HU219265B - Process for the efficient production of 7-adca via 3-(carboxyethylthio)propionyl-7-adca, recombinant dna vectors and host cells - Google Patents
Process for the efficient production of 7-adca via 3-(carboxyethylthio)propionyl-7-adca, recombinant dna vectors and host cells Download PDFInfo
- Publication number
- HU219265B HU219265B HU9600195A HU9600195A HU219265B HU 219265 B HU219265 B HU 219265B HU 9600195 A HU9600195 A HU 9600195A HU 9600195 A HU9600195 A HU 9600195A HU 219265 B HU219265 B HU 219265B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- adca
- gene
- carboxyethylthio
- propionyl
- chrysogenum
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
A találmány a 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav (7-ADCA)előállítására és izolálására alkalmas nagy hatásfokú eljárásravonatkozik, amelyben a 7-ADCA előállítása 3,3’-tio-dipropionsavjelenlétében 3-(karboxi-etil-tio)-- propionil-7-ADCA-n keresztültörténik olyan transzformált Penicillium chrysogenum használatával,amely együtt fejezi ki az expandázt és az aciltranszferázt. Atalálmány továbbá az eljárásban alkalmazható rekombináns DNS-vektorokra és transzformált gazdasejtekre is vonatkozik. ŕ
Description
A találmány a 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav (7-ADCA) előállítására és izolálására alkalmas bioszintetikus eljárásra, továbbá erre szolgáló rekombináns DNS-vektorokra és transzformált gazdasejtekre vonatkozik.
A β-laktámantibiotikumok az antibiotikus vegyületek legfontosabb csoportját alkotják, és klinikai felhasználásuk nagy múltra tekint vissza. A csoporton belül a legkiemelkedőbbek a penicillinek és cefalosporinok. Ezeket a vegyületeket a természetben a Penicillium chrysogenum, illetve Acremonium chrysogenum fonalas gombák termelik.
A klasszikus törzsjavító technikák eredményeként az elmúlt évtizedek folyamán a Penicillium chrysogenum és Acremonium chrysogenum törzsekben drámaian megnőtt az antibiotikumtermelés szintje. A penicillineket és cefalosporinokat eredményező bioszintetikus folyamatok egyre jobb megismerése és a rekombináns DNS-technológia megjelenése révén új eszközök váltak elérhetőkké a termelőtörzsek tökéletesítésére és a vegyületek in vivő módosítása területén.
A β-laktám bioszintézisében részt vevő legtöbb enzimet azonosították, és a megfelelő géneket klónozták [lásd: Ingolia and Queener, Med. Rés. Rév., 9, 245-264 (1989) (bioszintetikus út és enzimek); Aharonowitz, Cohen and Martin, Ann. Rév. Microbiol., 46, 461-495 (1992) (génklónozás)].
A P. chrysogenumban a penicillin bioszintézisének első két lépése három aminosav - L-5-amino-5-karboxi-pentánsav [L-a-amino-adipinsav (A)], L-cisztein (C) és L-valin (V) - az LLD-ACV tripeptiddé való kondenzációja, majd ezt követően a tripeptid ciklizálódása izopenicillin N-né. Ez a vegyület tipikus β-laktámszerkezetet tartalmazza.
A harmadik lépésben az L-5-amino-5-karboxi-pentánsav hidrofil lánca aciltranszferáz (AT) enzim hatására hidrofób oldalláncra cserélődik ki. A penicillin G-termelés ipari eljárásában a választott oldallánc a fenilecetsav (PA=phenylacetic acid). Az EP-A-0532341 számú európai szabadalmi bejelentésben nyersanyagként egy adipát (5-karboxi-pentanoát) szerepel. Ennek a szubsztrátumnak a bevitele egy 5-karboxi-pentanoiloldallánc-tartalmú penicillinszármazékot, azaz 5-karboxi-pentanoil-6-amino-penicillánsavat eredményez. E szubsztrátum bevezetése annak a ténynek tudható be, hogy az aciltranszferáznak bizonyítottan széles a szubsztrátumspecificitása [Behrens et al., J. Bioi. Chem., 175, 751-809 (1984); Colé, Process. Biochem., 1, 334-338 (1966); Ballio et al., Natúré, 185, 97-99 (1960)]. Az AT közvetítette enzimes kicserélődési reakció egy sejtorganellumban, a mikrotestben megy végbe, ahogyan ezt az EP-A-0448180 számú európai szabadalmi bejelentés leírja.
A cefalosporinok sokkal drágábbak, mint a penicillinek. Ennek egyik oka az, hogy bizonyos cefalosporinok (például a cefalexin) előállítása penicillinekből történik számos kémiai konverziós lépésen keresztül. Egy másik ok az, hogy eddig csak D-5-amino-5-karboxi-pentanoil-oldallánccal ellátott cefalosporinokat lehetett fermentálni. A cefalosporin C, amely e tekintetben messze a legfontosabb kiindulási anyag, minden pH-η nagyon jól oldódik vízben, és ez nehézkes és drága oszloptechnikák használatát igénylő hosszadalmas és költséges izolálási eljárásokat von maga után. Az ilyen módon előállított cefalosporin C-t kémiai és enzimes átalakítások segítségével kell terápiásán használható cefalosporinokká konvertálni.
A 7-ADCA-köztiterméket jelenleg a penicillin G kémiai átalakítása révén termelik. A 7-ADCA termeléséhez szükséges kémiai lépések a penicillin 5 tagú gyűrűs szerkezetének 6 tagú cefalosporin gyűrűs szerkezetté való expandálását tartalmazzák. Ezeket a gyűrűs expanziókat azonban csak a Streptomyces clavuligerus fonalas baktériumból származó expandáz enzim képes elvégezni. Ha az enzimet bevisszük a P. chrysogenumba, a penicillin gyűrűs szerkezetét cefalosporin gyűrűs szerkezetté tudja konvertálni [lásd: Cantwell et al., Proc. R. Soc. Lond. b., 248, 283-289 (1992); EP-A-0532341 és EP-A-0540210]. Az expandáz enzim mind biokémiai, mind funkciós szempontból jól jellemzett (EP-A-0366354), megfelelő génjét ismerjük. Leírták a cefE gén fizikai térképét (EP-A-0233715), DNS-szekvenciáját és ismertettek a P. chrysogenum cefE-vel való transzformációjával kapcsolatos tanulmányokat is.
Az alkalmas gyűrűexpanziós enzim egy másik forrása a Nocardia lactamdurans fonalas baktérium (azelőtt Streptomyces lactamdurans). Az enzim biokémiai tulajdonságait és a gén DNS-szekvenciáját közölték [Cortes et al., J. Gén. Microbiol., 133, 3165-3174 (1987); Coque et al., Mól. Gén. Génét., 236, 453-458 (1993)].
Az EP-A-0532341 számú európai szabadalmi bejelentés részletesebben írja le az expandáz enzim in vivő használatát P. chrysogenumban, 5-karboxi-pentanoil-oldallánc nyersanyaggal kombinálva, amelyet szubsztrátumként használnak a P. chrysogenumban lévő aciltranszferázhoz. Ebben a reakcióban 5-karboxipentanoil-6-ΑΡΑ képződik, amelyet a P. chrysogenum törzsbe bevezetett expandáz enzim 5-karboxi-pentanoil-7-ADCA-vegyületté konvertál. Végül az 5-karboxi-pentanoil-oldallánc eltávolítását javasolják, aminek következtében 7-ADCA-végtermék keletkezik.
Az EP-A-0540210 számú európai közrebocsátási iratban hasonló eljárást írnak el a 7-ADCA előállítására. Az eljárás külön lépéseket tartalmaz az ADCAgyűrű 3-metiloldalláncának az ACA 3-acetoxi-metil-oldalláncává való konvertálására.
A HU 217 171 számú magyar szabadalmi leírás eljárást, expressziós vektort és gazdasejtet ismertet 7ADCA előállítására, amelyben egy expandáz génnel transzformált Penicillin chrysogenum törzset tenyésztenek adipátszubsztrát jelenlétében, hogy adipoil-6APA-t termeljenek, amely 7-adipoil-ADCA-vá expandálódig és ezt követően adipoil-acilázzal hasítva kapják a 7-ADCA-t.
A HU 205 387 számú magyar szabadalmi leírás dezacetoxi-cefalosporin-C-szintetáz és dezacetil-cefalosporin-C-szintetáz-aktivitású fehérjéket kódoló DNSszekvenciákat ismertet cefalosporinexpandáz-aktivitású fehérjék expresszálására.
