JPS5931693A - 光学活性オキサゾリジノン誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は光学ン古性オキサゾリジノン誘導体の製造方法
に関するものであり、更に詳しくは、（） （式中、Ｘは低級アルキル基、Ｙは置換又は未置換アノ
Ｌ７−、）−ル基、アルケニル基或いは置換又は未置換
芳香族炭化水素基） で表わされる３−アルキル置換−５−アシロキシメチル
オキサゾリジン−２−オンラセミ体に、化合物〔１〕を
不斉的に加水分解して、 ｔ）　　　０．） で表わされる光学活性←）−３−アルキル置換−５−ヒ
ドロキシメチルオキサゾリジン−２−オンを生成させる
立体選択的エステラーゼ活性を有する微生物又は該微生
物より得られた酵素を作用させる事により化合物〔１１
〕を生成さ」ｔ、生成した化合物（Ｉｔ）及び有機酸と
未反応の一般式で表わされる光学活性（→−３−アルキ
ル置換−５−アシロキシメチルオキサゾリジン−２−オ
ンを分離し、次いで化合物（１）を採取する。或いは、
更に採取した化合物〔Ｉ〕を加水分解し、で表わされる
光学活性（＋）−８−アルキル置換−５−ヒドロキシメ
チルオキサゾリジン−２−オンを生成させ、採取するこ
とを特徴とする光学活性オキサゾリジノン誘導体〔白及
びイ〕を製造する方法に関する。

（イ） 化合物〔自及び〔１自は光学活性なβ−受容体遮断薬の
重要な中間体である。

従来、光学活性なβ−受容体遮断薬の製法としては、例
えば下記の方法が知られている。

１）β−受容体遮断薬ラセミ体を光学分割する方法（特
開昭５５−１４９２８８．米国特許第８．６５５，６６
８月）。

２）３−アルキル置換アミノ−１，２−プロパンジオー
ルラセミ体を光学分割し、この活性体から誘導していく
方法（特開昭５１−１１８，７１１）。

８）　　１）−マンニト−ルよりＤ−グリセロ−ルア老
１・ニドを経て誘導していく方法〔ジャーナル・オブ・
オーガニック・ケミストリー（Ｊ、　０．　Ｃ，）４１
（１９）、８１２１〜：９１２４　（１９７６）、ケミ
カル・アンド・ファーマシュテカル・ブレテン（Ｏｂｅ
ｍｊ−ｃａｌ、　＆　Ｐｈａｎｎａｃｅｕｔｉｃａｌ　
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）　　２９（１２）８５９８〜８６０
０（１９８１）））。

しかしながら、１）は最終製品ラセミ体を光学分割する
点でコスト的に不利である。２）は３−アルキル置換ア
ミノ−１，２−プロパンジオールが吸湿性であり、一旦
吸湿すると結晶性が悪く、光学分割法では容易に収率良
く高純度の光学活性体を得られない。また３）はＤ−マ
ンニトールからＤ−グリセロールアセトニドに誘導する
際、多量の四酢酸鉛を必要とし、工業的規模で行うには
廃棄物の点で問題がある。以上挙げたいずれの方法も一
長一短があった。

ところで、光学活性なβ−受容体遮断薬の合理的な合成
経路として下記のような経路が知られている（ケミカル
・アンド・ファーマシュテカル・ブレチン２９　（１２
）８５９８〜８６００（１９８１）津田喜典ら；カナダ
特許第９６５，７８７号）。

そこで本発明者らは化合物〔■′〕に着目し、化合物（
１自の簡便な新規製造法の開発を目的として鋭意研究１
ツた。

化合物（Ｉｉ’）の５位にヒドロキシメチル基があるこ
とに着１１シ、化合物Ｃ１１）のラセミ体をエステル化
させ、化合物（＋）を合成し、この化合物（１）を不斉
的に加水分解するエステラーゼ活性を有する微生物又は
酵素を作用させることにより化合物（１）が容易に１見
られるのではないかと考え、そのスクリーニング実験を
試みた。その結果、化合物（１）を不斉的に加水分解し
、化合物〔［１〕を生成させる立体選択的エステラーゼ
活性を有する微生物、及び該微生物」：り得られた酵素
を見い出し、更に簡単な分離操作にＪ：り化合物〔■〕
と未反応の化合物１白を分離し、目的物に適う化合物〔
白を化学的方法で加水分解することにより化合物（Ｉｆ
）を採取できることが判明し、本発明を完成させるに至
つ　？、：。

即ち本発明は、化合物ＣＩ）を不斉的に加水分解して化
合物（ＩＩ）を生成させる立体選択的エステラーゼ活性
を有する微生物又は該微生物よｉ）　ｌｊｊられた酵素
を作用させる事により化合物〔１１〕を生成させ、次い
で化合物（１）と生成した有機酸及び未反応の化合物Ｃ
ｉ　Ｉ　）を有機溶媒で抽出分離する方法、或いは反応
液を一旦有機溶媒で転溶するか又はそのまま反応液をカ
ラムクロマトグラフィー処理か、分溜操作を行い分離す
る方法等により化合物（−ｌ　７．、＋を採取し、或い
は、更に採取した化合物（１）を加水分解し、化合物（
ＩＩ）を生成し、採取することを特徴とする光学活性オ
キサゾリジノン誘導体（１）及びイ〕の製造方法に関す
るものである。

