DE69636195T2

DE69636195T2 - Phosphopantethenyltransferasen und deren verwendungen

Info

Publication number: DE69636195T2
Application number: DE69636195T
Authority: DE
Inventors: Ralph H. Wrentham LAMBALOT; Harvard Medical School Amy M. Boston GEHRING; University of California Ralph San Francisco REID; Wellesley College Christopher T. Wellesley WALSH
Original assignee: Harvard College; University of California San Francisco UCSF
Current assignee: Harvard College; University of California San Francisco UCSF
Priority date: 1995-10-13
Filing date: 1996-10-11
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2016-10-12
Also published as: AU727348B2; CA2232230A1; DE69636195D1; AU7435796A; ATE328069T1; CA2232230C; EP0861321A2; JPH11514868A; WO1997013845A3; US7192735B2; WO1997013845A2; US20030138879A1; US6579695B1; EP0861321B1; JP4709333B2

Description

Acylträgerprotein (ACP) ist ein kleines Protein (8,800 Da), das für eine Acylgruppenaktivierung bei der Fettsäurebiosynthese verantwortlich ist. Das ACP codierende Gen (acpP) wurde kloniert und überexprimiert (Rawlings, M. and Croman, J.E. J. Biol. Chem. 267 (1992), 5751–5754; Jones, A.L., et al., Biochem. Soc. Trans. 21 (1993) 202S) und die Lösungsstruktur von ACP wurde durch NMR-Spektroskopie (Holak, T. et al., Eur. J. Biochem. 175 (1988), 915) gelöst. Homologe von E. coli ACP kommen in der Natur überall in zwei Formen vor, entweder als eine integrale Domäne eines viel größeren, multifunktionellen Enzyms (Typ I) oder als ein einzelnes Protein, das sich mit mehreren anderen Enzymen assoziieren kann, die ein Multi-Enzym Synthasekomplex (Typ II) bilden. In diesen zwei Formen spielen die ACPs in einem weiten Bereich anderer biosynthetischer Wege zentrale Rollen, die von sich wiederholenden Acyl-Transfer Schritten abhängig sind, einschließlich Polyketid (Shen, B. et al, J. Bacteriol. 174 (1992), 3818–3821), nicht-ribosomalem Peptid (Baldwin, J.E., et al., J. Antibiot. 44: (1991), 241–247), und Depsipeptid-Biosynthese (Rusnak, F. et al., Biochemistry 30 (1991),2916–2927) als auch bei der Transacylierung von Oligosacchariden (Geiger, O., et al., J. Bacteriol. 173 (1991), 2872–2878) und Proteinen (Issartel. J.P., et al., Nature 351 (1991), 759–761).
Ein maßgebliches Merkmal von ACP ist die 4'-Phosphopantethein (4'-PP) prosthetische Gruppe (Majerus, P.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53 (1965), 410–417). 4'-PP wird durch eine Phosphodiesterbindung an ein in allen ACPS aufgefundenen konservierten Serinrest angefügt. Die Acylgruppen der zahlreichen, durch Typ I und Typ II ACPs erkannten, Substrate werden zum Acyl-Transfer durch eine Thioesterbindung an dem terminalen Cysteaminthiol des 4'-PP-Rests aktiviert. Es wird angenommen, dass die β-Alanyl- und Pantothenat-Anteile der 4'-PP-Struktur als ein Haltegurt zwischen der Phosphodiester-ACP Bindung und dem terminalen Thioester dient, was nahe legt, dass 4'-PP als ein Schwenkarm funktionieren kann, der wachsende Acylketten zwischen verschiedenen aktiven Stellen hin und her bewegt, beispielsweise wie in der sequentiellen Addition von 11 Aminosäuren durch die 800 kDa Cyclosporin-Synthase (Lawen. A. and Zocher, R.J.; Biol. Chem. 265 (1990),
Die Holo-ACP Synthase (Holo-ACPS) überträgt den 4'-PP-Rest von Coenzym A (CoA) auf Ser-36 von Apo-ACP, um in einer Mg²⁺ abhängigen Reaktion Holo-ACP und 3',5'-ADP zu erzeugen. Das (Acylträger-Synthaseprotein) ACPS von E. coli wurde aus Rohextrakten teilweise 780-fach aufgereinigt (Elovson, J. and Vagelos, P.R., J. Biol. Chem. 243 (1968), 3603–3611) und das ACPS vom Spinat wurde teilweise gereinigt (Elhussein, S. A. et al., Biochem. J. 252 (1988), 39–45), wobei jedoch bemerkenswert ist, dass wenig über den Mechanismus oder die Spezifität dieses post-translationalen Phosphopantetheinylierungsvorgang aufgezeigt wurde. Ein mutiertes E. coli, der in der Synthese von Holo-ACP bedingt fehlerhaft ist, wurde identifiziert und der mutante Phänotyp einer veränderten Holo-ACP-Synthaseaktivität (Polacco, M.L. and Cronan, J.E. Jr., J. Biol. Chem. 256 (1981), 5750–5754) zugeordnet.
Plant Physiol. 104 (1994), 989–995 betrifft ein phosphopantetheinyliertes Vorläufer-Acylträgerprotein, das in die Chloroplasten des Spinats importiert wird. Das Dokument offenbart die Holo-ACP Synthaseaktivität einer Spinacia oleracea Phosphopantetheinyl-Transferase, worin ein ACP-Substrat in vitro in der Gegenwart eines geeigneten Puffers phosphopantetheinyliert wird. Die Holo-ACP Synthase wird bei –70°C in einem Glycerol enthaltenden Puffer gelagert ohne Aktivitätsstabilität zu verlieren.
J. Biol. Chem. 266 (1991), 7220–7226 betrifft den Acylträgerproteinimport in Chloroplasten. Das Dokument offenbart eine im Spinat-Chloroplasten befindliche Holo-ACP Synthaseaktivität bei der Phosphopantetheinylierung eines Apo-ACP Substrats.
Die WO 93/13663 betrifft ein Verfahren zum Lenken einer Biosynthese von spezifischen Polyketiden. Das Dokument offenbart ein Verfahren zum Herstellen von Polyketidstrukturen durch Gestalten und Einführen spezifischer Änderungen in die DNA, die die Synthese der Polyketide steuert.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Phosphopantetheinylierung eines Substrats in einer Zelle oder eine erhöhte Phosphopantetheinylierung eines Substrats in einer Zelle bereit, umfassend, Transformieren der Zelle mit einer exprimierbaren Form eines Gens, das eine Phosphopantetheinyl-Transferase codiert, so dass das Substrat phosphopantetheinyliert wird, oder dass die Phosphopantetheinylierung des Substrats in der Zelle verglichen mit einer nicht transformierten Zelle erhöht wird. Das Verfahren umfasst weiterhin Transformieren der Zelle mit einer exprimierbaren Form eines Gens, das ein Substrat der Phosphopantetheinyl-Transferase codiert, worin das Substrat ein Typ I oder Typ Ii Acylträgerprotein ist.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Herstellen eines Antibiotikums in einer Zelle bereitgestellt, umfassend eine Zelle mit einer exprimierbaren Form eines ersten Gens, das eine Phosphopantetheinyl-Transferase codiert und einer exprimierbaren Form eines zweiten Gens, das ein Substrat der Phosphopantetheinyl-Transferase codiert, wobei das Substrat ein Typ I oder Typ II Acylträgerprotein ist.
1 ist eine schematische Darstellung der Übertragung eines 4'-PP-Rests von CoA auf Ser-36 von Apo-ACP durch ACPS, um in einer Mg²⁺ abhängigen Reaktion Holo-ACP und 3',5'-ADP zu erzeugen. Holo-ACP kann dann durch eine Thioesterbindung an dem terminalen Cysteamin des 4'-PP-Rests Acylgruppen zum Acyl-Transfer aktivieren.
2 Feld A zeigt die Ergebnisse einer nativen SDS-PAGE Analyse, die zeigt, in vitro Bildung von Holo-ACP unter Verwendung von rekombinanten ACPS (Spur 1. Apo-ACP; Spur 2, Holo-ACP Standard (Sigma), reduziert mit DTT; Spur 3, ³H-markiertes Holo-ACP, das unter Verwendung rekombinanten ACPS in vitro gebildet ist, reduziert mit DTT; Spur 4, Holo-ACP Standard, nicht reduziert mit DTT; Spur 5, ³H-markiertes Holo-ACP, das unter Verwendung rekombinanten ACPS in vitro gebildet wird, nicht reduziert mit DTT) eine in vitro Bildung von Holo-ACP zeigt.
2 Feld B stellt ein Autoradiogramm des in 2 Feld A gezeigten Gels dar, was die Einführung von [³H] Phosphopantethein in Holo-ACP (I), Holo-ACP-CoA gemischtes Disulfid (II), und (Holo-ACP)2 Disulfid (III).
3 zeigt die Ergebnisse einer Tris-Tricin SDS-PAGE Analyse von Fraktionen einer Aufreinigung von Wild-Typ und rekombinantem ACPS (Spur 1, Rohlysat of E. coli K-12; Spur 2, DE-52 Überstand; Spur 3. SP-Sepharose-Pool; Spur 4, Apo-ACP Affinitätssäulen-Pool (0.5 ml Probe durch Acetonpräzipitation 20-fach konzentriert; Spur 5 SP-Sepharose gereinigtes rekombinantes ACPS).
4 ist eine graphische Darstellung der Anzahl von pmol von Holo-Dcp, die pro Anzahl pmol von Apo-Dcp gebildet wurden, das in einer in vitro Phosphopantetheinylierungs-Reaktion mit rekombinantem E. coli ACPS eingebaut wird.
5 ist eine schematische Darstellung der Übertragung einer Acylgruppe auf die Sulfhydrylgruppe eines ACP durch Fettsäuresynthasen (FADs) und Polyketidsynthasen (PKSs) und der Übertragung einer Aminoacylgruppe auf die Sulfhydrylgruppe eines ACP durch Peptidsynthetasen.
6 stellt eine Angleichung von Aminosäuresequenzen von Fettsäuresynthasen Fas 2 Gsp, Lpa, Sfd, EntD der Hefe, und ACPS von E. coli dar. Konservierte Aminosäuren sind umrandet und durch Sterne angezeigt.
7 ist eine schematisches Diagramm von homologen Bereichen (schattiert) unter Fettsäuresynthasen (FAS) von S. cerevisiae, S. pombe, C. albicans, A. nidulans und P. patulum, wobei die EntD Homologiefamilie Sfp, Gsp, HetI, LysS und 0195 und E. coli AcpS einschließt. Ketoreduktase (KR), Ketosynthase (KS), Acyl-Transferase (AT), Enoyl-Reduktase (ER), Dehydratase (DH) und Malonyl/Palmitoyl-Transferase (MT/PT).
8 stellt eine Angleichung von Aminosäuresequenzen von E. coli ACPS, entD, sfp, gsp, und der Fettsäuresynthase fas2 von Hefe dar, die die Aminosäurehomologie zwischen diesen Proteinen zeigt. Die zwei Bereiche, die die stärkste Homologie zeigen sind umrandet und schattiert.
9 Feld A ist ein Diagramm, das die Lokalisation der vorgeschlagenen P-pant Transferasedomänen und die Lokalisation von Konsensussequenzen in den Fettsäuresynthasen (FAS) von Pilzen, der Homologiefamilie Sfp/Gsp/EntD/o195 und E. coli ACPS. FAS Baugruppenaktivitäten werden abgekürzt als AT, Acyl-transferase; ER, Enoyl-Reduktase; DH, Dehydratase: MT/PT Malonyl/Palmitoyl-Transferase; ACP, Acylträgerprotein; KR, Ketoreduktase; KS, Ketosynthase.
9 Feld B zeigt Angleichungen von Aminosäuresequenzen der of Konsensussequenzen der P-pant Transferase Enzymsuperfamilie. Hoch konservierte Reste sind umrandet.
10 zeigt ein schematisches Diagramm des Proteins TycA und den Bereich von 112 Aminosäuren von TycA, die zum Herstellen des Substrats His6-Peptidylträgerprotein (His6-PCP) verwendet wurde.
11 stellt Histogramm dar, das Sfp, EntD und o195 zeigt, die Einbau von [³H]-4'-Ppant in ACP und His6-PCP vermitteln.
12 stellt ein Histogramm, das EntD und Sfp vermittelten Einbau von [³H]4'-Ppant in EntF beziehungsweise SrfB1, zeigt.
13 ist eine graphische Darstellung der Menge von [³H]-4'-Ppant, die während einer 15 minütigen Reaktion mit 13 nM Sfp und unterschiedlichen Konzentrationen des Substrats in PCP-His6 eingebaut wird.
14 Feld A ist ein Diagramm, das die Menge von Holo-EntF darstellt, die als eine Funktion der Zeit auf Inkubation von Apo-EntF mit EntD, ALPS oder o195 gebildet wird.
14 Feld B ist ein Diagramm, das die Menge von Holo-ACP darstellt, die als eine Funktion der Zeit auf Inkubation von Apo-ACP mit EntD, ACPS, oder o195 gebildet wird.
15 ist ein Histogramm, das das Ausmaß einer [¹⁴C]Valin-Aktivierung durch Holo-SrfB1 Vorinkubation von SrfB1 mit CoA in der Abwesenheit von Sfp (–Sfp + [¹⁴C]Val) oder in der Gegenwart von Sfp (+ Sfp + [¹⁴C]Val) vor nachfolgender Inkubation mit [¹⁴C]-L-Valin, oder in der Gegenwart von Sfp vor nachfolgender Inkubation mit [¹⁴C]-L-Aspartat und ATP (+ Sfp + [¹⁴C]Asp) darstellt.
Diese Erfindung betrifft phosphopantetheinylierende Enzyme, die auch Phosphopantetheinyl-Transferasen genannt werden, wie Acylträgerproteinsynthasen (ACPS) oder aktive Fragmente davon. Der Begriff "Phosphopantetheinyl-Transferase" und "Phosphopantetheinyl-Transferaseenzym" und "phosphopantetheinylierendes Enzym" soll ein Molekül, beispielsweise Enzym einschließen, das die Übertragung einer 4'-Phosphopantetheingruppe von einer Spender-Verbindung, wie CoA, auf ein Substrat katalysiert. Demgemäß umfassen Phosphopantetheinyl-Transferasen natürliche Enzyme, rekombinante Enzyme, oder synthetische Enzyme, oder aktive Fragmente davon, die eine Verbindung phosphopantetheinylieren können. Bevorzugte Phosphopantetheinyl-Transferasen umfassen Enzyme, wie die E. coli ACPS, die Acylträgerproteine (ACPs) modifiziert und vorzugsweise zu einer Aktivierung eines ACP führt. Der Begriff Phosphopantetheinyl-Transferase umfasst ebenfalls Enzyme, die Nicht-Acylträgerproteine modifizieren, die beispielsweise für eine enzymatische Aktivität eine 4'-Phosphopantetheingruppe erfordern. Die Begriffe "isoliert" und "gereinigt" werden hier austauschbar verwendet und beziehen sich auf eine Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein aktives Fragment davon, das im Wesentlichen frei von anderen Bestandteilen des Wirtsorganismus ist, mit welchem es im natürlichen Zustand assoziiert ist. Die Begriffe "isoliert" und "gereinigt" werden weiter verwendet, um sich auf eine Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein aktives Fragment zu beziehen, die/das im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder Kulturmedium ist, wenn durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt, oder von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien ist, wenn chemisch synthetisiert.
So kann beispielsweise eine Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein aktives Frag ment davon, von einer Zelle, beispielsweise einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle, die die Synthase natürlich exprimiert, gereinigt werden. Da ACPs an der Fettsäurebiosynthese beteiligt sind, ist es wahrscheinlich, dass alle Arten, die Fettsäuren aufweisen, Phosphopantetheinyl-Transferasen zu deren Synthese erfordern würden. Prokaryotische Zellen, die Phosphopantetheinyl-Transferase herstellen, umfassen Bakterien, wie E. coli. Phosphopantetheinyl-Transferasen können von eukaryotischen Zellen, beispielsweise Säugerzellen, Hefezellen und Insektenzellen isoliert werden. Andere Quellen für phosphopantetheinylierende Enzyme umfassen Pflanzengewebe, wie Spinat und Erbsenblätter (Elhussein, et al., supra).
