CN103429596B - 青霉素化合物的降解 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在存在其他β-内酰胺化合物诸如头孢菌素类时诸如青霉素的β-内酰胺化合物的降解。此外，本发明还涉及亚硫酸盐在(例如工业废物流中的)青霉素的降解中的用途。

Description

青霉素化合物的降解

发明领域

本发明涉及在存在其他β-内酰胺化合物诸如头孢菌素类时降解诸如青霉素的β-内酰胺化合物。此外，本发明还涉及亚硫酸盐在(例如工业废物流中的)青霉素的降解中的用途。

发明背景

为了治愈患各种传染病的人，β-内酰胺抗生素已经被有利地使用了几十年。尽管如此，在某些情况下，β-内酰胺可以是有害的并且在某些产品例如食品、废物中以及在某些药物甚至抗生素产品本身中对β-内酰胺的存在有严格的要求。例如，头孢菌素类的β-内酰胺抗生素优选地不包含青霉素类的β-内酰胺抗生素，反之亦然。药典中要求了相对于青霉素的头孢菌素类的纯度。

7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)是头孢菌素类β-内酰胺抗生素(例如头孢氨苄、头孢羟氨苄和头孢拉定)的起始材料。7-ADCA的传统路线开始于青霉素G，从而其具有在7-ADCA中会存在残余青霉素化合物(例如青霉素G和6-氨基青霉烷酸(6-APA))的固有风险。WO93/05158、WO95/04148、WO95/04149、WO98/48036、WO98/48034、和/或WO98/48035中公开了经由发酵技术使用经扩环酶基因转化的Penicillium菌株生产7-ADCA的新方法，该新方法在过程中的各个阶段固有地具有污染水平的青霉素化合物如6-APA。因此，需要选择性地降解β-内酰胺化合物的方法，例如选择性地降解6-APA的方法。

发明详述

在一般情况下，β-内酰胺是不稳定的化合物并且存在几种降解β-内酰胺的方法。然而，现有的方法要么使用苛刻的反应条件并且/或者缺乏选择性和/或是昂贵的和/或费力的。例如，可以通过在所选温度范围和pH范围内或者在存在CO₂和CO₂的其他来源时温育，来选择性地降解6-APA。此外，可以使用β-内酰胺酶来选择性降解。Florey等(″Antibiotics″，第II卷(1949)OxfordUniversityPress，London，802)和Clarke等(″TheChemistryofPenicillin″(1949)PrincetonUniversityPress，Princeton，207-242)已经报道了使用亚硫酸氢钠Δ²-青霉素F和青霉素G的失活，然而这些研究没有表明任何与亚硫酸氢钠有关的选择性。最后，已知几种从头孢菌素产品中分离6-APA或其他青霉素的纯化方法。

一个方面，已经令人惊奇地发现，通过在亚硫酸盐的存在下进行降解可以获得青霉素化合物的选择性降解。因此，本发明提供了一种用于降解混合物中的通式(1)的青霉素化合物的方法，所述混合物包含所述通式(1)的化合物和通式(2)的头孢菌素化合物。

在通式(1)和(2)的化合物中，R₁和R₂为氢或酰基，例如己二酰基、2-氨基己二酰基、2-氨基-4-噻唑乙酰基、2-氨基-4-噻唑基(甲氧基亚氨基)乙酰基、2，5-二氢苯基甘氨酰基、2-呋喃基(甲氧基亚氨基)乙酰基、戊二酰基、羟基苯乙酰基、4-羟基苯基甘氨酰基、苯氧乙酰基、苯乙酰基、苯基甘氨酰基、4-吡啶基硫代乙酰基、1-H-四唑-1-基乙酰基或2-噻吩基乙酰基。上述基团广泛存在于具有治疗用途的大多数β-内酰胺中。出于类似的目的，通式(2)的化合物中的基团R₃可以是氢或如下片段，所述片段例如乙酰氨甲基、乙酰氧甲基、氯、乙烯基、氢、羟甲基、甲氧基、甲氧基甲基、甲基、甲基吡啶鎓(methylpyridinium)、(1-甲基-1H-四唑-5-基硫)甲基、丙烯基、1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧代-1，2，4-三嗪-3-基硫)甲基或(1，3，4-噻二唑-2-基硫)甲基。根据本发明可从中除去青霉素化合物的通式(2)的化合物的例子为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)、7-ADCA、己二酰基-7-ADCA、头孢克洛(cefaclor)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢孟多(cefamandole)、头孢曲嗪(cefatrizine)、头孢两酮(cefazedone)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢地尼(cefdinir)、头孢克肟(cefixime)、头孢甲肟(cefmenoxime)、头孢地嗪(cefodizime)、头孢尼两(cefonicid)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢雷特(ceforanide)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢替安(cefotiam)、头孢咪唑(cefpimizole)、头孢匹胺(cefpiramide)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢沙定(cefroxadine)、头孢磺啶(cefsulodin)、头孢他定(ceftazidime)、头孢特仑(cefteram)、头孢替唑(ceftezole)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢唑南(cefuzonam)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢来星(cephaloglycin)、头孢噻啶(cephaloridine)、头孢菌素C(cephalosporinC)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢匹林(cephapirin)和头孢拉定(cephradine)。

