JPS588838B2 - コウソホウニヨルコウセイブツシツノセイゾウホウ - Google Patents
コウソホウニヨルコウセイブツシツノセイゾウホウInfo
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- JPS588838B2 JPS588838B2 JP49024219A JP2421974A JPS588838B2 JP S588838 B2 JPS588838 B2 JP S588838B2 JP 49024219 A JP49024219 A JP 49024219A JP 2421974 A JP2421974 A JP 2421974A JP S588838 B2 JPS588838 B2 JP S588838B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、本発明者らが新たに分離したアゾトバクター
（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属またはチオノバチルス（
Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌体、菌体処
理生成物またはその分離酵素の存在下において、一般式 上式中，Ａは式 又は のアミンと 一般式 で示されるアシル化剤と縮合させ 一般式で表わされる
抗生物質の広汎なアシを誘導体を製造する方法に関する
。
（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属またはチオノバチルス（
Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌体、菌体処
理生成物またはその分離酵素の存在下において、一般式 上式中，Ａは式 又は のアミンと 一般式 で示されるアシル化剤と縮合させ 一般式で表わされる
抗生物質の広汎なアシを誘導体を製造する方法に関する
。
従来、微生物またはそれらが産生ずる酵素を用い種々な
半合成ペニシリン、半合成セファレキシン等を得る所謂
酵素法が幾つか知られているが、反応に関与する基質に
対応しいつれの場合も使用菌株と分離採取法を異にして
いる。
半合成ペニシリン、半合成セファレキシン等を得る所謂
酵素法が幾つか知られているが、反応に関与する基質に
対応しいつれの場合も使用菌株と分離採取法を異にして
いる。
本発明者らに、酵素合成に由来するアシル誘導体として
の抗生物質を、工業的に容易に製造する方法について検
討を重ねた結果、一種類の反応基質の組み合わせだけで
なく前述のように広範囲の基質に作用する縮合酵素を土
壌細菌中より検索することに成功した。
の抗生物質を、工業的に容易に製造する方法について検
討を重ねた結果、一種類の反応基質の組み合わせだけで
なく前述のように広範囲の基質に作用する縮合酵素を土
壌細菌中より検索することに成功した。
即ち、α位にアミン基を有するアシル化剤ならば一般式
にみられる広範なアミンと縮合して夫々のアシル誘導体
を生成するという工業的に好都合な基質特異性酵素を見
出したことは、驚くべきことで前例がない。
にみられる広範なアミンと縮合して夫々のアシル誘導体
を生成するという工業的に好都合な基質特異性酵素を見
出したことは、驚くべきことで前例がない。
本発明者らが新しく得た土壌細菌Ｎｏ．５６８６及びＮ
ｏ．５８８６が生産する酵素は、β−ラクタマーゼなど
の副作用がなく収率の高いことが特徴である。
ｏ．５８８６が生産する酵素は、β−ラクタマーゼなど
の副作用がなく収率の高いことが特徴である。
また両菌株とも、ペニシリンＧに対して全くアミダーゼ
作用がなく，６−ＡＰＡとフエニル醋酸の存在下でペニ
シリンＧを逆合成することもできないため、別の菌株が
産生するアミダーゼによるペニシリンＧ分解液（フエニ
ル醋酸を含む）をそのまゝ６−ＡＰＡ基質として採用で
きる工業的利点を有する。
作用がなく，６−ＡＰＡとフエニル醋酸の存在下でペニ
シリンＧを逆合成することもできないため、別の菌株が
産生するアミダーゼによるペニシリンＧ分解液（フエニ
ル醋酸を含む）をそのまゝ６−ＡＰＡ基質として採用で
きる工業的利点を有する。
このように広範な基質に効率よく適応する新規な分離細
菌による酵素合成法の確立は高く評価されるべきものと
考えられる。
菌による酵素合成法の確立は高く評価されるべきものと
考えられる。
本発明に使用される菌株について、その形態学的および
生理学的性状を略記すれば次の通りである。
生理学的性状を略記すれば次の通りである。
以上のような菌学的性状をもとに、バージ一の細菌同定
書（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅ
ｒｍｉｎａｔ−ｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），
スカーマンの細菌同定書（Ｓｋｃｒｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ
Ｇｅｎｅｒａ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ），国際細菌
