PT2325202E - Utilizações de interferões com estrutura espacial alterada - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

UTILIZAÇÕES DE INTERFERÕES COM ESTRUTURA ESPACIAL ALTERADA CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção está relacionada com um interferão super composto recombinante (rSIFN-co) obtenível por um processo que compreende a introdução em E. coli da sequência polinucleotídica como mostrada na Fig. 1, com configuração espacial alterada. Uma característica do rSIFN-co nesta invenção é que este pode não só inibir a duplicação de ADN (ácido desoxirribonucleico) do vírus da hepatite B, mas também a secreção de HBsAg e HBeAg.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 rSIFN-co é uma nova molécula de interferão construída com o aminoácido conservative mais popular encontrado em subtipos α-IFN humanos naturais utilizando métodos de engenharia genética. As Patentes dos Estados Unidos N.° 4.695.623 e 4.897.471 descreveram-no. 0 rSIFN-co provou ter atividade IFN de amplo espectro e atividade de inibição viral e tumoral e de células natural killer. A Patente dos Estados Unidos N.° 5.372.808 por Amgen, Inc. dirige-se ao tratamento de rSIFN-co. A Patente Chinesa N.° 97193506.8 por Amgen, Inc. dirige-se ao re-tratamento de rSIFN-co na hepatite C. A Patente Chinesa N.° 98114663.5 por Shenzhen Jiusheng Bio-engineering Ltd. dirige-se ao tratamento de rSIFN-co para hepatite B e hepatite C. A Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos autorizou Amgen a produzir rSIFN-co com E. Coli. para o tratamento clínico de hepatite C no final de 1997.

Pacientes com hepatite B podem ser identificados detetando HBsAg e HBeAg. O α-IFN é comummente utilizado em clínicas para tratar hepatite B. 0 IFN liga-se a recetores de membrana celular superficiais, inibindo a duplicação de ADN e ARN (ácido ribonucleico), incluindo a indução de algumas enzimas para evitar a duplicação do vírus em células infetadas com hepatite. Todos os IFNs podem apenas inibir a duplicação de ADN de vírus, não o antigénio e e s.

Esta divulgação descreve um interferão super composto recombinante, o método para produzir o mesmo e as utilizações deste.

Um surto de pneumonia atípica, referido como Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS) e identificado pela primeira vez na Província de Guangdong, China, propagou-se a vários países. Casos semelhantes foram detetados em pacientes em Hong Kong, Vietname e Canadá de fevereiro e março de 2003. A Organização Mundial de Saúde (OMS) lançou um alerta global para a enfermidade. Em meados de março de 2003, a SARS foi reconhecida em profissionais de saúde e membros das famílias os quais tinham cuidado de pacientes com enfermidade respiratória grave no Extremo Oriente. Muitos desses casos puderam ser rastreados através de múltiplas cadeias de transmissão a um profissional de saúde da Província de Guangdong que visitou Hong Kong, onde foi hospitalizado com pneumonia e morreu. No final de abril de 2003, milhares de casos de SARS e centenas de mortes relacionadas com SARS foram reportados à OMS a partir de mais de 25 países em todo o mundo. A maioria destes casos ocorreu após a exposição a pacientes com SARS em ambientes domésticos ou de cuidados de saúde. Esta divulgação proporciona um método para prevenir e/ou tratar a SARS.

Um outro susto epidémico atual na Ásia é o vírus da gripe aviária (H5N1). A gripe aviária é uma doença infecciosa em aves causada por estirpes do tipo A do vírus da gripe. Existem 15 subtipos do vírus da gripe aviária; H5N1 é particularmente preocupante porque muta rapidamente infetando não apenas animais, mas seres humanos. A contagem de mortes humanas confirmada por gripe aviária, a partir de 04 de fevereiro de 2004, foi de treze. Os laboratórios rede mundial de gripe da OMS têm trabalhado para controlar o vírus e evitar mais mortes humanas. No entanto, para entender completamente a magnitude do H5N1 e as suas formas de distribuição, são necessários testes mais meticulosos. Além disso, os fármacos antivirais são apenas eficazes no tratamento e prevenção de estirpes do vírus da gripe A naqueles cuja saúde é adequada. Veja-se http://www.who.int/csr/don/2004_01_15/en, 15 de janeiro de 2004 .

Investigadores em St. Jude e outros laboratórios de renome da gripe estão numa corrida para criar um protótipo de uma vacina humana contra ο H5N1. Esperam que os protótipos da vacina possam estar prontos em menos de três semanas. No entanto, até que uma vacina seja criada, os cientistas estão preocupados que ο H5N1 possa evoluir para uma super gripe humana. Veja-se The Wall Street Journal, Scientists Rush to Create Vaccine for Bird Flu - Just in Case, 20 de janeiro de 2004.

Esta divulgação descreve um interferão super composto recombinante como definido acima, o método para produzir o mesmo e as utilizações deste. Particularmente, o interferão super composto aqui divulgado é capaz de inibir, prevenir e/ou tratar os vírus da hepatite, vírus da SARS, ou doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, e o vírus da gripe aviária.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção proporciona um método para a inibição, prevenção ou tratamento de doenças virais e tumores num sujeito que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de interferão do super composto obtenível por um processo que compreende introduzir em E. coli a sequência polinucleotidica como mostrada na Fig. 1.

Esta invenção proporciona o método acima descrito, em que o interferão super composto é administrado oralmente, através de injeção venosa, injeção muscular, injeção peritoneal, injeção subcutânea, administração nasal ou mucosa, ou por inalação por meio de um inalador.

Esta invenção proporciona o método para prevenir ou tratar doenças virais, em que as doenças virais são hepatite A, hepatite B, hepatite C, outros tipos de hepatite, infeções virais causadas por vírus de Epstein-Barr, citomegalovírus, vírus herpes simplex, ou outros tipos de herpesvirus, papovavírus, poxvirus, picornavírus, adenovirus, rinovírus, vírus da leucemia de células T humana de tipo I, ou vírus da leucemia de células T humana de tipo II, ou vírus da leucemia de células T humana III.

Esta invenção proporciona um método para atividades anti-hepatite. Pode inibir a replicação do ADN do HBV, e a produção de HBsAg e HBeAg.

Esta invenção proporciona um método para prevenir ou tratar doenças por infeção respiratória superior.

Esta invenção proporciona um método para prevenir ou tratar tumores ou cancros em que o tumor é cancro da pele, carcinoma das células basais e melanoma maligno, carcinoma de células renais, cancro do fígado, cancro da tiróide, cancro da rinofaringe, carcinoma sólido, cancro da próstata, cancro do estômago/abdominal, cancro do esófago, cancro retal, cancro pancreático, cancro da mama, cancro do ovário, e cancro superficial da bexiga, hemangioma, carcinoma epidermóide, o cancro do colo do útero, cancro de pulmão de células não pequenas, cancro do pulmão de células pequenas, glioma, leucocitemia, leucocitemia aguda e leucocitemia crónica, leucemia mielóide crónica, leucemia de células pilosas, linfadenoma, mieloma múltiplo, policitemia vera, ou sarcoma de Kaposi.

Esta invenção proporciona um método para a prevenção ou tratamento de Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS) ou doenças respiratórias superiores induzidas por vírus num sujeito, que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de interferão super composto recombinante como definido acima. 0 interferão super composto pode ser administrado oralmente, através de injeção venosa, injeção muscular, injeção peritoneal, injeção subcutânea, administração nasal ou mucosa, ou por inalação por meio de um inalador.

Esta invenção proporciona um método para a inibição do agente etiológico de Síndrome Respiratória Aguda Grave, ou de doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, que compreende contactar o agente com uma quantidade eficaz de interferão super composto.

Esta invenção também proporciona um método para a inibição do vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave, de células infetadas com o vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave, ou de doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, que compreende contactar uma quantidade eficaz do interferão super composto com o dito vírus ou células. Esse contacto poderia ser direto ou indireto.

Esta invenção proporciona uma composição compreendendo uma quantidade eficaz do interferão super composto capaz de inibir, prevenir ou tratar o vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave, células infetadas com vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave, ou doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, e um veiculo adequado.

Esta invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do interferão super composto recombinante como definido acima capaz de inibir, prevenir ou tratar Síndrome Respiratória Aguda Grave, células infetadas com vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave, ou doenças respiratórias superiores induzidas por vírus num sujeito, e um veículo farmaceuticamente aceitável. É um objeto da invenção um método para a prevenção ou tratamento de Sindrome Respiratória Aguda Grave num sujeito, que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do interferão super composto recombinante, o mesmo conforme definido acima. É um objeto da invenção um interferão recombinante obtenível por um processo que compreende a introdução em E. coli da sequência polinucleotídica mostrada na Figura 1, para utilização como um medicamento para o tratamento de uma doença virai num sujeito. É um objeto adicional da invenção uma composição farmacêutica compreendendo um interferão recombinante obtenível por um processo que compreende a introdução em E. coli da sequência polinucleotídica mostrada na Figura 1 e uma veículo farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento de uma doença virai.

Preferivelmente, a doença virai é hepatite A, hepatite B, hepatite C, outros tipos de hepatites, ou uma doença respiratória superior induzida por vírus. Mais preferivelmente, a doença virai é uma infeção causada por vírus de Epstein-Barr, citomegalovírus, vírus herpes simplex, outros tipos de herpesvirus, papovavírus, poxvirus, picornavírus, adenovirus, rinovírus, vírus da leucemia de células T humana de tipo I, vírus da leucemia de células T humana de tipo II, vírus da leucemia de células T humana III, ou vírus da gripe aviária. É um objeto adicional da invenção um interferão recombinante obtenível por um processo que compreende a introdução em E. coli da sequência polinucleotídica mostrada na Figura 1, para utilização como um medicamento para o tratamento de um tumor num sujeito. É um objeto adicional da invenção uma composição farmacêutica compreendendo um interferão recombinante obtenível por um processo que compreende a introdução em E. coli da sequência polinucleotídica mostrada na Figura 1 e uma veiculo farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento de um tumor.

Preferivelmente, o tumor é cancro da pele, carcinoma das células basais, melanoma maligno, cancro do fígado, carcinoma das células renais, cancro da tiróide, cancro da rinofaringe, carcinoma sólido, cancro da próstata, cancro do estômago, cancro abdominal, cancro do esófago, cancro retal, cancro pancreático, cancro da mama, cancro do ovário, cancro superficial da bexiga, hemangioma, cancro do colo do útero, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro do pulmão de células pequenas, glioma, leucocitemia aguda, leucocitemia crónica, leucemia mielóide crónica, leucemia de células pilosas, linfadenoma, mieloma múltiplo, policitemia vera, ou sarcoma de Kaposi.

Preferivelmente, o interferão é administrado através de administração oral, injeção venosa, injeção muscular, injeção peritoneal, injeção subcutânea, administração nasal, administração na mucosa, ou por inalação.

Ainda preferivelmente, o interferão recombinante é formulado como um comprimido, cápsula, líquido oral, pasta, injeção, pulverizante, supositório, ou solução.

Preferivelmente o interferão é α, β ou ω. Também preferivelmente, o interferão é liofilizado.

Preferivelmente, o interferão super composto é administrado oralmente, através de injeção venosa, injeção muscular, injeção peritoneal, injeção subcutânea, administração nasal ou mucosa, ou por inalação por meio de um inalador.

Ainda preferivelmente, o interferão é administrado por um dispositivo de pulverização.

Ainda preferivelmente, o dispositivo é descrito na Figura 7 . É um objeto adicional da invenção um método para a inibição do agente etiológico de Síndrome Respiratória

Aguda Grave que compreende contactar, direta ou indiretamente, o agente com uma quantidade eficaz de interferão super composto como definido acima.

Preferivelmente, o agente etiológico é um vírus. É um objeto adicional da invenção um método para a inibição do vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave ou células infetadas com o vírus da Síndrome Respiratória

Aguda Grave, que compreende contactar uma quantidade eficaz do interferão super composto com o dito vírus ou células. É um objeto adicional da invenção uma composição compreendendo uma quantidade eficaz do interferão super composto capaz de inibir o vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave ou células infetadas com vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave e um veículo adequado. É um objeto adicional da invenção uma composição compreendendo uma quantidade eficaz do interferão super composto capaz de prevenir ou tratar a Síndrome Respiratória Aguda Grave de um sujeito e um veículo adequado. É um objeto adicional da invenção uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do interferão super composto recombinante capaz de inibir o vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave ou células infetadas com vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave e um veículo farmaceuticamente aceitável. É um objeto adicional da invenção uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do interferão super composto recombinante capaz de prevenir ou tratar a Síndrome Respiratória Aguda Grave num sujeito e um veículo farmaceuticamente aceitável. É um objeto adicional da invenção um dispositivo para administrar a composição farmacêutica como descrita acima.

Preferivelmente, o sujeito é um ser humano. É um objeto adicional da invenção um método para a prevenção de Síndrome Respiratória Aguda Grave em seres humanos, que compreende a aplicação do interferão super composto três vezes ao dia através de um pulverizante que contém vinte microgramas com dez milhões de unidades de atividade em três mililitros.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS

Figura 1. Sequência de ADNc do rSIFN-co concebida de acordo com E. Coli. Utilização do codão e sequência de aminoácidos do co-rSIFN deduzida.

Figura 2. Sequência de um outro interferão super composto.

Figura 3. Diagrama de vetor de clonagem plasmídico pLac T7 .

Figura 4. Diagrama de vetor de expressão plasmídico pHY-4 .

Figura 5. Processo de construção de plasmídeo de expressão pHY-5.

Figura 6-A. Espectro de dicroísmo circular de Infergen®. (Testado no Centro de Análise e Medição da Universidade de Sichuan)

Intervalo do espectro: 250 nm - 190 nm Sensibilidade: 2 m°/cm Caminho ótico: 0,20 cm

Equipamento: Dicroísmo circular J-500C

Amostras: contém 30 pg/ml de IFN-conl, 5,9 mg/ml de NaCl e 3,8 mg/ml de Na2P04, pH 7,0.

