JPH07227296A - ３−ヒドロキシメチルセファロスポリンの酵素アシル化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ３−ヒドロキシメチルセファロスポリンの酵
素アシル化を含む、ベータラクタム抗生物質中間体の製
造方法を提供する。 【構成】 当該製造方法では、リパーゼ又はエステラー
ゼ酵素を用いて３−ヒドロキシメチルセファロスポリン
を３’アシル化する。好ましい酵素はロドスポリジウム
・トルロイデスから得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、３−ヒドロキシメチル
セファロスポリンの酵素アシル化を含む、ベータラクタ
ム抗生物質中間体の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】３−アセトキシメチル−７β−アミノセ
フ−３−エム−４−カルボン酸（７−ＡＣＡ）は、半合
成工業セファロスポリン抗生物質の製造に関する最重要
出発物質である。この中間体は、Ｄ−α−アミノアジピ
ル側鎖を化学的又は酵素的に加水分解することにより、
セファロスポリウム・アクレモニウム(Cephalosporiuma
cremonium) （ニュートン及びエイブラハムのネイチャ
ー、175, 548 (1955) 参照）の発酵生成物であるセファ
ロスポリンＣから工業的に製造される。７−ＡＣＡの製
造において、３−アセチル基の化学的又は酵素（エステ
ラーゼ）的な加水分解に起因して、不要な副生成物とし
て３−ヒドロキシメチル−７β−アミノセフ−３−エム
−４−カルボン酸（デス−７−ＡＣＡ）が通常生成され
る。デス−７−ＡＣＡは７−ＡＣＡに対する様々なエス
テラーゼの作用により生成され得る。更に、デス−７−
ＡＣＡは、セファロスポリンＣから７−ＡＣＡへの転化
と類似の方法で、酵素的加水分解によりデスアセチル−
セファロスポリンＣから生成され得る（ＰＣＴ第90/121
10号明細書）。Ｃ−７アミノ基の高い反応性に起因し
て、脱アセチル化先駆物質から７−ＡＣＡを化学合成す
ると生成物は混合物となる。塩化アセチル又は無水酢酸
等の典型的な化学アセチル化試薬を使用すると、中でも
７−ＡＣＡ、Ｎ−アセチル−７−ＡＣＡ及びＮ−アセチ
ル−デスアセチル−７−ＡＣＡが生成される。更に、こ
の条件下では、３−ヒドロキシメチル−７β−アミノセ
フ−３−エム−４−カルボン酸はラクトン化され易い。
先行技術のＯ−アセチル化方法は、反応性のＣ−７アミ
ノ基をブロッキングした後に、酸受容体塩基を伴う４−
（第三アミノ）ピリジン触媒の存在下において非極性溶
媒中でＯ−アセチル化を行い、次にＣ−７アミノ基を脱
ブロッキングすることを含む（欧州特許第153,874A号明
細書）。更に他の方法では、Ｃ−７アセチル化化合物の
４−位のカルボキシル基をエステル化して反応中のラク
トン化を回避し、カルボキシル基を脱エステル化しＣ−
７アミノ基を脱保護して３−アルカノイルオキシメチル
−７β−アミノセフ−３−エム−４−カルボン酸を生成
すること（米国特許第3,532,694 号明細書）、又は酸受
容体塩基を伴う４−（第三アミノ）ピリジン触媒の存在
下において水性培地中でＯ−アセチル化を行い、次にＣ
−７アミノ基を脱ブロッキングすること（欧州特許第02
30972 号明細書）が含まれる。更に、３−ヒドロキシメ
チル−セファロスポリンを水性溶媒中でアセチル化する
化学的工程が記載されている（米国特許第5,221,739 号
明細書）。

【０００３】特定のエステラーゼ及びリパーゼは、加水
分解反応を触媒することが公知であるのみならず、エス
テル化及びエステル交換を目的とする合成に使用するこ
とも可能である。エステラーゼを用いてデスアセチル−
セファロスポリン誘導体を製造することは、ジェフリー
らによって初めて示され（Biochem. J. 、81, 591-596
(1961)）、そこではシトラスアセチルエステラーゼが使
用されている（米国特許第3,202,656 号明細書、欧州特
許第0,109,300 号明細書）。その後、オーレオバシディ
ウム(Aureobasidium) （欧州特許第0,044,736 号明細
書）、シゾミセテス(Schizomycetes) （米国特許第3,23
9,394 号明細書）、リゾビウム(Rhizobium) （米国特許
第3,436,310 号明細書）、バシルス・ズブチリス(Bacil
lus subtilis) （米国特許第3,304,310 号明細書、欧州
特許第0,173,206 号明細書）、ロドスポリジウム・トル
ロイデス(Rhodosporidium toruloides) （英国特許第2,
060,610 号明細書）、ロドトルーラ・ルブラ(Rhodotoru
la rubra) （英国特許第1,474,519 号明細書）、及び小
麦麦芽(wheat germ)から、セファロスポリン化合物を脱
アセチル化し得る多くの他のエステラーゼ及びリパーゼ
が発見された。更に最近では、ワン，Y-F らにより、リ
パーゼで触媒した砂糖のアセチル化における、不可逆ア
シル転移試薬としてのイソプロペニルアセテートの使用
が報告されている（J. Org. Chem. 、53, 3128-3129
）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】Ｃ−３’位がアセチル
化されたセファロスポリンを製造することを目的とする
合成において、以下に記載する特定のアシル供与体を伴
う以下に記載の特定の酵素の使用が機能することが、意
外にも発見された。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、Ｃ−７位のア
ミノ基をブロッキングすることが不要であってラクトン
化が除外されるようなＯ−アシル化セファロスポリンの
製造に関して有用である。酵素的反応に固有の特異性に
より、化学的反応に典型的な副生成物の生成を伴わずに
Ｃ−３’位を選択的にアセチル化することが可能とな
る。更に具体的には、本発明は、次の一般式で表される
セファロスポリン化合物

【０００６】

【化３】

【０００７】（式中、Ｒ’は水素又は次の一般式で表さ
れるアシル基 Ｒ−ＣＯ− （式中、Ｒはカルボン酸残基である）であり、Ｘは水素
又はハロであり、Ｇは硫黄、酸素、スルホキシド、スル
ホン又はメチレンである）の製造のためのアシル化方法
であって、次の一般式で表される化合物

【０００８】

【化４】

【０００９】とアシル供与体とを、ロドスポリジウム・
トルロイデス、小麦麦芽、オレンジピール、バシルス・
ズブチリス又はアスペルギルス・ナイジェール(Aspergi
llus niger) から得られるリパーゼ又はエステラーゼ酵
素の存在下で、水性媒体中で反応させることを含む、前
記方法に関する。

【００１０】本発明で使用するアシル供与体は、３個以
上の炭素原子を含み、合成法においてＣ−３’位での反
応を推進する。このようなアシル供与体はアセチル供与
体又はモノハロアセチル供与体である。アシル供与体は
「可逆」又は「不可逆」の供与体であってよい。可逆供
与体にはエチルアセテート及びトリアセチンが含まれ
る。これらのエステル及びアルコール（一般式IIの化合
物）を、生成物（一般式Ｉの化合物）及びエステル由来
のアルコールと平衡にする。例えば、エチルアセテート
を用いると反応は次の通りである。

【００１１】

【化５】

【００１２】この反応は反対方向に作用し、エステルＩ
及びエタノールからエチルアセテートとアルコールIIと
の混合物が得られる。イソプロペニルアセテート

【００１３】

【化６】

【００１４】のような不可逆供与体を用いると、エステ
ル交換から得られるアルコール

【００１５】

【化７】

【００１６】は不安定であり、互変転換によりアセトン
を与える。このアセトンは、「可逆」型供与体として逆
反応に参加し得ない。従って、アセチル化生成物（Ｉ）
を形成方向への推進力は

【００１７】

【化８】

【００１８】であり、収率は相対的に良好である。本発
明で使用するアシル供与体の例には、次の一般式で表さ
れるものがある。 Ｒ”−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ₂ Ｘ （III ） （式中、Ｒ”はＣ₁ −Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₂ −Ｃ₁₀アルケ
ニル、Ｃ₃ −Ｃ₁₀シクロアルキル、Ｃ₃ −Ｃ₁₀シクロア
ルケニル、Ｃ₂ −Ｃ₁₀アルキニル、Ｃ₆ −Ｃ₃₀アリー
ル、Ｃ₁ −Ｃ₁₀置換アルキル、Ｃ₂ −Ｃ₁₀置換アルケニ
ル、Ｃ₃ −Ｃ₁₀置換シクロアルキル、Ｃ₃ −Ｃ₁₀置換シ
クロアルケニル、Ｃ₆ −Ｃ₃₀置換アリール、又は次の一
般式で表される基 Ｒ"'−（ＯＣＨ₂ −ＣＨ₂ ）_n − （式中、ｎは２以上の整数（好ましくは２〜3,000 、更
に好ましくは２〜100）であり、Ｒ"'は水素又はアセチ
ルである） 又は次の一般式で表される基 Ｒ"'−（ＯＣＨ₂ −ＣＨ₂ −ＣＨ₂ ）_n − （式中、ｎ及びＲ"'は上記定義の通りである）であり、
Ｘは水素又はハロである） 好ましいアシル供与体は、Ｒ”がＣ₂ −Ｃ₆ アルケニ
ル、１〜３個のアセトキシ基で置換されたＣ₁ −Ｃ₆ ア
ルキル、Ｃ₆ −Ｃ₁₀アリール又は次の一般式で表される
基 ＣＨ₃ −ＣＯ（ＯＣＨ₂ −ＣＨ₂ ）_n − （式中、ｎは２〜１００の整数である）であるものであ
る。