在一个实施方式中，通式(1)的青霉素化合物优选地选自由6-APA和任何6-N-酰基衍生物组成的组，所述6-N-酰基衍生物例如己二酰-6-APA、青霉素G、青霉素V、阿莫两林、氨苄青霉素或上述引用的现有技术中公开的那些。在一个优选的实施方式中，通式(1)的青霉素化合物为6-APA或己二酰-6-APA。在另一个优选的实施方式中，通式(2)的头孢菌素化合物为7-ADCA或7-ADCA的任何7-N-酰基衍生物例如己二酰-7-ADCA。最优选的是在包含7-ADCA和/或己二酰-7-ADCA的混合物中的6-APA和/或己二酰-6-APA的降解。

本方法可以在任何合适的温度下进行，例如在0和60℃之间、优选地10和40℃之间的温度下。技术人员能够很好地为本发明的方法中青霉素化合物的降解选择适当的温度。

在本发明的上下文中，术语“亚硫酸盐”(sulfite或sulphite)指的是包含氧化态(也称为氧化数或化合价)4⁺的硫的任何化合物。优选的例子为SO₂、(HSO₃)^-和(SO₃)^2-，其在水溶液中根据pH依比例相互紧邻着存在。例如，在pH1下水溶液包含约90％的SO₂和约10％的(HSO₃)^-，在pH7下水溶液包含约50％的(HSO₃)^-和约50％的(SO₃)^2-，并且在pH8下水溶液包含约10％的(HSO₃)^-和约90％的(SO₃)^2-。可以以任意形式加入亚硫酸盐。一个合适的来源为NaHSO₃，但也可以使用其他来源例如(HSO₃)^-或(SO₃)^2-或(S₂O₃)^2-(偏亚硫酸氢根)的金属盐。此外，可以将气态SO₂引入到反应混合物中。技术人员可以很好地选择可用于本发明的方法中的适当的亚硫酸盐来源。

优选地，本方法在3和9之间、更优选地4和8之间、更优选地5和7之间、最优选地5.5和6.5之间的pH值下进行。优选地，pH为这样的，以使至少10％的亚硫酸盐作为(HSO₃)^-存在，其通常在pH1和8之间；更优选地，pH为这样的，以使至少40％的亚硫酸盐作为(HSO₃)^-存在，其通常在pH1.6和7.2之间；最优选地，pH为这样的，以使至少80％的亚硫酸盐作为(HSO₃)^-存在，其通常在pH2.5和6.3之间.

在本发明的上下文中，“青霉素化合物的降解”定义为，在青霉素化合物中优先裂解4-元的β-内酰胺-环，从而导致青霉素化合物的降解产物。优选地，速率常数k₍₁₎(以hr^-1.(g/l)^-1计)表示通式(1)的化合物的降解，速率常数k₍₂₎(以hr^-1.(g/l)^-1计)表示通式(2)的化合物的降解，k₍₁₎是k₍₂₎的10倍。更优选地，k₍₁₎是k₍₂₎的10至100倍，以及最优选地，k₍₁₎是k₍₂₎的50至1000倍。

另一个方面，本发明提供亚硫酸盐用于青霉素化合物的降解的用途，更优选地用于选自6-APA和任何6-N-酰基衍生物的青霉素化合物的降解的用途，所述6-N-酰基衍生物例如己二酰-6-APA、青霉素G、青霉素V、阿莫两林、氨苄青霉素或上述引用的现有技术中公开的那些。在一个实施方式中，本发明提供亚硫酸盐用于青霉素化合物的降解的用途，其中所述青霉素化合物在头孢菌素化合物的存在下被选择性地降解。一个优选的实施方式是亚硫酸盐用于降解在生产头孢菌素化合物的方法中的污染性青霉素化合物的用途。在另一个实施方式中，本发明提供亚硫酸盐用于降解废物流中青霉素的用途，所述废物流例如为用来生产β-内酰胺抗生素化合物的生产生物体的菌丝体，例如来自Penicillium属的生产青霉素的微生物的菌丝体。所述用途具有显著的实际意义，因为考虑到细菌对青霉素耐药性的不期望的和/或不受控制的发展，废物流中痕量的青霉素对公众健康是有害的。

