JPH0426839B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】

本発明は一般式 （式中Ｘは低級アルキル基、Ｙは置換又は未置
換アルキル基、アルケニル基或いは置換又は未置
換芳香族炭化水素基）で表わされるオキサゾリジ
ノン誘導体に、化合物〔〕を不斉的に加水分解
して、一般式 （式中、Ｘは前記と同じ）で表わされる光学活性
（＋）−３−アルキル置換−５−ヒドロキシメチル
オキサゾリジン−２−オンを生成させる立体選択
的エステラーゼ活性を有するブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属に属する微生物又は
該微生物より得られた酵素を作用させる事によ
り、化合物〔〕を生成させ、これを採取するこ
とを特徴とする光学活性（＋）−３−アルキル置
換−５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−２−
オンを製造する方法に関する。 化合物〔〕は光学活性なβ−受容体遮断薬の
重要な中間体である。 従来、光学活性なβ−受容体遮断薬の製法とし
ては、例えば下記の方法が知られている。 １ β−受容体遮断薬ラセミ体を光学分割する方
法。 （文献、特開昭55−149233、米国特許第
3655663号） ２ ３−アルキル置換アミノ−１，２−プロパン
ジオールラセミ体を光学分割し、この活性体か
ら誘導していく方法。 （文献、特開昭51−118711） ３ Ｄ−マンニトールよりＤ−グルセロールアセ
トニドを経て誘導していく方法。 （文献、ジヤーナル・オブ・オーガニツク・ケ
ミストリー（J.O.C.）41（19），3121−3124
（1976）エル・エム・ワインストツク（L.M.
Weinstock）ら；ケミカル アンド フアーマ
シユテカル ブレチン（Chmical＆
Pharmaceutical Bulletin）29（12）3593−
3600（1981）津田喜典ら） しかしながら、１は最終製品ラセミ体を光学分
割する点でコスト的に不利である。 ２は３−アルキル置換アミノ−１，２−プロパ
ンジオールが吸湿性であり、Ｍ旦吸湿すると結晶
性が悪く、光学分割法では、容易に収率良く高純
度の光学活性体を得られない。 又、３はＤ−マンニトールからＤ−グリセロー
ルアセトニドに誘導する際、多量の四酢酸鉛を必
要とし、工業的規模で行うには廃棄物処理の点で
問題がある。 以上挙げたいずれの方法も一長一短があつた。
ところで、光学活性なβ−受容体遮断薬の合理的
な合成経路として下記のような経路が知られてい
る。 （ケミカル アンドフアーマシユテカルブレチ
ン（Chemiical＆Pharmaceutical Bulletin）29
（12）3593−3600（1981）津田喜典ら；カナダ特許
第965787号） 光学活性β−受容体遮断薬 （式中、Ｘは前記と同じ）……反応経路〔Ａ〕 そこで本発明者らは、化合物〔〕に着目し、
化合物〔〕の簡便な新規製造法の開発を目的と
して研究に着手した。化合物〔〕の５位にヒド
ロキシメチル基があることに着目し、化合物
〔〕のラセミ体をエステル化させ、化合物〔〕
を合成し、この化合物〔〕を不斉的に加水分解
するエステラーゼ活性を有する微生物又は酵素を
作用させれば、化合物〔〕が簡単に得られるの
ではないかと考え、そのスクリーニング実験を試
みた。 その結果、化合物〔〕の不斉的に加水分解し
化合物〔〕を生成させる立体選択的エステラー
ゼ活性を有するブレビバクテリウム属又はコリネ
バクテリウム属に属する微生物及び該微生物より
得られた酵素を見いし、更に簡単な分離操作によ
つて目的物である化合物〔〕を採取できること
が判明し、本発明を完成させるに至つた。 即ち、本発明は化合物〔(オ)〕を不斉的に加水分
解して、化合物〔〕を生成させる立体選択的エ
ステラーゼ活性を有する微生物又は該微生物より
得られた酵素を作用せる事により、化合物〔〕
を生成させ、次いで化合物〔〕と生成した有機
酸及び未反応の化合物〔′〕を有機溶媒で抽出
分離する方法或いは反応液を一旦有機溶媒で転溶
するか、又はそのまま反応液をカラムクロマトグ
ラフイ−処理するか、又は分溜操作を行い分離す
る方法等により化合物〔〕を生成有機酸及び未
反応の化合物（′〕とから分離し、化合物〔
(ウ)を採取することを特徴とする光学活性（＋）−
３−アルキル置−５−ヒドロキシメチルオキサゾ
リジン−２−オンの新規製造方法に関するもので