Eine Aufreinigung einer Phosphopantetheinyl-Transferase von einer das Enzym naturgemäß exprimierenden Zelle kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden. Es ist jedoch bevorzugt, dass der Aufreinigungsvorgang einer Phosphopantetheinyl-Transferase von einer natürlichen Quelle einen Affinitätsreinigungsschritt über eine Apo-Acyl-Trägerproteinsäule, wie weiter im dem Abschnitt Beispiele ausgeführt, einschließt. Eine Verwendung dieses Affinitätsreinigungsschritts gestattet eine Aufreinigung einer Phosphopantetheinyl-Transferase bis mindestens zu einer Reinheit von ungefähr 60 %, mehr bevorzugt bis mindestens ungefähr 70 %, und am meisten bevorzugt bis mindestens ungefähr 80 % Reinheit. Eine Aufreinigung einer Phosphopantetheinyl-Transferasen bis mindestens ungefähr 90 % Reinheit, 95 % Reinheit, 97 % Reinheit, 98 % Reinheit oder 99 % Reinheit durch dieses Verfahren wird bevorzugt. Zusätzlich wird eine Aufreinigung einer Phosphopantetheinyl-Transferase von einer natürlichen Quelle durch das Verfahren mindestens ungefähr 800-fach oder 1.000-fach, mehr bevorzugt mindestens ungefähr 10.000-fach, mehr bevorzugt mindestens ungefähr 50.000-fach und noch mehr bevorzugt mindestens ungefähr 70.000-fach angereichert. Ebenfalls ist bevorzugt, dass eine gereinigte Phosphopantetheinyl-Transferase eine spezifische Aktivität von ungefähr 250 mE/mg aufweist, mehr bevorzugt ungefähr 400 mE/mg und noch mehr bevorzugt ungefähr 500 mE/mg Protein. Die spezifische Aktivität einer Phosphopantetheinyl-Transferase wird in mE/mg definiert, wobei eine Einheit gleich 1 μmol Substrat, beispielsweise Holo-ACP ist, das pro Minute bei 37°C, wie in dem Beispielabschnitt beschrieben, in einem in vitro Test gebildet wird.
Zur Erläuterung kann eine isolierte und gereinigte Phosphopantetheinyl-Transferase, wie eine ACPS oder ein aktives Fragment davon, durch rekombinante Verfahren hergestellt werden. Rekombinante Phosphopantetheinyl-Transferase, oder ein aktives Fragment davon, kann durch Expression einer die Synthase oder ein Fragment davon codierende Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle hergestellt werden. Dem Fachmann ist ein Wirtszelle, Expressionsvektoren und Verfahren zur Expression von heterologen Nukleinsäuren bekannt. So kann beispielsweise unter Verwendung rekombinanter Verfahren eine Phosphopantetheinyl-Transferase als ein intrazelluläres Protein, ein Membran assoziiertes Protein oder als ein serzerniertes Protein exprimiert werden.
Eine Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein aktives Fragment davon wird in einer prokaryotischen Zelle, wie einer Bakterienzelle, vorzugsweise E. coli, exprimiert. Alternativ kann die Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein Fragment davon in einer eukaryotischen Zelle, wie einer Hefezelle, einer Säugerzelle, wie den CHO- oder COS-Zellen oder in Insektenzellen (Baculovirussystem) exprimiert werden. Die Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein Fragment davon kann ebenfalls in einer Pflanzezelle exprimiert werden. Regulatorische Nukleinsäureelemente, die für die Expression von Nukleinsäuren erforderlich sind, die eine Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein Fragment davon in den verschiedenen Systemen codieren, und Verfahren zum Einführen einer oder mehrerer Nukleinsäuren in diese Wirtszellen sind im Stand der Technik wohlbekannt. Derartige Verfahren sind Routine und werden beispielsweise in Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Habor Laboratory press (1989)) und anderen Laborbüchern beschrieben.
Wenn eine Phosphopantetheinyl-Transferase rekombinant oder synthetisch hergestellt wird, kann es erforderlich sein, das Enzym erheblich aufzureinigen. Eine rekombinant hergestellte Phosphopantetheinyl-Transferase kann eine zu dem natürlichen Gegenstück identische Aktivität aufweisen, oder sie kann eine Aktivität aufweisen, die über oder unter dem des natürlichen Gegenstück liegt. So kann beispielsweise eine rekombinant hergestellte Phosphopantetheinyl-Transferase in der Effizienz einer Katalyse variieren. Es ist möglich die Aminosäuresequenz des Enzyms zu modifizieren, beispielsweise um dessen Effizienz, oder dessen Substratspezifität oder beides zu verbessern.
Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren kann eine Phosphopantetheinyl-Transferase oder aktives Fragment davon in einer geeigneten Wirtszelle "überexprimiert" werden. Der Begriff "Überexpression" einer Phosphopantetheinyl-Transferase soll eine Expression der eine Phosphopantetheinyl-Transferase codierenden Nukleinsäure bis zu einem Grad einzuschließen, der ungefähr 100-fach höher, mehr bevorzugt ungefähr 1.000-fach höher, noch mehr bevorzugt ungefähr 10.000-fach höher und noch mehr bevorzugt ungefähr 100.000-fach höher ist, als der Expressionsgrad der endogenen Phosphopantetheinyl-Transferase.
Es können verschiedene Verfahren zum Isolieren und Aufreinigen einer rekombinanten Phosphopantetheinyl-Transferase oder einem Fragment davon von einer Wirtszelle eingesetzt werden, welche vorzugsweise auf das zur Expression verwendete spezifische Wirtssystem angepasst sind. Ein bevorzugtes Aufreinigungsverfahren für eine Phosphopantetheinyl-Transferase oder eines Fragments davon umfasst einen Apo-Acyl Trägerproteinaffinitätsreinigungsschritt. Ein Aufreinigungsverfahren, das einen derartigen Affinitätsreinigungsschritt einer Phosphopantetheinyl-Transferase umfasst, wird in dem Abschnitt Beispiele beschrieben. Eine Aufreinigung durch dieses Verfahren einer Phosphopantetheinyl-Transferase oder eines Fragments davon führt zu einer Präparation einer Phosphopantetheinyl-Transferase oder eines aktiven Fragments davon mit einer Reinheit von mindestens ungefähr 90 % oder mehr, vorzugsweise mindestens ungefähr 95 % Reinheit, mehr bevorzugt mindestens ungefähr 97 % Reinheit, mehr bevorzugt mindestens ungefähr 98 % Reinheit und noch mehr bevorzugt mindestens ungefähr 99 % Reinheit. Die gereinigte rekombinante Phosphopantetheinyl-Transferase oder das Fragment davon weist vorzugsweise eine spezifische Aktivität von ungefähr 200 mE/mg Protein auf, mehr bevorzugt ungefähr 250 mE/mg Protein und noch mehr bevorzugt ungefähr 300 mE/mg Protein.
Isolierte oder aufgereinigte "aktive Fragmente" einer Phosphopantetheinyl-Transferase können ein Substrat phosphopantetheinylieren. Ein "aktives Fragment" einer Phosphopantetheinyl-Transferase soll ein Fragment einer Phosphopantetheinyl-Transferase umfassen, das ein Substrat phosphopantetheinylieren kann. Aktive Fragmente von Phosphopantetheinyl-Transferasen werden von dem hier verwendeten Begriff Phosphopantetheinyl-Transferasen umfasst, da aktive Fragmente einer Phosphopantetheinyl-Transferase ein Phosphopantethein auf ein Substrat übertragen können. Aktive Fragmente können unter Verwendung der vorher hier beschriebenen Verfahren zur Herstellung von gereinigter Phosphopantetheinyl-Transferase, rekombinanter Phosphopantetheinyl-Transferase verwendet werden oder unter Verwen dung bekannter Verfahren chemisch synthetisiert werden. So kann beispielsweise ein Peptidfragment einer Phosphopantetheinyl-Transferase durch Exprimieren von Nukleinsäurefragmenten einer Nukleinsäuresequenz erhalten werden, die eine Phosphopantetheinyl-Transferase in einer geeigneten Wirtszelle codieren und durch Durchmustern der erhaltenen Peptidfragmente auf Aktivität unter Verwendung bekannter Verfahren. Es sind verschiedene Verfahren im Stand der Technik bekannt, um Bibliotheken von Klonen herzustellen, die verschiedene Fragmente einer Phosphopantetheinyl-Transferase exprimieren. Diese Klone können anschließend durchmustert werden, um solche zu identifizieren, die ein aktives Fragment exprimieren, das ein Substrat phosphopantetheinylieren kann. In einem Verfahren wird ein Fragment einer Phosphopantetheinyl-Transferase in einem in vitro Test getestet, in dem eine radioaktiv markierte 4'-Phosphopantetheingruppe aufweisendes Apo-Acyl Trägerprotein und CoA mit dem zu testenden Phosphopantetheinyl-Transferasen Fragment in einem geeigneten Puffer inkubiert wird. Es wird dann die Menge von dem in dem Holo-Acyl Trägerprotein eingebauten radioaktiven Marker erfasst und ist kennzeichnend für die Aktivität des Fragments der Phosphopantetheinyl-Transferase. Weitere Details hinsichtlich dieses in vitro Tests werden in dem Beispielabschnitt bereitgestellt.
Andere zu der Erfindung gehörige Verbindungen umfassen modifizierte Phosphopantetheinyl-Transferasen oder modifizierte aktive Fragmente davon. Der Begriff "Modifizierung" soll Addition, Deletion oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäurereste in der Phosphopantetheinyl-Transferase oder einem aktiven Fragment davon umfassen, so dass die phosphopantetheinylierende Aktivität des Enzyms entweder erhalten, erhöht oder verringert ist. "Modifizierte Phosphopantetheinyl-Transferase" oder "modifiziertes aktives Fragment" umfassen ebenfalls eine Phosphopantetheinyl-Transferase oder Fragment, in dem die Substratspezifität geändert wurde. So kann beispielsweise eine modifizierte Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein modifiziertes aktives Fragment davon ein unterschiedliches Acyl-Trägerprotein als die nicht modifizierte Phosphopantetheinyl-Transferase phosphopantetheinylieren. Alternativ kann die modifizierte Phosphopantetheinyl-Transferase einen unterschiedlichen Spezifitätsbereich aufweisen. Insbesondere kann die Modifikation des Enzyms zu einer Phosphopantetheinyl-Transferase führen, die zusätzliche Substrate phosphopantetheinylieren kann. Andererseits kann Modifikation einer Phosphopantetheinyl-Transferase zu einer Phosphopantetheinyl-Transferase mit einem stärker beschränkten Bereich von Substraten führen. Es ist möglich das/die Ziel(e) einer Phosphopantetheinyl-Transferase durch beispielsweise Durchführen von in vitro Phosphopantetheinylierungstests zu bestimmen, die beispielsweise vorstehend beschrieben oder in den Beispielen beschrieben sind, wobei das E. coli Apo-Acyl Trägerprotein mit den Substraten von Interesse ersetzt werden.
Modifizierte Phosphopantetheinyl-Transferasen oder modifizierte aktive Fragmente davon umfassen weiter solche, in denen die Stabilität oder Löslichkeit, oder beides geändert wurde. Andere modifizierte Phosphopantetheinyl-Transferasen umfassen solche, worin ein "Tag" an die Phosphopantetheinyl-Transferase oder das aktive Fragment davon angefügt ist, um so eine Aufreinigung des Proteins von der es produzierenden Wirtszelle zu fördern. Derartige Tags sind im Stand der Technik wohlbekannt und umfassen Polypeptide, die durch spezifische Antikörper erkannt werden.
So können beispielsweise Homologe von Phosphopantetheinyl-Transferasen, beispielsweise solchen hier identifizierten, einschließlich des in dem Abschnitt Beispiele beschriebenen E. coli ACPS, bereitgestellt werden. Der Begriff "Homolog" einer Phosphopantetheinyl-Transferase soll Phosphopantetheinyl-Transferasen von anderen Arten als dem hier beschriebenen E. coli ACPS zu umfassen, die die gleichen oder unterschiedliche Substrate von solchen des E. coli ACPS phosphopantetheinylieren können. Demgemäß sollen Homologe von E. coli ACPS jegliche Enzyme zu umfassen, die ein Substrat phosphopantetheinylieren können. Phosphopantetheinylierung soll die Übertragung einer Phosphopantetheinylgruppe von einem Substrat auf ein anderes Substrat, beispielsweise die Übertragung eines Phosphopantetheins von CoA auf ein ACP, wie in 1 gezeigt, umfassen. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass Pflanzengewebe Phosphopantetheinyl-Transferasen aufweisen, und es ist höchst wahrscheinlich, dass die meisten Zellen, ob Eukaryoten oder Prokaryoten, ebenfalls mindestens ein Enzym beinhalten, das Substrate phosphopantetheinylieren kann. Homologe der E. coli ACPS-Transferase können unter Verwendung der Nukleinsäure isoliert werden, die das hier identifizierte E. coli ACPS codiert. Daher kann eine Nukleinsäure, die ein Homolog des E. coli ACPS codiert, durch Hybridisierung unter niedrigen oder hoch stringenten Bedingungen der die E. coli ACPS codierenden Nukleinsäure oder eines Fragments davon, beispielsweise ein Motiv 1 und Motiv 2 (wie hier beschrieben) codierender Abschnitt, an Bibliotheken von Klonen erhalten werden, die Nukleinsäuren von spezifischen Quellen beinhalten. Homologe können ebenfalls durch andere im Stand der Technik bekann te Verfahren, wie durch PCR-Verfahren unter Verwendung degenerierter Oligonukleotide mit einer Nukleinsäuresequenz, die von dem E. coli ACPS stammt, kloniert werden. Noch andere Verfahren zum Isolieren von Homologen des E. coli ACPS umfassen solche, bei denen ein Antikörper eingesetzt wird, der für das E. coli ACPS spezifisch ist. Antikörper zur Verwendung in diesen Verfahren können entsprechend von im Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt werden.
Homologe von E. coli ACPS können von der Aminosäuresequenz von E. coli ACPS (Lam et al., J. Bacteriol. 174 (1992), 15; Takiff et al., J. Bacteriol. 174 (1992), 1544) in einem Grad der Aminosäuresequenzhomologie-Identität verschieden sein, solange das homologe Enzym ein Substrat phosphopantetheinylieren kann. Homologe von E. coli ACPS können durch eine Nukleinsäure codiert werden, die einen beliebigen Grad von Nukleinsäuresequenzhomologie zu einer Nukleinsäure aufweisen, die E. coli ACPS (Lam et al., supra; Takiff et al., supra) codiert. Homologie wird hier ebenfalls "Identität" genannt, welche sich auf eine Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Proteinen (Peptiden) oder zwischen zwei Nukleinsäuremolekülen bezieht. Eine Homologie kann durch Vergleichen einer Position in jeder Sequenz bestimmt werden, die zu Zwecken eines Vergleichs abgeglichen ausgerichtet werden kann. Ist eine Position in der verglichenen Sequenz durch die gleiche Nukleotidbase oder Aminosäure besetzt, dann sind die Moleküle Homologe, oder identisch an der Position. Ein Grad (oder Prozentsatz) von Homologie zwischen Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl passender (matching) oder homologer Positionen, die von die Sequenzen geteilt werden. Ein Grad oder Prozentsatz von "Identität" zwischen Aminosäuresequenzen bezieht sich auf eine Aminosäuresequenzähnlichkeit, wobei konservierte Aminosäuren zum Zweck einer Bestimmung des Grads oder Prozentsatzes von Ähnlichkeit als identisch betrachtet werden. Eine konservierte Aminosäuresubstitution ist beispielsweise eine Substitution von einer Aminosäure mit einer negativen Seitenkette mit einer Aminosäure mit einer negativen Seitenkette.
E. coli ACPS Homologe oder Vertreter der Phosphopantetheinyl-Transferase-Superfamilie weisen insgesamt eine Aminosäureidentität oder Ähnlichkeit zu einer Aminosäuresequenz von E. coli ACPS oder den phosphopantetheinylierenden Enzymen und/oder Enzymen mit den hier beschriebenen konservierten Aminosäuremotiven von mindestens ungefähr 50 % auf, mehr bevorzugt mindestens ungefähr 60 %, mehr bevorzugt mindestens ungefähr 70 %, mehr bevorzugt mindestens ungefähr 80% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 90 %.