本発明により、従来法と比べ高純度でかつ安価な光学活
性β−受容体遮断薬の合成が可能となった。

で表わされるオキサゾリジノン誘導体における置換基Ｘ
としては低級アルキル基が用いられる。例えばメチル基
、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基又
はｔ−ブチル基等が挙げられるが、中でもイソプロピル
基又はｔ−ブチル基が好ましい。一方置換基Ｙとしては
、置換又は未置換アルキル基、アルケニル基、或いは置
換又は未置換芳香族炭化水素基が挙げられる。更に詳し
くは、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、又はブ
チル基の如き未置換アルキル基；例えばクロロメチル基
、ジクロロメチル基、トリフルオロメチル基、又はβ、
β、β−トリクロロエトキシメチル基の如きハロゲン基
、水酸基、或いはアルコキシ基で置換された置換アルキ
ル基；例えばアリル（Ａ１．１ｙｌ　）基の如きアルケ
ニル基；例えばフェニルＬ　１）−メチルフェニル基、
ｐ−クロロフェニル基、又はｐ−メトキシフェニル基の
如き未置換又はアルキル基、ハロゲン基、水酸基或いは
アルコキシ基で置換されたアリール（Ａｒｙｌ）基；例
えばベンジルＬ　１）−メチルベンジル基、ｐ−クロロ
ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、又はｐ−メト
キシベンジル基の如き未置換又はアルキル基、ハロゲン
基、水酸基或いはアルコキシ基で置換されたアラルキル
基を例示することができる。

化合物（Ｉ）を不斉的に加水分解し、化合物〔…〕又は
（１）を生成させる立体選択的エステラーゼ活性を有す
る微生物は次のようなスクリーニングを行うことにより
容易に見い出すことができる。

例えば、その具体的な一例として、基質に３−ｔ−ブチ
ル−５−アセトキシメチルオキサゾリジン−２−オンを
用いる場合、先づ菌が生育可能な栄養培地で１０ｍＪ／
大型チューブ中２５〜３５°Ｃ９１〜２日間振とう培養
により菌体培養を行う。この培養液に８−ｔ−ブチル−
５−ア−＋！ｌ・キシメチルオキサゾリジン−２−オン
（ラセミ体）を２％（ｗ／ｖ　）添加し、更に２０〜３
５°Ｃ，ｐＨをＮａＯＨ溶液で５〜７に調整しながら１
〜３日間反応させる。そして、ガスクロマトグラフィー
（充填剤、５ｉｌｉｃｏｎｅ　ＯＶ　−１７，１ｔｎ　
Ｘ　８φカラム、温度１８０’Ｃ）により各反応液の経
時変化をとり、ａ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシメチル
オキサゾリジン−２−オンが約５０％生成したところで
、反応が極端に遅くなる菌株を１次選抜する。

更にスケールを４００１にかえて、前記同様の培養及び
加水分解反応を行い、終了後、酢酸エチル４００ｍ１で
抽出濃縮し、この濃縮液をシリカゲルカラムに負荷し、
ヘキサン／アセトン混液で未反応のａ−ｔ−ブチル−５
−アセトキシメチルオキ１ノゾリジン−２−オンを溶出
分離し、５−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシメチルオキサ
ゾリジン−２−オン画分を濃縮し、ヘキサンを徐々に加
えていくと結晶が析出してくる。この結晶物を真空乾燥
後、その比旋光度を測定すれば立体選択的エステラーゼ
活性を有する微生物か否か容易に判断できる。立体選択
的加水分解能を有するエステラーゼは珍らしくないが、
持にβ−受容体遮断薬の重要な中間体である（−１）−
３−アルキル置換−５−ヒドロキシメチルオキサゾリジ
ン−２−オンの生産に着目し、スクリーニングを実施し
、かつ見い出したところが本発明の特徴である。

ｏｆｆ記と同様のスクリーニングを実施すれば、容易に
化合物〔１〕を不斉的に加水分解する立体選択的エステ
ラーゼ活性を有する微生物を見い出す１ことができる。

化合物（１）を不斉的に加水分解し、化合物ＣＩ）を生
成させる立体選択的エステラーゼ活性を有する微生物と
しては、細菌、酵母、かび又は放線菌等があり、例えば
エンテロバクタ−属、クレブシェラ属、ミクロコツカス
属、シトロバクタ−属、ニスケリチア属、シュードモナ
ス属、スタフィロコッカス属、キャンディダ属、デバリ
オマイセス属、エンドマイセス属、ハンセヌラ属、ケオ
トリクム属、クルイベロマイセスｔｐ、ｉ＋・シュニコ
ウィア属、ヒチア属又はスｉ・レプトマイセス８７４　
ニ属する微生物が挙げられ、特にエンテロバクタ−・ア
エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅ
ｎｅｓ　）ＩＦＯ１２０１０，ＴＦＯ１８５８４；　ｘ
ンテａバクター・クロアカｘ　（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　）、ＩＴｉ’０８　Ｂ　２０゜
ＩＦＯ１２９３５；クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）　ＩＦＯ
３８１８，ＩＩｉ’０８８２１　；ミクロコツカス・ル
テウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓ　）Ｉ
ＦＯ８０６４，ＵＦＯ８０６６；シトロバ’）ター　−
’７　。

インディー（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉ
ｉ　）ＩＦＯ１２６８１；ニスケリチア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）　ＩＦＯ８８６６；シ
ュードモナス・クルシヴイ−ｒ−（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓｃｒｕａｉｖｊ、ａｅ　）　ｌＦ’ｏ　］　２０４
７　；シュードモナス・フルオレツシエンス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　）　ＩＦＯ
８０８］　；スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｉ；
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）　ＩＴｉ
’０８７６１　；キャンプイタ・シュードトロピカリス
（Ｏａｎｄｉｃｌａ　ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌ釦
）ＩＴｉ’ＯＯ／Ｉ８２；キャンプイタ・ケフイル（Ｏ
ａｎｄｉｄａｋｅｆ’ｙｌｒ　）　Ｔ１７’００００８
　；　デバリオマイセス・ハンゲ＝　−（１）ｅｂａｒ
ｙｏｍｙｃｅｓ　ｈａｎｓｅｎｉｉ　）　ＩＦＯ００１
７，ＩＦＯ００８４ｉエンドマイセス・ゲオトリクム（
Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ　ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　）　ＯＲ
３１７８，７１暮ハンゼヌラ・アノマラ（ＩＪａｎｓｅ
ｎｕｌａ　ａｎｏｍａｌａ　）　ＩＪ’００１４４　；
ハンセヌラ・ミヌタ（１，（ａｎｓｅｎｕｌａ　ｍ１ｎ
ｕｔａ）　ＩＦＯ０９７５ｉゲオトリクム・キャンディ
ドラム（Ｏｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄＷｕｍ　）　
ＯＲ３１８７，６７；クルイベロマイセス・フラボリス
（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ　）
ＩＩｉ’００２８８．　ＩＩｉ’Ｏ０５４１、メトシュ
ニコウイア・ブルチェリｖ　（Ｍｅｔｓｃｈｎ：ｉｋｏ
ｗｉａ　ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ　）　ＩＦＯ０５６１
ｉビチア・ファリノサ（Ｐｉｃｈｉａ　ｆａｒｉｎｏｓ
ａ）ＴＰＯ０４５９；ビチア・メンブラナエファシエン
ス（Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ
　）　ＩＩｉ’００１８６　；ストレプトマイセス・フ
ラボビレンス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｌａｖｏｖ
ｉｒｅｎｓ　）　ＩＦＯ８４１２；　ストレプトマイセ
スアウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｕｒｅｕ
ｓ　）　ＩＦＯ　８　１　７　５がある。