ある。 本製造方法の発明により、従来法と比べ高純度
でかつ安価な光学活性β−受容体遮断薬の合成が
可能になつた。 本発明の基質として用いられる一般式 で表わされるオキサゾリジノン誘導体における置
換基Ｘとしては、低級アルキル基が用いられる。
例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソ
プロピル基、ブチル基又はｔ−ブチル基等が挙げ
られるが、中でもイソプロピル基或いはｔ−ブチ
ル基が好ましい。一方置換基Ｙとしては、置換又
は未置換アルキル基、アルケニル基或いは置換又
は未置換芳香族炭化水素基が挙げられる。更に詳
しくは、例えばメチル基、エチル基、プロピル
基、又はブチル基の如き未置換アルキル基；例え
ばクロロメチル基、ジクロロメチル基、トリフル
オロメチル基又はβ，β，β−トリクロロエトキ
シメチル基の如きハロゲン基、水酸基或いはアル
コキシ基で置換された置換アルキル基；例えばア
リル（Allyl）基の如きアルケニル基；例えばフ
エニル基、ｐ−メチルフエニル基、ｐ−クロロフ
エニル基又はｐ−メトキシフエニル基の如き未置
換又はアルキル基、ハロゲン基、水酸基或いはア
ルコキシ基で置換されたアリール（Aryl）基；
例えば、ベンジル基、ｐ−メチルベンジル基、ｐ
−クロロベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基
又はｐ−メトキシベンジル基の如き未置換又はア
ルキル基、ハロゲン基、水酸基、或いはアルコキ
シ基で置換されたアラルキル基を例示することが
できる。化合物〔〕を不斉的に加水分解し、化
合物〔〕を生成させる立体選択的エステラーゼ
活性を有する微生物は次の様なスクリーニングを
行えば容易に見い出すことができる。例えばその
具体的一例として基質に３−ｔ−ブチル−５−ア
セトキシメチルオキサゾリジン−２−オンを用い
る場合、先づ菌が生育可能な栄養培地で、10ml／
大型チユーブ中、25〜35℃、１〜２日間、振とう
培養により菌体培養を行う。この培養液に３−ｔ
−ブチル−５−アセトキシメチルオキサゾリジン
−２−オン（ラセミ体）を２％（ｗ／ｖ）添加
し、更に20〜35℃、PHをNaOH溶液で５〜７に
調整しながら、１〜３日間反応させる。そしてガ
スクロマトグラフイ−（充填剤、Silicone OV−
17、1m×３％カラム、温度180℃）により、各反
応液の経時変価をとり、３−ｔ−ブチル−５−ヒ
ドロキシメチルオキサゾリジン−２−オンが約50
％生成したところで、反応が極端に遅くなる菌株
を１次選抜する。更にスケールを400mlにかえて、
前記同様の培養及び加水分解反応を行い、終了後
酢酸エチル400mlで抽出濃縮し、この濃縮液をシ
リカゲルカラムに負荷し、ヘキサン／アセトン混
液で未反応の３−ｔ−ブチル−５−アセトキシメ
チルオキサゾリジン−２−オンを溶出分離し、３
−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシメチルオキサゾリ
ジン−２−オン画分を濃縮し、ヘキサンを徐々に
添加していくと結晶が析出してくる。 この結晶物を真空乾燥後、その比旋光度を測定
すれば立体選択的エステラーゼを有する微生物か
否か容易に判断できる。 立体選択的加水分解能を有するエステラーゼは
めずらしくないがβ−受容体遮断薬の重要な中間
体である（＋）３−アルキル置換−５−ヒドロキ
シメチルオキサゾリジン−２−オンの生産に着目
し、スクリーニングを実施し、かつ見い出したと
ころに本発明の特徴がある。 更に、前記と同様のスクリーニングを実施すれ
ば、化合物〔〕を不斉的に加水分解する立体選
択的エステラーゼ活性を有する微生物を見い出す
ことができる。化合物〔〕を不斉的に加水分解
して化合物〔〕を生成させる立体選択択的エス
テラーゼ活性を有する微生物としては、細菌酵
母、かび又は放線菌等があるが、実施例に示す通
り、ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
ム属に属する微生物が明らかに効果を発揮してお
り、特にブレビバクテリウム・プロトフオルミエ
（Brevibacterium Protophorimae）IFO12128；
コリネバクテリウム・パウロメタボルム
（Corynebacterium paurometabolum）IFO
12160がある。 これら微生物の培養液は通常資化しうる有機及
び無機の炭素源、窒素源及びビタミン・ミネラル
