JPH0253497A

JPH0253497A - 光学活性なマンデル酸の製法

Info

Publication number: JPH0253497A
Application number: JP63204991A
Authority: JP
Inventors: Fumihiro Ishimura; 文宏石村; Satoru Ishikawa; 覚石川; Seiji Akiyama; 整治秋山; Masaki Takada; 正樹高田
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1988-08-18
Filing date: 1988-08-18
Publication date: 1990-02-22

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、式（１）は不斉炭素を示す）で表される光学活性なマンデル酸類の製法に関する。

本発明により製造される光学活性なマンデル酸類は、医
薬品の製造原料特にペニシリンやセファロスポリンの側
鎖修飾剤として、また、液晶化合物の原料として有用で
ある。

（従来の技術及びその課題）従来、式（１）で表される化合物の製造法としては、■
ベンズアルデヒドとＨＣＮを用いてラセミ体のマンデル
酸を合成し、ついで光学分割を行う方法があり、その光
学分割法として、分別結晶による方法、クロマトグラフ
ィーによる方法、有機化学的な不斉合成法等、■ストレ
プトコンカス属、ラクトバチルス属、ペデイオコッカス
属、ロイコノストック属、ノカルデイア属に属する微生
物から選ばれた微生物の培養物またはその培養物から採
取された酵素を、ヘンゾイルギ酸に作用せしめ、光学活
性なマンデル酸を得る方法（特開昭６３−３２４９２号
公報５特開昭６３−３２４８０号公報、特開昭６２−６
１５８７号公報、特開昭５７−１９８０９７号公報、特
開昭５７−１９８０９６号公報）等が知られていた。

しかし、■の方法は、操作が煩雑であるとか、収率が低
い、生成物の光学純度が低い等の欠点を有しており、■
の方法は、反応の場にニコチン・アデニン・ジヌクレオ
チド等の高価な補酵素を必要とすること、光学純度が低
い等の欠点を有しており、安価に効率よく製造するには
問題があった。

〔問題点を解決するための手段〕本発明者らは、ｄ体と１体のマンデル酸エステルの混合
物から、いずれが一方のカルボン酸またはその対掌体カ
ルボン酸エステルを、工業的に効率良く醗酵工学的に不
斉加水分解して取得する方法に関して前述の従来技術の
問題点を鑑み、鋭意研究した。そしてその結果、極めて
効率良くしかも光学純度の高い光学活性なマンデル酸類
を製造できることを見出し本発明を完成した。

即ち、本発明は、式（１）は不斉炭素を示す）ぢで表される光学活性なマンデル酸類を製造する１５ｋに
おいて、弐（ｎ）（式中Ｒ３は低級アルキル基そ不ＩＪで表される化合物に、該化合物のエステル結合を不斉加
水分解する能力を有する微生物の培養物またはその処理
物を作用せしめ、反応混合物から、式（＋）で表される
光学活性なマンデル酸類を取得することを特徴とする光
学活性なマンデル酸類の製法を提供するものである。

本発明の出発原料である式（Ｉ［］で表される化合物は
、ｄ体と１体の混合物であり、例えば式〔■〕における
ａＲｌ　はメチル、エチル等低級アルキル基であり、本
化合物としてはマンデル酸メチルエステル１マンデル酸
エチルエステルなどが挙げられる。このｄ体とβ体の該
エステルの混合割合は、特に限定されるものでは無く、
これらの化合物はそれ自体公知の化合物であるか、また
は公知化合物の製造方法に準じて容易に製造されるもの
である。