これら微生物の培養源は、通常資化しうる有機及び無機
の炭素源、窒素源及びビタミン・ミネラル等を適宜配合
したものを用い、培養温度は２０〜４０°Ｃ，ｐＨ８〜
１１、好ましくは一ｐＴ−■４〜８の範囲が用いられる
。又通気攪拌により微生物の生育を促進させることもで
きる。

化合物（Ｉ）の不斉加水分解反応においては、培養の開
始時に培地中に基質即ち化合物〔Ｉ〕を添加し、培養と
並行して加水分解を行う方法、或いは前記のようにして
培養液菌体を化合物〔Ｉ〕と接触させ加水分解を行う方
法とがある。望ましくは、菌体を遠心分離等で濃縮後、
高濃度菌体液とし、このものに化合物（１）を添加する
方法が反応後の生産物の回収の立場から好ましい。

一方、前記該微生物より得られた酵素としては、例えば
１）ｉＩ記該微生物の培養液を遠心分離して菌体を得、
この菌体をリン酸緩衝液で均一になるよう懸濁させ、次
いで氷冷下、ブラウンホモジナイザーで破砕し、遠心分
離して得た無細胞抽出酵素液か或いは更にこの無細胞抽
出液を３０〜７０％の硫安分画処理を行い、塩析した両
分をリン酸緩衝液に溶解させ、−昼夜冷所透析して得た
部分精製酵素液が用いられ、これら酵素液に化合物（１
）を瞭触させ、加水分解反応を行うことができる。或い
は、又微生物より精製した加水分解酵素、例えばリボプ
ロティンリパーゼ（Ｅ、０．８．１．１．８．　）を接
触させ、加水分解反応を行うこともできる。更にこ４１
ら微生物又は該微生物より得られた酵素を用いて、例え
ば固定化させることにより、不斉加水分解反応を繰り返
し行うこともできる。

化合物〔１〕の反応液中での濃度は０．１％から３０％
程度の高濃度まで用いることができる。　　　　。

又、化合物〔１〕の水に対する溶解度は一般に低いが、
攪拌等により、混合を行うことにより、菌体又は酵素と
の接触を充分保つようにすれば、本反応にとって支障と
はならない。

又、アセトン等の親水性溶剤や界面活性剤等を反応に支
障とならない程度加えても良い。

加水分解反応を行う際のｐＨは４〜８の範囲が好ましい
。化合物（１）を高濃度で反応させる場合、加水分解さ
れた有機酸が次第に反応液中に蓄積し、ｐＨが低下して
くるので適当な中和剤例えばＮａＯＨ溶液等で最適ｐＨ
を保持するのが好ましい。

加水分解反応は通常１０〜５０°Ｃの範囲が用いられる
が、使用する菌株又は酵素に適した温度が採用される。

未反応の化合物〔白を生成する有機酸及び化合物（Ｉ［
、）ｌから分離し、採取する方法としては、一般的精製
方法を用いれば良い。

例えば、反応液より遠心分離処理によって、菌体等の不
溶性物質を除去した後、一般によく使用される有機溶媒
、例えばヘキサン、シクロヘキサン、エーテル、酢酸ブ
チル、クロロホルム、ジクロロメタン、ベンゼン又はト
ルエン等で未反応の化合物（１）を抽出、次いで減圧濃
縮することにより採取することができる。

又化合物〔白の種類例えば置換基Ｙがメチル基、エチル
基又はプロピル基等の低級アルキル基の場合、前記有機
溶媒抽出分離操作では完全に分離しがたい。この場合に
は、前記と同様不溶性物質を除去した後、減圧濃縮し、
そのままカラムクロマトグラフィー処理を行うか、或い
は一旦有機溶媒例えば酢酸エチル等で転溶、減圧濃縮後
、カラムクロマトグラフィー処理を行えば簡単に分離し
、化合物〔１〕を採取することができる。カラムクロマ
Ｉ・グラフィーとしては、通常よく使われるシリカゲル
、アルミナ又はフロリジル等の担体を用いることができ
る。一方、又、化合物〔１〕の種類により、化合物（１
）と生成した化合物（１）の沸点に差がある場合には、
分溜操作により容易に分離し、化合物〔１〕を採取する
こともできる。

化合物〔白を更に加水分解し、化合物１′〕を生成し、
採取する方法としては、例えば化合物（１）を室温下、
数日間ｐＨ８〜１３の範囲に調整しながら放置しておけ
ば化学的に加水分解が進行し、化合物イ〕が生成する。

又化合物〔白を２０〜４０°Ｃ，ｐＨ４〜８の範囲に調
整しながら、不斉炭素を識別しない加水分解酵素例えば
リパーゼ（ステアプシン）、エステラーゼ（豚レバー）
等を作用させて、化合物（ＩＩ）を生成させることもで
きる。

次いで生成した化合物〔■′〕を有機溶媒例えば酢酸エ
チル等で抽出し、減圧濃縮すれば化合物〔ｆ〕の結晶物
を採取することができる。

以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ 下記の組成からなる栄養液体培地を調製し、２１坂ロフ
ラスコに４０（１ｍ／ずつ分注後、１２０°Ｃ１１５分
殺菌した。

