CN1112927A - 3-羟甲基头孢菌素的酶促酰化 - Google Patents

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Abstract

使用脂肪酶或酯酶完成3-羟甲基头孢菌素的3′ 酰化的方法。优选的酶是从红冬孢酵母 (Rhodosporidium toruloides)得到的。

Description

本发明涉及包括酶促酰化3-羟甲基头孢菌素在内的制备β-内酰胺抗生素中间体的方法。
3-乙酸基甲基-7β-氨基头孢-3-em-4-羧酸（7-ACA）是制备半合成商品头孢菌素抗生素的重要起始材料。商业上，该中间体是通过化学或酶促水解头孢菌素C〔一种顶头孢霉（Cephalosporium  acremonium）的发酵产品〕的D-2-氨基己二酰侧链而产生的（参见Newton  and  Abraham，Nature  175，548，1955）。3-羟甲基-7β-氨基头孢-3-em-4-羧酸（des-7-ACA）通常是作为在通过化学或酶促（酯酶）水解3-乙酰基团以制备7-ACA中形成的付产物而产生的。可通过用各种酯酶作用于7-ACA而产生des-7-ACA。另外，可以按照将头孢菌素转化成7-ACA的同样方法，经酶水解从脱乙酰头孢菌素C生产之（世界专利No.WO90/12110）。由于C-7氨基基团的高反应性性质，可在从脱乙酰化前体化学合成7-ACA时产生产物的混合物。使用典型化学酰化剂如乙酰氯或乙酸酐而产生7-ACA、N-乙酰7-ACA和N-乙酰脱乙酰7-ACA。此外，在这些条件下3-羟甲基-7β-氨基头孢-3-em-4-羧酸是对内酯化敏感的。现有技术中，邻位乙酰化的方法包括封闭反应性C-7氨基基团，然后在具有酸受体碱的4-（叔氨基）吡啶催化剂存在下，在非极性有机溶剂中进行邻位乙酰化并使C-7氨基基团去封闭（欧洲专利NO.153，874A）。其他方法包括使C-7酰化合物的4-位羧基酯化，以防止反应期间发生内酯化作用，然后使此羧基去酯化并除去对C-7氨基的保护，以产生3-烷酰氧基甲基-3β-氨基头孢-3-em-4-羧酸（美国专利3，432，694）;或者在具有酸受体碱的4-（叔氨基）吡啶催化剂存在下，在含水介质中进行邻位乙酰化，然后再使C-7氨基基团去封闭（欧洲专利No.0230972）。另外，还已描述了在含水溶剂中酰化3-羟甲基头孢菌素的化学方法（美国专利5，221，739）。
已知某些酯酶和脂肪酶不仅可催化水解反应，而且对某些底物来说，还可用于合成中的定向酯化和酯基转移。Jeffrey等人（Biochem.J.81，591-596，1961）首先使用柑桔乙酰酯酶证明可使用酯酶产生脱乙酰头孢菌素衍生物（美国专利3，202，656;欧洲专利No.0109300）。继后，又从芽霉菌（欧洲专利0  044  736）、裂殖菌（美国专利3，239，394）、根瘤菌（美国专利3，436，310）、枯草芽孢杆菌（美国专利3，304，310，欧洲专利0  173  206）、红冬孢酵母（Rhodosporidium  toruloides）（英国专利No.2，060，610）、深红酵母菌（英国专利No.1，474，519）和麦胚中发现了许多其他具有使头孢菌素化合物脱乙酰化能力的酯酶和脂肪酶。最后，Wang，Y-F等人报导（J.Org.Chem.53，3128-3129，1988）了使用乙酸异丙烯酯作为不可逆酰基转移剂，用于糖的脂肪酶催化的乙酰化反应。
我们已不可预见地发现，可使用下文所述的某些酶，连同下文所述的在定向合成中发挥功能的某些酰基供体，以生产C-3′位酰化的头孢菌素。
本发明的方法用于生产邻位酰化的头孢菌素具有不需要封闭7位氨基基团和排除内酯化的优点。酶促反应所固有的特异性得以在C-3′位进引选择性酰化，而没有产生化学反应所特有的付产物。具体地说，本发明是涉及制备有下列结构式的头孢菌素化合物的酰化方法：
Figure 951019058_IMG7
其中R1是氢或式
Figure 951019058_IMG8
的酰基基团
其中R是羧酸的残基，X是氢或卤素，且G是氧、硫、亚砜或亚甲基;其包括在得自红冬孢酵母、麦胚、柑桔皮、枯草芽胞杆菌或黑曲霉的脂肪酶或酯酶存在下，在含水介质中使式
Figure 951019058_IMG9
的化合物与酰基供体反应。
图1：des-7-ACA至7-ACA的百分转化率对时间作图（实施例1）。
图2：des-7-ACA至7-ACA的百分转化率对时间作图（实施例2）。
图3说明实施例13中所述分离结果的254nm吸光率对管号作图。
本发明中所用酰基供体至少包含三个碳原子并且是在合成路线中驱动C-3′位上反应的供体。这些酰基供体是乙酰供体或一卤代乙酰供体。酰基供体可以是“可逆的”或“不可逆的”供体。可逆供体包括乙酸乙酯和三醋精。这些酯和醇（式Ⅱ的化合物）与产物（式Ⅰ的化合物）和衍生于酯的醇达到平衡。例如，使用乙酸乙酯完成下列反应：
该反应按可逆方向进行，以从酯Ⅰ和醇生成乙酸乙酯和醇Ⅱ的混合物。用不可逆供体如乙酸异丙烯酯
Figure 951019058_IMG11
产生的醇不稳定，并互变异构成为丙酮。该丙酮不能象“可逆”型供体一样参于逆反应。因此，在生成乙酰化产物（1）
Figure 951019058_IMG12
的方向中有一种驱动力，并使产率达到相应更好的水平。
用于本发明的酰基供体的例子有下式化合物：
其中R″是C1-C10烷基、C2-C10烯基、C3-C10环烷基、C3-C10环烯基、C2-C10炔基、C6-C30芳基、C1-C10取代的烷基、C2-C10取代的烯基、C3-C10取代的环烷基、C3-C10取代的环烯基、C6-C30取代的芳基、式
Figure 951019058_IMG14
的基团，其中n是2或更大的正整数，（较好是2至3，000，更好是2至100），且R'''是H或乙酰基，或式
Figure 951019058_IMG15
的基团，其中n和R'''定义同上;X是氢或卤素。
优选的芳基供体是其中R'''是C2-C6烯基、被1-3个乙酸基基团取代的C1-C6芳基、C6-C10芳基或式
Figure 951019058_IMG16
的基团，其中n是2至100的整数。
芳基供体的特定实例包括乙酸异丙烯酯、三醋精、乙酸乙烯酯、乙酸乙酯、二醋精、乙二醇二乙酸酯、顺-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯酯、1，2，4-三乙酸苯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯、乙酸正丁酯、三甘醇二乙酸酯、乙酸异丙酯和乙酸异丁酯等。