Infergen® (interferão alfacon-1), feito em Amgen Inc., também conhecido como interferão de consenso, é comercializado para o tratamento de adultos com infeções pelos vírus da hepatite C (HCV) . É atualmente o único interferão bio-otimizado aprovado pela FDA, desenvolvido através da conceção racional de fármacos e o único interferão com dados no marcador especificamente para pacientes que não respondem ou refratários. A força de vendas de InterMune relançou o Infergen® em janeiro de 2002 com uma campanha ativa para educar hepatólogos dos EUA sobre a utilização segura e apropriada de Infergen®, o qual representa uma nova esperança para os mais de 50 por cento de pacientes com HCV que falham outras terapias atualmente disponíveis. Veja-se http://www.inter-mune.com/wt/itmn/infergen, 27/08/2003 Figura 6-B. Especto de dicroísmo circular de Infergen® de referência [Journal of Interferon e Cytokine Research. 16:489-499 (1996)]

Espectro de dicroísmo circular de subformas do interferão de consenso. O interferão de consenso foi fracionado usando uma coluna de troca aniónica. As amostras foram dialisados em fosfato de sódio a 10 mM, pH 7,4. As medições foram feitas num espectropolarímetro Jasco J- 170, num termoestato celular a 15 °C. (-), forma acilada; (--) forma terminal de cis; (...), forma terminal de met. A. Espectro de UV afastado. B. Espectro de UV perto.

Figura 6-C. Espectro de dicroísmo circular de rSIFN-co Intervalo do espectro: 320 nm - 250 nm Sensibilidade: 2 m°/cm Caminho ótico: 2 cm

Equipamento: Dicroísmo circular J-500C

Amostras: contém 0,5 mg/ml de rSIFN-co, 5,9 mg/ml de NaCl e 3, 8 mg/ml de Na2PC>4, pH 7,0.

Figura 6-D. Espectro de dicroísmo circular de rSIFN-co

Intervalo do espectro: 250 nm - 190 nm

Sensibilidade: 2 m°/cm

Caminho ótico: 0,20 cm

Equipamento: Dicroísmo circular J-500C

Amostras: contém 30 pg/ml de rSIFN-co, 5,9 mg/ml de NaCl e 3,8 mg/ml de Na2P04, pH 7,0.

Claramente, conforme evidenciado pelos espectros acima, a estrutura secundária ou até mesmo terciária de rSIFN- co é diferente de Infergen®.

Figura 7A-C. Pulverizador de interferão super composto recombinante. Altura: 90 mm Largura: 25 mm (base), 6 mm (topo)

Peso: 9 g

Volume de administração: 0,1 ml

Figura 7D. Pulverizador de interferão super composto recombinante

Ao utilizar o pulverizador pela primeira vez, retire a tampa e descarregue para o ar várias vezes até que alguns esguichos líquidos saiam. Não necessita testar o pulverizador para utilizações subsequentes. Para utilizar, siga as ilustrações mostradas na figura, isto é: (1) Pré-pulverize e (2) Pressione para baixo o bico para libertar a medicação.

Figura 8. Comparação de efeitos de inibição de diferentes interferões na expressão do gene de HBV Figura 9A-1. Curvas de mudanças de temperatura corporal no grupo A (5 pacientes)

Esta figura é o registro de mudanças de temperatura corporal de 5 pacientes no Grupo A.

Figura 9A-2. Curvas de mudanças de temperatura corporal no grupo A (6 pacientes)

Esta figura é o registro de mudanças de temperatura corporal dos 6 pacientes no Grupo A.

Figura 9B-1. Curvas de mudanças de temperatura corporal no grupo B (5 pacientes)

Esta figura é o registro de mudanças de temperatura corporal de 5 pacientes no Grupo B.

Figura 9B-2. Curvas de mudanças de temperatura corporal no grupo B (5 pacientes)

Esta figura é o registro de mudanças de temperatura corporal dos 5 pacientes no Grupo B.

Figura 10. Cristal I de rsIFN-co

Figura 11. Cristal II de rsIFN-co

Figura 12. A difração de raios X do cristal de rsIFN-co DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esta invenção proporciona um método para a produção de um interferão super composto recombinante com configuração espacial alterada e atividade antiviral melhorada, que compreende as etapas de: (a) Introdução de uma molécula de ácido nucleico conforme mostrada na Fig. 1 que codifica o dito interferão com codões preferidos para a expressão num hospedeiro E. coli; e (b) Colocação do hospedeiro introduzido em condições que permitam a expressão do dito interferão.

Esta invenção proporciona o método para a produção do interferão, que compreende ainda a recuperação do interferão expresso.

Esta invenção proporciona um interferão super composto recombinante como descrito acima com configuração espacial alterada.

Esta invenção revela que proteínas com a mesma sequência primária podem ter diferentes atividades biológicas. Como ilustrado no exemplo seguinte, esta invenção divulga duas proteínas com sequências de aminoácidos idênticas, mas com diferentes atividades. A eficácia dessa atividade pode, por vezes, ser melhorada e, às vezes, a proteína com configuração espacial alterada revela nova função.

Também são divulgados equivalentes ou mímicos do interferão recombinante como descrito acima.

Um equivalente é uma molécula que é semelhante em função ao interferão composto. Um equivalente poderia ser um mutante por deleção, substituição ou reposição da sequência original. Mímicos poderiam ser um péptido, polipéptido ou uma entidade química pequena. 0 interferão aqui descrito inclui, mas não está limitado a, interferão α, β, ou ω. Numa forma de realização, é o IFN-la, IFN-2b ou outros mutantes.

Numa forma de realização, o interferão super composto divulgado tem maior eficácia que o interferão descrito nas Patentes U.S. N.° 4.695.623 ou 4.897.471. Este interferão super composto acredita-se ter uma estrutura secundária ou terciária única, (veja-se, por exemplo, Figura 6.) 0 interferon super composto aqui descrito tem uma alteração (ões) da estrutura espacial que resulta das alterações no seu processo de produção. 0 interferão super composto acima descrito pode ser produzido por um sistema de expressão de alta eficiência que utiliza um promotor especial. Numa concretização, o promotor é Pbad · Como poderia ser facilmente apreciado por outros peritos qualificados. Outros promotores induziveis, tais como promotores de choque térmico ou promotores induziveis de metais pesados, podem ser utilizados nesta invenção. 0 interferão super composto pode também ser produzido com o seu gene como ADNc sintetizado artificialmente com ajuste da sua sequência do tipo selvagem de acordo com a preferência de codões de E. coli. Extensa discussão da dita utilização de codões (preferência) pode ser encontrada na Patente U.S. N.° 4.695.623. Veja-se, por exemplo, coluna 6, linnh 41 - coluna 7, linha 35. 0 interferão super composto acima descrito possui atividade antiviral ou antitumoral, e, portanto, é útil na inibição, prevenção e tratamento de doenças virais, tumores ou cancros.

Como aqui utilizado, doenças virais incluem, mas não estão limitadas a, hepatite A, hepatite B, hepatite C, outros tipos de hepatites, infeções causadas por vírus de Epstein-Barr, citomegalovírus, vírus herpes simplex, outros herpesvirus, papovavírus, poxvirus, picornavírus, adenovirus, rinovírus humano, vírus da leucemia de células T humana tipo I, vírus da leucemia de células T humana tipo II, ou vírus da leucemia de células T humana tipo III.

Infeção respiratória superior virai, nomes alternativos resfriado comum, constipações. Esta é uma infeção virai contagiosa do trato respiratório superior, caracterizada por inflamação das membranas mucosas, espirros, e garganta inflamada. É geralmente causada por mais de 200 tipos diferentes de vírus, conhecidos como rinovírus. As constipações não são causadas pelos mesmos vírus responsáveis pela gripe. As constipações são propagadas através de gotículas provenientes da tosse ou espirros de terceiros com uma constipação ou por contacto das mãos com objetos contaminados por alguém com uma constipação. A incidência de constipações é mais elevada entre crianças, e a incidência diminui com a idade, porque a imunidade ao vírus que causa a constipação ocorre após a doença. Gradualmente, imunidade a uma ampla variedade de vírus que causam constipações é desenvolvida em adultos. As crianças podem ter 10 constipações por ano, e os adultos podem ter três constipações por ano.

Os Centros de Controlo e Prevenção de Doenças dos EUA estimam que a incidência anual média de infeções do trato respiratório superior (IRSs) nos Estados Unidos é 429 milhões de episódios, resultando em mais de 2,5 bilhões de dólares em custos diretos e indiretos de saúde. O resfriado comum é mais frequentemente causado por um de várias centenas de rinovírus (52%), mas coronavírus (8%) ou o vírus sincicial respiratório (7%) também podem levar a infeção. Outros vírus, como o influenza (6%), parainfluenza e adenovirus, podem produzir sintomas respiratórios, mas estes estão frequentemente associados a pneumonia, febre ou calafrios.

Constipações ocorrem num padrão sazonal que normalmente começa em meados de setembro e termina no final de abril e inicio de maio. 0 resfriado comum é bastante contagioso e pode ser transmitido tanto por contacto pessoa-a-pessoa como por goticulas transportadas pelo ar. Os sintomas respiratórios superiores geralmente começam 1 a 2 dias após a exposição e geralmente duram de 1 a 2 semanas, mesmo embora a propagação virai e contágio possam continuar por mais 2 a 3 semanas. Os sintomas podem persistir com a ocorrência de complicações tais como sinusite ou comprometimento respiratório inferior, tal como bronquite ou pneumonia. 0 resfriado comum tem uma variedade de sintomas evidentes, incluindo mal-estar, congestão nasal, rinorreia, tosse não produtiva, leve inflamação da garganta, e, em alguns casos, uma febre baixa. Devido à semelhança dos sintomas, uma constipação pode ser confundido com rinite alérgica perene, mas as alergias geralmente podem ser descartadas por causa das diferenças de cronicidade.

Se um paciente se apresenta com uma IRS virai, o espectro de remédios é extenso. Uma vez que a maioria dessas infeções são auto-limitantes, os médicos normalmente recomendam repouso e líquidos, mas outros tratamentos incluem terapias ambientais e nutricionais, produtos anti-histamínicos ou descongestionantes de venda livre ou com prescrição, novas formulações anti-histamínicas e anticolinérgicas e antibióticos. A Tabela 1 lista medicações comummente utilizadas para tosse e constipações e os seus efeitos secundários.

A utilização de interferão super composto para prevenir ou tratar IRS

Aproximadamente 70-80% das IRSs são causadas por vírus, tais como vírus sinciciais respiratórios, adenovirus, rinovirus, vírus de Coxsackie, coronavirus e as suas variantes, vírus influenza A e as suas variantes, vírus influenza B e as suas variantes, vírus parainfluenza e as suas variantes ou enterovirus e as suas variantes. A principal causa de IRSs em adultos é rinovirus. Para as crianças, vírus sinciciais respiratórios e vírus parainfluenza são as duas causas principais da IRSs. O interferão super composto desempenha um papel importante na luta contra vírus que causam IRS. O interferão super composto adquire o seu efeito antiviral principalmente mediante dois mecanismos: 1. Liga-se à superfície de células sensíveis e induz as mesmas a produzirem proteína antiviral, em seguida, bloqueia a duplicação e reprodução do vírus in vivo. 2. Interferão super composto consegue ajustar a resposta imunitária, incluindo a resposta imunitária de células T, atividade de células NK, a função de fagocitose de monocariota, e até mesmo a formação de alguns anticorpos in vivo.

No tratamento para IRS, o interferão super composto pode ser aplicado diretamente na área afetada mediante uma inspiração por pulverizador. Este método de tratamento permite que o interferão atinja as células alvo em primeira mão. Consequentemente, a comercialização da provisão como um pulverizador, ao invés de via oral ou injeção, seria mais seguro e mais eficaz para administrar o interferão.

Utilização de interferão super composto para prevenir ou tratar SARS

Com o consentimento do grupo de trabalho de Sichuan na prevenção e controlo de SARS, a distribuição de interferão super composto começou em maio de 2003. O pulverizador de interferão super composto foi distribuído a médicos e enfermeiros em hospitais, áreas povoadas com um alto risco de SARS, e ao grupo de investigação nacional de prevenção e controlo da SARS. Entre os 3000 utilizadores até 19 de dezembro de 2003, não houve relatos de quaisquer efeitos secundários relacionados à utilização do pulverizador. Além disso, nenhum dos médicos e enfermeiros, a população da Província de Sichuan, ou outras organizações que têm utilizado o pulverizador de interferão super composto foram infetados por SARS.

Portanto, esta invenção proporciona um método para inibir, prevenir ou tratar a replicação virai ou células infetadas por vírus, contactando o dito vírus ou células infetadas com uma quantidade eficaz de interferão super composto como definido acima.

Este interferão super composto é útil na inibição, prevenção ou tratamento dos seguintes cancros ou tumores:

Paciente #1. Um paciente do sexo feminino com cancro de ovário começou a receber injeções. Este recebeu injeções de 15 pg em 14 de julho, 16 de julho, 18 de julho, 20 de julho, e 22 de julho. Em 14 de julho, foram observados 2000 ml de liquido peritoneal. O paciente foi submetido a quimioterapia em 22 de julho. A 3 de agosto, o peritoneu do paciente foi aberto. 21 de fluido era esperado ser encontrado, mas só foram observados 200 ml de fluido. Os ovários esquerdo e direito e linfonodos foram cancerosos. Todos os outros órgãos estavam limpos.

Paciente #2. Um paciente com cancro renal foi tratado da seguinte maneira. Num período de meio mês, o paciente recebeu três injeções de 9 pg de rSIFN-co e 3 injeções de 15 pg de rSIFN-co. No mês inteiro a seguir a estas injeções, recebeu injeções de 9 pg e 15 pg de rSIFN-co em dias alternados. Uma biópsia renal não mostrou nenhuma metástase após este curso de tratamento. O paciente apresentou uma recuperação completa. Todos os semestres após a recuperação, o paciente recebeu injeções de 15 pg de rSIFN-co, 15 vezes ao longo de um período de um mês.

Assim, esta invenção proporciona um método para inibir o crescimento de células tumorais ou cancerígenas, contactando o interferão super composto como definido acima com as ditas células tumorais ou cancerígenas.

Numa forma de realização adicional, o interferão super composto inibe a duplicação do ADN e a secreção de HBsAg e HBeAg de vírus da Hepatite B.

Esta invenção também proporciona códigos de genes artificiais para o interferão super composto. Está dentro da perícia vulgar conceber um gene artificial. Muitos métodos para gerar uma sequência de nucleótidos e outras técnicas de biologia molecular foram descritos anteriormente. Veja-se, por exemplo, Joseph Sambrook e David W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

Dezembro de 2000, publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Esta invenção proporciona um vetor que compreende a sequência polinucleotídica mostrada na Fig. 1, a qual codifica o interferão super composto como definido acima.