本発明に用いられる式（ＩＩ）で表される化合物のエス
テル結合を不斉加水分解する能力を存する微生物として
は、スポロボマイセス属、シュードモナス属、トリコス
ポロン属、フラボバクテリウム属からなる群より選ばれ
る微生物が挙げられ、好ましくは、シュードモナス・リ
バフラビナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｒｉｂａｆｌ
ａｖｉｎａ　　）　、　　シュードモナス０デイミイヌ
タ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｄｉｍｉｎｕＬａ）、
　　フラボバクテリウム・フラルム（Ｆｌａｖｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｒｕｓ）　　、　　）リコスボ
ロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　　ｃｕ
ｔａｎｅｕｍ　　）スポロボマイセス・アルボ　ルベラ
センス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｏ−ｒ
ｕｂｅｓｃｅｎｓ）およびこれらの変異株またはこれら
の遺伝子操作、細胞融合によって誘導される本発明の特
徴である式〔■〕で表される化合物のエステル結合を不
斉加水分解する能力を有する微生物からなる群より選ば
れる微生物である。より具体的に選択された微生物とし
てはシュードモナス・リバフラビナｌＰＯ３１４０株、
シュードモナス・ディミイヌタＡＴＣＣ１１５６８株、
フラボバクテリウム・フラルムＩＦ０　３７７２株　）
リコスボロン・クタネウムＩＦ０　０１７３株、スポロ
ボマイセス・アルボ　ルベラセンスＡＴＣＣ２４２１６
株が挙げられる。

該微生物の培養物としては、培養された該微生物菌体お
よび／または該微生物培養液が挙げられる。その処理物
とは、培養された該微生物菌体および／または該微生物
培養液の処理物である。該微生物菌体の処理物としては
、乾燥菌体例えば凍結乾燥菌体、噴霧乾燥菌体または有
ｍ？８媒例えばアセトン、トルエン等で処理した菌体、
菌体破砕物、菌体抽出物、または固定化処理物が挙げら
れる。

更に、培養された該微生物菌体および／または該微生物
培養液の処理物としては、培養された該微生物菌体およ
び／または該微生物培養液を処理することによって採取
され、且つ式〔■］で表される化合物に作用し、該化合
物のエステル結合を不斉加水分解する能力を有する酵素
（通常、エステラーゼとして、命名されているもので、
水に不溶なエステル基質に対して活性を有するリパーゼ
を含む広義のエステラーゼを意味する）またはその処理
物が挙げられる。

該酵素を抽出取得するにあたっては、通常、微生物等か
ら酵素を取得するための種々の方法を駆使すれば良く、
例えば、赤堀四部編　酵素研究法第１巻、（１９５５年
）に記載の種々の抽出法にしたがって抽出される。単離
精製する場合においても、上記の酵素研究法等の種々の
公知文献に記載の方法を駆使し、該化合物のエステル結
合を不斉加水分解する酵素を取得すればよい。また、そ
の処理物は、上記の如くして得られた酵素を凍結乾燥、
噴霧乾等の乾燥処理を施した乾燥酵素、または固定化処
理物が挙げられる。

該微生物菌体又は該酵素の固定化処理物としては、固定
化微生物又は固定化酵素が挙げられる。

本発明に使用されうる固定化処理物としては、基質との
連続反応に使用出来うるちのであればいずれも採用でき
、例えば水不溶性の担体例えばセルロース、アガロース
等の多＃ａ類及びその誘導体、多孔性ガラス等への担持
、架橋剤例えばグルタルアルデヒド等による架橋二合成
高分子例えばポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアル
コールゲル、光硬化性樹脂又は天然高分子例えば澱粉、
カラギーナン、カゼインゲル等による包括等により固定
化された固定化微生物又は固定化酵素が挙げられる。

本発明方法を実施するには、原料化合物である弐（Ｉｔ
）で表される化合物の濃度を、通常０．５〜４０％（Ｖ
／Ｖ）とすれば良く、好ましくは１０〜５．０％（Ｖ／
Ｖ）とする。反応媒体としては、水又は緩衝液例えばリ
ン酸緩衝液が用いられる。菌体またはその処理物を用い
る場合は、その使用量は、菌体またはその処理物が有す
るエステラーゼ活性から換算して０．１〜ＩＯＵ／ｉｆ
、好ましくは１〜５Ｕ／ｄ、となる量を加えればよく、
酵素またはその処理物査用いる場合は、その使用量は、
酵素またはその処理物が有するエステラーゼ活性から換
算して０．１−１０Ｕ／ｄ、好ましくは１〜５υ／　ｔ
ｅｌとなる量を加えればよい。