更优选的酰基供体是乙酸异丙烯酯、三醋精、乙酸乙烯酯、二醋精、乙二醇二乙酸酯、顺-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯酯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯或三甘醇二乙酸酯。
R1是“羧酸的残基”，其包括头孢菌素工艺中已知的那些C7位侧链和青霉素工艺中已知那些C6位侧链。即，这些侧链是其中R为C1-C20羧酸的残基的侧链，且具体例子是此时R是氢、C1-C6烷基、被氰基、羧基、卤素、氨基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基、三氟甲基或三氟甲硫基取代的C1-C6烷基;萘基、苯基、被取代的式
Figure 951019058_IMG17
的苯基基团-其中α和α′各自为氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷酰氧基、C1-C4烷基、C1-C4烷硫基、氨基、C1-C4烷酰氨基、C1-C4烷基磺酰氨基、羧基、氨甲酰基、羟甲基、氨甲基或羧甲基;或
Figure 951019058_IMG18
的基团-其中α和α′具有如上限定的同样意义，Z是O或S，且m是0或1;式
R3-CH2-
的芳基甲基基团-其中R3是萘基、呋喃基、苯并噻吩基、苯并氨基噻唑基、苯并呋喃基、吡啶基、4-吡啶硫基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、吡唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噻二唑基、以及被氨基、羟基、氰基、硝基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、苯基或取代的苯基或C1-C4烷基磺酰氨基取代的所说的芳基甲基基团;被取代的式
Figure 951019058_IMG19
的甲基基团-其中R4是环己-1，4-二烯基、苯基或式
的取代的苯基-其中α和α′定义同上，或R4是如上文限定的R3，且Q是羟基、C1-C4烷酰氧基、羧基、磺基、氨基、磺氨基、或被取代的式
Figure 951019058_IMG21
的氨基基团-其中X是氢或C1-C4烷基，Ry是C1-C4烷基、呋喃基、噻吩基、苯基、卤代苯基、硝基苯基、苯乙烯基、卤代苯乙烯基、硝基苯乙烯基或式
Figure 951019058_IMG22
的基团-其中Rx有如上文限定的同样意义且R2是氢、C1-C4烷基磺酰、C1-C4烷基、或C1-C4烷酰基;或者Q是被取代的式
Figure 951019058_IMG23
的氨基基团-其中R2具有如上文限定的同样含义，且q是2或3;或者Q是被取代的式
的氨基基团;或者Q是式
Figure 951019058_IMG25
的苯甲酰氨基基团-其中X是1至3;或者Q是吡啶酮或结构式
Figure 951019058_IMG26
的吡啶酮基-碳酰氨基基团-其中Rx定义同上;或者Q是有结构式
的碳酰氨基基团，所说的基团可以是被C1-C4烷基、氨基、羧基、羟基或卤素取代的;或者Q是有结构式
Figure 951019058_IMG28
的咪唑基或吡唑基，且所说的咪唑基或吡唑基可以是被C1-C4烷基、羧基、氨基或卤素取代的;或者Q是由结构式
代表的苯并哒嗪酮基团或其互变体-其中Rx定义同上，且t是1至3;或者Q是有结构式
的苯并吡喃酮基团，或R是有结构式
Figure 951019058_IMG31
的基团-其中R5是如上文限定的R3或R4，R9是氢或卤素，且R6是氢、C1-C4烷基、被卤素取代的C1-C4烷基、羧基取代的烷基或由式
代表的环烷基基团-其中b和b′各自是氢或C1-C3烷基;n是0、1、或3;或者b或b′与它们所连接的碳一起形成3至6元碳环;且R7是羟基、C1-C4氨基、C1-C4烷氨基，或二（C1-C4烷基）氨基;或者R6是被苯基取代的C1-C4烷基或被一个或两个选自C1-C4烷基、氢、卤素、羧基或被保护的羧基的相同或不同的基团取代的苯基;或者R6是C1-C4烯基;或者R6是式
的环酰胺基团-其中Ⅴ是2-4;R8是氢或C1-C3烷基;且R6是式
R3-CH2-
的芳基甲基基团-其中R3定义同上文所述;或者R是式
-（CH2）tCOOH
的基团-其中t的定义同前所述;或者R是式
Figure 951019058_IMG34
的基团-其中t定义同上;或者R是式
Figure 951019058_IMG35
的基团-其中t定义同上，R12是氢且R11是苯基，取代的苯基，或式〈
Figure 951019058_IMG36
的基团-其中R13可以是苯基、取代的苯基、C1-C6烷基、C1-C6取代的烷基、氨基苯基、苯基磺酰、（取代的苯基）磺酰、C1-C4烷氧基、或氧代（C1-C6烷基）。
在上述由各结构式（即式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）代表的化合物的定义中，“烷基”是指直链或支链烷基基团，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、3-甲基戊基等烷基基团;“被取代的烷基”包括由氰基、羧基、卤素、氨基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基、三氟甲基及三氟甲硫基取代的烷基;“被氰基取代的烷基”是指氰基甲基、氰基乙基、4-氰基丁基等;“被羧基取代的烷基”是指例如羧甲基、2-羧基乙基、2-羧基丙基、4-羧基丁基、5-羧基戊基等基团;“被卤素取代的烷基”是指氯代甲基、溴代甲基、2-氯代乙基、1-溴代乙基、4-氯代丁基、4-溴代戊基、6-氯代己基、4-氟代丁基、3-氟代丙基、氟代甲基等基团;“被氨基取代的烷基”是指例如2-氨基乙基、氨基甲基、3-氨基丙基及4-氨基丁基等基团;“被C1-C4烷氧基取代的烷基”是指甲氧基甲基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基、乙氧基甲基、3-丙氧基丙基、3-乙氧基丁基、4-叔丁氧基丁基、3-甲氧基戊基、6-甲氧基己基等基团;“被C1-C4烷硫基取代的烷基”是指例如甲硫基甲基、2-甲硫基乙基、2-乙硫基丙基、4-甲硫基丁基、5-乙硫基己基、3-叔丁硫基丙基等基团;“被三氟甲基取代的烷基”的例子有2，2，2-三氟乙基、3，3，3-三氟丙基、4，4，4-三氟丁基、6，6，6-三氟己基等;“被三氟甲硫基取代的烷基”是指例如三氟甲硫基甲基、2-三氟甲硫基乙基、2-三氟甲硫基丙基、4-三氟甲硫基丁基、5-三氟甲硫基己基，以及C1-C6烷基取代的基团。
