquitis o neumonia.

0042 El resfriado comun tiene una variedad de sintomas evidentes, incluyendo malestar general, congestion nasal, rinorrea, tos no productiva, dolor de garganta leve, y, en algunos casos, algo de fiebre. Debido a la similitud de los sintomas, un resfriado puede ser confundido con rinitis alergica perenne, pero por lo general pueden descartarse las alergias debido a las diferencias en cronicidad.

0043 Si un paciente se presenta con un URI viral, el espectro de remedios es extenso. Dado que la mayoria de estas infecciones son autolimitantes, los medicos suelen recomendar reposo y liquidos, pero otros tratamientos incluyen terapias ambientales y nutricionales, descongestionantes de venta libre y de receta y productos antihistaminicos, nuevas formulaciones nasales antihistaminicas y anticolinergicas, y antibioticos. La Tabla 1 enumera medicaciones comunmente utilizadas para la tos y el resfriado y sus efectos secundarios.

Tabla 1. Un perfil de medicaciones habituales en la tos comun y el resfriado y sus efectos secundarios

Medicaci�n

Prop�sito Efectos secundarios y consideraciones especiales

Agonistas beta2 en aerosol (por ejemplo, albuterol)

Revertir broncoespasmo postinflamatorio Aumenta el ritmo cardiaco y puede causar temblores

Productos de combinacion de liquidos a base de alcohol

Tratar sintomas multiples Potencial somnolencia y problemas de coordinacion

Agonistas Alfa1 (oral) (por ejemplo, pseudoefedrina, fenilpropanolamina)

Descongestion Puede causar taquicardia, nerviosismo, estimulacion transitoria, mareos, somnolencia, elevacion de la presion arterial

Compuestos anticolinergicos: Bromuro de ipratropio (topico)

Secar Puede causar sequedad nasal y epistaxis ocasional

Otros anticolinergicos (por ejemplo, metescopolamina, atropina, hiosciamina)

Secar Puede causar ortostasis, disfuncion de la regulacion termica, sequedad de boca, estrenimiento

Antihistaminicos (oral) (por ejemplo, clorfeniramina, difenhidramina)

Secar Somnolencia, sequedad de boca, hipertension ortostatica

Capsulas de benzonatato

Supresion de la tos, anestesia local Masticar puede entumecer la boca; puede causar sedacion, mareos

Codeina, hidrocodona

Supresion de la tos Somnolencia, estrenimiento, nauseas

Dextrometorfano

Supresion de la tos Posible somnolencia, pero efectos secundarios poco frecuentes

Guaifenesina

Promueve la expectoracion (mucolisis) No tiene efectos secundarios, debe ser tomada con mucha agua para mejorar la eficacia

Descongestionantes topicos (por ejemplo, oximetazolina, fenilefrina)

Descongestion Ardor local, el uso prolongado puede causar dependencia

Pastillas de Zinc y vitamina C

Posible reduccion en la gravedad y duracion del sintoma Posible alteracion del gusto, aumento de calculos de oxalato si es susceptible

Resumen de

http://www.physsportsmed.com/issues/1998/02feb/swain.htm

5 El uso del interfer�n s�per-compuesto para evitar o tratar URI

0044 Casi el 70-80% de URI son causadas por virus tales como el virus respiratorio Sincitial, adenovirus, rinovirus, virus de coxsackie, coronavirus y su variante, virus de gripe A y su variante, virus de gripe B y su variante, virus de parainfluenza y su variante, o enterovirus y su variante. Una causa principal de URI en el adulto es del rinovirus. Para los ninos, el virus sincitial respiratorio y el virus parainfluenza son dos de las principales causas de URI.

10 0045 El interferon super-compuesto juega un papel importante en la lucha contra el virus que causa URI. El interferon super-compuesto obtiene sus efectos anti-virus principalmente por dos mecanismos:

1.

Fijar a la superficie de celulas sensibles e inducirlas a producir la proteina anti-virus, luego bloquear la duplicacion y reproduccion de los virus in vivo.

2.

El interferon super-compuesto puede ajustar la respuesta inmune, incluyendo respuesta inmune de

15 celulas T, actividad de celulas NK, funcion de fagocitosis de monocarion, e incluso formacion de algunos anticuerpos in vivo.

0046 En el tratamiento de URI, el interferon super-compuesto puede aplicarse directamente en la zona afectada a traves de una inspiracion de aerosol. Este metodo de tratamiento permite al interferon llegar a las celulas diana directamente. En consecuencia, comercializar el suministro como aerosol, en lugar de via oral o inyeccion, seria mas seguro y eficaz para administrar el interferon.

5 Uso del interfer�n s�per-compuesto para evitar o tratar el SARS

0047 Con el consentimiento del grupo de trabajo de Sichuan en la prevenci�n y control del SARS, la distribucion del super compuesto interferon se inicio en mayo de 2003. El aerosol de interferon super-compuesto fue distribuido a medicos y enfermeras en hospitales, zonas pobladas con un alto riesgo de SARS, y al grupo de investigaci�n Nacional sobre prevenci�n y control de SARS. Entre los 3.000 usuarios al 19 de Diciembre de 2003, no hubo

10 informes de efectos secundarios relacionados con el uso del aerosol. Por otra parte, ninguno de los medicos y enfermeras, la gente de la provincia de Sichuan, u otras organizaciones que han usado el aerosol de interferon super-compuesto ha sido infectado por el SARS.

0048 Por lo tanto, esta invencion proporciona un metodo para inhibir, evitar o tratar la replicacion del virus o celulas infectadas por el virus poniendo en contacto dicho virus o celulas infectadas con una cantidad eficaz del interferon

15 super-compuesto definido anteriormente.

0049 Este interferon super-compuesto es util en la inhibicion, prevencion o tratamiento de los siguientes canceres o tumores:

Cancer

Cancer de Piel Carcinoma basocelular

Melanoma maligno

Carcinoma de celulas renales

Cancer de higado

Cancer de tiroides

Cancer rinofaringeo

Carcinoma solido

Cancer de prostata

Cancer de estomago/abdominal

Cancer de esofago

Cancer rectal

Cancer de pancreas

Cancer de mama

Cancer de ovario y cancer de vejiga superficial

Hemangioma

Carcinoma epidermoide

Cancer de cuello uterino

Cancer de pulmon de celulas no pequenas

Cancer de pulmon de celulas pequenas

Glioma

Enfermedad de Hemal maligno

Leucocitemia Leucocitemia aguda

Leucocitemia Cronica

Leucemia mieloide cronica

Leucemia de celulas pilosas

Linfadenoma

Mieloma multiple

Policitemia Vera

Otros

Sarcoma de Kaposi

0050 Paciente #1. Una paciente con cancer de ovario comenzo a recibir inyecciones. Ella recibio inyecciones de 15lg el 14 de Julio, 16 de Julio, 18 de Julio, 20 de Julio y 22 de Julio. El 14 de Julio, se observo 2000ml de liquido peritoneal. La paciente se sometio a quimioterapia el 22 de Julio. El 3 de Agosto, se abrio el peritoneo de la paciente. Se esperaba encontrar 2l de liquido, pero solo se observo 200ml de liquido. Los ovarios derecho e izquierdo y los nodos linfaticos eran cancerosos. Todos los demas organos estaban limpios.

0051 Paciente #2. Un paciente con cancer de rinon fue tratado de la siguiente manera. En un periodo de medio mes, el paciente recibio 3 inyecciones de 9 lg de rSIFN-co y 3 inyecciones de 15 lg de rSIFN-co. En un mes completo despues de estas inyecciones, recibio inyecciones de 9 lg y 15 lg de rSIFN-co cada dos dias. Una biopsia renal no mostro metastasis despues de este curso de tratamiento. El paciente mostro una recuperacion completa. Cada medio ano despues de la recuperacion, el paciente recibio inyecciones de 15 lg de rSIFN-co 15 veces durante un periodo de un mes.

0052 En consecuencia, esta invencion proporciona un metodo para inhibir el crecimiento de tumor o celula cancerosa por contacto con el interferon super-compuesto como se ha definido anteriormente con dichas celulas tumorales o cancerosas.

0053 En una realizacion adicional, el interferon super-compuesto inhibe la duplicacion del ADN y la secrecion de HBsAg y HBeAg del virus de la Hepatitis B.

0054 Esta invencion tambien proporciona codigos de genes artificiales para el interferon super-compuesto. Esta dentro de la experiencia ordinaria para disenar un gen artificial. Muchos metodos para generar secuencia de nucleotidos y otras tecnicas de biologia molecular se han descrito anteriormente. Ver por ejemplo, Joseph Sambrook y David W. Russell, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Diciembre de 2000, publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press.

0055 Esta invencion proporciona un vector que comprende la secuencia de polinucleotido mostrada en la Fig. 1 que codifica para el interferon super-compuesto como se define anteriormente.

0056 Esta invencion proporciona un sistema de expresion que comprende el vector como se define anteriormente. Las celulas incluyen, pero no se limitan a, celulas procariotas o eucariotas.

0057 Esta invencion tambien proporciona una celula huesped que comprende el vector como se define anteriormente.

0058 Esta invencion proporciona un proceso para la produccion de interferon super-compuesto recombinante como se define anteriormente, que comprende introducir la secuencia de polinucleotido mostrada en la Fig. 1 con preferencia de codon seleccionado en huesped E. Coli, cultivar dicho huesped introducido en una condicion apropiada para la expresion de dicho interferon compuesto y cosechar el interferon compuesto expresado.

0059 El proceso puede comprender la extraccion del interferon super-compuesto del caldo de fermentacion, recoleccion de cuerpos de inclusion, desnaturalizacion y renaturalizacion de la proteina cosechada.

0060 El proceso puede mantener la alta eficacia incluso cuando el interferon super-compuesto es usado con un agente y en una concentracion particular. El proceso tambien comprende separacion y purificacion del supercompuesto interferon. El proceso comprende ademas la liofilizacion del interferon super-compuesto purificado. El proceso comprende produccion de inyeccion de liquido del super-compuesto interferon.

0061 Esta invencion tambien proporciona el interferon super-compuesto producido por los procesos anteriores.

0062 Esta invencion proporciona una composicion que comprende el interferon recombinante super-compuesto como se define anteriormente y un portador adecuado.

0063 Esta invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el interferon super-compuesto recombinante como se define anteriormente y un portador farmaceuticamente aceptable.

0064 Esta invencion proporciona un metodo para tratar o evitar enfermedades virales o tumores en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del interferon super-compuesto como se define anteriormente.

0065 Esta invencion proporciona el metodo descrito anteriormente en el que las enfermedades virales incluyen, pero no se limitan a, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, otros tipos de hepatitis, infecciones de virus causadas por el virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, virus del herpes simple, u otro tipo de virus de herpes, papovavirus, poxvirus, picornavirus, adenovirus, rinovirus, virus I de leucemia de celulas T humanas, o virus II de leucemia de celulas T humanas, o virus III de leucemia de celulas T humanas.

0066 Esta invencion proporciona el metodo descrito anteriormente en donde se administro interferon supercompuesto por via oral, por inyeccion en vena, inyeccion muscular, inyeccion peritoneal, inyeccion subcutanea, administracion nasal o mucosal, o por inhalacion mediante un inspirador.

0067 Esta invencion proporciona el metodo descrito anteriormente en donde el interferon super-compuesto se administro siguiendo el protocolo de inyecciones de 9lg o 15 lg cada dos dias, 3 veces por semana, durante 24 semanas.

0068 Fue sorprendente descubrir que rSIFN-co, cuya estructura espacial se ha cambiado, no es solo una preparacion para inhibir la duplicacion de ADN de la hepatitis B, sino que inhibe la secrecion de HBsAg y HBeAg en celulas 2.2.15.

0069 Un objetivo de esta invencion es ofrecer una preparacion de rSIFN-co para inhibir directamente la duplicacion del ADN de virus de hepatitis B y la secrecion de HBeAg y HBsAg de la hepatitis B y disminuirlas a niveles normales.

0070 En una realizacion, se produjo rSIFN-CO con tecnicas recombinantes. En la condicion de secuencia fija de aminoacidos, el ADN IFN fue redisenado de acuerdo con el uso de codones E. Coli. y luego el gen rSIFN-co fue sintetizado artificialmente. ADNc rSIFN-CO fue clonado en el vector de alta expresion de E. Coli. por tecnicas de recombinacion de ADN, y se logro una alta expresion de rSIFN-co usando mecanismo de induccion/activacion de Larabinosa para activar la transcripcion del promotor PBAD.

