JPH0353918B2

JPH0353918B2 -

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Publication number: JPH0353918B2
Application number: JP59098055A
Authority: JP
Priority date: 1984-05-15
Filing date: 1984-05-15
Publication date: 1991-08-16
Also published as: JPS60241893A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は、一般式（式中、R₁は水素、或いは置換又は未置換アリ
ル（Ar）基、R₂は置換又は未置換アルキル基）
で表わされる（Ｒ，Ｓ）−５−アシロキシメチル
−オキサゾリジン−２−オン（）を不斉的に加
水分解して、（R₁は前記に同じ）の（Ｒ）−５−ヒドロキシメ
チル−オキサゾリジン−２−オンを生成させる立
体選択的エステラーゼ活性を有する微生物或いは
酸素を作用させることにより、ラセミ体（）か
ら水解物（）及び未反応物である。（R₁，R₂は前記に同じ）の（Ｓ）−５−アシロキ
シメチル−オキサゾリジン−２−オンに変えて、
各々を分離採取し、また更に（Ｓ）−（）を加水
分解して（R₁は前記に同じ）の（Ｓ）−５−ヒドロキシメ
チル−オキサゾリジン−２−オンを生成させ、採
取することを特徴とするオキサゾリジノン誘導体
の光学分割方法に関する。これら光学活性な２−オキサゾリジノン化合物
は医薬品或いは医薬品の原料となる。例えばR₁
が水素基である（Ｓ）−（）は光学活性なβ−受
容体遮断薬の原料として利用できる。（従来の技術）これら光学活性な２−オキサゾリジノン類の製
造については、３−アリルアミノ−１，２−プロ
パンジオールを光学分割剤を用いて分割後、（Ｒ）
−５ヒドロキシメチル−３−アリル−オキサゾリ
ジン−２−オンに誘導する方法（特開昭58−
103376）が知られている。微生物を利用した分割
法については、本発明者らが、先に（Ｒ，Ｓ）−
５−アシロキシメチル−３−アルキル置換−オキ
サゾリジン−２−オンラセミ体を微生物菌体又は
酵素を作用させて不斉的に加水分解し、対応する
光学活性体を取得する方法を見い出している（特
開昭59−31692、同59−31693）。（発明が解決しようとする課題）本発明者らはＮ置換基が水素やアリル基の場合
も同様に不斉水解する能力を有する微生物菌体又
は酸素が見つかるのではないかと考え、スクリー
ニング実験を試みた。その結果、シユードモナス
（Pseudomonas）属又はアクロモバクター
（Achromobacter）属に属する微生物或いは該微
生物より得られる酸素を作用させると、ラセミ体
（）を不斉的に加水分解し、（Ｒ）−（）を生成
させる、次いで水解物（Ｒ）−（）と未反応物
（Ｓ）−（）を有機溶媒で抽出分離するか、或い
は更にカラムクロマトグラフイー操作を組み合せ
ることにより、（Ｒ）−（）と（Ｓ）−（）を分
離し採取する、或いは更に採取した（Ｓ）−（）
をアルカリ加水分解し、（Ｓ）−（）を生成し採
取することが出来ることを見出し、本発明を完成
した。（課題を解決するための手段）本発明の基質として用いられる、一般式で表わされる２−オキサゾリジノン誘導体の合成
は、下記ルートで容易に合成できる。置換基R₁は、水素或いは置換又は未置換アリ
ル基であり、アリル基としては、例えばベンゼ
ン、ピリジン、ピリミジンの如き単環式化合物の
基が挙げられる。又アリル基はすべて任意にいず
れかの位置において、以下に限定されるものでは
ないが、例えばハロゲン基、ニトロ基、C₁〜C₃
のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、メルカプ
ト基、シアノ基の１種又はそれ以上の置換基で置
換されうる。一方、置換基R₂は置換又は未置換
アルキル基であり、アルキル基としては例えば