分類学雑誌（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｓ−ｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ）に照合した結果、本菌株らは次のように分
類学上の属が決定される。
書（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅ
ｒｍｉｎａｔ−ｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），
スカーマンの細菌同定書（Ｓｋｃｒｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ
Ｇｅｎｅｒａ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ），国際細菌
分類学雑誌（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｓ−ｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ）に照合した結果、本菌株らは次のように分
類学上の属が決定される。
菌株４５６８６
若い細胞（１５〜２０時間）ぱ桿状を呈し鞭毛を有する
が、古い細胞（２５〜４０時間）は卵形状となり鞭毛は
脱落し易く多形性を示す。
が、古い細胞（２５〜４０時間）は卵形状となり鞭毛は
脱落し易く多形性を示す。
窒素を含有しない基礎培地として燐酸水素ニカリウム０
．０５％、硫酸マグネシウム０．０３％、塩化ナトリウ
ム０．０２％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸第一鉄
０．００１％、モリブデン酸ソーダ１０ｐｐｍ，グルコ
ース２％に生育した。
．０５％、硫酸マグネシウム０．０３％、塩化ナトリウ
ム０．０２％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸第一鉄
０．００１％、モリブデン酸ソーダ１０ｐｐｍ，グルコ
ース２％に生育した。
この無窒素培地にアンモニア態窒素もしくは硝酸態窒素
を添加して培養すると、窒素を添加しない無窒素培地に
比し急速に生育した。
を添加して培養すると、窒素を添加しない無窒素培地に
比し急速に生育した。
これらの結合態窒素を消費してからもエネルギー源さえ
残存すれば、空中窒素固定作用を行って増強することか
らアゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属と同定
。
残存すれば、空中窒素固定作用を行って増強することか
らアゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属と同定
。
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研閑寄第１６６
１号として寄託された。
１号として寄託された。
菌株Ａ５８８６
チオ硫酸塩を酸化、二酸化炭素を資化できる。
チオ硫酸平板寒天上のコロニーに、析出した硫黄に影響
されて黄色ないし褐色に変化する。
されて黄色ないし褐色に変化する。
液体培地硫酸アンモニウム０．０１％，硫酸マグネシウ
ム０．０１％、塩化カルシウム０．０１％、燐酸カリウ
ム０．８％、塩化第一鉄０．００２％、硫酸マンガン０
．００２％（ｐＨ ６．６）を基本培地とし、エネルギ
ー源としてチオ硫酸などを加えた培地で生育したことか
ら、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属と同
定。
ム０．０１％、塩化カルシウム０．０１％、燐酸カリウ
ム０．８％、塩化第一鉄０．００２％、硫酸マンガン０
．００２％（ｐＨ ６．６）を基本培地とし、エネルギ
ー源としてチオ硫酸などを加えた培地で生育したことか
ら、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属と同
定。
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１６６
５号として寄託された。
５号として寄託された。
強力なアシル化酵素生産菌として、空気中の窒素利用可
能なアゾトバクター属、硫黄酸化によるエネルギー利用
可能なチオバチルス属など、化学合成的な無機栄養菌群
が偶然こ＼に登場したことは興味深い。
能なアゾトバクター属、硫黄酸化によるエネルギー利用
可能なチオバチルス属など、化学合成的な無機栄養菌群
が偶然こ＼に登場したことは興味深い。
尚、アゾトバクター属、チオバチルス属に属するアシル
化酵素生産菌であれば、自然株でも変異株でもすべて本
発明方法において使用することができる。
化酵素生産菌であれば、自然株でも変異株でもすべて本
発明方法において使用することができる。
これらの菌株を培養するに当っては夫々の属に適応した
無機成分培地でもよいが、発育を促進するため、ペプト
ン、酵母エキス、コーンスチープリカー、硝酸塩、アン
モニウム塩などの窒素源、グルコースなどの炭素源、お
よび燐酸塩などの無機塩などを適当に含む栄養培地を用
い、２５〜３０℃、２４〜４．８時間にわたり好気的に
行われる。