HU 219 265 Β
A HU 209 581 számú magyar szabadalmi leírásban eljárást írnak le dezacetoxi-cefalosporin-C-szintetázenzim magas fokú kifejezésére rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtekben.
A fent említett szabadalmi leírások közül azonban egyik sem közöl eredményes és gazdaságilag hatékony módszert 7-ADCA előállítására, főként mivel nem ismerték fel az expandáz enzim kellő időben történő kifejeződésének problémáját.
A találmány alapja az a felismerés, hogy az expandáz enzimnek az aciltranszferáz enzimmel együtt és kellő időben kell kifejeződnie. Ehhez az expandáz génnek az aciltranszferáz (AT) gén megfelelő szabályozóelemeinek transzkripciós és transzlációs szabályozása alatt kell állnia, hogy a gének kellő időben, egyidejűleg fejeződjenek ki.
Ezen túlmenően azt találtuk, hogy a 3,3’-tio-dipropionsav egy nagyon alkalmas új oldalláncprekurzor, melyet a P. chrysogenum igen eredményesen visz be a megfelelő penicillinekbe, amelyek ezután az expandáz enzim hatására expandálódnak.
Ezenfelül találtunk egy hatékony módszert az új ΊADCA-származékok fermentléből való izolálására a dezacilezés előtt. A találmány szerinti eljárásban egy egyszerű oldószeres extrakciós lépésben a 7-ADCAszármazék kinyerhető, és a további lépésben dezacilezhető.
A találmány egy valóban minden tekintetben eredményes eljárást ismertet 7-ADCA előállítására, amely eddig még nem javasolt reakciólépéseket foglal magában.
A találmány alkalmazásával és az EP-A-05440210 számú európai közrebocsátási iratban leírtakkal analóg módon a 7-ACA is előállítható ezzel az eredményes eljárással.
Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik:
1. ábra: a pMcTNE plazmid funkciós térképe;
2. ábra: a pMcTSE plazmid funkciós térképe;
3. ábra: a pMcTNde plazmid funkciós térképe;
4. ábra: a pGNETA plazmid funkciós térképe;
5. ábra: a pGSETA plazmid funkciós térképe;
6. ábra: a pANETA plazmid funkciós térképe;
7. ábra: a pASETA plazmid funkciós térképe;
8. ábra: a Nocardia lactamdurans cefE DNS-szekvenciája (Coque et al., lásd fentebb) (alsó sorok), amelyhez az 1. PCR-termék szekvenciáját igazítottuk (felső sorok).
Az alábbiakban ismertetjük a szekvencialistákat.
1-13. számú szekvenciák: P. chrysogenum expressziós kazetta szerkesztésében felhasznált oligonukleotidok a Streptomyces clavuligerus és Nocardia lactamdurans cefE gének számára.
14. számú szekvencia: a Nocardia lactamdurans cefE DNS-szekvenciája (Coque et al., lásd előbb).
A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás 7amino-dezacetoxi-cefalosporánsav (7-ADCA) előállítására és izolálására, amely abban áll, hogy (i) egy Penicillium chrysogenum törzset transzformálunk egy expandáz génnel, beépítve a P. chrysogenumban lévő aciltranszferáz (AT) gén expressziós szignáljainak transzkripciós és transzlációs szabályozása alá a két gén szinkronizált expressziójához;
(ii) a transzformált törzset alkalmas táptalajban fermentáljuk, amelyhez szubsztrátként hozzáadunk 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-6-amino-penicillánsav és [3(karboxi-etil-tio)-propionil-6-APA] képződéséhez elegendő mennyiségű 3,3’-tio-dipropionsavat vagy annak sóját, vagy észterét, a képződött 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-6-APA-t in situ 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7ADCA-vá expandáljuk;
(iii) a 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA-t a fermentléből izoláljuk;
(iv) a 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA-t dezacilezzük; és (v) a kristályos 7-ADCA-t izoláljuk.
A (v) lépésben a 7-ADCA-t előnyösen szűréssel izoláljuk.
Az (iii) lépésben előnyösen a 3-(karboxi-etil-tio)propionil-7-ADCA-t úgy izoláljuk, hogy a fermentlevet szűrjük, majd egy vízzel nem elegyedő szerves oldószenei 4,5-nél alacsonyabb pH-η extraháljuk, majd vízzel pH 4 és 10 között visszaextraháljuk.
Az expandáz gén előnyösen Streptomyces clavuligerusból vagy Nocardia lactamduransból származik.
A P. chrysogenum törzset az (i) lépésben előnyösen egy rekombináns DNS-vektorral transzformáljuk, amely az expandáz enzimet kódoló DNS-szekvenciát fonalas gomba eredetű expressziós szignálok transzlációs és transzkripciós kontrollja alatt tartalmazza.
A találmány tehát rekombináns DNS-vektorokra is vonatkozik, amelyek egy expandáz enzimet kódoló DNS-szekvenciát fonalas gomba eredetű expressziós szignálok transzlációs és transzkripciós kontrollja alatt tartalmaznak.
Előnyösen a rekombináns vektorban az expandázt kódoló DNS-szekvencia a P. chrysogenum AT gén vagy az A. nidulans gpdA gén transzlációs és transzkripciós szabályozása alatt áll. Az expandázt kódoló DNS előnyösen Streptomyces clavuligerus vagy Nocardia lactamdurans eredetű.
A találmány tárgyát képezik továbbá a transzformáit fonalas gomba, előnyösen P. chrysogenum gazdasejtek, melyek egy találmány szerinti rekombináns vektorral vannak transzformálva.
A találmány tehát P. chrysogenumban működőképes, a penicillingyűrű in vivő expandálására alkalmas génszerkezetek használatára vonatkozik, amelyet a bioszintetikus enzimekhez szolgáló új szubsztrátum felhasználásával kombinálunk abból a célból, hogy a cefalosporinbioszintézis egy kulcsköztitermékének, a 7amino-dezacetoxi-cefalosporánsavnak (7-ADCA) új származékait állítsuk elő. Ezeknek a származékoknak a kémiai összetétele hatékony oldószeres extrakciót tesz lehetővé, ami gazdaságos izolálási eljárást eredményez.
A P. chrysogenum transzformálását elvben különböző DNS-bevezetési módszerekkel valósíthatjuk meg, ilyen például a protoplaszt által történő felvétel, melyet a PEG-Ca közvetít, az elektroporáció vagy a részecskebelövésés technikák. Ezt követi a transzformált sejtek
HU 219 265 Β szelekciója. Lásd például: Van den Hondel en Punt: „Gene Transfer and Vector Development fór Filamentous Fungi” című fejezet az Applied Molecular Genetics of Fungi (szerkesztők: Peberdy, Latén, Ogden, Bennett) című kiadványban (Cambridge University Press, 1991). A domináns és nem domináns szelekciós markerek alkalmazását Van den Hondel írta le (lásd fent). Mind a homológ (P. chrysogenum eredetű), mind a heterológ (nem P. chrysogenum) eredetű szelekciós markereket leírták.
A transzformált sejtek különböző szelekciós markereinek - amelyek lehetnek homológok vagy heterológok, vektorszekvenciák jelenlétében vagy ezek nélkül, fizikailag kötve vagy nem kötve a nem szelektálható DNS-hez - a használata jól ismert a transzformált sejtek szelekciós eljárásaiban.
Előnyösen homológ szelekciós markert használunk a transzformált P. chrysogenum sejtek szelektálására, hogy korlátozzuk a P. chrysogenumba bevitt heterológ DNS mennyiségét. A legelőnyösebb, ha domináns szelekciós markert használunk, amelyet szelektíven el lehet távolítani a transzformált törzsből, ilyen például az A. nidulans vagy más fonalas gombák amdS génje (EP 0635574 számú európai közrebocsátási irat). A P. chrysogenum transzformált sejt szelekciós markereinek ezen előnyös tulajdonságai nagyon kedvezőek a gyártásközi és termék-törzskönyvezési eljárások szempontjából, mivel antibiotikumrezisztencia-markereket nem tartalmaz az eljárás, vagy mivel ilyenek nem kerülnek a környezetbe.