术语“烯基”是指至少具有1个碳-碳双键的基团。这样基团的少数例子是乙烯基、1-丙烯-2-基、1-丁烯-4-基、1-戊烯-1-基、1-丁烯-1-基等基团。
术语“被取代的烯基”是指至少具有1个碳-碳双键，并且被选自卤素、羧基、氨基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基、三氟甲基、三氟甲硫基、氰基等的1个多个基团取代的基团。
术语“炔基”是指至少具有1个碳-碳三键的基团。其少数例子是乙炔基、丙炔基等基团。
术语“环烷基”是指至少有3个碳原子的环状烷基基团。其少数例子是环丙基、环己基等基团。
术语“被取代的环烷基”是指被卤素、羧基、氨基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基、三氟甲基、三氟甲硫基、氰基等中的1个或多个基团取代的环状烷基基团。
术语“芳基”代表芳族性质的环状基团。这些基团的例子包括苯基、萘基和蒽基。
术语“被取代的芳基”是指被卤素、羧基、氨基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基、三氟甲基、三氟甲硫基、氰基等中的1个或多个取代的芳基基团。
术语“C1-C4烷硫基”是指那些具有1至4个碳原子并且被至少1个硫原子取代的基团。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘基团。
式Ⅰ中，由α和α′代表取代基的被取代的苯基基团包括卤代苯基如4-氯代苯基、3-溴代苯基、2-氟代苯基、2-碘代苯基、2，4-二氯代苯基，和3，5-二氯代苯基;羟苯基如2-羟基苯基、3-羟基苯基、4-羟基苯基、2，4-二羟基苯基和3，4-二羟基苯基;烷氧基苯基如2，6-二甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、3-乙氧基苯基、3，4-二甲氧基苯基、4-叔丁氧基苯基、4-甲氧基-3-乙氧基苯基和4-正丙氧基苯基;烷酰氧基苯基如2-乙酰氧基苯基、4-丙酰氧基苯基、4-甲酰氧基苯基、4-乙酰氧基苯基、3-丁酰氧基苯基和3-乙酰氧基苯基;烷基苯基如4-甲基苯基、2-甲基苯基、2，4-二甲基苯基、3-叔丁基苯基、4-乙基苯基、4-乙基-3-甲基苯基、和3，5-二甲基苯基;烷硫基苯基如4-甲硫基苯基、3-正丁硫基苯基、2-乙硫基苯基、3，4-二甲硫基苯基和3-正丙硫基苯基;氨基苯基如2-氨基苯基、4-氨基苯基、3，5-二氨基苯基和3-氨基苯基;烷酰氨基苯基如2-乙酰氨基苯基、4-乙酰氨基苯基、3-丙酰氨基苯基和4-丁酰氨基苯基;烷基磺酰氨基苯基如3-甲基磺酰氨基-苯基、4-甲基磺酰氨基苯基、3，5-二（甲基磺酰氨基）苯基、4-正丁基磺酰氨基苯基和3-乙基磺酰氨基苯基;羧基苯基如2-，3-或4-羧基苯基、3，4-二羧基苯基和2，4-二羧基苯基;氨甲酰基苯基如2-氨甲酰基苯基、2，4-二氨甲酰基苯基和4-氨甲酰基苯基;羧甲基苯基如4-羟甲基苯基和2-羟甲基苯基;氨甲基苯基如2-氨甲基苯基和3-氨甲基苯基;羧甲基苯基如2-羧甲基苯基、4-羧甲基苯基和3，4-二（羧甲基）苯基;以及带有不同取代基的被取代的苯基基团如4-氯-3-甲基苯基、4-氟-3-羟苯基、3，5-二氯-4-羟苯基、4-羟基-3-氯代苯基、4-羟基-3-甲基苯基、4-乙基-3-羟苯基、4-甲氧基-3-羟苯基、4-叔丁氧基-2-羟苯基、4-乙酰氨基-3-甲氧苯基、3-氨基-4-乙基苯基、2-氨甲基-4-氯代苯基、3-羟甲基-3-甲氧基苯基、2-羟甲基-4-氟代苯基、2-乙酰氧基-4-氨基苯基、4-乙酰氧基-3-甲氧基苯基、3-异丙硫基-4-氯代苯基、2-甲硫基-4-羟甲基苯基、4-羧基-3-羟苯基、4-乙氧基-3-羟苯基、4-甲基磺酰氨基-2-羧基苯基、4-氨基-3-氯代苯基和2-羧甲基-4-羟苯基。
其中R是由式
Figure 951019058_IMG37
代表的基团且其中m＝0的式Ⅰ的RCO-基团的例子是：苯乙酰、4-氯代苯乙酰、3，4-二氯代苯乙酰、4-甲氧基苯乙酰、3-乙氧基苯乙酰、2-氨甲基苯乙酰、3-羧基苯乙酰、4-乙酰氧基苯乙酰、3-氨基苯乙酰和4-乙酰氨基苯乙酰;m＝1且Z＝0时，包括苯氧基乙酰、4-氯代苯氧基乙酰、4-氟代苯氧基乙酰、3-氨基苯氧基乙酰、3-羟基苯氧基乙酰、2-甲氧基苯氧基乙酰、2-甲硫基苯氧基乙酰、4-乙酰氨基苯氧基乙酰、3，4-二甲基苯氧基乙酰和3-羟甲基苯氧基乙酰;以及m＝1且Z＝s时，包括苯硫基乙酰、4-氯代苯硫基乙酰、3，4-二氯代苯硫基乙酰、2-氟代苯硫基乙酰、3-羟苯硫基乙酰和4-乙氧苯硫基乙酰。
其中R3是杂芳基的式Ⅰ的R3-CO2CO-基团的例子是：2-噻吩基乙酰、3-噻吩基乙酰、2-呋喃基乙酰、2-苯并噻吩基乙酰、2-苯并呋喃基乙酰、吲哚-2-基乙酰、1H-四唑-1-基乙酰、噁唑-2-基乙酰、噁唑-4-基乙酰、噻唑-4-基乙酰、2-氨基噻唑-4-基乙酰、1，3，4-噁二唑-2-基乙酰、1，3，4-噻二唑-2-基乙酰、5-乙基-1，3，4-噻二唑-2-基乙酰，以及被氨基、C1-C4烷基磺酰氨基、羟基、卤素、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基基团取代的杂芳基基团。
其中R是由式R4-CH（Q）-代表的被取代的甲基基团且Q是氨基、羧基、羟基或硫的式Ⅰ化合物之RCO-基团的例子是：2-羧基-2-苯乙酰、2-氨基-2-（2-萘基）乙酰、2-羧基-2-（4-羟苯基）乙酰、2-氨基-2-苯乙酰、2-氨基-2-（4-羟苯基）乙酰、2-氨基-2-（3-氯代-4-羟苯基）乙酰、2-氨基-2-（环己-1，4-二烯基）乙酰、2-氨基-2-（3-甲基亚磺酰氨基苯基）乙酰、2-氨基-2-（3-甲基亚磺酰氨基苯基）乙酰、2-氨基-2-（3-乙基亚磺酰氨基苯基）乙酰和2-乙氧基-2-（3-羟苯基）乙酰、2-氨基-2-（2-噻吩基）乙酰、2-氨基-2-（3-苯并噻吩基）乙酰、2-氨基-2-（1H-四唑-1-基）乙酰、2-羟基-2-（1，3，4-噻二唑-2-基）乙酰、2-氨基-2-（2-氨基噻唑-4-基）乙酰、2-羧基-2-（2-噻吩基）乙酰、2-羧基-2-（苯并噻吩-2-基）乙酰和2-羟基-2-（苯并呋喃-2-基）乙酰;当Q是由结构式