E. coli ACPS Homologe können insgesamt weniger als ungefähr 50 % Aminosäuresequenzidentität oder Ähnlichkeit mit E. coli ACPS aufweisen, wobei wie hier beschrieben tatsächlich gezeigt wurde, dass die spezifischen Proteine oder Peptide, die eine beschränkte Gesamtaminosäuresequenzhomologie mit E. coli ACPS aufweisen, Substrate phosphopantetheinylieren können. Tatsächlich wurde hier gezeigt, dass das B. subtilis Protein Sfp, das an der Biosynthese von Surfaction, einem zyklischen Lipopeptidantibiotikum, beteiligt ist, eine Phosphopantetheinyl-Transferase ist. Ein anderes Proteine, EntD von E. coli, das an der Biosynthese von Enterobactin, einem sezernierten Eisen abfangenden Dihydroxybenzoylserintriaceton, beteiligt ist, kann ebenfalls Substrate phosphopantetheinylieren. Weiterhin wurde hier ebenfalls gezeigt, dass das E. coli Protein o195 mit unbekannter Funktion Substrate phosphopantetheinyliert. Obwohl EntD, Sfp und o195 lediglich eine beschränkte Gesamt-Aminosäuresequenzhomologie mit E. coli ACPS aufweisen, weisen die C-Termini von EntD und Sfp 2 Bereiche konservierter Aminosäurereste mit E. coli ACPS auf. Die Bereiche von Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen sind in 6 und 8 dargestellt. Ein weiterer Aminosäurevergleich ergab, dass diese Bereiche von konservierten Aminosäureresten ebenfalls in den folgenden Proteinen vorhanden sind: dem Fas2 Protein von mehreren Organismen, einschließlich S. cerevisiae, das an der Fettsäuresynthese beteiligt ist, dem Gsp Protein von B. brevis, das an der Synthese des Peptidantibiotikums Gramicidin beteiligt ist und dem Lpa Protein von B. subtilis (9). Es wurde festgestellt, dass weitere Phosphopantetheinyl-Transferasen-Homologe, die in 9 aufgelistet sind, beispielsweise an der Heterocystenbildung von Cyanobakterien und der Lysin-Biosynthese von Hefe beteiligt zu sein. Zumindest teilweise basierend auf diesen Aminosäuresequenzhomologien sind Fas2, Gsp und Lpa ebenfalls wahrscheinlich Phosphopantetheinyl-Transferasen. Mutageneseuntersuchungen stellten weitere Anzeichen bereit, dass diese konservierten Bereiche erforderlich sind, um Substrate zu phosphopantetheinylieren.
Demgemäß weisen bevorzugte Phosphopantetheinyl-Transferasen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren mindestens eine oder mehrere konservierte Aminosäuren auf, wie beispielsweise die in 6 gezeigten, mit einem Stern versehenen Aminosäuren oder die in 9 zeigten Bereiche, oder Bereiche konservierter Aminosäuren, wie beispielsweise die Bereiche umrandeter Aminosäuren in den 6, 8 und 9. Zur Ver wendung in den erfindungsgemäßen Verfahren noch mehr bevorzugte Phosphopantetheinyl-Transferasen weisen eine oder mehrere der folgenden Aminosäuresequenzmotive auf, worin N jeden Aminosäurerest darstellt und zwei durch "/" getrennte Aminosäuren einen Rest darstellen, der eine von beiden Aminosäuren sein kann:
In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Phosphopantetheinyl-Transferase zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren mindestens ein Motiv 1 (a oder b) und mindestens ein Motiv 2 (a oder b). Weitere bevorzugte Phosphopantetheinyl-Transferasen umfassen ein Motiv 1 (a oder b) und Motiv 2 (a oder b), die durch mindestens ungefähr 5, vorzugsweise mindestens ungefähr 10, mehr bevorzugt mindestens ungefähr 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 und 55 Aminosäurereste getrennt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die zwei Motive durch mindestens ungefähr 30 bis 45 Aminosäurereste getrennt. Andere zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugte Phosphopantetheinyl-Transferasen umfassen solche, die Aminosäuresequenzen umfassen, die zu der Aminosäuresequenz von Motiven 1a, 1b, 2a oder 2b signifikant homolog sind. Ebenfalls zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen sind Phosphopantetheinyl-Transferasen, die ein Motiv 1 und ein Motiv 2 beinhalten, welche Aminosäuresubstitutionen, Deletionen oder Additionen beinhalten. Bevorzugte Aminosäuresubstitutionen sind konservierte Aminosäuresubstitutionen, beispielsweise Substitution einer Aminosäure durch eine andere mit einer ähnlichen Charakteristik.
Andere Phosphopantetheinyl-Transferasen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren umfassen ein oder mehrere Motive 1 und 2, die die folgenden Aminosäuresequenzen aufweisen oder eine oder mehrere konservierte Aminosäuresubstitutionen in diesen Sequenzen aufweisen, beispielsweise eine Substitution von einer Aminosäure mit einer ähnlichen Aminosäure, oder eine Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren aufweisen: Motiv 1 Sequenzen:
Motiv 2 Sequenzen:
Ebenfalls vorgesehen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren sind Phosphopantetheinyl-Transferasen, die ein Motiv 1, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die vorstehend oder in der linken Spalte von 9 aufgelistet ist, und ein Motiv 2 beinhalten, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die vorstehend oder in der rechten Spalte von 9 gezeigt ist. Phosphopantetheinyl-Transferasen, die Aminosäuresubstitutionen aufweisen, beispielsweise konservative Substitutionen, Deletionen von Aminosäuren befinden sich innerhalb des Umfangs der Erfindung. Mehrere Tests können dazu verwendet werden, zu bestätigen, dass eine Phosphopantetheinyl-Transferase, die modifizierte oder nicht modifizierte Motiv 1 und 2 Sequenzen aufweist, eine phosphopantetheinylierende Aktivität zeigt welche beispielsweise in den Beispielen beschrieben werden. Derartige Tests werden vorzugsweise an verschiedenen Substraten ausgeführt, da bestimmte Phosphopantetheinyl-Transferasen Substratspezifität zeigen.
Bevorzugte phosphopantetheinylierende Enzyme weisen eine Aminosäuresequenzidentität oder Ähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz von einem Motiv 1 und einem Motiv 2, die vorstehend oder in irgendeiner Figur gezeigt sind von mindestens ungefähr 50 % auf, mehr bevorzugt mindestens ungefähr 60 %, mehr bevorzugt mindestens ungefähr 70 %, mehr bevorzugt mindestens ungefähr 80 % und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 90 %. Peptide, die eine Aminosäuresequenzidentität oder Ähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz von einem Motiv 1 und einem Motiv 2, die vorstehend oder in irgendeiner Figur gezeigt sind von mindestens ungefähr 93 % aufweisen, mehr bevorzugt mindestens ungefähr 95 % und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 98–99 %, sind ebenfalls zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen.
Basierend auf dem Vorhandensein von Aminosäuresequenzhomologien zwischen phosphopantetheinylierenden Enzymen ist es möglich, zusätzliche phosphopantetheinylierende Enzyme zu identifizieren. Derartige phosphopantetheinylierende Enzyme sind zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls vorgesehen. Mehrere Verfahren können verwendet werden, um zusätzliche phosphopantetheinylierende Enzyme zu identifizieren: wie hier beschriebene Aminosäure oder Nukleinsäuresequenzvergleiche und in vitro Tests.
Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren können phosphopantetheinylierte Enzyme an einer Übertragung auf die neu eingeführte Sulfhydryl (SH)-gruppe der prothetischen Phosphopantethein-Gruppe, die als ein Nukleophil wirkt, beteiligt sein. Acyl-CoAs können zur Fettsäuresynthese (FAS) verwendet werden und alle Polyketidsynthasen (PKS), während Aminoacyl-AMPs zur Peptidsynthese verwendet werden können (5). In den PKS-Komplexen erfahren die Acyl-ACPs ein Einfangen durch CARBANION-Nukleophile zur Kohlenstoffskelettanordnung bei dem Polyketidaufbau, während bei Peptid- und Depsipeptidsynthasen die Aminoacyl-S-ACPs durch Stickstoff und Sauerstoff-Nukleophile bei Amid und Ester bildenden Schritten angegriffen werden.
Ein Phosphopantetheinyl-Transferase-Protein, ein aktives Fragment davon, eine modifizierte Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein modifiziertes aktives Fragment und Phosphopantetheinyl-Transferase-Homologe, die von deren natürlichen Quellen aufgereinigt wurden oder als rekombinantes Protein hergestellt wurden, beispielsweise gemäß der hier beschrieben Verfahren können anschließend für eine in vitro Phosphopantetheinylierung eines Substrats, wie einem Acyl-Trägerprotein, verwendet werden. In einer spezifischen Ausführungsform ist das Substrat ein "heterologes" Substrat, d.h. ein Substrat von einer Spezies, die verschieden ist von der Spezies von der die Phosphopantetheinyl-Transferase abgeleitet ist/stammt. Es wurde tatsächlich gezeigt, dass eine Phosphopantetheinyl-Transferase von einer Spezies ein Substrat von einer anderen Spezies zu phosphopantetheinylieren. Beispielsweise phosphopantetheinylierten mehrere Pflanzenenzyme E. coli ACP genauso effektiv wie ACP von Pflanzen (Elhussein et al., Supra). Weiterhin wurde ebenfalls gezeigt, dass E. coli ACPS andere Acyl-Trägerproteine, als E. coli ACPS, phosphopantetheinylieren können: (1) Lactobacillus D-Alaynl-Trägerprotein (DCP), das in der Biosynthese der bakteriellen Zellwandbestandteils Lipoteichonsäure aktiv ist, (2) Rhizobial NodF, das im Nodulationsvorgang von Gemüsen der Hülsenfrüchte aktiv ist, und (3) Streptomyceten ACP, das der Actinorhodin, Granaticin, Tetracenomycib, Frenolicin, Oxytetracyclin und Tetracenomycin Polyketid- Antibiotikum Biosynthese beteiligt ist.
In einer Ausführungsform kann ein innerhalb des Umfangs der Erfindung befindliches phosphopantetheinylierendes Enzym hauptsächlich ein einzelnes Substrat phosphopantetheinylieren. In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform kann das phosphopantetheinylierende Enzym, beispielsweise E. coli ACPS eine beschränkte Anzahl von Substraten phosphopantetheinylieren. In noch einer anderen Ausführungsform weist das phosphopantetheinylierende Enzym ein breites Spektrum von Substraten auf.
Es können Kits zur in vitro Phosphopantetheinylierung von Substratproteinen bereitgestellt werden. Derartige Kits umfassen eine wie hier beschriebene isolierte oder gereinigte Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein aktives Fragment davon und Anweisungen zur Verwendung. Die Phosphopantetheinyl-Transferase oder das aktive Fragment davon können durch rekombinante Verfahren, chemische Synthese hergestellt oder von einer natürlichen Quelle aufgereinigt werden. Eine derartige Phosphopantetheinyl-Transferase oder Fragment davon weist vorzugsweise eine spezifische Aktivität von mindestens 250 mE/mg auf. Die Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein Fragment davon kann derart verpackt werden, so dass es im Wesentlichen die gesamte Phosphopantetheinylierungsaktivität für mindestens einen Monat, vorzugsweise für mindestens 2 Monate, sogar mehr bevorzugt für mindestens 3 Monate beibehält. Noch mehr bevorzugt ist die Phosphopantetheinyl-Transferase für mindestens 6 Monate stabil und am meisten bevorzug für mindestens 1 Jahr. So kann beispielsweise die Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein Fragment davon bei –20°C in einem auf Tris basierenden Puffer aufrechterhalten werden, der Magnesium und ungefähr 20 % Glycerol enthält. Alternativ kann die Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein Fragment davon als ein lyophilisiertes Pulver bereitgestellt werden. Die Kits können weiterhin ein eine 4'-Phosphopantetheinylatgruppe bereitstellendes Reagenz, wie Coenzym A (CoA) beinhalten. Zusätzlich kann ein geeigneter Reaktionspuffer für die Phosphopantetheinylierungsreaktion, vorzugsweise in einer konzentrierten Form in dem Kit enthalten sein. Der Reaktionspuffer umfasst vorzugsweise Magnesiumionen und Tris-Puffer.
Es können Wirtszellen, die modifiziert sind, um mindestens eine Nukleinsäure zu exprimieren, die eine Phosphopantetheinyl-Transferase oder ein Fragment davon codiert, bereitgestellt werden. Phosphopantetheinyl-Transferase exprimierende oder überexprimierende Wirtszellen wurden hier beschrieben. Zusätzlich können Wirtszellen bereitgestellt werden, die mit einer Nukleinsäure transformiert sind, die eine nicht sezenierende Form einer Phosphopantetheinyl-Transferase oder Fragment davon codiert und mindestens eine zusätzlich Nukleinsäure, die mindestens ein Polypeptid codiert. Das mindestens eine Polypeptid kann eine Komponente des Substrats der Phosphopantetheinyl-Transferase sein.
Es ist bekannt, dass eine Expression von heterologen 4'-Phosphopantethein-Synthasen in E. coli durch die Fähigkeit von E. coli beschränkt ist/wird große Mengen überproduzierten Proteins in vivo zu phosphopantetheinylieren. Daher stellt die Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Expression einer aktiven, rekombinanten Form eines Enzyms, das eine 4'-Phosphopantetheingruppe erfordert, bereit, indem sowohl das Enzym als auch eine Phosphopantetheinyl-Transferase in der gleichen Zelle exprimiert oder überexprimiert wird. Das in der Wirtszelle co-exprimierte Enzym kann ein beliebiges Enzym sein, das eine Phosphopantetheinylierung erfordert, um in einer Reaktion aktiv zu sein. Beispielsweise kann eine Wirtszelle modifiziert werden, um sowohl die E. coli ACPS als auch das E coli Acyl-Trägerprotein oder ein heterologes Substrat, wie NodF oder D-Alanyl-Trägerprotein zu exprimieren, so dass sie aktives E. coli Acyl-Trägerprotein, NodF beziehungsweise D-Alanyl-Trägerprotein erzeugt.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Wirtszellen, die ein phosphopantetheinylierendes Enzym, beispielsweise eine Phosphopantetheinyl-Transferase oder aktives Fragment davon exprimieren oder überexprimieren, zur Herstellung von Verbindungen verwendet, deren Synthese mindestens einen Schritt aufweist, der ein phosphopantetheinylierendes Enzym erfordert. Derartige Verbindungen umfassen Polyketide (sowohl aromatische als auch Makrolid) und nicht-ribosomal hergestellt Peptide, einschließlich Depsipeptiden, Lipopeptiden, und Glycopeptiden. Biosynthetische Wege, die mit erfindungsgemäßen Phosphopantetheinyl-Transferasen moduliert werden können, schließen Fettsäuren, oberflächenaktive Lipopeptid-Mittel und Antibiotika ein. Bevorzugte Antibiotika sind solche nicht-ribosomal hergestellten Peptide, die durch einen Thiomatrizenmechanismus synthetisiert werden können. Sehr bevorzugte, nicht-ribosomal hergestellte Peptidantibiotika umfassen (a) lineare Peptide, beispielsweise Edein, ACV, Gramacidin und zyklische Alamethicin-Peptide, (b) zyklische Peptide, beispielsweise Cyclopeptin, Enterochelin, Ferrichrom, Gramacidin S, Tyrocidin und Mycobacillin, (c) Laktone, beispielsweise Destruxin, Actinomycin, Etamycin und Echinomycin, (d) verzweigte Cyclopeptide, beispielsweise Polymyxin und Bacitracin und (e) Depsipeptide, beispielsweise Enniatin und Beauvericin (Kleinlaufand von Doehren Eur. J. Biochem. 192 (1990), 1). Andere innerhalb des Umfangs der Erfindung befindliche Antibiotika umfassen Erythromycin, Clarythromycin, Oxytetracyclin, Bacitracin, Cyclosporin, Penicillin, Cephalosporine, Vancomycin. Zusätzliche Antibiotika innerhalb des Umfangs der Erfindung umfassen solche im Stand der Technik wohl bekannte, die beispielsweise in pharmakologischen Katalogen aufgefunden werden können.
Die Synthese von Verbindungen, beispielsweise Antibiotika, können durch Enzyme, einschließlich Polyketidsynthasen (die beispielsweise an der Synthese von Erythromycin und Tetracyclin beteiligt sind), nicht-ribosomalen Peptidsynthasen und Depsipeptidsynthasen katalysiert werden. Diese Enzyme gehören zu der Familie von Acyl-Trägerproteinen, die Homologe von E. coli ACP sind und eine 4'-Phosphopantetheingruppe zu deren Aktivität erfordern. Die ACPs sind entweder Typ I oder Typ II Acyl-Trägerproteine. Die Erfindung stellt somit Verfahren zur Herstellung von Verbindungen, beispielsweise Antibiotika bereit, deren Synthese entweder durch eine Typ I oder Typ II ACP katalysiert wird.