C₁〜C₁₇のアルキル基が挙げられる。又アルキル
基は例えばハロゲン基、アルコキシ基、水酸基、
フエニル基等の１種又はそれ以上の置換基で置換
されうる。ラセミ体（）の不斉的に加水分解し、（Ｒ）−
（）を生成される立体選択的なエステラーゼを
有する微生物としては、例えばシユードモナス属
或いはアクロモバクター属等に属する微生物があ
り、更に詳しくはシユードモナス・アエルギノサ
（Pseudomonas aeruginosa）IFO3080，
IFO13130やアクロモバクター・パルブルス
（Achromobacter parvulus）IFO13182がある。これら微生物の栄養源は、通常、資化しうる有
機及び無機の炭素源、窒素源、ビタミン及びミネ
ラルを適宜配合したものを用い、培養温度は20〜
40℃、PH４〜８の範囲が用いられる。又、通気撹
拌により微生物の生育を促進させることもでき
る。化合物（）の不斉水解反応においては、培
養の開始と同時に培地中に基質即ち化合物（）
を添加し、培養と並行して加水分解を行う方法、
或いは前記の様にして培養液菌体を化合物（）
と接触させ加水分解を行う方法がある。望ましく
は、菌体を遠心分離等で濃縮後、高濃度菌体液と
し、このものに化合物（）を添加する方法が反
応後の生産物回収の他利場から望ましい。一方、
該微生物菌体を破砕後、硫安分画やアセトン処理
して得られる粗酵素或いは更にカラムクロマトグ
ラフイー操作を行い、得られる精製酵素が使用で
きる。又、市販されているリパーゼは、例えばリ
ポプロテインリパーゼ（L.P.L.アマノ３；起源
シユードモナス・アエルギノサ；天野製薬(株)製）
やリパーゼAL（起源アクロモバクター属；名糖
産業(株)製）も用いることができる。加水分解反応は、基質のラセミ体（）を濃度
２〜50％（ｗ／ｖ）の範囲で添加し、酵素を適
量、例えばＥ／Ｓ＝１〜20〜１／5000量加え、温
度10〜40℃の範囲で反応を行い、ガスクロ或いは
液クロにより加水分解の反応の経時変化を追い、
反応が（）と（）のモル比50％ずつになつた
時点で反応を終了させれば良い。また加水分解を
行う際のPH範囲は４〜8.5であれば良いが、加水
分解反応が進むに従い反応液中のPHが酸性側に傾
くので、中和剤例えばNaOH溶液等で最適PHを
保持するのが望ましい。更に上記記載の不斉水解
反応を、例えば微生物菌体或いは酵素を固定化さ
せることにより繰り返し行なうこともできる。化合物（）の水に対する溶解度は一般に低い
が、撹拌すれば本反応にとつて支障とはならな
い。又、例えばアセトン、メタノール等の有機溶
媒や界面活性剤等を反応に支障とならない程度加
えても良い。水解物（Ｒ）−（）と未反応物（Ｓ）−（）を
分離する方法としては、疎水性の有機溶剤、例え
ばヘキサン、シクロヘキサン、酢酸エチル、塩化
メチレン又はトルエン等で疎水性の未反応（Ｓ）
−（）のみを抽出し、親水性の水解物（Ｒ）−
（）と分離することができる。又、置換基R₂の
炭素鎖が短い場合、（Ｓ）−（）と（Ｒ）−（）
の化学的性質に顕著な差がないため抽出操作のみ
では高純度の（Ｓ）−（）が得られない。その場
合には、例えばシリカゲルカラムクロマトグラフ
イー操作等を併せて行えば容易に分離し、高純度
の（Ｓ）−（）を採取することができる。更に、
（Ｓ）−（）を室温下、PH10〜13.5の範囲で数時
間アルカリ加水分解を行うか、或いは（Ｓ）−
（）を加水分解する能力を有する酵素、例えば
ステナプシンを作用させて加水分解を行えば、
（Ｓ）−（）が生成し、PHを7.0に付近に調整後、
減圧濃縮し、有機溶剤例えばアセトン、メタノー
ル或いは酢酸エチル等で溶解し、再濃縮するか、
或いは一旦有機溶剤例えば酢酸エチル或いは塩化
メチレン等で転溶後、減圧濃縮すれば（Ｓ）−
（）を採取することができる。なお、抽出分離
の際、水層側に残つた（Ｒ）−（）も上記と同様