代表的被取代的氨基基团时，这样的芳基基团的例子是2-（N-甲基-N-苯甲酰基氨甲酰基氨基）-2-（2-呋喃基）乙酰、2-（N，N-二甲基氨甲酰脲基）-2-（4-氯代苯基）乙酰、2-〔N-甲基-N-（2-氯代肉桂酰）氨基甲酰氨基〕-2-（2-噻吩基）乙酰和2-（N-乙基-N-乙酰氨基甲酰氨基）-2-（4-羟苯基）乙酰;当Q是由结构式
Figure 951019058_IMG39
代表的被取代的氨基基团时，例子包括2-〔（3-甲基咪唑啉-2-酮-1-基）碳酰氨基〕-2-苯乙酰、2-〔（3-乙酰咪唑啉-2-酮-1-基）碳酰氨基-2-苯乙酰、2-〔（3-甲基磺酰咪唑啉-2-酮-1-基）-2-（2-噻吩基）乙酰和2-〔（3-乙酰六氢嘧啶-2-酮-1-基）碳酰氨基〕-2-苯乙酰;当Q是由结构式
Figure 951019058_IMG40
代表的羟基取代的苯甲酰氨基基团时，这样的芳基基团的例子是2-（2，4-二羟苯甲酰氨基）-2-苯乙酰、2-（4-羟苯甲酰氨基）-2-（4-羟苯基）乙酰、2-（3，4-二羟苯甲酰氨基）-2-（2-氨基噻唑-4-基）乙酰、2-（3，5-二羟苯甲酰氨基）-2-（3-噻吩基）乙酰和2-（2-羟苯甲酰氨基）-2-（2-苯并呋喃基）乙酰。
当Q是羟基取代的吡啶碳酰氨基基团时，例子包括例如2-羟吡啶-4-酮-6-基碳酰氨基和3-羟吡啶-4-酮-6-基碳酰氨基。当Q是吡啶基碳酰氨基基团时，例子是例如吡啶-3-基碳酰氨基、4-氨基吡啶-3-基磺碳酰氨基、5-氯代吡啶-2-基碳酰氨基、3-羧基吡啶-4-基碳酰氨基和4-氨基吡啶并-2-基碳酰氨基。当Q是如上限定的咪唑或吡唑基团时，例子包括例如2-氨基咪唑-4-基碳酰氨基、5-羧基吡唑-3-基碳酰氨基、3-氨基吡唑-4-基碳酰氨基和4-羟吡唑-5-基碳酰氨基。当Q是苯并哒嗪-4-酮-3-基碳酰氨基基团时，Q的例子是由结构式
Figure 951019058_IMG41
代表的。
当R是酮基团或由式
Figure 951019058_IMG42
代表的肟基取代的基团时，由式Ⅰ代表的化合物中RCO芳基基团的例子是酮基团2-氧代-2-苯基乙酰、2-氧代-2-（2-噻吩基）乙酰、2-氧代-2-（2-氨基-噻吩-4-基）乙酰;以及肟基取代的基团2-苯基-2-甲氧基氨基乙酰、2-（2-噻吩基）-2-乙氧基亚氨基乙酰、2-（2-呋喃基）-2-甲氧基亚氨基乙酰、2-（2-苯并噻吩基）-2-羧基甲氧基亚氨基乙酰、2-（2-噻吩基）-2-（2-羧基乙氧基）亚氨基乙酰、2-（2-氨基-1，2，4-噻二唑-4-基）-2-甲氧基亚氨基乙酰、2-（2-氨基噻唑-4-基）-2-甲氧亚氨基乙酰、2-（2-氨基噻唑-4-基）-2-（2-羧基丙-2-基）氧代亚氨基乙酰、2-（5-氨基-1，3，4-噻二唑-2-基）-2-甲氧亚亚氨基乙酰。
当结构式（Ⅰ）中的R6是由苯基或取代的苯基取代的C1-C4烷基时，这样的基团可以是苄基、4-羟苄基、4-氯代苄基、3-羧基苄基、3-氯代-4-羟苄基、2-苯乙基、1-苯乙基、3-苯丙基、4-羟基-2-苯丙基、3-苯丁基和类似的苯基-烷基基团。
当R6代表被氨基或保护氨基取代的C1-C4烷基时，例子包括2-氨乙基、3-氨丙基、4-氨丁基、2-氨丙基以及其中氨基被氨基保护基团保护的这些基团。
当R6是C2-C4烯基基团时，例子包括乙烯基、丁烯-2、丁烯-3、丁烯-1及类似基团
由其中R是式
Figure 951019058_IMG43
的基团的式（Ⅱ）代表的化合物，可见于Hamashima的美国专利4，634，671中。可举例的取代基是，R9为氢;R5为苯基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、可以被保护或未被保护的氨基噻唑基、噻二唑基及氨基噻唑基，且R6可以是C1-C3烯基和-CH2COO2H。
当R是式
-（CH2）1CH（R12NR11）COOH
的基团时，且其中R12是氢时，R11的例子包括：
Figure 951019058_IMG44
Figure 951019058_IMG45
或者R11与R12一起形成基团
Figure 951019058_IMG46
这样的R11和R12的其他例子可见于美国专利号：3，853，863、3，522，248;3，573，296、3，641，081、3，980，644和3，821，208中;日本专利号：108，085（1976）、112，892（1978）、53，689（1978）、029，493（1976）、13，389（1973）、149，694（1975）、82，791（1977）中;德国专利号2，157，693、2，721，731、2，507，117、2，208，631、2，458，554、2，418，088、2，523，280和2，841，363中;比利时专利号：790，540（1973）中和美国专利号1，565，053与2，040，942中，以及下列文章中：Anctrisano，T.，et al.，J.Appl.Chem.Biotechnol，（1976），26，459-468。
式Ⅰ和式Ⅱ化合物中最优选的R1是氢、乙酰、戊二酰、α-氨基邻联吡啶基和苯乙酰;G最好是硫且X最好是氢。
用以完成本发明酰化过程的酶是得自红冬孢酵母、麦胚、桔皮、枯草芽孢杆菌或黑曲霉的脂肪酶或酯酶。
可以任何形成使用酶。例如，它们可以是粗制品、部分纯化的或纯化至结晶的。如果酶浊由微生物得到的，可用全细胞在原位生成酶完成酶促反应，或者在适当地处理细胞后得到可溶性酶再以其完成酰化作用。
一般说来，酶的形式应是易于分散于与酰基供体和式Ⅱ的起始化合物接触的反应介质中的。因此，可以使来自微生物的酶、细胞全培养物的样品，较好在经处理后使细胞不再存活，并且在必要时，可在例如用超处理、溶解酶处理或去污剂处理等常规方法破坏细胞后使用之。也可使用在得以保留酶活性情况下储存的细胞制品，例如丙酮干燥的粉末或丙酮处理的细胞。优选的处理方法是使用络合剂例如乙二胺四乙酸（EDTA）。
也可以使无细胞形式的微生物酶。因此，可使用得自培养物的滤液或悬浮液。必要时，可在过滤或离心前用上述方法破碎细胞。另外，可用常规方法进一步纯化无细胞酶。可使用的技术包括例如用盐或用有机溶剂如丙酮沉淀酶、在例如在离子交换柱上或对酶有特异亲和性的载体上层析，并经凝胶过滤或透析脱盐。无细胞酶可以作为溶液、沉淀物或适当固相化的制剂使用。
当酶是来自麦胚或桔皮时，可以使用植物材料的含酶提取物。可用常规方法制备这样的提取物，一般可包括首先用物理技术例如用如英国专利说明书No.966，222中所述的研磨或榨压方法或用化学技术例如按英国专利说明书No.1，121，308中所述用石油醚等烃溶剂处理植物材料，以从植物材料中释放出酶。可以将除去或未除去细胞碎片的所得制剂直接加到反应混合物中。或者，必要时可进一步例如使用上述制备微生物酶的技术处理制剂，以得到可以如上述微生物酶一样使用的无细胞酶。