0071 En comparacion con la termo-induccion usual, sistemas de induccion de pH e induccion de IPTG de ingenieria genetica, el sistema de induccion/activacion de arabinosa tiene algunas ventajas: (1) Sistemas comunes liberan la funcion promotora mediante la creacion de un patron de "desrepresion". Luego los promotores inducen expresion genica aguas abajo. El cambio de temperatura y pH y la adicion de IPTG no pueden activar promotores directamente. En el sistema aqui revelado, L-arabinosa no solo desactiva y reprime sino tambien activa la transcripcion del promotor PBAD que induce una alta expresion de rSIFN-co. Por lo tanto, el sistema de induccion/activacion de arabinosa es un sistema de expresion mas eficaz. (2) La relacion entre exogeno y dosis de L-arabinosa es lineal. Esto significa que la concentracion de arabinosa se puede cambiar para ajustar el nivel de expresion del gen exogeno. Por lo tanto, es mas facil controlar el nivel de expresion del gen exogeno en E. Coli. por arabinosa que por cambios de temperatura y valor de pH. Esta caracteristica es significativa para la formacion de cuerpos de inclusion. (3) L-arabinosa es capaz, barata y segura, que, por el contrario, son las desventajas de otros inductores tales como IPTG.

0072 Esta realizacion crea una cepa de ingenieria de E. Coli. que expresa rSIFN-co eficaz y resistente con un sistema de induccion/activacion de L-arabinosa. La cepa se cultiva y fermenta en condiciones adecuadas para cosechar los organismos bacterianos. Los cuerpos de inclusion se purifican despues de destruir bacterias y lavar repetidamente. El resultado final, la masa de alta pureza de proteina rSIFN-co de configuracion espacial cambiada para esta invencion y para tratamiento clinico, se obtuvo de la desnaturalizacion y renaturalizacion de cuerpos de inclusion y de una serie de etapas de purificacion.

0073 Las siguientes son algunas preparacionesde rSIFN-co: comprimidos, capsulas, liquidos para consumo oral, pastas, inyecciones, aerosoles, supositorios, y soluciones. Se recomiendan inyecciones. Es comun inyectar el medicamento por via subcutanea o por vena. El portador del medicamento podria ser cualquier portador de medicamento aceptable, incluyendo carbohidratos, cellulosum, adhesivo, colapso, emoliente, relleno, agente de adicion de disolvente, amortizacion, conservante, agente espesante, adaptador, etc.

0074 Esta invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende la composicion anterior y un portador farmaceuticamente aceptable.

0075 Para los fines de esta invencion, "portadores farmaceuticamente aceptables" se refiere a cualquiera de los portadores farmaceuticos convencionales. Ejemplos de portadores adecuados son bien conocidos en la materia y pueden incluir, pero no se limitan a, cualquiera de los portadores farmaceuticos estandar, tales como una solucion salina tamponada con fosfato y diversos agentes humectantes. Otros portadores pueden incluir aditivos utilizados en comprimidos, granulos, capsulas, etc. Normalmente, tales portadores contienen excipientes tales como almidon, leche, azucar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, acido estearico o sales del mismo, estearato de calcio o magnesio, talco, grasas o aceites vegetales, goma, glicoles u otros excipientes conocidos. Tales portadores tambien pueden incluir aditivos de sabor y color u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden tales portadores se formulan por metodos convencionales bien conocidos.

0076 Esta invencion proporciona un metodo para evitar o tratar el Sindrome Respiratorio Agudo Grave, o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidas por virus, de un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de interferon recombinante super-compuesto como se define anteriormente.

0077 En una realizacion del metodo anterior, el interferon es a, �, o w.

0078 El interferon super-compuesto como se ha definido anteriormente puede ser administrado por via oral, por inyeccion en vena, inyeccion muscular, inyeccion peritoneal, inyeccion subcutanea, administracion nasal o mucosal, o, por inhalacion via un inspirador.

0079 En una realizacion, el interferon es suministrado por un dispositivo de aerosol.

0080 En una realizacion especifica, el dispositivo se describe en la Figura 7.

0081 En una de las realizaciones, el interferon se liofiliza.

0082 Esta invencion proporciona un metodo para inhibir el agente causante del Sindrome Respiratorio Agudo Severo, o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidos por virus, que comprende poner en contacto el agente con una cantidad eficaz del interferon super compuesto como se ha definido anteriormente.

0083 Se determina que el agente causante del SARS es un virus. Vease, por ejemplo. Rota et al (2003), Characterization of a Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome. Science 1085952 www.sciencexpress.org and Marra, et al. (2003), The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus. Science 1085853 www.sciencexpress.org.

0084 Esta invencion tambien proporciona un metodo para inhibir el virus del Sindrome Respiratorio Agudo Severo o celulas infectadas por el virus del Sindrome Respiratorio Agudo Severo, o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidas por virus o celulas infectadas con virus capaces de inducir enfermedades del tracto respiratorio superior, que comprende poner en contacto una cantidad eficaz del interferon super-compuesto como se define anteriormente, con dicho virus o celula. Este contacto puede ser directo o indirecto.

0085 Esta invencion proporciona una composicion que comprende una cantidad eficaz del interferon supercompuesto como se ha definido anteriormente capaz de inhibir el virus del Sindrome Respiratorio Agudo Severo o celulas infectadas por el virus del Sindrome Respiratorio Agudo Severo, o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidas por virus o celulas infectadas con virus capaces de inducir enfermedades del tracto respiratorio superior, y un portador adecuado.

0086 Esta invencion proporciona una composicion que comprende una cantidad eficaz del interferon supercompuesto como se ha definido anteriormente capaz de evitar o tratar el Sindrome Respiratorio Agudo Severo, o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidas por virus, de un sujeto y un portador adecuado.

0087 Esta invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del super compuesto interferon recombinante como se ha definido anteriormente capaz de inhibir el virus del Sindrome Respiratorio Agudo Severo o celulas infectadas por el virus del Sindrome Respiratorio Agudo Severo, o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidas por virus, y un portador farmaceuticamente aceptable.

0088 Esta invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del interferon recombinante super-compuesto como se define anteriormente capaz de evitar o tratar el Sindrome Respiratorio Agudo Severo, o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidas por virus, en un sujeto y un portador farmaceuticamente aceptable.

0089 Esta invencion proporciona un dispositivo para suministrar la composicion farmaceutica descrita anteriormente.

0090 En una realizacion preferida, el sujeto es un humano. Como facilmente se puede apreciar, el interferon supercompuesto como se ha definido anteriormente se puede utilizar en otros animales o mamiferos.

0091 Esta invencion proporciona un metodo para evitar el Sindrome Respiratorio Agudo Severo o enfermedades del tracto respiratorio superior inducidas por virus, en humanos que comprende la aplicacion del interferon supercompuesto como se ha definido anteriormente tres veces al dia via un aerosol que contiene veinte microgramos de interferon, igual a diez millones de unidades de actividad en tres mililitros.

0092 Esta invencion se entendera mejor a partir de los ejemplos que siguen. Sin embargo, un experto en la materia apreciara facilmente que los metodos especificos y los resultados discutidos son meramente ilustrativos de la invencion como se describe mas completamente en las reivindicaciones que siguen posteriormente.

DETALLES EXPERIMENTALES

EJEMPLO 1

0093 rSIFN-co es una nueva molecula de interferon construida de acuerdo a aminoacidos conservadores en el subtipo IFN-a humano utilizando metodos de ingenieria genetica. Se ha demostrado que rSIFN-co tiene actividad IFN de amplio espectro, tal como alta actividad antivirus y de inhibicion de tumores, especialmente para tratar eficazmente la hepatitis C.

0094 El codon de E. coli. se utilizo para redisenar el ADNc de rSIFN-co y luego sintetizar artificialmente el ADNc de rSIFN-co de secuencias publicadas de ADN de rSIFN-co y secuencias de aminoacidos deducidas (Figura 1).

0095 Con el fin de conseguir proteina-rSIFN co pura, se clono ADN de rSIFN-co en el vector de alta expresion de E. Coli., y se utilizo L-arabinosa, que puede activar el promotor fuerte PBAD en vectores, para inducir alta expresion del gen rSIFN-co.

S�ntesis de la secuencia de ADN de E. Coli Redise�o de la secuencia de ADN de rSIFN-co

0096 ADNc de rSIFN-co se rediseno de acuerdo con el uso de codones de E. Coli. para conseguir una alta expresion en E. Coli. La secuencia deducida de aminoacidos de la secuencia redisenada de ADNc de rSIFN-co es 5 completamente coincidente con la secuencia de aminoacidos primitiva del rSIFN-co publicado (Figura 1).

S�ntesis de la secuencia de ADNc de rSIFN-co S�ntesis semi-molecular del ADNc de rSIFN-co del extremo 5' y extremo 3'.

0097 Dos semi-moleculares pueden ser sintetizados directamente: ADNc de rSIFN-co 280pb extremo 5' (fragmento I) y 268bp extremo 3' (fragmento II) por PCR. Hay superposicion de 41bp entre fragmento II y fragmento I. 10 (1) fragmento oligodeoxinucleotido de sintesis quimica: 0098 Oligomero A:

Oligomero B:

Oligomero C:

Oligomero D:

Oligomero E:

Oligomero F: 0099 PCR I para el Fragmento I: oligodesoxinucleotido B como plantilla, oligodesoxinucleotido A y C como cebadores, 280 pb de Fragmento I sintetizados.

0100 Mezcla PCR I: (unidades: ll)

Agua destilada esterilizada Tampon 10xPfu (Stratagen American Ltd.) Mezcla dNTP (concentracion de dNTP 2.5 mmol/L) Cebador de Oligomero A (25 lmol/L) Cebador de Oligomero C (25 lmol/L) Plantilla de Oligomero B (1 lmol/L) Pfu ADN Polimerasa (Stratagen American Ltd.)

39 5 2 1 1 1 1

Volumen total

50ll

PCR, ciclo : 95 I 2m�(95�C45s�65�C1m�72�C1m)x25 ciclo�72�C10m�4�C

0101 PCR II para el Fragmento II: oligodesoxinucleotido E como plantilla, oligodesoxinucleotido D y F como cebadores, 268 pb sintetizados de Fragmento II.

Mezcla PCR II: (unidades: ll)

Agua destilada esterilizada Tampon 10xPfu (Stratagen American Ltd.) Mezcla dNTP (concentracion de dNTP 2.5 mmol/L) Cebador de Oligomero A (25 lmol/L) Cebador de Oligomero C (25 lmol/L) Plantilla de Oligomero B (1 lmol/L) Pfu ADN Polimerasa (Stratagen American Ltd.)

39 5 2 1 1 1 1

Volumen total

50ll

Ciclo PCR: el mismo que PCR I

Montaje del ADNc de rSIFN-co

0102 Fragmento I y II fueron montados juntos para obtener la secuencia molecular completa del ADNc de rSIFN-co utilizando el metodo de superposicion y extension de PCR. Enzimas de restriccion Nde I y Pst I se introdujeron para clonar la secuencia de ADNc de rSIFN-co en el plasmido. 15 (1) Cebadores de sintesis quimica 0103 Oligomero G: 5'ATCGGCCATATGTGCGACCTGCCGCAGACCC3' Oligomero H: 5'ACTGCCAGGCTGCAGTTATTCTTTACGACGCAGACGTTCC3'

(2) Superposicion y extension de PCR

0104 Mezcla PCR: (unidades: ll)

Agua destilada esterilizada 38 Tampon 10XPfu (Stratagen American Ltd.) 5 Mezcla dNTP (concentracion dNTP 2.5 mmol/L) 2 Cebador G (25 lmol/L) 1 Cebador H (25 lmol/L) 1 *produccion fragmento I (1 lmol/L) 1 *produccion fragmento II (1 lmol/L) 1 Pfu ADN Polimerasa (Stratagen American Ltd.) (2.5U/lL) 1

Volumen total 50ll

*separar y purificar la produccion PCR con el kit de purificacion de PCR StratePrep producido por Stratagen American Ltd. Y disolver en agua destilada esterilizada. Ciclo PCR: el mismo que PCR I

5 An�lisis de clonaci�n y secuencia del gen rSIFN-co

0105 El plasmido pLac T7 como vector de clonacion. El plasmido pLac T7 se reconstruye con pBluescript II KS(+) plasmido producido por Stratagen (Figura 3).

