JPH0523757B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、一般式 （式中、R₁は水素、或いは置換又は未置換ア
リル（Ar）基、R₂は置換又は未置換アルキル基）
で表される（Ｒ，Ｓ）−５−アシロキシメチル−
オキサゾリジン−２−オン（）を不斉的に加水
分解して、 （R₁は前記に同じ）の（Ｓ）−５−ヒドロキシ
メチル−オキサゾリジン−２−オンを生成させる
立体選択的エステラーゼ活性を有するムコール属
もしくはリゾプス属に属する微生物或いはこれら
の微生物から得られる、（Ｒ，Ｓ）−５−アシロキ
シメチル−オキサゾリジン−２−オンから（Ｓ）
−５−ヒドロキシメチル−オキサゾリジン−２−
オンを生成させる立体選択的エストラーゼ活性を
有する（以下、ラセミ体（）から（Ｓ）−（）
を生成させる、と略記する）酵素を作用させるこ
とにより、ラセミ体（）から水解物（）及び
未反応物である （R₁、R₂は前記に同じ）の（Ｒ）−５−アシロ
キシメチル−オキサゾリジン−２−オンに変え
て、各々を分離採取し、また更に（Ｒ）−（）を
加水分解して （R₁は前記に同じ）の（Ｒ）−５−ヒドロキシ
メチル−オキサゾリジン−２−オンを生成させ、
採取することを特徴とするオキサゾリジノン誘導
体の光学分割方法に関する。 これら光学活性な２−オキサゾリジノン化合物
は医薬品或いは医薬品の原料となる。例えば、
（Ｒ）−（）のうちR₁がアリル基である化合物の
中に強い抗菌活性をもつ化合物が見い出されてい
る（特開昭58−103376）。 （従来の技術） これら光学活性な２−オキサゾリジノン類の製
造については、３−アリルアミノ−１，２−プロ
パンジオールを光学分割剤を用いて分割後、（Ｒ）
−５−ヒドロキシメチル−３−アリル−オキサゾ
リジン−２−オンに誘導する方法（特開昭58−
103376）が知られている。微生物を利用した分割
法については、本発明者らが、先に（Ｒ，Ｓ）−
５−アシロキシメチル−３−アルキル置換−オキ
サゾリジン−２−オンラセミ体を微生物菌体又は
酵素を作用させて不斉的に加水分解し、対応する
光学活性体を取得する方法を見い出している（特
開昭59−31692、同59−31693）。 （発明が解決しようとする課題） 本発明者らはＮ置換基が水素やアリル基の場合
も同様に不斉水解する能力を有する微生物菌体又
は酵素が見つかるのではないかと考え、スクリー
ニング実験を試みた。その結果、ラセミ体（）
から（Ｓ）−（）を生成させるムコール属もしく
はリゾプス属に属する微生物またはこれらの微生
物から得られる、ラセミ体（）から（Ｓ）−
（）を生成させる酵素又は動物臓器由来のラセ
ミ体（）から（Ｓ）−（）を生成させる酵素を
作用させると、ラセミ体（）を不斉的に加水分
解し、（Ｓ）−（）を生成させ、次いで水解物
（Ｓ）−（）と未反応物（Ｒ）−（）を有機溶媒
で抽出分離するか、或いは更にカラムクロマトグ
ラフイー操作を組み合せることにより（Ｓ）−
（）と（Ｒ）−（）を分離し採取する、或いは
更に採取した（Ｒ）−（）をアルカリ加水分解
し、（Ｒ）−（）を生成し採取することを見出し、
本発明を完成した。 （課題を解決するための手段） 本発明の基質として用いられる、一般式 で表わされる２−オキサゾリジノン誘導体の合成
は、下記ルートで容易に合成できる。 置換基R₁は水素或いは置換又は未置換アリル
基であり、アリル基としては、例えばベンゼン、
ピリジン、ピリミジンの如き単環式化合物の基が
挙げられる。又アリル基はすべて任意にいずれか
の位置において、以下に限定されるものではない
が、例えばハロゲン基、ニトロ基、C₁〜C₃のア
ルキル基、アルコキシ基、水酸基、メルカプト
基、シアノ基の１種又はそれ以上の置換基で置換
されうる。一方、置換基R₂は置換又は未置換ア
ルキル基であり、アルキル基としては例えばC₁
〜C₁₇のアルキル基が挙げられる。又アルキル基
は例えばハロゲン基、アルコシキ基、水酸基、フ
エニル基等の１種又はそれ以上の置換基で置換さ
れうる。 ラセミ体（）を不斉的に加水分解し、（Ｓ）−
（）を生成させる立体選択的エステラーゼ活性
を有する微生物としては、ムコール属或いはリゾ
プス属に属する微生物があり、更に詳しくはムコ
ール・ジヤバニクス（Mucor Javanicus）IFO
4572，ムコール・プシルス（Mucor pusillus）
IFO 9744，リゾプス・ジヤポニクス（Rhizopus
japonicus）IFO 4780やリゾプス・デレマー
（Rhizopus delemar）IFO 4730がある。 これら微生物の栄養源は、通常、資化しうる有