实施例

材料和方法

通过HPLC使用装配有LichrospherRP-18柱(5μm，250*4.6mm(Merck))的DionexUltimate3000RS在1.3ml/min的流速下操作来测定6-APA的浓度。其他条件：

●洗脱液(等强度)：将6.62gK₂HPO₄+17.76gKH₂PO₄溶解于经纯化的水中。加入100ml乙腈(HPLC级)。通过加入经纯化的水，将体积调节至总共2升。

●运行时间12分钟

●注射体积10μl

●检测波长：214nm

●温度：20-25℃

在这些条件下，在2.9分钟时洗脱6-APA并且在1.5分钟时洗脱pHPG。

使用Reflectoquant亚硫酸盐测试(Merckprod.nr.1.16987.0001)在RQflex2(Merckprod.nr.1.16970.0001)上测量来测定亚硫酸盐。

实施例1

使用NaHSO₃的6-APA的降解

在多个亚硫酸氢盐浓度(0-8g/l)下以及多个pH-值(4、6和9)下，以时间为函数测定6-APA((1)，R₁＝H)的降解。使用1NNaOH和/或1NH₂SO₄使包含1g/l6-APA的水溶液调节到所需pH。然后，加入指定量的NaHSO₃。在20℃下温育各个混合物，并且为了测量残留6-APA浓度以及剩余的亚硫酸盐浓度及时采样。根据pH，亚硫酸盐可以作为H₂SO₃、HSO₃ ^-或SO₃ ^2-存在于溶液中。H₂SO₃具有两个pKa值，一个在～1.8处，第二个在～7.0处。在pH值4和6时，几乎所有亚硫酸盐以HSO₃ ^-存在，而在pH9时几乎所有亚硫酸盐以SO₃ ^2-存在。表1a-1c分别示出了在pH4、6和9时通过亚硫酸盐的6-APA的时间依赖性降解。

表1a：在pH＝4时以亚硫酸盐浓度为函数的6-APA降解

表1b：在pH＝6时以亚硫酸盐浓度为函数的6-APA降解

表1c：在pH＝9时以亚硫酸盐浓度为函数的6-APA降解

结果示出了降解速率取决于6-APA浓度[6-APA]和亚硫酸(氢)盐浓度[SO₃ ^2-]二者，因此是至少二级反应。可以使用二级速率方程为该反应建立模型：

$r=k\left[6\mathrm{APA}\right]\left[{\mathrm{SO}}_3^{2-}\right]$

其中k为速率系数或速率常数(以hr^-1.(g/l)^-1计)

反应中所测定的SO₃ ^2-浓度表示该浓度在降解中保持相当恒定(未示出)。亚硫酸根/盐过量存在。因此，速率方程可以被简化为伪一级速率方程：

r＝k′[6APA]

其中k′＝k[SO₃ ^2-](以hr^-1计)。

在pH4、6和9时对于每个亚硫酸根-浓度，计算k′以及随后的k(见表1a-1c)。在pH6时发现6-APA的最快降解速率。从计算的k-值可以推导出pH9时降解与pH6时相比慢约30-倍。在pH4时，降解速率慢2.5倍，但仍然显著。

实施例2

在pH7下使用NaHSO₃的己二酰-7-ADCA的降解

在多个亚硫酸氢盐浓度(0-12g/l)下和pH＝7下，以时间为函数测定己二酰-7-ADCA((2)，R₂＝己二酰基，R₃＝CH₃)的降解。实验详述和分析参见实施例1。

表2：在pH＝7时以亚硫酸盐浓度为函数的己二酰-7-ADCA降解

表2中数据示出了己二酰-7-ADCA对通过亚硫酸盐的降解更具耐性。几乎没有任何降解发生。这通过以下来说明：对比pH＝6时6-APA的二级速率常数(0.097)与pH＝7时己二酰-7-ADCA的二级速率常数(0.00020)，以上结果说明6-APA降解比己二酰-7-ADCA快485倍。

实施例3

使用不同浓度的NaHSO₃的7-ADCA的降解

在0g/l、4g/l、13g/l和16g/l的亚硫酸氢盐浓度下，以时间为函数测定7-ADCA((2)，R₂＝H，R₃＝CH₃)的降解。在20℃下搅拌四种7-ADCA溶液(50ml)2天。通过HPLC测定7-ADCA的浓度，准确度±2％。用1MNaOH将pH调节至如下表中所示的7.6或pH9.4。