等を適宜配合したものを用い、培養温度は20〜40
℃、PH３〜11、好ましくはPH４〜８の範囲が用い
られる。 又通気撹拌により、微生物の生育を促進させる
こともできる。化合物〔〕の不斉加水分解反応
においては、培養の開始時に培地中に基質即ち化
合物〔〕を添加し、培養と並行して加水分解を
行う方法、或いは前記のようにして培養液菌体を
化合物〔〕と接触させ、加水分解を行う方法と
がある。 望ましくは、菌体を遠心分離等で濃縮後、高濃
度菌体液とし、このものに化合物〔〕を添加す
る方法が反応後の生産物の回収の立場から好まし
い。一方、前記微生物より得られた酵素として
は、例えば、前記微生物の培養液を遠心分離して
菌体を得、この菌体をリン酸緩衝液で均一になる
よう懸濁させ、次いで氷冷下、ブラウンホモジナ
イザー等で破砕し、遠心分離して得た無細胞抽出
酵素液か、或いは更にこの無細胞抽出液を30〜70
％の硫安分画処理を行い、塩析した画分をリン酸
緩衝液に溶解させ、一昼夜、冷所で透析処理して
得た部分精製酵素液等が用いられ、これら酵素液
に化合物〔〕を接触させ、加水分解反応を行う
こともできる。更にこれら微生物又は該微生物よ
り得られた酵素を用いて、例えば固定化させるこ
とにより、不斉加水分解反応を繰り返し行うこと
もできる。 化合物〔〕の反応液中での濃度は0.1％から
30％程度の高濃度まで用いることができる。 又、化合物〔〕の水に対する溶解度は、一般
に低いが撹拌により混合を行うことにより、菌体
又は酵素との接触を充分保つようにすれば、本反
応にとつては、支障とはならない。又、アセトン
等の親水性溶剤や界面活性剤等を反応に支障とな
らない程度加えても良い。 加水分解反応を行う際のPHは４〜８の範囲が好
ましい。化合物〔〕を高濃度で反応させる場
合、加水分解された有機酸が次第に反応液中に蓄
積し、PHが低下してくるので、適当な中和剤例え
ばNaOH溶液等で最適PHを保持するのが好まし
い。 加水分解反応は通常10〜50℃の範囲が用いられ
るが、使用する菌株又は酵素に適した温度が採用
される。 化合物〔〕を生成する有機酸及び未反応の化
合物〔′〕とから単離し、採取する方法として
は一般的精製方法を用いれば良い。 例えば、反応液より遠心分離処理によつて、菌
体等の不溶性物質を除去した後、一般によく使用
される有機溶媒、ヘキサン、シクロヘキサン、エ
ーテル、酢酸ブチル、クロロホルム、ジクロロメ
タン、ベンゼン又はトルエン等で未反応の化合物
〔′〕を抽出除去し、更に目的物即ち化合物
〔〕を含んだ水溶液を減圧濃縮した後、化合物
〔〕が微溶であるヘキサン、シクロヘキサン又
はエーテル等の有機溶媒を徐々に添加すると化合
物〔〕が析出しだし、採取することができる。 又、化合物〔〕の種類例えば置換基Ｙがメチ
ル基、エチル基又はプロピル基等の低級アルキル
基の場合、前記有機溶媒抽出分離操作では完全に
分離しがたい。この場合には、前記と同様不溶性
物質を除去した後、減圧濃縮し、そのままカラム
クロマトグラフイ−処理を行うか、或いは一旦有
機溶媒例えば酢酸エチル等で転溶、次いで減圧濃
縮し、カラムクロマトグラフイ−処理を行えば簡
単に分離し、化合物〔〕を採取することができ
る。カラムクロマトグラフイ−としては通常よく
使われるシリカゲル、アルミナ又はフロリジル等
の担体を用いることができる。一方、又、化合物
〔〕の種類により化合物〔′〕と化合物〔〕
の沸点に差がある場合には、分溜操作により、容
易に分離し、化合物〔〕を採取することもでき
る。 以下、実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例のみに限定されるも
のではない。 実施例 １ 下記の組成からなる栄養液体培地を調製し、２
坂口フラスコに400mlずつ分注後、120℃、15分
殺菌した。 〔培地組成〕グルコース４％、イーストエキス
0.3％、肉エキス0.3％、ペプトン0.3％、リン酸二
アンモニウム0.2％、リン酸一カリウム0.1％（PH
7.0）これとは別に同じ組成の培地にて、前培養
をしたブレビバクテリウム・プロトフオルミエ
IFO 12128の種菌液10mlを前記培養培地に接種
し、30℃、24時間振とう培養を行つた。合計10本
培養し、培養液計４を得た。これから遠心分離
によつて菌体を集めた。この菌体をＭ／10リン酸
緩衝液（PH7.0）400mlに懸濁し、基質３−ｔ−ブ
チル−５−アセトキシメチルオキサゾリジン−２
−オン