A legelőnyösebb kiviteli alakban az amdS szelekciós marker, amely szelektíven eltávolítható a törzsből, ismételt transzformációs meneteket tesz lehetővé ugyanazon domináns szelekciót használva újra meg újra. Az új, expandált kifejező P. chrysogenum törzs ezen szelekciósmarker-mentes sajátossága egy ipari törzsfejlesztési programban döntő szempont a jó termelőképességű törzsek gyors kifejlesztéséhez.
A gyűrűexpanziós reakciót egy P. chrysogenumba, például a Wisconsin 54-1255 törzsbe bevitt expandáz enzimet kódoló DNS és ennek kifejezése által valósítjuk meg. A gyűrűexpanziós reakciót a törzs olyan mutánsaiban is kivitelezhetjük, amelyeknek javított a βlaktámkihozatala. Világos, hogy ebben az esetben a táptalajfeltételeket kissé módosítani szükséges ahhoz, hogy jó növekedést kapjunk.
Ezenfelül a cefE gént a P. chrysogenum aciltranszferáz (AT) génszabályozó elemeinek transzkripciós és transzlációs szabályozása alá helyezzük, és lehetővé tesszük, hogy az optimális időtartamon belül, magának az aciltranszferáznak a hatásával szinkronban fejeződjék ki. Ezek a szempontok döntőek a penicillinmolekulán végbemenő gyűrűexpanziós reakció eredményessége szempontjából.
Az expandázt és aciltranszferázt kódoló gének szinkronizált expresszióján kívül előnyös lehet egy gazdaságos termelési folyamat kifejlesztése érdekében, ha az expandáz enzim egy része és az aciltranszferáz együtt helyezkednek el a mikrotestekben (az aciltranszferáz intracelluláris helyén). Ezek az előnyös kiviteli formák rendkívüli módon hozzájárulnak ahhoz, hogy a penicillin melléktermékek mennyisége csökkenjen; a törzskönyvezési hatóságok ugyanis nem engedik meg ezek jelenlétét a 7-ADCA-végtermékben.
Összefoglalva, a találmány bemutatja, hogy egy P. chrysogenumba bevitt expandáz enzim aktivitását hogyan lehet a penicillingyűrű expanziójára fordítani szinkronizált expresszió mellett.
A találmány szerint β-laktámköztitermékeket, azaz
3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA-t állítunk elő P. chrysogenumban 3,3’-tio-dipropionsav vagy sója, vagy észtere adagolásával. Megfelelő só például a nátriumvagy káliumsó. Ezek a vegyületek eredményesen izolálhatok a táptalajból egyszerű oldószeres extrahálással, például a következőképpen.
A fermentlevet szűrjük, és egy vízzel nem elegyedő szerves oldószert adunk a szűrlethez. A pH-t úgy állítjuk be, hogy a cefalosporint kivonhassuk a vizes fázisból. A pH alacsonyabb legyen 4,5-nél; előnyös az 1 -4 pH-tartomány, még előnyösebb az 1 -2 pH-tartomány. így választjuk el a cefalosporint a fermentlében jelen lévő sok más szennyezéstől. Előnyös, ha kis mennyiségű szerves oldószert használunk, és így olyan koncentrált cefalosporinoldatot kapunk, amely a térfogatáramlás sebességének csökkenését eredményezi. Egy másik lehetőség szerint a teljes fermentlevet extraháljuk pH 4 mellett vagy ennél alacsonyabb pH-n. A fermentlevet előnyösen pH 1-4 között extraháljuk egy vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel.
Minden olyan oldószer használható, amely nem károsítja a cefalosporinmolekulát. Alkalmas oldószerek például a butil-acetát, etil-acetát, metil-izobutil-keton, az alkoholok, mint a butanol stb. Előnyös a butanol vagy izobutanol használata.
A cefalosporint ezután vízzel visszaextraháljuk pH 4 és 10 között, előnyösen pH 6-9 között. A végső térfogatot megint drasztikusan csökkentjük. Az izolálást 0 °C és 50 °C közötti hőmérsékleten végezhetjük, előnyösen környezeti hőmérsékleten.
Az így kapott vizes cefalosporinoldatot megfelelő enzimmel kezeljük, hogy eltávolítsuk a 3-(karboxi-etiltio)-propionil-oldalláncot, és hogy megkapjuk a kívánt 7-ADCA-t.
Előnyös, ha immobilizált enzimet használunk annak érdekében, hogy az enzimet ismételten használhassuk. Az ilyen részecskék előállításának és az enzimek immobilizálásának metodológiáját részletesen tárgyalja az EP-A-0222462 számú európai szabadalmi bejelentés. A vizes oldat pH-ja például 4-9, amelynél a cefalosporin degradációs reakciója minimális, és az enzimmel elért kívánt konverzió optimális. Tehát az enzimet hozzáadjuk a vizes cefalosporinoldathoz, mialatt a pHértéket a megfelelő szinten tartjuk, például úgy, hogy egy szervetlen bázist, például kálium-hidroxid-oldatot adunk hozzá, vagy pedig kationcserélő gyantát alkalmazunk. Amikor a reakció végbement, az immobilizált enzimet szűréssel távolítjuk el. Egy másik lehetőség szerint az immobilizált enzimet fix vagy fluid töltetű oszlopban alkalmazzuk. Oldatban is használhatjuk az enzimet, és a termékeket membránszűréssel távolíthatjuk
HU 219 265 Β el. A reakcióelegyet ezután vízzel nem elegyedő szerves oldószer jelenlétében megsavanyítjuk.
Megfelelőek például a Pseudomonas SY77 mikroorganizmusból származó olyan enzimek, amelyek a 62, 177, 178 és 179 pozíciók közül egy vagy több helyen mutációt tartalmaznak. Más Pseudomonas mikroorganizmusból származó enzimek is használhatók, főként a Pseudomonas SE83-ból származók, amelyek adott esetben a Pseudomonas SY77,62,177,178 és 179 pozícióinak megfelelő helyek közül egy vagy több helyen mutációt tartalmaznak.
Miután a pH-t körülbelül 0,1-1,5-re állítottuk be, a rétegeket elválasztjuk, és a vizes réteg pH-ját 2-5-re állítjuk be. A kristályos 7-ADCA-t ezután kiszűrjük.
A dezacilezést kémiai úton is kivitelezhetjük - ismert módon - például imino-klorid-oldallánc képzése útján, 10 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten foszforpentoxid hozzáadásával, majd környezeti hőmérsékleten vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten izobutanol hozzáadásával.
A találmányt a következő példákkal szemléltetjük, ezekkel azonban nem kívánjuk korlátozni a találmány oltalmi körét.
1. példa
A Streptomyces és Nocardia cefE gén expressziója Penicillium chrysogenumban
a) Általános génklónozási és géntranszformációs eljárások
A találmány szerinti génklónozási eljárásokban közhasználatban lévő technikákat használtunk. Ilyen technikák a következők: polimeráz láncreakciók (PCR), szintetikus oligonukleotid-szintézis, E. coli vektor szubklónozása, transzformálása, a transzformált sejtek szelekciója, DNS-izolálás és -tisztítás, DNS-vizsgálat Southern biot analízissel és 32P-jelzett szondákkal, és DNS 32Pjelzése random priming eljárással. Ezek a technikák jól ismertek ezen a szakterületen, és a technikákat számos közlemény kimerítően ismerteti. Lásd például: Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, USA (1989); Innes és munkatársai, PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990); McPherson és munkatársai, PCR, A Practical Approach, IRL Press (1991).
A fonalas gombák transzformálásában és a transzformáit sejtek szelekciójában használt általános eljárások magukban foglalják a gombaprotoplasztok előállítását, a DNS-átvitel és protoplasztregenerálás feltételeit, a transzformált sejtek tisztítását és vizsgálatát. Ezek az eljárások ezen a szakterületen jól ismertek, és nagyon jól dokumentáltak az alábbi kiadványokban: Finkelstein and Ball (szerkesztők), Biotechnology of Filamentous Fungi, Technology and Products, Butterwort-Heinemann (1992); Bennett and Lasura (szerkesztő), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press (1991); Tumer közlése a Biotechnology című kiadványban [Pühler (szerkesztő), második, teljesen átdolgozott kiadás, VCG (1992)].
A génklónozás és géntranszformálás technológiájának Penicillium chrysogenumra való speciálisabb alkalmazásait adatokkal nagyon jól alátámasztotta Bennett és Lasure (lásd előbb) és Finkelstein és Ball (lásd előbb).