Esta invenção proporciona um sistema de expressão que compreende o vetor como definido acima. As células incluem, mas não estão limitadas a, células procarióticas ou eucarióticas.

Esta invenção também proporciona uma célula hospedeira compreendendo o vetor como definido acima.

Esta invenção proporciona um processo para a produção de interferão super composto recombinante como definido acima compreendendo a introdução da sequência polinucleotídica mostrada na Fig. 1 com o codão selecionado de preferência num hospedeiro E. coli, cultivando o dito hospedeiro introduzido em condições apropriadas para a expressão do dito interferão composto e colhendo o interferão composto expresso. O processo pode compreender extração do interferão super composto do caldo de fermentação, recolha de corpos de inclusão, desnaturação e renaturação da proteína colhida. O processo pode manter a elevada eficácia, mesmo quando o interferão super composto é utilizado com um agente e numa concentração particular. O processo também compreende a separação e purificação do interferão super composto. O processo compreende ainda a liofilização do interferão super composto purificado. O processo compreende a produção de uma injeção liquida de interferão super composto.

Esta invenção também proporciona o interferão super composto produzido pelos processos acima.

Esta invenção proporciona uma composição compreendendo o interferão super composto recombinante como definido acima e um veículo adequado.

Esta invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o interferão super composto recombinante como definido acima e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Esta invenção proporciona um método para o tratamento ou prevenção de doenças virais ou tumores num sujeito, que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de interferão super composto como definido acima.

Esta invenção proporciona o método acima descrito, em que as doenças virais incluem, mas não estão limitadas a, hepatite A, hepatite B, hepatite C, outros tipos de hepatites, infeções virais causadas por vírus de Epstein-Barr, citomegalovírus, vírus herpes simplex, ou outros tipos de herpesvirus, papovavírus, poxvirus, picornavírus, adenovirus, rinovírus, vírus da leucemia de células T humana de tipo I, ou vírus da leucemia de células T humana de tipo II, ou vírus da leucemia de células T humana III.

Esta invenção proporciona o método acima descrito, em que o interferão super composto foi administrado oralmente, via injeção venosa, injeção muscular, injeção peritoneal, injeção subcutânea, administração nasal ou mucosa, ou por inalação por meio de um inalador.

Esta invenção fornece o método acima descrito, em que o interferão super composto foi administrado seguindo o protocolo de injeções de 9 pg ou 15 pg a cada dois dias, três vezes por semana, durante 24 semanas.

Foi surpreendente encontrar que rSIFN-co, a estrutura espacial do qual foi alterada, não é apenas uma preparação para inibir a duplicação do ADN de hepatite B, mas também para inibir a secreção de HBsAg e HBeAg em células 2.2.15.

Um objetivo desta invenção é oferecer uma preparação de rSIFN-co para inibir diretamente a duplicação do ADN do vírus da hepatite B e a secreção de HBeAg e HBsAg da hepatite B e diminuí-los para níveis normais.

Numa forma de realização, o rSIFN-co foi produzido com técnicas recombinantes. Na condição de sequência de aminoácidos fixa, o ADN do IFN foi redesenhado de acordo com a utilização do codão de E. Coli. e, em seguida, o gene de rSIFN-co foi sintetizado artificialmente. 0 ADNc de rSIFN-co foi clonado no vetor de alta expressão de E. coli por técnicas recombinantes, e uma expressão alta de rSIFN-co foi obtida usando o mecanismo de indução/ativação de L-arabinose para ativar a transcrição do promotor PBAD.

Comparando com sistemas de indução térmica, indução por pH e indução por IPTG da engenharia genética, o sistema de indução/ativação de arabinose tem algumas vantagens: (1) Sistemas comuns aliviam a função do promotor criando um padrão de "desrepressão" . Os promotores, em seguida, induzem a expressão de genes a jusante. A alteração da temperatura e pH e a adição de IPTG não pode ativar diretamente os promotores.

No sistema aqui divulgado, L-arabinose não só desativa e reprime, mas também ativa a transcrição do promotor PBad que induz uma alta expressão de rSIFN-co. Portanto, o sistema de indução/ativação de arabinose é um sistema de expressão mais eficaz. (2) A relação entre dosagem de exógeno e de L-arabinose é linear. Isto significa que a concentração de arabinose pode ser alterada para ajustar o nível de expressão do gene exógeno. Portanto, é mais fácil controlar o nivel de expressão do gene exógeno em E. Coli. por arabinose do que por alteração do valor de temperatura e pH. Esta característica é significante para a formação de corpos de inclusão. (3) L-arabinose é engenhosa, barata e segura, as quais, pelo contrário, são as desvantagens de outros indutores, tais como IPTG. Esta forma de realização cria uma eficaz e resistente E. coli de expressão de rSIFN-co manipulando uma estirpe com um sistema de indução/ativação de L-arabinose. A estirpe é cultivada e fermentada sob condições adequadas para colher os corpos bacterianos. Os corpos de inclusão são, em seguida, purificados depois de destruir as bactérias e lavar repetidamente. 0 resultado final, uma massa de alta pureza, uma proteína rSIFN-co de configuração espacial alterada para esta invenção e para tratamento clínico, foi adquirida a partir de desnaturação e renaturação de corpos de inclusão e de uma série de etapas de purificação.

As seguintes são algumas preparações de rSIFN-co: comprimidos, cápsulas, líquidos para consumo oral, pastas, injeções, pulverizadores, supositórios e soluções. Injeções são recomendadas. É comum injetar o medicamento por via subcutânea ou injeção venosa. 0 veículo médico poderia ser qualquer veículo medicamente aceitável, incluindo hidratos de carbono, cellulosum, agente de adesão, de colapso, emoliente, de carga, de adição-dissolução, agente de amortização, conservante, espessante, de correspondência, etc. Esta invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo a composição acima e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Para os propósitos desta invenção, "veículos farmaceuticamente aceitáveis" significa qualquer dos veículos farmacêuticos padrão. Exemplos de veículos adequados são bem conhecidos na técnica e podem incluir, mas não estão limitados a, qualquer dos veículos farmacêuticos padrão, tais como uma solução salina tamponada com fosfato e vários agentes humectantes. Outros veículos podem incluir aditivos utilizados em comprimidos, grânulos, cápsulas, etc. Tipicamente, tais veículos contêm excipientes tais como amido, leite, açúcar, determinados tipos de argila, gelatina, ácido esteárico ou seus deste, estearato de magnésio ou cálcio, talco, gorduras ou óleos vegetais, gomas, glicóis ou outros excipientes conhecidos. Tais veículos podem também incluir aditivos de aroma e cor ou outros ingredientes. Composições compreendendo tais veículos são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos.

Esta invenção proporciona um método para a prevenção ou tratamento de Sindrome Respiratória Aguda Grave ou doenças respiratórias superiores induzidas por vírus de um sujeito, que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de interferão super composto recombinante como definido acima.

Numa forma de realização do método acima, o interferão é α, β, ou ω. 0 interferão super composto como definido acima pode ser administrado oralmente, através de injeção venosa, injeção muscular, injeção peritoneal, injeção subcutânea, administração nasal ou mucosa, ou por inalação por meio de um inalador.

Numa forma de realização, o interferão é administrado por um dispositivo de pulverização.

Numa forma de realização específica, o dispositivo é descrito na Figura 7.

Numa forma de realização, o interferão é liofilizado. Esta invenção proporciona um método para a inibição do agente etiológico de Sindrome Respiratória Aguda Grave, ou de doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, que compreende contactar o agente com uma quantidade eficaz de interferão super composto como definido acima.

Determinou-se que o agente etiológico de SRAS é um vírus. Veja-se, por exemplo, Rota et al. (2003),

Characterization of a Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome. Science 1085952 www.sciencexpress.org e Marra, et al. (2003), The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus. Science 1085853 www.sciencexpress.org. Esta invenção também proporciona um método para a inibição do vírus da Sindrome Respiratória Aguda Grave ou de células infetadas com o vírus da Sindrome Respiratória Aguda Grave, ou de doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, ou de células infetadas com vírus capazes de induzir doenças respiratórias superiores, que compreende contactar uma quantidade eficaz do interferão super composto como definido acima com o dito vírus ou célula. Esse contacto poderia ser direto ou indireto.

Esta invenção proporciona uma composição compreendendo uma quantidade eficaz do interferão super composto como definido acima capaz de inibir o vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave ou células infetadas com vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave, ou doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, ou células infetadas com vírus capazes de induzir doenças respiratórias superiores, e um veículo adequado.

Esta invenção proporciona uma composição compreendendo uma quantidade eficaz do interferão super composto como definido acima, capaz de prevenir ou tratar Síndrome Respiratória Aguda

Grave, ou doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, de um sujeito e um veículo adequado. Esta invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do interferão super composto recombinante como definido acima capaz de inibir o vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave, ou células infetadas com vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave, ou doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Esta invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do interferão super composto recombinante como definido acima capaz de prevenir ou tratar Síndrome Respiratória Aguda Grave, ou doenças respiratórias superiores induzidas por vírus num sujeito, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Esta invenção proporciona um dispositivo para administrar a composição farmacêutica acima descrita. Numa forma de realização preferida, o sujeito é um ser humano. Como pode ser facilmente apreciado, o interferão super composto como definido acima pode ser usado em outros animais ou mamíferos.

Esta invenção proporciona um método para a prevenção da Síndrome Respiratória Aguda Grave ou de doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, em seres humanos, compreendendo a aplicação do interferão super composto como definido acima três vezes ao dia através de um pulverizador que contém vinte microgramas de interferão, igual a dez milhões unidades de atividade em três mililitros. Esta invenção será melhor entendida a partir dos exemplos que se seguem. No entanto, um perito na especialidade apreciará rapidamente que os métodos específicos e os resultados discutidos são meramente ilustrativos da invenção como descrito mais completamente nas reivindicações que se seguem.

DETALHES EXPERIMENTAIS EXEMPLO 1 0 rSIFN-co é uma nova molécula de interferão construída de acordo com aminoácidos conservativos num subtipo de IFN-α humano utilizando métodos de engenharia genética. Provou-se que rSIFN-co tem atividade de IFN de largo espectro, tal como elevada atividade antiviral e de inibição tumoral, especialmente para tratar eficazmente hepatite C.

Um codão de E. Coli codão foi utilizado para redesenhar o ADNc de rSIFN-co e, em seguida, sintetizar artificialmente ADNc de rSIFN-co a partir de sequências de ADN de rSIFN-co publicadas e sequências de aminoácidos deduzidas (Figura 1).

No sentido de obter uma proteína rSIFN-co pura, ADNc de rSIFN-co foi clonado num vetor de alta expressão de E. Coli, e L-arabinose, a qual pode ativar fortemente o promotor PBad em vetores, foi utilizada para induzir a expressão elevada do gene rSIFN-co. Síntese de E. Coli Sequência de ADNc Redesenho da sequência de ADNc de rSIFN-co 0 ADNc de rSIFN-co foi redesenhado de acordo com o codão utilizado de E. Coli para alcançar elevada expressão em E. coli. A sequência de aminoácidos deduzida a partir da sequência de ADNc redesenhado de rSIFN-co é completamente coincidente com sequência de aminoácidos primitiva do rSIFN-co publicado (Figura 1) . Síntese da sequência de ADNc de rSIFN-co Síntese semi-molecular da terminação 5' e terminação 3' do ADNc de rSIFN-co

Duas semi-moléculas podem ser diretamente sintetizadas: terminação 5' de 280 pb (fragmento I) e terminação 3' de 268 pb (fragmento II) de ADNc de rSIFN-co por PCR. Existem 41 pb sobrepondo-se entre o fragmento I e o fragmento II. (1)Síntese química de fragmento oligodesoxinucleotídico: Oligómero A: SEQ ID No. 5 5'ATGTGCGACCTGCCGCAGACCCACTCCCTGGGTAACCGTCGTGCTCTGATCC TGCTGGCTCAGATGCGTCGTATCTCCCCGTTCTCCTGCCTGAAAGACCGTCACG AC3 '

Oligómero B: SEQ ID No. 7 5'CTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAGAGGTTCGACGGTAACC AGTTCCAGAAGCTCAGGCTATCTCCGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGACCTT C3 '

Oligómero C: SEQ ID No. 8 5'GCTGCTGGTACAGTTCGGTGTAGAATTTTTCCAGCAGGGATTCGTCCCAAGC AGCGGAGGAGTCTTTGGTGGAGAACAGGTTGAAGGTCTGCTGGATCATTTC3' Oligómero D: SEQ ID No. 9

5'ATCCCTGCTGGAAAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTG GAAGCTTGCGTTATCCAGGAAGTTGGTGTTGAAGAAACCCCGCTGATGAAC3' Oligómero E: SEQ ID No. 10 5'GAAGAAACCCCGCTGATGAACGTTGACTCCATCCTGGCTGTTAAAAAATACT TCCAGCGTATCACCCTGTACCTGACCGAAAAAAAATACTCCCCGTGCGCTTGGG 3 '

Oligómero F: SEQ ID No. 11 5'TTATTCTTTACGACGCAGACGTTCCTGCAGGTTGGTGGACAGGGAGAAGGAA CGCATGATTTCAGCACGAACAACTTCCCAAGCGCACGGGGAGTATTTTTTTTCG GTCAGG3' PCR I para Fragmento I: oligodesoxinucleótido B como modelo, oligodesoxinucleótido A e C como iniciadores, sintetizado fragmento I de 280 pb. Mistura do PCR I (unidades: μΐ)

PCR II para Fragmento I: oligodesoxinucleótido E como modelo, oligodesoxinucleótido D e F como iniciadores, sintetizado Fragmento II de 268 pb.

Mistura de PRC II (unidades: μΐ) água destilada esterilizada 39 10 x tampão Pfu (Stratagem American Ltd.) 5 mistura de dNTP (concentração de dNTP 2,5 2 mmol/1)

Iniciador do oligómero D (25 pmol/l) 1

Iniciador do oligómero F (25 pmol/l) 1

Modelo do oligómero F (pmol/l) 1 DNA polimerase em Pfu (Stratagem American 1

Ltd.) (25 U/μΙ)

Volume total 50 μΐ

Ciclo de PCR: o mesmo que para PCR I

Montagem do ADNc de rSIFN-co

Os fragmentos I e II foram montados em conjunto para obter a sequência molecular de ADNc completa de rSIFN-co utilizando o método de PCR de sobreposição e extensão. As enzimas de restrição Ndel e PstI foram introduzidos para clonar a sequência de ADNc de rSIFN-co num plasmideo. (1) Iniciadores de síntese química

Oligómero G: 5'ATCGGCCATATGTGCGACCTGCCGCAGACCC3' SEQ ID No. 12

Oligómero H: 5'ACTGCCAGGCTGCAGTTATTCTTTACGACGCAGACGTTCC3' SEQ ID No. 13 (2) PCR de sobreposição e extensão

Mistura de PRC (unidades: μΐ) água destilada esterilizada 38 10 x tampão Pfu (Stratagen American Ltd.) 5 mistura de dNTP (concentração de dNTP 2,5 mmol/1)

Iniciador G (25 pmol/l) 1

Iniciador H (25 pmol/l) 1 * predução de fragmento I (1 pmol/l) 1 * predução de fragmento II (1 ymol/l) 1 DNA polimerase em Pfu (Stratagem American

Ltd.) (2,5 U/μΙ)

Volume total 50 μΐ

*Separar e purificar a produção por PCR com o kit de purificação StrataPrep PCR produzido por Stratagem American Ltd. e dissolver em água destilada esterilizada. Ciclo de PCR: o mesmo que para PCR I

Análise do clone e sequência do gene de rSIFN-co

Plasmideo pLac T7 como vetor de clonagem. O plasmídeo pLac T7 é reconstruído com plasmídeo pBluescript II KS(+) produzido por Stratagem (Figura 3).

Produção por PCR de ADNc de rSIFN-co purificada com kit de purificação StrataPrep PCR. Digerir ADNc e plasmídeo pLac T7 com Ndel e PstI. Executar eletroforese em gel de agarose a 1% e separar estes fragmentos de ADN duplamente digeridos. Recuperar fragmento de ADN de rSIFN-co longo de 507 pb e fragmento de ADN plasmídico de 2,9 kb. Ligar estes fragmentos através de DNA ligase T4 para formar um plasmídeo recombinante. Transformar células competentes DH5a (Gibco) com o plasmídeo recombinante, cultura a 37 °C durante a noite. Identificar a colónia recombinante positiva, chamada pHY-1.

Executar sequenciação de ADN com kit de sequenciação cíclica SequiTherm™ produzido por American Epicentre

Technologies Ltd., usando L1-C0R Model 4000L. Os iniciadores são iniciadores de sequência comum T7 e T3, o resultado da sequenciação de ADN corresponde ao desenho teórico.

Purificar o rSIFN-co, sequenciar os aminoácidos da terminação N, a sequência de aminoácidos da terminação N corresponde ao desenho experimental que é como se segue: N- Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu- (SEQ ID No. 14)

Construção, transformação, identificação e estabilidade hereditária do vetor de expressão

Construção e transformação do vetor de expressão

Vetor de expressão em E. Coli pHY-4 digerido (veja-se Figura 3) com Ndel para linearizar e subsequentemente digerir com Xbal. Executar eletroforese em gel de agarose a 1% e purificar o fragmento digerido por Ndel-Xbal de pHY-4 de 4,8 kb com kit QIAEX II porduzido por QIAGEN Germany Ltd.

Ao mesmo tempo, o plasmídeo pHY-4 é duplamente digerido com Ndel-Xbal. Executar eletroforese em gel de agarose a 1% e purificar o fragmento de 715 pb. Ligar o rSIFN-co e fragmentos de pHY-4 com DNA ligase T4 para construir o plasmídeo recombinante (veja-se Figura 4) . Transformar células competentes DH5a com o plasmídeo recombinante. Espalhar as células transformadas em placas de LB com Amp, cultivar a 37 °C durante a noite.

Rastreio da estirpe de clonagem positiva

Escolher aleatoriamente colónias de E. coli das placas de LB acima, rastrear as estirpes positivas contendo vetor recombinante por digestão com endonucleases e análise de PCR. Nomear um dos plasmídeo recombinantes positivos como pHY-5, e nomear a estirpe contendo o plasmídeo pHY-5 como PVIII. Amplificar e armazenar a estirpe positiva com glicerol a -80 °C.

Expressão elevada do gene de rSIFN-co em E. Coli.

No plasmídeo ρΗΥ-5, o gene de rSIFN-co está sob o controlo do promotor forte Pbad · Este promotor é positivamente e negativamente regulado pelo produto do gene araC. AraC é um regulador transcricional que forma um complexo com arabinose. Na ausência de arabinose, O dímero de AraC liga-se a 02 e li, formando uma ansa de 210 pb. Esta conformação leva a uma inibição completa da transcrição. Na presença de arabinose, o dímero é libertado de 02 e liga-se a li e I2 levando a transcrição. A ligação de arabinose desativa, reprime, e até mesmo ativa a transcrição do promotor PBad/· que estimula Pbad/· induzindo expressão elevada de rSIFN-co. O nível de expressão de rSIFN-co em PVIII é mais que 50% do total da proteína de E. coli.

Sumário O rSIFN-co é uma nova molécula de interferão artificialmente construída de acordo com os aminoácidos conservatives de interferões α humanos. Foi provado como um fármaco anti-hepatite eficaz. A fim de obter uma proteína rSIFN-co pura o suficiente, uma estirpe de E. coli recombinante estável que expressa altamente a proteína rSIFN-co foi construída.

Em primeiro lugar, de acordo com a sequência de aminoácidos de rSIFN-co publicada, um codão de E. Coli foi utilizado para sintetizar todo o ADNc de rSIFN-co. Este fragmento de ADN foi sequenciado, provando que a sequência do codão de 501 pb e sequência do codão de terminação TAA são válidas e idênticas ao desenho teocrático. A análise subsequente revelou que a sequência de aminoácidos da terminação N e aminoácido composto de rSIFN-co produzidos pela estirpe recombinante eram ambos idênticos à previsão. 0 ADNc de rSIFN-co foi clonado no vetor de expressão plasmidico de E. coli pHY-4 para construir o plasmideo recombinante pHY-5. A estirpe de E. Coli LMG194 foi ainda transformada com plasmideo pHY-4 para obter um transformante de expressão elevada de rSIFN-co estável. Este transformante foi cultivado durante 30 gerações. A hereditariedade do plasmideo recombinante pHY-5 em E. coli LMG194 foi normal e estável, e a expressão de rSIFN-co foi elevada e constante. E. Coli LMG194, que contém o plasmideo recombinante pHY-5, é, na verdade, uma estirpe de manipulação para expressão elevada ideal.

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J., E. F. Fritsch e T. Maniatis. Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed. CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. 1989. 10. Guzman, L. M et al: Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 1995, 177:4121-4130 .

SEQUÊNCIA DE ADNc DE rSIFN-CO CONCEBIDA DE ACORDO COM UTILIZAÇÃO DO CODÃO DE E. COLI E SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE rSIFN-co DEDUZIDA 5' II 21 31 41 51

+1MCD LPQT HSL GNR RALI LLA I ATGTGCGACC TGCCGCAGAC CCACTCCCTG GGTAACÇGTC GTGCTCTGAT CCTGCTGGCT TACACGCTGG ACGGCGTCTG ggtgagggac ccattggcag d acg AG ACTA GGACGACCGA 5’ 71 SI 91 101 111 +1QMR RISP FSC LKD RHDF G.FP 6] CAGATGCGTC GTATCTCCCC GTTCTCCTGC ctgaaagacc gtcacgactt cggtttcccg GTCTACGCAG CATAGAGGGG caagaggacg gactttctgg cagtgctgaa gccaaagggc 5’ 131 141 151 161 171

+ 1 QEE FDGN QFQ K A Q A I S V LHE 121 caggaagaat tcgacggtaa ccagttccag aaagctcagg ctatctccgt tctgcacgaa GTCCTTCTTA AGCTGCCATT GGTCAAGGTC tttcgagtcc gatagaggca agacgtgctt 5’ 191 201 211 221 231

Ί-1 MIQ QTFN LFS TKD SSAA WDE

181 ATQATCCAGC AGACCTTCAA CCTGTTCTCC ACCAAAGACT CCTCCGCTGC TTGGGACGAA TACTAGGTCG TCTGGAAGTT GGACAAGAGG TGGTTTCTGA GGAGGCGACG AACCCTGCTT 5' 251 261 271 281 291

+1 SLL EKFY TEL YQQ LNDL EAC 241 TCCCTGCTGG AAAAATTCTA CACCGAACTG TACCAGCAGC TGAACGACCT GGAAGCTTGC AGGGACGACC TTTTTAAGAT GTGGCTTGAC ATGGTCGTCG ACTTGCTGGA CCTTCGAACG 5' 311 321 331 341 351

+ 1VIQ EVGV EETPLMN VDSILA

301 GTTATCCAGG AAGTTGGTGT TGAAGAAACC CCGCTGATGA ACGTTGACTC CATCCTGGCT CAATAGGTCC TTCAACCACA ACTTCTTTGG GGCGACTACT TGCAACTGAG GTAGGACCGA 5' 371 381 391 401 411

+ 1VKKYFQRITLYLTEKKY SP C

361 GTTAAAAAAT ACTTCCAGCG TATCACCCTG TACCTGACCG AAAAAAAATA CTCCCCGTGC

CAA'ITJTITA TGAAGGTCGC ATAGTGGGAC ATGGACTGGC TTTTTTTTAT GAGGGGCACG 5' 431 441 451 461 471

+ 1AWEVVRAEIMRSFSLSTNL Q

421 GCTTGGGAAG TTGTTCGTGC TGAAATCATG CGTTCCTTCT CCCTGTCCAC CAACCTGCAG CGAACCCTTC AACAAGCACG ACTTTAGTAC GCAAGGAAGA GGGACAGGTG GTTGGACGTC 5' 491 501 + 1 ERL RRKE #

481 GAACGTCTGC GTCGTAAAGA ATAA CTTGCAGACG CAGCATTTCT TATT A sequência de nucleótidos é SEQ ID No. lea sequência de aminoácidos é SEQ ID No. 2 EXEMPLO 2

Separação e purificação de rSIFN-co 1. Fermentação

Inocular a estirpe recombinante em meio LB, agitando (200 rpm) a 37 °C durante a noite (aproximadamente 18 horas), em seguida, adicionar glicerol a 30% ao caldo de fermentação para obter uma concentração final de 15%, repartida em tubos de 1 ml e mantida a -20 °C como semente para produção.

Adicionar 1% da semente ao meio LB, agitando (200 rpm) a 37 °C durante a noite para aumentar a escala da semente, em seguida, adicionar a meios RM com um rácio de 10%, cultivando a 37 °C. Adicionar arabinose (solução a 20%) para 0,02% como um indutor quando OD600 atinge cerca de 2,0. 4 horas despois disto, parar o processo de cultura, recolher as bactérias por centrifugação, ressuspender o sedimento com tampão A, e manter a -20 °C durante a noite. Descongelar e quebrar as bactérias por homogeneização, em seguida centrifugar. Lavar o sedimento com tampão B, tampão C e água destilada para obter um corpo de inclusão relativamente puro. 2. Desnaturação e renaturação

Dissolver o corpo de inclusão em HC1 de guanidina (ou ureia) de 6 mol/1. A solução será um pouco turva. Centrifugar a uma velocidade de 10000 rpm. Determinar a concentração proteica do sobrenadante. Este sobrenadante é chamado "solução de desnaturação". Adicionar a solução de desnaturação a tampão de renaturação, e manter a concentração proteica final a 0,3 mg/ml. É melhor adicionar totalmente a solução desnaturada em três etapas em vez de em uma etapa. Manter a solução durante a noite a 4 °C. Mais tarde, dialisar 10 mol/1, 5 mol/1 de tampão PB e água destilada, em seguida ajustar o seu pH em 2 mol/1 HAc-NaAc. Deixar repousar, em seguida filtrar. 3. Purificação

Cromatografia de troca aniónica com POROS HS/M:

Coluna equivalente a HAc-NaAc a 20 mmol/1 (pH 5,0)

I

Carregar amostras a uma velocidade de 30 ml/min

I

Lavar com 20 CV de HAc-NaAc a 20 mmol/1 (pH 5,0) 4

Lavar com 5 CV de NaCl a 0,15 mol/1 + HAc-NaAc a 20 mmol/1 (pH 5,0)

I

Lavar com 3 CV de NaCl a 0,18 mol + HAc-NaAc a 20 mmol (pH 5,0)

I

Eluir proteína alvo com NaCl a 0,25 mol/1 + HAc-NaAc a 20 mmol/1 (pH 5,0)

Chelating Sepharose™ Fast Flow: Adicionar tampão PB de 0.2 mol/1 (pH 6,6) e NaCl de 4 mol/1 na solução de HS para ajustar o pH da solução a pH 6,0 e concentração de NaCl a 1 mol/1.

Coluna com tampão D I

Carregar a uma taxa de 1 ml/min I

Lavar com tampão E I

Lavar com tampão F I

Eluir com tampão G

Condensar a solução eluída por POROS HS/M. Por vezes, uma purificação por etapa de Sephacryl S-100 pode ser adicionada para cumprir os requisitos de pureza.

Nota:

Tampão A: Tris-HCl a 100 mmol/1, pH 7,5 - EDTA a 10 mmol/1 - NaCl a 100 mmol/1

Tampão B: Tris-HCl a 50 mmol/1, pH 7,5 - Ureia a 1 mol/1 - EDTA a 10 mmol/L - Triton X-100 a 0,5%

Tampão C: Tris-HCl a 50 mmol/1, pH 7,5 - Ureia a 2 mol/1 - EDTA a 10 mmol/L - Triton X-100 a 0,5%

Tampão D: NaCl a 1 mol/L NaCl---Na2HPC>4 a 50 mmol/1 (pH 5.5)

Tampão E: NaCl a 1 mol/L NaCl --- Na2HP04 a 50 mmol/1 (pH 5.0)

Tampão F: NaCl a 1 mol/L NaCl --- Na2HP04 a 50 mmol/1 (pH 4.0)

Tampão G: NaCl a 1 mol/L NaCl---Na2HPC>4 a 50 mmol/1 (pH 3.6)

Tampão de renaturação: Arginina a 0,5 mol/1 - Tris-HCl a 150 mmol/L, pH 7,5 - EDTA 0,2 mmol/1

Meio LB: 11

Triptona 10 g

Extratos de levadura 5 g

NaCl 10 g

Meio RM: 1 1

Caseína 20 g

MgCl 1 mmol/1 (0,203 g)

Na2HP04 4 g; KH2P04 3 g,

NaCl 0,5 g NH4C1 1 g

Após purificação, o tampão foi mudado para PBS (pH 7,0) juntamente com a etapa de condensação por POROS HS/M. Esta é chamada a "Solução-mãe de Proteína". Pode ser utilizada diretamente na preparação de injeções ou pulverizadores, ou armazenada a 2-8 °C. Fórmula para injeção:

Solução Pó liofilizado

Solução de rSIFN-co 34,5 pg/ml 34,5 pg/ml PB (pH 7,0) 25 mmol/1 10 mmol/1

Glicina ------— 0,4 mol/1

NaCl 0,1 mol/1 ------—

Para pulverizar: EDTA 0,01%

Tween 80 0,05%

Citrato trisódico 10 mmol/1

Glicerol 1,26%

Cloreto de sódio 0,03%

Fenilmetanol 0,5% HSA 0,1% rSIFN-co 10 pg/ml

PROCESSO DE CONTROLO DE QUALIDADE

Durante a purificação, testes para o teor proteico, pureza proteica, atividade especifica e pirogénio são realizados depois de cada etapa. Quando a solução-mãe é obtida, todos os testes listados na tabela são feitos um após o outro. A qualidade do produto é controlada de acordo com "Chinese Requirements for Biologies." 1. Solução da proteína original

EXEMPLO 3

Estabilidade do pó liofilizado de injeção de interferão super composto recombinante

As experiências de estabilidade foram levadas a cabo com amostras de pó liofilizado de injeção de interferão super composto recombinante (rSIFN-co) em duas especificações e três lotes. As experiências começaram em abril de 2000. 1. Origem das amostras

As amostras foram fornecidas por Sichuan Huiyang Lifeengineering Ltd., Província de Sichuan. Lote: 990101-03, 990101-05, 990102-03, 990102-05, 990103-03, 990103-05 2. Especificações das amostras

Cada amostra nesta experiência deveria estar em conformidade com os requisitos na tabela abaixo.

Tabela 1 Padrão de amostras na experiência

3. Conteúdo experimental

Amostras de teste a 2~8 °C: As amostras de teste foram colocadas num refrigerador a 2~8 °C, em seguida os itens acima destas amostras foram respetivamente testados no Io, 3o, 6o, 9o, 12°, 18°, 24°, 30°, 36° mês. Os resultados foram registados.

Amostras de teste a 25 °C: As amostras de teste foram colocadas num termostato a 25 °C, em seguida os itens acima destas amostras foram respetivamente testados no Io, 3o, 6o, 9o, 12°, 18°, 24°, 30° mês. Os resultados foram registados.

Amostras de teste a 37 °C: As amostras de teste foram colocadas num termostato a 37 °C, em seguida os itens acima destas amostras foram respetivamente testados no Io, 3o, 6o, 9o, 12°, 18°, 24° mês. Os resultados foram registados. 4. Resultados e conclusão 1) A 37 °C, de acordo com os dados recolhidos em pontos designados durante o teste e comparados com os dados antes do teste, a potência começou a decrescer a partir do 6o mês e as alterações nos três lotes foram semelhantes. 0 aparecimento de outros itens não apresentou alterações. 2) A 25 °C, de acordo com os dados recolhidos em pontos designados durante o teste e comparados com os dados antes do teste, a potência só apresentou uma pequena alteração, e as alterações nos três lotes foram semelhantes. 0 aparecimento de outros itens não apresentou alterações. 3) A 2-8 °C, de acordo com os dados recolhidos em pontos designados durante o teste e comparados com os dados antes do teste, a potência foi estável no três lotes. 0 aparecimento de outros itens também não apresentou alterações.

Em conclusão, sugere-se que o pó liofilizado de interferão super composto recombinante para injeção deve ser melhor armazenado e transportado a baixas temperaturas. Na ausência de tais condições, o produto também pode ser armazenado por curtos períodos (isto é, 3 meses), à temperatura ambiente. EXEMPLO 3,5

Fluxograma da produção de rSIFN-co 1. Produção 1.1 Fermentação

Utilizar mistura de LB + M9 como meio de cultura. A quantidade de inoculo será 1,5%. Agitar a OD600 = 0,4 (cerca de 3,5 horas) a 32 °C, em seguida subir a temperatura até 42 °C. Continuar a agitação por outras 6 horas, a expressão de rSIFN-co atingirá o nível máximo. 0 exame sob varrimento do gel resultante da SDS-PAGE mostra que o nível de expressão é até 57%, o qual é o padrão mais elevado na China. 1.2 Purificação

Centrifugar a solução bacteriana para recolher o sedimento bacteriano I

Lavar com soro fisiológico duas (2) vezes 4

Adicionar tampão (Tris-HCl a 50 mM, EDTA a 1 mM, NaCl a 100 mM, Triton X-100 a 1%, Urea a 1-2 M), sonicação para romper as células bacterianas durante 20-30 minutos I

Precipitar a solução tampão e lavar algumas vezes até que a cor se torne branco puro I

Usar HC1 de guanidina a 7 M para desnaturar I

Diluir o HC1 de guanidina para renaturar, passar a noite 4

Usar Sephadex G25 para dessalinizar 4

Usar NaCl a 0,1 M para aplicar CM-Sepharose 4

Fazer eluição etapa a etapa para recolher o pico ativo 4

Depois de o pico ativo ser dessalinizado, aplicar a uma coluna de HPLC positivamente carregada 4

Usas NaCl a 0,1 M para fazer a eluição etapa a etapa, recolher o pico ativo que é o produto de rSIFN-co 4

Adicionar veiculo de proteção e agente liofilizante Separar os materiais liofilizados (rSFIN-co) A pureza do produto (rSIFN-co) deste procedimento de produção é mostrada a 95% sob o teste de SDS-PAGE onde a massa molecular é 14,5 kDa. A HPLC de fase reversa mostra um pico único e a pureza é de até 97%. A sua atividade especifica é até 1 x 109 Ul/mg de proteína. 1.3 Embalagem e inspeção

Após purificação por HPLC, albumina sérica humana a 2%, sacarose a 1% e glucose a 1% são adicionadas à co-rSIFN. Em seguida, esta é separada e liofilizada na amostra de injeção. Quando testado sob o sistema de inspeção Wish-VVS, o resultado foi de 4,5 x 108 UI. Quando testado com inspeção asséptica e inspeção pirogénica sob o requisito padrão da China, os resultados foram negativos. Este resultado cumpre os requisitos para injeção IV. 2. Contolo de qualidade 2.1 Características biológicas (1) Quando utilizando LB + M9 para cultivar bactérias, as características deveriam corresponder às características de bactérias E. coli. Nenhumas outras bactérias foram detetadas. (2) Quando espalhadas para coloração Gram e inspecionadas sob um microscópio, é uma bactéria gram-negativa. (3) A reação a antibióticos é a mesma que aquela das bactérias originais. (4) A inspeção por microscopia eletrónica mostra características típicas de bactérias E. coli. Nenhum micoplasma, esporos de vírus ou outros micropoluentes foram detetados. (5) 0 teste de reação bioquímica mostra características de bactérias E. coli. 2.2 Controlo de qualidade de expressão do interferão (1) A expressão do interferão (cultivado numa plataforma de agitação) corresponde à quantidade de expressão em bactérias de entrada originais. (2) Quando testado com o soro anti-interferão, uma reação é apresentada. (3) Inspeção de plasmídeo: A digestão de restrição correspondeu ao plasmídeo original. 2.3 Produto da estirpe bacteriana 0 produto da estirpe bacteriana denota o espécime da estirpe bacteriana original que foi produzido a partir dos procedimentos mostrados em 1.2. 0 produto da estirpe bacteriana deveria ser inspecionado como segue para se certificar de que não há derivação: Usar LB para semear em placa 2-3 partes e cultivar. Separe e levar 5-10 grupos bacterianos para o teste de expressão do interferão. Repetir o teste pelo menos duas (2) vezes. Utilizar apenas aquele que apresente a maior % para ser o produto da estirpe bacteriana. 2.4 Inoculo O inoculo denota o produto das estirpes bacterianas escolhido após fermentação. A quantidade, tempo de cultivo e valor de OD mais apropriado do inoculo podem ser decididos de acordo com a estirpe bacteriana. Um procedimento bacteriano anti-poluído deveria aplicar-se para qualquer inoculo a ser produzido. 2.5 Crescimento da estirpe bacteriana O crescimento da estirpe bacteriana seria feito num ambiente de uma sala livre de bactérias, onde mais de uma bactéria cresce na mesma sala. 0 mesmo meio de cultura será usado tanto para a estirpe bacteriana como para o inoculo. 0 utilizado em rSIFN-co é LB. 2.6 Fermentação (1) A fermentação apenas ocorre numa sala de fermentação limpa com um único ambiente de fermentação bacteriana. (2) A lavagem do recipiente e tubo de fermentação é feita duas vezes, antes e depois da inserção do meio de cultura. Em seguida, o recipiente deveria ser congelado para atingir a temperatura apropriada para o inoculo. (3) Evitar a utilização de antibióticos os quais podem afetar o crescimento celular no meio de cultura. (4) Os parâmetros de fermentação tais como a temperatura, valor de pH, oxigénio dissolvido e tempo necessário poderiam variar de acordo com diferentes tipos de estirpes bacterianas. 2.7 Recolha de bactérias (1) Centrifugar a solução bacteriana para recolher as bactérias ou usar um outro método Todos os aparelhos deveriam ser limpos antes e depois da operação A solução residual deveria ser drenada após o precedimento de limpeza. (2) As bactérias deveriam ser mantidas a 4-8 °C se são para serem dividas dentro de 24 horas. De outra forma, deveriam ser mantidas a -30 °C. Aquelas que são mantidas sob tais condições podem ser usadas dentro de 6 meses. 2.8 Lise de células bacterianas (1) Usar solução tampão apropriada para equilibrar a estirpe bacteriana. A lise celular pode ser feita por métodos físicos, químicos ou biológicos. Usas centrifugação para precipitar as bactérias e aplicar as soluções de limpeza. (2) se o método químico é utilizado para dividir as células, não deveriam ser utilizadas soluções prejudiciais aos seres humanos. 2.9 Purificação (1) Purificação livrar-se-á da maioria dos conteúdos não-interferão. No processo de purificação, nenhuns materiais tóxicos deveriam ser encontrados se elementos extra são adicionados. (2) Se se utilizar cromatografia de afinidade de anticorpo para purificação, deveria haver uma indicação da origem e grau de pureza. Além disso, a inspeção de IgG de pequena qualidade deveria ser realizada. (3) Durante o processo de purificação, a eliminação de pirogénio é crítica. Todos os aparelhos deveriam ser verificados para eliminar esta interferência. (4) 0 interferão altamente concentrado é conhecido como "produto intermediário". Após a inspeção e testes, adicionar albumina para elevar a concentração até 2%, que é agora conhecido como "produto intermediário de albumina". Após exame e testes, deveria ser mantido a -30 °C e nunca descongelado antes da utilização. Este produto deveria ser utilizado dentro de 6 meses. (5) A albumina que é usada neste processo deveria também satisfazer os testes e requisitos, tais como: negatividade sob inspeção de RBSAG e uma indicação do rácio entre monómero, dimero e polímero. 2.10 Produção no tubo do produto (1) Filtração: Usar membrana de 0,22 μ para filtrar as bactérias. O produto deveria ser manuseado com técnicas asséticas. As amostras deveriam ser tomadas para testar o valor do interferão. (2) Diluição: Diluir o produto intermediário de albumina com diluente a 2%. Nenhum conservante deveria ser adicionado. 0 produto pode ser liofilizado após a inspeção assética e inspeção pirogénica. 2.11 Liofilização A liofilização não deveria afetar a atividade do interferão, e o teor de água do dito liofilizado será mantido. 2.12 Inspeção

Existem dois tipos de rSIFN-co feitos. Um é para injeção e o outro para utilização tópica. As especificações para os dois são diferentes. Existem produtos intermediários e produtos finais de cada tipo. No tipo para injeção, os produtos intermediários incluem interferão purificado, produto intermediário de albumina e produto intermediário de albumina livre de bactérias. 0 produto final do tipo para injeção denotará apenas produto liofilizado. 0 produto intermediário no tipo tópico denota apenas interferão purificado. 0 produto final do tipo tópico denota apenas produtos liofilizados com liquido embalado em separado. 2.13 Embalagem

Existem diferentes embalagens para o tipo para injeção e o tipo tópico. 2.14 Armazenamento 0 produto deveria ser mantido a 4 °C. A solução de purificação não deveria ser armazenada num estado congelado. 2.15 Expiração 0 prazo de validade é de dois (2) anos após o procedimento de liofilização para produtos liofilizados. 0 prazo de validade é de 6 meses após a embalagem individual para produtos liquidificados. EXEMPLO 4 rSIFN-co inibe a duplicação de ADN de HBV e a secreção de HBsAg e HBeAg.

Materiais

Solvente e método de dispersão: Adicionar 1 ml de solução salina a cada frasco, dissolver e misturar com meio de cultura MEM a diferentes concentrações. Misturar no lugar. Fármacos de controlo: IFN-a2b (Intrão A) como pó liofilizado, comprado em Schering Plough. 3 x 105 U cada, misturar até 3 x 106 Ul/ml com meio de cultura; Infergen® (solução líquida), comprada em Amgen, 9 pg, 0,3 ml cada, igualar a 9 x 106 UI, e misturar com 9 x 106 Ul/ml de meio de cultura, conservar a 4 °C; célula 2.2.15: linha celular 2.2.15 de hepatoma (Hep G2) clonada e transferida por ADN de HBV, construída por Mount Sinai Medical Center.

Reagente: pó MEM, Gibco American Ltd. Soro sanguíneo fetal bovino, HycloneLab American Ltd. G-418(Geneticin); dispersante MEM, Gibco American Ltd.; L-Glutamilo, importado e embalado por JING KE Chemical Ltd.; caixa de radioimunoensaio de fase sólida para HBsAg e HBeAg, Northward Reagent Institute of Chinese Isotope Ltd.; Biograncetina, Northern China Medicine; e Lipofectin, Gibco American Ltd.