無機成分培地でもよいが、発育を促進するため、ペプト
ン、酵母エキス、コーンスチープリカー、硝酸塩、アン
モニウム塩などの窒素源、グルコースなどの炭素源、お
よび燐酸塩などの無機塩などを適当に含む栄養培地を用
い、２５〜３０℃、２４〜４．８時間にわたり好気的に
行われる。
本酵素は菌体内酵素であるので、培養後集菌して得た生
菌体そのまゝか又は物理的あるいは化学的方法による菌
体処理生成物など目的とする酵素活性を保持する限り如
何なる形態においても本発明に使用し得る。
菌体そのまゝか又は物理的あるいは化学的方法による菌
体処理生成物など目的とする酵素活性を保持する限り如
何なる形態においても本発明に使用し得る。
酵素反応は通常、一般式で示したアシル基供与体と６−
アミノペニシラン酸または３−セフエム核の３位に置換
基を有する７−アミノセファロスポラン酸を、水または
緩衝液に溶解し、アシル化酵生産菌体または酵素担体を
加えることにより行われる。
アミノペニシラン酸または３−セフエム核の３位に置換
基を有する７−アミノセファロスポラン酸を、水または
緩衝液に溶解し、アシル化酵生産菌体または酵素担体を
加えることにより行われる。
基質濃度としては、６−アミノペニシラン酸４５μＭ／
ｍｌに対しアシル基供与体１．２〜１．５倍モル、３−
セフエム核の３位に置換基を有する７−アミノセファロ
スポラン酸３．５〜９３．５μＭ／ｍｌに対しアシル基
供与体１．２〜１０倍モル程度である。
ｍｌに対しアシル基供与体１．２〜１．５倍モル、３−
セフエム核の３位に置換基を有する７−アミノセファロ
スポラン酸３．５〜９３．５μＭ／ｍｌに対しアシル基
供与体１．２〜１０倍モル程度である。
機能的アシル基供与体としては夫々のメチルエステル塩
酸塩が賞用される。
酸塩が賞用される。
反応温度は３０〜３７℃、攪拌しながら０．５〜３時間
攪拌しながら酵素反応を行った。
攪拌しながら酵素反応を行った。
反応液中に生成した抗生物質は、バチルス・ズブチリス
ＡＴＣＣ６６３３を用いカップ法により算定する。
ＡＴＣＣ６６３３を用いカップ法により算定する。
確認法としては，バイオオートグラフイーと同時に薄層
クロマトグラフイー（ｎ°プタノール■：醋酸■：水■
）を行い、夫々の相当する標品と比較する。
クロマトグラフイー（ｎ°プタノール■：醋酸■：水■
）を行い、夫々の相当する標品と比較する。
反応液から夫々の目的とする抗生物質を採取するには，
従来、アニオン交換樹脂に通し酸性水で溶出し震縮して
等電点沈澱させたり、強酸性下でメチルイソプチルケト
ン等の非親水溶媒で抽出したりすることが知られている
。
従来、アニオン交換樹脂に通し酸性水で溶出し震縮して
等電点沈澱させたり、強酸性下でメチルイソプチルケト
ン等の非親水溶媒で抽出したりすることが知られている
。
また工業的には水に難溶性の塩を形成させる方法が一般
に採用され、ペニシリン誘導体ではβ−ナフタレンスル
ホン酸、セファロスポリン誘導体ではキノリン類、芳香
族アミン類などの例があるが、構造類似物の分別法とし
ての普遍性は認められない。
に採用され、ペニシリン誘導体ではβ−ナフタレンスル
ホン酸、セファロスポリン誘導体ではキノリン類、芳香
族アミン類などの例があるが、構造類似物の分別法とし
ての普遍性は認められない。
一般式に相当するアンピシリン，セファログリシン、セ
ファレキシンのように、側鎖アシル基にはアミン基、３
位または４位にはカルボキシル基をも有する両性物質で
、且、甚だ安定性の悪いβーラクタム項を有する物質の
場合、目的物のみを収率よく単離精製することは、非常
に困難と考えられている。
ファレキシンのように、側鎖アシル基にはアミン基、３
位または４位にはカルボキシル基をも有する両性物質で
、且、甚だ安定性の悪いβーラクタム項を有する物質の
場合、目的物のみを収率よく単離精製することは、非常
に困難と考えられている。
新規に有用な抗生物質が合成されても、純粋にこれを反
応液から分離する手段が渇望される所以である。
応液から分離する手段が渇望される所以である。
殊に酵素反応液では本来の性質上、基質濃度が薄く、化
学合成法の比ではない。
学合成法の比ではない。
その上、生成物、副生物および未反応物は、いづれもア
ミン基およびカルボキシル基の両方を有する両性物質ま
たはそれに類するものであり、更に安定性の悪いβ−ラ
クタム環を有する物質または光学活性体であるために、
それらの何れをも回収することは至難である。
ミン基およびカルボキシル基の両方を有する両性物質ま
たはそれに類するものであり、更に安定性の悪いβ−ラ
クタム環を有する物質または光学活性体であるために、
それらの何れをも回収することは至難である。
本発明者らは、これらの点に鑑み種々検討の結果、酵素
反応中に存在する目的生成物、未反応物、副生物などを
、非イオン性ポリスチレン重合体とイオン交換樹脂を手
順よく組み合わせることにより、それらの何れをも相互
に収率上く分別回収できる知見を得た。
反応中に存在する目的生成物、未反応物、副生物などを
、非イオン性ポリスチレン重合体とイオン交換樹脂を手
順よく組み合わせることにより、それらの何れをも相互
に収率上く分別回収できる知見を得た。
しかも一般式にみられる構造のものは、６−アミノペニ
シラン酸、セフエム核の如何を問わず基本的に一定の分