【００１９】アシル供与体の具体例には、イソプロペニ
ルアセテート、トリアセチン、ビニルアセテート、エチ
ルアセテート、ジアセチン、エチレングリコールジアセ
テート、シス−１，４−ジアセトキシブタン、１，４−
ジアセトキシブタン、フェニルアセテート、１，２，４
−トリアセトキシベンゼン、１，３−ブタンジオールジ
アセテート、１，２−プロパンジオールジアセテート、
ｎ−ブチルアセテート、トリエチレングリコールジアセ
テート、イソプロピルアセテート又はイソブチルアセテ
ート等が含まれる。更に好ましいアシル供与体は、イソ
プロペニルアセテート、トリアセチン、ビニルアセテー
ト、ジアセチン、エチレングリコールジアセテート、シ
ス−１，４−ジアセトキシブタン、１，４−ジアセトキ
シブタン、フェニルアセテート、１，３−ブタンジオー
ルジアセテート、１，２−プロパンジオールジアセテー
ト又はトリエチレングリコールジアセテートである。
Ｒ’は「カルボン酸残基」であり、セファロスポリンの
当業界で公知のＣ₇-位の側鎖のもの、及びペニシリンの
当業界で公知のＣ₆-位の側鎖のものを含む。通常は、こ
れらの側鎖はＲがＣ₁ −Ｃ₂₀カルボン酸の残基であるも
のであり、例えばＲは水素、Ｃ₁ −Ｃ₆ アルキル、Ｃ₁
−Ｃ₆ シアノ置換アルキル、カルボキシ、ハロゲン、Ｃ
₁ −Ｃ₄ アルコキシ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキルチオ、トリフ
ルオロメチル又はトリフルオロメチルチオ、次の一般式
で表されるナフチル、フェニル又は置換フェニル基

【００２０】

【化９】

【００２１】（式中、ａ及びａ’は独立に水素、ハロゲ
ン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルコキ
シ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルカノイルオキシ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキ
ル、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキルチオ、アミノ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アル
カノイルアミノ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキルスルホニルアミ
ノ、カルボキシ、カルバモイル、ヒドロキシメチル、ア
ミノメチル、又はカルボキシメチルである） 次の一般式で表される基

【００２２】

【化１０】

【００２３】（式中、ａ及びａ’は上に定義した通りで
あり、ＺはＯ又はＳであり、ｍは０又は１である） 次の一般式で表されるアリールメチル基 Ｒ₃ −ＣＨ₂ − （式中、Ｒ₃ はナフチル、チエニル、フリル、ベンゾチ
エニル、ベンゾアミノチアゾリル、ベンゾフリル、ピリ
ジル、４−ピリジルチオ、ピリミジル、ピリダジニル、
インドリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリ
ル、テトラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、オキサ
ジアゾリル、チアジアゾリルである）及びアミノ、ヒド
ロキシ、シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキ
ル、Ｃ ₁ −Ｃ₄ アルコキシ、フェニル又は置換フェニル
又はＣ₁ −Ｃ₄ アルキルスルホニルアミノで置換された
前記アリールメチル基、次の一般式で表される置換メチ
ル基 Ｒ₄ −ＣＨＱ− （式中、Ｒ₄ はシクロヘキサ−１，４−ジエニル、次の
一般式で表されるフェニル又は置換フェニル

【００２４】

【化１１】

【００２５】（式中、ａ及びａ’は上記定義の通り） 又はＲ₄ は上記定義のＲ₃ であって、Ｑはヒドロキシ、
Ｃ₁ −Ｃ₄ アルカノイルオキシ、カルボキシ、スルホ、
アミノ、スルホアミノ、又は次の一般式で表される置換
アミノ基 −ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ^x −ＣＯ−Ｒ^y （式中、Ｒ^x は水素又はＣ₁ −Ｃ₄ アルキル、Ｒ^y はＣ
₁ −Ｃ₄ アルキル、フリル、チエニル、フェニル、ハロ
フェニル、ニトロフェニル、スチリル、ハロスチニル、
ニトロスチニル又は次の一般式で表される基 −ＮＲ^x −Ｒ² （式中、Ｒ^x は上に定義した通りであり、Ｒ² は水素、
Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキルスルホニル、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキル、
又はＣ₁ −Ｃ₄ アルカノイルである）である）であり、
又はＱは次の一般式で表される置換アミノ基

【００２６】

【化１２】

【００２７】（式中、Ｒ² は上に定義した通りであり、
ｑは２又は３である）であり、又はＱは次の一般式で表
される置換アミノ基

【００２８】

【化１３】

【００２９】であり、又はＱは次の一般式で表されるベ
ンズアミド基

【００３０】

【化１４】

【００３１】（式中、ｘは１〜３である）であり、又は
Ｑは次の一般式で表されるピリドン又はピリドニル−カ
ルボニルアミノ基

【００３２】

【化１５】

【００３３】（式中、Ｒ^x は上に定義した通りである）
であり、又はＱは次の一般式で表されるピリジル−カル
ボニルアミノ基

【００３４】

【化１６】

【００３５】であって、該基はＣ₁ −Ｃ₄ アルキル、ア
ミノ、カルボキシ、ヒドロキシ又はハロゲンで置換され
ていてよく、又はＱは次の一般式で表されるイミダゾリ
ル又はピラゾリル基

【００３６】

【化１７】

【００３７】であって、該イミダゾリル又はピラゾリル
はＣ₁ −Ｃ₄ アルキル、カルボキシ、アミノ又はハロゲ
ンで置換されていてよく、又はＱは次の一般式で表され
るベンズピリダジン−４−オン基又はその互変異性体

【００３８】

【化１８】

【００３９】（式中、Ｒ^x は上記定義の通りであり、ｔ
は１〜３である）であり、又はＱは次の一般式で表され
るベンズピラノン基

【００４０】

【化１９】

【００４１】である） あるいは、Ｒは次の一般式で表される基

【００４２】

【化２０】

【００４３】（式中、Ｒ₅ は上記定義のＲ₃ 又はＲ₄ で
あり、Ｒ₉ は水素又はハロゲンであり、Ｒ₆ は水素、Ｃ
₁ −Ｃ₄ アルキル、ハロゲンで置換されたＣ₁ −Ｃ₄ ア
ルキル、次の一般式で表されるカルボキシ置換のアルキ
ル又はシクロアルキル基

【００４４】

【化２１】

【００４５】（式中、ｂ及びｂ’は独立に水素又はＣ₁
−Ｃ₃ アルキルであり、ｎは０、１、２又は３であり、
又はｂ及びｂ’はそれらが結合している炭素とともに３
〜６員の炭素環を形成し、Ｒ₇ はヒドロキシ、Ｃ₁ −Ｃ
₄ アミノ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキルアミノ、又はジ（Ｃ₁ −
Ｃ₄ アルキル）アミノである）であり、又はＲ₆ はフェ
ニルで置換されたＣ₁ −Ｃ₄ アルキル、又はＣ₁ −Ｃ₄
アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、カルボキシ又は保護
されたカルボキシの中から選ばれる１個以上の同じか又
は異なる基で置換されたフェニルであり、又はＲ₆ はＣ
₁ −Ｃ₄ アルケニルであり、又はＲ₆ は次の一般式で表
される環状ラクタム基

【００４６】

【化２２】

【００４７】（式中、ｖは２〜４であり、Ｒ₈ は水素又
はＣ₁ −Ｃ₃ アルキルである）であり、又はＲ₆ は次の
一般式で表されるアリールメチル基 Ｒ₃ −ＣＨ₂ − （式中、Ｒ₃ は上に定義した通りである）であり、又は
Ｒは次の一般式で表される基 −（ＣＨ₂ ）_t ＣＯＯＨ （式中、ｔは前記定義の通りである）であり、又はＲは
次の一般式で表される基 −（ＣＨ₂ ）_t ＣＨ（ＮＨ₂ ）ＣＯＯＨ （式中、ｔは上記定義の通りである）であり、又はＲは
次の一般式で表される基である。 −（ＣＨ₂ ）_t ＣＨ（Ｒ₁₂ＮＲ₁₁）ＣＯＯＨ （式中、ｔは上記定義の通りであり、Ｒ₁₂は水素であ
り、Ｒ₁₁はフェニル、置換フェニル、又は次の一般式で
表される基 −ＣＯ−Ｒ₁₃ （式中、Ｒ₁₃はフェニル、置換フェニル、Ｃ₁ −Ｃ₆ ア
ルキル、Ｃ₁ −Ｃ₆ 置換アルキル、アミノフェニル、フ
ェニルスルホニル、（置換フェニル）スルホニル、Ｃ₁
−Ｃ₄ アルコキシ、又はオキソ（Ｃ₁ −Ｃ₆ アルキル）
であってよい）である）