0106 La produccion de PCR purificado de ADNc de rSIFN-co con el kit de purificacion de PCR StrataPrep. Digerir ADNc y plasmido pLac T7 con Ndel y Pstl. Ejecutar electroforesis en gel de agarosa 1% y separar estos fragmentos

10 de ADN de doble digestion. Recuperar fragmento de ADN de rSIFN-co 507bp de longitud y el fragmento de ADN plasmido de 2.9kb. Ligar estos fragmentos mediante ADN ligasa T4 para formar un plasmido recombinante. Transformar las celulas competentes DH5a (Gibco) con el plasmido recombinante, cultivar a 37�C durante la noche. Identificar la colonia recombinante positiva, llamado pHY-1.

0107 Ejecutar la secuenciacion de ADN con el Kit De Secuenciacion De Ciclo SequiTherm™ producido por

15 American Epicentre Technologies Ltd utilizando L1-COR Model 4000L. Los cebadores son cebador de secuencia comun T7 y T3, el resultado de la secuenciacion de ADN coincide con el diseno teorico.

0108 Purificar el rSIFN-co, secuenciar los aminoacidos N-terminal, la secuencia de aminoacidos N-terminal coincide con el diseno experimental que es como sigue:

Construcci�n, transformaci�n, identificaci�n, y estabilidad hereditaria del vector de expresi�n

Construcci�n y transformaci�n de vector de expresi�n

0109 El vector de expresion E. Coli. digerido PHY-4 (ver la Figura 3) con Nde I para linealizar y posteriormente digerir con Xba I. Ejecutar al electroforesis en gel de agarosa 1%, y purificar el fragmento de digestion 4.8 kb PHY-4

25 Nde I-Xba I con el kit QIAEX II producido por QIAGEN Germany Ltd.

0110 Al mismo tiempo, el plasmido pHY-4 es doblemente digerido con Nde I-Xba I. Ejecutar electroforesis en gel de agarosa 1% y purificar el fragmento de 715bp. Ligar los fragmentos de rSIFN-co y pHY-4 con ADN ligasa T4 para construir el plasmido recombinante (Ver Figura 4). Transformar las celulas competentes DH5a con el plasmido recombinante. Extender las celulas transformadas sobre placa LB con Amp, cultivar a 37�C durante la noche.

Cribado de cepa de clonaci�n positiva

0111 Las colonias E. Coli. se eligen al azar de arriba de la placa LB, se criba las cepas positivas que contienen el vector recombinante por digestion con endonucleasas y analisis de PCR. Se nombra uno de los plasmidos recombinantes positivos pHY-5, y se nombra la cepa que contiene plasmido pHY-5 PVIII. Se amplifica y almacena la cepa positiva con glicerol a -80�C.

Alta Expresi�n del gen rSIFN-co en E. Coli.

0112 En el plasmido pHY-5, el gen rSIFN-co esta bajo el control del promotor fuerte PBAD. Este promotor esta regulado positiva y negativamente por el producto del gen araC. AraC es un regulador transcripcional que forma un complejo con arabinosa. En ausencia de arabinosa, el dimero AraC se enlaza a O2 y I1, formando un bucle de 210pb. Esta conformacion conduce a una inhibicion completa de la transcripcion. En presencia de arabinosa, el dimero se libera de O2 y se une a I1 e I2 conduciendo a la transcripcion. El enlace de arabinosa desactiva, reprime, e incluso activa la transcripcion del promotor PBAD, que estimula PBAD, induciendo alta expresion de rSIFN-co. El nivel de expresion de rSIFN-co en PVIII es mas de 50% del total de proteina E. Coli.

Resumen

0113 RSIFN-CO es una nueva molecula de interferon construida artificialmente de acuerdo con el aminoacido conservador de interferones a humanos. Se ha demostrado como un farmaco eficaz contra la hepatitis. Con el fin de obtener suficiente proteina rSIFN-co pura, se construyo una cepa E. Coli. recombinante estable que expresa altamente la proteina rSIFN-co.

0114 Primero, de acuerdo con la secuencia de aminoacidos de rSIFN-co publicada, se uso el codon E. Coli. para sintetizar todo el ADNc de rSIFN-co. Este fragmento de ADN fue secuenciado, probando que la secuencia de 501bp de codon y la secuencia de codon de terminacion TAA son validas e identicas al diseno teocratico. El analisis subsiguiente revelo que la secuencia de aminoacidos N-terminal y de aminoacidos compuesta de rSIFN-co producida por la cepa recombinante eran ambas identicas a la prediccion.

0115 El ADNc de rSIFN-co fue clonado en el plasmido pHY-4 del vector de alta expresion de E. coli. para construir el plasmido recombinante pHY-5. La cepa E. coli. LMG194 fue de nuevo transformada con plasmido pHY-4 para obtener el transformante de alta expresion rSIFN-co estable. Este transformante se cultivo durante 30 generaciones. La herencia de plasmido recombinante pHY-5 en E. Coli. LMG194 fue normal y estable, y la expresion de rSIFN-co fue alta y constante.

0116 E. Coli. LMG194, que contiene plasmido pHY-5 recombinante, es de hecho una ideal cepa de ingenieria de alta expresion.

Referencias

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Guzman, L. M et al: Tight regulation, modulation, and high-level express-ion by vectors containing the arabinose

SECUENCIA DE ADNc DE rSIFN-co DISE�ADA SEG�N EL USO DEL CODON E.COLI. Y SECUENCIA DEDUCIDA DE AMINOACIDO DE rSIFN-co

5 0118

EJEMPLO 2 Separaci�n y purificaci�n de rSIFN-co

1. Fermentacion

0119 Se inocula la cepa recombinante en medio LB, agitando (200 rpm) a 37�C durante la noche (aproximadamente 18 horas), luego anadir 30% de glicerol al caldo de fermentacion para obtener una concentracion final de 15%, asignado a un tubo de 1 ml y mantenido a -20�C como semilla para produccion.

0120 Anadir 1% de la semilla a medio LB, agitando (200 rpm) a 37�C durante la noche para ampliar la escala de la semilla, luego anadir a medio RM con una proporcion de 10%, cultivando bajo 37�C. Anadir arabinosa (solucion al 20%) al 0.02% como un inductor cuando la OD600 alcanza aproximadamente 2.0. 4 horas despues de ello, detener el proceso de cultivo, recoger las bacterias mediante centrifugacion, resuspender el pellet con tampon A, y mantener en -20�C durante la noche. Descongelar y romper las bacterias mediante homogeneizador, despues centrifugar. Lavar el pellet con tampon B, tampon C, y agua destilada para conseguir un cuerpo de inclusion relativamente puro.

2.

Desnaturalizacion y renaturalizacion

0121 Disolver el cuerpo de inclusion en Guanidina-HCl (o urea) de 6 mol/L. La solucion sera un poco nublada. Centrifugar a una velocidad de 10.000 rpm. Determinar la concentracion de proteina del sobrenadante. Este sobrenadante se llama "solucion de desnaturalizacion." Anadir la solucion de desnaturalizacion al tampon de renaturalizacion, y mantener la concentracion final de proteina a 0.3 mg/ml. Es mejor anadir la solucion totalmente desnaturalizada en tres pasos en lugar de un solo paso. Mantener la solucion durante la noche a 4�C. Despues, dializar 10 mol/L, 5 mol/L de tampon PB y agua destilada, y luego ajustar su pH por 2 mol/L HAc-NaAc. Dejar reposar y luego filtrar.

3.

Purificacion 0122 POROS HS/M cromatografia de intercambio de aniones:

Columna equivalente con 20 mmol/L de HAC-NaAc (pH 5.0) Cargar muestras a una velocidad de 30 ml/min Lavar con 20 CV 20 mmol/L de HAc-NaAc(pH 5.0) 5 CV de 0.15 mol/L de NaCl 20 mmol/L HAc-NaAc (pH 5.0) de lavado 3 CV de 0.18 mol/L de NaCl+20 mmol/L HAc-NaAc(pH 5.0) de lavado

0.25 mol/L de NaCl + 20 mmol/L de HAC-NaAc (pH 5.0) eluir proteina diana

0123 Quelante de Sefarosa™ de flujo rapido: Anadir tampon PB de 0.2 mol/L (pH 6.6) y NaCl de 4 mol/L en la solucion de HS para ajustar pH de solucion a pH 6.0 y la concentracion de NaCl a 1 mol/L.

Columna con tampon D

Cargando a una velocidad de 1 ml/min

Lavar con tampon E

Lavar con tampon F

Eluir con tampon G

0124 Condensar la solucion eluida por POROS HS/M. A veces se puede anadir una etapa de purificacion por Sephacryl S-100 para cumplir con los requisitos de pureza mas estrictos. Nota: 0125

Tampon A: 100 mmol/l de Tris-HCl,pH 7.5-10 mmol/L de EDTA-100 mmol/L de NaCl Tampon B: 50 mmol/L de Tris-HCl,pH 7.5-1 mol/L de urea-10 mmol/L de EDTA-0.5% de Triton X-100 Tampon C: 50 mmol/L de Tris-HCl,pH 7.5-2 mol/L de urea-10 mmol/L de EDTA-0.5% de Triton X-100 Tampon D: 1 mol/L de NaCl --- 50 mmol/L de Na2HPO4 (pH 5.5) Tampon E: 1 mol/L de NaCl --- 50 mmol/L de Na2HPO4 (pH 5.0) Tampon F: 1 mol/L de NaCl ---50 mmol/L de Na2HPO4 (pH 4.0) Tampon G: 1 mol/L de NaCl --- 50 mmol/L de Na2HPO4 (pH 3.6)

Tampon de renaturalizacion: 0.5 mol/L de Arginina-150 mmol/L de Tris-HCl, pH 7.5 a 0.2 mmol/L de EDTA

Medio LB: 1L

0126 Triptona 10 g Extractos de levadura 5 g

NaCl

10 g

Medio RM: 1L

0127

Caseina

20 g

MgCl 1 mmol/L (0.203 g)

Na2HPO4

4g;

KH2PO4

3 g,

NaCl

0.5 g

NH4Cl

1 g

0128 Despues de la purificacion, el tampon se cambio a PBS (pH 7.0) junto con la etapa de condensacion por POROS HS/M. Esto se conoce como la "Solucion Madre de Proteina". Se puede utilizar directamente en la preparacion de inyecciones o aerosoles, o almacenado a 2-8�C.

Formula para inyeccion: 5 0129

Solucion Polvo liofilizado

Solucion de-rSIFN-co 34.5 lg/ml 34.5 lg/ml

PB (pH 7.0) 25 mmol/L 10 mmol/L

Glicina --- ---- -- 0.4 mol/L

10 NaCl 0.1 mol/L ---- ------Para aerosol: 0130 EDTA 0.01% Tween 80 0.05%

15 Citrato trisodico 10mmol/L Glicerol 1.26% Cloruro de sodio 0.03% Fenilmetanol 0.5% HSA 0.1%

20 rSIFN-co 10 mg/ml

PROCESO DE CONTROL DE CALIDAD

0131 Durante la purificacion, se llevan a cabo ensayos para contenido de proteina, pureza de proteina, actividad especifica y pirogeno despues de cada paso. Cuando se obtiene la solucion madre, todos los ensayos listados en la tabla se realizan uno despues de otro.

25 0132 La calidad del producto se controla de acuerdo a "Requisitos Chinos para Biologicos."

1. Solucion de proteina original Lowry 0133

Art�culo de Ensayo

M�todo

Soluci�n Madre de Prote�na

Ensayo de Contenido de Proteina

Lowry

Ensayo de Pureza de la Proteina

Analisis SDS-PAGE no reductor (electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio) Analisis HPLC

Ensayo de Pesos Moleculares

SDS-PAGE reductor

Ensayo de Actividad Especifica

Segun metodo en "Ensayo de Actividad Especifica" de Interferon

Ensayo de ADN Exogeno Sobrante

Utilizando un kit de deteccion y etiquetado de ADN

Ensayo de Actividad de Antibioticos Sobrantes

Segun el metodo en "Metodos Quimicos y otras Pruebas para Biologicos"

Ensayo de Endotoxina Bacteriana

Segun el metodo en "Requerimientos para ensayo de endotoxina bacteriana de biologicos"

Ensayo de Punto Isoelectronico

Electroforesis de focalizacion Isoelectrica

Ensayo para Identificar Caracteristicas de la Proteina

Espectro UV (rango de longitud de onda: 190380nm)

Mapeo de Peptidos (hidrolizado por enzima pancreatica, analizado por columna C-18)

Ensayo de secuencia N-terminal

Ensayo de secuencia C-terminal

Dicroismo Circular

Analisis de aminoacidos

Producto Semi-acabado

Ensayo de Endotoxina Bacteriana

Segun el metodo en "Requerimientos para la prueba de endotoxina bacteriana de biologicos"

Producto

Control de Apariencia

Quimica

Segun metodo en "Metodos Quimicos y Otras Pruebas para Biologicos"

Ensayo de Actividad Especifica

Segun metodo en "Prueba de Actividad Especifica del Interferon"

Ensayo de Esterilidad

Segun metodo en "c"

Ensayo de Toxicidad Anormal

Ensayo en Raton

Ensayo de Pirogenos

Segun metodo en "Requerimientos para la prueba de pirogenos de biologicos"

Ensayo de Estabilidad del Producto

Nota: "Metodos de Ensayo Quimicos y Otras para Biologicos", "Requerimientos para nsayo de pirogenos de biologicos" y "Requerimientos para ensayo de endotoxina bacteriana de biologicos" todos se pueden encontrar en "Requerimientos Chinos para Biologicos." "Requerimientos Chinos para Biologicos", PAN Zhengan, ZHANG Xinhui, DUAN Zhibing, et al. Comite Chino de Normalizacion de Biologicos. Publicado por Chemical Industry Publishing Company, 2000.

EJEMPLO 3 Estabilidad de Polvo Liofilizado de la Inyecci�n de Interferon S�per-Compuesto Recombinante

0134 Los experimentos de estabilidad se llevaron a cabo con muestras de polvo liofilizado de inyeccion de interferon super-compuesto recombinante (rSIFN-CO) en dos especificaciones y tres lotes. Los experimentos comenzaron en Abril de 2000.

1. Fuente de Muestra

0135 Las muestras fueron administradas por Sichuan Huiyang Life-engineering Ltd., Provincia de Sichuan. Lot: 990101-03, 990101-05, 990102-03, 990102-05, 990103-03, 990103-05

2. Especificaciones de la Muestra

0136 Cada muestra en este experimento debe cumplir con los requisitos de la siguiente tabla. Tabla 1 Estandar de muestras en el Experimento

Elementos

Estandares

1. Apariencia

polvo suelto blanco

2. Tiempo de disolucion

disolver rapidamente en agua de inyeccion (dentro de 2min) a temperatura ambiente

3. Claridad

liquido incoloro o con poco resplandor lechoso; no debe ser turbio, con impureza o con deposito indiscernible

4. Valor pH

7.5׽6.5

5. Potencia (IU/dosis)

IU)6IU, 15lg: 7.5 3 106150% de cantidad indicada (9lg:4.5 3 10׽80%

6. Humedad

No mas de 3.0% (P/P)

3. Contenido Experimental

0137 Muestras de ensayo a 2-8�C: Las muestras de ensayo se pusieron en un refrigerador a 2-8�C, luego los

10 elementos anteriores de estas muestras se ensayaron respectivamente en el mes 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30, 36. Se registraron los resultados.

0138 Muestras de ensayo a 25�C: Las muestras de ensayo se pusieron en un termostato a 25�C, luego los elementos anteriores de estas muestras se ensayaron respectivamente en el en el mes 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30. Se registraron los resultados.

15 0139 Muestras de ensayo a 37�C: Las muestras de ensayo se pusieron en un termostato a 37�C, luego los elementos anteriores de estas muestras se ensayaron respectivamente en el mes 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24. Se registraron los resultados.

4. Resultados y Conclusi�n

20 1) A 37�C, segun los datos recogidos en los puntos designados durante el ensayo y comparados con los datos antes del ensayo, la potencia comenzo a descender a partir del 6� mes y los cambios en los tres lotes fueron similares. La apariencia de otros elementos no tenia cambios.

2) A 25�C, segun los datos recogidos en los puntos designados durante el ensayo y comparados con los datos antes del ensayo, la potencia solo tuvo un pequeno cambio, y los cambios en los tres lotes fueron similares. 25 La apariencia de otros elementos no tenia cambios.

3) A 25�C, segun los datos recogidos en los puntos designados durante el ensayo y comparados con los datos antes del ensayo, las potencias de los tres lotes fueron todas estables. La apariencia de otros elementos tampoco no tuvo cambios.

0141 En conclusion, se sugiere que el polvo liofilizado de interferon super-compuesto recombinante para inyeccion

30 debe ser mejor almacenado y transportado a temperaturas bajas. Sin estas condiciones, el producto tambien puede ser almacenado durante periodos cortos (es decir, 3 meses) a temperatura ambiente.

EJEMPLO 3.5 Diagrama de Flujo de Producci�n de rSIFN-co

1. Produccion

1.1 Fermentacion

Usar mezcla de LB+M9 como medio de cultivo. La cantidad de inoculo sera 1.5%. Agitar a OD600=0.4 (unas 3.5 horas) a 32�C, luego elevar la temperatura a 42�C. Continuar la agitacion otras 6 horas, la expresion de rSIFN-co alcanzara el maximo nivel. El examen bajo el escaneo del gel resultante de SDS-PAGE muestra que el nivel de expresion es de hasta 57%, que es el mas alto estandar en China.

1.2 Purificacion Centrifugar la solucion de bacterias para recoger el pellet bacteriano

Lavar con solucion salina fisiologica dos (2) veces

Agregar tampon (50mM de Tris-HCl, 1mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1-2 M urea), sonicacion para romper las celulas bacterianas durante 20-30 minutos

Precipitar la solucion tampon y lavar unas pocas veces hasta que el color se convierte en blanco puro

Usar 7M guanidina HCl para desnaturalizar

Diluir la Guanidina HCl para renaturalizar, dejar durante la noche

Usar Sefadex G25 para desalar

Usar 0.1 M de NaCl para aplicar Sefarosa-CM

Hacer elucion escalonada para recoger el pico activo

Despues de desalado el pico activo, aplicar a columna HPLC cargada positivamente

Usar 0.1 M de NaCl para hacer elucion paso a paso, recoger el pico activo que es el producto de rSIFN-co

Agregar un portador de proteccion y agente liofilizante

Separar los materiales liofilizados (rSIFN-co)

La pureza del producto (rSIFN-CO) a partir de este procedimiento de produccion es hasta 95% bajo la prueba de SDS-PAGE donde el peso molecular es de 14.5 kDa. La HPLC de fase inversa muestra un solo pico y la pureza es de hasta 97%. Su actividad especifica es de hasta 1x109 UI/mg de proteina.

1.3

Envasado e Inspeccion

Despues de la purificacion por HPLC, se agregan 2% de albumina de suero humano, 1% de sacarosa y 1% de glucosa a la rSIFN-co. A continuacion se separa y se liofiliza en la muestra de inyeccion. Cuando se ensayo bajo el sistema de inspeccion Wish-VVS, el resultado fue 4.5x108 IU. Cuando se ensayo con inspeccion aseptica e inspeccion de pirogeno bajo el requisito estandar de China, los resultados fueron negativos. Este resultado cumple los requisitos para la inyeccion IV.

2.

Control de Calidad

2.1 Caracteristicas biologicas

(1)

Al utilizar LB + M9 para cultivar bacterias, las caracteristicas deben coincidir con las caracteristicas tipicas de la bacteria E-coli. No se detectaron otras bacterias.

(2)

Cuando se froto para la tincion de Gram e inspecciono bajo un microscopio, es bacteria negativa.

(3)

La reaccion a los antibioticos es la misma que las bacterias originales.

(4)

La inspeccion por microscopi electronico muestra caracteristicas tipicas de la bacteria E-coli. No se detecto micoplasma, esporas de virus u otros microcontaminantes.

(5)

El ensayo de reaccion bioquimica muestra las caracteristicas de bacteria E-coli.

2.2 Control de calidad de la expresion de interferon

(1)

La expresion de interferon (cultivado en una plataforma de agitacion) coincide con la cantidad de expresion en bacterias de entrada originales.

(2)

Cuando se ensaya con suero anti-interferon, se muestra una reaccion.

(3)

inspeccion de plasmido: La digestion de restriccion coincidio con el plasmido inicial.

2.3 Producto de cepa bacteriana

El producto de cepa bacteriana denota el especimen de la cepa de la bacteria original que fue producido a partir de los procedimientos que se muestran en 1.2.

El producto de cepa bacteriana debe ser inspeccionado como sigue para asegurarse de que no hay derivacion: Usar LB para colocar en placa 2-3 piezas y cultivar. Separar y tomar 5-10 grupos de bacterias para el ensayo de expresion de interferon. Repetir el ensayo al menos dos (2) veces. Utilizar unicamente el que muestra el mayor % para ser el producto de cepa bacteriana.

2.4 Inoculo

El inoculo denota el producto de cepa bacteriana elegida despues de la fermentacion. La cantidad, el tiempo de cultivo y el valor de OD mas adecuado de inoculo pueden decidirse segun la cepa bacteriana. Un procedimiento de bacterias anti-contaminadas debe aplicarse para cualquier inoculo que se produjera.

2.5 Crecimiento de la cepa bacteriana

El crecimiento de la cepa bacteriana se haria en un ambiente de sala Libre de Bacterias en donde no mas de una bacteria esta creciendo en la misma sala. El mismo medio de cultivo sera usado tanto para la cepa bacteriana como para el inoculo. El usado en rSIFN-co es LB.

2.6 Fermentacion

(1)

La fermentacion se lleva a cabo solo en una sala de fermentacion limpia con un unico entorno de fermentacion de bacterias.

(2)

La limpieza del recipiente de fermentacion y el tubo se realiza dos veces, antes y despues de la insercion del medio de cultivo. Luego, el recipiente se debe congelar para alcanzar la temperatura apropiada para el inoculo.

(3)

Evitar el uso de antibioticos que pueden afectar al crecimiento celular en el medio de cultivo.

(4)

Parametros de la fermentacion tales como temperatura, valor de pH, oxigeno disuelto y tiempo requerido se podrian variar de acuerdo con diferentes tipos de cepas bacterianas.

2.7 Recoleccion de bacterias

(1)

Centrifugar la solucion bacteriana para recoger las bacterias o usar otro metodo. Todos los aparatos deben limpiarse antes y despues de la operacion. La solucion de desecho debe ser drenada despues del procedimiento de limpieza.

(2)

Las bacterias deben mantenerse a 4-8�C si se van a dividir dentro de las 24 horas. De lo contrario, deben mantenerse a -30�C. Las que se mantienen bajo tales condiciones se pueden usar dentro de 6 meses.

2.8 Lisis celular de bacterias

(1) Usar solucion tampon apropiada para equilibrar la cepa bacteriana. La lisis celular se puede hacer por metodos fisicos, quimicos o biologicos. Usar centrifugadora para precipitar las bacterias y aplicar soluciones de limpieza.

2) Si se utiliza el metodo quimico para dividir celulas, no se deben utilizar soluciones nocivas para los seres humanos.

2.9 Purificacion

(1)

La purificacion se deshara de la mayor parte de los contenidos sin interferon. En el proceso de purificacion, no debe encontrarse material toxico alguno si se anaden elementos adicionales.

(2)

Si se usa cromatografia de afinidad de anticuerpos para la purificacion, deberia haber una indicacion de la fuente y el grado de pureza. Tambien, se debe realizar inspeccion de IgG de menor calidad.

(3)

Durante el proceso de purificacion, la depuracion de pirogenos es critica. Todos los aparatos deben ser evaluados para eliminar esta interferencia.

(4)

El interferon altamente concentrado se conoce como "producto intermedio". Tras la inspeccion y ensayos, agregar albumina para elevar la concentracion al 2%, lo que ahora se conoce como "producto intermedio de albumina". Despues del examen y ensayos, debe mantenerse a -30�C y nunca descongelarse antes de su uso. Este producto debe ser utilizado dentro de los 6 meses.

(5)

La albumina que se utiliza en este proceso tambien debe cumplir ensayos y requisitos tales como: negatividad bajo inspeccion RBSAG y una indicacion de la proporcion entre monomero, dimero y polimero.

2.10 Produccion en producto de tubo

(1)

Filtracion: Usar membrana de 0.22 l para filtrar las bacterias. El producto debe ser manipulado, con tecnicas asepticas. Las muestras deben ser tomadas para ensayar el valor del interferon.

(2)

Dilucion: Diluir el producto intermedio de albumina con un 2% de diluyente. No se debe anadir conservante. El producto se puede liofilizar despues de la inspeccion aseptica y la inspeccion de pirogenos.

2.11 Liofilizacion

La liofilizacion no deberia afectar a la actividad del interferon, y el contenido de agua de dicho liofilizado se mantendra

2.12 Inspeccion

Hay dos tipos de rSIFN-co hechas. Uno es para inyeccion y el otro para uso topico. Las especificaciones de los dos son diferentes. Hay productos intermedios y productos finales para cada tipo. En el tipo de inyeccion, los productos intermedios incluyen interferon purificado, producto intermedio de albumina y producto intermedio de albumina libre de bacterias. El producto final a partir del tipo de inyeccion denotara solo producto liofilizado. El producto intermedio en el tipo topico denota solo interferon purificado. El producto final a partir del tipo topico denota solo productos liofilizados formados de liquido envasados por separado.

2.13 Envasado Hay diferentes envases para el tipo de inyeccion y el tipo topico.

2.14 Almacenamiento El producto debe mantenerse a 4�C. La solucion de purificacion no debe almacenarse en estado congelado.

2.15 Expiracion

El periodo de expiracion es de dos (2) anos despues del procedimiento de liofilizacion para productos liofilizados. El periodo de expiracion es de 6 meses desde el envasado individual para los productos liquidos.

EJEMPLO 4

rSIFN-co inhibe la duplicaci�n de ADN-HBV y la secreci�n de HBsAg y HBeAg.

Materiales

0143 Disolvente y Metodo de dispensacion: Anadir 1ml de solucion salina en cada vial, disolver y mezclar con medio de cultivo MEM a diferentes concentraciones. Mezclar en el acto.

0144 Medicamentos de control: IFN-a2b (Intron A) como polvo liofilizado, adquirido de Schering Plough. Cada 3x106U, mezclar a 3x106IU/ml con medio de cultivo; Infergen� (solucion liquida), adquirido de Amgen, 9 lg, cada 0.3 ml, igual a 9X106IU, y mezclar con medio de cultivo 9X106IU/ml conservar a 4�C; celula 2.2.15: linea celular 2.2.15 de hepatoma (Hep G2) clonado y transfectado por ADN-HBV, construido por Mount Sinai Medical Center.

0145 Reactivo: Polvo MEM, Gibco American Ltd. suero sanguineo fetal de ganado, HycloneLab American Ltd. G-418 (Geneticina); dispensar MEM, Gibco American Ltd.; L-Glutamil, importado y envasado por JING KE Chemical Ltd.; caja de radioinmunoensayo en fase solida de HBsAg y HBeAg, Northward Reagent Institute of Chinese Isotope Ltd.; Biograncetina, Northern China Medicine; Y Lipofectina, Gibco American Ltd.

0146 Productos y equipos experimentales: frasco de cultivo, Denmark Tunclon™; placa de cultivo de 24 pocillos y 96 pocillos, Corning American Ltd.; caja de incubacion de Dioxido de Carbono, Shel-Lab American Ltd.; medio de cultivo MEM 100ml: 10% suero sanguineo fetal de ganado, 3% Glutamil 1%, 380lg/ml G418, biograncetina 50U/ml.

Metodo

0147 Cultivo celular 2.2.15: Anadir 0.25% de enzima pancreatica en la caja de cultivo con llenado de celula 2.2.15, digerir a 37�C durante 3 minutos, y anadir medio de cultivo para parar digestion y alterarlo para dispersar las celulas, reproducir con proporcion 1:3. Alcanzaran crecimiento total en 10 dias.

0148 Prueba de toxicidad: Establecer grupos de diferentes concentraciones y un grupo de control en el que no se ha actuado sobre las celulas con medicamento. Digerir las celulas, y dispensar a una solucion de 100.000 cel/ml. Inocular al tablero de cultivo de 96 pocillos, 200 ll cada pocillo, cultivar a 37�C durante 24 horas con 5% de CO2. Ensayar cuando crezca la capa simple de celulas.

0149 Dispensar rSIFN-co a 1,83107IU/ml de solucion, luego preparar una serie de soluciones diluidas en gradientes dobles. Anadir en placa de cultivo de 96 pocillos, 3 pocillos por concentracion. Cambiar la solucion cada 4 dias. Ensayar efecto citopatico por microscopio despues de 8 dias. Destruir completamente como 4, 75% como 3, 50% como 2, 25% como 1, cero como 0. Calcular tasa promedio de lesion celular y de inhibicion de diferentes concentraciones. Calcular TC50 y TC0 segun el metodo de Reed Muench.

A = log> 50% concentracion de medicamento, B = log <50% concentracion de medicamento, C = log potencia de dilucion

0150 Ensayo de inhibicion de HBeAg y HBsAg: Separar en grupos de contraste positivos y negativos de HBeAg y HBsAg, grupo de contraste de celulas y grupos de concentracion de medicamento. Inocular 700.000 celulas/ml de celulas 2.2.15 en placa de cultivo de 6 pocillos, 3 ml cada pocillo, cultivar a 37�C durante 24 horas con 5% de CO2, luego preparar 5 soluciones diluidas en gradiente con 3 veces el grado (Preparar 5 soluciones, cada una con una concentracion de proteina diferente. La concentracion de la Solucion 2 es 3 veces menor que la de la Solucion 1, la concentracion de la Solucion 3 es 3 veces menor que la de la Solucion 2, etc.) 4.5X106IU/ml, 1.5X106IU/ml, 0.5X106IU/ml, 0.17X106IU/ml, y 0.056X106IU/ml, 1 pocillo por concentracion, cultivar a 37�C durante 24 horas con 5% de CO2. Cambiar las soluciones cada 4 dias usando la misma solucion. Recoger todo el medio de cultivo en el octavo dia. Conservar a -20�C. Repetir el ensayo 3 veces para estimar HBsAg y HBeAg con caja de radioinmunoensayo en fase solida (Northward Reagent Institute of Chinese isotope Ltd.). Estimar el valor cpm de cada pocillo con una maquina de recuento y-.

0151 Calculo de Efectos: Calcular el valor medio de cpm de los grupos de contraste y los grupos de diferente concentracion y su desviacion estandar, valor de P/N como tasa de inhibicion, IC50 y SI.

1)

Tasa de inhibicion de antigeno (%) = ୅ି୆ x 100

୅

A = cpm de grupo control; B = cpm de grupo de ensayo;

2) Contar la concentracion de eficiencia mitad del medicamento

IC50 de inhibicion de antigeno = Antilog (B + ହ଴ି୆ x C)

୅ି୆

A=log>50% concentracion de medicamento, B=log <50%concentracion de medicamento, C=log poder de dilucion

3) SI de efecto rSIFN-co de interespacio-conformacion cambiada en HBsAg y HBeAg en cultivo celular 2.2.15:

SI = = ୘େହ଴

୍େହ଴

4) Estimar las diferencias en cpm de cada grado de dilucion respecto al grupo de control mediante el ensayo t de Student

0152 Southern blot: (1) extracto de ADN-VHB en celula 2.2.15: Cultivar celulas 8 dias. Medio de cultivo exsuction (Separar celulas del medio de cultivo mediante drenaje del medio de cultivo.). Anadir tampon de lisis para romper las celulas, a continuacion, extraer 2 veces con una mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamilico (1:1:1), centrifugar a 10000 g. Recoger el sobrenadante anadiendo alcohol anhidro para depositar acido nucleico. Drenar al vacio, redisolver en tampon 20llTE. (2) Electroforesis: Anadir tampon de carga de 6XADN, electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, IV/cm, a presion fija durante 14-18h. (3) Desnaturalizacion e hibridacion: respectivamente sumergir gel en HCl, tampon de desnaturalizacion y tampon de neutralizacion. (4) Transmembrana: Hacer una transferencia ordenada de ADN a membrana Hybond-N. Secar al horno, hibridar y exponer con hibridacion dot blot. Escanear y analizar la densidad relativa con software gel-pro. Calcular la tasa de inhibicion y IC50.

Resultados

0153 Los resultados de las Tablas 4.1, 4.2 y 4.3 muestran: Despues de cultivar a exponente de concentracion maximo inocuo durante 8 dias con celula 2.2.15, la maxima es 9.0 � 0X106IU/ml tasa de inhibicion promedio de la concentracion maxima inocua de rSIFN-co para HBeAg es 46.0�5.25% (P<O. 001), IC50 es 4.54�1.32X106IU/ml, SI es 3.96; la tasa para HBsAg es 44.8� 6.6%, IC50 es 6.49�0.42X109IU/ml, SI es 2.77. Esto muestra que rSIFN-co puede inhibir significativamente la actividad de HBeAg y HBsAg, pero que el IFN del grupo de contraste y Infergen� no pueden. Tambien se ha demostrado clinicamente que rSIFN-co puede disminuir HBeAg y HBsAg o devolverlos a los niveles normales.

EJEMPLO 5

Preparaci�n de rSIFN-co

Preparacion de inyeccion liofilizada

Polvo liofilizado

0154

Solucion madre de rSIFN-co 34.5 lg/ml

PB (pH7.0)

10mmol/L

Glicina

0.4mol/L

0155 Tecnica de preparacion: Pesar los materiales segun la receta. Disolver con agua esteril y libre de pirogenos. Filtrar a traves de membrana de 0.22 lm para de-bacterializar, conservar a 6-10�C. Rellenar en viales despues de confirmar que son esteriles y sin pirogenos, 0.3 ml/vial o 0.5 ml/vial y liofilizar en liofilizador.

Preparacion de la inyeccion liquida

Solucion

Solucion madre de rSIFN-co 34.5 lg/ml

PB (pH7.0) 25mmol/L

NaCI 0.1mol/L

0157 Preparacion: Pesar los materiales segun la receta. Anadir hasta el nivel deseado con agua esteril y libre de pirogenos. Filtrar a traves de membrana de 0.22 lm para de-bacterializar, conservar a 6-10�C. Rellenar en frasco hermetico tras confirmar que es esteril y sin pirogeno a 0.3 ml/vial o 0.5 ml/vial. Almacenar a 2-10�C, y proteger de la luz.

EJEMPLO 6

Toxicidad aguda de rSIFN-co

0158 Tratar ratones con dosis grande (150lg/kg, igual a 1000 veces la dosis normal por kilo usada en tratamiento de pacientes adultos) de rSIFN-co en una vez mediante inyeccion intramuscular. Luego observar y registrar sus muertes y reacciones toxicas. Los resultados muestran que: 24 horas despues de la inyeccion, no se habia registrado reaccion anormal alguna. Los organos de los animales que habian sido seleccionados para ser sacrificados tampoco tenian signos de cambios anormales. Esos ratones restantes fueron mantenidos vivos y estaban normales despues de dos semanas. Los pesos de los ratones en el grupo experimental y en el grupo de control aumentaron todos, y la proporcion de aumento no mostro ninguna diferencia obvia entre los dos grupos (P> 0.05) de acuerdo a sus pesos en el dia catorce. No se observaron cambios anormales de los principales organos de los ratones despues de dos semanas.

1. Material experimental

1.1 Animales

0159 40 ratones adultos sanos, con un peso de 18-22g, mitad machos y mitad hembras, calificados por el centro de control animal experimental de Sichuan.

1.2

Medicamentos

0160 Solucion esterilizada rSIFN-co (Proporcionada por Sichuan Huiyang Life-engineering Ltd.) 0.15 mg/ml, Lote: 981201 rSIFN-co se administro i.m. en solucion salina.

2.

Metodo

0161 Separar los 40 ratones en dos grupos al azar, uno para medicina experimental, otro para control. Inyectar medicamentos o solucion salina en la misma proporcion (0.1 ml/10 g) por via muscular a cada raton segun el grupo al que pertenece. (150 lg/kg de rSIFN-co para el grupo experimental, y solucion salina para el grupo de control). Despues de la inyeccion, observar y registrar la toxicidad aguda mostrada en los ratones. Matar la mitad de los

ratones (mitad machos y mitad hembras) para comprobar si habia cambios patologicos anormales en sus principales organos, como corazon, bazo, higado, pulmon, rinon, glandula suprarrenal, estomago, duodeno, etc, despues de 24 horas. Los que quedan son conservados y observados hasta el dia catorce. Pesar todos los ratones, matarlos, y luego observar la apariencia de los organos antes mencionados para ver si hay alguna anormalidad. Tomar tejido patologico y examinarlo, utilizando el examen para evaluar la diferencia en aumentos de peso en los dos grupos.

3.

Resultados

0162 Los resultados muestran que no hubo toxicidad aguda vista despues de que todos los ratones fueron tratados con i.m. rSIFN-co con 150 lg/kg de una vez, igual a 1000 veces la dosis normal por kilo usada en tratamiento de pacientes adultos. En los 14 dias despues de la inyeccion, todos los ratones vivian bien. Comieron, bebieron, se ejercitaron, y excretaron con normalidad y mostraron condiciones de pelo normales. Ninguno de ellos murio. La observacion de los principales organos de los ratones seleccionados al azar no muestra cambios anormales 24 horas despues de la inyeccion. 14 dias despues de la inyeccion, los ratones restantes fueron sacrificados. Las autopsias tampoco mostraron cambios. Los pesos de los ratones en ambos grupos aumentaron todos, pero no se mostro diferencia obvia cuando se trato con metodo estadistico (p> 0.05). Ver Tabla 6.1:

4.

Conclusion

Tabla 6.1 Influencia en el peso de los ratones despues de la inyeccion de rSIFN-co

Grupo

Dosis Animal Pesos antes inyeccion de Pesos despues de inyeccion Valor incrementado pesos (g) de

Control

0 20 19.8 � 1.7 30.8 � 2.8 11.0 � 2.9

rSIFN-co

150 20 19.4 � 1.7 32.1 � 3.3 12.7 � 4.3

0163 Bajo las condiciones de este experimento, no hubo reacciones toxicas en ninguno de los ratones despues de la inyeccion de rSIFN-co con 150 lg/kg. Se puede llegar a la conclusion de que la dosis maxima tolerable de i.m. en ratones es de 150 lg /kg, que es igual a 1000 veces la dosis normal por kilo usada en el tratamiento de pacientes adultos.

EJEMPLO 7 Los efectos cl�nicos del s�per-compuesto interfer�n recombinante (rSIFN-co)

0164 El interferon super-compuesto recombinante (rSIFN-co) es una invencion para terapia de enfermedad viral, especialmente para hepatitis. Mientras tanto, puede inhibir la actividad de los virus de EB, VSV, virus de herpes simplex, cornaviruses, virus del sarampion, y otros. Usando el sistema de celulas WISH/VEV como ensayo para actividad anti-virus, los resultados mostraron que: el otro rIFN, era 0.9X108 UI/mg, Intron A era 2.0X108 UI/mg y rSIFN-co era 9X108 UI/mg. La actividad anti-viral de rSIFN-co es mucho mayor que las de los dos primeros.

0165 Bajo el permiso de la Administracion de Alimentos y Medicamentos (SFDA), Republica Popular de China, los ensayos clinicos han tenido lugar en el Hospital de China Occidental, la Universidad de Sichuan, el Segundo Hospital de la Universidad Medica de Chongqing, el Primer Hospital de la Facultad de Medicina, Universidad de Zhejiang desde Febrero de 2003. El tratamiento clinico que se centra en la hepatitis B se lleva a cabo bajo la guia del ensayo aleatorio doble ciego multicentrico. IFN-a1b se utilizo como control, y los resultados primarios mostraron lo siguiente:

El efecto de rSIFN-co comparado con IFN-α1b en el tratamiento de hepatitis B cr�nica activa

1. Est�ndar de selecci�n de pacientes: Estandares 1-4 son efectivos para ambos tratamientos con rSIFN-co (9lg) y IFN-a1b (5MU, 50lg), y estandar 1-5 son para tratamiento rSIFN-co (15lg). 1) Edad: 18-65 2) Ensayo HBsAg positivo durante los ultimos seis meses, ensayo HBeAg positivo, ensayo PCR, copias de ADN de VHB � 105/ml

3) ALT � dos veces el valor normal 4) Nunca recibido tratamiento IFN; o recibido tratamiento Lamividine pero fracasado o recidivante

5) Una vez recibido otro tratamiento de IFNs (3MU o 5MU) hace seis meses siguiendo el estandar de SFDA, pero fracasado o recidivante

2. Evaluaci�n de los efectos:

En referencia a las recomendaciones del Decimo Comite Nacional de China de Virus de Hepatitis y Hepatopatias, 5 los efectos fueron divididos en tres grados de acuerdo con los ensayos ADN-VHB y HBeAg, nivel ALT. Respuesta: nivel ALT normal, ADN-HBV negativa, HBeAg negativa Respuesta parcial: nivel ALT normal, ADN-HBV o HBeAg negativa Sin respuesta: ALT, ADN-HBV y HBeAg no alterado Los grupos de respuesta y respuesta parcial se consideraron casos eficaces.

10 3. Resultados de ensayo cl�nico:

Grupo A: tratamiento con rSIFN-co (9lg) Grupo B: tratamiento con IFN-a1b (5MU, 50lg)

Periodo

Grupo Medicamento Casos Tasa efectiva Transferencia de HBsAg a tasa negativa Transferencia de HBeAg a tasa negativa Transferen-cia de ADN-HBV a tasa negativa Tasa de recuperacion de la funcion Heptal

Semana

A rSIFN-co (9lg) 32 46.88 (15) 9.38 (3) 28.12 (9) 37.50 (12) 84.38 (27)

8-12

B IFN-a1b (5MU, 50lg) 32 21.88 (7) 0.00 (0) 9.38 (3) 15.62 (5) 56.25 (18)

Semana 16-24

A rSIFN-co (lg) 64 54.69 (35) 7.81 (5) 25.00 (16) 34.38 (22) 90.62 (58)

B

IFN-a1b (5MU, 50lg) 64 25.00 (16) 0.00 (0) 9.38 (6) 18.75 (12) 78.13 (50)

15 En el Grupo C, los casos fueron tratamiento previo de hepatitis B cronica activa con otros IFNs (3MU o 5MU) que fracasaron o recidivaron y fueron tratados luego con rSIFN-co (15 lg), inyeccion subcutanea, cada dia, durante 24 semanas. Los casos totales fueron 13. Despues de 12 semanas de tratamiento, 7 de 13 (53.85%) fueron eficaces. 3 de 13 (23.08%) HBeAg transferido a negativo, 7 de 13 (53.85%) DNA-HBV transferido a negativo, 11 de 13 (84.62%) las funciones heptales recuperaron la normalidad.

20 4. Los efectos secundarios de rSIFN-co comparado con IFN-α1b en el tratamiento

Los efectos secundarios de IFN incluyen fiebre, nauseas, mialgia, anorexia, perdida de pelo, leucopenia y trombocitopenia, etc. La dosis maxima de IFN-a1b es 5MIU por vez; la dosis de rutina es 3 MIU. Cuando se tomo la dosis habitual, 90% de los pacientes tienen efectos secundarios grado I-II (estandar OMS). Tuvieron fiebre inferior a 38�C, nauseas, mialgia, anorexia, etc. Cuando se tomo en dosis maxima, la tasa de efectos secundarios no se elevo 25 obviamente, pero fueron mas graves. La dosis maxima de rSIFNco es 24 lg, inyeccion subcutanea, cada dia durante 3 meses. La dosis rutinaria es 9 lg. Cuando se utilizaron dosis de rutina, menos de 50% de pacientes tenian efectos secundarios grado I-II (estandar OMS), como fiebre inferior a 38�C, nauseas, mialgias, anorexia, leucopenia y trombocitopenia leve. Con dosis maxima, alrededor de 50% de pacientes sufrieron leucopenia y trombocitopenia despues de usar rSIFN-co un mes, pero esos efectos secundarios desaparecieron despues de suspender el

30 tratamiento durante una semana. Es seguro para uso continuado.

Las observaciones de rSIFN-co tratando hepatitis C

1. Est�ndar de selecci�n de pacientes

1) Edad: 18-65

2) Anticuerpo HCV positivo

3) ALT �1.5 veces del valor normal, dura mas de 6 meses

2. Evaluaci�n de los efectos:

0168 Haciendo referencia al estandar de Infergen� para el tratamiento de hepatitis C y de acuerdo con el nivel de ALT y

ensayo ARN-VHC, dividio a los efectos en tres grados:

Respuesta: nivel ALT normal, ARN-HCV negativo

Respuesta parcial: nivel ALT normal, ARN-HCV no alterado

Sin respuesta: ALT y ARN-HCV no alterado

3. Efectos en cl�nica

0169 El ensayo clinico se llevo a cabo al mismo tiempo con tratamiento de hepatitis B. 46 casos recibieron el tratamiento, 9 lg cada vez, inyeccion subcutanea, cada dia durante 24 semanas. Despues del tratamiento, 26 de 46 (56.52%) tienen efectos obvios, 12 de 46 (26.08%) ARN-HCV transferido a negativo, 26 de 46 (56.52%) funciones heptales recuperaron la normalidad.

EJEMPLO 8 Aerosol del S�per Compuesto Interfer�n Recombinante

Componente principal: Interferon Super Compuesto Recombinante

Caracter�stica: Liquido, material no insoluble

Farmacolog�a: El Interferon Super-Compuesto Recombinante tiene un amplio espectro de actividad anti-virus. Sus efectos son 5-20 veces mayores que los interferones (IFN) que estan disponibles en el mercado. Puede inhibir el crecimiento de coronavirus en cultivo celular. El mecanismo es la interrupcion de la reaccion de combinacion entre el IFN y el receptor correspondiente, y la induccion de la expresion de enzima de sintesis 2'5'-A, proteina quinasa R en la celula diana, por lo tanto, inhibiendo la expresion de la proteina viral. IFN puede inducir la expresion de diversas proteinas anti-virus para inhibir la reproduccion de proteinas virales, mejorar la funcion de las celulas asesinas naturales (NK) y otras funciones reguladoras inmunes, e inhibir la invasion de virus. Toxicidad aguda: Todos los ratones estan vivos tras la inyeccion subcutanea de dosis maxima (1000 veces la dosis humana), no se observo DL50.

Indicaci�n: Prevencion del Sindrome Respiratorio Agudo Severo Dosificaci�n y Administraci�n: Rociar la cavidad nasal y la garganta, tres veces al dia.

Reacciones adversas: No hubo ningun informe de reacciones adversas por el aerosol rIFN. No indujo alergia. Si la estimulacion es ocasional, la reaccion adversa gastrointestinal es pequena, y no se observo ninguna otra reaccion adversa obvia durante el tratamiento, es seguro para continuar el uso. Todas las reacciones se resolveran solas.

Advertencia: Los pacientes alergicos a aIFN y producciones de E. coli. no pueden utilizar este producto.

Precauciones: Antes del primer uso, rociar dos veces para expulsar el aire. Si hay algun material de precipitacion turbio, si ha caducado el producto, o si hay material sobre el vial, no lo use.

Uso pedi�trico: No esta claro.

Uso geri�trico: No esta claro.

Madres lactantes y mujeres embarazadas: Prohibido

Interacciones del medicamento: No esta claro.

Sobredosis: Exceso 150.lg (7,5X107 UI) cada vez, fiebre, anorexia, mialgias, escalofrios ocurriran con mas frecuencia. No hay ninguna reaccion adversa grave. Presentaci�n: 1 aerosol/paquete, 20 lg (1X107IU)/3 ml Almacenamiento: Almacenar a 4-8�C. No congelar, proteger de la luz. Vigencia: Aproximadamente un ano. Fabricaci�n: Fabricado por Sichuan Huiyang Life Engineering Ltd. Direcci�n: 8 Yusa Road, Room 902, Edificio A Chengdu, 610017 Sichuan, P.R. China

EJEMPLO 9-A

Efecto in vitro de un compuesto interfer�n recombinante de estilo nuevo sobre coronavirus asociado al SARS

0171 Muestra suministrada por: Sichuan Huiyang Life Engineering Ltd. Company, Provincia de Sichuan Experimentador: Departamento de Biologia Molecular, Instituto de microorganismo y epidemiologia, Academia de

Ciencias Medicas Militares Datos originales: Conservado en el archivo del Departamento de Biologia Molecular, Instituto de microorganismo y epidemiologia, Academia de Ciencias Medicas Militares

1. Materiales

0172

Medicamento: Nuevo tipo de interferon compuesto recombinante, 9 lg cada uno, suministrado por Huiyang Life Engineering Lt Company, Provincia de Sichuan, Numero de lote: 20020501. C�lulas: Vero E6, suministradas por el Departamento de Biologia Molecular del Instituto de Microorganismos y

Epidemiologia, Academia de Ciencias Medicas Militares.