A PCR-t kereskedelemből beszerezhető PCR-készülék (Perkin Elmer, USA) és Ultma DNS-polimeráz (Perkin Elmer) használatával végezzük, a gyártó cég utasításai szerint.
A hGC PCR-előiratot [Dutton et al., Nucl. Acids. Rés., 21, 2953-2954 (1993)] használjuk azN. lactamdurans és az S. clavuligerus kromoszomális DNS cefE kódolószakaszának sokszorozásához.
A restrikciós enzimek és az egyéb DNS-módosító enzimek a Bethesda Research Laboratoriestől (BRL, MD., USA) származnak, és ezeket a gyártók előírásai szerint használjuk.
Szintetikus DNS-oligonukleotidokat kereskedelemben kapható DNS-szintetizátoron szintetizálunk (Applied Biosystem, CA., USA) a gyártó cég utasításai szerint.
Az E. coli pBluescript vektort a Stratagene (CA., USA) cégtől szereztük be.
A használt vegyszereket analitikai minőségben, különböző szállítócégektől szereztük be.
A DNS-nukleotid-szekvencia-analízist automata DNS-szekvenátorral (Applied Biosystems) végezzük, szekvenciaspecifikus fluoreszceinjelzés kimutatása alapján, a gyártó cég utasításai szerint.
b) A mikroorganizmusok tenyésztése
A Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 törzset tripszines szójalevesben (DIFCO) tenyésztjük. A törzs kromoszomális DNS-éből izoláljuk a cefE gént [Kovacevic et al., J. Bacteriol., 173, 754-760 (1989)].
A Nocardia lactamdurans ATCC 27382 törzset szintén tripszines szójalevesben (DIFCO) tenyésztjük. A törzs kromoszomális DNS-éből izoláljuk a cefE gént (Coque et al., lásd előbb).
A Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) törzset komplett YPD táptalajban tenyésztjük (YPD: 1% élesztőkivonat, 2% pepton, 2% glükóz). Ennek a törzsnek a kromoszomális DNS-éből izoláljuk a penDE gén 5’- és 3’-szabályozószakaszait, amelyek a cefE gén expressziójához szükségesek. A Penicillium chrysogenum ATCC 28089 törzset gazdasejtként is használjuk a cefE gén transzformációs kísérleteiben. Más olyan Penicillium chrysogenum törzsek is alkalmasak, beleértve a Wisconsin 54-1255 törzs mutánsait, amelyeknek javított a β-laktámkihozatala. A transzformált sejt szelekciós markerétől függően használhatók azok a P. chrysogenum törzsek, amelyek a pyrG, niaD vagy facA génben mutációt tartalmaznak. Ezeket a mutáns törzseket a szakterület jól ismert módszereivel állíthatjuk elő [Cantoral, Bio/Technol., 5, 494-497 (1987); Gouka et al., J. Biotechn., 20, 189-200 (1991); Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 83(4), 514-519 (1993)].
Transzformáláshoz és a használt protoplasztok képzéséhez a P. chrysogenumot szintén YPD táptalajban tenyésztjük.
Jól ismert ezen a szakterületen, hogy a protoplasztképzéshez és -regeneráláshoz szükséges eljárások a használt sajátos Penicillium chrysogenum törzstől füg5
HU 219 265 Β gően és a transzformált törzs szelekciójára alkalmazott eljárástól függően kissé különbözőek lehetnek.
Az E. coli WK6 [Zell and Fritz, EMBO J., 6, 1809-1815 (1987)] XLI-Blue (Stratagene) és HB101 [Boyer and Roulland-Dussoix, J. Mól. Bioi., 41, 459 5 (1969); Bolivár and Backman, Messages Enzymol., 68,
2040 (1979)] törzseket standard E. coli táptalajokon (Sambrook, lásd előbb) tartjuk fenn és tenyésztjük,
c) cefE expressziós kazetták szerkesztése
A cefE expressziós kazettákat az 1. táblázatban soroljuk fel, amely ezen plazmidok nómenklatúráját is tartalmazza.
1. táblázat
A megszerkesztett cefE expressziós kazetták listája
Magyarázat:
*tac =trp-lac hibrid promoter 2gpd =az A. nidulans gpdA gén 5’-vége 3AT =a P. chrysogenum penDE gén 3 ’-vége 4AT =a P. chrysogenum penDE gén 5’-vége
| Plazmid | Promoter | Gén | Mikrotcsttargeting | Termínátor |
| pMCTSE | tac’ | S. cla cefE | FdT | |
| pMCTNE | tac | N. lac ce/E | FdT | |
| pGSE | gpd2 | S. cla cefE | - | |
| pGNE | gpd | N. lac ce/E | - | |
| pGNETA | gpd | N. lac ce/E | +target | AT3 |
| pGNEWA | gpd | N. lac cefE | Wt | AT |
| pANETA | AT4 | N. lac cefE | +target | AT |
| pANEWA | AT | N. lac ce/E | Wt | AT |
| pGSETA | gpd | S. cla ce/E | +target | AT |
| pGSEWA | gpd | S. cla ce/E | Wt | AT |
| pASETA | AT | S. cla cefE | +target | AT |
| pASEWA | AT | S. cla cefE | Wt | AT |
Az S. clavuligerus cefE gén (Kovacevic, lásd előbb), 35 az N. lactamdurans cefE gén (Coque, lásd előbb), az A. nidulans gpdA gén [Punt et al., Gene, 69, 49-57 (1988)] és a P. chrysogenum penDE gén [Barredo et al.,
Gene, 83, 291-300 (1989), Diezt et al., Mól. Gén. Génét., 218, 572-576 (1989)] közölt szekvenciáit a 2. táblázatban felsorolt szintetikus oligonukleotidok tervezésénél használjuk fel.
2. táblázat
Az N. lactamdurans és az S. clavuligerus cefE génhez szükséges P. chrysogenum expressziós kazetták szerkesztéséhez használt oligonukleotidok
| 1. | 5’-GCT GAA GGA GCT GAG CAT ATG ACG GAC GCG ACC GTG CCG ACC-3’ |
| 2. | 5’-CCC GGG TCT AGA TCT AGA TCA CCG GGC GGC GGC GGT CTT CCG GAT GTT-3’ |
| 3. | 5’-GAT CAG TGA GAG TTG CAT ATG GAC ACG ACG GTG CCC ACC TTC AGC CTG-3’ |
| 4. | 5’-CCC GGG TCT AGA TCT AGA CTA TGC CTT GGA TGT GCG GCG GAT GTT-3’ |
| 5. | 5’-GAG CTC TGT GAA TTC ACA GTG ACC GGT GAC TCT TTC-3’ |
| 6. | 5’-GGG AGC CAT ATG GAT GTC TGC TCA AGC GGG GTA GCT-3’ |
| 7. | 5’-AGA ACG GAT TAG TTA GTC TGA ATT CAA CAA GAA CGG CCA GAC-3’ |
| 8. | 5’-GAC AGA GGA TGT GAA GCA TAT GTG CTG CGG GTC GGA AGA TGG-3’ |
| 9. | 5’-ACA TCA ACA TCC GGA AGA CCG CCG CCG CCC GGT GGA GGC TCT TCA TGA-3’ |
| 10. | 5’-GGA CTA GTG TCG ACC CTG TCC ATC CTG AAA GAG TTG-3’ |
| 11. | 5’-ACA TCA ACA TCC GGA AGA CCG CCG CCG CCC GGC TTT GAA GGC TCT TCA-3’ |
HU 219 265 Β
2. táblázat (folytatás)
| 12. | 5’-TTC GAT GTC AGC CTG GAC GGC GAG ACC GCC ACG TTC CAG GAT TGG ATC GGG GGC AAC TAC GTG AAC ATC CGC CGC ACA TCC AAG GCA TGA AGG CTC TTC ATG ACG-3’ |
| 13. | 5’-GAT GTC AGC CTG GAC GGC GAG ACC GCC ACG TTC CAG GAT TGG ATC GGG GGC AAC TAC GTG AAC ATC CGC CGC ACA TCC AAG CTA TGA AGG CTC TTC ATG ACG-3’ |
c) 1. A pMcTSE és pMcTNE E. coli cefE expressziós plazmidok szerkesztése PCR, 1: N. lactamdurans cefE
Egy első PCR-ben, amelyben az N. alctamdurans kromoszómális DNS-t és az 1. és 2. oligonukleotidot használtuk, az N. lactamdurans cefE nyílt leolvasási keretét 0,9 kb méretű PCR-termékként kapjuk meg, amely egyetlen Ndel restrikciós helyet tartalmaz az 5’végen és egyetlen Xbal restrikciós helyet a 3’-végen. PCR, 2: S. clavuligerus cefE
Egy második PCR-ben, amelyben az S. clavuligerus kromoszómális DNS-t és a 3. és 4. oligonukleotidot használjuk, az S. clavuligerus cefE gén nyílt leolvasási keretét 0,9 kb méretű PCR-termékként kapjuk meg, amely szintén egyetlen Ndel restrikciós helyet tartalmaz az 5’-végen és egyetlen Xbal restrikciós helyet a 3’-végen.