优选的制备方法是用戊二醛/聚1，2-亚乙基亚胺（PE1）处理可溶性酶使之不能溶解。这种不溶化技术是本领域已知的，例如参见Ogata，Ottesen  &  Svendson，Biochim.Biophys.Acta，159，（1968），403-405。
用于本发明的麦胚脂肪酶是本领域中已知的。例如，Singer，J.Biol，Chevn.，174，1948，11描述了这样的脂肪酶，并可按该出版物中所述方法进一步纯化之。一种商业来源的麦胚脂肪酶是可由Sigma  Chemical  Company，St.Lowis，Mo提供的Ⅰ型麦胚脂肪酶（Cat.No.L3001）。
本发明所用于桔皮酯酶是已知的。例如英国专利申请966，222，美国专利3，202，056和欧洲专利0109300中描述了这些酯酶，并可按这些专利说明书中所述方法制备之。商业来源的适当桔皮酯酶包括可得自Sigma  Chemical  Company，St.Lowis，Mo的乙酰酯酶（Cat，No.A  4530）。
得自黑曲霉的适当脂肪酶是本领域中已知的。Malcata，Hill和Amundson，在Biotechonl.Bioeng.，38，1991，853-868中描述了这种脂肪酶。可使用已知的培养基和生长条件，发酵黑曲霉的产生脂肪酶的菌株，以制备这种脂肪酶。可由Biocatalysts，Ltd.，MainAve.，Traforest  Industrial  Estate，Pontypridd，Mid  Glamorgan，CS  37  5UT，United  Kingdom购得由黑曲霉产生的商品脂肪酶。
由枯草芽胞杆菌产生的适当酯酶是本领域已知的。例如美国专利3，304，301和欧洲专利0173206中描述了这样的酯酶。可使用本领域已知的培养基和生长条件发酵产生酯酶的葳草胞杆菌菌株，以制备这样的酯酶。优选的枯草芽胞杆菌菌株包括ATCC  6633和ATCC  9466。
得自红冬孢酵母的适当酯酶是本领域中已知的。例如，英国专利2060610中描述了这样的酯酶。可使用已知的培养基和生长条件发酵能产生酯酶的红冬孢酵母菌株，以制备这种酯酶。优选的红冬孢酵母菌株包括ATCC  10657。
进行常规实验的确定方法中所需酶的量，该量可根据来源、纯度及反应条件而有所不同。
可在含水介质中完成本发明的方法。例如，可在水中或适于培养脂肪酶或酯酶生产菌的发酵液中完成该方法。在水中完成本发明方法的能力，可使酰化过程在从培养液中纯化的早期阶段完成。另外，当在含水介质中完成酰化过程中，不必为了完成酰化而将培养液混合物移入溶剂中。本领域技术人员可使用适当的培养基培养微生物。较好使用搅拌或振荡下的通气条件。培养微生物的适当条件包括提供微生物生长所需的营养素。生长所需的典型培养基包含必要的碳源、氮源和微量元素。
碳源可包括糖如麦芽糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油、山梨醇、蔗糖、淀粉、甘露醇、丙二醇等;有机酸如乙酸钠、柠檬酸钠等;氨基酸如谷氨酸钠等;以及醇如乙醇、丙醇等。
氮源可包括N-乙胺A、玉米浆、大豆粉、牛肉膏、酵母浸膏、废糖蜜、面包酵母、胰胨、营养大豆（nutrisoy）、胨、yeastamin、硝酸钠、硫酸铵等。
微量元素可包括磷和镁、锰、钙、钴、镍、铁、钠及钾盐。
使用的培养基可包含一种以上的碳和氮源或其他营养素。
ATCC  Catalogue  of  Filamentous  Fungi，Ameriam  Type  Culture  Collecfion，Roclcville，MD中描述了培养黑曲霉的适当技术;美国专利3，304，310中描述培养枯草芽胞杆菌的适当技术;英国专利2，060，610描述了培养红冬孢酵母的适当技术。
在本发明的方法中，条件可以有很大变异。例如，可在大约-20℃至30℃的温度下，在大约5至9的pH条件下，用足可完成该反应的时间，如通常约用5分钟至100小时完成该方法。较好在大约0℃至25℃的温度，在大约7至8的pH的条件下，使反应进行大约10分钟至48小时（最好约30分钟至4小时）。
本发明的方法至少使4%或更多的式Ⅱ化合物转化为式Ⅰ化合物，且转化率较好为至少10%，更好为至少50%，最好为至少80%。
本发明的方法较好包括从反应介质中分离所需产物的附加步骤。分离技术是本领域中已知的。这些分离技术包括层析、用有机溶剂提取、作为不溶性材料沉淀及重结晶。优选的分离技术是层析、特别是柱层析。例如，可以真空处理反应介质以除去微量未反应的酰基供体和杂质。然后将粗混合物加于制备性层析柱（如Hp  20ss）上。用水洗后，可用适当的溶剂如甲醇洗脱所需产物。然后用常规结晶技术制得所需产物。
下列实施例是举例说明本发明，而不看作是对本发明的限制。
实施例1
使用R.toruloides全细胞作为酶来源并使用乙酸异丙烯酯作为酰基供体从des-7-ACA合成7-ACA
按下述方法制备用于生产酯酶的红冬孢酵母（R.toruloides）的摇瓶发酵培养物：为制备种子培养物，首先将冷冻保存的培养物以2%的浓度接种到含100ml下述培养基的500ml培养瓶中：2%葡萄糖、1%酵母浸膏、1%细菌蛋白胨、0.5%KH2PO4、pH6.0。培养基经蒸汽灭菌30分钟。在28℃和250rpm的转速将种子培养物培养24小时，用2%培养体积开始生产阶段发酵。生产阶段培养基组成是：8%玉米浆、1%K2HPO4、3%葡萄糖，pH6.2。在1L发酵罐中将培养基蒸汽灭菌2小时。在高通气条件下，于16-24℃将发酵罐内发酵液培养3或4天。按下述方法监测酯酶活性：向200μL全细胞中（在蒸馏水中稀释得到10-20%的底物转化率）加入在0.2M磷酸钾缓冲液（pH6.5）中浓度为200mg/mL的200μL头孢菌素C钾盐。将混合物于37℃保温20分钟并加入3.0mL乙腈/水（1/1）以终止反应。在C18反相柱上，使用由10mM辛磺酸、0.1%H3PO4、10%甲醇（pH2.5）组成的流动相，以HPLC法分析乙腈/水混合物的上清液。全培养液的比活性一般为L0-37国际单位/mL（一个国际单位（IU）定义为每分钟生成1微摩尔产物所需的酶量）。离心全细胞培养液制备红冬孢酵母洗出的细胞浓缩物，并使细胞悬浮液达到每毫升80单位活性。经差速离心除去玉米浆固形物。将333mg/mL的固形物加到2MHEPES缓冲液（pH6.5-8.1）中，并用浓氨水将pH调到7.8-8.0，直至达到使之溶解，以制备脱乙酰7-ACA储备溶液。调整溶液的体积以使底物在0.75M HEPES缓冲液中的终浓度为250mg/mL。合并底物储备溶液（12.5mL）和酶（12.5mL）（红冬孢酵母细胞浓缩物，80IU/mL）并加入乙酸异丙烯酯（10mL）以开始反应。温度保持在20-24℃并用浓氨水滴定使pH保持在6.5。持续搅拌反应混合物并使反应进行2小时，或直到产物生成达到平台。用如前所述的HPLC方法监测反应。图1显示了典型的反应曲线。