【００４８】様々な一般式（即ち一般式Ｉ、II及びIII
）で表される化合物の上記定義において、「アルキ
ル」はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、
ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、
ｎ−ヘキシル、３−メチルペンチル、及び同様のアルキ
ル基等の直鎖又は枝分れ鎖のアルキル基を意味し、「置
換アルキル」はシアノ、カルボキシ、ハロゲン、アミ
ノ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルコキシ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキルチオ、
トリフルオロメチル、及びトリフルオロメチルチオで置
換されたこれらのアルキルを含み、「シアノ．．．で置
換されたアルキル」はシアノメチル、シアノエチル、４
−シアノブチル等を意味し、「カルボキシ．．．で置換
されたアルキル」はカルボキシメチル、２−カルボキシ
エチル、４−カルボキシブチル、５−カルボキシペンチ
ル等の基を意味し、「ハロゲン．．．で置換されたアル
キル」はクロロメチル、ブロモメチル、２−クロロエチ
ル、１−ブロモエチル、４−クロロブチル、４−ブロモ
ペンチル、６−クロロヘキシル、４−フルオロブチル、
３−フルオロプロピル、フルオロメチル等を意味し、
「アミノ．．．で置換されたアルキル」は２−アミノエ
チル、アミノメチル、３−アミノプロピル及び４−アミ
ノブチル等の基を意味し、「Ｃ₁ −Ｃ₄ アルコキ
シ．．．で置換されたアルキル」はメトキシメチル、２
−メトキシエチル、２−エトキシエチル、エトキシメチ
ル、３−プロポキシプロピル、３−エトキシブチル、４
−ｔ−ブトキシブチル、３−メトキシペンチル、６−メ
トキシヘキシル等の基を意味し、「Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキル
チオ．．．で置換されたアルキル」は、例えばメチルチ
オメチル、２−メチルチオエチル、２−エチルチオプロ
ピル、４−メチルチオブチル、５−エチルチオヘキシ
ル、３−ｔ−ブチルチオプロピル等の基を意味し、「ト
リフルオロメチル．．．で置換されたアルキル」は、例
えば２，２，２−トリフルオロエチル、３，３，３−ト
リフルオロプロピル、４，４，４−トリフルオロブチ
ル、６，６，６−トリフルオロヘキシル等を意味し、
「トリフルオロメチルチオ．．．で置換されたアルキ
ル」は、例えばトリフルオロメチルチオメチル、２−ト
リフルオロメチルチオエチル、２−トリフルオロメチル
チオプロピル、４−トリフルオロメチルチオブチル、５
−トリフルオロメチルチオヘキシル、及び同様のＣ₁ −
Ｃ₆ 置換アルキル基を意味する。

【００４９】「アルケニル」の語は、１個以上の炭素−
炭素二重結合を有する基を意味する。そのような基の例
としてはビニル、１−プロペン−２−イル、１−ブテン
−４−イル、１−ペンチン−１−イル、１−ブチン−１
−イル等の基がある。「置換アルケニル」の語は、１個
以上の炭素−炭素二重結合を有し、１個以上のハロ、カ
ルボキシ、アミノ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルコキシ、Ｃ₁ −Ｃ₄
アルキルチオ、トリフルオロメチル、トリフルオロメチ
ルチオ、シアノ等により置換された基を意味する。「ア
ルキニル」の語は、１個以上の炭素−炭素三重結合を有
する基を意味する。そのような基の例としてはエチニ
ル、プロピニル等の基がある。「シクロアルキル」の語
は、３個以上の炭素原子を有する環状アルキル基を意味
する。そのような基の例としてはシクロプロピル、シク
ロヘキシル等の基がある。「置換シクロアルキル」の語
は、１個以上のハロ、カルボキシ、アミノ、Ｃ₁−Ｃ₄
アルコキシ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキルチオ、トリフルオロメ
チル、トリフルオロメチルチオ、シアノ等により置換さ
れた環状アルキル基を意味する。「アリール」の語は、
芳香族性の環状基を意味する。そのような基の例にはフ
ェニル、ナフチル及びアンチルが含まれる。「置換アリ
ール」の語は、１個以上のハロ、カルボキシ、アミノ、
Ｃ₁ −Ｃ₄アルコキシ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキルチオ、トリ
フルオロメチル、トリフルオロメチルチオ、シアノ等に
より置換されたアリール基を意味する。「Ｃ₁ −Ｃ₄ ア
ルキルチオ」の語は、１〜４個の炭素原子を有し、１個
以上の硫黄原子で置換された基を意味する。「ハロ」及
び「ハロゲン」の語は、フルオロ、クロロ、ブロモ又は
ヨード基を意味する。

【００５０】一般式Ｉにおいて、置換基がａ及びａ’で
表されている置換フェニル基の例としては、４−クロロ
フェニル、３−ブロモフェニル、２−フルオロフェニ
ル、２−ヨードフェニル、２，４−ジクロロフェニル、
及び３，５−ジクロロフェニル等のハロフェニル；２−
ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシフェニル、４−ヒ
ドロキシフェニル、２，４−ジヒドロキシフェニル、及
び３，４−ジヒドロキシフェニル等のヒドロキシフェニ
ル；２，６−ジメトキシフェニル、４−メトキシフェニ
ル、３−エトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニ
ル、４−ｔ−ブトキシフェニル、４−メトキシ−３−エ
トキシフェニル、及び４−ｎ−プロポキシフェニル等の
アルコキシフェニル；２−アセトキシフェニル、４−プ
ロピオノキシフェニル、４−フォルミルオキシフェニ
ル、４−アセトキシフェニル、３−ブチリルオキシフェ
ニル、及び３−アセトキシフェニル等のアルカノイルオ
キシフェニル；４−メチルフェニル、２−メチルフェニ
ル、２，４−ジメチルフェニル、３−ｔ−ブチルフェニ
ル、４−エチルフェニル、４−エチル−３−メチルフェ
ニル、及び３，５−ジメチルフェニル等のアルキルフェ
ニル；４−メチルチオフェニル、３−ｎ−ブチルチオフ
ェニル、２−エチルチオフェニル、３，４−ジメチルチ
オフェニル、及び３−ｎ−プロピルチオフェニル等のア
ルキルチオフェニル；２−アミノフェニル、４−アミノ
フェニル、３，５−ジアミノフェニル、及び３−アミノ
フェニル等のアミノフェニル；２−アセチルアミノフェ
ニル、４−アセチルアミノフェニル、３−プロピオニル
アミノフェニル、及び４−ブチリルアミノフェニル等の
アルカノイルアミノフェニル；３−メチルスルホニルア
ミノフェニル、４−メチルスルホニルアミノフェニル、
３，５−ジ（メチルスルホニルアミノ）フェニル、４−
ｎ−ブチルスルホニルアミノフェニル、及び３−エチル
スルホニルアミノフェニル等のアルキルスルホニルアミ
ノフェニル；

【００５１】２−、３−、又は４−カルボキシフェニ
ル、３，４−ジカルボキシフェニル、及び２，４−ジカ
ルボキシフェニル等のカルボキシフェニル；２−カルバ
モイルフェニル、２，４−ジカルバモイルフェニル、及
び４−カルバモイルフェニル等のカルバモイルフェニ
ル；４−ヒドロキシメチルフェニル及び２−ヒドロキシ
メチルフェニル等のヒドロキシメチルフェニル；２−ア
ミノメチルフェニル及び３−アミノメチルフェニル等の
アミノメチルフェニル；及び２−カルボキシメチルフェ
ニル、４−カルボキシメチルフェニル、及び３，４−ジ
（カルボキシメチル）フェニル等のカルボキシメチルフ
ェニルがあり、更に４−クロロ−３−メチルフェニル、
４−フルオロ３−ヒドロキシフェニル、３，５−ジクロ
ロ−４−ヒドロキシフェニル、４−ヒドロキシ−３−ク
ロロフェニル、４−ヒドロキシ−３−メチルフェニル、
４−エチル−３−ヒドロキシフェニル、４−メトキシ−
３−ヒドロキシフェニル、４−ｔ−ブチロキシ−２−ヒ
ドロキシフェニル、４−アセチルアミノ−３−メトキシ
フェニル、３−アミノ−４−エチルフェニル、２−アミ
ノメチル−４−クロロフェニル、２−ヒドロキシメチル
−３−メトキシフェニル、２−ヒドロキシメチル−４−
フルオロフェニル、２−アセトキシ−４−アミノフェニ
ル、４−アセトキシ−３−メトキシフェニル、、３−イ
ソプロピルチオ−４−クロロフェニル、２−メチルチオ
−４−ヒドロキシメチルフェニル、４−カルボキシ−３
−ヒドロキシフェニル、４−エトキシ−３−ヒドロキシ
フェニル、４−メチルスルホニルアミノ−２−カルボキ
シフェニル、４−アミノ−３−クロロフェニル、及び２
−カルボキシメチル−４−ヒドロキシフェニル等の異な
る置換基を有する置換フェニル基がある。

【００５２】Ｒが次の一般式で表される基

【００５３】

【化２３】

【００５４】である一般式ＩのＲＣＯ−基の例として
は、ｍ＝０の場合には、フェニルアセチル、４−ヒドロ
キシフェニルアセチル、４−クロロフェニルアセチル、
３，４−ジクロロフェニルアセチル、４−メチルフェニ
ルアセチル、３−エチルフェニルアセチル、２−アミノ
メチルフェニルアセチル、３−カルボキシフェニルアセ
チル、４−アセトキシフェニルアセチル、３−アミノフ
ェニルアセチル、及び４−アセチルアミノフェニルアセ
チルがあり；ｍ＝１でＺ＝Ｏの場合には、フェノキシア
セチル、４−クロロフェノキシアセチル、４−フルオロ
フェノキシアセチル、３−アミノフェノキシアセチル、
３−ヒドロキシフェノキシアセチル、２−メトキシフェ
ノキシアセチル、２−メチルチオフェノキシアセチル、
４−アセチルアミノフェノキシアセチル、３，４−ジメ
チルフェノキシアセチル、及び３−ヒドロキシフェノキ
シアセチルがあり；ｍ＝１でＺ＝Ｓの場合には、フェニ
ルチオアセチル、４−クロロフェニルチオアセチル、
３，４−ジクロロフェニルチオアセチル、２−フルオロ
フェニルチオアセチル、３−ヒドロキシフェニルチオア
セチル、及びエトキシフェニルチオアセチルがある。