〔培地組成〕　グルコース４％、イーストエキス０．３
％、肉エキス０．８％、ヘフトン０．８％、リン酸ニア
ンモニウム０．２％、リン酸−カリウム０．１％、（ｐ
Ｈ７，０） これとは別に同じ組成の培地にて前培養をしたエンテロ
バクタ−・アエロゲネス　ＩＦＯ１２０１０の種菌液１
０ゴを前記培養培地に接種し、３０°Ｃ１２４時間振と
う培養を行った。合計１０本培養し、培養液旧４ｅを得
た。この培養液を遠心分離し、１ｙ１体を集めた。この
菌体をＭ／１０！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　４．０
０ｍｌに懸濁し、基質ローｔ−ブチル−５−アセトキシ
メチルオキサゾリジン−２−を１ｅ容器内で攪拌下、Ｎ
ａＯＨ溶液でｐＨを５〜７に調整しながら、３０°Ｃ９
１８時間反応させた。

反応後、遠心分離して得た上清を酢酸エチル４００ｍ１
で２回抽出し、減圧濃縮した。

この濃縮物をシリカゲルカラムに負荷し、ヘキ→ノーン
／アセトン（８：１）混液で溶出される３−ｔ−ブチル
−５−アセトキシメチルオキサゾリジン−２−オン両分
を集め減圧濃縮し、溶媒を除去すると、無色の油状物１
８．５ｙが得られた。比旋光度（マ、１丁α〕ニア　＋
８６．８°（Ｃ１１，０，クロロホルム）であり、ＮＭ
几測定値は以下の通りであった。

ＮＭＲ（９０Ｍ比） δ０ＤＯｎ８１．４　（９Ｈ，８，０（Ｃ！Ｈ８）、　
）２．１（８Ｈ，ｓ、　　Ｃ０Ｈ３） ８．８　３．８　（２Ｈ，ｍ、　　Ｃ！Ｈ２Ｎ　　）４
、１　４．２５　（２Ｈ，ｍ、　　０Ｈ２０）４．４　
４．７　（ＩＨ，ｍ、　−ＣＨ２引（０−）ＣＨ２−）
次いで、得られた（ト）−３−ｔ−ブチル−５−アセト
キシメチルオキサゾリジン−２−オンを１００ｍ１の水
に懸濁し、ＮａＯＨ溶液を加えてｐＨ１０〜１２に調整
しながら、室温下、２日間加水分解反応を行った。

酢酸エチル２００＋Ｊで抽出し、脱水処理後、減圧濃縮
した。この濃縮物にヘキサンを徐々に加えていくと、無
色の結晶が析出しだし、これを集めて真空乾燥したとこ
ろ、比旋光度〔α〕１６＋４６０゜１） （０，１，０，クロロホルム）を有する（１→−３−を
−ブチル−５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−２−
オン１２．９１９を得た。ＮＭＴｉｔ測定値は以下の通
りであった。

ＮＭ’ｌｔ　　　（９０ＭＩＩｚ） δＣ１）ＣｅＢ　１．４　（９’Ｈ，Ｓ、　０（ＣＩ（
Ｂ）Ｂ　、）８．４−３．９５　（５１−１，−０Ｈ２
Ｎ−、−Ｇ！、Ｉ（２０−、−０Ｈ）４．３　４．６（
ＩＴｌ、　ｍ、　　ＣＨ２０Ｈ（０）ＯＨ２）実施例２
５ 下記の組成からなる栄養液体培地を調製し、２１坂ロフ
ラスコに４００ｍＪずつ分注後、１２０°Ｃ９１５分殺
菌した。

〔培地組成〕　グルコース２％、イーストエキス０．３
％、リン酸ニアンモニウム１．３％、リン酸−カリウム
０７％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸亜鉛０．００６
％、硫酸第一鉄０．００９％、（ｐＨ６，５）これとは
別に同じ組成の培地にて前培養をしたキャンデイダ・シ
ュードトロピカリスＩＦＯ０４８２の種菌液１０ｍ／を
前記培養培地に接種し、３０°Ｃ１２４時間振とう培養
を行った。合計１０本培養し、培養波計４１ｆｅ得た。

この培養液を遠心分離し、菌体を集めた。この菌体をＭ
／１０！］ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）４００耐に懸濁し
、基質ローｔ−ブチル−５−アセトキシメチルオキサゾ
リジン−２−を１１容器内で攪拌下、ＮａＯＨ溶液でｐ
Ｈを５〜７に調整しながら、３０°Ｃ１１８時間反応さ
せた。

（至） 実施例２６〜３７ 反応後、遠心分離して得た上清を酢酸エチル４００ｍ１
で２回抽出し、減圧濃縮した。

この濃縮物をシリカケルカラムに負荷し、ヘキ→ノン／
アセトンｌ：ｌ）混液で溶出される。３−１．−ブチル
−５−アーＩ！トキシメチルオキサゾリジン−２−オン
両分を集め、減圧濃縮し、溶媒を除去すると、無色の油
状物１７，５ダが得られた。

比旋光度は　（（１）１６−１−２４．．５°（０，１
，０，クロロホルム）１） であった。次いで得られた（１→−８−ｔ−ブチル−５
−アセトキシメチルオキサゾリジン−２−オンを１００
ｍ１の水に懸濁し、Ｎａ０Ｉ（溶液を加えて、ｐＨｌ　
Ｏ〜１２に調整しながら、室温下、２日間加水分解反応
を行った。

酢酸エチル２００ｇ／で抽出し、脱水処理後減圧濃縮１
７だ。この濃縮物にヘキサンを徐々に加えていくと、無
色の結晶が析出しだし、これを集めて真空乾燥したとこ
ろ比旋光度〔α〕ゎ＋３１．１°（Ｃ９１，０，クロロ
ホルム）を有する０→−ａ−ｔ−ブチル−５−ヒドロキ
シメチルオキサゾリジン−２−オン１１．５ｇを得た。