【式】40gを添加 した。これを１容器内で撹拌下PHをNaOH溶
液で５〜７に調整しながら、30℃、18時間反応さ
せた。反応後、遠心分離して得た上清を酢酸エチ
ル400mlで２回抽出し、減圧濃縮した。この濃縮
物をシリカゲルカラムに負荷し、ヘキサン／アセ
トン（３：１）混液で先づ未反応物３−ｔ−ブチ
ル−５−アセトキシメチルオキサゾリジン−２−
オンを溶出させ、次いでヘキサン／アセトン
（１：１）混液で溶出される３−ｔ−ブチル−５
−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−２−オン画
分を集め、減圧濃縮し、溶媒を除去すると無色の
油状物15.5gが得られた。これを一旦50℃に加温
しながら、約20mlの酢酸エチルを加える。次いで
ヘキサンを徐々に加えていくと、無色の結晶が析
出した。これを集めて真空乾燥したところ、〔α〕
¹⁶ _D＋40.6゜（Ｃ，1.0、クロロホルム）の比旋光度を
有する（＋）−３−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ
メチルオキサゾリジン−２−オン13.6gを得た。
NMR測定値は以下の通りであつた。 NMR（90MHz、CDCl₃）；δ（ppm） 1.4（9H，Ｓ，Ｃ（CH₃）₃），3.4−3.95（5H，−
CH₂N−，−CH₂O−，−OH）4.3〜4.6（1H，
ｍ，CH₂CH（Ｏ−）CH₂−） 実施例 ２〜５ 菌株及び基質をかえて、実施例１と同様の操作
を行い、表１の結果を得た。