【００５５】Ｒ₃ がヘテロアリール基である一般式Ｉの
Ｒ₃ −ＣＯ₂ ＣＯ−基の例としては、２−チエニルアセ
チル、３−チエニルアセチル、２−フリルアセチル、２
−ベンゾチエニルアセチル、２−ベンゾフリルアセチ
ル、インドール−２−イルアセチル、１Ｈ−テトラゾー
ル−１−イルアセチル、オキサゾール−２−イルアセチ
ル、オキサゾール−４−イルアセチル、チアゾール−４
−イルアセチル、２−アミノチアゾール−４−イルアセ
チル、１，３，４−オキサジアゾール−２−イルアセチ
ル、１，３，４−チアジアゾール−２−イルアセチル、
５−エチル−１，３，４−チアジアゾール−２−イルア
セチル、及びアミノ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキルスルホニルア
ミノ、ヒドロキシ、ハロ、Ｃ₁ −Ｃ₄ アルキル又はＣ₁
−Ｃ₄ アルコキシ基により置換された同様のヘテロアリ
ール基がある。

【００５６】Ｒが一般式Ｒ₄ −ＣＨ（Ｑ）−（式中、Ｑ
はアミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、又はスルホであ
る）で表される置換メチル基である一般式ＩのＲＣＯ−
基の例としては、２−カルボキシ−２−フェニルアセチ
ル、２−アミノ−２−（２−ナフタレニル）アセチル、
２−カルボキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）アセ
チル、２−アミノ−２−フェニルアセチル、２−アミノ
−２−（４−ヒドロキシフェニル）アセチル、２−アミ
ノ−２−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アセ
チル、２−アミノ−２−（シクロヘキサ−１，４−ジエ
ニル）アセチル、２−アミノ−２−（３−メチルスルホ
ンアミドフェニル）アセチル、２−アミノ−２−（３−
メチルスルホンアミドフェニル）アセチル、２−アミノ
−２−（３−エチルスルホンアミノフェニル）アセチ
ル、２−ヒドロキシ−２−フェニルアセチル、２−ホル
ミルオキシ−２−フェニルアセチル、２−スルホ−２−
フェニルアセチル、２−スルホ−２−（４−メチルフェ
ニル）アセチル、及び２−アセトキシ−２−（３−ヒド
ロキシフェニル）アセチル、２−アミノ−２−（２−チ
エニル）−アセチル、２−アミノ−２−（３−ベンゾチ
エニル）アセチル、２−アミノ−２−（１Ｈ−テトラゾ
ール−１−イル）アセチル、２−ヒドロキシ−２−
（１，３，４−チアジアゾール−２−イル）アセチル、
２−アミノ−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）
アセチル、２−カルボキシ−２−（２−チエニル）アセ
チル、２−カルボキシ−２−（ベンゾチエン−２−イ
ル）アセチル、及び２−ヒドロキシ−２−（ベンゾフル
−２−イル）アセチルがあり；

【００５７】Ｑが次の一般式で表される置換アミノ基 −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ^x −Ｃ（Ｏ）−Ｒ^y である場合には、そのようなアシル基の例としては２−
（Ｎ−メチル−Ｎ−ベンゾイル−カルバモイルアミノ）
−２−フェニルアセチル、２−（Ｎ−メチル−Ｎ−シン
ナモイル−カルバモイルアミノ）−２−（２−フリル）
アセチル、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−カルバモイルウレ
イド）−２−（４−クロロフェニル）アセチル、２−
〔Ｎ−メチル−Ｎ−（２−クロロシンナモイル）カルバ
モイルアミノ〕−２−（２−チエニル）アセチル、及び
２−（Ｎ−エチル−Ｎ−アセチルカルバモイルアミノ）
−２−（４−ヒドロキシフェニル）アセチルがあり；Ｑ
が次の一般式で表される置換アミノ基

【００５８】

【化２４】

【００５９】である場合には、例としては２−〔（３−
メチルイミダゾリジン−２−オン−１−イル）カルボニ
ルアミノ〕−２−フェニルアセチル、２−〔（３−アセ
チルイミダゾリジン−２−オン−１−イル）カルボニル
アミノ〕−２−フェニルアセチル、２−〔（３−メチル
スルホニルイミダゾリジン−２−オン−１−イル）−２
−（２−チエニル）アセチル、及び２−〔（３−アセチ
ルヘキサヒドロピリミジン−２−オン−１−イル）カル
ボニルアミノ〕−２−フェニルアセチルがあり；Ｑが次
の一般式で表されるヒドロキシ置換ベンズアミド基

【００６０】

【化２５】

【００６１】である場合には、そのようなアシル基の例
としては２−（２，４−ジヒドロキシベンズアミド）−
２−フェニルアセチル、２−（４−ヒドロキシベンズア
ミド）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−アセチル、
２−（３，４−ジヒドロキシベンズアミド）−２−（２
−アミノチアゾール−４−イル）−アセチル、２−
（３，５−ジヒドロキシベンズアミド）−２−（３−チ
エニル）アセチル、及び２−（２−ヒドロキシベンズア
ミド）−２−（２−ベンゾフリル）−アセチルがある。
Ｑがヒドロキシ置換ピリジンカルボニルアミノ基である
場合には、例としては例えば２−ヒドロキシピリジン−
４−オン−６−イルカルボニルアミノ及び３−ヒドロキ
シピリジン−４−オン−６−イルカルボニルアミノが含
まれる。Ｑがピリジルカルボニルアミノ基である場合に
は、例としては例えばピリジン−３−イルカルボニルア
ミノ、４−アミノピリジン−３−イルカルボニルアミ
ノ、５−クロロピリジン−２−イルカルボニルアミノ、
３−カルボキシピリジン−４−イルカルボニルアミノ、
及び４−アミノピリジノ−３−イルカルボニルアミノが
ある。Ｑが上記定義のイミダゾール又はピラゾール基で
ある場合には、例としては例えば２−アミノイミダゾー
ル−４−イルカルボニルアミノ、５−カルボキシ−２−
メチルイミダゾール−４−イルカルボニルアミノ、５−
カルボキシピラゾール−３−イルカルボニルアミノ、３
−アミノピラゾール−４−イルカルボニルアミノ及び４
−ヒドロキシピラゾール−５−イルカルボニルアミノが
含まれる。Ｑがベンズピリダジン−４−オン−３−イル
カルボニルアミノ基である場合には、Ｑの例としては次
の一般式で表されるもの

【００６２】

【化２６】

【００６３】がある。Ｒが次の一般式で表されるケト基
又はオキシミノ置換基

【００６４】

【化２７】

【００６５】である一般式Ｉで表される化合物のＲＣＯ
アシル基の例としては、ケト基２−オキソ−２−（２−
チエニル）アセチル、２−オキソ−２−（２−アミノチ
アゾール−４−イル）アセチルがあり；オキシミノ置換
基２−フェニル−２−メトキシアミノアセチル、２−
（２−チエニル）−２−エトキシイミノアセチル、２−
（２−フリル）−２−メトキシイミノアセチル、２−
（２−ベンゾチエニル）−２−カルボキシメトキシイミ
ノアセチル、２−（２−チエニル）−２−（２−カルボ
キシエトキシ）イミノアセチル、２−（２−アミノ−
１，２，４−チアジアゾール−４−イル）−２−メトキ
シイミノアセチル、２−（２−アミノチアゾール−４−
イル）−２−メトキシイミノアセチル、２−（２−クロ
ロチアゾール−４−イル）−２−メトキシイミノアセチ
ル、２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−
（２−カルボキシプロプ−２−イル）オキシイミノアセ
チル、２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−２−
（２−カルバモイル−プロプ−２−イル）オキシイミノ
アセチル、２−（５−アミノ−１，３，４−チアジアゾ
ール−２−イル）−２−メトキシイミノアセチルがあ
る。

【００６６】Ｒ₆ がフェニル又は置換フェニルで置換さ
れているＣ₁ −Ｃ₄ アルキルである場合、そのような基
の例としてはベンジル、４−ヒドロキシベンジル、４−
クロロベンジル、３−カルボキシベンジル、３−クロロ
−４−ヒドロキシベンジル、２−フェニルエチル、１−
フェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−ヒドロキ
シ−２−フェニルプロピル、３−フェニルブチル、及び
同様のフェニルアルキル基がある。Ｒ₆ がアミノ又は保
護されたアミノで置換されているＣ₁ −Ｃ₄ アルキルで
ある場合、例としては２−アミノエチル、３−アミノプ
ロピル、４−アミノブチル、２−アミノプロピル、及び
アミノ基がアミノ保護基により保護されているそれらの
基が含まれる。Ｒ₆ がＣ₂ −Ｃ₄ アルケニル基である場
合、例としてはアリル、ブテン−２、ブテン−３、ブテ
ン−１、及び同様の基が含まれる。Ｒが次の一般式で表
される基