の操作を行えば容易にい採取することができる。（実施例及び発明の効果）以下、実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。実施例１ 100mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に、L.P.L
アマノ３を0.5ｇ及び基質（Ｒ，Ｓ）−５−ブタノ
イロキシメチル−オキサゾリジン−２−オン１〜

【式】18.7ｇ（0.1モル）を添加し、1N NaOH溶液でPHを7.0に調整
しながら、撹拌下、30℃、12時間不斉水解反応を
行つた。この反応液を各100mlの酢酸エチルで４
回抽出操作を行い、酢酸エチル層を減圧濃縮後、
未反応物（Ｓ）−１〜の中に、不純物として水解物
（Ｒ）−５−ヒドロキシメチル−オキサゾリジン−
２−オン（Ｒ）−２〜が約３モル％含まれていたの
でシリカゲルカラムクロマトグラフイー操作（条
件；ワコーゲルＣ−100、Ｌ／Ｄ＝50cm×2.4cm、
ヘキサン：アセトン＝１：１の系）を行つた。溶
出した（Ｓ）−１〜画分を減圧濃縮したところ、比
旋光度〔α〕²⁰ _D＋34.6°（ｃ＝1.0，メタノール）を
有する白色粉末の（Ｓ）−１〜が5.2ｇ（0.028モル、
収率28％）得られた。mp及び ¹H NMR（90M
Hz）測定値は以下の通りであつた。 mp62℃，¹H NMR（CDCl₃）δppm：0.8−1.1
（3H，ｔ，CH₃），1.4−1.9（2H，ｍ，CH₃CＨ
₂CH₂−），2.15−2.45（2H，ｍ，CH₃CH₂CＨ ₂
−），3.25−3.85（2H，ｍ，−CH₂N−），4.1−4.3.
（2H，ｍ，−CH₂O−），4.55−4.9（1H，ｍ，−
CH₂CＨ（Ｏ−）CH₂−），6.4−6.6（1H，ｂ，−
NH−）得られた（Ｓ）−１〜の4.0ｇ（0.021モル）を40
mlの1N NaOH溶液に添加し、室温下、約５時間
加水分解を行い、反応液をPH7.0に調整し、濃縮
乾固する。得た乾固物を50mlの酢酸エチルで溶解
し不溶物を去した後、減圧濃縮し、ヘキサン−
アセトン（10ml−10ml）で再結すると比旋光度
〔α〕²⁰ _D＋36.0°（ｃ＝1.0，メタノール）を有する白
色の粉末の（Ｓ）−５−ヒドロキシメチル−オキ
サゾリジン−２−オン（Ｓ）−２〜が1.8ｇ（0.015
モル、（Ｓ）−１〜よりの収率71％）得られた。mp
及び ¹H NMR（90MHz）値は以下の通りであつ
た。 mp55〜58℃、 ¹H NMR（CD₃OD）δppm；
3.35−3.9（4H，ｍ，−NHCＨ₂CH（Ｏ−）ＣＨ
₂OH），4.5〜4.85（3H，ｍ，−ＮＨCH₂CＨ（Ｏ
−）CH₂OＨ）又（Ｓ）−１〜の光学純度を求める（Ｓ）−α−メ
トキシ−α−トルフルオロメチルフエニルアセチ
ルクロライドを用いてジアステレオマーの形に
し、GLC法（10％シリコンDCQC−１、クロモソ
ルブAW−DMCS，60〜80メツシユ，５ｍカラ
ム、240℃）により求めたところ75％e.e.であつ
た。一方、酢酸エチル抽出操作で水層側に残つた水
解物（Ｒ）−２含有水溶液を減圧濃縮し、得られ
た乾固物を100mlの酢酸エチルで溶解し、不溶物
を去した後、減圧濃縮し、ヘキサン−アセトン
（10ml−10ml）で再結すると比旋光度〔α〕²⁰ _D−
25.5°（ｃ＝1.0、メタノール）を有する白色の粉末
（Ｒ）−２〜が1.9ｇ（0.016モル，１〜よりのモル収率
16％）得られた。その光学純度は53％e.e.であつ
た。実施例２ 100mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）にL.P.L.ア
マノ３を0.5ｇ及び基質（Ｒ，Ｓ）−５−ヘキサノ
イロキシメチル−オキサゾリジン−２−オン３〜

【式】21.5ｇ（0.1モル）を添加し、1N NaOH溶液でPHを７に調整し
ながら、撹拌下、30℃、12時間不斉水解反応を行
つた。この反応液を各100mlの酢酸エチルで４回
抽出操作を行い、酢酸エチル層を無水硫酸ソーダ
で脱水処理後、減圧濃縮し、比旋光度〔α〕²⁰ _D＋
41.3°（ｃ＝1.0、メタノール）を有する白色の粉末