また反応温度は、−１０〜４０°Ｃ１好ましくは一１０
〜３０°Ｃであり、氷点下で反応を行う場合には、必要
に応じメタノール、エタノール等のアルコール、ＤＭＳ
Ｏ等の水溶性有機溶媒を添加し反応を行えばよい。反応
時間は、１〜２４時間、好ましくは２〜１０時間であり
、反応時のｐＨは３〜７程度、好ましくはｐＨ４〜６に
調整する。ｐ＋１の調整に関しては、反応が進行するに
伴い生成するカルボン酸によりｐＨが低下してくるので
、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム
等の中和剤を反応の進行に従って随時添加してもよい。

反応後、反応液または培養液からの生成物の分離精製は
、通常の公知方法、例えば再結晶、抽出、カラムクロマ
トグラフィー、蒸溜等により行えばよく、菌体等を用い
る場合には、例えば遠心分離により反応媒体から分離す
ればよい。

〔実施例〕

以下、実施例により、本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例に限られるものではない。

実施例　１（１）グルコース２％、ペプトン０．５％、麦芽エキス
０．３％、イーストエキス０．３％、を含む培地（ＰＨ
６，０）１０００ｔ１！を滅菌し、スポロボマイセス・
アルボ　ルベラセンスＡＴＣＣ２４２１６株を接種し、
２８°Ｃで７０時間培養した。培養液を遠心濾過して菌
体を集め、これに生理食塩水１００ｄを加え、菌体懸濁
液を得た。

（２１ｄＮ−マンデル酸メチルエステルＩｇを含む２０
０ｄの水に、（１）で得られた菌体懸濁液全量を加え、
ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液にて、ｐ　Ｈ５，０に調整
し、２０°Ｃで４時間反応させた。反応中、ＩＮ水酸化
ナトリウムを添加することによりＰＨ５，０に調製した
０反応後、反応液を遠心濾過して菌体を除き、酢酸エチ
ル１００ｄを用い残存する加水分解されていないマンデ
ル酸メチルエステルを抽出した。この抽出操作を更に酢
酸エチル１ＯＯＩｄを用い実施した。反応水溶液を更に
、２Ｎ塩酸水溶液によりｐＨ２，０に調製し、酢酸エチ
ル１００ｄｘ２回抽出した。ｐＨ２，０に調製した水溶
液から抽出した酢酸エチル層を合わせ、減圧下、酢酸エ
チルを留去し、粗粉末を得た。

得られた粗粉末に酢酸エチル１５ｍを加え溶解し、その
後、０．２ｇのカーボン（タチコール；武田薬品工業製
）を加え、攪拌した。攪拌後の溶液を吸引濾過により濾
過し、カーボンを除去し、濾液を約７ｄにまで減圧下、
酢酸エチルを留去し、冷却下−夜静置し、晶出した結晶
を濾取、乾燥し、０．２１ｇの！−マンデル酸を得た。

光学純度は、下記の条件のＨＰＬＣを用い決定し、その
結果、４体は検出されず、１００％の光学純度を示した
。

ＭＰｌｊ嘱に住カラム　；エナンティオＬＬ（東ソー製）移動相　；　
１　＋ｉＭ　ＣｕＳＯｓ　・５ＨｔＯ溶液流速　　；ｌ
ｌｌｌＺ分検出　　；ＵＶ　　２５４ｎｍ温度　　；４５°Ｃ上記条件にて１体の保持時間　１０．５’ ４体の保持時間　１４．０’ であった。