【００６７】

【化２８】

【００６８】である場合の一般式（Ｉ）で表される化合
物の例は、ハマシマの米国特許第4,634,617 号明細書中
に見出すことができ、当該明細書の内容はここに含まれ
るものとする。置換基の例としては、Ｒ₉ については水
素、Ｒ₅ についてはフェニル、フリル、チエニル、オキ
サゾリル、イソオキサゾリル、最適に保護されたアミノ
イソオキサゾリル、チアゾリル、保護されていてもよい
アミノチアゾリル、チアジアゾリル、及びアミノチアゾ
リル、及びＲ₆ についてはＣ₁ −Ｃ₃ アルケニル及び−
ＣＨ₂ ＣＯＯ₂ Ｈがある。Ｒが次の一般式で表される基 −（ＣＨ₂ ）₁ ＣＨ（Ｒ₁₂ＮＲ₁₁）ＣＯＯＨ である場合、Ｒ₁₁の例としては、Ｒ₁₂が水素である場合
には次の一般式で表されるもの

【００６９】

【化２９】

【００７０】が含まれ、あるいはＲ₁₁とＲ₁₂とが一体と
なって次の一般式で表される基

【００７１】

【化３０】

【００７２】を形成する。そのようなＲ₁₁及びＲ₁₂の更
に他の例は、米国特許第3,853,863 号、第3,522,248
号、第3,573,296 号、第3,641,018 号、第3,980,644
号、及び第3,821,208号、日本国特許第108,085 号(197
6)、第112,892 号(1978)、第53,689号(1978)、第029,49
3 号(1976)、第13,389号(1973)、第149,694 号(1975)、
第82,791号(1977)、ドイツ特許第2,157,693 号、第2,72
1,731 号、第2,507,117 号、第2,208,631 号、第2,458,
554 号、第2,418,088 号、第2,523,280 号、及び第2,84
1,363 号、ベルギー特許第796,540 号(1973)、英国特許
第1,565,053 号及び第2,040,942号の各明細書、アンド
リサーノ，R.らのJ. Appl. Chem. Biotechnol.、26, 45
9-468 (1976)中に見出すことができ、上記全ての内容は
ここに含まれるものとする。一般式Ｉ及びIIの化合物に
おいて、最も好ましいＲ’は水素、アセチル、グルタリ
ル、α−アミノジピル、及びフェニルアセチルであり、
Ｇは最も好ましくは硫黄、及びＸは好ましくは水素であ
る。

【００７３】本発明のアシル化工程を行うのに用いる酵
素は、ロドスポリジウム・トルロイデス、小麦麦芽、オ
レンジピール、バシルス・ズブチリス又はアスペルギル
ス・ナイジェールから得られるリパーゼ又はエステラー
ゼである。酵素はいかなる形態で使用してもよい。例え
ば、酵素は粗形態であっても、部分的に精製されていて
も、あるいは精製され結晶化していてもよい。酵素が微
生物から得られる場合には、該工程は全細胞を用いて行
ってもよく（この場合には酵素はin situ で形成され
る）、又は細胞を適切に処理した後に溶解性酵素を得て
もよい。一般に、酵素の形態は、反応培地中で容易に分
散してアシル供与体及び一般式IIの出発化合物と接触し
うるものであろう。従って、酵素が微生物由来のもので
ある場合、好ましくは細胞が増殖しないよう処理した後
に、及び所望により、超音波処理、溶菌酵素を用いた処
理又は洗浄剤を用いた処理等の従来の方法により細胞を
破壊した後に、カルチャー全体の細胞を使用してよい。
アセトン乾燥粉末又はアセトン処理細胞等の、酵素活性
を維持しながら細胞の保存が可能なその他の細胞調製法
を用いることも可能である。エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）等のキレート試薬を用いた処理が好まし
い。

【００７４】微生物酵素を無細胞形態で使用してもよ
い。従って、カルチャーから得た濾過物又は上澄みを使
用してもよい。必要に応じて、濾過又は遠心分離の前
に、上記のように細胞を破壊してもよい。あるいは、無
細胞酵素を常法により更に精製してもよい。使用し得る
手法には、塩又はアセトン等の有機溶媒等を用いた酵素
の沈殿、イオン交換樹脂又は酵素に特別に親和性のある
支持体等によるクロマトグラフィー、ゲル濾過又は透析
等の脱塩が含まれる。無細胞酵素は溶液、沈殿又は適切
な固定化調製物として使用してよい。酵素が小麦麦芽又
はオレンジピール由来である場合、植物材料の酵素含有
抽出物を使用するのが望ましい。そのような抽出物は、
英国特許第966,222 号明細書に記載のような粉砕又は圧
搾等の物理的手法による、又は英国特許第1,121,308号
明細書に記載のような石油エーテル等の炭化水素溶媒を
用いた植物材料の処理等の化学的手法による、植物材料
からの酵素の初期放出を一般に含む常法により調製して
よい。細胞の残骸が除去されているか否かを問わず、得
られた調製物を直接反応混合物に添加してよい。あるい
は、必要に応じて、微生物酵素についての上記の手法等
を用いて調製物を更に処理し、微生物酵素について記載
した使用可能な無細胞酵素を得てもよい。好ましい調製
方法は、溶解性酵素のグルタルアルデヒド／ポリエチレ
ンイミン（ＰＥＩ）処理による酵素の不溶化である。そ
のような不溶化手法は当業界で周知であり、例えばオガ
タ、オッテセン(Ottesen) 及びスベンセン(Svendsen)の
Biochim. Biophys. Acta、159, 403-405 (1968) に開示
されている。

【００７５】本発明に有用な小麦麦芽リパーゼは、当業
界で周知である。そのようなリパーゼは、例えばシンガ
ーのJ. Biol. Chem.、174, 11 (1948)に記載されてお
り、この刊行物に記載のように更に精製してもよい。好
適な小麦麦芽リパーゼの工業原料は、シグマ社（ミズー
リ州セントルイス）から入手可能な小麦麦芽リパーゼＩ
型（Cat.番号L 3001）である。本発明に有用で好適なオ
レンジピールエステラーゼは、当業界で周知である。そ
のようなエステラーゼは、例えば英国特許出願第966,22
2 号明細書、米国特許第3,202,656 号明細書、及び欧州
特許第0,109,300 号明細書に記載されており、これら特
許に記載の方法により調製可能である。好適なオレンジ
ピールエステラーゼの工業原料には、シグマ社（ミズー
リ州セントルイス）から入手可能なアセチルエステラー
ゼ（Cat.番号A 4530）が含まれる。本発明に有用で好適
なアスペルギルス・ナイジェールから得られるリパーゼ
は、当業界で周知である。そのようなリパーゼは、マル
カタ(Malcata) 、ヒル及びアムンドソン(Amundson)のBi
otechnol. Bioeng. 、38, 853-868 (1991)に記載されて
いる。そのようなリパーゼは、当業界で周知の培地及び
成長条件を用いて、アスペルギルス・ナイジェールのリ
パーゼ産生性菌株の発酵により調製しうる。アスペルギ
ルス・ナイジェールから得られるリパーゼの工業原料
は、バイオキャタリスト社（英国CS37 5UTミッドグラモ
ーガン、ポンティプリッド、トレフォレスト・インダス
トリアル・エステート、メイン・アベニュー）から入手
可能である。

【００７６】本発明に有用で好適なバシルス・ズブチリ
スから得られるエステラーゼは、当業界で周知である。
そのようなエステラーゼは、例えば米国特許第3,304,31
0 号明細書及び欧州特許第0,173,206 号明細書に記載さ
れている。そのようなエステラーゼは、当業界で周知の
培地及び成長条件を用いて、バシルス・ズブチリスのエ
ステラーゼ産生性菌株の発酵により調製しうる。好まし
いバシルス・ズブチリスの菌株にはATCC6633及びATCC94
66が含まれる。本発明に有用で好適なロドスポリジウム
・トルロイデスから得られるエステラーゼは、当業界で
周知である。そのようなエステラーゼは、例えば英国特
許第2,060,610 号明細書に記載されている。そのような
エステラーゼは、当業界で周知の培地及び成長条件を用
いて、ロドスポリジウム・トルロイデスのエステラーゼ
産生性菌株の発酵により調製しうる。好ましいロドスポ
リジウム・トルロイデスの菌株にはATCC10657 が含まれ
る。

【００７７】工程において必要な酵素の量は、原料、純
度、反応条件等に依存して変化し得るものであり、日常
実験により決定する。本発明の方法は水性媒体中で行
う。例えば、該方法は水中、又はリパーゼ又はエステラ
ーゼ産生性微生物を培養するのに好適な発酵ブロス中で
行い得る。本発明の方法を水中で行い得ることから、ブ
ロスからの精製の初期段階においてアシル化を完了する
ことが可能となる。更に、該方法を水性媒体中で行うこ
とにより、ブロス混合物を溶媒に移してアシル化を完了
させる必要がない。通常の当業者であれば、適切な媒体
（培地）を用いて微生物を成長させることができる。振
盪又は攪拌等による有気性条件を使用するのが好まし
い。微生物の成長に適切な培地には、微生物細胞の成長
に必要な栄養素を供給するものが含まれる。一般的な成
長用培地は必須炭素源、窒素源及び微量元素を含む。炭
素源は、マルトース、ラクトース、グルコース、フルク
トース、グリセロール、ソルビトール、スクロース、ス
ターチ、マンニトール、プロピレングリコール等の糖；
酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸；グル
タミン酸ナトリウム等のアミノ酸；及びエタノール、プ
ロパノール等のアルコールを含んでよい。窒素源は、Ｎ
−ＺアミンＡ、コーン・スティープ・リカー(corn stee
p liquor) 、ダイズ粉、牛肉抽出物、イースト抽出物、
糖蜜、イースト、トリプトン、ニュートリソイ（nutris
oi) 、ペプトン、イーストアミン、硝酸ナトリウム、硫
酸アンモニウム等を含んでよい。微量元素はホスフェー
ト及びマグネシウム、マンガン、カルシウム、コバル
ト、ニッケル、鉄、ナトリウム及びカリウム塩を含んで
よい。使用する培地は１種以上の炭素又は窒素源あるい
は他の栄養素を含んでいてよい。