（至） ｌ坂ロフラスコに４００ゴずつ分注後、１２０°Ｃ９１
５分殺菌した。

〔培地組成〕　グルコース２％、グリセリン２％、ニス
サンミート３％、イーストエキス０．３％、ビタミンＢ
Ｉ２１　ｐｐｍ、　　（ｐＨ７，２）これとは別に同じ
組成の培地にて、前培養をしたストレプトマイセス・フ
ラボビレンス　ＩＦＯ３４１２の種菌液１０ｇ／を前記
培養培地に接種し、３０°Ｃ２４８時間振とう培養を行
った。合計１０本培養し、培養波計４１を得た。この培
養液を遠心分離し、菌体を集めた。この菌体をＭ／１０
りン酸緩衝液（ｐＨ７，０）４００＋／に懸濁し、基質
３−１−ブチル−５−ア七トキシメチルオキサゾリした
。これをｌｌ容器内で攪拌下、Ｎａ０Ｔ■溶液でｐＨを
５〜７に調整しながら、３０°Ｃ９１８時間反応させた
。反応後、遠心分離して得゛た−に〆１りを酸アセＩ・
ン（，１：ｌ）Ｕ液で溶出される５−ｔ−ブチル−５−
ア士１−キシメチルオキサゾリジン−２−オン画分を集
め減圧濃縮し、溶媒を除去すると、無色の油状物１６．
９９が得られた。比旋光度は〔α青＋２２．６°（０，
１，０，クロロポルム）であった。

次いで得られた（」→−ａ−ｔ−ブチルー５−アセトキ
シメチルオキサゾリジン−２−オンを１００ｍ１の水に
懸濁し、Ｎａ０Ｔ（溶液を加えてｐＨ１０〜Ｉ２に調整
しながら、室温下、２日間加水分解反応を行った。

次いで酢酸エチル２００ｇ／で抽出し、脱水処理後減圧
濃縮した。この濃縮物にヘキサンを徐々に加えていくと
、無色の結晶が析出しだし、これを集めて真空乾燥した
ところ、比旋光度〔α）１６＋２８．７゜（０，１，０
，クロロホルム）を有する（ト）−３−ｔ−ブチル−５
−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−２−オン１１．１
ｇを得た。

実施例５５ 下記の組成からなる栄養液体培地を調製し、２１坂ロフ
ラスコに４００耐ずつ分注後、１２０°Ｃ９１５分殺菌
した。

〔培地組成〕　グルコース４％、イーストエキス０．３
％、肉エキス０．３％、ペプトン０．３％、リン酸ニア
ンモニウム０．２％、リン酸−カリウム０．１％、（ｐ
Ｈ７，０） これとは別に同じ組成の培地にて前培養をしたエンテロ
バクタ−・アエロゲネスＩＴｌ’０１２０１０の種菌液
１０ｙｔｔｌを前記培養培地に接種し、３０°Ｃ１２４
時間振とう培養を行った。合計１０本培養し、培養波計
４１を得た。この培養液を遠心分離１７、菌体を集めた
。この菌体をＭ／１０！Ｊン酸緩衝液（ｐＩ（７，０）
４００肩ｌに懸濁し、基質ローｔ−ブチル−５−ベンゾ
イロキシメチルオキサゾリジン−これを１４容器内で攪
拌下、ＮａＯＨ溶液でｐｈｉを５〜７に調整しながら、
３０°Ｃ２４０時間反応させた。反応後、遠心分離して
得た上清をＩ・ルエン４００ｔｔｔｔで未反応のａ−ｔ
−ブチル−５−ベンゾイロキシメチルオキサゾリジン−
２−オンを抽出し、減圧濃縮した。

次に、この濃縮物を２００＋＋ｔ／のＭ／１０！Ｊン酸
緩衝液に懸濁し、リパーセ（ステアプシン）２ｇを添加
、攪拌下３０°Ｃ，ＮａＯＨ溶液でｐ　Ｉ−Ｉを５〜７
に調整しながら加水分解反応を１８時間行った。

次いで酢酸エチル４００ｍ１で抽出し、脱水処理後減圧
濃縮した。この濃縮物にヘキサンを徐々に加えていくと
、無色の結晶が析出しだし、これを隼めで真空乾燥した
ところ、比旋光度〔α）；ｒ：＋４６．１゜（０，１，
０，クロロホルム）を有する（＋）　−８−ｔ　−ブチ
ル−５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−２−オン１
２．８ｉｆを得た。

エンテロバクタ−・アエロケネスＩＦＯ１２０１０を用
いて前記実施例１と同様の培養を行い、培養液４００ｍ
１を得た。この培養液に基質８−ｔ−ブチル−５−アセ
トキシメチルオキサゾリジン−２す れを１４容器内で通気攪拌下、ＮａＯＨ溶液でｐＨを５
〜７に調整しながら、３０°Ｃ９１８時間反応させた。

以下実施例１と同様の操作を行い、比旋光度〔α〕ゎ＋
４３．９°（Ｃ，１，０，クロロホルム）を有する（−
１−１−８−ｔ−ブチル−５−ヒドロキシメチルオキサ
ゾリジン−２−オンｉ、ｏｓｆＩを得た。

実施例７５ グルコース７％、イーストエキス０−３％、肉エキス０
．３％、ペプトン０．３％、リン酸ニアンモニウト０２
％、リン酸−カリウム０．１％（ｐＨ７，０）含有する
培地１０肩ｔにエンテロバクタ−・アエロゲネスｌＩｉ
’０１２０１０を植菌し、３０°Ｃ１２４時間振とう培
養を行った。

次に前記培養培地４００ｍ１に前培養液を接種し、同時
に基質ローｔ−ブチル−５−アセトキシメチ４．０ｇを
添加し、３０°Ｃ９４８時間培養及び反応を並行して行
った。

以−Ｆ実施例１と同様の操作を行い、比旋光度１α〕”
　−１−４１，５°（０，１，０，クロロホルム）を有
す−１） る（］）−］８−ｔ−ブチルー５−ヒドロキシメチルオ
キ→Ｊ′シリジン２−オン０．８２９を得た。