Abból a célból, hogy elérjük a cefE gének expresszióját E. coliban, és hogy a PCR-termékeket DNSszekvencia-analízissel vizsgálhassuk, a PCR 1- és 2-termékeket beklónozzuk a pMcTNde vektorba, amely a pMc-5 egy származéka [Stanssens et al., Nucl. Acids. Rés., 17, 4441 (1989)]. A pMcTNde plazmidot a pMc5-8-ból (0351029 számú európai szabadalmi bejelentés) állítjuk elő úgy, hogy beépítünk egy tac promotert kódoló fragmentumot, amely után egy RBS hely és egy Ndel klónozóhely következik (3. ábra).
A PCR 1- és 2-termékeket Ndel-gyel és Xbal-gyel emésztjük, majd az Ndel-Xbal-gyel emésztett pMcTNde vektorba ligáljuk. A ligációs keveréket használjuk az E. coli WK6 sejtek transzformálásához. A transzformált sejteket kloramfenikolrezisztencia alapján szelektáljuk. A transzformált sejtekből izoláljuk a plazmid DNS-t. A cefE expresszióskazetta-inszertumot először restrikciós enzimes emésztéssel analizáljuk, hogy képződnek-e a várható restrikciós fragmentumok. Azokat a plazmidokat, amelyek a várt restrikciósenzim-helyeket tartalmazzák, végül automata DNSszekvenátor segítségével analizáljuk.
Az S. clavuligerus cefE nyílt leolvasási keretének DNS-szekvenciája a pMcTSE plazmidban (2. ábra) 100%-ban azonos volt a leközölt szekvenciával (Kovacevic, lásd előbb).
Az analizált összes többi klón DNS-szekvenciája (8. ábra), amelyek az N. lactamdurans cefE nyílt leolvasási keretét tartalmazzák, különbözik a leközölt szekvenciától (Coque, lásd előbb).
A leközölt N. lactamdurans cefE génből származó aminosavszekvencia prolint tartalmaz a 41. aminosav helyen (lásd a 14. számú szekvenciát). Ez a prolin hiányzik azokban a kiónokban, amelyeket a PCR 1-ben kapunk. A plazmid neve: pMcTNE (1. ábra), c) 2. P. chrysogenum cefE expressziós plazmidok szerkesztése
PCR, 3: gpdA promoter
A harmadik PCR-ben a pAN7-l plazmid DNS-ét [Punt et al., Gene, 56, 117-124 (1987)] használjuk, amely az E. coli hph gént az A. nidulans gpdA promoter szabályozása alatt tartalmazza, és az 5. és 6. oligonukleotidot. A gpdA promotert 0,9 kb méretű PCR-termékként kapjuk meg, amely egyetlen EcoRI restrikciós helyet tartalmaz az 5’-végen és egyetlen Ndel helyet a 3’-végen. PCR, 4: A Tpromoter
A negyedik PCR-ben a P. chrysogenum kromoszomális DNS-ét és a 7. és 8. oligonukleotidot használjuk, és így 1,5 kb méretű AT promoterfragmentumot kapunk, amely szintén egyetlen EcoRI restrikciós helyet tartalmaz az 5’-végen és egyetlen Ndel restrikciós helyet a 3’-végen.
PCR, 5: AT terminátor és az N. lactamdurans cdfE gén 3 '-vége
Az ötödik PCR-ben egy 0,5 kb méretű penDE (AT) terminátorszakaszt kapunk a P. chrysogenum kromoszomális DNS és a 9. és 10., illetve a 11. és 10. oligonukleotidok használatával. Ezek a PCR-termékek a cefE gén 3’-terminális szekvenciáját tartalmazzák mikrotesttargeting-szignállal - amely egy C-terminális ARL aminosavszekvenciából áll - vagy e nélkül [Müller et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1116, 210-213 (1992)].
Az oligonukleotidokat úgy tervezzük meg, hogy egyetlen BspEI helyet vigyünk be a PCR-termék 5’végére és egyetlen Spel helyet a PCR-termék 3’-végébe. PCR, 6: AT terminátor és az S. clavuligerus cefE gén 3 '-vége
A hatodik PCR-ben a 0,5 kb méretű penDE (AT) terminátorszakaszhoz a P. chrysogenum kromoszomális DNS és a 12. és 13., illetve a 13. és 10. oligonukleotidok használatával jutottunk. Ezek a PCR-termékek tehát az S. clavuligerus cefE gén 3’-terminális szekvenciáját tartalmazzák, és ezek vagy tartalmaznak mikrotesttargeting-szignált - amely egy C-terminális SKL aminosavszekvenciából áll -, vagy nem [De Hoop et al., Biochem. J„ 286, 657-669 (1992)].
Az oligonukleotidokat úgy szerkesztjük, hogy a PCR-termék 5’-végére egyetlen BglII restrikciós hely kerüljön, és a PCR-termék 3’-végére egyetlen Spel hely kerüljön.
Abból a célból, hogy a P. chrysogenumban megkapjuk a cefE gének kifejeződését, a gpdA promotert és az
HU 219 265 Β
AT promotert a pMcTNE és pMcTSE plazmidból származó cefE fragmentumokhoz ligáljuk. Ezeket a ligáit fragmentumokat a pBluescript II KS vektorba klónozzuk.
A PCR 3-termékeket EcoRI-gyel és Ndel-gyel emésztjük. A pMcTNE és pMcTSE plazmidot Ndelgyel és Sbal-gyel emésztjük. A restrikciós fragmentumokat agarózgél-elektroforézissel választjuk el. A 0,9 kb méretű cefE kódolófragmentumokat az agarózgélből tisztítjuk. Az EcoRI-Ndel promoterfragmentumot az Ndel-Xbal cefE fragmentumokkal együtt az EcoRI-Xbal-gyel emésztett pBluescript II KS vektorba ligáljuk. így a következő plazmidokhoz jutunk: pGSE és pGNE.
A P. chrysogenumban a cefE gének optimális kifejeződése érdekében az AT terminátor-szignálszekvenciát a cefE gének mögé klónozzuk a fent említett Penicillium expressziós plazmidokban.
pGNETA-pGNEWA
A PCR 5-termékeket BspEI-gyel és Spel-gyel emésztjük, és a BspEI-gyel és Spel-gyel emésztett pGNE-vektorba ligáljuk. A ligációs keverékkel E. coli HB101 sejteket transzformálunk. A transzformált sejteket ampicillinrezisztencia alapján szelektáljuk. A transzformált sejtekből izolált plazmidokat restrikciósfragment-analízissel és ezután DNS-szekvenciaanalízissel vizsgáljuk. A következő plazmidokat kapjuk: pGNEWA és pGNETA (4. ábra).
pGSETA-pGSEWA
A PCR 6-termékeket BglI-gyel és Spel-gyel emésztjük, és a BglI-gyel és Spel-gyel emésztett pGSE-vektorba ligáljuk. A ligációs keverékkel E. coli HB101 sejteket transzformálunk. A transzformált sejteket ampicillinrezisztencia alapján szelektáljuk. A transzformált sejtekből izolált plazmidokat restrikciósfragmentanalízissel és később DNS-szekvencia-analízissel vizsgáljuk. így a következő plazmidokat kapjuk: pGSEWA és pGSETA (5. ábra).
pANETA, pANEWA és pASETA és pASEWA
A pGNETA, pGNEWA, pGSETA és pGSEWA plazmidokat EcoRI-gyel és Ndel-gyel emésztjük. A restrikciós fragmentumokat agarózgél-elektroforézissel választjuk el, és a 4,5 kb méretű fragmentumokat tisztítjuk a gélből.
A PCR 4-termékeket EcoRI-gyel és Ndel-gyel emésztjük, és a fent említett tisztított fragmentumokba ligáljuk. A ligációs keverékkel E. coli HB101 sejteket transzformálunk, majd a transzformált sejteket ampicillinrezisztencia alapján szelektáljuk.