Typ I ACPS (ebenfalls Typ I Synthese genannt) sind multifunktionelle Enzyme, die auch "Multienzym-Polypeptide" genannt werden, die zusätzlich zu einer Domäne, die ein Substrat phosphopantetheinylieren kann mindestens einige/mehrere oder alle katalytischen Aktivitäten umfasst/beinhaltet, die für eine Peptidbildung und Aktivierung erforderlich sind. Typ I ACPs umfassen Erythromycin-, Rapamycin-, Cyclosporin-, Avernectin- und Tetracyclinsynthasen. Diese Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, beispielsweise eines Antibiotikums bereit, deren/dessen Synthese durch eine Typ I ACP von einer Wirtszelle katalysiert wird, die modifiziert wurde, um eine Typ I ACP und eine Phosphopantetheinyl-Transferase zu exprimieren und die Typ I ACP zu aktivieren. Die modifizierte Wirtszelle wird in einem Medium inkubiert, das die notwendigen Substrate für das Multienzym-Polypeptid beinhaltet. Alternativ können die Verbindungen, die eine Typ I ACP für deren Synthese erfordern mit gereinigten Enzymen oder rekombinant erzeugten Enzymen in vitro hergestellt werden.
Typ II ACPS (auch Typ II Synthase genannt) sind einzelne Proteine, die mit mehreren anderen Enzymen assoziiert sein können, um einen Multienzym-Synthasekomplex zu bilden. Typ II ACPS sind Komponenten der Tetracyclin-, Gramicidin-, Tyrocidin-, Anthrocyclin- und Bacitracin-Synthasen. Diese Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums bereit, dessen Synthese durch eine Typ II ACP katalysiert wird, indem die Nukleinsäuren, die mindestens mehrere oder alle die Einheiten des Multienzymkomplexes codieren und eine Nukleinsäure, die eine Phosphopantetheinyl-Transferase codiert in eine Wirtszelle eingeführt/eingebracht und in ihr exprimiert werden und wobei eine derart modifizierte Wirtszelle in einem Medium inkubiert wird, dass die geeigneten Substrate für die Enzyme enthält. Alternativ können die Verbindungen, die eine Typ II ACP für deren Synthese erfordern in vitro hergestellt werden, indem eine gereinigte Phosphopantetheinyl-Transferase(n) und die geeigneten Enzyme, die für die Synthese der Verbindung erforderlich sind in einem geeigneten Puffer in Kontakt gebracht werden.
Bevorzugte Wirtszellen zur Herstellung von Antibiotika umfassen Zellen für die das Antibiotikum nicht toxisch ist. Alternativ kann eine modifizierte Form eines Antibiotikums, die nicht toxisch ist für die Zelle, exprimiert werden und wobei die modifizierte Form in vitro oder in vivo geändert werden kann, um die aktive Form des Antibiotikums zu erhalten.
Organismen, die in natürlicher Weise Antibiotika erzeugen, wurden modifiziert, um eine Phosphopantetheinyl-Transferase zu exprimieren oder überzuexprimieren. Derart modifizierte Organismen können zusätzliche Mengen eines Antibiotikums herstellen, indem sichergestellt wird, dass die für deren Synthese erforderlichen Typ I oder Typ II ACPs sich in einer aktiven Form befinden.
In den Typ I und Typ Ii ACPS enthält das Multikomponentensystem eine kleine (beispielsweise um 80 bis 100 Aminosäuren) Proteineinheit oder Domäne, die als ein Trägerprotein für die wachsende Acylkette dient. Diese Acyl-Trägerproteine sind durch das konservierte Sequenzsignaturmotiv D(N,D)FFX(L,I)GG(H,D)S(L,I)X(A,G,C)XX(L,V,M) (Stein et al., Biochemistry 34 (1995), 4633) oder (L,V)(G,L)(G,A,F,Y)(D,H,K,E)S(L,Q)(D,A,G) (Schlumbohm W., et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), 23135) erkennbar sind, werden durch post-translationale Modifikation von den inaktiven Apo-Formen zu funktionellen Holo-Formen umgesetzt, welche an einem Angriff der konservierten Serin β-CH₂-OH Seitenkette auf die Pyrophosphatbindung von CoA beteiligt ist, was zu einer Übertragung des 4-Phospho pantetheinrests von CoA auf das angreifende Serin führt. Das neu eingeführte -SH der prothetischen Phosphopantethein (P-Pant) Gruppe wirkt nun als ein Nukleophil für eine Acylierung durch ein spezifisches Substrat, d.h. Acyl-CoA und Malonyl-CoA Derivate für die Fettsäure- und Polyketidsynthasen (PKS) und Aminoacyl-AMPs für die Peptid- und Depsipeptidsynthasen. In den PKS-Komplexen erfährt das Carboxy-aktivierte Malonyl-ACP Derivat dann eine Decarboxylierung, was eine nukleophile Carbanion-Spezies bildet, die einen zweiten Acyl-Thioester angreift, um eine neue Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung bei der Polyketid-Biosynthese zu ergeben. In Peptid- und Depsipeptidsynthetasen dienen die Aminoacyl-ACPs oder Hydroxyacyl-ACPs als Nukleophile bei Amid- beziehungsweise Esterbindung bildenden Schritten. Die Phosphopantetheinylierung von Apo-ACP Domänen spielt somit eine zentrale Rolle bei der Aktivierung von Multienzym-Synthasen, die für die Biogenese einer umfangreichen Anzahl natürlicher Produkte verantwortlich ist.
Nukleinsäuren, die Typ I und Typ II ACPs und damit assoziierte Komponenten codieren, wurden isoliert und sind beispielsweise in den folgenden Dokumenten beschrieben: Donadio, S. et al., Science 252 (1991), 675; Gocht, M. et al., J. Bacteriol. 176 (1994), 2654; MacCabe, A. et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), 12646; Schweke, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7839; Ye, J. et al., J. Bacteriol. 176 (1994), 6270 und Zhang et al., J. bacteriol. 177 (1995), 4009.
Eine Phosphopantetheinyl-Transferase ist beispielsweise ein Enzym, bei dem diese enzymatische Aktivität die Hauptfunktion des Enzyms darstellt. E. coli ACPS ist wahrscheinlich ein derartiges Enzym. Phosphopantetheinyl-Transferasemoleküle können zusätzliche enzymatische Aktivitäten, wie ein Molekül aufweisen, das sowohl eine Phosphopantetheinyl-Transferase und eine ACP Aktivität aufweist. Beispielsweise weist die hier aufgezeigte Fettsäuresynthase Untereinheit II (FAS II) der Hefe eine Domäne auf, die zu E. coli ACPS und Sfp homolog ist, was anzeigt, dass dieses Enzym intramolekular wirken könnte, um eine Phosphopantetheinyl-Einheit an Ser-80, der möglichen ACP Domäne dieses Polyproteins, hinzuzufügen. Demgemäß können polyfunktionelle oder polyenzymatisache Proteine bereitgestellt werden, die als eine der unterschiedlichen enzymatischen Funktionen die Fähigkeit umfassen Phosphopantetheinyl-Gruppen zu übertragen. Eine derartige Übertragung kann auf das gleiche oder ein anderes Molekül erfolgen.
So können beispielsweise Proteine, die normalerweise die Fähigkeit zu phosphopante theinylieren nicht aufweisen, modifiziert werden, um diese enzymatische Aktivität zu erhalten. Zum Binden an ein anderes Protein, beispielsweise durch chemisches Vernetzen oder rekombinante Verfahren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird mindestens eine Phosphopantetheinyl-Transferase oder aktives Fragment davon an ein Protein, das eine ACP ist, verbunden. Die Transferaseaktivität, die übertragen ist, kann von E. coli ACPS, von Sfp oder einem beliebigen anderen Protein sein, das eine derartige katalytische Aktivität aufweist.
Andere Verbindungen, deren Synthese eine Typ I und Typ II ACP (ebenfalls Typ I beziehungsweise Typ II Synthasen genannt) erfordern und die somit eine Phosphopantetheinylierung durch eine Phosphopantetheinyl-Transferase erfordern, umfassen unter anderen immunsuppressive Mittel (beispielsweise, FK506), Anti-Pilzmittel (beispielsweise, Amphotericin), Anti-Parasitenmittel, kardiovasculäre Mittel (beispielsweise, Lovostatin) und Antitumormittel (beispielsweise, Anthracyclin) Mittel. Verfahren zur Herstellung derartiger Verbindungen unter Verwendung der Phosphopantetheinyl-Transferase, aktiver Fragmente davon und Expressionssystemen werden hier beschrieben.
Verfahren zur Herstellung einer gereinigten Phosphopantetheinyl-Transferase werden zur Erläuterung beschrieben. Eine Phosphopantetheinyl-Transferase oder aktives Fragment davon kann von einer das Enzym in natürlicher Weise herstellenden Zelle, wie E. coli, isoliert werden und durch einen Faktor von mindestens ungefähr 1.000-fach, mehr bevorzugt mindestens ungefähr 10.000-fach und noch mehr bevorzugt mindestens ungefähr 50.000-fach aufgereinigt werden. Verfahren zur Isolierung des Enzyms umfassen vorzugsweise einen Affinitätsreinigungsschritt über eine Säule, die Apo-Acyl-Trägerprotein beinhaltet. Derartige Verfahren werden hier im Detail weiter beschrieben. Die gereinigte Phosphopantetheinyl-Transferase weist vorzugsweise eine spezifische Aktivität von 250 mE/mg Protein auf, mehr bevorzugt 400 mE/mg und noch mehr bevorzugt500 mE/mg Protein. Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Herstellung rekombinanter Formen von Phosphopantetheinyl-Transferasen bereit. Derartige Verfahren umfassen ein Transformieren einer Wirtszelle mit einer Nukleinsäure, die eine Phosphopantetheinyl-Transferase codiert, unter geeigneten Bedingungen zur Expression des Proteins und Isolieren der Synthase von der Wirtszellen und Kulturmedien. Eine gereinigte rekombinante Phosphopantetheinyl-Transferase weist vorzugsweise eine spezifische Aktivität von 200 mE/mg und mehr bevorzugt 250 mE/mg auf.
Weiter werden zur Erläuterung Verfahren zum Identifizieren von Hemmstoffen einer Phosphopantetheinyl-Transferase beschrieben. Eine Hemmstoffverbindung wird definiert als eine Verbindung, die Phosphopantetheinylierung eines Substrats durch Phosphopantetheinyl-Transferase verringert oder hemmt. Hemmstoffe von Phosphopantetheinyl-Transferase können unter Verwendung eines in vitro oder in vivo Tests identifiziert werden. In einer Ausführungsform werden mögliche Hemmstoffverbindungen in einem in vitro Phosphopantetheinylierung-Test, wie einem in dem Abschnitt Beispiele beschriebenen Test, durchmustert. In einer anderen Ausführungsform werden Hemmstoffverbindungen mit einem Mikroorganismus in Kontakt gebracht, der eine Phosphopantetheinyl-Transferase aufweist, wobei die Phosphopantetheinylierung von Substrat überwacht wird. Hemmstoffverbindungen können beispielsweise zum Blockieren spezifischer Wege verwendet werden, die eine Phosphopantetheinylierung in einem Mikroorganismus erfordern, wie beispielsweise ACP abhängige Wege. ACPs sind beispielsweise an der Transacylierung von Proteinen, wie Haemolysin, einem Pathogenitätsfaktor von E. coli, beteiligt. Die Identifikation des Proteins Lys 2 der Hefe, das in einem primären Lysin-Biosyntheseweg als eine Phosphopantetheinyl-Transferase beteiligt ist, stellt ein Verfahren zum Abtöten von Hefe dar. Demgemäß können Hemmstoffe von phosphopantetheinylierenden Enzymen als Anti-Pilzmittel verwendet werden. Außerdem werden zahlreiche Membran-assoziierte Proteine acyliert, wobei ein Blockieren oder Vermindern einer Acylierung jener Proteine in einem Mikroorganismus die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus möglicherweise beeinflussen kann. ACPS sind an der Transacylierung von Zellwandbestandteilen ebenfalls beteiligt, die populäre therapeutische Ziele darstellen. Andere Reaktionen an den ACPS beteiligt sind, umfassen Transacylierung von Oligosacchariden, die beispielsweise in den Nodulationsfaktoren der Gattung Rhiobia beteiligt sind. Transacylierung von Oligosacchariden stellen einen wesentlichen Schritt bei der Nodulbildung bei Stickstoff fixierenden Pflanzen dar und weist landwirtschaftliche Anwendungen auf.
So können beispielsweise Durchmusterungsverfahren verwendet werden, um neue Antibiotika aufzufinden. Neue Antibiotika werden durch Co-Exprimieren verschiedener Formen von Typ I oder Typ II ACPs identifiziert, beispielsweise modifizierten ACPs, die durch Zufallsmutagenese (random mutagenesis) und/oder einer Phosphopantetheinyl-Transferase, oder einer mutierten Form davon erhalten werden, die für eine Phosphopante theinylierung und somit Aktivierung der ACPs erforderlich sind. Auf ähnliche Art und Weise können neue Immunsuppressiva, Anti-Pilz-, Anti-Helminthen-, Anti-Parasiten- und Anti-Tumormittel isoliert werden.
Es wurde hier gezeigt, dass das E. coli EntD Gen, das ein für die Synthese des Eisen chelatierenden/abfangenden und Transportmoleküls Entrobactin (Ent) notwendiges Produkt codiert, signifikante Aminosäuresequenzhomologie zu den Phosphopantetheinyl-Transferasen E. coli ACPS und Sfp zeigt, und dass es mindestens zwei Substrate, ACP und PCP phosphopantetheinyliert. Dementsprechend kann die Eisenaufnahme durch Bakterien, beispielsweise durch Exprimieren des EtnD Gens in Bakterien verbessert werden. Eine verbesserte Eisenaufnahme kann zu einem effizienteren Bakterienwachstum führen, das in Fällen nützlich sein wird, bei denen Bakterien zur Herstellung einer vorteilhaften Verbindung gezüchtet werden. Eine Eisenaufnahme durch Bakterien kann ebenfalls durch züchten von Bakterien in der Gegenwart eines Hemmstoffs einer Phosphopantetheinylierung verringert werden. Derartige Hemmstoffe können wie vorstehend und in dem Abschnitt Beispiele beschrieben, isoliert werden.
Die Erfindung wird ebenfalls für die Gestaltung von Strategien zur heterologen Herstellung funktioneller Polyketid- und Polypeptidsynthetasen sein, beispielsweise bei einer kombinatorischen Biosynthese von "unnatürlich" natürlichen Produkten. So können beispielsweise neue Arzneimittelmoleküle durch genetische Veränderung von Genclustern in einem Organismus, wie beispielsweise Streptomyces erzeugt werden, die Polyketide synthetisieren. Dann können die modifizierten Gene, die beispielsweise in E. coli hergestellt wurden, in die Streptomyces wieder eingeführt werden, in denen neue Polyketide exprimiert werden. Ein derartiger Vorgang kann zusätzlich zu Polyketid-Antibiotikas auf die Synthese verschiedener Verbindungen angewendet werden. Daher befinden sich Vorgänge zum Herstellen neuer Verbindungen in einem Wirt oder in vitro durch Verwenden modifizierter, beispielsweise mutierter phosphopantetheinylierender Enzyme innerhalb des Umfangs der Erfindung. Bevorzugte Biosynthese-Stoffwechselwege, die gemäß dieses Verfahrens modifiziert werden können, umfassen solche in die Biosynthese von Erythromycin, die Antikrebsarznei Daunorubicin und das Immunsuppressivum Rapamycin beteiligt sind.
Diese Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht als beschränkend ausgelegt werden sollen.
Beispiel 1: Klonieren und Überproduktion der E.coli Holo-Acyl Trägerproteinsynthase
Material und Methoden:
Präparation von [³H]Coenrym A. CoA (220 mg) wurden durch Aussetzen an Tritiumgas (New England Nuclear) markiert, um 600 mCi eines Rohmaterials zu erhalten. Dieses Material wurde zu nicht markiertem CoA gegeben und das Gemisch wurde acyliert und wie durch Elovson und Vagelos (supra) gereinigt. Auf diese Art und Weise wurde [³H]CoA mit spezifischen Aktivitäten so hoch wie 7 × 10¹⁴ dpm/mol und mit 70 % der ³H-Markierung in dem Phosphopantethein-Anteil hergestellt.