離手段が適用できｉるという点で、極めて有利な方法で
ある。
シラン酸、セフエム核の如何を問わず基本的に一定の分
離手段が適用できｉるという点で、極めて有利な方法で
ある。
但し、セフエム核の３位置換基に比較的大きい分子量の
置換基を有する場合のみ、極く一部の修正が望ましい。
置換基を有する場合のみ、極く一部の修正が望ましい。
実際の採取法は、次のような系統的手順による。
（１）反応液を酸性にし、非イオン型合成吸着樹脂力ラ
ムに通すと、酵素合成された抗生物質のみが吸着される
。
ムに通すと、酵素合成された抗生物質のみが吸着される
。
溶離にぱ含水メタノールを用いる。
（２）通過液を陰イオン交換樹脂カラムに通して、６−
ＡＰＡ又は７−ＡＤＣＡなどを吸着させる，溶離には酸
または、その塩溶液を用いる。
ＡＰＡ又は７−ＡＤＣＡなどを吸着させる，溶離には酸
または、その塩溶液を用いる。
（３）その通過液を中和し、改めて非イオン型合成吸着
樹詣に通すとアシル供与体の低級アルキルエステルが吸
着される。
樹詣に通すとアシル供与体の低級アルキルエステルが吸
着される。
溶離にぱ含水メタノールを用いる。
（４）通過液を強酸性イオン交換樹脂力ラムに通して、
アシル供与体の遊離酸を吸着させる。
アシル供与体の遊離酸を吸着させる。
溶離には塩基またはその塩を用いる。
但し、セフエム核の３位置挾基に大きい分子量の置換基
を有する場合には上記の手順の中、（１）では、酵素合
成物と同時に未反応のセフエム核部分が吸着されるので
、先づ含水メタノールにより目的の抗生物質を単離溶出
した後、酸性の含水メタノールでセフエム核部分を溶離
分別する点のみが修正される。
を有する場合には上記の手順の中、（１）では、酵素合
成物と同時に未反応のセフエム核部分が吸着されるので
、先づ含水メタノールにより目的の抗生物質を単離溶出
した後、酸性の含水メタノールでセフエム核部分を溶離
分別する点のみが修正される。
次に実施例を挙げて本発明方法を具体的に説明するが、
これにより使用菌株、酵素反応条件および、結果として
系統的分別がなされるならば吸着樹脂とイオン交換樹脂
の組み合ハせの変更などは限定されるものでなく、本発
明方法の範囲において適宜変更され得るものである。
これにより使用菌株、酵素反応条件および、結果として
系統的分別がなされるならば吸着樹脂とイオン交換樹脂
の組み合ハせの変更などは限定されるものでなく、本発
明方法の範囲において適宜変更され得るものである。
実施例１
グルコース０．５％、ペプトン５．０％，硫酸マグネシ
ウム０．０２％、塩化ナトリウム０．０２％、燐酸一加
里０．０１％、硫酸石灰０．０１％を含むシード培地（
ｐＨ７．０）にアゾトバクター属菌洗５６８６の斜面培
養１白金耳を接種し、２８℃、２４時間の振盪培養をす
る。
ウム０．０２％、塩化ナトリウム０．０２％、燐酸一加
里０．０１％、硫酸石灰０．０１％を含むシード培地（
ｐＨ７．０）にアゾトバクター属菌洗５６８６の斜面培
養１白金耳を接種し、２８℃、２４時間の振盪培養をす
る。
その成育シード８ｍｔを採り，グルコース６．０％、酵
母エキス１．０，チ、燐酸−アンモン０．２％、燐酸二
加里０．１％を含む酵素生産液体培地（ｐＨ６．５）２
００ｍｌに移液し，更に４８時間の振盪培養を行う。
母エキス１．０，チ、燐酸−アンモン０．２％、燐酸二
加里０．１％を含む酵素生産液体培地（ｐＨ６．５）２
００ｍｌに移液し，更に４８時間の振盪培養を行う。
培養後の液に遠心分離して菌体を集め，０．０５１１＃
酸緩衝液５０ｍｌで洗滌後、６−アミノペニシラン酸と
Ｄ（−）フエニルグリシン・メチルエステル塩酸塩を、
夫々９．７ｍｇ／ｍｌおよび１３．７ｍｇ／ｍｌ濃度で
含有する０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００蔵に
添加し、３７℃、３時間攪拌しながら酵素反応を行った
。
酸緩衝液５０ｍｌで洗滌後、６−アミノペニシラン酸と
Ｄ（−）フエニルグリシン・メチルエステル塩酸塩を、
夫々９．７ｍｇ／ｍｌおよび１３．７ｍｇ／ｍｌ濃度で
含有する０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００蔵に
添加し、３７℃、３時間攪拌しながら酵素反応を行った
。
反応濾液中のＤ（−）Ｃｔ−アミノベンジルペニシリン
（アンピシリン）生成量は、バイオオートグラフイーで
同定した上、微生物検定した所９．６ｍｇ／ｍｌであっ
た。
（アンピシリン）生成量は、バイオオートグラフイーで
同定した上、微生物検定した所９．６ｍｇ／ｍｌであっ
た。
酵素反応中の基質と生成物の経時的変化を検べるため薄
層クロマトグラフィを利用する。
層クロマトグラフィを利用する。
展開溶媒ＢｕＯＨ：ＡｃＯＨ：Ｈ２０＝３：１：１その
ときのＲｆは、 アンピシリン：０．５０ Ｄ（−）フエニル Ｄ（−）フエニルグリシン：０、４６ ６−ＡＰＡ：０．３７ 但し、スポットの発色はニンヒドリンによる。
ときのＲｆは、 アンピシリン：０．５０ Ｄ（−）フエニル Ｄ（−）フエニルグリシン：０、４６ ６−ＡＰＡ：０．３７ 但し、スポットの発色はニンヒドリンによる。
酵素反応終了後の液１００ｍｌをｐＨ３．０以下の酸性
、好ましくはｐＨ２．０〜２．５とし遠心分離、上澄液