機及び無機の炭素源、窒素源、ビタミン及びミネ
ラルを適宜配合したものを用い、培養温度は20〜
40℃、PH４〜８の範囲が用いられる。又、通気攪
拌により微生物の生育を促進させることもでき
る。化合物（）の不斉水解反応においては、培
養の開始と同時に培地中に基質即ち化合物（）
を添加し、培養と平行して加水分解を行う方法、
或いは前記の様にして培養液菌体を化合物（）
と接触させ加水分解を行う方法がある。望ましく
は、菌体を遠心分離等で濃縮後、高濃度菌体液と
し、このものに化合物（）を添加する方法が反
応後の生産物回収の立場から望ましい。一方、該
微生物菌体を破砕後、硫安分画やアセトン処理し
て得られる粗酵素或いは更にカラムクロマトグラ
フイー操作を行い、得られる精製酵素が使用でき
る。又、市販されているリパーゼは、例えばリパ
ーゼＭ−AP10（起源；ムコール属、天野製薬製）、
リパーゼ「サイケン」100（起源；リゾプス・ジヤ
ポニクス、大阪細菌研）、リパーゼ（起源；リゾ
プス・デレマー、生化学工業）、ステアプシン
（豚膵臓）、バンクレアチン（豚膵臓）等を用いる
ことができる。 加水分解反応は、基質のラセミ体（）を濃度
２〜50％（ｗ／ｖ）の範囲で添加し、酵素を適
量、例えばＥ／Ｓ＝１／20〜１／5000量加え、温
度10〜40℃の範囲で反応を行い、ガスクロ或いは
液クロにより加水分解の反応の経時変化を追い、
反応が（）と（）のモル比50％ずつになつた
時点で反応を終了させれば良い。また加水分解を
行う際のPH範囲は４〜8.5であれば良いが、加水
分解反応が進むに従い反応液中のPHが酸性側に傾
くので、中和剤例えばNaOH溶液等で最適PHを
保持するのが望ましい。更に上記記載の不斉水解
反応を、例えば微生物菌体或いは酵素を固定化さ
せることにより繰り返し行なうこともできる。 化合物（）の水に対する溶解度は一般に低い
が、攪拌すれば本反応にとつて支障とはならな
い。又、例えばアセトン、メタノール等の有機溶
媒や界面活性剤等を反応に支障とならない程度加
えても良い。 水解物（Ｓ）−（）と未反応物（Ｒ）−（）を
分離する方法としては、疎水性の有機溶剤、例え
ばヘキサン、シクロヘキサン、酢酸エチル、塩化
メチレン又はトルエン等で疎水性の未反応（Ｒ）
−（）のみを抽出し、親水性の水解物（Ｓ）−
（）と分離することができる。又、置換基R₂の
炭素鎖が短い場合、（Ｒ）−（）と（Ｓ）−（）
の化学的性質に顕著な差がない為、抽出操作のみ
では高純度の（Ｒ）−（）が得られない。その場
合には、例えばシリカゲルカラムクロマトグラフ
イー操作等を併せて行えば容易に分離し、高純度
の（Ｒ）−（）を採取することができる。更に、
（Ｒ）−（）を室温下、PH10〜13.5の範囲で数時
間アルカリ加水分解を行うか、或いは（Ｒ）−
（）を加水分解する能力を有する酵素、例えば
リポプロテインリパーゼを作用させて加水分解を
行えば（Ｒ）−（）が生成し、PHを7.0の付近に
調整後、減圧濃縮し、有機溶剤例えばアセトン、
メタノール或いは酢酸エチル等で溶解し、再濃縮
するか、或いは一旦有機溶剤例えば酢酸エチル或
いは塩化メチレン等で転溶後、減圧濃縮すれば
（Ｒ）−（）を採取することができる。なお、抽
出分離の際、水層側に残つた（Ｓ）−（）も上記
と同様の操作を行えば容易に採取することができ
る。 （実施例及び発明の効果） 以下、実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。 実施例 １ 100mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）にステア
プシン0.5ｇ及び基質（Ｒ，Ｓ）−５−ブタノイロ
キシメチル−オキサゾリジン−２−オン−１

〔培地組成〕

グルコース４％、イーストエキス0.3％、肉エ
キス0.3％、プペトン0.3％、リン酸二アンモニウ
ム0.2％、リン酸一カリウム0.1％（PH7.0） これとは別に同じ組成の培地にて前培養をした
ムコール・ジヤバニクスIFO 4572の種菌液10ml
を前培養培地に接種し、30℃、24時間振とうを行
つた。合計５本培養し、培養液計２を得た。こ
の培養液を遠心分離し、菌体を集めた。この菌体
を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）200mlに懸濁し、
基質（Ｒ，Ｓ）−５−ブタノイロキシメチル−３
−フエニル−オキサゾリジン−２−オン−４を
13.15ｇ（0.05モル）添加した。これを500ml容器
内で攪拌下、1N NaOH溶液でPHを7.0に調整し
ながら、30℃、18時間反応させた。反応後、遠心
分離して得た上清を各200mlの酢酸エチルで４回