A transzformált sejteket tenyésztjük, izoláljuk belőlük a plazmidokat, amelyeket restrikciósfragment-analízissel és végül DNS-szekvencia-analízissel vizsgálunk. A következő kívánt szerkezetekhez jutunk: pANETA (6. ábra), pANEWA, pASETA (7. ábra) és pASEWA.
d) P. chrysogenum transzformálása
A Ca-PEG közvetített protoplaszttranszformációs eljárást használjuk.
A Cantoral (lásd: előbb és Gouka és munkatársai [J. Biotechn. (lásd: előbb); Appl. Microbiol. Biotechnol. (lásd: előbb)] által leírt eljárások alapján teljes plazmidot vagy a tisztított cefE expressziós kazettát (E. coli vektorszekvenciák nélkül) használjuk azon P. chrysogenum törzsek transzformálására, amelyek pyrG, niaD, facA vagy amdS [Béri et al., Curr. Génét., 11, 639-641 (1987)] gént tartalmaznak szelekciós marker gyanánt.
A homológ pyrG, niaD vagy facA szelekciós markerek, E. coli szekvenciáktól mentes, tisztított formában való felhasználásával olyan transzformált P. chrysogenum törzseket kapunk, amelyek nem tartalmaznak bakteriális rezisztenciagéneket.
A 94201896.1 számú európai szabadalmi bejelentés módszert ír le szelekciósmarker-mentes rekombináns törzsek előállítására. Eredményesen használtuk ezt a módszert az A. nidulans amdS gént mint domináns szelekciós gént tartalmazó P. chrysogenum transzformált sejteknél.
Kizárólag a 0,9 kb méretű cefE kódolószakasz és adott esetben a 0,9 kd gpdA promoterszakasz olyan elemek, amelyek heterológ természetűek.
e) A transzformált sejtek analízise
A P. chrysogenum transzformált sejteket szelektív táptalajon való ismételt tenyésztéssel tisztítjuk. Egyedi, stabil telepeket oltunk ferde agarra spóraképzés céljából, és hogy kiszűrjük a cefE expressziós kazettát tartalmazó transzformált sejteket. Agarlemezről levett transzformált sejtekből származó friss micélium főzött részletéből elegendő templát DNS-t kapunk ahhoz, hogy a transzformált sejtek százait szűrjük cefE gén jelenlétére PCR-technika alkalmazásával [Seth, Fungal Geneties Conference, Asilomar (1991), kivonat a Fungal Geneties Newsletter, 38 (55. oldal) kötetében]. így értékeljük ki a transzformálás eredményességét.
A transzformált sejteket bioassay segítségével is szűrjük. A transzformált sejteket olyan agar táptalajon tenyésztjük, amely a legmegfelelőbb oldalláncprekurzort tartalmazza. Az E. coli ESS2231 törzset használjuk indikátorbaktérium gyanánt egy olyan rétegezett agarban, amely BACTO Penase-t is tartalmaz, hogy el lehessen különíteni a penicillin- és a cefalosporinképződést a szakterületen jól ismert módszerek szerint [lásd például: Guttiérez et al., Mól. Gén. Génét., 225, 56-64(1991)].
A P. chrysogenum táptalaj beoltásához spórákat használunk, ahogyan ezt a d) fejezetben leírtuk. Hetvenkét órás tenyésztés után (25 °C-on) a micéliumból kromoszomális DNS-t izolálunk. A DNS-t egy 6 bp felismerőszekvenciát igénylő restrikciós enzimmel - ilyen például az EcoRI vagy a PstI - emésztjük.
A DNS-fragmentumokat agarózgél-elektroforézissel választjuk el, és Gene screen nejlonmembránokra (New England Nuclear) cseppentjük. A Southern biotokat 32P-jelzett PCR 2-termékkel - ez a cefE génszekvenciákat szondázza - hibridizáljuk. A tisztított PCR2-termék 32P-jelzését random priming módszerrel végezzük 32P dCTP jelenlétében, kereskedelemben kapható jelzőkészlet (Boehringer-Mannheim) használatával.
HU 219 265 Β
A cefE kódolószekvenciát tartalmazó transzformált sejteket cefE géntermék-expresszióra, azaz expandázaktivitásra vizsgáljuk.
A szelektált transzformáit sejteket penicillintermelő táptalajban tenyésztjük (lásd a 2. példát).
A folyamat időbeli lefolyásának vizsgálata érdekében micéliummintákat veszünk 48, 72 és 96 órás fermentálás után. Micéliumkivonatokat készítünk, és a nyerskivonatokban meghatározzuk az expandázaktivitást, lényegében úgy, ahogy Rollins és munkatársai leírták [Can. J. Microbiol., 34, 1196-1202 (1988)]. Az expandázaktivitást mutató transzformált sejteket aciltranszferáz-aktivitásra is megvizsgáljuk Alvarez és munkatársai módszereinek alkalmazásával [Antimicrob. Agent Chem., 31, 1675-1682 (1987)].
Az analízisek alapján különböző szintű aciltranszferáz- és expandázenzim-aktivitást kifejtő transzformáit sejteket szelektálunk 7-ADCA-származékok fermentációs úton történő előállításához.
2. példa
3-(Karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA fermentációs termelése és izolálása
A P. chrysogenum Wisonsin 54-1255 törzset (ATCC 28089) egy 1. példában leírt DNS-szerkezettel transzformáljuk, és az előtenyészet táptalaját 2xl06 konídium/ml mennyiséggel oltjuk be. A táptalaj összetétele literenként: 30 g glükóz, 10 g ammónium-szulfát, 10 g kálium-dihidrogén-foszfát, 10 ml nyomelemoldat I (literenként 25 g MgSO4-7H2O, 10 g FeSO4 -7H2O, 0,5 g CuSO4-5H2O, 2 g ZnSO4 -7H2O, 50 g Na2SO4, 2 g MnSO4 H2O, 5 g CaCl2 -2H2O tartalmú oldat). (A pH sterilizálás előtt: 6,5).
Az előtenyészetet 48-72 órán át 25-30 °C-on inkubáljuk, majd ezzel 10-20-szoros mennyiségű fermentortáptalajt oltunk be, melynek literenkénti összetétele a következő : 80 g laktóz, 20 g maltóz, 4 g kalciumszulfát, 3 g karbamid, 2 g magnézium-szulfát-víz (1/7), 7 g kálium-dihidrogén-foszfát, 0,5 g nátriumklorid, 6 g ammónium-szulfát, 0,1 g vas(II)-szulfát-víz (1/7), 5 g 3,3’-tio-dipropionsav, 10 ml nyomelemoldat II (literenként 0,5 g CuSO4-5H2O, 2 g ZnSO4-7H2O, 2 g MnSO4 H2O, 50 g Na2SO4-tartalmú oldat). (A pH sterilizálás előtt: 5,5-6,0). Az inkubálást ezután 96-120 órán át folytatjuk.
A fermentációs termelés végén a micéliumot centrifugálással vagy szűréssel távolítjuk el, és a fermentlevet 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA-tartalomra vizsgáljuk nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiával (HPLC) reverz fázisú oszlopon. Beckman System Gold HPLC-készüléket használunk, amely programozható oldószerrendszerből (model 126), automata mintavevőből (model 507), diódasor-detektorból (model 168) és System Gold adatfeldolgozó rendszerből (5.10) áll. Szilárd fázis gyanánt két (2) sorba kapcsolt Chromspher Cl8 patronoszlopot (100x3 mm, Chrompack) használunk. A mobil fázis a következő lineáris gradiensből áll: 100% 0,07 M foszfátpuffertől (pH 4,8) 25% acetonitril+75% foszfátpufferig (pH 4,8) 15 percen belül, 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett. A 3(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA-termelés kihozatalát 260 nm-en mérjük, referenciakészítményként szintetikus 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA-t használtunk.
A csúcs azonosságát az egy vonalas UV- és NMRspektrumok összehasonlítása révén ellenőrizzük.
A fermentlé szűrése után a szűrlethez 0,1 térfogat butanolt adunk. A pH-t 2-re állítjuk be híg sósavval, és az elegyet 5 percig szobahőmérsékleten keveijük. Elválasztás után a szerves oldószeres fázist vagy lepároljuk és a későbbiekben a kémiai dezacilezésnél használjuk fel (3. példa), vagy visszaextraháljuk 0,33 térfogat pH
8-as vízzel, és a továbbiakban az enzimes dezacilezésnél használjuk fel (4. és 5. példa).