を非イオン型吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ−２０の３０ｍ
ｌカラムに通す。
、好ましくはｐＨ２．０〜２．５とし遠心分離、上澄液
を非イオン型吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ−２０の３０ｍ
ｌカラムに通す。
続いて０．５％食塩液７０彪および水４０ｍｌで洗滌後
、酸性メタノール（７０％ＭｅＯＨ）で溶出する。
、酸性メタノール（７０％ＭｅＯＨ）で溶出する。
活性出液量２０ｍｌ。
（４１．７ｍｇ／ｍｌ、推定収率８６．８％）この活性
溶出液を約ｐＨ４．０とし濃縮後に析出する針状結晶を
戸取し、アンピシリンー水塩を得た。
溶出液を約ｐＨ４．０とし濃縮後に析出する針状結晶を
戸取し、アンピシリンー水塩を得た。
（８４８ｍｇ、力価９１１ｍｃｇ／ｍｇ、純度９５％、
収率８３．９％） ＨＰからの通過液をｐＨ６．０に修正後に陰イオン交換
樹脂ＳＡ−１０ＡＳ（醋酸型）４０ｍｌに通過させ、水
洗後（０．１Ｎ塩酸：０．２Ｎ塩化アンモン＝１：１）
で溶出する。
収率８３．９％） ＨＰからの通過液をｐＨ６．０に修正後に陰イオン交換
樹脂ＳＡ−１０ＡＳ（醋酸型）４０ｍｌに通過させ、水
洗後（０．１Ｎ塩酸：０．２Ｎ塩化アンモン＝１：１）
で溶出する。
溶出液はｐＨ４．２に修正後濃縮。
（６−ＡＰＡ２７３ｍｇ、収率７１．９％）ＳＡ−１０
ＡＳの通過液をｐＨ６．０〜７．０に修正し、ＨＰ−２
０に再度吸着させ５０％メタノールで溶出する。
ＡＳの通過液をｐＨ６．０〜７．０に修正し、ＨＰ−２
０に再度吸着させ５０％メタノールで溶出する。
この溶出液を濃縮してＤ（−）フエルグリシンメチルエ
ステル３８０ｍｇを得た。
ステル３８０ｍｇを得た。
ＨＰ−２０の通過液を陽イオン交換樹脂ＰＲ−１２０（
遊離型）の４０ｍｌカラムに吸着させ、水洗後２Ｎアン
モニアで溶離した液を濃縮して、Ｄ（−）フエニルグリ
シン４３３ｍｇを得た。
遊離型）の４０ｍｌカラムに吸着させ、水洗後２Ｎアン
モニアで溶離した液を濃縮して、Ｄ（−）フエニルグリ
シン４３３ｍｇを得た。
実施例２
実施例１と全く同様に培養して得られたアゾトバクター
属菌Ｎｏ．５６８６の洗滌菌体を、６−アミノペニシラ
ン酸とＤ（一）バラヒドロキシ・フエニルグリシン・メ
チルエステル塩酸塩の各々９．７ｍｇ／ｍｌおよび１４
．６ｍｇ／ｍｌ濃度で含有する０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）２００ｍｌに添加し、３７℃で２〜３時間攪
拌しながら酵素反応を行った。
属菌Ｎｏ．５６８６の洗滌菌体を、６−アミノペニシラ
ン酸とＤ（一）バラヒドロキシ・フエニルグリシン・メ
チルエステル塩酸塩の各々９．７ｍｇ／ｍｌおよび１４
．６ｍｇ／ｍｌ濃度で含有する０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）２００ｍｌに添加し、３７℃で２〜３時間攪
拌しながら酵素反応を行った。
この反応Ｐ液中のＤ（−）α−アミノバラヒドロキシＯ
ベンジルペニシリン（アモキシシリン）の生成量は、バ
イオオートグラフィーで同定し、微生物検定した所４．
８ｍｇ／ｍｌであった。
ベンジルペニシリン（アモキシシリン）の生成量は、バ
イオオートグラフィーで同定し、微生物検定した所４．
８ｍｇ／ｍｌであった。
酵素反応中の基質と生成物の経時的変化を検べるため薄
層クロマトグラフィを利用する。
層クロマトグラフィを利用する。
展開溶媒ＢｕＯＨ：ＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ＝３：１：１その
ときのＲｆは、 アモキシシリン ：０．４７６−ＡＰＡ
：０．３７但し、スポットの発色
はニンヒドリンによる。
ときのＲｆは、 アモキシシリン ：０．４７６−ＡＰＡ
：０．３７但し、スポットの発色
はニンヒドリンによる。
目的物を採取するには、先づ酵素反応終了後の液２００
ｍｌをｐＨ ２．０〜２．５とし遠心分離、上澄液を非
イオン型吸着樹脂アンバーライトＸＡＤ−２の３０ｄカ
ラムに通す。
ｍｌをｐＨ ２．０〜２．５とし遠心分離、上澄液を非
イオン型吸着樹脂アンバーライトＸＡＤ−２の３０ｄカ
ラムに通す。
続いて０．５係食塩水７０ｍｌおよび水４０ｍｌで洗滌
後、酸性メタノール（７０％ＭｅＯＨ−０．０６ＮＯＨ
ｅｌ）で溶出する。
後、酸性メタノール（７０％ＭｅＯＨ−０．０６ＮＯＨ
ｅｌ）で溶出する。
活性溶出液量２５ｍｌ。（３３．７ｍｇ／ｍｌ、推定収
率８８％）この活性溶出液を約ｐＨ ４．０とし、濃縮
後に析出する結晶を戸取し、アモキシシリンを得た。
率８８％）この活性溶出液を約ｐＨ ４．０とし、濃縮
後に析出する結晶を戸取し、アモキシシリンを得た。
（７７７．６ｍｇ、収率８１％）ＸＡＤ−２からの通過
液をｐＨ ６．０に修正後に陰イオン交換樹脂アンバー
ライトＩＲＡ−４００（醋酸型）の４０ｍｌカラムに通
過させ、水洗後（０．１Ｎ塩酸：０．２Ｎ塩化アンモン
＝１：１）で溶出する。
液をｐＨ ６．０に修正後に陰イオン交換樹脂アンバー
ライトＩＲＡ−４００（醋酸型）の４０ｍｌカラムに通
過させ、水洗後（０．１Ｎ塩酸：０．２Ｎ塩化アンモン
＝１：１）で溶出する。