Test einer Phosphopantetheinyl-Transferasen Aktivität. In einem gewöhnlichen Test wurden 100 μM [³H]CoA, 50 μM Apo-ACP, 10 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,8 und ACPS in einem Endvolumen von 100 μl bei 37°C für 30 Min. in einem 1,5 ml Mikrozentrifugengefäß inkubiert. Die Reaktionen wurden mit 800 μl 10 % TCA gestoppt. BSA (20 μl einer 25 mg/ml Lösung) wurden anschließend zugegeben, um eine Präzipitation radioaktiv markierten Proteins zu fördern. Die 1,5 ml Gefäße wurden bei 12.000 × g für 5 Min. zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt und die Pellets wurden mit 3 × 900 μl einer 10 % TCA gespült. Restliches TCA wurde durch Zentrifugation gesammelt, und die Pellets wurden in 150 μl einer 1M Tris-Base gewaschen. Die resuspendierten Pellets wurden in Szintillationsgefäße überführt, 2,5 ml Szintillations-Cocktail (Pachard) wurden zugegeben und die Menge von gebildetem ³H-markiertem Holo-ACP wurde durch Flüssigkeitsszintillationsmessung quantifiziert.
Bestätigung einer in vitro Bildung von Holo-ACP durch native-PAGE, Autoradiographie und Massenspetrometrie. ACPS-Tests wurden für 12 Std. bei 37°C inkubiert. Kontrolltests wurden auf normale Weise aufbereitet/verarbeitet und Holo-ACP Bildung wurde durch Flüssigkeitsszintillationsmessung bestätigt. Testgemische für native-PAGE wurden nicht mit 10 % TCA gestoppt. Das ACPS Testgemisch wurde in zwei gleiche Anteile aufgeteilt. Zu einem 50 μl Anteil wurden 20 μl eines 5 × nativ-PAGE Probenpuffers (Ausubel, F.M. et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1992)) gegeben, der DTT enthielt, wohingegen die andere Probe nicht mit DTT reduziert wurde. Diese Proben wurden auf einem 20 % nativen Gel durch Elektrophorese, gefolgt durch Coomassie-Färbung analysiert. Die gefärbten Gele wurden vor dem Trocknen unter Vakuum für 15 Min. in Verstärker (Amersham) eingetaucht. Die getrockneten Gele wurden bei –80°C autoradio graphiert, gefolgt von photographischer Entwicklung (2). Auf einem 20 % nativen Gel wandert Holo-ACP-SH etwas schneller als Apo-ACP, während Holo-ACP Dimer erheblich langsamer wandert (Rock, C.O. and Cronan, J.E. Methods Enzymol. 71 (1981), 341–351). Überproduktion und Aufreinigung von Apo-ACP. E. coli DK554, eine Apo-ACP überproduzierender Stamm, wurde durch Prof. John E. Cronan, Jr. (Deparment of Microbiology and Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champagn) bereitgestellt. Kulturen, die in Terrific-Brühe, die mit 50 mM Glucose, 25 μM Phantothenat und 50 μg/ml Kanamycin ergänzt war, gezüchtet wurden, wurden mit 1 mM IPTG bei einer O.D. von 0.8 induziert. Die Zellen wurden durch zwei Passagen durch eine French-Presse bei 10.000 psi lysiert. Der Hauptanteil des überproduzierten Apo-ACPs lag in der Apo-Form vor. Geringe Mengen von Holo-ACP wurden unter Verwendung einer endogenen Holo-ACP Hydrolase zu Apo-ACP umgesetzt, indem das Lysat unter Rühren mit 10 mM MgCl₂ und 2 mM MnCl₂ für 60 Min. bei 25 °C inkubiert wurde (Fischl, A.S. and Kennedy, E.P. J. Bacteriol. 172 (1990), 5445–5449). Apo-ACP wurde dann dem Verfahren von Rock und Cronan (Supra) folgend gereinigt, um 60 mg pro L Kultur zu erhalten.
Aufreinigung von ACPS von E. coli K-12. Ein Gefrorener Block von 500 g E. coli K-12 Zellen (ATCC 14948), die bis zur ¾ log Phase gezüchtet wurden, wurde mit einem Schlägel in kleinere Stücke zerbrochen und zu einem L einer 50 mM Tris-Lösung, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM Benzamidin, 50 μM CoA und 5 % (w/v) Glycerol, die mit 1M MES auf einen pH-Wert von 8,1 titriert wurde, zugegeben. Die Zellen wurden durch eine einzelne Passage durch eine Amicon French-Presse bei 8,000–16,000 psi lysiert. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 8,000 × g für 30 Min. entfernt, um 1,5 1 Rohextrakt zu erhalten. 150 g einer DE-52 Aufschlämmung (Whatman) in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0 wurde dem Überstand zugegeben und für 15 Min bei 4°C behutsam gemischt. DE-52 wurde durch Zentrifugation entfernt und der Überstand wurde noch einmal mit 150 g von DE-52, pH-Wert 8,0 behandelt. Nach Entfernung des DE-52 Harzes wurde der Überstand durch Zentrifugation bei 16,000 × g für 30 Min, weiter geklärt.
Der geklärte Extrakt (1,3 L) wurde mit gesättigter MES-Lösung auf einen pH-Wert von 6,5 titriert und dann mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. auf eine 3 × 30 cm SP-Sepharose-Säule (Pharmacia) geladen, die mit 50 mM MES, 10 mM MgCl₂, 5 % (w/v) Glycerol, pH-Wert 6,1 (Puffer A) equilibriert wurde. Nachdem der Extrakt aufgetragen war, wurde die Säule mit 750 ml Puffer A gewaschen, während 25 ml Fraktionen gesammelt wurden. Die Säule wurde anschließend mit einem linearen 0 bis 1 M NaCl-Gradienten (1L) in Puffer A eluiert. Aktive Fraktionen wurden gepoolt, um 190 ml zu erhalten. Diese 190 ml SP-Sepharose gereinigtes Material wurden als nächstes auf eine 2,5 × 4,0 cm Affi-Gel 15 Apo-ACP Affinitäts-Säule (BioRad, Hercules, CA, Herstellung gemäß Anweisungen des Herstellers) mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/Min. geladen, während 25 ml Fraktionen gesammelt wurden. Die Säule wurde mit 100 ml Puffer A gewaschen, und ACPS wurde dann mit 50 ml einer 6 M Guanidinium-HCl-Lösung in 50 mM MES, pH-Wert 6,1 eluiert, während 8 ml Fraktionen gesammelt wurden. Phosphopantetheinyl-Transferaseaktivität wurde durch Verdünnen der Guanidinium-HCl-Lösung auf eine Endkonzentration von < 2M in dem Testgemisch wiederhergestellt. Es wurden aktive Fraktionen gepoolt, um 16 ml zu erhalten, die gegen 2 × 1L Puffer A dialysiert wurden, um ungefähr 0,2 mg Protein einer scheinbar 70.000-fachen Aufreinigung (Tabelle 1) zu erhalten. Eine Tris-Tricin SDS-PAGE Analyse (Schagger, H. and von Jagow, G. Anal. Biochem. 166 (1987), 368–379) zeigte die Anwesenheit von lediglich ein paar Hauptbanden (3). Vorhergehende Aufreinigungen zeigten, dass die 14 kDa Bande mit der Phosphopantetheinyl-Transferaseaktivität (Daten nicht gezeigt) mit aufgereinigt wurde. Aliquots (500 μl) des Affinitäts-gereinigten Proteins wurden durch Aceton-Ausfällung konzentriert. Das ausgefällte Protein wurde durch 16 % T, 6 % C Tris-Tricin SDS-PAGE aufgelöst und anschließend, den Anweisungen des Herstellers folgend, durch Elektroblotting auf eine Pro-Blot Membran (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) übertragen. Die Proteine wurden durch ein kurzes Anfärben mit 0,1 % Amidoschwarz in 1 % Essigsäure sichtbar gemacht. Das 14 kDa Protein wurde ausgeschnitten und einer N-terminale Sequenzierung unterworfen.
Klonieren und Überexprimieren des dpj-Gens. Das dpj-Gen wurde unter Verwendung einer frisch gezüchteten Einzelkolonie des E. coli Stamms BW13711 als Matrize bei der Polymerase Ketten Reaktion (PCR) vermehrt. Der E. coli Stamm BW13711, ein Gabe von Prof. Barry Wanner von der Purdue Universität, weist eine lacX74 Deletion des gesamten lac-Operons auf, ist jedoch andererseits Wild-Typ E. coli K-12, der durch Lambda und den F-Faktor geheilt wurde. Der Vorwärts-Primer beinhaltet eine NdeI-Restriktionsstelle an dem Startcodon:
Der Rückwärts-Primer beinhaltet eine HindIII-Restriktionsstelle nach dem Stoppcodon:
Das sich ergebende PCR-Produkt wurde unter Verwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie in der NdeI/HindIII-Stelle des pET22b Expressionsplasmid (Novagen) subkloniert und pDPJ (Asubel, F.M. et al., Supra) bezeichnet. E. coli BL21 (DE3) wurde mit supergeknäultem pDPJ transformiert.
Drei 1 L Kulturen von E. coli BL21(DE3)pDPJ in 2xYT-Medium, das mit 50 μg/ml Ampicillin ergänzt wurde, wurden bei 37 °C, 250 Upm bis zu einer O.D. von 0,8–1,0 gezüchtet, bevor die Kulturen auf 30°C, 250 Upm umgesetzt und mit 100 μM IPTG induziert wurden. Die Kulturen wurden bei 30 °C für zusätzliche 3 Std. gezüchtet und dann durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden in 50 mM Tris-HCl-Lösung, 10 mM MgCl2, 5 % Glycerol, pH-Wert 8,0 (Puffer B) resuspendiert und durch zwei Passagen durch eine French-Presse bei 10.000–15.000 Psi lysiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 30 Min. entfernt. Der zellfreie Extrakt wurde dann zweimal mit einem gleichen Volumen einer DE-52 Aufschlämmung (pH-Wert 8,0) behandelt. Der DE-52 Überstand wurde mit gesättigter MES-Lösung auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und auf eine 3 × 30 cm SP-Sepahrose-Säule geladen, die mit Puffer-A vor-equilibriert war. Die Säule wurde mit 250 ml Puffer A gewaschen. ACPS wurde anschließend mit 500 ml eines linearen, 0 bis 1 M NaCl-Gradienten eluiert.
Ergebnisse:
Um eine Aufreinigung von ACPS zu beginnen, wurde ein schneller und zuverlässiger Test zum Überwachen der Phosphopantetheinyl-Transferaseaktivität durch das Aufreinigungsverfahren gesucht. Von den zahlreichen Verfahren, die für die in vitro Bestimmung einer Phosphopantetheinyl-Transferaseaktivität (Elovson, J. and Vagelos, P.R. Supra, Elhussein et al., supra; Polacco, M.L. and Cronan, J.E.; Jr. Supra) beschrieben sind, wurde der direkt diskontinuierliche radioaktive Test gewählt, der [³H]-(Pantetheinyl)-CoA und Apo-ACP verwendet. Die Menge einer Phosphopantetheinyl-Transferaseaktivität wurde durch Überwachen der Geschwindigkeit erfasst, mit der radioaktiv markiertes Pantethein in Holo-ACP eingebaut wird. Radioaktiv markiertes Holo-ACP wird durch Co-Ausfällung mit BSA unter Verwendung 10 % TCA mit folgender Flüssigkeitsszintillationsmessung des Proteinpellets quantifiziert. Die Bildung von 3H-markiertem Holo-ACp wurde durch Autoradiographie eines nativen 20 % Polyacrylamidgels bestätigt.
Frühere Berichte zeigten, dass ACPS ein basisches Protein ist, das nicht an eine Anionen-Austauscherharz (Elovson, J. and Vegalos, P.R.; Supra) bindet. Eine 3-fache Aufreinigung wurde dabei durch eine chargenweise DE-52 Behandlung schnell erreicht. Der DE-52 Überstand wurde dann auf dem Kationen-Austauscherharz SP-Sepharose absorbiert. Nach ausführlichem Waschen, wurde die Säule unter Verwendung eines linearen NaCl-Gradienten (0–1 M) eluiert. Die ACPS-Aktivität eluierte bei ungefähr 0,35 M NaCl. Der submikromolare K_m von ACPS für Apo-ACP, der vorher mit 780-fach aufgereinigtem Enzym (Elovson, J. and Vegalos, P.R., Supra) erfasst wurde, legte eine für eine Affinitätschromatographie geeignete, sehr feste Bindungswechselwirkung nahe. Apo-ACP wurde an eine Affi-Gel 15 Matrix gebunden wobei festgestellt wurde, dass tatsächlich durch die Apo-ACP Affinitätssäule eine Phosphopantetheinyl-Transferaseaktivität fest zurückgehalten wurde. Die Phosphopantetheinyl-Transferaseaktivität eluierte weder mit hohem Salz noch bei niedrigem pH-Wert, obwohl sie mit Apo-ACP eluierte. Leider war die Apo-ACP Elution für anschließende Reinigungsschritte ungeeignet, da eine Abtrennung von Apo-ACP von ACPS schwer war und geringe Verunreinigungen in der Apo-ACP Präparation eine Identifikation des in geringer Menge vorliegende ACPS Protein verhinderte. Dem Elutionserfordernis wurde genügt, als gezeigt wurde, dass das ACPS nach Elution mit Chaotropen unter denaturierenden Bedingungen durch nachfolgende Verdünnung des Denaturierungsmittels neu gefaltet und dessen Aktivität wiederhergestellt werden konnte. Obwohl sowohl Harnstoff als auch Guanidinium-HCl sich als geeignet für diesen Zweck erwiesen, wurde Guanidinium-HCl (6M) als das bevorzugte Elutionsmittel gewählt, um das Risiko einer N-terminalen Carbamylierung des Zielproteins zu minimieren. Die Guanidinium-HCl Elution einer ACPS Aktivität von der Apo-ACP Affinitätssäule ergab eine scheinbare 70.000-fach aufgereinigte Präparation. Eine Tris-Tricin SDS-PAGE Analyse (Schagger, H. and von Jagow, G. Supra) zeigte die Anwesenheit von lediglich ein paar Hauptbanden (3). Vorherige Aufreinigungen zeigten, dass die 14 kDa Bande zusammen mit der ACPS-Aktivität gereinigt wird (Daten nicht gezeigt). Unter Verwendung der Standard Tris-Tricin SDS-PAGE Analyse wandert das 14 kDa Protein mit der Pufferfront, was die anfängliche Detektion einer Kandidatenbande für eine N-terminale Sequenzanalyse behindert. Die Tris-Tricin SDS-Page Analyse bietet eine große Auflösung von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht und wurde daher für alle nachfolgenden Analysen von ACPS enthaltenden Fraktionen verwendet. Eine Superdex-75 Gel-Filtrationschromatographie der ACPS-Präparation zeigte ein natives Molekulargewicht von ungefähr 30.000 an, was nahe legte, dass das native Enzym ein Homodimer (Daten nicht gezeigt) ist. Das 14 kDa Protein erfuhr Elektroblotting und wurde anschließend einer N-terminalen Sequenzierung unterzogen. Fünfundzwanzig Zyklen einer N-terminalen Sequenzierung ergab eine primäre Sequenz von AILGLGTDIVELARIEAVIARSGDR. Eine BLAST-Suche (Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403–410) der nicht redundanten Proteindatenbank ergab, dass das 14 kDa Protein durch dpj (downstream of Pyridoxal J), dem zweiten Gen in dem pdxJ Operon (Takiff, H.E., et al., J. Bacteriol. 174 (1992), 1544–1553) codiert wird.