3. példa
A 3-(karboxí-etil-tio)-propionil-7-ADCA dezacilezése
A 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA 3 g-jához (8 mM) hozzáadunk 3,5 ml (36 mM) N,N-dimetilanilint, 13 ml metilén-dikloridot és 2,6 ml (21 mM) trimetil-klór-szilánt környezeti hőmérsékleten. A reakcióelegyet 30 percig keveijük, majd körülbelül -50 °C-ra hűtjük, és egyszerre hozzáadunk 1,8 g (8,5 mM) foszforpentakloridot. A hőmérsékletet 2 órán át -40 °C-on tartjuk, és ezután a reakcióelegyet -65 °C-ra hűtjük le. Az elegyhez ekkor 12 ml (137 mM) izobutanolt adagolunk olyan ütemben, hogy hőmérséklete ne emelkedjék -40 °C fölé. További 2 órás keverés után az oldatot 15 ml vízbe öntjük, és ezután azonnal hozzáadunk 5 ml
4,5 M ammóniaoldatot. Az oldat pH-ját 4-re állítjuk be szilárd ammónium-hidrogén-karbonát lassú adagolásával. Az oldatot 5 °C-ra hűtjük és szüljük. A kristályos 7ADCA-t 5 ml vizes acetonnal (1:1) mossuk, majd izoláljuk.
4. példa
A 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA dezacilezése egy Pseudomonas SY77 acilázmutáns használatával
A 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA konverzióját egyetlen enzimes reakciólépésben végezzük olyan specifikus aciláz segítségével, amelyet szakaszra irányuló mutagenezis révén a Pseudomonas SY77 acilázból állítunk elő. A 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-oldalláncra jobb aktivitással ható Pseudomonas SY77 acilázmutáns szerkesztését és azonosítását az EP-A-0453048 számú európai szabadalmi bejelentés írja le. A mutánsban a Pseudomonas SY77 aciláz α-alegységében a 178. pozícióban lévő tirozint hisztidin helyettesíti. A mutáns acilázt E. coliban termeljük. A sejteket centrifiigálással aratjuk le, és 140 mM nátrium-klorid-tartalmú 10 mM foszfátpufferben (pH 7,4) reszuszpendáljuk. A sejteket ezután ultrahangos kezeléssel táljuk fel. A sejttörmelék eltávolítása után az aciláz aktivitását tartalmazó felülúszókat egyesítjük. Az aciláz további tisztítását kromatográfiás lépések sorozatával végezzük: 1. ioncserés kromatográfia Q-Sepharose fast-flow használatával, pH 8,8 mellett; 2. hidrofób interaktív kromatográfia PhenylSepharose használatával; és 3. géláteresztéses kromatográfia Sephacryl S200HR oszlopon.
HU 219 265 Β
A tisztított acilázt zselatin és kitozán (Chitosan) keverékéből álló részecskéken immobilizáljuk. A részecskéket glutáraldehiddel kezeljük közvetlenül az enzim hozzáadása előtt.
A 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA konverzióját keverővei ellátott reaktortartályban végezzük. Először a vizes cefalosporinoldatot visszük a reaktorba. Az oldat hőmérsékletét állandó keverés mellett 30 °C-ra emeljük, és pH-ját 8-ra állítjuk be kálium-hidroxiddal. Ezután hozzáadjuk az immobilizált enzimet, és ekkor indul meg a konverzió. A konvertálás alatt a reaktorban a pH-t folyamatosan ellenőrizzük, és 8-as értéken tartjuk. A reakció folyamán felszabaduló 3,3’tio-dipropionsavat kálium-hidroxiddal titráljuk. A hozzáadott kálium-hidroxid mennyiségét öníró regisztrálókészülék összegezi és jelzi. A konverzió monitorozását úgy végezzük, hogy a reaktorból vett mintákban HPLC-vel analizáljuk a 3-(karboxi-etil-tio)-propionil7-ADCA-t és a 7-ADCA-t a 2. példában leírtak szerint.
Amikor a reakció végbement, az immobilizált enzimet szűréssel távolítjuk el, és a szűrlet pH-ját 1-re állítjuk be, miközben a szűrlet butil-acetátot tartalmaz. A rétegeket elválasztjuk, és a 7-ADCA-t tartalmazó vizes fázis pH-ját 3-ra állítjuk be. Ezután a kristályos 7-ADCA-t kiszűijük.
5. példa
A 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA enzimes dezacilezése Pseudomonas SE83 aciláz alkalmazásával
A 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA konverzióját a 4. példában leírtak szerint végezzük, de acilázként Pseudomonas SE83 acilázt használunk, amely azonos kihozatalt eredményez.
Claims (10)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav (7ADCA) előállítására és izolálására, azzal jellemezve, hogy (i) egy Penicillium chrysogenum törzset transzformálunk egy expandáz génnel úgy, hogy bevisszük a P. chrysogenum aciltranszferáz (AT) gén expressziós szignáljainak transzkripciós és transzlációs szabályozása alá a két gén szinkronizált expressziójához;(ii) a transzformált törzset alkalmas táptalajban fermentáljuk, amelyhez szubsztrátként hozzáadunk 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-6-amino-penicillánsav és képződéséhez elegendő mennyiségű 3,3’-tio-dipropionsavat vagy annak sóját, vagy észterét, a képződött 6-aminopenicillánsavat in situ 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7ADCA-vá expandáljuk;(iii) a 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCA-t a fermentléből izoláljuk;(iv) a kapott 3-(karboxi-etil-tio)-propionil-7-ADCAt dezacilezzük; és (v) a kristályos 7-ADCA-t izoláljuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (v) lépésben a 7-ADCA-t szűréssel izoláljuk.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (iii) lépésben a 3-(karboxi-etil-tio)propionil-7-ADCA izolálásához a fermentlevet szűrjük, majd egy vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel 4,5-nél alacsonyabb pH-η extraháljuk, majd vízzel pH 4 és 10 között visszaextraháljuk.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expandáz gén Streptomyces clavuligerusból vagy Nocardia lactamduransból származik.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben a P. chrysogenum törzs transzformálását egy rekombináns DNSvektorral végezzük.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS-vektorként egy 7-9. igénypontok szerinti vektort alkalmazunk.
- 7. Rekombináns DNS-vektor, amely egy expandáz enzimet kódoló DNS-t tartalmaz működőképesen összekapcsolva fonalas gomba expressziós szignálok transzkripciós és transzlációs szabályozórégióival.
- 8. A 7. igénypont szerinti rekombináns vektor, amelyben az expandáz enzimet kódoló DNS az AT gén expressziós szignáljainak transzkripciós és transzlációs szabályozása alatt áll.
- 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti rekombináns vektor, amelyben az expandáz enzimet kódoló DNS Streptomyces clavuligerus vagy Nocardia lactamdurans eredetű.