溶出液ＵｐＨ４．２に修正後濃縮。（６−ＡＰＡ９３４
．３ｍｇ，収率６８．２％）ＩＲＡ−４００の通過液を
ｐＨ ６．０〜７．０に修正し、ＸＡＤ−２に再度吸着
させ５０％メタノールで溶出する。
．３ｍｇ，収率６８．２％）ＩＲＡ−４００の通過液を
ｐＨ ６．０〜７．０に修正し、ＸＡＤ−２に再度吸着
させ５０％メタノールで溶出する。
この溶出液を濃縮してＤ（−）バラヒドロキシフエニル
グリシンメチルエステル８２０〜を得た。
グリシンメチルエステル８２０〜を得た。
ＸＡＤ−２の通過液をＩＲ−１２０（遊離型）の４０ｍ
ｌカラムに吸着させ、水洗後２Ｎアンモニアで溶離した
液を濃縮して、Ｄ（−）パラヒドロキシフエニルグリシ
ン８８４ｍｇを得た。
ｌカラムに吸着させ、水洗後２Ｎアンモニアで溶離した
液を濃縮して、Ｄ（−）パラヒドロキシフエニルグリシ
ン８８４ｍｇを得た。
実施例 ３
実施例１と同様に培養して得られたアゾトバクター属菌
Ｎｏ．５６８６の洗滌菌体を、７−アミノ−３−（１，
２，３−トリアゾール−４−イルチオメチル）−３−セ
フエム−４−カルボン酸とＤ（−）パラヒドロキシフエ
ニルグリシンメチルエステル塩酸塩の各々５．５ｍｇ／
ｍｌおよび１５．２ｍｇ／ｍｌ濃度で含有する０．１Ｍ
燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）２００ｍｌに添加し、３７℃
，１時間攪拌しながら酵素反応を行った。
Ｎｏ．５６８６の洗滌菌体を、７−アミノ−３−（１，
２，３−トリアゾール−４−イルチオメチル）−３−セ
フエム−４−カルボン酸とＤ（−）パラヒドロキシフエ
ニルグリシンメチルエステル塩酸塩の各々５．５ｍｇ／
ｍｌおよび１５．２ｍｇ／ｍｌ濃度で含有する０．１Ｍ
燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）２００ｍｌに添加し、３７℃
，１時間攪拌しながら酵素反応を行った。
この反応沖液中の７−（α−アミノ−ｐ−ヒドロキシフ
エニルアセトアミド）−３−（１，２，３−トリアゾー
ルー４−イルチオメチル）−３−セフエム−４−カルボ
ン酸生成量は、バイオオートグラフイーで同定し、微生
物検定したところ８．０８ｍｇ／ｍｌであった。
エニルアセトアミド）−３−（１，２，３−トリアゾー
ルー４−イルチオメチル）−３−セフエム−４−カルボ
ン酸生成量は、バイオオートグラフイーで同定し、微生
物検定したところ８．０８ｍｇ／ｍｌであった。
酵素反応中の基質と生成物の経時的変化を検べるために
は薄層クロマトグラフイを利用する。
は薄層クロマトグラフイを利用する。
展開溶媒ＢｕＯＨ：ＡｃＯＨ：Ｈ２０＝３：１：そのと
きのＲｆは、 目的とするセファロスポリン 誘導体 ：０．４１７−アミノ
ー３−セフエムー ３位誘導体 ：０．３３但し、スポ
ットの発色はニンヒドリンによる。
きのＲｆは、 目的とするセファロスポリン 誘導体 ：０．４１７−アミノ
ー３−セフエムー ３位誘導体 ：０．３３但し、スポ
ットの発色はニンヒドリンによる。
酵素反応終了後の液２００ｍｌをｐＨ１．８に修正し遠
心分離した上澄液をＨＰ−２０の５０ｍｌカラムに通す
。
心分離した上澄液をＨＰ−２０の５０ｍｌカラムに通す
。
水１５０ｍで洗滌後、５０％メタノールで溶出する。
活性溶出液量５０ｍｌ。（１６．０７ｍｇ／ｍｌ、推定
収率８８．３％）この活性溶出液をｐＨ４．３とし濃縮
して得られる結晶を濾取し，目的とする抗生物質を得た
。
収率８８．３％）この活性溶出液をｐＨ４．３とし濃縮
して得られる結晶を濾取し，目的とする抗生物質を得た
。
（７００ｍｇ、収率７８．１％）
このＨｐ力ラムには、未反応の７−アミノー３−（１，
２，３−トリアゾール−４−イルチオメチル）−３−セ
フエム−４−カルボン酸が吸着されたまゝになっている
ので、０．２Ｎ・Ｈｃ１−５０％ＭｅＯＨで溶出させる
。
２，３−トリアゾール−４−イルチオメチル）−３−セ
フエム−４−カルボン酸が吸着されたまゝになっている
ので、０．２Ｎ・Ｈｃ１−５０％ＭｅＯＨで溶出させる
。
溶出赦をｐＨ４．５に修正して濃縮。
（３７７ｍｇ、収率７８．３％）Ｈｐに対する最初の通
過液を中和してｐＨ６．５とし、改めてＨｐ−２０の８
０ｍｌカラムに通す。
過液を中和してｐＨ６．５とし、改めてＨｐ−２０の８
０ｍｌカラムに通す。
水洗後５０％メタノールで溶出し濃縮してＤ（−）パラ
ヒドロキシフエニルグリシンメチルエステル１．５５６
ｍｇを得た。
ヒドロキシフエニルグリシンメチルエステル１．５５６
ｍｇを得た。
とのＨＰ−２０の通過液をＩＲ−１２０の８０ｄカラム
に通液させ、水洗後２Ｎアンモニアで溶離した液を濃縮
して、Ｄ（−）パラヒドロキシフェニルグリシン９０４
ｍｇを得た。
に通液させ、水洗後２Ｎアンモニアで溶離した液を濃縮
して、Ｄ（−）パラヒドロキシフェニルグリシン９０４
ｍｇを得た。
実施例 ４
実施例１と同様に培養して得られたアゾトバクター属菌
Ｎｏ．５６８６の洗滌菌体を、７−ＡＣＡとＤ（−）フ
エニルグリシンメチルエステル塩酸塩の各々２４．９ｍ
ｇ／ｍｌおよび２７．３ｍｇ／ｍｌ濃度で含有する０．
１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌに添加し、３
７℃で１時間攪拌しながら酵素反応を行った。