Bens e equipamentos experimentais: garrafa de cultura, Denmark Tunclon”; placas de cultura de 24 poços e 96 poços, Corning American Ltd.; caixa de incubação com dióxido de carbono, Shel-Lab American Ltd.; 100 ml de meio de cultura MEM: soro sanguíneo bovino fetal a 10%, 1% de glutamilo a 3%, 380 pg/ml de G414, 50 U/ml de biograncetina. Método :

Cultura de células 2.2.15: Adicionou-se enzima pancreática a 0,25% à caixa de cultura completa com células 2.2.15, digerir a 37 °C durante 3 minutos, e adicionar o meio de cultura para parar a digestão e perturbá-la para dispersão das células, reproduzir com rácio de 1:3. Atingirão o crescimento completo em 10 dias.

Teste de toxicidade: Definir grupos de diferentes concentrações e um grupo controlo no qual as células não são submetidas ao medicamento. Digerir as células, e dispensar para uma solução a 100 000 células/ml. Inocular numa placa de cultura de 96 poços, 200 μΐ cada poço, cultivar a 37 °C durante 24 h com 5% de C02. Testar enquanto a camada celular simples cresce.

Dispensar rSIFN-co para uma solução a 1,8 x 107 Ul/ml, em seguida preparar uma série de soluções diluídas em gradientes de duas vezes. Adicionar numa placa de cultura de 96 poços, 3 poços por concentração. Mudar a solução a cada 4 dias. Testar efeito citopático por microscopia após 8 dias. Destruir completamento como 4, 75% como 3, 50% como 2, 25% como 1, zero como 0. Calcular a lesão celular média e taxa de inibição das diferentes concentrações. Calcular TC5o e TC0 de acordo com o método de Reed Muench.

A = log > 50% da concentração do medicamento, B = log < 50% da concentração do medicamento, C = log do pó de diluição.

Teste de inibição para HBeAg e HBsAg: Separar em grupos de contraste de HBeAg e HBsAg positivos e negativos, grupo de contraste celular e grupos de concentração do medicamento. Inocular 700 000 células/ml de células 2.2.15 numa placa de cultura de 6 poços, 3 ml cada poço, cultivar a 37 °C durante 24 h com 5% de C02, em seguida preparar 5 soluções diluídas em gradiente de 3 vezes como o grau (Preparar 5 soluções, cada com uma concentração proteica diferente A concentração da Solução 2 é 3 vezes menor que a da Solução 1, a concentração da Solução 3 é 3 vezes menor que a da Solução 2, etc.) 4,5 x 106 Ul/ml, 1,5 x 106 Ul/ml, 0,5 x 106 Ul/ml, 0,17 x 106 Ul/ml, e 0,056 x 106 Ul/ml, 1 poço por concentração, cultivar a 37 °C durante 24 h com 5% de C02. Mudar as soluções a cada 4 dias usando a mesma solução. Recolher todo o meio de cultura no 8o dia.

Conservar a -20 °C Repetir o teste 3 vezes para estimar HBsAg e HBeAg com a caixa de radioimunensaio de fase sólida (Northward Reagent Institute of Chinese Isotope Ltd.). Estimar o valor de cpm de cada poço com uma máquina de contabilidade γ. Cálculo dos efeitos: Calcular o valor médio de cpm dos grupos de contraste e grupos de diferentes concentrações e os seus desvios padrões, valor P/N tal como taxa de inibição, IC50 e IS.

D

A = cpm do grupo controlo; B = cpm do grupo de teste; 2) Contar a concentração de metade da eficiência do medicamento

A = log > 50% da concentração do medicamento, B = log < 50% da concentração do medicamento, C = log do pó de diluição 3) IS da conformação do interespaço alterou efeito de rSIFN-co em HBsAg e HBeAg na cultura de células 2.2.15:

4) Estimar as diferenças em cpm de cada grau de diluição do grupo controlo usando um teste t de Student

Southern blot: (1) Extracto de ADN de HBV em célula 2.2.15: cultivar célula 8 dias. Sugar o meio de cultura (separar as células do meio de cultura por meio de drenagem do meio de cultura) . Adicionar tampão de lise para romper as células, em seguida, extrair 2 vezes com uma mistura de fenol, clorofórmio e álcool isoamilico (1:1:1), centrifugar a 10 000 g. Recolher o sobrenadante adicionando álcool anidro para depositar o ácido nucleico. Extrair a vácuo, redissolver em 20 μΐ de tampão TE. (2) Eletroforese: Adicionar tampão de carga 6XDNA, eletroforese em gel de agarose a 1,5%, IV/cm, a pressão fixa durante 14-18 h. (3) Desnaturação e hibridização: respetivamente mergulhar o gel em HC1, tampão de desnaturação e tampão de neutralização. (4) Transmembrana: Fazer uma transferência ordenada de ADN para membrana Hybond-N. Cozer, hibridizar e expor com hibridização dot blot. Examinar e analisar a densidade relativa com software gel-pro. Calcular a taxa de inibição e IC50 ·

Resultados

Os resultados das Tabelas 4.1, 4.2 e 4.3 mostram: Após a cultura do expoente de concentração inócua máximo durante 8 dias com células 2.2.15, o máximo é 9, 0 ± 0 x 106 Ul/ml, a taxa de inibição média máxima da concentração inócua máxima de rSIFN-co para HBeAg é 46,0 ± 5,25% (P < 0,001), IC50 é 4,54 ± 1,32 x 105 Ul/ml, IS é 3,96; taxa para HBsAg é 44,8 ± 6,6%, IC50 é 6,49 ± 0,42 x 106 Ul/ml, IS é 2,77. Isto mostra que a rSIFN-co pode inibir significativamente a atividade de HBeAg e HBsAg, mas que o IFN do grupo de contraste e Infergen® não podem. Também foi provado em clinica que o rSIFN-co pode reduzir HBeAg e HBsAg ou devolvê-los a níveis normais.

EXEMPLO 5 Preparação de rSIFN-co

Preparação de injeção liofilizada Pó liofilizado

Solução-mãe de rSIFN-co 34,5 pg/ml PB (pH 7,0) 10 mmol/1

Glicina 0,4 mol Técnica de preparação: Pesar materiais de acordo com a receita. Dissolver com água estéril e apirogénea. Filtrar através de uma membrana de 0,22 pm para remover bactérias, conservar a 6-10 °C. Encher em frascos depois de confirmar que estão estéreis e apirogéneos, 0,3 ml/frasco ou 0,5 ml/frasco, e liofilizar num liofilizador.

Preparação de injeção liquida

Solução

Solução-mãe de rSIFN-co 34,5 pg/ml PB (pH 7,0) 25 mmol

NaCl 0,1 mol

Preparação: Pesar materiais de acordo com a receita.

Adicionar até ao nível desejado com água estéril e apirogénea. Filtrar através de uma membrana de 0,22 pm para remover bactérias, conservar a 6-10 °C. Encher em frasco hermético depois de confirmar que está estéril e apirogéneo a 0,3 ml/frasco ou 0,5 ml/frasco. Armazenar a 2-10 °C e proteger da luz. EXEMPLO 6

Toxicidade aguda de rSIFN-co

Tratar ratinhos com dose grandes (150 pg/kg, igual a 1000 vezes a dose normal por quilo usada no tratamento de pacientes adultos) de rSIFN-co uma vez por injeção intramuscular. Em seguida, observar e registar as suas mortes e reações tóxicas. Os resultados mostram que: 24 horas depois da injeção, nenhuma reação anormal foi registada. Os órgãos dos animais que foram selecionados para morrer também não tinham sinais de alterações anormais. Aqueles ratinhos remanescentes foram todos mantidos vivos e estavam normais após duas semanas. Os pesos dos ratinhos no grupo experimental e grupo controlo aumentaram todos, e o rácio de aumento não mostrou uma diferença óbvia entre os dois grupos (P > 0,05), de acordo com os seus pesos no décimo quarto dia. Não foram vistas alterações anormais dos principais órgãos daqueles ratinhos após duas semanas. 1. Material experimental 1.1 Animais 40 ratinhos adultos saudáveis, pesando 18-22 g, metade machos e metade fêmeas, qualificados pelo centro de controlo de animais de experimentação de Sichuan. 1.2 Medicamentos

Solução esterilizada de rSIFN-co (fornecido por Sichuan Huiyang Life-engineering Ltd.), 0,15 mg/ml, Lote: 981201 rSIFN-co foi administrada i.m. em solução salina. 2. Método

Separar os 40 ratinhos em dois grupos aleatoriamente, um para o medicamento experimental e outro para controlo. Injetar os medicamentos ou solução salina no mesmo rácio (0,1 ml/10 g) através do músculo a cada ratinho, de acordo com o grupo ao qual pertence. (150 pg/kg de rSIFN-co para o grupo experimental; e solução salina para o grupo controlo). Após a injeção, observar e registrar a toxicidade aguda mostrada nos ratinhos. Matar metade dos ratinhos (cada metade machos e fêmeas) para verificar se houve quaisquer alterações patológicas anormais nos seus órgãos principais, tais como coração, baço, fígado, pulmão, rim, glândula adenal, estômago, duodeno, etc., após 24 horas. Aqueles que permanecem são mantidos e observados até ao décimo quarto dia. Pesar todos os ratos, matá-los, e, em seguida, observar a aparência dos órgãos listados acima para ver se existem quaisquer anomalias. Tomar tecido patológico e examiná-lo, usando o exame para avaliar a diferença nos aumentos de peso nos dois grupos. 3. Resultados

Os resultados mostram que não foi observada toxicidade aguda depois de todos os ratinhos terem sido tratados com rSIFN-co i.m. com 150 pg/kg uma vez, igual a 1000 vezes a dose normal por quilo usada no tratamento de pacientes adultos. Nos 14 dias após a injeção, todos os ratinhos viveram bem. Comeram, beberam, exercitam-se, e excretaram normalmente e mostraram condições normais do pelo. Nenhum deles morreu. A observação dos órgãos principais dos ratinhos selecionados aleatoriamente não mostra alterações anormais 24 horas após a injeção. 14 dias após a injeção, todos os ratinhos restantes foram mortos. As necropsias também não mostraram alterações. Os pesos dos ratinhos nos dois grupos aumentaram todos, mas nenhuma diferença óbvia foi vista quando acedida com um método estatístico (p > 0,05). Veja-se a Tabela 6.1:

Tabela 6.1 Influência nos pesos dos ratinhos após injeção de rSIFN-co

Grupo Dose Animal Pesos antes Pesos depois Valor da injeção da injeção aumentado dos ____(g)__(g)_pesos (g)_

Controlo 0_2_0_19,8 ± 1,7 30,8 ± 2,8 11,0 ± 2,9_ rSIFN-co| 150 \20 |l9, 4 ± 1,7 132,1 ± 3,3 112,7 ± 4,3 4. Conclusão

Sob as condições desta experiência, não houve reações tóxicas em nenhum dos ratinhos após a injeção de rSIFN-co com 150 pg/kg. A conclusão que pode ser alcançada é que a dose máxima tolerável i.m. em ratinhos é 150 pg/kg, a qual é igual a 1000 vezes a dose normal por quilo usada no tratamento de pacientes adultos. EXEMPLO 7

Os efeitos clínicos do interferão super composto recombinante (rSIFN-co) O interferon super composto recombinante (rSIFN-co) é uma invenção para a terapia de doenças virais, especialmente para hepatite. Enquanto isso, pode inibir a atividade de vírus EB, VSV, vírus herpes simplex, coronavírus, vírus do sarampo, et al. Usando um sistema de células Wish/VSV como o ensaio para a atividade antiviral, os resultados mostraram que: o outro rIFN foi 0,9 x 108 Ul/mg, Intrão A foi 2,0 x 108 Ul/mg e rSIFN-co foi 9 x 108 Ul/mg. A atividade antiviral de rSIFN-co é muito maior do que a dos dois anteriores.

Sob a permissão da State Food and Drug Administration (SFDA), República Popular da China, os ensaios clínicos foram realizados no West China Hospital, Universidade de Sichuan, no segundo Hospital da Universidade de Medicina de Chongqing, no primeiro hospital da Faculdade de Medicina, Universidade de Zhejiang, desde fevereiro de 2003. O tratamento clínico que se foca na hepatite B é realizado sob a orientação do ensaio multicêntrico, duplo-cego, aleatório. 0 IFN-alb foi utilizado como controlo, e os resultados preliminares mostraram o seguinte: O efeito de rSIFN-co em comparação com IFN-alb no tratamento de hepatite B ativa crónica 1. Critérios de seleção de pacientes:

Os critérios 1-4 são eficaz tanto para o tratamento com rSIFN-co (9 pg) como com IFN-alb (5MU, 50 pg) e os critérios 1-5 são para o tratamento com rSIFN-co (15 pg) 1) . Idade: 18-65 2) . Teste positivo a HBsAg ao longo dos últimos seis meses, teste positivo a HBeAg, ensaio de PCR, cópias ADN de HBV > 101 2 3 4/ml 3) . ALT > duas vezes o valor normal 4) . Nunca ter recebido um tratamento com IFN; ou ter recebido o tratamento com lamivudina, mas este falhou ou houve recidiva 5) . Ter recebido uma vez outros tratamentos com IFNs (3MU ou 5MU) há seis meses, seguindo a norma da SFDA, mas estes falharam ou houve recidiva 1

Avaliação dos efeitos:

Em referência às recomendações do Tenth China National Committee of Virus Hepatitis and Hepatopathy, os efeitos foram divididos em três graus, de acordo com os testes do nível de ALT, ADN de HBV e HBeAg. 2

Resposta: nível normal de ALT, ADN de HBV negativo, HBeAg negativo 3

Resposta parcial: nível normal de ALT, ADN de HBV ou HBeAg negativo 4

Nenhuma resposta: ALT, ADN de HBV e HBeAg inalterados Os grupos de resposta e resposta parcial foram considerados casos eficazes. 3. Resultados do ensaio clínico:

Grupo A: tratamento com rSIFN-co (9 pg)

Grupo B: tratamento com IFN-alb (5MU, 50 pg)

Transferência Transferência Transferência Taxa de Taxa de de HBsAg para de HBeAg para de ADN de HBV recuperação

Periodo grupo Medicamento casos eficácia taxa taxa para taxa da função negativa negativa negativa hepática rSIFN-co (9 46, 88 A 32 9,38 (3) 28,12 (9) 37,50 (12) 84,38 (27) 8-12__pg)___(15)_____ semanas IFN-alb 21,88 B 32 0,00 (0) 9,38 (3) 15,62 (5) 56,25 (18) ___(5MU, 50 pg)___(_7J_____ rSIFN-co (9 54,69 A 64 7,81 (5) 25,00 (16) 34,38 (22) 90,62 (58) 16-24__pg)___(35)_____ semanas IFN-alb 25,00 B 64 0,00 (0) 9,38 (6) 18,75 (12) 78,13 (50) _|_ (5MU, 50 pg) |_ (16) |_|_|_|_

No Grupo C, os casos foram de tratamentos anteriores de hepatite B ativa crónica com outros IFNs (3MU ou 5MU) que falharam ou recidivaram e, em seguida, foram tratados com rSIFN-co (15 pg), injeção subcutânea, a cada dia, durante 24 semanas. Os casos totais foram 13. Após 12 semanas de tratamento, 7 dos 13 (53,85%) foram eficazes, em 3 dos 13 (23,08%), HBeAg foi transferido para negativo; em 7 dos 13 (53,85%), ADN de HBV foi transferido para negativo; em 11 dos 13 (84,62%), funções hepáticas recuperadas para o normal. 4. Os efeitos secundários de rSIFN-co em comparação com IFN-alb no tratamento

Os efeitos secundários de IFN incluem febre, náusea, mialgia, anorexia, perda de cabelo, leucopenia e trombocitopenia, etc. A dose máxima de IFN-alb é 5MIU por tempo; a dose de rotina é de 3 MIU. Quando tomada a dose de rotina, 90% dos pacientes têm efeitos colaterais de grau I-II (padrão da OMS). Tiveram febre inferior a 38 °C, náusea, mialgia, anorexia, etc. Quando tomada a dose máxima, a taxa de efeitos secundários não subiu de forma óbvia, mas foram mais graves. A dose máxima de rSIFN-co é 24 pg, injeção subcutânea, a cada dia, durante 3 meses. A dose de rotina é de 9 pg. Quando foram utilizadas doses de rotina, menos de 50% dos pacientes tiveram efeitos secundários de grau I-II (padrão da OMS), incluindo febre abaixo de 38 °C, náusea, mialgia, anorexia, leucopenia e trombocitopenia ligeira. Com a dosagem máxima, cerca de 50% dos pacientes sofreu de leucopenia e trombocitopenia após usar rSIFN-co um mês, mas esses efeitos secundários desapareceram após a interrupção do tratamento por uma semana. Este é seguro para utilização continuada.