【００７８】アスペルギルス・ナイジェールの培養に関
する好適な手法は、線状菌のATCCカタログ（アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション、メリーランド州
ロックビル）に記載され；バシルス・ズブチリスの培養
に関する好適な手法は、米国特許第3,304,310 号明細書
に記載され；ロドスポリジウム・トルロイデスの培養に
関する好適な手法は、英国特許第2,060,610 号明細書に
記載されている。本発明の方法において、条件は著しく
変わり得る。例えば、当該方法は、約−２０℃〜約３０
℃の温度で、約５〜約９のｐＨにおいて、反応が完了す
るのに十分な時間（一般には約５分〜１００時間）行う
ことが可能である。好ましくは、該方法を約０℃〜約２
５℃の温度で、約７〜約８のｐＨにおいて、約１０分〜
約４８時間（更に好ましくは約３０分〜４時間）行う。
本発明の方法により結果として得られる一般式IIの化合
物の一般式Ｉの化合物への転化率は４％以上であり、好
ましくは１０％以上の転化率、更に好ましくは５０％以
上の転化率、最も好ましくは８０％以上の転化率であ
る。本発明の方法は、好ましくは更に反応培地から所望
の生成物を分離する工程を含む。そのような分離又は単
離手法は当業界で周知である。そのような分離手法には
クロマトグラフィー、有機溶媒への抽出、不溶物質とし
ての沈殿、及び再結晶化が含まれる。例えば、反応培地
を真空処理して未反応アシル供与体及び不純物の残骸を
除去し得る。次に粗混合物を分取クロマトグラフィー
（HP20SS等）にかけてよい。水洗後、メタノール等の適
切な溶媒を用いて所望の生成物を溶出し得る。次に標準
的な結晶化手法により所望の生成物を得ることができ
る。以下の実施例は本発明を説明するためのものであっ
て、本発明を制限するものと考えてはならない。

【００７９】

【実施例】

実施例１酵素源としてロドスポリジウム・トルロイデス全細胞
を、アシル供与体としてイソプロペニルアセテートを使
用した、デス−７−ＡＣＡからの７−ＡＣＡの合成 エステラーゼ生成用のロドスポリジウム・トルロイデス
（ATCC10657 ）の振盪フラスコ発酵を、次の手順に従っ
て準備した：以下の培地を100 ミリリットル含む500 ミ
リリットルのフラスコに、２％の凍結保存カルチャーを
接種して、種培養を開始した：グルコース２％、イース
ト抽出物１％、バクトペプトン１％、KH ₂PO₄0.5 ％、ｐ
Ｈ6.0 。培地を３０分間高圧蒸気滅菌した。種フラスコ
を２８℃において250rpmで２４時間培養し、２体積％の
接種原を生産段階発酵の開始に使用した。生産段階培地
は、コーン・スティープ・リカー１％、K₂HPO₄１％、グ
ルコース３％からなり、ｐＨ6.2 である。培地を１リッ
トルの発酵槽中で２時間高圧蒸気滅菌した。発酵槽ブロ
スを高曝気下で１６〜２１℃において３又は４日間培養
した。エステラーゼの活性を、以下のように監視した：
200 マイクロリットルの全細胞（蒸留水で希釈して１０
〜２０％の基質転化率を得た）に、２０ミリグラム／ミ
リリットルのカリウムセファロスポリンＣのリン酸カリ
ウム緩衝液（0.2 Ｍ、ｐＨ6.5 ）溶液を、200 マイクロ
リットル添加した。混合物を３７℃で２０分間温置し、
3.0 ミリリットルのアセトニトリル／水（１／１）を添
加して停止した。１０ｍＭのオクタンスルホン酸、H₃PO
₄ 0.1 ％、メタノール１０％からなる移動相（ｐＨ2.5
）を有するＣ₁₈逆相カラムでＨＰＬＣにより、アセト
ニトリル／水混合物の上澄みを検定した。

【００８０】全ブロスの比活性は一般に２０〜３７国際
単位／ミリリットル（国際単位（ＩＵ）は、１分当たり
に形成される生成物１マイクロモルと定義される）の範
囲であった。全細胞ブロスを遠心分離し、水１ミリリッ
トル当たり８０活性単位に細胞を再懸濁して、ロドスポ
リジウム・トルロイデス洗浄細胞濃厚物を調製した。分
別遠心により、コーン・スティープ固体を除去した。２
ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ6.5 〜8.1 ）に333 ミリグ
ラム／ミリリットルで固体を添加し、濃縮アンモニアを
溶解してｐＨを7.8 〜8.0 に調節して、デスアセチル−
７−ＡＣＡ保存溶液を調製した。最終基質濃度が0.75Ｍ
のＨＥＰＥＳ緩衝液中250 ミリグラム／ミリリットルの
デス−７−ＡＣＡとなるように、溶液の体積を調節し
た。基質保存溶液（12.5ミリリットル）と酵素（12.5ミ
リリットル）（８０ＩＵ／ミリリットルのロドスポリジ
ウム・トルロイデス細胞濃度）を混合し、イソプロペニ
ルアセテート（１０ミリリットル）を添加して、反応を
開始させた。温度を２０〜２４℃に維持し、濃縮アンモ
ニアを用いた滴定によりｐＨを6.5 に維持した。定常的
に攪拌して２時間、又は生成物の形成が変動しなくなる
まで反応を進行させた。前記のようにＨＰＬＣにより反
応を監視した。図１に典型的な反応曲線を示す。

【００８１】実施例２酵素源としてロドスポリジウム・トルロイデス全細胞
を、アシル供与体としてトリアセチンを使用した、デス
−７−ＡＣＡからの７−ＡＣＡの合成 実施例１に記載のようにロドスポリジウム・トルロイデ
ス及び７−ＡＣＡを調製した。アシル供与体としてトリ
アセチン（１０ミリリットル）を添加したことを除き、
実施例１に記載のように２４℃での温置を開始した。ア
シル供与体としてトリアセチンを用いた場合の典型的な
反応曲線を図２に示す。 実施例３酵素源としてロドスポリジウム・トルロイデス全細胞
を、アシル供与体としてビニルアセテートを使用した、
デス−７−ＡＣＡからの７−ＡＣＡの合成 500 マイクロリットルの７−ＡＣＡ保存溶液（ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ7.8 ）750 ｍＭ中250 ミリグラム／ミリ
リットル）を、500 マイクロリットルの細胞保存液に添
加した。亜硫酸水素ナトリウム（100 ミリグラム）をア
セトアルデヒド掃去剤として混合物に添加した。260 マ
イクロリットルのビニルアセテートを添加し、混合物を
振盪して−２０℃で反応させた。濃縮アンモニアを添加
して、ｐＨを7.0 に維持した。試料を継代サンプリング
のために−２０℃環境から除去し、その間に温度は０〜
−１０℃の間まで上昇した。混合物の分析から、デス−
７−ＡＣＡから７−ＡＣＡへの転化率が約７３％である
ことが示された。 実施例４酵素源としてロドスポリジウム・トルロイデス全細胞を
使用し、かつ様々なアシル供与体を使用した、デス−７
−ＡＣＡからの７−ＡＣＡの合成 実施例１に記載のようにロドスポリジウム・トルロイデ
ス及び７−ＡＣＡを調製した。実施例１に記載のように
２４℃での温置を開始するか、あるいは比率を変えずに
反応を1.0 ミリリットルスケールまでスケールダウンし
た。様々なアシル供与体を使用した場合の生成物形成の
結果を、次の表にまとめた。

【００８２】

【表１】 表 １ 供与体 転化率（％） 反応時間（分） イソプロペニルアセテート ８２ １５０ トリアセチン ６４ １２０ ビニルアセテート ２３ １２０ エチルアセテート １４ ２０ ジアセチン ２２ １２０ エチレングリコールジアセテート ４９ １２０ シス−１，４−ジアセトキシブタン ２９ ６０ １，４−ジアセトキシブタン ２３ ３５ フェニルアセテート ４９ ３５ １，２，４−トリアセトキシベンゼン １３ ６０ １，３−ブタンジオールジアセテート ２４ ３０ １，２−プロパンジオールジアセテート ４０ ９０ ｎ−ブチルアセテート ４ ３０ トリエチレングリコールジアセテート ３２ １５０ イソプロピルアセテート １０ １５ イソブチルアセテート ９ ３０ オキシムエステル（比較） 1.３ ３０