【表】 実施例 ６ 下記の組成からなる栄養液体培地を調製し、２
坂口フラスコに400mlずつ分注後、120℃15分殺
菌した。 〔培地組成〕グルコール４％、イーストエキス
0.3％、肉エキス0.3％、ペプトン0.3％、リン酸二
アンモニウム0.2％、リン酸一カリウム0.1％、
（PH7.0）これとは別に同じ組成の培地にて、前培
養をしたブレビバクテリウム・プロトフオルミエ
IFO 12128の種菌液10mlを前記培養培地に接種
し、30℃、24時間振とう培養を行つた。合計10本
培養し、培養液計４を得た。これから遠心分離
によつて菌体を集めた。この菌体をＭ／10リン酸
緩衝液（PH7.0）400mlに懸濁し、基質３−ｔ−ブ
チル−５−ベンゾイロキシメチルオキサゾリジン
−２−オン

【式】40gを添 加した。これを１容器内で撹拌下、PH円
NaOH溶液で５〜７に調整しながら、30℃、40
時間反応させた。 反応後、遠心分離して得た上清をトルエン400
mlで未反応物３−ｔ−ブチル−５−ベンゾイロキ
シメチルオキサゾリジン−２−オンを抽出除去
し、目的物即ち、３−ｔ−ブチル−５−ヒドロキ
シメチルオキサゾリジン−２−オンを含んだ水溶
液を60℃、減圧濃縮した。この濃縮物に約100ml
の酢酸エチルを加え、溶解し、不溶物を過し再
び50℃、減圧濃縮し、黄色味を帯びた油状物
10.8gが得られた。これを一旦50℃に加温しなが
ら約20mlの酢酸エチルを加え溶解させる。次にヘ
キサンを徐々に加えていくと、無色の結晶が析出
した。これを集めて真空乾燥したところ、〔α〕¹⁶ _D
＋38.3゜（Ｃ，1.0、クロロホルム）の比旋光度を有
する（＋）−３−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシメ
チルオキサゾリジン−２−オン8.1gを得た。 実施例 ７〜15 菌株及び基質をかえて、実施例６と同様の操作
を行い、表２の結果を得た。

【表】 ＊表１と同じ
実施例 16 ブレビバクテリウム・プロトフオルミエIFO
12128を用いて前記実施例１と同様の培養を行い、
培養液400mlを得た。この培養液に基質３−ｔ−
ブチル−５−アセトキシメチルオキサゾリジン−
２−オン

【式】4.0gを添 加した。 これを１容器内で、通気撹拌下PHをNaOH
溶液で５〜７に調整しながら、30℃、18時間反応
させた。反応液は以下実施例１と同様の精製操作
を行い、〔α〕¹⁶ _D＋39.9゜（Ｃ，1.0，クロロホルム）
の比旋光度を有する（＋）−３−ｔ−ブチル−５
−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−２−オン
1.05gを得た。 実施例 17〜20 菌株及び基質をかえて、実施例16と同様の操作
を行い、表３の結果を得た。

【表】 ＊表１と同じ
実施例 21 グルコース４％、イーストエキス0.3％、肉エ
キス0.3％、ペプトン0.3％、リン酸二アンモニウ
ム0.2％、リン酸一カリウム0.1％（PH7.0）含有す
る培地10mlにブレビバクテリウム・プロトフオル
ミエIFO 12128を植菌し、30℃、24時間振とう前
培養を行つた。次に前記培養培地400mlに前培養
液を接種し、同時に基質３−ｔ−ブチル−５−ア
セトキシメチルオキサゾリジン−２−オン

【式】4.0gを添加し、30 ℃、48時間培養及び反応を並行して行つた。 以下、実施例１と同様の精製操作を行い、〔α〕
¹⁶ _D＋35.8゜（Ｃ，1.0，クロロホルム）の比旋光度を
有する（＋）−３−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシ
メチルオキサゾリジン−２−オン0.81gを得た。 実施例 22〜24 菌株及び基質をかえて、実施例21と同様の操作
を行い、表４の結果を得た。

【表】 ＊表１と同じ
実施例 25 ブレビバクテリウム・プロトフオルミエIFO
12128を用いて前記実施例‘と同様にして得た培
養液４を遠心分離し、菌体を集めた。この菌体
とＭ／10リン酸緩液（PH7.0）400mlに懸濁し、氷
冷しながらブラウンホモジナイザーで菌体破砕
し、遠心分離して無細胞抽出酵素液を得た。この
酵素液に基質３−ｔ−ブチル−５−アセトキシメ
チルオキサゾリジン−２−オンを4.0g添加し、撹
拌下PHをNaOH溶液で５〜７に調整しながら、
30℃、18時間反応を行つた。この反応液を減圧濃
縮し、シリカゲルカラムに負荷し、以下実施例１
と同様の操作を行い、〔α〕¹⁶ _D＋38.6゜（Ｃ，1.0、ク
ロロホルム）の比旋光度を有する（＋）−３−ｔ
−ブチル−５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン
−２−オン1.12gを得た。 実施例 26〜28 菌株及び基質をかえて、前記実施例25と同様の
操作を行い、表５の結果を得た。