As observações de hepatite C tratada com rSIFN-co 1. Critérios de seleção de pacientes 1) Idade: 18-65

2) Positivo a anticorpos para HCV 3) ALT >1,5 vezes ao valor normal há mais de 6 meses 2. Avaliação dos efeitos:

Em referência ao padrão de Infergen® para tratamento de hepatite C e de acordo com o nível de ALT e teste de ARN de HCV, dividiu-se os efeitos em três graus:

Resposta: nível normal de ALT, ARN de HBV negativo Resposta parcial: nível normal de ALT, ARN de HBV inalterado

Nenhuma resposta: ALT e ARN de HCV inalterados 3. Efeitos em clinica 0 ensaio clínico foi feito em simultâneo com o tratamento de hepatite B. 46 casos receberam o tratamento, 9 pg de cada vez, injeção subcutânea, cada dia durante 24 semanas. Após o tratamento, 26 de 46 (56,52%) têm efeitos óbvios, em 12 dos 46 (26, 08%), ARN de HBV foi transferido para negativo, em 26 dos 46 (56,52%), funções hepáticas recuperadas para o normal. EXEMPLO 8

Pulverizador de interferão super composto recombinante

Componente principal: Interferão super composto recombinante Caracteristica: Líquido, material não insolúvel

Farmacologia: O interferão super composto recombinante tem um amplo espectro de atividade antiviral. Os seus efeitos são 5-20 vezes maiores que o daqueles interferões (IFNs) que estão disponíveis no mercado. Consegue inibir o crescimento de coronavírus em culturas celulares. O mecanismo é a interrupção da reação de combinação entre o IFN e o recetor correspondente, e indução da expressão de enzima de síntese 2'5'-A, proteína quinase R na célula alvo, inibindo, deste modo, a expressão da proteína virai. O IFN pode induzir a expressão de várias proteínas anti-virais para inibir a reprodução de proteínas virais, melhorar a função das células natural killer (NK) e de outras funções reguladoras imunitárias, e inibir a invasão de vírus.

Toxicidade aguda: Todos os ratinhos estão vivos após a injeção subcutânea da dose máxima (1000 vezes a dose humana), não se observou LD50.

Indicação: Prevenção de Síndrome Respiratória Aguda

Grave Dosagem e Administração: pulverizar ambas as narinas e garganta, três vezes ao dia.

Reações adversas: Não foram reportadas reações adversas do pulverizador de rIFN. Não induziu alergia. Se a estimulação é ocasional, a reação adversa gastrointestinal é peguena, e nenhuma outra reação adversa óbvia foi observada durante o tratamento, é seguro para utilização continuada. Todas as reações se resolverão.

Aviso: Pacientes alérgicos a alFN e produções de E. Coli não podem utilizar este produto.

Precauções: Antes da primeira utilização, pulverize duas vezes para expelir o ar. Se houver qualquer material de precipitação turvo, se o produto está caducado, ou há material no frasco, não usá-lo.

Utilização pediátrica: Não está clara.

Utilização geriátrica: Não está clara.

Mulheres em lactação ou grávidas: Proibido Interações com fármacos: Não está clara.

Sobredose: Excesso de 150 ug (7,5 x 107 UI) de cada vez, febre, anorexia, mialgia, calafrio ocorrerão mais frequentemente. Não há uma reação adversa grave. Fornecido: 1 pulverizador/pack, 20 ug (1 x 107 IU)/3 ml Armazenamento: Armazenar a 4-8 °C. Não congelar, proteger da luz.

Período efetivo: Aproximadamente um ano

Fabrico: Fabricado por Sichuan Huiyang life-engineering

Ltd.

Morada: 8 Yusa Road, Room 902, Building A Chengdu, 610017

Sichuan, P.R. China Exemplo 9-A

Efeito in vitro de um novo estilo de interferão composto recombinante em coronavirus associado a SARS

Amostra fornecida por: Huiyang Life Engineering Lt

Company, Província de Sichuan

Experimentador: Molecular Biology Department, microorganism and epidemiology Institute, Academy of Military Medical Science

Dados originais: Preservados no arquivo do Molecular

Biology Department, microorganism and epidemiology Institute, Academy of Military Medical Science 1. Materiais

Medicamento: Novo tipo de interferão composto recombinante, 9 pg cada, fornecido por Huiyang Life Engineering Lt Company, Província de Sichuan, Número do lote: 20020501. Células Vero E6, fornecidas por Molecular Biology Department of Microorganism and Epidemiology Institute, Academy of Military Medical Science.

Virus: Coronavirus associado a SARS, BJ-01, fornecido por Molecular Biology Department of Microorganism and Epidemiology Institute, Academy of Military Medical Science .

Meio celular: DMEM suplementado com FBS a 10%. 2. Condição O vírus foi medido num laboratório de nível 3 de biossegurança. 3. Método

Ensaio de CPE (efeito citopático) de TCID50 : 10 0 μΐ de células Vero E6 foram semeadas em placas de 96 poços a 2 x 104 células por poço. Após 24 h de incubação a 37 °C, células Vero E6 em monocamada foram tratadas com 9 níveis de diluição de coronavírus associado a SARS diluindo 10 vezes, 4 poços por diluição. As células foram incubadas a 37 °C e 5% de C02. O CPE (efeito citopático) foi examinado diariamente por microscopia. CPE menor que 25% foi determinado como +, 26-50% como ++, 51-75% como +++, 76-100% como ++++. O CPE foi registado. Em seguida, a TCID50 foi calculada pelo método de Reed-Muench. Citotoxicidade do medicamento: Células Vero E6 foram inoculadas em placas de 96 poços a 2 x 104 (100 ul) células por poço. Após 24 h de incubação a 37 °C, as células crescem em monocamada. O medicamento foi diluído em 36, 18, 9, 4,5, 2,25 pg/ml (concentração final) e adicionado em poços, por 4 poços cada. As células normais foram definidas como grupo controlo. O CPE do grupo do medicamento foi observado diariamente durante um período de 5 dias, e, em seguida, a concentração de medicamento que não apresenta toxicidade foi determinada.

Ensaio de CPE da atividade do medicamento contra coronavírus associado a SARS: 10 0 μΐ de células Vero E6 foram semeadas em placas de 96 poços a 2 x 104 células por poço. Após 24 h de incubação a 37 °C, as células cresceram para monocamada. O medicamento na concentração máxima que não apresenta citotoxicidade foi diluído em 5 níveis, diluindo duas vezes, e adicionado a poços (100 μΐ por poço). Por incubação com 5% de C02 a 37 °C durante 24 horas, concentrações diferentes de vírus (10~3, 10~4, 10~5) foram adicionadas. Após tratamento com vírus durante 48-72 horas, o CPE foi examinado (CPE menor que 25% foi determinado como +, 26-50% como + + , 51-75% como +++, 76-100% como ++++, célula normal como -). As células foram divididas no grupo normal, o grupo de controlo do medicamento, e o grupo de controlo do vírus a diferentes diluições, 4 poços por grupo. O CPE foi examinado diariamente. Até que o efeito citopático foi obviamente exibido no grupo de controlo do vírus, a atividade antiviral do interferão foi avaliada. A experiência foi repetida. A IC50 do medicamento foi calculada pelo método de Reed-Muench. 4. Resultados

Toxicidade do virus: A TCID50 do vírus foi 1CT8. Citotoxicidade do medicamento: a concentração de interferão composto recombinante que não apresentou citotoxicidade foi 18 yg/ml, a forma celular foi semelhante à do grupo controlo, e não foi apresentado efeito citopático. O efeito antiviral do medicamento: mostrado na Tabela 9-A.l e Tabela 9-A.2

5. Conclusão A concentração do novo tipo de interferão composto recombinante que não apresentou citotoxicidade foi 18 pg/ml. A sua IC50 foi 1,27, 2,25, e 4,04 pg/ml, respetivamente, de acordo com a concentração de 10~5 (1000TCID50) , 10~4 (1000TCID50) , 10~3 (100000TCID50) de coronavirus associado a SARS (Tabela 9-A.3).

Principal: Jin-yan Wang

Assistente de laboratório: Yan-hong Zhao, Xiao-guang Ji, Xiao-yu Li.

Dados originais: Preservados nos arquivos do Molecular

Biology Department, microorganism and epidemiology Institute, Academy of Military Medical Science Data: De 12 a 30 de maio de 2003

Exemplo 9-B

Efeito in vitro de um novo tipo de interferão composto recombinante e injeção de interferão-a2b recombinante em coronavirus associado a SARS

Amostra fornecida por: Huiyang Life Engineering Ltd.,

Província de Sichuan

Experimentador: Molecular Biology Department, microorganism and epidemiology Institute, Academy of Military Medical Science

Dados originais: Preservados no arquivo do Molecular

Biology Department, microorganism and epidemiology Institute, Academy of Military Medical Science 1. Materiais

Medicamento: Novo tipo de interferão composto recombinante, 618 yg/ml, fornecido por Huiyang Life Engineering Ltd., Província de Sichuan; Anfulong (injeção de interferão-a2b recombinante), fornecido por Hua-li-da Biology Engineering Ltd. Company, Cidade de Tianjin, 30 ug/frasco (300,0000 UI/frasco), Número do lote: 20030105. Células: Vero E6, fornecidas por Molecular Biology

Department of Microorganism and Epidemiology Institute, Academy of Military Medical Science.

Virus: Coronavirus associado a SARS, BJ-01, fornecido por Molecular Biology Department of Microorganism and Epidemiology Institute, Academy of Military Medical Science .

Condição: Os vírus foram medidos num laboratório de nível 3 de biossegurança. 2. Método TCID50 foi medida com ensaio de CPE: células Vero E6 foram inoculadas em placas de 96 poços a 2 x 104 (100 μΐ) células por poço. Após 24 h de incubação a 37 °C, monocamadas de Vero E6 foram tratadas com 9 níveis de diluição de coronavírus associado a SARS diluindo 10 vezes, cada diluição por 4 poços. As células foram incubadas a 37 °C e 5% de dióxido de carbono. O CPE foi examinado diariamente por microscopia de contraste de fase. CPE menor que 25% foi determinado como +, 26-50% como ++, 51-75% como +++, 76-100% como ++++. O CPE foi registado. Em seguida, a TCID50 foi calculada pelo método de Reed-Muench. TC50 dos IFNs foi medida por ensaio de MTT: células Vero Eg foram incubadas em placas de 96 poços a 2 x 104 células por poço (100 μΐ) . Após 24 horas de incubação a 37 °C, o líquido sobrenadante foi removido quando as células cresceram até monocamada, em seguida as Vero E6 foram tratadas com diferentes concentrações de IFNs, cada diluição por 4 poços. Um grupo normal foi definido. Depois de 5 dias de observação, as células foram misturadas com MTT durante 4 horas. Depois disso, remove-se o liquido, e em seguida, posteriormente, DMSO foi adicionado às células durante 0,5 horas. O OD57onm foi medido num leito de microplacas. Finalmente, a TC50 foi calculada pelo método de Reed-Muench. A atividade dos INFs contra coronavírus associado a SARS foi medida com um ensaio de MTT: 100 μΐ de células Vero E6 foram inoculados em placas de 96 poços a 2 x 104 células por poço. Após 24 h de incubação a 37 °C, as células tornaram-se numa monocamada. A diluição do medicamento na concentração que não apresentou citotoxicidade foi diminuída 5 vezes e existiam 5 níveis de diluição. Em seguida, cada diluição foi adicionada a 4 poços, 100 ul por poço. Após 24 horas de incubação a 37 °C e 5% de C02, a solução de IFN foi removida, em seguida diferentes concentrações de diluição do vírus (TCID50 de 10000, 1000, 100) foram adicionadas nas placas, 4 poços por diluição. As células foram divididas no grupo normal, o grupo de controlo do medicamento, e o grupo de controlo do vírus a diferentes diluições (TCID50 a 10000, 1000, 100) . As células foram incubadas a 37 °C e 5% de CCç durante 48-72 h, até que o grupo de controlo do vírus apresentou efeito citopático, o CPE foi registado (CPE menor que 25% foi determinado como +, 26-50% como + + , 51-75% como ++ + , 76-100% como +++ + , célula normal como -) . A capacidade de crescimento das células foi medida com um ensaio de MTT, e, em seguida, o efeito antiviral dos INFs foi avaliado A experiência foi repetida 3 vezes. A IC50 do medicamento foi calculada pelo método de Reed-Muench. 3. Resultados TCID50 do virus: A TCID50 do vírus foi 10~7. TC50 dos IFNs: A concentração do novo tipo de interferão composto recombinante que não apresentou citotoxicidade foi 100 pg/ml, e a do IFN-a-2b recombinante foi 12,5 pg/ml, a forma das células foi idêntica à do grupo normal àquela concentração. A TC50 do novo tipo de interferão composto recombinante foi 139,18 pg/ml, a do IFN-a-2b recombinante foi 17,18 pg/ml.