（３）前述工程により得られたマンデル酸メチルエステ
ルを含む酢酸エチル層２００−を減圧下、酢酸エチルを
留去し、粗粉末を得た。得られた粗粉末に酢酸エチル１
５ｍを加え溶解し、その後、０．２ｇのカーボン（タチ
コール；武田薬品工業製）を加え、攪拌した。攪拌後の
溶液を吸引濾過により濾過し、カーボンを除去し、濾液
を約４　ｍｌにまで減圧下、酢酸エチルを留去し、冷却
下−夜静置し、晶出した結晶を濾取、乾燥し、０．３２
ｇのｄ−マンデル酸メチルエステルを得た。光学純度は
、立体選択性加水分解を触媒せず、単なる加水分解を触
媒するロドトルーラー・グルティニス（Ｒｈｄｏｔｏｒ
ｕｌａ　　ｇｌｕｔｉｎｉｓ　　）　　Ｉ　Ｆｏ　　０
３８９株の培養菌体懸濁液を用い、加水分解反応させた
後、（２）に記載のＨＰ　Ｌ　Ｃ条件にて分析した結果
、２体は検出されず、１００％の光学純度を示した。尚
、ロドトルーラー・グルティニス（Ｒｈｄｏｔｏｒｕｌ
ａ　ｇｌｕ口ｎｉｓ　）ｒＦｏ　　０３８９株の培養菌
体懸濁液Ｑ液は（１）に記載の培養方法に従い鋼製した
。

実施例　２（１）　　ペプトン２．０％、イーストエキス０．４％
、を含む培地（ｐ＋Ｔ７．Ｏ）ＩＯＭを滅菌し、シュー
ドモナス・ディミイヌタ（Ｐｓｅｕｄｏ＋Ｉｏｎａｓ　
ｄｉｍｉｎｕｔａ）　　Ａ　ＴＣＣ１１５６８株を接種
し、２８°Ｃで３０時間培養した。培養液を遠心ｉｌ！
過して菌体を集め、これに生理食塩水２ｄを加え、菌体
懸濁液を得た。

（２）ｄｊ！−マンデル酸メチルエステル０．１ｇを含
む２０ｄの水に、上記の（１）で得られた菌体懸濁液全
量を加え、ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液にて、ｐＨ５，
０に調整し、３０°Ｃで６時間反応させた。反応後、実
施例１の（２）と同様な操作を行い、カーボン処理した
酢酸エチル層に含まれるマンデウ酸の光学純度を、実施
例１の（２）に記載の方法により測定し、９０％の光学
純度である２体であることを確認した。また、含まれる
マンデル酸の量は、以下のＨＰＬＣ条件により定量し、
０．０２ｇの結果を得た。

マンー゛ル　　　のためのＨＰＬＣカラム　、ＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ３１２（山村化学！！り移動相　ｔアセトニトリル：　Ｈ，Ｏ＝３　：　７温度
　　；２５°Ｃ流速　　；１ｍｆｆ１／分検出　　；Ｒ１（示差屈折率検出）上記条件にて、マンデル酸メチルエステルの保持時間８．５′マンデル
酸の保持時間　　　　　　　４．５′であった。

実施例　３〜５第１表に記載した培地１００　ｍｌを滅菌し、第１表に
記載した各微生物を接種し、２８°Ｃで、培養を行った
後、実施例２の（１）と同様に集菌した。得られた微生
物菌体を用い、実施例２の（２）と同様にｄＮ−マンデ
ル酸メチルエステルＯ，Ｉｇを基質とする反応を第１表
に記載した反応条件で行い、実施例２の（２）と同様に
処理し、実施例２の（２）と同様に光学純度と収量を測
定した。その結果を第１表に示す。

〔発明の効果〕

本発明によれば、効率よく、しかも高光学純度の光学活
性なマンデル酸類を製造することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕（式中Ｒは水素原子または低級アルキル基を、Ｃ＾＊は
不斉炭素を示す）で表される光学活性なマンデル酸類を製造する方法にお
いて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼〔II〕（式中Ｒ＿１は低級アルキル基を示す）で表される化合物に、該化合物のエステル結合を不斉加
水分解する能力を有する微生物の培養物またはその処理
物を作用せしめ、反応混合物から、式〔 I 〕で表され
る光学活性なマンデル酸類を取得することを特徴とする
光学活性なマンデル酸類の製法。
（２）該化合物のエステル結合を不斉加水分解する能力
を有する微生物が、スポロボマイセス属、シュードモナ
ス属、トリコスポロン属、フラボバクテリウム属からな
る群より選ばれる微生物である特許請求の範囲第１項記
載の製法。