表3：以亚硫酸盐浓度为函数的7-APA降解

实施例4

在pH10下使用NaHSO₃的7-ADCA的降解

在3g/l的亚硫酸氢盐浓度和pH＝10下，以时间为函数测定7-ADCA((2)，R₂＝H，R₃＝CH₃)的降解。实验详述和分析参见实施例1。

表4：在pH＝10和3g/l的亚硫酸氢盐浓度时以时间为函数的7-ADCA降解

实施例5

在7-ADCA和己二酰-7-ADCA的存在下使用NaHSO₃的6-APA的降解

用4NNaOH和6NH₂SO₄将包含6-APA((1)，R₁＝H)、7-ADCA((2)，R₂＝H，R₃＝CH₃)和己二酰-7-ADCA((2)，R₂＝己二酰基，R₃＝CH₃)的混合物(500ml)的pH调节至2.7(表5a)、4.2(表5b)和6.0(表5c)。在t＝0时，从所获得的溶液(加入亚硫酸氢盐之前)采样。在19±3℃下，以30ml/hr(60ml.l^-1.hr^-1)的流速向每个溶液中加入25％亚硫酸氢钠的溶液。在t＝5、20、40和60分钟时采样(2ml)。将用于6-APA分析的样品在磷酸缓冲液pH7.5下稀释两次，并通过LC-MS来分析样品。将用于7-ADCA和己二酰-7-ADCA分析的样品直接稀释151x，并通过HPLC测定。

表5a：在pH＝2.7时以时间为函数的降解

表5b：在pH＝4.2时以时间为函数的降解

表5c：在pH＝6.0时以时间为函数的降解

实施例6

在46±2℃下使用NaHSO₃的己二酰-6-APAvs.己二酰-7-ADCA的降解

将己二酰-7-ADCA((2)，R₂＝己二酰基，R₃＝CH₃；95％纯度，7.06mg，～1当量)和己二酰-6-APA((1)，R₁＝己二酰基；44％纯度，14.65mg，～1当量)溶解于4mL的磷酸缓冲液pH＝6-7中。为了获得澄清溶液，将样品置于超声浴中2-3分钟。转移550μl到NMR管中，并置于色谱仪(700MHz，在46±2℃下预热)中。样品保持在色谱仪中，并在表6中所示的时间记录图谱。

在接下来的实验中，将己二酰-7-ADCA((2)，R₂＝己二酰，R₃＝CH₃；95％纯度，6.66mg，～1当量)、己二酰-6-APA((1)，R₁＝己二酰基；44％纯度，14.57mg，～1当量)和NaHSO₃(9.43mg，4.7当量)溶解于4mL的磷酸缓冲液pH＝6-7中。为了获得澄清溶液，将样品置于超声浴中2-3分钟。转移550μl到NMR管中，并置于色谱仪(700MHz，在46±2℃下预热)中。样品保持在色谱仪中，并在表6中所示的时间记录图谱。

通过测量5.4ppm处双重峰(己二酰-6-APA的β-内酰胺环)的积分和5.05ppm处双重峰(己二酰-7-ADCA的β-内酰胺环)的积分来测定标题化合物的分解。己二酰-6-APA和己二酰-7-ADCA信号二者的初始增长可能是样品达到46±2℃的所需温度前进行测量的结果。结果示于表6中，其表明在亚硫酸盐存在时己二酰-6-APA比己二酰-7-ADCA优先降解。

表6：在46±2℃和pH＝6时使用NaHSO₃的己二酰-6-APAvs.己二酰-7-ADCA的降解

Claims (6)

1.一种降解混合物中的通式(1)的化合物的方法，所述混合物包含所述通式(1)的化合物和通式(2)的化合物，

其中R₁和R₂独立地选择由以下组成的列表：己二酰基和氢，并且其中R₃为甲基，其特征在于所述降解在3和9之间的pH下在亚硫酸盐存在下进行。

2.如权利要求1所述的方法，其中R₁与R₂相同。

3.如权利要求1所述的方法，其中R₁为氢，R₂为己二酰基。

4.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中所述通式(1)的化合物的降解的速率系数k₍₁₎为所述通式(2)的化合物的降解的速率系数k₍₂₎的10至1000倍。

5.亚硫酸盐用于在3和9之间的pH下降解水性混合物中的式(1)的化合物的用途，所述水性混合物包含所述通式(1)的化合物和通式(2)的化合物，

其中R₁和R₂独立地选择由以下组成的列表：己二酰基和氢，并且其中R₃为甲基。

6.如权利要求5所述的用途，其中所述水性混合物为废物流。