0 efeito antiviral do medicamento: Os efeitos anti-virais dos dois IFNs foram observados in vitro. Os resultados das experiências são apresentados na Tabela 9-B.2, e os resultados de TI são apresentados na Tabela 9-B.3.

4. Conclusão 0 efeito de proteção do novo tipo de interferão composto recombinante e IFN-a-2b em Vero E6 foi observado in vitro, e a capacidade antiviral dos IFNs manifestou-se. A IC50 do novo tipo de interferão composto recombinante em coronavirus associado a SARS, na concentração de 10000, 1000, 100 foi 0,92, 0,18, e 0,10 pg/ml em três experiências, o TI deste foi 151,28, 773,32, e 1391,80, respetivamente. A IC50 do IFN-a-2b foi 4,75, 1,16, e 0,28 pg/ml, o TI (índice de tratamento) deste foi 3,62, 14,78, 61,36 respetivamente.

Mais importante ainda, os dois testes (veja-se os exemplos acima 9A e 9B) do efeito anti-virus SARS in vitro de rSIFN-co testemunharam todos que até mesmo a dose eficaz de rSIFN-co para inibir vírus de SARS é 1/5 da do Interferão a-2b que foi utilizado clinicamente na China até ao presente, o índice de tratamento (TI) de rSIFN-co é quase 50 vezes o do Interferão a-2b (VEJA-SE: Efeito in vitro de um novo tipo de interferão composto recombinante e injeção de interferão-a2b recombinante em coronavirus associado a SARS. Por The Institute of Microbiology &

Epidemiology, Academy of Military Medical Science)

Trinta mil pulverizadores de rSIFN-co foram usados entre enfermeiros e médicos da linha de frente, e pessoas com alto risco na Província de Sichuan. 0 resultado mostra que nenhum dos enfermeiros e médicos se infectou com SARS na província de Sichuan.

Principal: Jin-yan Wang

Assistente de laboratório: Yan-hong Zhao, Xiao-guang Ji, Min Zhang, Jing-hua, Zhao.

Data: De 1 a 30 de julho de 2003

Exemplo 10:

COMPARAÇÃO DOS EFEITOS DE INIBIÇÃO DE DIFERERENTES INTERFERÕES NA EXPRESSÃO DO GENE DE HBV O ADN do vírus da hepatite B (HBV) contém elementos de consenso para transativação de proteínas cuja atividade de ligação é regulada por interferões. O tratamento de hepatócitos infetados por HBV com interferões leva a inibição da expressão do gene de HBV. O objetivo do presente estudo foi caracterizar os efeitos de diferentes interferões na transcrição regulada de HBV. Usando transfeção transitória de células de hepatoma humano com plasmídeos repórteres contendo o gene da luciferase do vaga-lume sob o controlo de potencializador de HBV (EnH) I, EnH II e promotor do núcleo, o requerente estudou as atividades biológicas de três interferões diferentes na transcrição.

Materiais e métodos 1. Interferões: IFN-conl (Infergen®), IFN-Hui-Yang (ySIFN-co) e IFN-beta lb 2. Plasmídeo repórter: Os fragmentos de ADN contendo potencializador de HBV (EnH) I, EnH II e promotor do núcleo foram preparados utilizando PCR e clonados através de extremidades cegas no sítio Smal I do plasmídeo repórter pGL3 básico de luciferase do vaga-lume sem promotor e potencializador (Promega, WI , EUA) . 0 plasmídeo repórter resultante foi denominado como pGL3-HBV-Luc. 3. Cultura de células e transfeção de ADN: Células HepG2 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com FBS a 10% e penicilina a 100 U/ml e estreptomicina a 100 ug/ml. As células foram mantidas a 30 °C, numa incubadora com 5% de CO2. As células foram transfetadas com o plasmídeo repórter pGL3-HBV-Luc utilizando o kit Lipofectin Transfection da Boehringer. Após 18 horas, o meio contendo os reagentes de transfeção foi removido e foi adicionado meio fresco com ou sem interferões. As células foram mantidas em cultura por 48 horas adicionais. 4. Ensaio de luciferase: Quarenta e oito horas após a adição de interferão, as células foram colhidas e lise celular foi preparada. A concentração proteica de lisados celulares foi medida utilizando o kit de ensaio proteico da Bio-Rad. A atividade de luciferase foi medida utilizando sistemas de ensaio Luciferase Reporter de Promega, de acordo com as instruções do fabricante.

RESULTADOS

Expressão de atividade de luciferase em diferentes interferões - Lisados celulares tratados

Este resultado mostra que o ySIFN-co inibe de forma mais eficaz sobre a expressão da expressão do gene de HBV.

Exemplo 11:

EFEITOS SECUNDÁRIOS E ALTERAÇÕES NA TEMPERATURA CORPORAL QUANDO USANDO ySIFN-CO

Normalmente existem mais efeitos secundários utilizando interferão. Os efeitos secundários incluem: náuseas, dor muscular, perda de apetite, perda de cabelo, hipoleucocitose (hypoleukmia; hipoleucocitose; hypoleukia), e diminuição em plaquetas sanguíneas, etc.

MÉTODO

Os pacientes amostra são divididos em dois grupos. 11 pacientes no Grupo A foram injectados com 9 pg de Infergen®. 10 pacientes no Grupo B foram injetados com 9 pg de ySIFN-co. Ambos os grupos foram monitorizados durante 48 horas após as injeções. A primeira monitorização foi registada 1 hora após a injeção. Depois disso, os registos foram tomados a cada 2 horas. A Tabela 11.1 é a comparação dos efeitos secundários entre pacientes que são injetados com 9 pg de Infergen® e 9 pg de ySIFN-co.

RESULTADOS

Para aqueles pacientes que foram injetados com ySIFN-co, os efeitos secundários foram menores. Tiveram alguns sintomas comuns semelhantes aos de gripe, tais como: cefaleia, fraqueza, labilidade por frio, dor muscular, hidrose, artralgia (dor articular; artronalgia). Os efeitos secundários dos pacientes a quem foi administrado Infergen® foram piores do que os dos injetados com ySIFN-co.

Das Figuras 9A-1, 9A-2, 9B-1, e 9B-2, foi óbvio que as temperaturas corporais de pacientes amostra no Grupo A foram maiores do que as dos pacientes no Grupo B. Também refletiu que a resistência de ySIFN-co foi muito melhor que a de Infergen®.

Exemplo 12:

CRESCIMENTO DE CRISTAIS DE ySIFN-CO E TESTO DE PARÂMETROS DE CRISTALOGRAFIA

Cristal de ySIFN-co. Dois tipos de cristais foram encontrados após ensaiar e experimentar sistematicamente. (Veja-se Figuras 10-12) 1. Crescimento de cristais

Dissolver proteína ySIFN-co com água pura (H20) para 3 mg/ml em densidade. Pesquisar cristalização usando

Varrimento para Pesquisa de Cristais I e II Hampton, que foi feito por Hampton Company. Usando o método de difusão de suspensão por gotas, 500 μΐ de liquido, gota de 1 μΐ de proteína + 1 μΐ de líquido, a 293 K de temperatura. Os primeiros 2 tipos diferentes de cristais pequenos foram encontrados como listado na Tabela 12.1.

2. Recolha e processamento de dados O cristal I foi utilizado para recolher dados de difração de raios-X e análise preliminar de cristalografia. Os parâmetros também foram testados. Os dados de difração foram recolhidos à temperatura ambiente. O cristal I (Condição I) foi inserido num tubo de parede fina com silicone. Usando um detetor BrukerAXS Smart CCD, a fonte de luz é CuKa (X - 1,5418 Â) gerado por um gerador de raios-X Nonius FR591. A potência da luz é 2000 kW (40 kv x 50 mA), comprimento de onda 1,00 Á, sob 60 segundo de explosão, Δφ = 2o, a distância entre o cristal e o detetor foi 50 mm. Os dados foram processados para utilizar Pacote de Procedimento Proteum de Bruker Company. Veja-se a Figura 12 para o padrão de difração do cristal (parcialmente) . Veja-se a Tabela 12.2 para o resultado do processo.

Tabela 12.2. Resultados dos parâmetros de cristalografia a (Á) 82,67 b (Â) 108,04 c (Â) 135,01 a (°) 90,00 β (°) 90,00 Y (°) 98,35

Grupo espacial P2 ou P2i Nitidez de separação 5 Á Molécula assimétrica # 10 Dissolução 57,6%

Além disso, não houve crescimento de cristais ySIFN-co com base em publicações anteriores. O resultado mais próximo do ySIFN-co foi huIFN-a2b, mas o varrimento foi muito complicado. Após semear-se 3 vezes, o cristal cresceu para 0,5 x 0,5 x 0,3 mm, a nitidez da separação foi de 2,9 Á, grupo espacial foi P2i. Os cristais foram também grandes, o número de moléculas assimétricas foi 6, e a dissolução foi cerca de 60%.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 4695623 A [0002] [0043] [0046] • US 4897471 A [0002] [0043] • US 5372808 A [0002] • CN 97193506 [0002] • CN 98114663 [0002]

Documentos de não patente citados na descrição • Scientists Rush to Create Vaccine for Bird Flu - Just in Case. The Wall Street Journal, 28 January 2004 [0008] • Journal of Interferon and Cytokine Research, 1996, vol. 16, 489-499 [0037] • JOSEPH SAMBROOK ; DAVID W. RUSSELL. Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, December 2000 [0064] • BLATT LM ; DAVIS JM ; KLEIN SB et al. The biologic activity and molecular characterization of a novel synthetic interferon-alpha species, consensus interferon. Journal of Interferon and Cytokine Research, 1996, vol. 16 (7), 48 9-499 [0096] • Production characterization and biological effects of recombinant DNA derived human IFN-α and IFN-γ analogs. ALTON,K. et al. The Biology of Interferon System. Elsevier Science Publishers, 1983, 119-128 [0096] • PFEFFER LM. Biologic activity of natural and synthetic type 1 interferons. Seminars in Oncology, 1997, vol. 24 (3), S9-63, S9-69 [0096] • OZES ON ; REITER Z ; KLEIN S et al. A comparison of interferon-conl with natural recombinant interferons-(: antiviral, antiproliferative, and natural killer- inducing activities. J. Interferon Res., 1992, vol. 12, 55-59 [0096] • HEATHCOTE EJL ; KEEFFE EB ; LEE SS et al. Re-treatment of chronic hepatitis C with consensus interferon. Hepatology, 1998, vol. 27 (4), 1136-1143 [0096] • KLEIN ML; BARTLEY TD ; LAI PH et al. Structural characterization of recombinant consensus interferon-alpha. Journal of Chromatography, 1988, vol. 454, 205-215 [0096] • The Wisconsin Package. Genetics Computer Group, Inc, 1992 [0096] • NISHIMURA, A et al. A rapid and highly efficient method for preparation of competent E. coli cells. Nuclei. Acids Res., 1990, vol. 18, 6169 [0096] • SAMBROOK, J. ; E. F. FRITSCH ; T. MANIATIS. Molecular Cloning:A laboratory manual. CSH Laboratory Press, 1989 [0096]

Lisboa, 19 de Janeiro de 2015

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um interferão recombinante obtenível por um processo que compreende a introdução em E. coli da sequência polinucleotídica mostrada na Figura 1, para utilização como um medicamento para o tratamento de uma doença virai num sujeito.
2. 2. Uma composição farmacêutica compreendendo um interferão recombinante obtenível por um processo que compreende a introdução em E. coli da sequência polinucleotídica mostrada na Figura 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento de uma doença virai.
3. 3. 0 interferão recombinante para utilização da reivindicação 1 ou a composição farmacêutica para utilização da reivindicação 2, em que a doença virai é hepatite A, hepatite B, hepatite C, outros tipos de hepatite, ou doenças respiratórias superiores induzidas por vírus.
4. 4. 0 interferão recombinante para utilização da reivindicação 1 ou a composição farmacêutica para utilização da reivindicação 2, em que a doença virai é uma infeção causada por vírus de Epstein-Barr, citomegalovírus, vírus herpes simplex, outros tipos de herpesvirus, papovavírus, poxvirus, picornavírus, adenovirus, rinovírus, vírus da leucemia de células T humana de tipo I, vírus da leucemia de células T humana de tipo II, vírus da leucemia de células T humana III, ou vírus da gripe aviária.
5. 5. Um interferão recombinante obtenível por um processo que compreende a introdução em E. coli da sequência polinucleotídica mostrada na Figura 1, para utilização como um medicamento para o tratamento de um tumor num sujeito.
6. 6. Uma composição farmacêutica compreendendo um interferão recombinante obtenível por um processo que compreende a introdução em E. coli da sequência polinucleotídica mostrada na Figura 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento de um tumor.
7. 7. 0 interferão recombinante para utilização da reivindicação 5 ou a composição farmacêutica para utilização da reivindicação 6, em que o tumor é cancro da pele, carcinoma de células basais, melanoma maligno, cancro do fígado, carcinoma de células renais, cancro da tiróide, cancro da rinofaringe, carcinoma sólido, cancro da próstata, cancro do estômago, cancro abdominal, cancro do esófago, cancro retal, cancro pancreático, cancro da mama, cancro do ovário, cancro superficial da bexiga, hemangioma, cancro do colo do útero, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro do pulmão de células pequenas, glioma, leucocitemia aguda, leucocitemia crónica, leucemia mielóide crónica, leucemia de células pilosas, linfadenoma, mieloma múltiplo, policitemia vera, ou sarcoma de Kaposi.
8. 8. 0 interferão recombinante para utilização da reivindicação 1 ou 5, em que o interferão é administrado através de administração oral, injeção venosa, injeção muscular, injeção peritoneal, injeção subcutânea, administração nasal, administração na mucosa, ou por inalação.
9. 9. 0 interferão recombinante para utilização da reivindicação 1 ou 5, em que o interferão recombinante é formulado como um comprimido, cápsula, líquido oral, pasta, injeção, pulverizante, supositório, ou solução. Lisboa, 19 de Janeiro de 2015