【００８３】実施例５ｐＨ4.0 においてＥＤＴＡで処理することによりロドス
ポリジウム・トルロイデス全細胞から放出されたエステ
ラーゼを用いた、デス−７−ＡＣＡ及びイソプロペニル
アセテートからの７−ＡＣＡの合成 実施例１に記載のように、ロドスポリジウム・トルロイ
デスを培養した。ｐＨ4.0 においてカルチャーをＥＤＴ
Ａ（0.1 Ｍ）で処理し、全細胞からエステラーゼ酵素を
放出させた。溶解性酵素を分子量30,000のカットオフ膜
上で濃縮し、８０ＩＵ／ミリリットルの比活性を得た。
反応を６℃で行ったことを除き、実施例１に記載のよう
に７−ＡＣＡの合成を行った。200 分後に７−ＡＣＡに
転化した収率は７９％であった。 実施例６ロドスポリジウム・トルロイデス由来の固定化エステラ
ーゼを用いた、デス−７−ＡＣＡ及びイソプロペニルア
セテートからの７−ＡＣＡの合成 実施例１に記載のように、ロドスポリジウム・トルロイ
デスを培養した。溶解性エステラーゼを実施例５に記載
のように得た。溶解性酵素をＰＥＩ（0.1 ％）及びグル
タルアルデヒド（0.5 ％）で処理した。混合物を１時間
攪拌した後に、濾過により固定化酵素を回収した。酵素
を水洗し、再度濾過して、350 ＩＵ／グラムの活性の固
定化エステラーゼ酵素を得た。反応を５℃で行ったこ
と、及び反応混合物中で60ＩＵ／ミリリットルの固定化
酵素を使用したことを除き、実施例１に記載のように７
−ＡＣＡの合成を行った。180 分後に７−ＡＣＡに転化
した収率は７６％であった。

【００８４】実施例７酵素源としてバシルス・ズブチリス（ATCC6633) 無細胞
抽出物を使用し、かつ様々なアシル供与体を使用した、
デス−７−ＡＣＡからの７−ＡＣＡの合成 振盪フラスコ発酵を、次の手順に従って準備した。２５
ミリリットルのトリプチカーゼダイズ培地入りの125 ミ
リリットルのフラスコに、トリプチカーゼダイズ寒天斜
面からのカルチャーを接種して、種培養を開始し、２８
℃において250rpmで２４時間振盪した。500 ミリリット
ルのフラスコ毎に100 ミリリットルのトリプチカーゼダ
イズ培地を含む２０個の生成保存フラスコに、２％で種
培養を接種した。カルチャーを２８℃において250rpmで
４８時間振盪した。1800ミリリットルの生産段階全ブロ
スを遠心分離し、細胞をホスフェート緩衝液（ｐＨ6.5
）で洗浄し、合計９０ミリリットルとして再懸濁した
後凍結した。溶解した細胞を遠心分離により更に１５ミ
リリットルまで濃縮し、再懸濁して、0.63ＩＵ／ミリリ
ットルの最終エステラーゼ活性を得た。最終細胞濃縮物
（0.63ＩＵ／ミリリットル）500 マイクロリットルを、
500 マイクロリットルのデス−７−ＡＣＡ保存溶液（実
施例１）に添加した。400 マイクロリットルのアセチル
供与体を添加して、反応を開始した。ｐＨを最初は6.5
〜7.0 に維持したが、後に8.0 まで増加して反応速度を
上昇させた。ｐＨを合計４８時間8.0 に維持した。様々
なアセチル供与体について７−ＡＣＡに転化した収率
を、次の表中に比較した。

【００８５】

【表２】 表 ２ 供与体 転化率（％） イソプロペニルアセテート １６ トリアセチン １６ トリエチルグリコールジアセテート ２７ エチレングリコールジアセテート ２６

【００８６】実施例８酵素源として濃縮バシルス・ズブチリス（ATCC9466）無
細胞抽出物を、アシル供与体としてエチレングリコール
ジアセテートを使用した、デス−７−ＡＣＡからの７−
ＡＣＡの合成 セファロスポリンＣエステラーゼ活性の生成用のバシル
ス・ズブチリスの振盪フラスコ発酵を、実施例７と同様
に行った。1500ミリリットルの無細胞抽出物由来の細胞
外酵素を、分子量30,000のカットオフ膜上の限外濾過に
より濃縮し、体積２０ミリリットル、比活性４０ＩＵ／
ミリリットルとした。４０単位の酵素を1.0 ミリリット
ルの保存デス−７−ＡＣＡ溶液に添加し、400 マイクロ
リットルのエチレングリコールジアセテートを添加して
反応を開始した。２ＭのNH₃ を添加して、反応のｐＨを
7.5 に維持した。更に400 マイクロリットルのエチレン
グリコールジアセテートアリコートを６０分に添加し
た。ｔ＝６０、120 、及び180 分において試料を採取
し、実施例１と同様に７−ＡＣＡ生成について検定し
た。120 分後には５４％の基質が生成物に転化してい
た。このレベルを続く６０分間一定に維持した。 実施例９様々な市販のエステラーゼ及びリパーゼを使用し、かつ
アシル供与体としてイソプロペニルアセテートを使用し
た、デス−７−ＡＣＡからの７−ＡＣＡの合成 アシル供与体としてのイソプロペニルアセテートの存在
下において、デス−７−ＡＣＡから７−ＡＣＡを生成し
得る能力について、様々な市販のエステラーゼ及びリパ
ーゼをスクリーニングした。125 ミリグラム／ミリリッ
トルのデス−７−ＡＣＡ（実施例１と同様に調製）500
マイクロリットルを、500 マイクロリットルの２０ｍＭ
ホスフェート緩衝液（ｐＨ6.5 ）中に懸濁した様々な酵
素とともに温置した。500 マイクロリットルのイソプロ
ペニルアセテートを添加して反応を開始し、濃縮アンモ
ニアでｐＨを7.0 として２０〜２４℃に３時間維持し
た。次の酵素はデス−７−ＡＣＡから７−ＡＣＡを合成
し得た。

【００８７】

【表３】 表 ３ 酵 素 量 転化率（％） 小麦麦芽由来リパーゼＩ型 ５０ｍｇ ２４ （シグマ化学） アスペルギルス・ナイジェール由来 １００ｍｇ １３ リパーゼ（バイオキャタリスト） オレンジピール由来アセチル ２５０μＬ １４ エステラーゼ（シグマ化学）

【００８８】実施例１０アシル供与体として７−ＡＣＡを、酵素源として小麦麦
芽由来リパーゼＩ型を使用した、デスアセチルセファロ
スポリンＣからのセファロスポリンＣの合成 小麦麦芽由来リパーゼＩ型をデスアセチルセファロスポ
リンＣ（300 ｍＭ／150 ｍＭのビス−トリス／ＭＥＳ緩
衝液中、200 ミリグラム／ミリリットル）とともに温置
し、５０ミリグラムの７−ＡＣＡを添加して反応を開始
し、２０〜２４℃、ｐＨ7.0 において反応を進めた。セ
ファロスポリンＣに転化した収率は１９％であった。 実施例１１アシル供与体としてイソプロペニルアセテート又はビニ
ルアセテートを、酵素源として小麦麦芽由来固定化リパ
ーゼＩ型を使用した、デス−７−ＡＣＡからの７−ＡＣ
Ａの合成 小麦麦芽（200 グラム）を、水（800 ミリリットル）及
び氷（400 グラム）と混合し、ブレンダー中で１分間均
質化し、更に１分間均質化した。得られた混合物を0.1
％のＰＥＩで処理し、室温で１０分間攪拌した。溶液を
8000rpm で１０分間遠心分離して、透明なリパーゼ抽出
物を得た。抽出物を30,000MWCOの膜を通して限外濾過
し、100 ミリリットルに濃縮した。残留物を４℃に冷却
し、固体硫酸アンモニウム（４０グラム）を１０分間添
加した。得られた混合物を8000rpmで１０分間遠心分離
した。タンパク質ペレットを３０ミリリットルの水中で
４℃において１０分間攪拌して溶解した。懸濁物を8000
rpm で１０分間遠心分離して、５０ミリリットルのリパ
ーゼ濃縮物を得た。濃縮物を４℃で攪拌し、セライト
（0.5 グラム）を添加し、次に５０％のグルタルアルデ
ヒドを１分間に渡り0.5ミリリットル添加する。混合物
をさらに４分間攪拌し、１体積の冷アセトンを２分間に
渡り添加した。混合物を４℃に１０分間保存した。濾過
により固定化酵素を除去し、水中で再懸濁した。ｐＨを
7.0 に調節し、次に酵素を再濾過して13.5グラムの固定
化酵素を得た。

【００８９】150 ミリグラム／ミリリットルの固定化小
麦麦芽リパーゼを、150 ミリグラム／ミリリットルのデ
ス−７−ＡＣＡと混合し、１ミリリットルの１ＭのＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ7.8 ）中、２５℃において、250rpm
で４時間温置した。ビニルアセテート（0.1 ミリリット
ル）又はイソプロペニルアセテート（0.10ミリリット
ル）を、ｔ＝０及び150 分に添加した。４時間後に７−
ＡＣＡに転化した収率は、ビニルアセテート及びイソプ
ロペニルアセテートにつき、各々１８％及び７％であっ
た。 実施例１２フェニルアセチル−デスアセチル−７−ＡＣＡのアセチ
ル化 以下の成分からなる混合物を作製した：フェニルアセチ
ル−デスアセチル−７−ＡＣＡ（５０ミリグラム）、Ｍ
ＥＳ／NH₄ ⁺ 緩衝液（２Ｍ、0.5 ミリリットル）、メチ
ルアセテート（4.5 ミリリットル）、イソプロペニルア
セテート（0.5ミリリットル）及びロドスポリジウム・
トルロイデス細胞の懸濁物（150 ＩＵ／ミリリットル、
0.5 ミリリットル）。混合物を２５℃で２時間攪拌した
（ｐＨは〜6.0 まで低下させた）。この時、ＴＬＣによ
り反応混合物が未反応フェニルアセチル−デスアセチル
−７−ＡＣＡとフェニルアセチル−７−ＡＣＡとの５
０：５０の混合であることが示された（規格化合物との
比較）。