Ｎｏ．５６８６の洗滌菌体を、７−ＡＣＡとＤ（−）フ
エニルグリシンメチルエステル塩酸塩の各々２４．９ｍ
ｇ／ｍｌおよび２７．３ｍｇ／ｍｌ濃度で含有する０．
１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌに添加し、３
７℃で１時間攪拌しながら酵素反応を行った。
この反応液中の７（Ｄ−α−アミノーフエニルアセトア
ミド）−セファロスポラン酸（セファログリシン）生成
量は、バイオオートグラフィーで同定し、微生物検定し
たところ２９．５ｍｇに達した酵素反応中の基質と生成
物の経時的変化を検ぺるため薄層クロマトグラフィを行
う。
ミド）−セファロスポラン酸（セファログリシン）生成
量は、バイオオートグラフィーで同定し、微生物検定し
たところ２９．５ｍｇに達した酵素反応中の基質と生成
物の経時的変化を検ぺるため薄層クロマトグラフィを行
う。
展開溶媒ＢｕＯＨ：ＡｃＯＨ：Ｈ２０＝３：１：１セフ
ァログリシン Ｒｆ：０．３３ ７−ＡＣＡ Ｒｆ：０．２４ 但し、スポットの検出はニンヒドリンによる。
ァログリシン Ｒｆ：０．３３ ７−ＡＣＡ Ｒｆ：０．２４ 但し、スポットの検出はニンヒドリンによる。
酵素反応終了後の液１００ｍｌをｐＨ１．８に修正して
遠心分離した上澄液をＸＡＤ−２の１００ｍｌカムラに
通す。
遠心分離した上澄液をＸＡＤ−２の１００ｍｌカムラに
通す。
水３００Ｈで洗滌後、５０％メタノールで溶出する。
活性溶出液量１００ｍ。（２４．４２ｍｇ／ｍｌ、推定
収率８６，２％）この活性溶出液をｐＨ４．３とし濃縮
して得られる結晶を戸取し、セファログリシンを得た。
収率８６，２％）この活性溶出液をｐＨ４．３とし濃縮
して得られる結晶を戸取し、セファログリシンを得た。
（２，３０１ｇ、収率７８％）
ＸＡＤ−２からの通過液をｐＨ６．０に修正後に陰イオ
ン交換樹脂アンバーライトＩＲＡ−４００（醋酸型）５
０Ｈに通過させ、水洗後（０．１Ｎ塩酸：０．２Ｎ塩化
アンモン＝１：１）で溶離する。
ン交換樹脂アンバーライトＩＲＡ−４００（醋酸型）５
０Ｈに通過させ、水洗後（０．１Ｎ塩酸：０．２Ｎ塩化
アンモン＝１：１）で溶離する。
溶離液をｐＨ３．７に修正後濃縮。
（７−ＡＣＡ３１３．７ｍｇ、収率６３％）
ＩＲＡ−４００の通過液をｐＨ６．０に修正し、ＸＡＤ
−２に再度吸着させ５０％メタノールで溶出する。
−２に再度吸着させ５０％メタノールで溶出する。
この溶出液を濃縮してＤ（−）フエニルグリシンメチル
エステル４２５ｍｇを得た。
エステル４２５ｍｇを得た。
ＸＡＤ−２の通過液をＩＲ−１２０の５０ｍｌカラムに
通液させ，水洗後２Ｎアンモニアで溶離しだ液を濃縮し
て、Ｄ（−）フエニルグリシン２７１ｍｇを得た。
通液させ，水洗後２Ｎアンモニアで溶離しだ液を濃縮し
て、Ｄ（−）フエニルグリシン２７１ｍｇを得た。
実施例 ７
グルコース２％、コンスチープリカ−５％、の組成の培
養液（ｐＨ６．８）１ｌにチオバチルス属菌Ｎｏ．５８
８６を接種し２９℃４８時間振盪培養を行う。
養液（ｐＨ６．８）１ｌにチオバチルス属菌Ｎｏ．５８
８６を接種し２９℃４８時間振盪培養を行う。
培養後の液は遠心分離して菌体を集め、０．０５Ｍ燐酸
緩衝液５０ｍｌで洗滌後、６−アミノベニシラン酸とＤ
（−）フェニルグリシンメチルエステル塩酸塩を夫々９
．７ｍｇ／ｍｌおよび１３．７ｍｇ／ｍｌ濃度で含有す
る０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌに添加
し、３７℃３時間攪拌しながら酵素反応を行った。
緩衝液５０ｍｌで洗滌後、６−アミノベニシラン酸とＤ
（−）フェニルグリシンメチルエステル塩酸塩を夫々９
．７ｍｇ／ｍｌおよび１３．７ｍｇ／ｍｌ濃度で含有す
る０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌに添加
し、３７℃３時間攪拌しながら酵素反応を行った。
反応濾液中のアンピシリン生成量に、バイオオートグラ
フイーで同定した上，微生物検定したところ１０．６ｍ
ｇ／ｍｌであった。
フイーで同定した上，微生物検定したところ１０．６ｍ
ｇ／ｍｌであった。
実施例 ８
実施例７と同様に培養して得られたチオバチルス属菌Ｎ
ｏ．５８８６の洗滌菌体を、６−アミノペニシラン酸と
Ｄ（−）パラヒドロキシフェニルグリシンメチルエステ
ル塩酸塩の各々９．７ｍｇ／ｍｌおよび１４．６ｍｇ／
ｍｌ濃度で含有する０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６）３０
０ｍｌに添加し、３７℃で３時間攪拌しながら酵素反応
を行った。
ｏ．５８８６の洗滌菌体を、６−アミノペニシラン酸と
Ｄ（−）パラヒドロキシフェニルグリシンメチルエステ
ル塩酸塩の各々９．７ｍｇ／ｍｌおよび１４．６ｍｇ／
ｍｌ濃度で含有する０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６）３０
０ｍｌに添加し、３７℃で３時間攪拌しながら酵素反応
を行った。
この反応戸液中のアモキシシリンの生産量は、バイオオ
ートグラフイーで同定し，微生物検定したところ５．２
ｍｇ／ｍｌであった。
ートグラフイーで同定し，微生物検定したところ５．２