抽出分離を行い、以下実施例４に準じて同様の操
作を行い、表１に示す結果を得た。 実施例 ７〜９ 菌株を変えて、実施例６に準じて菌体の不斉水
解反応及び抽出精製を行い、表１に示す結果を得
た。 実施例 10 リゾプス・デレマーIFO 4730を用いて実施例
６と同様にして得た培養液２を遠心分離し、菌
体を集めた。この菌体を0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）200mlに懸濁し、氷冷しながらブラウンホモ
ジナイザーで菌体破砕し、遠心分離して無細菌抽
出酵素を得た。この酵素液に基質（Ｒ，Ｓ）−５
−ブタノイロキシメチル−３−フエニル−オキサ
ゾリジン−２−オン−４を13.15ｇ（0.05モル）
添加し、1N NaOH溶液でPHを7.0に調整しなが
ら攪拌下、30℃、48時間不斉水解反応を行つた。
以下、実施例４に準じて抽出精製を行い、表１に
示す結果を得た。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式（Ｒ，Ｓ）−（） （式中、R₁は水素、あるいは置換又は未置換
   アリル（Ar）基、R₂は置換又は未置換アルキル
   基である。） で表される（Ｒ，Ｓ）−５−アシロキシメチル−
   オキサゾリジン−２−オンを不斉的に加水分解し
   て、一般式（Ｓ）−（） （式中、R₁は前記（Ｒ，Ｓ）−（）と同じ） で表される（Ｓ）−５−ヒドロキシメチル−オキ
   サゾリジン−２−オンを生成させる立体選択的エ
   ステラーゼ活性を有するムコール属もしくはリゾ
   プス属に属する微生物またはこれらの微生物から
   得られる、（Ｒ，Ｓ）−５−アシロキシメチル−オ
   キサゾリジン−２−オンから（Ｓ）−５−ヒドロ
   キシメチル−オキサゾリジン−２−オンを生成さ
   せる立体選択的エステラーゼ活性を有する酵素ま
   たはステアプシンもしくはパンクレアチンを作用
   させることにより、ラセミ体の（Ｒ，Ｓ）−（）
   を（Ｓ）−（）と一般式（Ｒ）−（） （式中、R₁，R₂は前記（Ｒ，Ｓ）−（）と同
   じ） で表される未反応の光学活性（Ｒ）−５−アシロ
   キシメチル−オキサゾリジン−２−オンとにし、
   それぞれの光学活性体を分離、採取することを特
   徴とする光学活性（Ｒ）−５−アシロキシメチル
   −オキサゾリジン−２−オンの製造方法。 ２ ムコール属もしくはリゾプス属に属する微生
   物から得られる、（Ｒ，Ｓ）−５−アシロキシメチ
   ル−オキサゾリジン−２−オンから（Ｓ）−５−
   ヒドロキシメチル−オキサゾリジン−２−オンを
   生成させる立体選択的エステラーゼ活性を有する
   酵素がリパーゼである特許請求の範囲第１項記載
   の製造方法。 ３ 一般式（Ｒ，Ｓ）−（） （式中、R₁は水素、あるいは置換又は未置換
   アリル（Ar）基、R₂は置換又は未置換アルキル
   基である。） で表される（Ｒ，Ｓ）−５−アシロキシメチル−
   オキサゾリジン−２−オンを不斉的に加水分解し
   て、一般式（Ｓ）−（） （式中、R₁は前記（Ｒ，Ｓ）−（）と同じ） で表される（Ｓ）−５−ヒドロキシメチル−オキ
   サゾリジン−２−オンを生成させる立体選択的エ
   ステラーゼ活性を有するムコール属もしくはリゾ
   プス属に属する微生物またはこれらの微生物から
   得られる、（Ｒ，Ｓ）−５−アシロキシメチル−オ
   キサゾリジン−２−オンから（Ｓ）−５−ヒドロ
   キシメチル−オキサゾリジン−２−オンを生成さ
   せる立体選択的エステラーゼ活性を有する酵素ま
   たはステアプシンもしくはパンクレアチンを作用
   させることにより、ラセミ体の（Ｒ，Ｓ）−（）
   を（Ｓ）−（）と一般式（Ｒ）−（） （式中、R₁，R₂は前記（Ｒ，Ｓ）−（）と同
   じ） で表される未反応の光学活性（Ｒ）−５−アシロ
   キシメチル−オキサゾリジン−２−オンとし、
   （Ｒ）−（）を分離、採取した後、さらに（Ｒ）−
   （）を加水分解することを特徴とする一般式
   （Ｒ）−（） （式中、R₁は前記（Ｒ，Ｓ）−（）と同じ） で表される光学活性（Ｒ）−５−ヒドロキシメチ
   ル−オキサゾリジン−２−オンの製造方法。 ４ ムコール属もしくはリゾプス属に属する微生
   物から得られる、（Ｒ，Ｓ）−５−アシロキシメチ
   ル−オキサゾリジン−２−オンから（Ｓ）−５−
   ヒドロキシメチル−オキサゾリジン−２−オンを
   生成させる立体選択的エステラーゼ活性を有する
   酵素がリパーゼである特許請求の範囲第３項記載
   の製造方法。