实施例2
使用R.toruloides全细胞作为酶来源并用三醋精作为酰基供基供体从des-7-ACA合成7-ACA
按实施例1中所述方法制备红冬孢酵母和脱乙酰7-ACA（des-7-ACA）。按实施例1中所述于24℃开始保温，但不同的是加入三醋精作为乙酰供体。图2中举例说明了用三醋精作酰基供体的典型反应曲线。
实施例3
使用R.toruloides全细胞作为酶来源并用乙酸乙烯酯作为酰基供体从des-7-ACA合成7-ACA
将500μl  des-7-ACA储备溶液（在750mM  HEPES缓冲液（pH7.8）中，250mg/mL）加至500μl细胞原培养物中。向混合物中加入作为乙醛清除剂的亚硫酸氢钠（100mg）。加入260μl乙酸乙烯酯并振荡混合物，使之在-20℃下反应。加入浓氨水使pH保持在7.0。从-20℃环境中取出样品，周期取样期间温度升至0至-10℃之间。分析混合物后证明des-7-ACA至7-ACA的转化率为73%。
实施例4
使用R.toruloides全细胞作为酶来源并使用各种不同的酰基供体从des-7-ACA合成7-ACA
按实施例1中所述方法制备红冬孢酵母和des-7-ACA）。按实施例1中所述于24℃开始保温或者使反应成比例地降至1.0mL规模。下列表中总结了使用各基供体的产物生成情况。
表1
供体    转化率(%)    反应时间(分钟)
乙酸异丙烯酯    82    150
三醋精    64    120
乙酸乙烯酯    23    120
乙酸乙酯    14    20
二醋精    22    120
二甘醇二乙酸酯    49    120
顺-1,4-二乙酸基丁烷    29    60
1,4-三乙酸基丁烷    23    35
乙酸苯酯    49    35
1,2,4-三乙酸基苯    13    60
1,3-丁二醇二乙酸酯    24    30
1,2-丙二醇二乙酸酯    40    90
乙酸-正丁酯    4    30
三甘醇二乙酸酯    32    150
乙酸异丙酯    10    15
乙酸异丁酯    9    30
肟酯(比较)    1.3    30
实施例5
使用经用EDTA（pH4.0）处理从R.toruloides全细胞释放的酯酶从des-7-ACA和乙酸乙丙烯酯合成7-ACA
按实施例1所述方法培养红冬孢酵母。用EATA（0.1M，pH4.0）处理培养物以从全细胞中释放酯酶。在截留分子量为30，000的滤膜上浓缩可溶性酶。使之达到80IU/mL的最终比活性。按实施例1所述进行7-ACA的合成，但不同的是反应在6℃下完成。200分钟后所产生的7-ACA的转化率为79%。
实施例6
使用固相化的R.toruloides产生的酯酶从des-7-ACA和乙酸异丙烯酯合成7-ACA
按实施例1中已述方法培养红冬孢酵母。按实施例5中所述方法得到可溶性酯酶。用PEI（0.1%）和戊二醛（0.5%）处理可溶性酶。将混合物搅拌1小时，然后过滤回收固定化的酶。用水洗酶并再次过滤得到活性为350IU/g的固相化酯酶。按实施例1中所述从des-7-ACA合成7-ACA，但不同的是在5℃下进行反应，并且反应混合物中使用60IU/mL的固相化酶。180分钟后得到7-ACA的转化产率为76%。
实施例7
使用枯草芽胞杆菌（ATCC  6633）无细胞提取物作为酶来源并使用不同的酰基供体从des-7-ACA合成ACA
按下述程序进行摇瓶发酵。将得自胰酶解大豆琼脂斜面的培养物接种到含有25mL胰酶解大豆培养基的125mL培养瓶中，于28℃以250rpm的速度振荡24小时，以制备种子培养物。将种子培养物以1%浓度接种到20个生产储存瓶中，其中每个500mL培养瓶含有100mL胰酶解大豆培养基。于28℃，以250rpm的速度将培养物振荡培养4小时。离心1800mL生产阶段全培养液，用20mM磷酸盐缓冲液（pH6.5）洗细胞，以总体90mL重新悬浮并冷冻之。经离心将融解的细胞进一步浓缩至15mL并重新悬浮以使酯酶的终活性达到0.63IU/mL。
将最后的细胞浓缩物（0.63IU/mL）500μL加到500μL  des-7-ACA母液（实施例1）中。加入400μL乙酰供体以开始反应。开始时使pH保持在6.5-7.0，但后来增加到8.0.以提高反应速度。pH在8.0保持总共48小时。下表中比较了使用各种乙酰供体时所得7-ACA的转化产率。
表2
供体    转化率(%)
乙酸异丙烯酯    16
三醋精    16
三甘醇二乙酸酯    27
二甘醇二乙酸酯    26
实施例8
使用浓缩的枯草芽胞杆菌（ATCC  9466）无细胞提取物作为酶来源并用二甘醇二乙酸酯作为酰基供体从des-7-ACA合成7-ACA
按实施例7所述进行用于生产头孢菌素C酯酶活性的枯草芽胞杆菌的摇瓶发酵。用截留分子量为30，000的滤膜超滤，将得自1500mL无细胞提取物的细胞外酶浓缩到20mL体积，且其中酶的比活性为40UI/mL。将40单位的酶加到1.0mL des-7-ACA母液中，再加入400μl二甘醇二乙酸酯以开始反应。加入2M NH3使反应的pH保持在7.5。于60分钟时加入另一份400μL二甘醇二乙酸酯。在t＝60λ120和180分钟时取样品并按实施例1中所述方法检测7-ACA产生量。120分钟后，有54%的底物被转化成产物。在继后60分钟一直保持着这一水平。
实施例9
使用各种事业上可利用的酯酶和脂肪酶并用乙酸异丙烯酯作为酰基供体从des-7-ACA合成7-ACA
在作为酰基供体的乙酸异丙烯酯存在下，筛选具有从des-7-ACA产生7-ACA能力的各种市售脂肪酶和酯酶。将浓度为125mg/mL的500μL  des-7-ACA（按实施例1的相似方法制备）与已悬浮在500μL  20mM磷酸盐缓冲液（pH6.5）中的各种酶一起保温。加入500μL乙酸异丙烯酯以启动反应，并在20-24℃下用浓氨水将pH保持在7.0以使反应进行3小时。下列酶能够从des-7-ACA合成7-ACA。
表3
酶    量    转化率(%)
得自麦胚的I型脂肪酶    50mg    24
(Sigma  Chemical  Co.)