Virus: Coronavirus asociado al SARS, BJ-01, suministrado por Departamento de Biologia Molecular del Instituto de Microorganismos y Epidemiologia, Academia de Ciencias Medicas Militares. Medio celular: DMEM suplementado con 10% de FBS.

2. Condici�n

El virus se midio en laboratorio 3� grado de bioseguridad

3. M�todo

0173 Ensayo de CPE (efecto citop�tico) de DICT50: 100 ll de celulas Vero E6 se sembraron en placas de 96 pocillos a 2X.104 celulas por pocillo. Despues de 24 horas de incubacion a 37�C, las celulas Vero E6 monocapa se trataron con 9 niveles de dilucion de coronavirus asociado al SARS por dilucion de 10 veces, 4 pocillos por dilucion. Las celulas se incubaron a 37�C y 5% de CO2. El CPE (efecto citopatico) se examino por microscopia diariamente. CPE menos de 25% se determino como +, 26-50% como ++, 51-75% como +++, 76-100% como ++++. Se registro el CPE. Entonces se calculo TCID50 por el metodo de Reed-Muench.

0174 Citotoxicidad del medicamento: Las celulas Vero E6 se inocularon en placas de 96 pocillos a 2X.104 celulas (100 ul) por pocillo. Despues de la incubacion de 24 horas a 37�C, las celulas crecieron hasta monocapa. El medicamento se diluyo en 36, 18, 9, 4,5, 2.25lg/ml (concentracion final) y se anadio a los pocillos cada uno para 4 pocillos. Se fijaron las celulas normales como grupo de control. El CPE del grupo del medicamento se observo diariamente durante un periodo de 5 dias, y luego se determino la concentracion del medicamento que no presenta toxicidad.

0175 Ensayo de CPE de la actividad del medicamento contra el coronavirus asociado al SARS: 100 ll de celulas Vero E6 se sembraron en placas de 96 pocillos a 2X.104 celulas por pocillo. Despues de incubar 24 horas a 37�C, las celulas crecieron hasta monocapa. El medicamento a la concentracion maxima que no presenta citotoxicidad se diluyo en 5 niveles por dilucion de 2 veces y se anadio a los pocillos (100 ll por pocillo). Por incubacion con 5% de CO2 a 37�C durante 24 horas, se anadieron diferentes concentraciones de virus (10-3, 10-4, 10-5). Despues del tratamiento con virus durante 48-72 horas, se examino el CPE (CPE menos de 25% se determino como +, 26-50% como ++, 51-75% como +++, 76-100% como ++++, celula normal como -). Las celulas se dividieron

5 en el grupo normal, el grupo de control del medicamento, y la dilucion diferente del grupo de control de virus, 4 pocillos por grupo. CPE se examino diariamente. Hasta que el efecto citopatico fue obviamente expuesto en el grupo de control de virus, se evaluo la actividad anti-virus del interferon. Se repitio el experimento. IC50 del medicamento se calculo por el metodo de Reed-Muench.

4. Resultados

10 0176 Toxicidad del virus: TCID50 del virus fue 10-8.

0177 Citotoxicidad del medicamento: la concentracion de interferon compuesto recombinante que no presenta citotoxicidad fue 18lg/ml, la forma de las celulas fue similar con el grupo de control, y no se mostro efecto citopatico alguno.

0178 El efecto anti-virus del medicamento: Se muestra en la Tabla 9-A.1 y Tabla 9-A.2

Tabla 9-A.1, el efecto antivirus del nuevo tipo de compuesto interfer�n recombinante (primer experimento)

Concentracion de IFN

CPE a diferente concentracion del virus

(lg/ml)

10-3 10-4 10-5

18

- - -

9

- - -

4.5

++ - -

2.25

+++ ++ -

1.125

++++ ++++ ++

Grupo de control de virus

++++ ++++ +++

Grupo normal

- - -

Grupo de control de medicamento

- - -

Tabla 9-A.2, el efecto antivirus del nuevo tipo de compuesto interfer�n recombinante (segundo experimento)

Concentracion de IFN

CPE a diferente concentracion del virus

(lg/ml)

10-3 10-4 10-5

18

- - -

9

- - -

4.5

+ - -

2.25

+++ ++ -

1.125

++++ ++++ ++

Grupo de control de virus

++++ ++++ +++

Grupo normal

- - -

Grupo de control de medicamento

- - -

5. Conclusion

0179 La concentracion del nuevo tipo de compuesto interferon recombinante que no presenta citotoxicidad a 18 lg/ml. Sus IC50 fueron 1.27, 2.25, y 4.04lg/ml respectivamente segun la concentracion de 10-5(1000TCID50), 10-4 (1000TCID50), 10-3 (100000TCID50) de coronavirus asociado al SARS (Tabla 9-A.3).

Tabla 9-A.3, IC50 de IFN a diferente concentraci�n de virus

Dilucion del virus

IC50 de IFN(lg/ml)

10-3

4.04

10-4

2.25

10-5

1.27

Director: Jin-yan Wang Auxiliar de laboratorio: Yan-hong Zhao Xiao-Guang Ji, Xiao Yu Li. Datos originales: Conservado en los archivos del Departamento de Biologia Molecular, Instituto de microorganismo

y epidemiologia, Academia de Ciencias Medicas Militares Fecha: Del 12 al 30 de mayo 2003 EJEMPLO 9-B Efecto in vitro de un nuevo tipo de interfer�n compuesto recombinante y, inyecci�n de interfer�n

recombinante -α-2b en coronavirus asociado al SARS

0180 Muestra suministrada por: Huiyang Life Engineering Ltd., provincia de Sichuan Experimentador: Departamento de Biologia Molecular, Instituto microorganismo y epidemiologia, Academia de

Ciencias Medicas Militares Datos originales: Conservados en sala de archivos del Departamento de Biologia Molecular, Instituto microorganismo y epidemiologia, Academia de Ciencias Medicas Militares

1. Materiales

Medicamento: Nuevo tipo de interferon compuesto recombinante, 618 lg/ml, suministrado por Huiyang Life Engineering Ltd., provincia de Sichuan; Anfulong (inyeccion de interferon recombinante -a-2b), suministrado por Hua-li-da Biology Engineering Ltd. Company, ciudad de Tianjin, 30ug/vial (300, 0000IU/vial), Numero de Lote: 20030105.

C�lulas: Vero E6, suministradas por el Departamento de Biologia Molecular, Instituto microorganismo y epidemiologia, Academia de Ciencias Medicas Militares

Virus: Coronavirus asociado al SARS, BJ-01, suministrado por Departamento de Biologia Molecular, Instituto microorganismo y epidemiologia, Academia de Ciencias Medicas Militares

Condici�n: El virus se midio en laboratorio de bioseguridad de 3� grado

2. Metodo

0182 Se midi� DICT50 con ensayo CPE: Se inocularon celulas Vero E6 en placas de 96 pocillos a 2X104 celulas (100 ll) por pocillo. Despues de una incubacion de 24-hr a 37�C, se trataron las monocapas Vero E6 con 9 niveles de dilucion de 10 veces de coronavirus asociado al SARS decreciendo, cada dilucion por cada 4 pozos. Las celulas se incubaron a 37�C y dioxido de carbono al 5%. Se examino CPE diariamente por microscopia de contraste de fase. CPE menor de 25% se determino como +, 26-50% como ++, 51-75% como +++, 76-100% como ++++. Se registro CPE. Luego se calculo TCID50 por el metodo de Reed-Muench.

0183 Se midieron TC50 de IFNs mediante ensayo MTT: Se inocularon celulas Vero E6 en placas de 96 pocillos a 2X104 celulas por pocillo (100 ll). Despues de incubar 24 horas a 37�C, se elimino el liquido sobrenadante cuando las celulas crecieron hasta monocapa, luego se trato Vero E6 con diferente concentracion de IFNs, cada dilucion por cada 4 pocillos. Se establecio el grupo normal. Tras 5 dias de observacion, se mezclaron las celulas con MTT durante 4 horas. Despues de eso, se elimina el liquido, y luego a partir de entonces se anadio DMSO a las celulas durante 0.5 horas. Se midio OD570nm por lector de microplacas. Finalmente, se calculo TC50 mediante el metodo de

5 Reed-Muench.

0184 La actividad de los INFs contra el coronavirus asociado al SARS, fue medido con ensayo MTT: 100 ml de celulas Vero E6 se inocularon en placas de 96 pocillos a 2X104 celulas por pocillo. Despues de incubar 24 horas a 37�C, las celulas se hicieron monocapas. La dilucion del medicamento a la concentracion que no presenta citotoxicidad fue 5 veces decreciendo y hubo 5 niveles de dilucion. Luego se anadio cada dilucion a 4 pocillos, 100 ul 10 por pocillo. Despues de incubar 24 horas a 37�C y 5% de CO2, se elimino la solucion de IFN, luego se anadieron diferentes concentraciones de dilucion de virus (10000, 1000, 100 DICT50) en placas, 4 pocillos por dilucion. Las celulas se dividieron en el grupo normal, el grupo de control de medicamento, y la dilucion diferente del grupo de control de virus (10000, 1000, 100 DICT50). Las celulas se incubaron a 37�C y 5% de CO2 durante 48-72h, hasta que se exhibio el efecto citopatico en el grupo de control de virus, se registro CPE (CPE menor de 25% se determino

15 como +, 26-50% como ++, 51-75% como +++, 76-100% como ++++, celula normal como -). La capacidad de crecimiento de las celulas se midio con el ensayo MTT, y luego se evaluo el efecto de antivirus de los INFs. El experimento se repitio 3 veces. Se calculo IC50 del medicamento por el metodo de Reed-Muench.

3. Resultados

20 TCID50 del virus: TCID50 del virus fue 10-7.

TC50 de IFNs: La concentracion del nuevo tipo de interferon compuesto recombinante que no presenta citotoxicidad fue 100lg/ml, y la del IFN-a-2b recombinante fue 12.5lg/ml, la forma de las celulas fue identica que el grupo normal a esa concentracion. TC50 del nuevo tipo de interferon compuesto recombinante fue 139.18lg/ml, la del IFN-a-2b recombinante fue 17.18lg/ml.

25 Tabla 9-B.1 TC50 de IFNs

IFN

TC50 lg/ml Valor medio (X�SD, n=3)

1er experimento

2do experimento 3er experimento

Nuevo tipo de interferon compuesto recombinante

141.42 125.96 150.08 139.18�12.22

IFN-a-2b

17.68 15.75 18.10 17.18�1.25

El efecto anti-virus del medicamento: se observaron los efectos anti-virus de dos IFNs in vitro. Los resultados de los experimentos se muestran en la Tabla 9-B.2, y los resultados de TI se muestran en la Tabla 9-B.3.

Tabla 9-B.2, La actividad anti-virus de IFNs Tabla 9-B.3, La actividad anti-virus de IFNs

IFNs

Concentracion de virus (TCID50) IC50(lg/ml)

1er experimento

2do experimento 3er experimento Valor medio (X�DE, n=3)

Nuevo tipo de compuesto interferon recombinante

10000 0.79 1.04 0.93 0.92�0.12

IFN-a-2b

5.04 4.56 4.56 4.75�0.25

Nuevo tipo de compuesto interferon recombinante

1000 0.19 0.18 0.18 0.18�0.01

IFN-a-2b

1.18 1.19 1.12 1.16�0.04

Nuevo tipo de compuesto interferon recombinante

100 0.08 0.10 0.11 0.10�0.02

IFN-a-2b

0.33 0.21 0.30 0.28�0.06

IFNs

Concentracion del virus (TCID50) TC50(lg/ml) IC50(lg/ml) TI (TC50/IC50)

Nuevo tipo de compuesto interferon recombinante

10000 139.18 0.92 151.28

IFN-a-2b

17.18 4.75 3.62

Nuevo tipo de compuesto interferon recombinante

1000 139.18 0.18 773.22

IFN-a-2b

17.18 1.16 14.78

Nuevo tipo de compuesto interferon recombinante

100 139.18 0.10 1391.80

IFN-a-2b

17.18 0.28 61.36

4. Conclusi�n

5 0186 Se observo el efecto de proteccion del nuevo tipo de compuesto interferon recombinante e IFN-a-2b en Vero E6 in vitro, y se manifesto la capacidad anti-virus de los IFNs. IC50 del nuevo tipo de compuesto interferon recombinante sobre coronavirus asociado al SARS a la concentracion de 10000, 1000, 100 fue 0.92, 0.18 y 0.10lg/ml en tres experimentos, TI de ellos fueron 151.28, 773.32 y 1.391.80 respectivamente. IC50 de IFN-a-2b fue 4.75, 1.16, y 0.28lg/ml, TI (indice de tratamiento) de ellos fueron 3.62, 14.78, 61.36 respectivamente.