Das dpj-Gen wurde durch PCR aus dem E. coli Genom vermehrt und in der NdeI/HindIII-Restriktionsstelle des pET22b Vektors (Novagen) subkloniert. Induktion von E. coli BL21(DE3)pDPJ und Aufreinigung der Phosphopantetheinyl-Transferaseaktivität ergab 50 mg Protein mit > 95 % Reinheit und einer spezifischen Aktivität (Tabelle 2) von 320 mE/mg. Dies entspricht mindestens einer Hälfte der spezifischen Aktivität der teilweise reinen Wild-Typ-Präparation. Dieser Unterschied liegt am wahrscheinlichsten an Fehlern, die mit der Quantifizierung der verdünnten Wild-Typ-Präparation unter Verwendung des Bradford-Proteintests assoziiert sind. Eine DNA-Sequenzierung des pDPJ Konstrukts bestätigte, dass die rekombinante Sequenz richtig war (Dana-Farber Molecular Biology Core Facility, Boston, MA). Das überproduzierte rekombinante 14 kDa Protein wurde geblottet und einer N-terminalen Sequenzierung unterzogen, die die ersten zehn Reste als das dpj Genprodukt bestätigte. Eine Massenspektrometrie-Analyse zeigte eine Molmasse von 13.950 innerhalb der berechneten Masse von 13.922 an. Ein Einbau des [³H]-Phosphopantetheinrests in Apo- ACP durch ein rekombinantes Enzym, wurde erneut durch eine 20 % native Gelelektrophorese, gefolgt durch Autoradiographie (2) bestätigt. Auf einem 20 % nativen PAGE (14) wandert Holo-ACP etwas schneller als Apo-ACP. Weiterhin zeigte Massenspektrometrie-Analyse von nicht markiertem enzymatischem Holo-ACP Produkt ein MW von 8841 (berechnet 8847) im Gegensatz zu einem beobachteten MW von 8518 (berechnet 8508) für das Apo-ACP-Substrat. Steady-state Kinetiken unter Verwendung des [³H]CoA Radioaktivitätstests an rekombinante ACPS ergaben einen K_m-Wert von 50 μM für CoA. Wie vorher über teilweise gereinigtes ACPS (11) berichtet, konnte eine Substrathemmung bei Apo-ACP Konzentrationen von größer als 2 μM beobachtet werden. Es konnte jedoch eine obere Grenze von ~ 1μM für den Km-Wert für Apo-ACP bestimmt werden. Ein scheinbarer k_cat-Wert von ungefähr 10 Min.^-1 wurde bei gesättigtem CoA und 50 μM Apo-ACP erfasst. Es wurden unter den gleichen Testbedingungen identische K_m-Werte für Apo-ACP und CoA mit Wild-Typ-ACPS erhalten. Unterschiede zwischen unseren kinetischen Konstanten und solchen früher berichteten, 0,4 μM und 150 μM für K_m(Apo-ACP) beziehungsweise K_m(CoA) (Elovson, J. and Vagelos, P.R. Supra), können am wahrscheinlichsten Variationen in den Apo-ACP und CoA Substratpräparationen und den angewendeten Testbedingungen zugeschrieben werden.
In vitro Phosphopantetheinylierung von NodF mit rekombinantem E. coli ACPS
Diese Beispiel zeigt, dass E. coli ACPS das heterologe Substrat NodF von Rhizobiales phosphopantetheinylieren kann.
Die Bedingungen des in vitro Phosphopantetheinylierungstests, die in diesem Beispiel verwendet werden, sind die gleichen wie die vorstehend unter Verwendung des E. coli ACP als Substrat beschriebenen. Die Effizienz einer Phosphopantetheinylierung von Wild-Typ NodF, einer ACP-NodF Chimäre und eines Wild-Typ ACP durch E. coli ACPS wird nachfolgend dargestellt:
Die Werte stellen Mittelwerte von 3 wiederholten Tests dar. Die damit assoziierten Fehler waren 5 %, 20 % und 10 % für die ACP-, ACP::NodF- beziehungsweise NodF-Tests. Die % Umsetzung wurde unter Verwendung der spezifischen Aktivität für den Pantetheinrest des radioaktiv markierten CoA berechnet, die 4,8 × 10⁸ dpm/μmol betrug.
In vitro Phosphopantetheinylierung von D-Alanyl-Trägerprotein mit rekombinantem E. coli ACPS
Diese Beispiel zeigt, dass E. coli ACPS in vitro D-Alanyl-Trägerprotein (Dcp), wie beispielsweise Lactobacillus casei Dcp, phosphopantetheinylieren kann.
Die Bedingungen der in vitro Phosphopantetheinylierungsreaktion waren im Wesentlichen die gleichen, wie die in den vorherigen Beispielen beschriebenen, mit der Maßgabe von 36 Stunden Inkubationszeit und einer Erhöhung der anfänglichen CoA-Konzentration. Alle Tests wurden erneut als Triplikate bei 37°C ausgeführt. Die Reaktionen wurden mit 800 μl 10 % TCA gestoppt und 500 μg BSA wurde zugegeben. Die 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen wurden durch Inversion sorgfältig gemischt und das Protein wurde durch Zentrifugation bei 12.000 × g pelletiert. Die Pellets wurden 3 × mit 900 μl 10 % TCA gewaschen und anschließend in 150 μl 1M Tris-Base erneut gelöst. Das erneut gelöste Protein wurde dann zu 3 ml Packard Flüssigkeitsszintillationscocktail gegeben und die Menge von in der Proteinfraktion eingebauter Radioaktivität wurde quantifiziert. Dcp: ACPS-Tests (3 × mit ACPS, 3 × ohne ACPS)

ACP: ACPS-Tests (3 × mit ACPS, 3 × ohne ACPS)
Die Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt: Tabelle III:
Diese Ergebnisse zeigen daher, dass E. coli ACPS Dcp phosphopantetheinylieren kann.
In einem anderen Beispiel werden verschiedener Konzentrationen von Apo-Acp mit ACPS bei 37°C inkubiert, um das Ausmaß einer Phosphopantetheinylierung zu bestimmen.
Die Tests wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
Das gebildete [³H] Holo-Dcp wurde durch Teilen von dpm durch die spezifische Aktivität des Pantetheinrests von CoA quantifiziert, die 4,83 × 10⁴ dpm/mol ist. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Menge von gebildetem Holo-Dcp mit der Menge von Apo-Dcp in der Reaktion ansteigt.
Es wurde gezeigt, dass E. coli ACPS die Apo-Form von Streptomyceten ACPs modifiziert, das bei der Frenolicin, Granaticin, Oxytetracyclin und Tetracenomycin Polyketid-Antibiotikum Biosynthese beteiligt ist.
Diskussion:
Es wurde die Wild-Typ Holo-ACP Synthase (ACPS) von E. coli bis zur Homogenität gereinigt und die N-terminale Peptidsequenz wurde verwendet, um dpj als das Gen zu identifizieren, das ACPS codiert. ACPS scheint ein Homodimer mit einem Molekulargewicht von 28.000 zu sein. Überexpression von dpj gestattete die Isolierung von > 10 mg eines aktiven rekombinanten ACPS. Überraschender Weise zeigte eine erste Durchsuchung der Genbank Datenbanken, einschließlich des kürzlich berichteten Haemophilus influenzae Genoms (Fleischmann, R.D., et al., Science 269 (1995), 496–512) keine bekannten Gene, die eine signifikante Homologie mit dpj teilten. Es ist wahrscheinlich, dass dpj zum Klonieren anderer Phosphopantetheinyl-Transferasen nützlich sein und die heterologe Überproduktion von geeigneten modifizierten 4'-PP erfordernden Enzymen unterstützen wird, wie beispielsweise PhbC (Gerngross, T.U. et al., Biochemistry 33 (1994), 9311–9320), Dcp (Heaton, M.P. and Neuhaus J. Bacteriol. 176 (1994), 681–690) und NodF (Geiger, O. et al., supra). wodurch die Herstellung von Acyl-aktivierenden Enzymen stark gefördert wird, die an der Makrolid-, Polyketid-, Depsipeptid- und nicht ribosomalen Peptid-Biosynthese, als auch ACP abhängigen Transacylaseaktivitäten beteiligt sind.
Beispiel 2: Identifikation zusätzlicher phosphopantetheinylierenden Enzyme
BLAST-Suchen (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403–410) mit der 125 AS aufweisenden E. coli ACPS Proteinsequenz, zeigte geringfügige Ähnlichkeiten zu dem C-terminalen Bereich von fünf Fettsäuresynthasen vom Pilz, was nahe legte, dass die Phosphopantetheinylierungsaktivität als eine Domäne in diesen Polyenzymen (6 und 7) subsumiert werden kann. Insbesondere wurden Ähnlichkeiten von 15–22 % über 120 Reste zu dem C-terminalen Bereich von drei Fettsäuresynthasen aufgefunden. Ein genetischer Beleg/Hinweis stützt ein Schema, in dem der C-Terminus der FAS2-Untereinheit für die Auto-Phosphopantetheinylierung der FAS2 N-terminalen ACP-Domäne (Kuhn, L. et al, Eur. J. Biochem. 24 (1972), 492–497; Schweizer, E. et al., Eur. J. Biochem. 39 (1973), 353–362; Schweizer, E. Naturwissenschaften 64 (1977), 366–370; Schweizer, E. et al., Fat Sci. Technol. 89 (1987), 570–577; Werkmeister, K. et al., Biochem. Biophs. Res. Comm. 96 (1980), 483–490) verantwortlich sein kann. Beispielsweise können die C-terminalen 121 Aminosäuren der 1894 Aminosäuren (aa) der Fettsäuresynthase Untereinheit II (yFASII) der Hefe intramolekular bewirken eine P-pant-Einheit an Ser-180, die mögliche ACP-Domäne dieses Polyproteins, anzufügen. Die Gruppe von Schweizer berichtete vorher eine intra-allelische Komplementation und eine in vitro Reaktivierung von mutierter FAS, eine an 5180 und eine an G1777, die selbst inaktiv sind, was mit diesem Vorschlag vereinbar ist (Kuhn, L. et al, Eur. J. Biochem. 24 (1972), 492; Schweizer, E. et al., Eur. J. Biochem. 39 (1973), 353; Schweizer, E. Naturwissenschaften 64 (1977), 366; Schweizer, E. et al., Fat Science Technology 89 (1987), 570; Werkmeister, K. et al., Biochem. Biophs. Res. Comm. 96 (1980), 483; Schorr, R. et al., J. Plant Physiol. 143 (1994), 407).
Ausgehend von der Homologie zwischen den Pilz FAS2 C-Termini und ACPS, zeigten weitere Sequenzvergleiche eine Homologie von E. coli ACPS zu drei bakteriellen Proteinen EntD (: coli), Sfp (B. subtilis) und Gsp (B. brevis) (6 und 8). Die spezifischen biochemischen Funktionen von entD, sfp und gsp waren unbekannt. Es wurde gezeigt, dass EntD zur Herstellung des Fe^III-abfangenden Siderophors Enterobactin in E. coli (Coderre, P.E. and Earhart, C.F. J. Gen. Micorbiol. 135 (1989), 3043–3055) erforderlich ist. Sfp wurde als ein Lokus isoliert, der zur Herstellung des Lipopeptid-Antibiotikums Surfaction in B. subtilis (Nakano, M.M. mol. Gen. Genet. 232 (1992), 313–321) erforderlich ist. Gsp ist ein Protein, das für die Synthese von Gramicidin durch den Multidomänen Gramicidin-Synthasekomplex GrsAB (Borchert, S. et al., J. Bacteriol. 176 (1994), 2458) erforderlich ist. Zusätzlich zu EntD, Sfp und Gsp zeigten weitere Durchsuchungen von BLAST, dass ein als o195 bezeichneter dritter E. coli ORF (zusätzlich zu ACPS und EntD) mit unbekannter Funktion zu ACPS ebenfalls homolog ist.
EntD, Sfp und Gsp wurden bisher als Orthologe von hoher Dreiweg-Homologie (Grossman, T.H. et al., J. Bacteriol. 175 (1993), 6203) identifiziert. Tatsächlich kann E. coli EntD sfp Mutanten mit äquivalenter Funktionalität (Grossman, T.H. et al., Supra; Borchert, S. et al., J. Bacteriol. 176 (1994), 2458) komplementieren.
Die 6 und 8 zeigen Angleichungen von Aminosäuresequenzen der Fettsäuresynthasen von Hefe, E. coli ACPS, EntD, Sfp, Gsp und Lpa. Diese Angleichungen zeigen 2 Bereiche konservierter Aminosäuren in diesen Proteinen. Zusätzlich zu EntD, Sfp, Gsp und Lpa zeigten weitere Durchsuchungen von BLAST mehrere andere Proteine, die mit ACPS (9) eine mögliche Homologie teilen, unter denen sich ein dritter E. coli ORF (zusätzlich zu ACPS und EntD) mit unbekannter Funktion befindet, der als o195 bezeichnet wird, als auch Proteine, die bei der Heterocystendifferenzierung von Cyanobakterien und der Lysin-Biosynthese von Pilzen beteiligt sind. Lokale Sequenzangleichungen der möglichen Ppant Transferasedomänen zeigen zwei Sequenzmotive, die mehrere hoch-konservierte Reste beinhalten. Die hoch-konservierten Reste in diesen Homologiebereichen sind in 9 umrandet. Es ist höchst-wahrscheinlich, dass diese Bereiche bei dem Transfer der Phosphopantetheingruppe beteiligt sind. Mutageneseuntersuchungen dieser Domäne bestätigen tatsächlich, dass die konservierten Bereiche an der Phosphopantetheinyl-Übertragung beteiligt sind.
Beispiel 3: Sfp, EntD und o195 phosphopantetheinylierte Substrate in vitro
Dieses Beispiel zeigt, dass die Proteine Sfp, EntD und o195 mit gezeigter Sequenzhomologie zu dem E. coli ACPS ein oder mehrere Substrate in vitro phosphopantetheinylieren können. Jedes dieser Proteine wurde überproduziert und gereinigt, und wurden gezeigt Tritium markiertes 4'-P-pant von CoA auf das E. coli FAS Apo-ACP, die Apo-ACP Domäne aus der multifunktionellen Peptidsynthase, TycA, EntF und/oder SrfB1, abhängig von der Transferase, übertragen zu können.
Überproduktion und Aufreinigung von Sfp, EntD und o195 wurden wie folgt ausgeführt. Sfp (26,1 kD) wurde überproduziert und nach früher veröffentlichten Verfahren (Nakano, M.M. et al., Mol. Gen. Genet. 232, (1992)) gereinigt.
EntD (23,6 kD) wurde kürzlich kloniert, wobei sich jedoch dessen Überproduktion vermutlich aufgrund der Häufigkeit seltener Codons und eines ungewöhnlichen UUG Startcodons (Coderre, R.E. & Earhart, C.F. 135 (1989), 3043) als schwer erwies. Daher wurde das UUG Startcodon zu einem AUG geändert und die Codon-Nutzung für die ersten sechs Reste wurde optimiert. EntD wurde durch PCR von dem Wild-Typ E. coli K-12 durch Kolonie-PCR unter Verwendung des Vorwärts-Primers 5'-ATTATATCCATGGgtTCcTCcGTtTCcA AcATGGTCGATATGAAAACTACGCA-3' und dem Rückwärts-Primer 5'-GATGTCAAG CTTATTAATCGTGTTGGCACAGCGTTAT-3' (IDT) vermehrt. Der Vorwärts-Primer enthält eine NcoI-Restriktionsstele (unterstrichen), die eine Mutation des TTG Start zu einem ATG Start gestattete und fügte ein Gly-Codon (GGT) nach dem Met-Initiator ein. Zusätzlich optimierte der Vorwärts-Primer die Codon-Nutzung für die ersten sechs Codons des entD Gens (modifizierte Basen in Kleinbuchstaben gezeigt). Der Rückwärts-Primer führte eine HindIII-Restriktionsstelle (unterstrichen) ein. Das mit NcoI/HindIII verdaute PCR-Produkt wurde in pET28b (Novagen) kloniert und in kompetente E. coli DHSa transformiert. Kompetente Zellen des Überproduktions-Stammes E. coli BL21(DE3) wurden anschließend mit dem superverknäulten pET28b-entD Plasmid transformiert. Induktion einer 2 L Kultur BL21(DE3)pET28b-entD mit 1 mM IPTG, gefolgt durch Wachstum bei 25°C für 5 Stunden ergab hauptsächlich Einschluss-gebundenes EntD, wobei jedoch kleine Mengen des überproduzierten Proteins löslich war. Die induzierte Zellpaste wurde in 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 % Glycerol, pH-Wert 8,0 (40 ml) resuspendiert und durch zwei Passagen durch die French-Presse bei 15.000 Psi lysiert. Zelltrümmer und Einschluss-gebundenes Protein wurden durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 30 Minuten entfernt. Pulverisiertes Ammoniumsulfat wurde bis zu 35 %, 65 % und 80 % Sättigung zugegeben. Die 35 % Fraktion, die die größte Fraktion von EntD beinhaltet wurde auf eine 2,5 × 115 Sephacryl S-100 Säule aufgetragen. Die Säule wurde bei einer Flussrate von 1 ml/Min. unter Verwendung des gleichen Puffers wie vorstehend zum Sammeln von 8 ml Fraktionen eluiert, um gleichförmig reine EntD zu erhalten.