得自黑曲霉的脂肪酶    100mg    13
(Biocatalysts)
得自桔皮乙酰酯酶    250μL    14
(Sigma  Chemical  Co.)
实施例10
使用7-ACA作为乙酰供体并使用得自麦胚的I型脂肪酶作为酶源从脱乙酰头孢菌素C合成头孢菌素C
将麦胚I型脂肪酶与脱乙酰头孢菌素C（在Bis-Tris缓冲液300mM/150mM中，200mg/mL）一起保温，加入50mg  7-ACA以启动反应并使反应在20-24℃，pH7.0条件下进行。生成头孢菌素C的转化产率为19%。
实施例11
使用乙酸异丙烯酯或乙酸乙烯酯作为乙酰供体并使用固相化的麦胚I型脂肪酶作为酶源从des-7-ACA合成7-ACA
将麦胚（200g）与水（800mL）混合，在搅拌器中匀浆1分钟，然后再匀浆1分钟。用1%  PEI处理所得混合物并在室温下搅拌10分钟。将溶液以8000rpm离心10分钟，以得到澄清的脂肪酶提取物。通过截留分子量为30，000的滤膜超滤提取物并浓缩到100mL。将所得物冷却到4℃并经10分钟加入固体硫酸铵（40g）。将所得混合物以8000rpm离心10分钟。于40℃下搅拌10分钟将蛋白饼溶解在30mL水中。将悬液以8000rpm离心10分钟得到50mL脂肪酶浓缩物。将浓缩物于4℃搅拌，加入硅藻土（0.5g），然后在约1分钟时间内缓慢加入0.5mL  50%戊二醛。将混合物搅拌4分钟以上，然后经2分钟时间加入1体积的冷丙酮。于4℃将混合物存放10分钟。过滤除去固定化的酶并重新悬浮在水中。将pH调到7.0，然后再次过滤回收得到13.5g固定化酶。
将150mg/mL的固定化麦胚脂肪酶与150mg/mL  des-7-ACA合并并在1mL  1M  HEPES缓冲液（pH7.8）中25℃保温4小时（振荡速度250rpm）。在t＝0和150分钟时加入乙酸乙烯酯（0.1mL）或乙酸异丙烯酯（0.10mL）。4小时后，在分别使用乙酸乙烯酯和乙酸异丙烯酯的情况下，7-ACA的转化产率分别为18%和7%。
实施例12
苯乙酰脱乙酰7-ACA的酰化
制得有下列成分的混合物：苯乙酰-脱乙酰7-ACA（50mg）、2M MES/NH+缓冲液（0.5mL）、乙酸甲酯（4.5mL）、乙酸异丙烯酯（0.5mL）和红冬孢酵母细胞的悬浮液（150IU/mL）。混合物于25℃搅拌2小时（使pH降至6.0）。此时，TLC显示反应混合物为大约50∶50的未反应苯乙酰-脱乙酰7-ACA与苯乙酰7-ACA的混合物（与真实化合物相比较）。
实施例13
从7-ACA和未反应的脱乙酰7-ACA中分离合成的7-ACA
真空处理50mL如实施例1中所述的反应混合物，以除去微量丙酮和未反应的乙酸异丙烯酯。7-ACA和脱乙酰7-ACA的终浓度分别为2.45%和1.25%。将样品加于制备性HP20ss柱（4cm×30cm）上。用150mL蒸馏水洗柱并用10%甲醇洗脱产物，每管收集10mL。图3显示了典型的柱洗脱曲线。合并7-ACA峰值部分（100mL）并经旋转蒸发浓缩到20mL终体积。用6N    HCl使pH降至4.2，加入10mL甲醇并冷却样品。过滤收集所得固体物。7-ACA的回收率为65%，余留有5%脱乙酰7-ACA且存在的7-ADCA少于0.1%。

Claims (20)

1、制备下列结构式之头孢菌素化合物的酰化方法，
Figure 951019058_IMG1
其中，R1是氢或R-C-的酰基基团-其中R是羧酸的残基，
X是氢或卤素，且
G是硫、氧、亚砜、砜或亚甲基；
该方法包括在得到红冬孢酵母、麦胚、桔皮、枯草芽胞杆菌、黑曲霉的脂肪酶或酯酶存在下，使结构式
Figure 951019058_IMG2
的化合物与酰基供体在含水介质中反应。
2、根据权利要求1的方法，其中所说的脂肪酶或酯酶得自红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）。
3、根据权利要求1的方法，其中所说的脂肪酶或酯酶得自红冬孢酵母ATCC 10657。
4、根据权利要求1的方法，其中R1是氢、乙酰、戊二酰、α-氨基己二酰或苯乙酰，G是硫且X是氢。
5、根据权利要求4的方法，其中G是硫。
6、根据权利要求4的方法，其中R1是氢。
7、根据权利要求5的方法，其中R1是氢。
8、根据权利要求1的方法，其中所说的酰基供体是式
Figure 951019058_IMG3
的基团-其中R″是C1-C10烷基、C2-C10烯基、C3-C10环烷基、C3-C10环烯基、C2-C10炔基、C6-C30芳基、C1-C10被取代的烷基、C2-C10被取代的烯基、C3-C10被取代的环烷基、C3-C10被取代的环烯基、C6-C30被取代的芳基、式
Figure 951019058_IMG4
的基团-其中n是2或大于2的整数，R'''是H或乙酰或式
Figure 951019058_IMG5
的基团-其中n和R'''定义同上所述;X是氢或卤素。
9、根据权利要求8的方法，其中R″是C2-C6烯基、被1-3个乙酸基基团取代的C1-C6烷基、C6-C10芳基，或式
Figure 951019058_IMG6
的基团-其中n是2至100的整数。
10、根据权利要求1的方法，其中酰基供体是乙酸异丙烯酯、三醋精、乙酸乙烯酯、乙酯乙酯、二醋精、二甘醇二乙酸酯、顺-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯酯、1，2，4-三乙酸基苯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯、乙酸-正丁酯、三甘醇二乙酸酯、乙酸异丙酯或乙酸异丁酯。
11、根据权利要求4的方法，其中酰基供体是乙酸异丙烯酯、三醋精、乙酸乙烯酯、乙酯乙酯、二醋精、二甘醇二乙酸酯、顺-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯酯、1，2，4-三乙酸基苯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯、乙酸-正丁酯、三甘醇二乙酸酯、乙酸异丙酯或乙酸异丁酯。
12、根据权利要求7的方法，其中酰基供体是乙酸异丙烯酯、三醋精、乙酸乙烯酯、乙酯乙酯、二醋精、二甘醇二乙酸酯、顺-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯酯、1，2，4-三乙酸基苯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯、乙酸-正丁酯、三甘醇二乙酸酯、乙酸异丙酯或乙酸异丁酯。
13、根据权利要求1的方法，其中酰基供体是乙酸异丙烯酯、三醋精、乙酸-乙烯酯、二醋精、二甘醇二乙酸酯、顺-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯基酯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯或三甘醇二乙酸酯。
14、根据权利要求4的方法，其中酰基供体是乙酸异丙烯酯、三醋精、乙酸-乙烯酯、二醋精、二甘醇二乙酸酯、顺-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯基酯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯或三甘醇二乙酸酯。
15、根据权利要求7的方法，其中酰基供体是乙酸异丙烯酯、三醋精、乙酸-乙烯酯、二醋精、二甘醇二乙酸酯、顺-1，4-二乙酸基丁烷、1，4-二乙酸基丁烷、乙酸苯基酯、1，3-丁二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯或三甘醇二乙酸酯。
16、根据权利要求1的方法在大约-20℃至30℃的温度，在大约5至9的pH条件下进行大约5分钟至100小时。
17、根据权利要求1的方法在大约0℃至25℃的温度，在大约7至8的pH条件下进行大约30分钟至4小时。
18、根据权利要求1的方法包括分离所需产物的附加步骤。
19、根据权利要求16的方法，其中分离是经层析完成的。
20、根据权利要求3的方法是用全细胞、用EDTA处理细胞后得到的可溶性酶、或用戊二醛/PEI处理可溶性酶后得到的固定化酶完成的。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154129A (zh) * 2011-01-10 2011-08-17 南京农业大学 一株降解棉酚的红冬孢酵母及其应用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0801683B1 (de) * 1995-02-03 2002-05-02 Basf Aktiengesellschaft Racematspaltung primärer und sekundärer heteroatomsubstituierter amine durch enzym-katalysierte acylierung
ES2105988B1 (es) * 1996-03-15 1998-07-01 Antibioticos Sa Procedimiento para purificar 7-sustituido-amino-desacetoxi-cefalosporinas mediante el empleo de membranas de filtracion.