10 0187 Lo mas importante, los dos ensayos (ver los ejemplos anteriores 9A y 9B) del efecto in vitro del virus anti-SARS de rSIFNco testificaron que aunque la dosis efectiva de rSIFN-co para inhibir el virus del SARS es de 1/5 de la delinterferon a-2b que se utiliza clinicamente en China en la actualidad, el indice de Tratamiento (TI) de rSIFN-co es casi 50 veces el de interferon a-2b. (VER: Efecto in vitro de un nuevo tipo de compuesto interferon recombinante e inyeccion de interferon recombinante-a2b en coronavirus asociado al SARS. Por el Instituto de Microbiologia y

15 Epidemiologia, Academia de Ciencias Medicas Militares)

0188 Treinta mil pulverizaciones de rSIFN-co se habian utilizado entre enfermeras de primera linea y medicos, y personas de alto riesgo en la provincia de Sichuan. El resultado muestra que ni las enfermeras y ni los medicos infectaron el SARS en la provincia de Sichuan.

Director: Jin-yan Wang

20 Auxiliar de laboratorio: Yan-hong Zhao, Xiao-guang Ji, Min Zhang, Jing-hua, Zhao.

Fecha: de 1 a 30 de julio 2003

Ejemplo 10:

COMPARACI�N DE LOS EFECTOS INHIBITORIOS DE DIFERENTES INTERFERONES SOBRE LA EXPRESI�N DEL GEN VHB

25 0189 El ADN del virus de la hepatitis B (VHB) contiene elementos de consenso para transactivar proteinas cuya actividad ligante se rige por interferones. El tratamiento de hepatocitos infectados por VHB con interferones conduce a inhibicion de la expresion de genes del VHB. El objetivo del presente estudio fue caracterizar los efectos de diferentes interferones sobre la transcripcion regulada de VHB. Usando transfeccion transitoria de celulas de hepatoma humano con plasmidos indicadores que contienen el gen de luciferasa de luciernaga bajo el control del Reforzador del VHB (EnH) I, Enh II y nucleo promotor, el Solicitante estudio las actividades biologicas de tres diferentes interferones en la transcripcion.

Materiales y M�todos

1.

Interferones: IFN-con1 (Infergen�), IFN-Hui-Yang (ySIFN-co) e IFN-beta 1b

2.

Plasmido indicador: Los fragmentos de ADN que contienen Reforzador del VHB (EnH) I, Enh II y promotor de nucleo se prepararon usando PCR y extremo romo clonado en el sitio SmaI I del plasmido indicador promotor y potenciador menor de luciferasa de luciernaga pGL3-Basic (Promega, WI, EE.UU.). El plasmido indicador resultante se denomino como pGL3-HBV-Luc.

3.

Cultivo de celulas y transfeccion de ADN: las celulas HepG2 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de FBS y 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina. Las celulas se mantuvieron en 30�C, incubadora 5%CO2. Las celulas fueron transfectadas con plasmido indicador pGL3-VHB-Luc usando kit de transfeccion de Lipofectina de Boehringer. Tras 18 horas, se elimino el medio que contiene los reactivos de transfeccion y se anadio medio fresco con o sin interferones. Las celulas se mantuvieron en cultivo durante otras 48 horas.

4.

Ensayo de luciferasa: Cuarenta y ocho horas despues de la adicion del interferon, se cosecharon las celulas y se preparo la lisis celular. La concentracion de proteina de lisados celulares se midio usando el kit de Ensayo de Proteinas de Bio-Rad. La actividad de luciferasa se midio usando Sistemas de Ensayo de Indicador de Luciferasa de Promega segun las instrucciones del fabricante.

RESULTADOS

La Expresion de la Actividad de Luciferasa en Diferentes Lisados Celulares Tratados con Interferon

Sin tratamiento IFN-con1 IFN-Hui-Yang IFN-beta 1b 100 48+8 29+6 64+10

0192 Este resultado muestra que ySIFN-CO inhibe mas eficazmente sobre la expresion de la expresion de genes del VHB.

Ejemplo 11:

EFECTOS SECUNDARIOS Y CAMBIOS EN LA TEMPERATURA DEL CUERPO CUANDO SE UTILIZA ySIFN-co

0193 En general hay mas efectos secundarios al uso de interferon. Los efectos secundarios incluyen: nausea, dolor muscular, perdida de apetito, perdida de pelo, hipoleucocitosis (hipoleukmia; hipoleucocitosis; hipoleukia), y disminucion de plaquetas en sangre, etc.

M�TODO

0194 Se dividen muestras de pacientes en dos grupos. 11 pacientes en el grupo A se inyectaron con 9 lg Infergen�. A 10 pacientes en el Grupo B se inyectaron 9 lg ySIFN-co. Ambos grupos fueron controlados durante 48 horas tras las inyecciones. El primer control se registro 1 hora tras la inyeccion. Despues de eso, se realizaron registros cada 2 horas.

0195 Tabla 11.1 es la comparacion de efectos secundarios entre pacientes inyectados con 9lg de Infergen� y 9lg de ySIFN-co.

Tabla 11.1 Efectos Secundarios

ySIFN-co 9lg

Infergen� 9lg

Persona: n=10

Persona: n=11

Sistemas corporales

Reacciones Recuento Recuento

En general

Debil 3 3

Calor plantar

1

frigolabil

3 4

Pierna sin fuerzas

3

Lumbago leve

2 1

Dolor corporal

4 5

Sistema Nervioso Central/ Sistema Nervioso Periferico

Dolor de cabeza 3 6

Mareos

2 11

Somnolencia

3

Gastroenterostomia

Apoclesis 1

Celiodinia

1

Diarrea

1

Sistema musculoesqueletico

Mialgia 1 2

Artralgia

2

Sistema respiratorio

nariz congestionada 1

Paropsia

Ojos inflamados 1

RESULTADOS

0196 Para los pacientes inyectados con ySIFN-co, los efectos secundarios fueron menores. Tenian algunos 5 sintomas comunes similares a la gripe, tales como: dolor de cabeza, debilidad, frigolabilidad, dolor muscular, hidrosis, artralgia (artrodinia; artronalgia). Los efectos secundarios de los pacientes inyectados con Infergen� fueron peores que los inyectados con ySIFN-co.

0197 De las figuras 9A-1, 9A-2, 9B-1, y 9B-2, era obvio que las temperaturas corporales de los pacientes de la muestra en el grupo A eran mas altas que las de los pacientes del grupo B. Tambien reflejo que la resistencia de

10 ySIFN-co fue mucho mejor que la de infergen�.

Ejemplo 12:

CRECIMIENTO DE CRISTALES de γSIFN-co Y ENSAYO DE PAR�METRO DE CRISTALOGRAF�A

0198 Cristal de ySIFN-co. Se encontraron dos tipos de cristales despues de ensayar y experimentar sistematicamente. (Ver Figuras 10-12)

15 1. Crecimiento de cristal

0199 Disolver la proteina ySIFN-co con agua pura (H2O) a 3mg/ml en densidad. Buscar la cristalizacion usando Hampton Research Crystal Screen I y II que fue hecha por Hampton Company. Usando el Metodo de Difusion de Gotas en Suspension, 500 ll de liquido, gota de proteina 1 ll + 1 ll de liquido, a temperatura 293 K. Se encontraron los primeros 2 tipos diferentes de pequenos cristales como se listan en la Tabla 12.1.

Tabla 12.1 Cribado de γSIFN-co Cristalino

Condicion

I II

Diluyente

0.1M Tris-HCl PH=8.75 0.1M HEPES PH=7.13

Precipitante

17.5%(p/v) PEG550 MME 10%(p/v)PEG6K

Aditivos

0.1M NaCl 3%(v/v)MPD

Temperatura

293K 293K

Tamano de Cristal (mm)

0.2x0.2x0.1 0.6x0.02x0.02

Cristalograma

Figura 10 Figura 11

2. Recogida de Datos y Procesamiento

0200 Se utilizo el Cristal I para recopilar datos de difraccion de rayos X y analisis preliminar de cristalografia. Se

5 ensayaron tambien los parametros. Los datos de difraccion se recogieron a temperatura ambiente. Se inserto Cristal I (Condicion I) en un tubo de pared delgada siliconada. Usando detector BrukerAXS Smart CCD, la fuente de luz esCuKa (A=1.5418A) generada por generador de rayos X Nonius FR591. Energia luminosa 2000 KW (40 kv x 50mA),longitud de onda 1.00A, bajo explosion 60 segundos, L<=2�, la distancia entre cristal y detector fue 50 mm. Los datos fueron procesados usando Proteum Procedure Package de Bruker Company. Ver Figura 12 para el patron de

10 difraccion de cristal (parcialmente). Ver Tabla 12.2 para el resultado del proceso.

Tabla 12.2 Resultados de Par�metros de Cristalograf�a

Parametros a (A) 82.67 b (A) 108.04

15 c (A) 135.01

a (�) 90.00 � (�) 90.00 y (�) 98.35

20 Grupo Espacial P2 o P21 Nitidez de separacion 5 A Molecula asimetrica # 10 Disolucion 57.6% 0201 Ademas, no hubo crecimiento de cristales de ySIFN-co basado en publicaciones anteriores. El resultado mas

25 cercano al ySIFN-co fue huIFN-a2b pero el analisis era muy complicado. Despues de sembrar 3 veces, el cristal crecio hasta 0.5x0.5x0.3mm, la nitidez de separacion fue 2.9 A, el grupo espacial fue P21. Los cristales tambien eran grandes, el numero de molecula asimetrica fue 6, y la disolucion fue aproximadamente 60%.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polinucleotido aislado que tiene la secuencia mostrada en la Figura 1.

2. 2.

   Un interferon recombinante obtenible mediante un proceso que comprende introducir en E. coli la secuencia de polinucleotidos mostrada en la Figura. 1.

   5 3. Una composicion que comprende el interferon recombinante de la reivindicacion 2.

3. 4.

   Una composicion farmaceutica que comprende el interferon recombinante de la reivindicacion 2 y un portador farmaceuticamente aceptable.

4. 5.

   Un vector que comprende el polinucleotido de la reivindicacion 1.

5. 6.

   Una celula huesped aislada que comprende el vector de la reivindicacion 5.

   10 7. El interferon recombinante de la reivindicacion 2 para uso medico.

6. 8.

   El interferon recombinante de la reivindicacion 2 para uso como un medicamento para evitar o tratar el Sindrome Respiratorio Agudo Severo.

7. 9.

   El interferon recombinante para uso de la reivindicacion 7, en el que el interferon se administra por via oral,

   a traves de inyeccion en vena, inyeccion muscular, inyeccion peritoneal, inyeccion subcutanea, 15 administracion nasal o mucosal, o por inhalacion via un inspirador.

8. 10.

   El interferon recombinante para uso de la reivindicacion 7, en el que el interferon es suministrado por un dispositivo de pulverizacion.

9. 11.

   El interferon recombinante para uso de la reivindicacion 7, en el que el interferon esta liofilizado.

10. 12. Un proceso para la preparacion del interferon recombinante de la reivindicacion 2 que comprende: 20 -introducir en un huesped E. coli la secuencia de polinucleotidos mostrada en la Fig. 1;

    -

    cultivar la celula huesped en condiciones adecuadas para la expresion del interferon recombinante; y

    -

    cosechar el interferon recombinante.

11. 13. Uso del interferon recombinante de la reivindicacion 2 para la fabricacion de un medicamento.