（Ｓ）−３〜が8.6ｇ（0.04モル、収率40％）得られ
た。mp及び ¹H NMR（90MHz）の測定値は以下
の通りであつた。 mp61.5〜62.0℃， ¹H NMR（CDCl₃）δppm：
0.70−2.15（11H，ｍ，C₅H₁₁−），3.30−3.90（2H，
ｍ，−CH₂N−），4.20〜4.35（2H，ｄ，−CH₂O），
4.65−5.00（1H，ｍ，−CH₂CＨ（Ｏ−）CH₂−），
6.40−6.75（1H，ｂ，−NH−）更に、（Ｓ）−３〜の8.0ｇ（0.037モル）を80mlの
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に懸濁し、ステアプ
シン0.2ｇを添加し、30℃で約12時間加水分解反
応を行つた。この反応液をPH7.0に再調整した後、
濃縮乾固する。このようにして得た乾固物を100
mlの酢酸エチルで溶解し、不溶物を去した後、
減圧濃縮し、ヘキサン−アセトン（10ml−10ml）
で再結して比旋光度〔α〕²⁰ _D＋47.4°（ｃ＝1.0、メ
タノール）、光学純度98％e.e.を有する白色の粉
末（Ｓ）−５−ヒドロキシメチル−オキサゾリジ
ン−２−オン（Ｓ）−２を2.4ｇ（0.021モル、
（Ｓ）−３よりの収率55％）得た。一方、水層側の
（Ｒ）−２〜も実施例１と同様の操作を行い、比旋光
度〔α〕²⁰ _D−11.4°（ｃ＝1.0、メタノール）、光学純
度24％，e.e.を有する白色の粉末（Ｒ）−２〜を3.5
ｇ（0.030モル、３よりの収率30％）得た。実施例３ 100mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）にL.P.Lア
マノ３を0.5ｇ及び基質（Ｒ，Ｓ）−５−ブタノイ
ロキシメチル−３−フエニル−オキサゾリジン−
２−オン４〜

〔培地組成〕

グルコース４％、イーストエキス0.3％、肉エ
キス0.3％、ペプトン0.3％、リン酸二アンモニウ
ム0.2％、リン酸一カリウム0.1％（PH7.0）これとは別に同じ組成の培地にて前培養をした
シユードモナス・アエルギノサIFO3080の種菌液
10mlを前培養培地に接種し、30℃、24時間振とう
を行つた。合計５本培養し、培養液計２を得
た。この培養液を遠心分離し、菌体を集めた。こ
の菌体を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）200mlに懸
濁し、基質（Ｒ，Ｓ）−５−ヘキサノイロキシメ
チル−オキサゾリジン−２−オン３を18.7ｇ
（0.1モル）添加した。これを500ml容器内で撹拌
下、1N NaOH溶液でPHを7.0に調整しながら、
30℃、18時間反応させた。反応後、遠心分離して
得た上清を各200mlの酢酸エチルで４回抽出分離
を行い、次いで実施例２に準じて同様の操作を行
い、表１に示す結果を得た。実施例６菌株をかえて、実施例２及び５に準じて菌体の
不斉水解反応及び抽出精製を行い、表１に示す結
果を得た。実施例７シユードモナス・アエルギノサIFO 3080を用
いて、前記実施例５と同様にして得た培養液２
を遠心分離し、菌体を集めた。この菌体を0.1M
リン酸緩衝液（PH7.0）200mlに懸濁し、氷冷しな
がら超音波破砕器で菌体破砕し、遠心分離して無
細胞抽出酵素を得た。この酸素液に基質（Ｒ，
Ｓ）−５−ヘキサノイロキシメチル−オキサゾリ
ジン−２−オン３〜を18.7ｇ添加し、1N NaOH溶
液でPHを7.0に調整しながら、撹拌下、30℃、48
時間不斉水解反応を行つた。以下、実施例２に準
じて抽出精製を行い表１に示す結果を得た。

【表】実施例８アクロモバクター・パルブルスIFO13182及び
基質（Ｒ，Ｓ）−５−ブタノイロキシメチル−３
−フエニル−オキサゾリジン−２−オン４（13.15
ｇ）を用い、実施例３及び５に準じて不斉水解反
応及び抽出精製を行い、以下の結果を得た。（Ｓ）−４〜：収量3.2ｇ，〔α〕²⁵ _D＋56.4°（ｃ＝1.