実施例７９ エンテロバクタ−・アエロゲネスＩＦＯ１２０１０を用
いて前記実施例１と同様にして得た培養液４ｅを遠心分
離し、菌体を集めた。この菌体をＭ／１０リン酸緩衝液
（ｐＴＴ　７．０　）　４００ｍｌに懸濁し水冷【ッな
がら、ブラウンホモジナイザーで菌体破砕し、遠心分離
して無細胞抽出酵素液を得た。この酵素液に基質８−ｔ
−フチルー５−アセトキシメチル詞キ→ノゾリジン−２
−オンを４，０ｇ添加し、攪拌下、ｐｌｌをＮａＯＨ溶
液で５〜７に調整しながら、３０°Ｃ９１８時１？ｆｆ
ｉ反応を行った。この反応液を減圧濃縮し、シリカゲル
カラムに負荷し、以下、実施例１と同様の操作を行い、
比旋光度〔α）貨＋４６．８゜（０，１，０，クロロホ
ルム）を有する（→−８−ｔ−ブチルー５−ヒドロキシ
メチルオキサゾリジン−２−オン１．０’ｌ（ｌを得た
。

実施例８０〜８６ 菌株及び基質をかえて、実施例７９と同様の操作を行い
、表１０の結果を得た。

＝５５１− 実施例８７ エンテロバクタ−・アエロケネス■ＦＯ１２０１０を用
いて前記実施例１と同様にして得た培養液４ｅを遠心分
離し、菌体を集めた。この菌体をＭ／１０リン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）４００薄ｔに懸濁し、氷冷しながらブラ
ウン・ホモジナイザーで破砕し、遠心分離して無細胞抽
出液を得た。

次いで硫安分画を行い、３０〜７０％濃度で塩析した両
分をＭ／１０！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）４０ｍｌに
懸濁させ、−昼夜冷所で透析して部分精製した酵素液を
得た。この酵素液に基質５−ｔ−ブチル−５−アセトキ
シメチルオキサゾリジン−２−オンを４．０ｇ添加し、
攪拌下、ＮａＯＨ溶液でｐｌｌを５〜７に調整しながら
、３０°Ｃ１１８時間反応を行った。反応液は以下実施
例１と同様の操作を行い、比旋光度〔α）１６＋４６．
２°（Ｃ２■、０．クロロポルム）ヲ有する（→−８−
ｔ−ブチルー５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−２
−オン１．１０ｆを得た。

実施例９５ ４０＊ｅ（７）Ｍ／１０　！Ｊ　ン酸緩１１ｊ液（ｐＩ
−Ｉ　７．０　）ｊｉ：、リボプロティンリパーゼ（Ｆ
ｉ、０．８．１．１．８．、シュードモナス、大野製薬
り、Ｐ、　Ｌ、　）　１．　Ｏｆ及び３−ｔ−ブチル−
５−アセトキシメチルオキサゾリジン−２−オン４．Ｏ
Ｆを添加し、Ｎａ０Ｉ−Ｉ溶液でｐＨを５〜７に調整し
ながら、攪拌下、３０°Ｃ２１８時間加水分解反応を行
った。この反応液は以下実施例１と同様の操作を行い、
〔α、ｌ、＋４２．８°（Ｃ，１，０゜クロロホルム）
を有する０う−ａ−ｔミーｔ−ブチル−５−ヒドロキシ
メチルオキサゾリジンオン１．１ｇを得た。

実施例９６ 基質を３−イソプロピル−５−アセトキシメチルオキサ
ゾリジン−２−オンにかえて実施例９５と同様の操作を
行い、表１２の結果を得た。

表　　　１２ 特許出願人　　鐘淵化学工業株式会社 代理人　弁理士浅野真− 自発手続補正書 １１１（和５７年ｌＯ月２６ＬＩ １、月１件の表示 牛ｊＪｒｌ”Ｓ５　７　−−１　　４　　１　　５　７
　５２　発明の名称 光学活性オキザゾリジノン誘導体の製造方法３、袖Ｅを
する者 １１件との関係　特許出願人 大阪市北区中之島三丁目２番４号 （０９４）鐘ｆｌｌ！ｌ化学工業株式会社代表者　薗　
［Ｂ　　敞 ４、代理人 大阪市西区京町掘１丁目１３番２号 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６　補正の内容 α）明細書箱３８頁３行目の表１の標題の１−３−１−
ブチル−５−アシロキシメチルオキサゾリジン−２−オ
ン」を「３−１−プヂルー５−アセトキシメチルオキサ
ゾリジン−２−オン」に訂正する。

（２）　　同第３０頁表１中の基質の項の１（ヵ３−を
一ブチルー５−アシロキシメチルオキサゾリジン−２−
オン」を［（イ）３−［−ブチル−５−アセトキシメチ
ルオキサゾリジン−２−オン」に訂正する。

（３）　　同第３１頁２行目［３−イソプロピル−５−
アシロキシメチルオキサンリジン−２−オン」全「３−
イソプロピル−５−アセトキシメチルオキサゾリジン−
２−オン」に訂正する。

（４）同第３１頁表２中の基質のＪｒ、　＋　（−１−
）−３−イソプロピル−５−アシロキシメチルオキサゾ
リジン−２−オン」を１’　（−１）−３−イソゾ［１
ピル−５−アセトキシメチルオキサゾリジン−２−オン
」に訂正する。

（５）同第３４頁２行目「操作を作い」を「操作會行い
」に訂正する。

（６）　　同第３４頁３行目の表３の標題の１３−ｔ−
ブチル−５−アシロキシメチルオキサゾリジン−２−オ
ン」全「３−１−ブチル−５−アセトギシメチルオキサ
ゾリジン−２−オン］に訂正する。

（７）同３４頁表３中の基質の項１（ト）−３−を−ブ
チル−５−アシロキシメチルオキサゾリジン−２−オン
」をｒ　（−１→−３−ｔ−ブチル−５−アセトキシメ
チルオキサゾリジン−２−オン」に訂正する。

（８）同第３５しイ２行目「３−インプロビル−５−ア
シロキシメチルオキサゾリジン−２−オン」全「３−イ
ソプロピル−５−アセトキシメチルオキサゾリジン−２
−オン」に訂正する。