【表】 ＊表１と同じ
実施例 29 ブレビバクテリウム・プロトフオルミエIFO
12128を用いて前記実施例１と同様にして得た培
養液４を遠心分離し、菌株を集めた。この菌体
をＭ／10リン酸緩衝液（PH7.0）400mlに懸濁し、
氷冷しながらブラウンホモジナイザーで破砕し、
遠心分離して無細胞抽出液を得た。次いで硫安分
画を行い、30〜70％濃度で塩析した画分をＭ／10
リン酸緩衝液（PH7.0）40mlに溶解させ、一昼夜
冷所で透析して部分精製した酵素液を得た。この
酵素液に基質３−ｔ−ブチル−５−アセトキシメ
チルオキサゾリジン−２−オンを4.0g添加し、撹
拌下PHをNaOH溶液で５〜７に調整しながら30
℃、18時間反応を行つた。 反応液は以下実施例25と同様の操作を行い、
〔α〕¹⁶ _D＋38.6゜（Ｃ，1.0，クロロホルム）の比旋光
度を有する（＋）−３−ｔ−ブチル−５−ヒドロ
キシメチルオキサゾリジン−２−オン1.12gを得
た。 実施例 30〜32 菌株及び基質をかえて前記実施例29と同様の操
作を行い、表６の結果を得た。

【表】 ＊表１と同じ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中、Ｘは低級アルキル基、Ｙは置換又は未
   置換アルキル基、アルケニル基或いは置換又は未
   置換芳香族炭化水素基）で表わされるオキサゾリ
   ジノン誘導体に、化合物［］を不斉的に加水分
   解して一般式 （式中、Ｘは前記と同じ）で表わされる光学活
   性（＋）−３−アルキル置換−５−ヒドロキシメ
   チルオキサゾリジン−２−オンを生成させる立体
   選択的エステラーゼ活性を有するブレビバクテリ
   ウム属又はコリネバクテリウム属に属する微生物
   又は該微生物より得られた酵素を作用させる事に
   より、化合物［］を生成させ、これを採取する
   ことを特徴とする光学活性（＋）−３−アルキル
   置換−５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−２
   −オンの製造方法。 ２ 化合物［］の式中Ｘがｔ−ブチル基又はイ
   ソプロピル基である特許請求の範囲第１項記載の
   製造方法。 ３ 化合物［］の式中Ｙの置換又は未置換芳香
   族炭化水素基が、アリール基（Aryl）、置換アリ
   ール基（Aryl）、アラルキル基又は置換アラルキ
   ル基である特許請求の範囲第１項記載の製造方
   法。 ４ 微生物がブレビバクテリウム・プロトフオル
   ミエ又はコリネバクテリウム・パウロメタボルム
   である特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ５ 酵素が微生物菌体を破砕処理して得た無細胞
   抽出液の酵素、或いは更にこの無細胞抽出液を硫
   安分画処理して得た部分精製された酵素である特
   許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ６ 化合物［］を添加した培地で、PH４〜８の
   範囲で微生物を培養し、作用させる特許請求の範
   囲第１項記載の製造方法。 ７ 微生物を栄養培地で培養して得た培養液又は
   この培養液から、微生物菌体を分離して、菌体懸
   濁液を調製し、それを化合物［］に作用させる
   特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ８ 微生物の培養をPH３〜11の範囲で行い、培養
   液又は菌体懸濁液と化合物［］との反応をPH４
   〜８の範囲で行う特許請求の範囲第７項記載の製
   造方法。 ９ 酵素と化合物［］との反応を10〜50℃、PH
   ４〜８の範囲で行う特許請求の範囲第１項又は第
   ５項記載の製造方法。 １０ 化合物［］を採取する方法において、化
   合物［］と生成する有機酸及び未反応の一般式 （式中、Ｘ及びＹは前記と同じ）で表わされる
   オキサゾリジノン誘導体を分離する特許請求の範
   囲第１項記載の製造方法。 １１ 化合物［］と生成する有機酸及び未反応
   の化合物［′］を分離する方法において、有機
   溶媒で抽出分離する特許請求の範囲第１０項記載
   の製造方法。 １２ 化合物［］と生成する有機酸及び未反応
   の化合物［′］を分離する方法において、反応
   液を一旦有機溶媒で転溶するか、又はそのまま反
   応液をカラムクロマトグラフイ−処理で分離する
   特許請求の範囲第１項又は第１０項記載の製造方
   法。 １３ 化合物［］と生成する有機酸及び未反応
   の化合物［′］を分離する方法において、反応
   液を一旦有機溶媒で転溶するか、又はそのまま反
   応液を分溜操作により分離する特許請求の範囲第
   １項又は第１０項記載の製造方法。