In ähnlicher Weise wurde o195 (Sofia et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 2576–2586) aus dem Wild-Typ E. coli K-12 durch Kolonie-PCR unter Verwendung des Vorwärts-Primers 5'-ATTATATCCATGGgtTAcCGGATAGTTCTGGGGAAAGTT-3' und dem Rückwärts-Primer 5'-TGATGTCAAGCTTATCAGTTAACTGAATCGATCCATTG-3' (IDT) mit PCR vermehrt. Der Vorwärts-Primer mit dessen NcoI-Restriktionsstelle (unterstrichen) ergab eine Insertion eines Gly-Codons (GGT) nach dem Met-Startcodon der o195 Sequenz. Die Codon-Nutzung für das nachfolgende Codon wurde ebenfalls optimiert (Basenänderung in Kleinbuchstaben gezeigt). Der Rückwärts-Primer führte eine HindIII-Restriktionsstelle (unterstrichen) ein. Das mit NcoI/HindIII verdaute PCR-Produkt wurde in pET28b (Novagen) kloniert und in kompetente E. coli DH5α transformiert. Die kompetenten Zellen des Überproduktions-Stamms E. coli BL21(DE3) wurden anschließend mit dem superverknäulten pET28b-o195 Plasmid transformiert. Induktion einer 2 L Kultur (2 xYT Medien) von BL21(DE3)pET28b-o195 mit 1 mM IPTG, gefolgt durch Wachstum bei 37°C für 3,5 Std. ergab hauptsächlich Einschluss-gebundenes o195 Protein. Die Zellpaste wurde in 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 5 % Glycerol, pH-Wert 8,0 (40 ml) resuspendiert und durch zwei Passagen durch eine French-Presse bei 15.000 psi lysiert. Zelltrümmer und Einschlussgebundenes Protein wurde durch Zentrifugation bei 27.000 × g für 30 Min. pelletiert. Das Pellet des Einschluss-gebundenen Proteins wurde in 30 ml einer Tris-HCl Lösung, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA und 5 % Glycerol resuspendiert und für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 10 mg Lysozym und 30 mg Deoxycholat inkubiert. Das Pellet wurde durch Zentrifugation für 15 Min. bei 27.000 × g erneut erhalten und in 30 ml von 8 M Harnstoff, pH-Wert 8,0, 10 mM DTT solubilisiert. Restliches festes Material wurde durch Zentrifugation für 15 Min. bei 27.000 × g entfernt. Die Harnstoff solubilisierte Lösung (30 ml) wurde dann auf eine 2,5 × 10 cm Q-Sepharose-Säue aufgetragen, die mit 8 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0 äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit 50 ml des Äquilibrierungspuffers gewaschen und anschließend wurde ein Gradient von 250 ml von 0–0,25 NaCl in 8 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl pH-Wert 8,0 gefolgt durch 200 ml von 0,25–1 M NaCL in dem gleichen Puffer aufgebracht. Das o195 Protein eluierte, wie durch ein 15 % SDS-PAGE bestimmt, bei ungefähr 200 mM NaCl. Das gereinigte o195 wurde durch 10-faches Verdünnen eines Anteils davon in 8M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 10 mM DTT renaturiert und über Nacht bei 4°C gegen 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM DTT dialysiert. Zwei Liter Kultur, die in 2 × YT Medien wuchsen, ergaben 3,1 g Zellen, aus denen ungefähr 80 mg von o195 Protein erhalten wurden.
Die Substrate wurden überproduziert und wie folgt gereinigt. Die E. coli Fettsäuresynthase ACP wurde überproduziert und aus E. coli Stamm DK554 (Crosby, J. et al., Biochemia et Biophysica Acta 1251 (1995), 32) dem Verfahren von Rock und Cronan (Rock, C.O. & Cronan, J.E. Jr. Methods Enzymol. 71 (1981), 241–351) folgend in dessen Apo-Form gereinigt, mit der Maßgabe, dass nach der Zellzerstörung und Zentrifugation (30 Min. bei 28.000 × g) der 10 mM MgCl₂ und 10 mM MnCl₂ beinhaltende Rohextrakt für 60 Min. bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Auf diese Weise wurden unter Verwendung der endogenen E. coli ACP Phosphodiesterase (Fischt, A.S. & Kennedy, E.P. J. Bacteriol. 172 (1990), 5445–5449) geringfügige Mengen von Holo-ACP zu der Apo-Form hydrolysiert.
Die Peptidyl-Trägerprotein (PCP) Domäne von TycA (10) wurde mit einem Hexa-Histidin-Tag unter Verwendung des E. coli Stamms SG13009(pREP4)/pQE60-PCP (Stachelhaus et al., Chemistry & Biology (1996) in press) überproduziert. Nach Lyse der induzierten Kultur wurde das His₆-getaggte Protein durch Nickel-Chelat Chromatographie gereinigt.
Apo-SrfB1 wurde aus Plasmid p120-21 E (Nakano, M.M. et al., J. Bacteriol. 173 (1991), 1770–1778) kloniert. In Kürze, p120-21E wurde mit EcoRV verdaut, um ein 3.648 Basenpaar-Fragment freizusetzen, das das SrfB1, die Valin aktivierte Domäne der Surfactin-Synthetase, codiert. Dieses Fragment wurde in ein StuI gespaltenes pPROEX-1 (Gibco/BRL life Sciences Technologies) eingefügt, um das Plasmid pML 118 zu ergeben, das für eine N-terminale Hexa-Histidin getaggte SrfB1 Domäne (142,7 kD) codiert. Das His6-SrfB1 wurde unter Verwendung des E. coli Stamms AG1574 (Frisby, D. & Zuber, P. J. Bacteriol. 173 (1991), 7557–7564) überproduziert. Die Zellen wurden bei 25°C in 2 × YT Medien (2L) bis zu einer OD von 0,4 gezüchtet, zu welchem Punkt sie mit 1 mM IPTG induziert wurden und für zusätzliche 4 Stunden wachsen konnten. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (3 g) geerntet, in 35 ml einer 5 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCL, pH-Wert 7,9 enthaltenden Lösung resuspendiert und durch zwei Passagen durch eine French-Presse lysiert. Dieser Rohextrakt wurde durch Zentrifugation für 30 Min. bei 27.000 × g geklärt. Mehr als 50 % des überexprimierten SrfB1 wurde in der löslichen Fraktion durch 6 % SDS- PAGE bestimmt. Das Hexa-Histidin getaggte SrfB1 wurde an einem His-bindendes Harz (Novagen) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers gereinigt.
EntF wurde überproduziert und wie in Keating, D.H. et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 22229 und Reichert, J. et al., Prot. Sci. 1 (1992), 549 beschrieben, aufgereinigt.
Phosphopantetheinyl-Transferaseaktivität, die auf ein Substrat gerichtet ist, wurde durch Überwachen der Übertragung von [³H]-4'-Phosphopantethein aus [³H]-(Pantetheinyl)-CoASH in der Gegenwart des möglichen P-pant Transferaseenzyms durch einen radioaktiven Test getestet. Die Enzympräparationen wurden mit 75 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 160 μM [³H]-(Pantetheinyl)-CoA, 25 μM ACP oder His6-PCP für 60 Min. bei 37°C in einem Endvolumen von 100 μl inkubiert. Die Inkubationen wurden mit 10 % TCA gestoppt und 500 μg BSA wurde als ein Träger zugegeben. Das Protein wurde durch Zentrifugation präzipitiert, 3 × mit 10 % TCA gewaschen und das Proteinpellet wurde mit 150 μl 1 M Tris-Base solubilisiert. Das resuspendierte Protein wurde zu 3 ml eines Flüssigkeitsszintillationscocktails zugegeben und die Menge von in dem Substratprotein eingebautem [³H]-Phosphopantethein wurde durch Flüssigkeitsszintillationsmessung quantifiziert.
Das spezifische kovalente Anbringen von 4'-Ppant an die ACP und His6-PCP Substrate wurde durch Autoradiographie bestätigt. Diese Tests wurden, wie vorstehend beschrieben, ausgeführt, mit der Maßgabe, dass 20 μM [³H]-(Pantetheinyl)-CoASH (2,6 × 10⁶ dpm Gesamtaktivität) in dem Test verwendet wurden, kein BSA wurde zu dem TCA-Präzipitat gegeben und die Pellets wurden in SDS oder in nativem PAGE Probenpuffer solubilisiert, der mit 1 M Tris-Base titriert war. Die Tests wurden unter Verwendung von Apo-PCP als Substrat durch 15 % SD-PAGE aufgelöst, wobei Tests, bei denen E. coli ACP verwendet wurden, durch ein 20 % natives PAGE aufgelöst wurden und Tests, bei denen die SrfB1 oder EntD verwendet wurden, wurden auf einem 8 % SDS-PAGE aufgelöst. Die Gele wurden mit Coomassie gefärbt, 30 Min. in Verstärker (Amersham) getränkt, bei –80°C unter vermindertem Druck getrocknet und für 24 bis 150 Stunden bei –70°C einem Röntgenfilm exponiert. Die Autoradiogramme wurden unter Verwendung eines digitalen Scanners gescannt und die relativen Intensitäten der radioaktiv markierten Banden wurden unter Verwendung einer NIH-Image 1.59 Software (National Institutes of Health, USA) quantifiziert.
Die Ergebnisse des Phosphopantetheinylierungstests, die in Gegenwart von Sfp, EntD oder o195 ausgeführt wurden, sind in 11 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Sfp, EntD und o195 Phosphopantetheingruppen auf ein Substrat, wie beispielsweise ACP und His6- PCP übertragen können. Es wurde weiterhin gezeigt, dass [³H]-Phosphopantethein tatsächlich nach der durch Sfp, EntD oder o195 vermittelten Phosphopantetheinylierungsreaktion spezifisch und kovalent an ACP und His6-PCP angebracht ist.
12 zeigt, dass EntD ein EntF-Fragment phosphopantetheinylieren kann und Sfp ein SfrB1-Fragment phosphopantetheinylieren kann.
Eine weitere Bestätigung, dass die Tritiumradioaktivität, die in den Apo-Proteinen eingebaut ist, eine Übertragung der intakten Phosphopantetheinylgruppe darstellt, wurde durch Massenspektrometrie (Lambalot, R.H. and Walsh, C.T. j. Biol. Chem. 270 (1995), 24658) bewertet. Eine Massenspektrometrieanalyse (MALDI-TOF) einer nicht markierten enzymatischen Holo-PCP zeigte ein Molekulargewicht von 13.431 (berechnet 13.459) im Gegensatz zu einem beobachteten Molekulargewicht von 13.130 (berechnet 13.120) für das Apo-PCP Substrat. Daher zeigen diese Daten, dass EntD, Sfp und o195 Enzyme sind, die die Übertragung eines Ppant auf die Serinseitenkette eines Acyl-Trägerproteins katalysieren.
Zur Bestimmung eines Km für Apo-ACP und His6-PCP unter Verwendung von Sfp, wurde der lineare Bereich des Tests bestimmt, indem die prozentuale Umsetzung eines Apo-Substrats gegen die Zeit bei verschiedenen Enzymkonzentrationen unter Verwendung des vorstehend beschriebenen radioaktiven Tests bestimmt wurde. Wurde der lineare Bereich des Tests bestimmt, dann wurde die Anfanggeschwindigkeit der Phosphopantetheinylübertragung unter Verwendung einer festen Konzentration von Sfp und verschiedenen Konzentrationen des Substrat (ACP oder His6-PCP) erfasst.
Die Ergebnisse sind in 13 dargestellt. Diese zeigen, dass Sfp ein Substrat, wie beispielsweise PCP, in einem weiten Konzentrationsbereich phosphopantetheinylieren kann.
Ein Zeitverlauf eines EntD katalysierten Einbaus einer radioaktiven Markierung in EntF wurde ausgeführt. Wie in 14A gezeigt, wird EntF durch EntD (100 nM) effizient modifiziert, während EntF in Gegenwart einer 15-fach höheren Konzentrationen von ACPS und o195 nahezu keine Modifikationen erfährt, was die Spezifität von EntD für EntF deutlich zeigt. Dagegen zeigt 14B eine nahezu ausschließliche Modifikation von Apo-ACP durch ACPS, was bestätigt, dass ACPS die P-pant-Transferase ist, die die Typ II Fettsäuresynthase aktiviert und EntD ist die P-pant-Transferase, die die Typ I Enterobactin Synthetase in E. coli aktiviert.
Daher stellt diese Analyse einen in vitro Beleg von mindestens zwei Partner spezifischen P-pant Übertragungsreaktionen bereit, die innerhalb E. coli vorkommen: ACPS katalysiert spezifisch eine Übertragung von P-pant auf Apo-ACP, während EntD die Partner-Transferase für EntF ist. Es ist wahrscheinlich, dass o195 eine einzigartige Spezifität für ein drittes unbekanntes Substrat in E. coli aufweist. Es ist wahrscheinlich, dass eine P-pant Übertragung auf dieses unbekannte Protein lediglich durch o195 effizient und nicht durch ACPS oder EntD katalysiert würde. Ein möglicher Partner für o195 ist das unbekannte 35 kDa Protein in E. coli, das beobachtet wurde [³H]β-Alanin in vivo einzubauen (Gerngross, T.U. et al., Biochemistry 33 (1994), 9311).
Andererseits würde Sfp bezüglich der zwei von Bacillus abgeleiteten Typ I Peptidsynthetasedomänen, PCP und SrfB1, und der E. coli Typ II Fettsäuresynthase ACP Untereinheit nicht spezifisch erscheinen. Wie vorstehend gezeigt katalysiert Sfp Modifikationen von allen drei Substraten effizient und kann zusätzlich eine Modifikation von EntF katalysieren. Basierend auf diesem Beleg scheint Sfp nicht zwischen Typ I Peptidsynthetasedomänen und Typ II Fettsäure-Untereinheiten unterscheiden, wodurch nahe gelegt wird, dass zwischen Sfp und Fettsäuresynthetasen zumindest, wenn sie in E. coli exprimiert sind, ein CROSS TALK besteht.
Die Versorgung/Einrichtung einer Phosphopantetheinyl-Übertragungsaktivität für Sfp in den hier beschriebenen Untersuchungen bezeichnet deutlich eine katalytische Ladefunktion für Sfp zur post-translationalen Modifikation des konservierten Serins in der ersten Nebenstelle von SrfB, die für eine Valinaktivierung verantwortlich ist. Das srf-Operon besteht aus vier offenen Leserastern, in denen srfA, srfB und srfC für die Aktivitäten codieren, die sieben Komponentenaminosäure und die verzweigtkettige β-Hydroxy-Fettsäure von Surfactin aktivieren und anordnen. Es ist wahrscheinlich, dass Sfp den Konsensus Serinrest an allen sieben Aminosäure aktivierenden Stellen in SrfABC modifizieren kann.
Durch Erweiterung ist gsp für die post-translationale Modifikation der fünf Aminosäuren aktivierenden Stellen in GrsA und GrsB verantwortlich, wodurch die sequentielle Aktivierung und Polymerisation von Aminosäuren in dem Thiomatrizenmechanismus zur nicht ribosomale Peptidbindungsanordnung gestattet wird.