側　同第３５頁表４中の基質の項のＩｌト）３−イソプ
ロピル−５−アシロキシメチルオキサゾリジン−２−オ
ン」ヲ［（ト）３−イソプロピル−５−アセトキシメチ
ルオキサゾリジン−２−オン」に訂正する。

ａＯ同第３８頁３行目表５の標題のｒ３−ｔ−ブチル−
５−アシロキシメチルオキサゾリジン−２−オン」全「
３−１−ブチル−５−アセトキシメチルオキサゾリジン
−２−オン」に訂正する。

αυ　同第３８頁表５中の基質の項の「０→−３−ｔ−
ブチル−５−アシロキシメチルオキサゾリジン−２−オ
ン」を「（ト）−３−【−ブチル−５−アセトキシメチ
ルオキサゾリジン−２−オン」に訂正する。

＠　同第３８頁１０行「菌株及び基質を３−インプロビ
ル−５−ヒドロキシメチルオキザゾリジン−２−オンに
かえて、」ｒ「菌株及び基質を３−イソプロピル−５−
アセトキシメチルオキサゾリジン−２−オンにかえて、
」に訂正する。

（至）同第３８頁表６中の基質のＪ）４の１（ト）−３
−イソブロビルアシロギシメチルオキサゾリジン−２−
オンＪ　ｋ　Ｉ’　（ｅ→−３−１ソプロピルア中トギ
シメチルオキザノリジン−２−オン」に５丁１Ｆする。