0，
アセトニトリル）（Ｓ）−５〜：収量2.0ｇ，〔α〕²⁵ _D＋75.7°（ｃ＝1.
0，
アセトニトリル）（Ｒ）−５〜：収量2.1ｇ，〔α〕²⁵ _D−53.1°（ｃ＝1.
0，
アセトニトリル）

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（Ｒ，Ｓ）−（）（式中、R₁は水素、あるいは置換又は未置換ア
リル（Ar）基、R₂は置換又は未置換アルキル基
である。）で表される（Ｒ，Ｓ）−５−アシロキシメチル−
オキサゾリジン−２−オンを不斉的に加水分解し
て、一般式（Ｒ）−（）（式中、R₁は前記（Ｒ，Ｓ）−（）と同じ）で表される（Ｒ）−５−ヒドロキシメチル−オキ
サゾリジン−２−オンを生成させる立体選択的エ
ステラーゼ活性を有するシユードモナス属もしく
はアクロモバクター属に属する微生物またはこれ
らの微生物から得られるリポプロテインリパーゼ
もしくはリパーゼを使用させることにより、ラセ
ミ体の（Ｒ，Ｓ）−（）を（Ｒ）−（）と一般式
（Ｓ）−（）（式中、R₁、R₂は前記（Ｒ，Ｓ）−（）と同じ）で表される未反応の光学活性（Ｓ）−５−アシロ
シキメチル−オキサゾリジン−２−オンとにし、
それぞれの光学活性体を分離、採取することを特
徴とする光学活性（Ｓ）−５−アシロキシメチル
−オキサゾリジン−２−オンの製造方法。２一般式（Ｒ，Ｓ）−（）（式中、R₁は水素、あるいは置換又は未置換ア
リル（Ar）基、R₂は置換又は未置換アルキル基
である。）で表される（Ｒ，Ｓ）−５−アシロキシメチル−
オキサゾリジン−２−オンを不斉的に加水分解し
て、一般式（Ｒ）−（）（式中、R₁は前記（Ｒ，Ｓ）−（）と同じ）で表される（Ｒ）−５−ヒドロキシメチル−オキ
サゾリジン−２−オンを生成させる立体選択的エ
ステラーゼ活性を有するシユードモナス属もしく
はアクロモバクター属に属する微生物またはこれ
らの微生物から得られるリポプロテインリパーゼ
もしくはリパーゼを作用させることにより、ラセ
ミ体の（Ｒ，Ｓ）−（）を（Ｒ）−（）と一般式
（Ｓ）−（）（式中、R₁、R₂は前記（Ｒ，Ｓ）−（）と同じ）で表される未反応の光学活性（Ｓ）−５−アシロ
シキメチル−オキサゾリジン−２−オンとにし、
（Ｓ）−（）を分離、採取した後、さらに（Ｓ）−
（）を加水分解することを特徴とする一般式
（Ｓ）−（）（式中、R₁は前記（Ｒ，Ｓ）−（）と同じ）で表される光学活性（Ｓ）−５−ヒドロキシメチ
ル−オキサゾリジン−２−オンの製造方法。