In ähnlicher Art und Weise weist eine 4'-Phosphopantetheinyl (4'-Ppant) Transferaseaktivität in EntD, EntD eine biochemische Funktion zu. EntD, eine 140 kDa Komponente in dem Stoffwechselweg, wurde kürzlich kloniert, sequenziert und gereinigt und es wurde gezeigt, dass diese L-Serin aktiviert und Phosphopantethein (Rusnak, F. et al., Biochemistry 30 (1991), 7740) enthält. Mit der Maßgabe, dass EntD für die Enterobactin-Biosynthese in vivo erforderlich ist und falls, wie vorstehend ausgeführt, eine hohe Aktivität für eine in vitro Phosphopantetheinylierung von reinem Apo-EntF zeigt, dann kann EntD als die spezifische P-pant-Transferase definiert werden, die in vivo aus Apo-EntF aktives Holo-EntF erzeugt. Reines E. coli ACPS wird EntF nicht signifikant post-translational modifizieren, was mit der Hypothese übereinstimmt, dass eine Protein-Protein Erkennung die Spezifität einer Phosphopantetheinylierung in vivo steuert. Es ist wahrscheinlich, dass Inkubationen von EntD und den Enterobactinsynthetasekomponenten mit CoASH, L-Serin und Dihydroxybenzoat die Enterobactin-Produktion in vitro wiederherstellt. Mit 140 kDa stellt EntD die gewöhnliche Größe eines AA aktivierenden Moduls bei Multidomänen Polypeptid-Synthetasen (Stachelhaus, T. & Marahiel, M.A. FEMS Microbiol. Lett, 125 (1995), 3) dar. Dessen effiziente Modifikation durch EntD in vitro zeigt, dass eine Ppant Addition des Apo-Proteins nach der Translation vielmehr als ausschließlich co-translational vor einem Falten des Apo-Proteins in dessen native Struktur vorkommen kann. Die NMR-Struktur von E. coli Apo-ACP zeigt, dass das nukleophile Ser-36 sich in einer zugänglichen β-Windung (Holak, T.A. et al., Eur. J. Biochem. 175 (1988), 9), möglicherweise einer gemeinsamen architektonischen Grundstruktur für ACP-Domänen in Polyketid- und PolypeptidSynthasen befindet, die bei einer Erkennung durch P-pant-Transferasen eine Rolle spielen können.
Die Genetik spricht stark für eine spezifische Partnerpeptidsynthetasenerkennung durch ein gegebenes, post-translational wirkendes Modifikationsenzym und dies kann gut ein Thema bei der nicht ribosomalen Peptidantibiotika-Biosynthese sein. Es wurde vorher beobachtet, dass reine E. coli ACP-Synthase EntD nicht post-translational modifizieren wird, was mit einer Protein-Protein-Erkennung übereinstimmt, um eine Spezifität zu steuern.
Beispiel 4: Holo-SrfB1 ist kompetent zur Aktivierung seiner erkennenden bzw. Erkennungs-Aminosäure L-Valin.
Diese Beispiel zeigt, dass Holo-SrfB1, das in vitro von einer Modifikation eines Apo-SrfB1 mit Sfp erzeugt wurde, zur Aktivierung dessen erkennender Aminosäure L-Valin befähigt ist.
Die Reaktion wurde wie folgt ausgeführt. Apo-SrfB1 (2 μM) wurde mit 200 μM CoASH, 75 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 10 mM MgCl₂, 25 mM DTT und 1,3 μM Sfp für 15 Min. bei 37°C inkubiert, um Holo-SrfB1 zu erzeugen. Zu dem SrfB1-Sfp Reaktionsgemisch wurde nicht markierte Aminosäure (Valin oder Asparaginsäure) zu 90 μM Endkonzentration zugegeben. ATP wurde zu einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben, gefolgt durch 0,5 μCi [¹⁴C]Val (281 Ci/mol) oder [¹⁴C]Asp (207 Ci/mol). Die Reaktion (115 μl) wurde für 15 Min. bei 37°C inkubiert, anschließend durch die Zugabe von 800 μl 10 % TCA mit 15 μl einer 25 mg/ml BSA-Lösung als Carrier gestoppt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt, mit 10 % TCA gewaschen, in 150 μl Tris-Base gelöst und dann durch Flüssigkeitsszintillation gemessen.
Die Ergebnisse sind in 15 dargestellt. Das in dieser Figur dargestellte Histogramm zeigt, dass wird Apo-SrfB1 mit [¹⁴C]-L-Valin inkubiert eine sehr geringe Acylierung erfährt, was eine Verunreinigung kleiner Mengen durch Holo-SrfB1 anzeigt. Nach Inkubation mit Sfp steigt jedoch der Grad des kovalenten Komplexes von [¹⁴C]-L-Valin-Holo-SrfB1 in dem gesamten Inkubationsgemisch ungefähr 14-fach an, was mit einem Anstieg in der vorhandenen Menge von Holo-SrfB1 übereinstimmt. Dies ergibt sich von der Bildung von Valyl-AMP durch die Aminosäure aktivierende Domäne von Holo-SrfB1, gefolgt durch intramolekularen Acyl-Übertragung auf die SH-Gruppe des P-pant-Rests in der benachbarten PCP-Domäne. Schließlich kann Holo-SrfB1 durch den nicht erkennenden L-Aspartatrest nicht kovalent acyliert werden, die die durch SrfABC zu aktivierende fünfte Aminosäure ist, was mit der Abwesenheit einer Aspartat spezifischen Adenylierungsdomäne an SrfB1 übereinstimmt.
Dieses Beispiel zeigt daher, dass das Holo-SrfB1 nach Inkubation mit Sfp und CoaSH sowohl eine aktive Adenylierungsdomäne als auch eine funktionelle Holo-Peptidyl-Trägerproteindomäne aufweist. Weiterhin wird gezeigt, dass die Wirkung von Sfp auf das SrfB1-Fragment bei der Umsetzung der Apo- zu der Holo-Form ein kompetentes phosphopantetheinyliertes SrfB1 erzeugt, um durch die Aminosäure L-Valin, Rest 4 in Surfactin, eine spezifische Erkennung und Acylierung zu erfahren. Sfp und andere Phosphopantetheinyl-Transferasen sollten daher beispielsweise nützliche Reagenzien sein, um Peptidbindung bildende Schritte zwischen benachbarten Stellen von Multienzym, mehrfacher Thiomatrizensynthasen, zu testen.
Beispiel 5: Identifikation zusätzlicher phosphopantetheinylierender Enzyme
Verwenden der EntD/Sfp/Gsp Familie als eine Basis für weitere Datenbankdurchsuchungen führte zu der Identifikation mehrerer zusätzlicher Kandidaten, die wahrscheinlich Mitglieder der 4'-P-pant-Transferasefamilie (Tabelle IV und 9) sind. Ein hypothetisches Protein, HIO152 in H. Influenzae wurde als eine mögliche P-pant Transferase identifiziert, wodurch dem scheinbaren Fehlen (Verwenden von auf ACPS basierten Suchen) einer P-pant-Transferase in dem Genom von Haemophilus genüge getan wird. HIO152 ist unmittelbar stromaufwärts des Fettsäuresynthase-Genclusters von H. influenzae lokalisiert, was mit einer Funktion für dessen Proteinprodukt bei der Fettsäurebiogenese übereinstimmt. Außerdem werden in Tabelle IV und 9 zwei zusätzliche Proteine in Cyanobakterien und Hefe identifiziert, für die frühere genetische Belege mit den hier vorgeschlagenen möglichen Funktionen übereinstimmen. In Anabaena wurden die Gene HetI, HetM und HetN mit der Herstellung eines vorgeschlagenen sekundären Metaboliten in Zusammenhang gebracht, der die Heterocystendifferenzierung hemmt, einen Vorgang, der unter Bedingungen einer niedrigen Stickstofffixierung vorkommt, bei dem eine Subpopulation von cyanobakteriellen Zellen in spezialisierte Heterocysten differenzieren, die die Fähigkeit aufweisen Stickstoff zu fixieren (Black, T.A. & Wolk, C.P. J. Bacteriol. 176 (1994), 2282). Die Sequenzanalyse legt nahe, dass HetN eine NAD(P)H abhängige Oxidoreduktase, wie solche in der Biosynthese von Polyketiden und Fettsäuren beteiligten ist, während HetM eine ACP-Domäne aufweist. HetI ist daher mit dessen Ähnlichkeit zu Sfp/Gsp/EntD wahrscheinlich die HetM spezifische Phosphopantetheinyl-Transferasen bei der Synthese des hypothetischen sekundären Metaboliten.
Ein anderer Kandidat der phosphopantetheinylierenden Enzymfamilie ist das 272 Aminosäuren unfassende Lys5 Protein, das in der Hefe an dem biosynthetischen Lysin-Stoffwechselweg beteiligt ist. Hefe und andere Pilze synthetisieren Lysin über den einzigartigen α-Aminoadiapat-Stoffwechselweg, einen Acht-Schritte Stoffwechselweg, der mit Homocitrat beginnt und über α-Aminoadiapat zu Saccharopin zu Lysin fortführt (Bhattachrjee, J.K. CRC Critical Reviews in Microbiology 12 (1985), 131). Eine genetische Analyse hatte durch Komplementation zur Folge, dass Lys2 und Lys5 an dem gleichen Schritt dieses Stoffwechselwegs, der Reduktion von α-Aminoadiapat zu Aminoadiapat-Semialdehyd (Storts, D.R. & Bhattacharjee, J.K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 161 (1989), 182) beteiligt zu sein scheinen. Diese Reaktion scheint, wie durch Austauschexperimente mit markiertem Pyrophosphat angezeigt (Sagisaka, S. & Shimura, K. Nature 188 (1960) 1191; Sinha, A.K. & Bhattacharjee, J.K. Biochem. J. 125 (1971), 743) durch ein α-Aminoadipoyl-AMP-Zwischenprodukt abzulaufen. Neueste Sequenzanalysen (Morris, M.E. & Jinks-Robertson, S. Gene 98 (1991), 141) zeigen, das Lys2 ein 155 kDa Protein mit einer Homologie zu Aminosäure aktivierenden Peptidsynthetasen, einschließlich TycA, GrsAB und SrfA, ist. Analog zu diesen Peptidsynthetasen, wird angenommen, dass Lys2 ATP zu AMP und PPi spaltet, wodurch α-Aminoadiapat als das α-Aminoacyl-AMP aktiviert wird, welches anschließend durch NADPH zu dem Aldehyd reduziert wird. Eine Suche nach einer Konsensus P-pant-Anhaftungsstelle in Lys2 ergab das Signaturmotiv LGGHS um Ser-880. Es ist somit wahrscheinlich, das Lys2 und Lys5 ein Enzym aus zwei Untereinheiten (Storts, D.R. and Bhattacharjee, J.K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 161 (1989), 182) bilden, und das das 272 AA umfassende Lys5 eine spezifische Phosphopantetheinyl-Transferase für Ser-880 in Lys2 ist. Das Thiol der neu eingeführten prosthetischen Ppant Gruppe an Lys2 würde das Aminoadipoyl-AMP angreifen, um in enger Analogie zu der sequentiellen Bildung von Aminoacyl-AMP zu Aminoacyl-S-pant-TycA in der homologen Tyrocydin-SynthetaseA-Untereinheit, Aminoadipoyl-S-pant-Lys2 zu ergeben. An diesem Punkt würde eine Hydridaddition zu dem Acyl-S-pant-Lys2 ein Thiohemiacetal ergaben, das leicht zu dem Aldehyd-Produkt und dem H-pant-Lys2 zerfällt. Diese Sequenz kann in die umgekehrte Richtung ablaufen, in der Oxidation von Glyceraldehyd-3-P zu dem Acyl-S-Enzym bei der Katalyse von GAP-Dehydrogenase über ein Cysteinyl-S-Enzym Hemithioacetal (Walsh, C.T. Enzymatic Reaction Meachnisms, W.H. Freeman and Company, New York (1979)).
Die bli- und lpa-14-Genprodukte spielen sehr wahrscheinlich eine äquivalente Rolle, einer iterativen P-Pantetheinylierung von jeder AA aktivierenden Domäne bei der Bacitracin-Synthetase in B. licheniformis (Gaidenko, T.A. et al., Biotechnologia 13 (1992)) und der IturinA Synthetase von B. subtilis (Huang, C.-C. et al., J. Ferment. Bioeng. 76 (1993), 445). Tabelle IV. ACP Synthasehomologe
Diese Ergebnisse stellen daher Belege für das Vorhandensein einer Familie von mehr als einem Dutzend Proteinen bereit, die eine katalytische, post-translationale Modifikationsaktivität aufweisen. Es ist wahrscheinlich, dass P-Pantetheinyl-Transferasen vorkommen, die CoASH als ein gemeinsames Substrat aufweisen, wobei diese jedoch eine Spezifität zeigen, die durch Protein-Protein-Wechselwirkungen auf das konservierte Serinmotiv in den spezifischen Partnerproteinen gerichtet ist. Weiterhin ist es wahrscheinlich, dass die meisten, wenn nicht alle, der Multienzym-Peptid-Synthetasen, die das mehrfach Thiomatrizengrundgerüst verwenden, um Peptidantibiotika nicht-ribosomal zu erzeugen, diesem Paradigma eines spezifischen post-translational modifizierenden Enzyms folgen, um die für Acyl-Übertragungen erforderliche Schwingarm-Thiolgruppe kovalent zu befestigen. Verglichen zu der 126 Aminosäuren umfassenden E. coli Untereinheit von ACPS weisen die in 6, 8 und 9 gezeigten Phosphopantetheinyl-Transferasehomologe einen 50–150 Aminosäurerest auf, die Spezifität übertragende Bereiche für Partnerproteine sein können.
Equivalente
Dem Fachmann werden zahlreiche Equivalente zu den hier beschriebenen spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsformen bekannt sein oder unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten bestimmen können. Derartige Equivalente sollen durch die folgenden Ansprüche umfasst sein.

Claims

Verfahren zur Phosphopantetheinylierung eines Substrats in einer Zelle oder zur Steigerung der Phosphopantetheinylierung eines Substrats in einer Zelle, welches umfasst, Transformieren der Zelle mit einer exprimierbaren Form eines Gens, welches eine Phosphopantetheinyl-Transferase codiert, derart, dass das Substrat phosphopantetheinyliert wird oder dass die Phosphopantetheinylierung des Substrats in der Zelle im Vergleich zu einer nicht-transformierten Zelle erhöht wird, und weiter umfassend, Transformieren der Zelle mit einer exprimierbaren Form eines Gens, welches ein Acyl-Trägerprotein vom Typ I oder Typ II codiert, und worin die Transferase das Aminosäuresequenzmotiv 2b (F/W-N-N-K/R-E-S/A-N-N-K) oder das Aminosäuresequenzmotiv 2a (W-S-A-K-E-N-N-N-K-N-N-G) umfasst, worin N jeden Aminosäure-Rest darstellt, und worin zwei durch "/" getrennte Aminosäuren einen Rest darstellen, welcher jeder der Aminosäuren sein kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Transferase weiter das Aminosäuresequenzmotiv 1b (G-N-D) umfasst, worin N jeden Aminosäure-Rest darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Transferase weiter das Aminosäuresequenzmotiv 1a (G-N-D-N-N-E) umfasst, worin N jeden Aminosäure-Rest darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Phosphopantetheinyl-Transferase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sfp, EntD, o195, E. coli Acyl-Trägerprotein-Synthase und aktiven Fragmenten davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zelle eine prokaryotische Zelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zelle eine Hefezelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zelle E. coli ist.
Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums in einer Zelle umfassend, Transformieren einer Zelle mit einer exprimierbaren Form eines ersten Gens, welches eine Phosphopantetheinyl-Transferase codiert, und einer exprimierbaren Form eines zweiten Gens, welches ein Acyl-Trägerprotein vom Typ I oder Typ II codiert, derart, dass das Antibiotikum in der Zelle produziert wird, worin die Transferase das Aminosäurensequenzmotiv 2b (F/W-N-N-K/R-E-S/A-N-N-K) oder das Aminosäuresequenzmotiv 2a (W-S-A-K-E-N-N-N-K-N-N-G) umfasst, worin N jeden Aminosäure-Rest darstellt, und worin zwei durch "/" getrennte Aminosäuren einen Rest darstellen, welcher jeder der Aminosäuren sein kann.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Transferase weiter das Aminosäuresequenzmotiv 1b (G-N-D) umfasst, worin N jeden Aminosäure-Rest darstellt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Transferase weiter das Aminosäuresequenzmotiv 1a (G-N-D-N-N-E) umfasst, worin N jeden Aminosäure-Rest darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, weiter umfassend, Transformieren einer Zelle mit einer exprimierbaren Form von mindestens einem dritten Gen, welches ein Protein codiert, das zur Synthese des Antibiotikums in der Zelle erforderlich ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das Antibiotikum ausgewählt ist unter Erythromycin, Clarythromycin, Oxytetracyclin, Bacitracin, Cyclosporin, Penicillinen, Cephalosporinen und Vancomycin.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Phosphopantetheinyl-Transferase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sfp, EntD, o195, E. coli Acyl-Trägerprotein-Synthase und aktiven Fragmenten davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das Antibiotikum ein Polyketid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das Antibiotikum ein nicht-ribosomal hergestelltes Peptid ist.