以　　　」ニ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （式中、Ｘは低級アルキル基、Ｙは置換又は未置換アル
   キル基、アルケニル基或いは置換又は未置換芳香族炭化
   水素基） で表わされる３−アルキル置換−５−アシロキシメチル
   オキサゾリジン−２−オンラセミ体に、化合物（Ｉ）を
   不斉的に加水分解して、（式中、Ｘは前記と同じ） で表わされる光学活性Ｈ−８−アルキル置換−５−ヒド
   ロキシメチルオキサゾリジン−２−オンを生成させる立
   体選択的エステラーゼ活性を有する微生物又は該微生物
   より得られた酵素を作用させる事により化合物（１）を
   生成させ、生成した化合物（１）及び有機酸と未（式中
   、Ｘ、Ｙは前記と同じ） で表わされる光学活性（ト）−３−アルキル置換−５−
   アシロキシメチルオキサゾリジン−２−オンを分離し、
   次いで化合物〔白を採取することを特徴とする光学活性
   （ト）−３−アルキル置換−５−アシロキシメチルオキ
   サゾリジン−２−オンの製造方法。 （２）化合物ＣＩ）の式中Ｘがｔ−ブチル基又はイソプ
   ロピル基である特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 （３）化合物ＣＩ）の式中Ｙの置換又は未置換芳香族炭
   化水素基がアリール基（ａｒｙ’ｌ）、ＩＩ換アリール
   基、アラルキル基又は置換アラルキル基である特許請求
   の範囲第１項記載の製造方法。 （４）微生物がエンテロバクタ−属、クレブシェラ属、
   ミクロコツカス属、シトロバクタ−属。 ニスケリチア属、シュードモナス属、スタフィロコッカ
   ス属、キャンディダ属、デバリオマイセス属、エンドマ
   イセス属、ハンゼヌラ属、ゲオトリクム属、クルイベロ
   マイセス属。 メＩ・シュニコウィア属、ピチアＸ　又はストレプトマ
   イセス 項記載の製造方法。 （５）微生物がエンテロバクタ−・アエロゲネス。 エンテロバクタ−・クロアカニ、クレブシェラ・ニュー
   モニエ、ミクロコツカス・ルテウス，シトロバタター・
   フロインディー、ニスケリチア・コリ、シュードモナス
   ・クルシヴイエ，シュードモナス・フルオレッセンス。 スタフィロコッカス・アウレウス、キャンデイダ・シュ
   ードトロピカリス、キャンデイダ・ケフイル，デバリオ
   マイセス・ハンゼニー。 エンドマイ士ス・ゲオトリクム，ハンゼヌラ・アノマラ
   、ハンゼヌラ・ミヌタ，ゲオトリクム・キャンディドウ
   ム，クルイベ口マイセス・フラギリス，メトシュニコウ
   ィア・プルチェリマ，ピチア・フリノサ，ビチア・メン
   ブラナエファシエンス，ストレプトマイセスラボビレン
   ス又はストレプトマイセス レウスである特許請求の範囲第１項又は第４項記載の製
   造方法。 （６）酵素が微生物菌体を破砕処理して得た無細胞抽出
   液の酵素或いは更にこの無細胞抽出液を硫安分画処理し
   て得た部分精製された酵素である特許請求の範囲第１項
   記載の製造方法。 （７）化合物（Ｉ）を添加した培地で、ｐ．ＦＩ４〜８
   の範囲で微生物を培養し、作用させる特許請求の範囲第
   １項記載の製造方法。 （８）微生物を栄養培地で培養して得た培養液、又はこ
   の培養液から微生物菌体を分離して菌体懸濁液を調製し
   、それを化合物〔１〕に作用させる特許請求の範囲第１
   項記載の製造方法。 （９）微生物の培養をｐＨ８〜１１の範囲で行い、培養
   液又は菌体懸濁液と化合物（１）との反応をｐＨ４〜８
   の範囲で行う特許請求の範囲第８項記載の製造方法。 （Ｉ（）　　酵素と化合物〔１〕との反応を１０〜５０
   °Ｃ。 ｐＴＴ４〜８の範囲で行う特許請求の範囲第１項又は第
   ６項記載の製造方法。 （１１）化合物〔自と生成する化合物（Ｉｔ）及び有機
   酸を分離する方法において、有機溶媒で抽出分前する特
   許請求の範囲第１項記載の製造方法。 （１埠　　化合物〔ｒ〕と生成する化合物（ＩＩ）及び
   有機酸を分離する方法において、反応液を一旦有機溶媒
   で転溶するか、又はそのまま反応液をカラノ・クロマト
   グラフィー処理で分離する特許請求の範囲第１項記載の
   製造方法。 （１；ヤ　　化合物〔白と生成する化合物〔口及び有機
   酸を分離する方法において、反応液を一旦有機溶媒で転
   溶するか、又はそのまま反応液を分溜操作により分離す
   る特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 （式中、Ｘは低級アルキル基、Ｙは置換又は未置換アル
   キル基，アルケニル基或いは置換又は未置換芳香族炭化
   水素基） で表わされる３−アルキル置換−５−アシロキシメチル
   オキサゾリジン−２−オンラセミ体に、化合物（１）を
   不斉的に加水分解して（式中、Ｘは前記と同じ） で表わされる光学活性０３−アルキル置換−５−ヒドロ
   キシメチルオキサゾリジン−２−オンを生成させる立体
   選択的エステラーゼ活性を有する微生物又は該微生物よ
   り得られた酵素を作用させる事により化合物（ＩＩ）を
   生成させ、生成した化合物（１）及び有機酸と未反り （式中、Ｘ．Ｙは前記と同じ） で表イ）される光学活性（ト）−３−アルキル置換−５
   −アシロキシメチルオキサゾリジン−２−オンを分離後
   、化合物（Ｉ）を採取し、次いで採取した化合物〔１〕
   を加水分解し、（」 （式中、Ｘは前記と同じ） で表わされる光学活性（−））−８−アルキル置換−５
   −ヒドロキシメチルオキサゾリジン−２−オンを生成さ
   せ、採取することを特徴とする光学活性（ト）−３−ア
   ルキル置換−５−ヒドロキシメチルオキサゾリジン−２
   −オンの製造方法。 （ｌＴｈ　　化合物（１）の式中Ｘがｔ−ブチル基又は
   イソプロピル基である特許請求の範囲第１４項記載の製
   造方法。 ０〔９化合物ＣＩ、ｌの式中Ｙの置換又は未置換芳香族
   炭化水素基がアリール基（ａｒｙ’ｌ）、置換アリール
   基、アラルキル基又は置換アラルキル基である特許請求
   の範囲第１４項記載の製造方法。 ０η　微生物がエンテロバクタ−属、クレブシェラ属、
   ミクロコツカス属、シトロバクタ−属。 ニスケリチア属、シュードモナス属、スタフィロコッカ
   ス属、キャンディダ属、テバリオマイセス属、エンドマ
   イセス属、ハンゼヌラ属、ゲオトリクム属、クルイベロ
   マイセス属。 メトシュニコウィア属、ヒチアＲ又ハスＩ−１／ブトマ
   イセス属に属する特許請求の範囲第１４項記載の製造方
   法。 （至）微生物がエンテロバクタ−・アエロゲネス。 エンテロバクタ−・クロアカニ、クレブシェラ・ニュー
   モニエ、ミクロコツカス・ルテウス、シトロバクタ−・
   フロインティー、ニスケリチア・コリ、シュードモナス
   ・クルシヴイエ、シュードモナス・フルオレッセンス。 スタフィロコッカス・アウレウス、キャンデイダ・シュ
   ードトロピカス、キャンディダ・ケフイル、デバリオマ
   イセス・ハンゼニー。 エンドマイセス・ゲオトリクム、ハンゼヌラ・アノマラ
   、ハンゼヌラ・ミヌタ、ゲオトリクム・キャンディドウ
   ム、クルイベロマイセス・フラギリス、メトシュニコウ
   イア・プルチェリマ、ビチア・フリノサ、ピチア・メン
   ブラナエファシエンス、ス］・レプトマイセス・フラボ
   ビレンス又はストレプトマイセス・アウレウスである特
   許請求の範囲第１４項又は第１７項記載の製造方法。 ０呻　酵素が微生物菌体を破砕処理して得た無細胞抽出
   液の酵素、或いは更に硫安分画処理して得た部分精製さ
   れた酵素である特許請求の範囲第１４項記載の製造方法
   。 （ホ）化合物〔１〕を添加した培地で、ｐＩ−Ｉ４〜８
   の範囲で微生物を培養し、作用させる特許請求の範囲第
   １４項記載の製造方法。 ＠１）　　＊生物を栄養培地で培養して得た培養液、又
   はこの培養液から微生物菌体を分離して菌体懸濁液を調
   製し、それを化合物（Ｉ）に作用させる特許請求の範囲
   １４項記載の製造方法。 ＠　微生物の培養をｐＨ８〜１１の範囲で行い、培養液
   又は菌体懸濁液と化合物〔１〕との反応をｐＨ４〜８の
   範囲で行う特許請求の範囲第２１項記載の製造方法。 に）酵素と化合物（１）との反応を１０〜５０’ｃ。 ｐＨ４〜８の範囲で行う特許請求の範囲第１４項又は第
   １９項記載の製造方法。 ■　化合物〔白と生成する化合物（Ｉｔ）及び有機酸を
   分離する方法において、有機溶媒で抽出分離する特許請
   求の範囲第１４項記載の製造方法。 （ハ）化合物〔白と生成する化合物（ＩＩ）及び有機酸
   を分離する方法において、反応液を一旦有機溶媒で転溶
   するか、又はそのまま反応液をカラムクロマトグラフィ
   ー処理で分離する特許請求の範囲第１４項記載の製造方
   法。 （ホ）化合物〔１′〕と生成する化合物（１）及び有機
   酸を分離する方法において、反応液を一旦有機溶媒で転
   溶するか、又はそのまま反応液を分溜操作により分離す
   る特許請求の範囲第１４項記載の製造方法。 （イ）化合物〔白を加水分解する方法において、ｐｌ［
   ８〜１３の範囲に保持し、化学的に加水分解反応を行う
   特許請求の範囲第１４項記載の製造方法。 （ハ）化合物〔白を加水分解する方法において、ｐｌ【
   ４〜８の範囲で加水分解酵素を作用させ、酵素的に加水
   分解反応を行う特許請求の範囲第１４項記載の製造方法
   。