AU729815B2 (en) * 1996-09-18 2001-02-08 Bristol-Myers Squibb Company Cephalosporin esterase gene from Rhodosporidium toruloides
IL135827A0 (en) * 1997-10-30 2001-05-20 Bristol Myers Squibb Co Chemical acetylation of desacetyl-cephalosporins
WO2024041972A1 (en) 2022-08-23 2024-02-29 Bayer Aktiengesellschaft Nucleic acids encoding improved lipase proteins

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB966222A (en) * 1960-04-11 1964-08-06 Nat Res Dev Derivatives of cephalosporin c
CH462993A (de) * 1961-06-12 1968-09-30 Ciba Geigy Verfahren zur Herstellung von Küpenfarbstoffen
GB1080904A (en) * 1963-11-19 1967-08-31 Ciba Ltd Process for the manufacture of desacetyl-u-amino-cephalosporanic acid
US3239394A (en) * 1964-06-15 1966-03-08 Merck & Co Inc Process for producing 7-amino-cephalosporanic acid
GB1121308A (en) * 1964-10-30 1968-07-24 Glaxo Lab Ltd Cephalosporins
FR1460131A (fr) * 1964-10-30 1966-06-17 Glaxo Lab Ltd Procédé de préparation de produits de dégradation de la céphalosporine c et de ses dérivés
GB1141293A (en) * 1964-12-23 1969-01-29 Glaxo Lab Ltd Cephemoic acids and derivatives thereof
CH481142A (de) * 1966-12-05 1969-11-15 Ciba Geigy Verfahren zur Isolierung von Cephalosporin C
US3573296A (en) * 1968-07-01 1971-03-30 Bristol Myers Co Process for the preparation of 7-aminocephalosporanic acid
US3641018A (en) * 1969-06-26 1972-02-08 Lilly Co Eli Process for preparing 7-amino cephalosporanic acid
GB1355347A (en) * 1970-08-25 1974-06-05 Glaxo Lab Ltd Recovery of cephalosporin c and derivatives thereof
SU603343A3 (ru) * 1972-11-13 1978-04-15 Эли Лилли Энд Компани (Фирма) Способ очистки цефалоспорина с
US3980644A (en) * 1973-04-23 1976-09-14 Eli Lilly And Company Pentavalent phosphorus amides of cephalosporins and separation process using same
GB1474519A (zh) * 1973-05-14 1977-05-25
GB1531212A (en) * 1974-11-08 1978-11-08 Glaxo Lab Ltd Enzymatic hydrolysis of 3-acyloxymethylceph-3-em-4-carboxylic acids or salts thereof
GB1565053A (en) * 1977-08-12 1980-04-16 Proter Spa Intermediate product for the preparation of cefazolin antibiotic
AT367060B (de) * 1979-01-25 1982-05-25 Biochemie Gmbh Verfahren zur herstellung neuer cephalosporinderivate
GB2060610B (en) * 1979-07-19 1983-12-07 Glaxo Group Ltd Desaacetyl cephalosporin c production
DE3163939D1 (en) * 1980-03-08 1984-07-12 Fuji Oil Co Ltd Method for enzymatic interesterification of lipid and enzyme used therein
US4414328A (en) * 1980-07-21 1983-11-08 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Process for the preparation of deacetylcephalosporin C
IE54838B1 (en) * 1982-04-30 1990-02-28 Unilever Plc Improvements in and relating to interesterification of triglycerides of fatty acids
US4459405A (en) * 1982-11-16 1984-07-10 Eli Lilly And Company Desacetylcephalosporin sulfones
IL70216A0 (en) * 1982-11-16 1984-02-29 Lilly Co Eli Desacetylcephalosporin sulfones
US4584371A (en) * 1984-03-01 1986-04-22 The Upjohn Company Catalytic process for preparing 3-ester-methyl cephalosporins from desacetyl-7-aminocephalosporanic acid
DE3432060A1 (de) * 1984-08-31 1986-03-06 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Immobilisierte zellen von bacillus subtilis, immobilisierungsverfahren und verwendung des praeparats zur abspaltung der 3-acetoxygruppe aus 7-ss-acylamido-cephalosporansaeuren
US4892822A (en) * 1987-10-22 1990-01-09 General Electric Company Enzyme-catalyzed reactions involving diphenyl carbonate
MY103640A (en) * 1987-12-09 1993-08-28 Kao Corp Immobilized enzyme and esterification and interesterification therewith
CA2049958A1 (en) * 1989-04-04 1990-10-05 Bing L. Wong Enzymatic production of 7-amino cephalosporanic acid
US5229274A (en) * 1989-06-27 1993-07-20 Merck & Co., Inc. Gene encoding one step cephalosporin C amidase and expression thereof in recombinant bacillus
US5220063A (en) * 1991-05-10 1993-06-15 Hoechst Celanese Corporation Method for the preparation of arylalkanolacylamides
US5221739A (en) * 1992-01-09 1993-06-22 Eli Lilly And Company Acetylation of 3-hydroxymethyl cephalosporins
JPH06170999A (ja) * 1992-12-08 1994-06-21 Kanebo Ltd 複合発泡ポリエステルシート

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154129A (zh) * 2011-01-10 2011-08-17 南京农业大学 一株降解棉酚的红冬孢酵母及其应用

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Publication number Publication date
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