【００９０】実施例１３７−ＡＤＣＡ及び未反応デスアセチル−７−ＡＣＡから
の合成７−ＡＣＡの分離 実施例１に記載の反応混合物５０ミリリットルを真空処
理し、アセトン及び未反応イソプロペニルアセテートの
残骸を除去した。最終濃度は７−ＡＣＡについて2.45
％、デスアセチル−７−ＡＣＡについて1.25％であっ
た。試料を分取HP20SSカラム（４cm×３０cm）にかけ
た。カラムを150 ミリリットルの蒸留水で洗浄し、生成
物を１０％のメタノールで希釈して、１０ミリリットル
の分画を分取した。典型的なカラム曲線を図３に示し
た。７−ＡＣＡのピーク分画を収集し（100 ミリリット
ル）、ロータリーエバポレーターで最終体積２０ミリリ
ットルまで濃縮した。HCl （６Ｎ）でｐＨを4.2 まで低
下させ、１０ミリリットルのメタノールを添加して、試
料を冷却した。得られた固体を濾過により収集した。７
−ＡＣＡの回収は６５％であり、５％のデスアセチル−
７−ＡＣＡが残存しており、0.1 ％未満の７−ＡＤＣＡ
が存在した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１についての時間に対するデス
−７−ＡＣＡから７−ＡＣＡへの転化率（％）を示す。

【図２】図２は、実施例２についての時間に対するデス
−７−ＡＣＡから７−ＡＣＡへの転化率（％）を示す。

【図３】図３は、実施例３記載の分離についての分画番
号に対する254 ナノメーター(nm)での吸収を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 35/04 Ｃ１２Ｒ 1:66） (72)発明者 グーナ ロマンシク アメリカ合衆国 ニューヨーク州 イース ト シラキュース サマーヘヴン ドライ ヴ 464 (72)発明者 マイケル ポリティーノ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 フェイ エットヴィル ハイブリッジ ストリート 5100 アパートメント ５エイ (72)発明者 ディヴィッド エイ ロウ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 フェイ エットヴィル フェイエットヴィル マン リアス 816

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の一般式で表されるセファロスポリン
   化合物 【化１】 （式中、Ｒ’は水素又は次の一般式で表されるアシル基 Ｒ−ＣＯ− （式中、Ｒはカルボン酸残基である）であり、 Ｘは水素又はハロであり、 Ｇは硫黄、酸素、スルホキシド、スルホン又はメチレン
   である）の製造のためのアシル化方法であって、次の一
   般式で表される化合物 【化２】 とアシル供与体とを、ロドスポリジウム・トルロイデ
   ス、小麦麦芽、オレンジピール、バシルス・ズブチリス
   又はアスペルギルス・ナイジェールから得られるリパー
   ゼ又はエステラーゼ酵素の存在下で、水性媒体中で反応
   させることを含む、前記方法。
2. 【請求項２】 前記リパーゼ又はエステラーゼ酵素がロ
   ドスポリジウム・トルロイデスから得られる、請求項１
   記載の方法。
3. 【請求項３】 前記リパーゼ又はエステラーゼ酵素がロ
   ドスポリジウム・トルロイデスATCC10657 から得られ
   る、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 Ｒ’が水素、アセチル、グルタリル、α
   −アミノアジピル又はフェニルアセチルであり、Ｇが硫
   黄であり、Ｘが水素である、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 Ｇが硫黄である請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 Ｒ’が水素である請求項４記載の方法。
7. 【請求項７】 Ｒ’が水素である請求項５記載の方法。
8. 【請求項８】 前記アシル供与体が次の一般式で表され
   る、請求項１記載の方法。 Ｒ”−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ₂ Ｘ （式中、Ｒ”はＣ₁ −Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₂ −Ｃ₁₀アルケ
   ニル、Ｃ₃ −Ｃ₁₀シクロアルキル、Ｃ₃ −Ｃ₁₀シクロア
   ルケニル、Ｃ₂ −Ｃ₁₀アルキニル、Ｃ₆ −Ｃ₃₀アリー
   ル、Ｃ₁ −Ｃ₁₀置換アルキル、Ｃ₂ −Ｃ₁₀置換アルケニ
   ル、Ｃ₃ −Ｃ₁₀置換シクロアルキル、Ｃ₃ −Ｃ₁₀置換シ
   クロアルケニル、Ｃ₆ −Ｃ₃₀置換アリール、又は次の一
   般式で表される基 Ｒ"'−（ＯＣＨ₂ −ＣＨ₂ ）_n − （式中、ｎは２以上の整数であり、Ｒ"'は水素又はアセ
   チルである） 又は次の一般式で表される基 Ｒ"'−（ＯＣＨ₂ −ＣＨ₂ −ＣＨ₂ ）_n − （式中、ｎ及びＲ"'は上記定義の通りである）であり、 Ｘは水素又はハロである）
9. 【請求項９】 Ｒ”がＣ₂ −Ｃ₆ アルケニル、１〜３個
   のアセトキシ基で置換されたＣ₁ −Ｃ₆ アルキル、Ｃ₆
   −Ｃ₁₀アリール又は次の一般式で表される基である、請
   求項８記載の方法。 ＣＨ₃ −ＣＯ（ＯＣＨ₂ −ＣＨ₂ ）_n − （式中、ｎは２〜１００の整数である）
10. 【請求項１０】 アシル供与体がイソプロペニルアセテ
    ート、トリアセチン、ビニルアセテート、エチルアセテ
    ート、ジアセチン、エチレングリコールジアセテート、
    シス−１，４−ジアセトキシブタン、１，４−ジアセト
    キシブタン、フェニルアセテート、１，２，４−トリア
    セトキシベンゼン、１，３−ブタンジオールジアセテー
    ト、１，２−プロパンジオールジアセテート、ｎ−ブチ
    ルアセテート、トリエチレングリコールジアセテート、
    イソプロピルアセテート又はイソブチルアセテートであ
    る、請求項１記載の方法。
11. 【請求項１１】 アシル供与体がイソプロペニルアセテ
    ート、トリアセチン、ビニルアセテート、エチルアセテ
    ート、ジアセチン、エチレングリコールジアセテート、
    シス−１，４−ジアセトキシブタン、１，４−ジアセト
    キシブタン、フェニルアセテート、１，２，４−トリア
    セトキシベンゼン、１，３−ブタンジオールジアセテー
    ト、１，２−プロパンジオールジアセテート、ｎ−ブチ
    ルアセテート、トリエチレングリコールジアセテート、
    イソプロピルアセテート又はイソブチルアセテートであ
    る、請求項４記載の方法。
12. 【請求項１２】 アシル供与体がイソプロペニルアセテ
    ート、トリアセチン、ビニルアセテート、エチルアセテ
    ート、ジアセチン、エチレングリコールジアセテート、
    シス−１，４−ジアセトキシブタン、１，４−ジアセト
    キシブタン、フェニルアセテート、１，２，４−トリア
    セトキシベンゼン、１，３−ブタンジオールジアセテー
    ト、１，２−プロパンジオールジアセテート、ｎ−ブチ
    ルアセテート、トリエチレングリコールジアセテート、
    イソプロピルアセテート又はイソブチルアセテートであ
    る、請求項７記載の方法。
13. 【請求項１３】 アシル供与体がイソプロペニルアセテ
    ート、トリアセチン、ビニルアセテート、ジアセチン、
    エチレングリコールジアセテート、シス−１，４−ジア
    セトキシブタン、１，４−ジアセトキシブタン、フェニ
    ルアセテート、１，３−ブタンジオールジアセテート、
    １，２−プロパンジオールジアセテート又はトリエチレ
    ングリコールジアセテートである、請求項１記載の方
    法。
14. 【請求項１４】 アシル供与体がイソプロペニルアセテ
    ート、トリアセチン、ビニルアセテート、ジアセチン、
    エチレングリコールジアセテート、シス−１，４−ジア
    セトキシブタン、１，４−ジアセトキシブタン、フェニ
    ルアセテート、１，３−ブタンジオールジアセテート、
    １，２−プロパンジオールジアセテート又はトリエチレ
    ングリコールジアセテートである、請求項４記載の方
    法。
15. 【請求項１５】 アシル供与体がイソプロペニルアセテ
    ート、トリアセチン、ビニルアセテート、ジアセチン、
    エチレングリコールジアセテート、シス−１，４−ジア
    セトキシブタン、１，４−ジアセトキシブタン、フェニ
    ルアセテート、１，３−ブタンジオールジアセテート、
    １，２−プロパンジオールジアセテート又はトリエチレ
    ングリコールジアセテートである、請求項７記載の方
    法。
16. 【請求項１６】 温度約−２０℃〜約３０℃、ｐＨ約５
    〜約９において、約５分〜１００時間行う、請求項１記
    載の方法。
17. 【請求項１７】 温度約０℃〜約２５℃、ｐＨ約７〜約
    ８において、約３０分〜４時間行う、請求項１記載の方
    法。
18. 【請求項１８】 更に所望の生成物を分離する工程を含
    む、請求項１記載の方法。
19. 【請求項１９】 クロマトグラフィーにより分離を行
    う、請求項１６記載の方法。
20. 【請求項２０】 全細胞、細胞のＥＤＴＡ処理後に得ら
    れる可溶性酵素、又は可溶性酵素のグルタルアルデヒド
    ／ＰＥＩ処理後に得られる固定化酵素を用いて行う、請
    求項３記載の方法。