ｍｇ／ｍｌであった。
実施例 ９
実施例７と同様に培養して得られたチクバチルス属菌Ｎ
ｏ．５８８６の洗滌菌体を、７−アミノ−３−（１，２
．３−トリアゾール−４−イルチオメチル−３−セフエ
ム−４−カルボン酸とＤ（−）パラヒドロキシフエニル
グリシンメチルエステル塩酸塩の各々５．５ｍｇ／ｍｌ
および１５．２ｍｇ／ｍｌ禮度で含有する０．１Ｍ燐酸
緩衝液（ｐＨ６．０）２００ｍｌに添加し、３７℃で１
時間攪拌しながら酵素反応を行なった。
ｏ．５８８６の洗滌菌体を、７−アミノ−３−（１，２
．３−トリアゾール−４−イルチオメチル−３−セフエ
ム−４−カルボン酸とＤ（−）パラヒドロキシフエニル
グリシンメチルエステル塩酸塩の各々５．５ｍｇ／ｍｌ
および１５．２ｍｇ／ｍｌ禮度で含有する０．１Ｍ燐酸
緩衝液（ｐＨ６．０）２００ｍｌに添加し、３７℃で１
時間攪拌しながら酵素反応を行なった。
この反応Ｆ液中のセファは、パイオオートグラフイーで
同定し微生物検定したところ９．３ｍｇ／ｍｌであった
。
同定し微生物検定したところ９．３ｍｇ／ｍｌであった
。
実施例 １０
実施例７と同様に培養して得られたチオバチルス属菌Ｎ
ｏ．５８８６の洗滌菌体を，７−ＡＣＡとＤ（−）フエ
ニルグリシンメチルエステル塩酸塩の各各２４．９ｍｇ
／ｍｌおよび２７．３ｍｇ／ｍｌ濃度で含有する０．１
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌに添加し、３７
℃で１時間攪拌しながら酵素反応を行った。
ｏ．５８８６の洗滌菌体を，７−ＡＣＡとＤ（−）フエ
ニルグリシンメチルエステル塩酸塩の各各２４．９ｍｇ
／ｍｌおよび２７．３ｍｇ／ｍｌ濃度で含有する０．１
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍｌに添加し、３７
℃で１時間攪拌しながら酵素反応を行った。
この反応液中のセファログリシン生成量は，バイオオー
トグラフイーで同定し、微生物検定したところ２６．８
ｍｇ／ｍｌであった。
トグラフイーで同定し、微生物検定したところ２６．８
ｍｇ／ｍｌであった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式 〔式中、Ａは 又は （式中Ｒ は−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ，または を 示す）を示す〕のアミンと、一般式 （式中、Ｒ′は または を示 し、Ｒ″は低級アルキル基を示す）のアシル基供与体と
を、アゾトバクター属またはチオバチルス属に属する細
菌の生産酵素の存在下でカップリング反応させることを
特徴とする一般式 （式中、ＡおよびＲ′は前記と同義）で表わされる抗生
物質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP49024219A JPS588838B2 (ja) | 1974-03-04 | 1974-03-04 | コウソホウニヨルコウセイブツシツノセイゾウホウ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP49024219A JPS588838B2 (ja) | 1974-03-04 | 1974-03-04 | コウソホウニヨルコウセイブツシツノセイゾウホウ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS50117990A JPS50117990A (ja) | 1975-09-16 |
| JPS588838B2 true JPS588838B2 (ja) | 1983-02-17 |
Family
ID=12132162
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP49024219A Expired JPS588838B2 (ja) | 1974-03-04 | 1974-03-04 | コウソホウニヨルコウセイブツシツノセイゾウホウ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS588838B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5437238A (en) * | 1977-08-31 | 1979-03-19 | Toyota Motor Co Ltd | Circuit breaker |
-
1974
- 1974-03-04 JP JP49024219A patent/JPS588838B2/ja not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5437238A (en) * | 1977-08-31 | 1979-03-19 | Toyota Motor Co Ltd | Circuit breaker |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS50117990A (ja) | 1975-09-16 |
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