- 10. Transzformált fonalasgomba-gazdasejt, amely egy 7-9. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-vektorral transzformált.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93202260 | 1993-07-30 | ||
| EP93203695 | 1993-12-24 | ||
| PCT/EP1994/002544 WO1995004149A1 (en) | 1993-07-30 | 1994-07-29 | Process for the efficient production of 7-adca via 3-(carboxyethylthio)propionyl-7-adca |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9600195D0 HU9600195D0 (en) | 1996-03-28 |
| HUT75367A HUT75367A (en) | 1997-05-28 |
| HU219265B true HU219265B (en) | 2001-03-28 |
Family
ID=26133941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9600195A HU219265B (en) | 1993-07-30 | 1994-07-29 | Process for the efficient production of 7-adca via 3-(carboxyethylthio)propionyl-7-adca, recombinant dna vectors and host cells |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5795733A (hu) |
| EP (1) | EP0711348B1 (hu) |
| JP (1) | JP3574453B2 (hu) |
| KR (1) | KR100327881B1 (hu) |
| CN (1) | CN1087780C (hu) |
| AT (1) | ATE234926T1 (hu) |
| BR (1) | BR9407104A (hu) |
| CA (1) | CA2168004A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ285622B6 (hu) |
| DE (1) | DE69432303D1 (hu) |
| ES (1) | ES2194873T3 (hu) |
| HU (1) | HU219265B (hu) |
| PL (1) | PL180565B1 (hu) |
| PT (1) | PT711348E (hu) |
| SI (1) | SI0711348T1 (hu) |
| SK (1) | SK282617B6 (hu) |
| WO (1) | WO1995004149A1 (hu) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3789880T2 (de) * | 1986-01-31 | 1994-09-08 | Beecham Group Plc | Isolierung und Expression von bei der Biosynthese von Beta-Laktamen beteiligten Genen. |
| US6709859B1 (en) | 1986-01-31 | 2004-03-23 | Beecham Group P.L.C. | Chromosomal DNA Fragments Encoding Enzymes for Encoding B-Lactam Biosynthesis Enzymes, and Vector and Transformants for Their Expression |
| CN1084791C (zh) * | 1995-06-02 | 2002-05-15 | 吉斯特·布罗卡迪斯股份有限公司 | 通过扩环酶活性作用于青霉素g生产7－adca的方法 |
| US5731165A (en) * | 1995-06-02 | 1998-03-24 | Gist-Brocades, B.V. | Process for the production of 7-ADCA via expandase activity on penicillin G |
| WO1997020053A2 (en) * | 1995-11-27 | 1997-06-05 | Gist-Brocades B.V. | Improved process for the production of semi-synthetic cephalosporins via expandase activity on penicillin g |
| PT915988E (pt) | 1997-04-22 | 2003-06-30 | Dsm Nv | Processo para a producao fermentativa de cefalosporinas desaciladas |
| JP2000512511A (ja) | 1997-04-22 | 2000-09-26 | ギスト ブロカデス ベスローテン フェンノートシャップ | 脱アシル化セファロスポリンの発酵による製造方法 |
| BR9910532A (pt) | 1998-05-19 | 2001-10-16 | Dsm Nv | Produção melhorada in vivo de cefalosporina |
| US6455603B1 (en) | 1998-06-30 | 2002-09-24 | Dow Global Technologies Inc. | Polymer polyols and a process for the production thereof |
| AU3042600A (en) * | 1998-12-22 | 2000-07-12 | Dsm N.V. | Improved (in vivo) production of cephalosporins |
| ES2571865T3 (es) | 2005-12-28 | 2016-05-27 | Dsm Sinochem Pharm Nl Bv | Acilasas de beta-lactama de tipo II mutantes |
| EP2123772A1 (en) | 2008-04-29 | 2009-11-25 | DSM IP Assets B.V. | Beta-lactam antibiotic producing strains |
| EP2392649A3 (en) | 2008-08-05 | 2012-01-11 | DSM IP Assets B.V. | Adipoyl-7-ADCA producing strains |
| CN102131917A (zh) * | 2008-08-05 | 2011-07-20 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 生产己二酰基-7-adca的菌株 |
| WO2010115838A1 (en) | 2009-04-03 | 2010-10-14 | Dsm Ip Assets B.V. | Fermentation process |
| HUE035540T2 (hu) | 2010-06-22 | 2018-05-02 | Dsm Sinochem Pharm Nl Bv | Légbuborékos fermentálási eljárás |
| EP2614066B1 (en) * | 2010-09-07 | 2017-11-29 | DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Process for the production of cephalosporins |
| CN103429596B (zh) | 2011-03-03 | 2016-03-02 | 中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司 | 青霉素化合物的降解 |
| WO2013113646A1 (en) | 2012-01-31 | 2013-08-08 | Dsm Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Mbth-like proteins in the production of semi synthetic antibiotics |
| WO2015091455A1 (en) | 2013-12-17 | 2015-06-25 | Dpx Holdings B.V. | Bioreactor |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5070020A (en) * | 1988-05-09 | 1991-12-03 | Eli Lilly And Company | Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode deacetoxycephalosporin c synthetase |
| US5082772A (en) * | 1988-10-24 | 1992-01-21 | Eli Lilly And Company | Process for preparing deacetylcephalosporin c |
| US5318896A (en) * | 1991-09-11 | 1994-06-07 | Merck & Co., Inc. | Recombinant expandase bioprocess for preparing 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA) |
| KR100227711B1 (ko) * | 1991-10-15 | 1999-12-01 | 한스 발터 라벤 | 7-아미노세팔로스포란산 및 7-아미노데아세틸세팔로스포란산 제조를 위한 신규한 생물학적 공정 |
-
1994
- 1994-07-29 HU HU9600195A patent/HU219265B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-07-29 BR BR9407104A patent/BR9407104A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-07-29 CZ CZ96157A patent/CZ285622B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-07-29 CN CN94192932A patent/CN1087780C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-29 SK SK98-96A patent/SK282617B6/sk unknown
- 1994-07-29 KR KR1019960700485A patent/KR100327881B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-07-29 JP JP50558495A patent/JP3574453B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-29 CA CA002168004A patent/CA2168004A1/en not_active Abandoned
- 1994-07-29 DE DE69432303T patent/DE69432303D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-29 AT AT94926136T patent/ATE234926T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-07-29 PT PT94926136T patent/PT711348E/pt unknown
- 1994-07-29 PL PL94312747A patent/PL180565B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-07-29 EP EP94926136A patent/EP0711348B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-29 US US08/591,501 patent/US5795733A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-29 SI SI9430443T patent/SI0711348T1/xx unknown
- 1994-07-29 ES ES94926136T patent/ES2194873T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-29 WO PCT/EP1994/002544 patent/WO1995004149A1/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3574453B2 (ja) | 2004-10-06 |
| HU9600195D0 (en) | 1996-03-28 |
| CZ15796A3 (en) | 1996-07-17 |
| PL312747A1 (en) | 1996-05-13 |
| WO1995004149A1 (en) | 1995-02-09 |
| CA2168004A1 (en) | 1995-02-09 |
| BR9407104A (pt) | 1996-08-27 |
| CN1128545A (zh) | 1996-08-07 |
| US5795733A (en) | 1998-08-18 |
| CN1087780C (zh) | 2002-07-17 |
| ATE234926T1 (de) | 2003-04-15 |
| KR960704048A (ko) | 1996-08-31 |
| SK282617B6 (sk) | 2002-10-08 |
| PT711348E (pt) | 2003-08-29 |
| PL180565B1 (pl) | 2001-02-28 |
| EP0711348A1 (en) | 1996-05-15 |
| CZ285622B6 (cs) | 1999-10-13 |
| EP0711348B1 (en) | 2003-03-19 |
| HUT75367A (en) | 1997-05-28 |
| KR100327881B1 (ko) | 2002-07-02 |
| SK9896A3 (en) | 1996-09-04 |
| ES2194873T3 (es) | 2003-12-01 |
| SI0711348T1 (en) | 2003-08-31 |
| DE69432303D1 (de) | 2003-04-24 |
| JPH09503908A (ja) | 1997-04-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5726032A (en) | Process for the efficient production of 7-ADCA via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-ADCA and 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-ADCA | |
| CN100390285C (zh) | 体内生产头孢菌素的改良 | |
| HU219265B (en) | Process for the efficient production of 7-adca via 3-(carboxyethylthio)propionyl-7-adca, recombinant dna vectors and host cells | |
| KR100227711B1 (ko) | 7-아미노세팔로스포란산 및 7-아미노데아세틸세팔로스포란산 제조를 위한 신규한 생물학적 공정 | |
| JP3072101B2 (ja) | ７―ａｄｃａの生化学的新規製造法 | |
| Cantwell et al. | Cloning and expression of a hybrid Streptomyces clavuligerus cef E gene in Penicillium chrysogenum | |
| US5919680A (en) | Process for the production of SSC's via expandase activity on penicillin G | |
| RU2139350C1 (ru) | Способ эффективного производства 7-адцк через 3-(карбоксиэтилтио)пропионил-7-адцк | |
| EP0716698B1 (en) | Process for the efficient production of 7-ADCA via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-ADCA and 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-ADCA | |
| US6368820B1 (en) | Process for the preparation of cephalosporins using acremonium chrysogenum | |
| RU2139349C1 (ru) | Способ эффективного производства 7-адцк через 2-(карбоксиэтилтио) ацетил-7-адцк и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-адцк | |
| RU2202616C2 (ru) | Способ получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты, вектор экспрессии, рекомбинантный штамм | |
| JPH09503907A (ja) | ２−（カルボキシエチルチオ）アセチル−７−ａｄｃａ及び３−（カルボキシメチルチオ）プロピオニル−７−ａｄｃａを経由した７−ａｄｃａの効果的な製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |