WO1996017930A1 - Nouveau gene de decarboxylase de lysine et procede de production de lysine l - Google Patents

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WO1996017930A1
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Yoshimi Kikuchi
Tomoko Suzuki
Hiroyuki Kojima
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to a novel lysine decarboxylase gene of Escherichia coli involved in the degradation of L-lysine, which gene is known as the gene and / or cad A gene.
  • demand for L-lysine has been rapidly increasing as a feed additive.
  • lysine decarboxylase As a L-lysine degrading enzyme of Escherichia coli, lysine decarboxylase, which catalyzes a reaction to produce cadaverine by decarboxylation of L-lysine, is known.
  • the amino acid sequence encoded by the gene has already been reported (Meng, S and Bennett, GN, J. Bacteriol., 174, 2659 (1992)).
  • weak activity was detected in a mutant strain of Escherichia coli for lysine decarboxylase encoded by genes other than cad A in Escherichia coli (Goldemberg). , SH, J.
  • An object of the present invention is to obtain a novel lysine decarboxylase gene of Escherichia coli, and to provide an L. escherichia coli having reduced expression of this gene and / or cadA gene.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing L-lysine by constructing a lysine-producing bacterium and culturing these microorganisms.
  • the present inventors have constructed an Escherichia coli strain in which the cad A gene, which is a known lysine decarboxylase gene, has been disrupted.In this strain, cadaverine, which is a degradation product of L-lysine by lysine decarboxylase, is still present. Found to be generated.
  • the present inventors presume that a novel lysine decarboxylase gene is present in Escherichia coli, which has a significant effect on fermentative production of L-lysine using a microorganism of the genus Escherichia, As a result, we succeeded in obtaining a novel lysine decarboxylase gene different from the cad A gene, and suppressed the expression of this gene in L-lysine-producing bacteria of Escherichia coli. Furthermore, they found that suppressing the expression of the cad A gene significantly reduced or eliminated the activity of degrading L-lysine and significantly improved the L-lysine producing ability, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides a novel gene encoding lysine decarboxylase derived from Escherichia coli (this gene was designated as “1dc” gene). -The present invention also provides a microorganism belonging to the genus Escherichia, which has an ability to produce L-lysine, and in which lysine decarboxylase activity in cells is reduced or eliminated.
  • the present invention provides a method for producing L-lysine, which comprises culturing the microorganism of the genus Escherichia in a liquid medium, producing and accumulating L-lysine in the culture, and collecting the L-lysine. .
  • Microorganisms belonging to the genus Escherichia include, for example, lysine decarboxylase in cells due to suppressed expression of 1 dc gene and no or cad A gene. Microorganisms whose activity has been reduced or eliminated.
  • the DNA fragment containing the novel lysine decarboxylase gene (1 dc) of the present invention can be obtained as follows from an available strain of Escherichia coli, for example, K-12 strain or a derivative strain thereof. .
  • the cadA gene a known lysine decarboxylase gene
  • the nucleotide sequence of the cdA gene and the amino acid sequence encoded thereby are shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively.
  • a DNA fragment having a sequence similar to this cad A gene was cloned from a chromosomal DNA library of Escherichia coli W3110 using a plasmid vector or a phage vector, and a novel lysine decarboxylase was added to this DNA fragment. Make sure the gene is included. Confirmation that the target gene is contained can be performed by Southern hybridization using a probe prepared by PCR.
  • the nucleotide sequence of the gene contained in the thus obtained DNA fragment is determined as follows. First, the above DNA fragment is ligated with a plasmid vector capable of autonomous propagation in Escherichia coli cells to prepare a recombinant DNA, which is introduced into a competent cell of Escherichia coli. The obtained transformant is cultured in a liquid medium, and the recombinant DNA is recovered from the grown cells. The entire nucleotide sequence of the DNA fragment contained in the recovered recombinant DNA was determined by the dideoxy method (Sanger. F. et al, Proc. Natl. Acad. Sci .. 74, 5463 (1977)), and the DNA was subjected to structural analysis. To determine the location of promoter, operator, SD sequence, start codon, stop codon, open reading frame, etc.
  • the novel lysine decarboxylase gene of the present invention has a sequence ranging from the 005th to the 107th position to the 3141 to the 3143th position of the GGA of the entire nucleotide sequence of the DNA fragment shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. .
  • This gene encodes a lysine decarboxylase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • This new The homology between lysine decarboxylase and lysine decarboxylase encoded by the cad A gene was 69.4%.
  • the gene of the present invention may be any as long as it encodes a lysine decarboxylase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing, and its base sequence is not limited to the above. Further, the lysine decarboxylase encoded by the gene of the present invention has, in the amino acid sequence, substitution, deletion or insertion of one or more amino acid residues that do not substantially impair lysine decarboxylase activity. It may be.
  • a gene encoding a lysine decarboxylase having such a deletion, insertion or substitution can be obtained from a microorganism of the genus Escherichia other than Escherichia or Escherichia coli, a spontaneous mutant or an artificially mutant, Escherichia or Escherichia coli. .
  • a mutant gene encoding a lysine decarboxylase having a deletion, insertion or substitution is obtained by in vitro mutagenesis of a gene encoding a lysine decarboxylase having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, or site-specific. It can also be obtained by performing a mutation treatment. These mutation treatments can be performed by a method well-known to those skilled in the art as described below.
  • ⁇ dc gene the gene encoding a lysine decarboxylase having one or more amino acid residues having S-substitution, deletion or insertion is derived from ⁇ dc gene, It refers to something that can be considered substantially the same and is not intended to be extended to messages of different origins.
  • the “plurality” is, for example, the cad A gene which codes for the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a protein having more than 200 amino acid residues Is different from the gene of the present invention.
  • a gene encoding a protein having the same lysine decarboxylase activity even if the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 differs by a few amino acid residues is the gene of the present invention Will be readily understood by those skilled in the art.
  • the microorganism of the genus Escherichia of the present invention is a microorganism which is associated with Escherichia, wherein the lysine decarboxylase activity in the cell is reduced or eliminated.
  • Esseri Examples of microorganisms belonging to the genus A. include Escherichia coli. Reduction or elimination of lysine decarboxylase activity in cells is achieved, for example, by suppressing the expression of one or both of the novel lysine decarboxylase gene (1 dc) and the known cadA gene. Will be In addition, by modifying the structure of the lysine decarboxylase enzyme encoded by these genes to reduce or eliminate the specific activity, the lysine decarboxylase activity in the cell may be reduced or eliminated. it can.
  • Means for suppressing the expression of the dc gene and the known cadA gene include, for example, substitution, deletion, insertion, addition or addition of one or more bases in the promoter sequence of these genes.
  • There is a method to suppress gene expression at the transcriptional level by inverting and reducing promoter activity M. Rosenberg and D. Court, Ann. Rev. Genetics 13 (1979) p. 319, P. Youderian, S. Bouvier and M.
  • substitution, deletion, insertion, addition or addition of one or more bases in the base sequence in the coding region of the lysine decarboxylase gene can be performed.
  • There are ways to alter or destroy the coding region by inverting it. -Genes that cause substitution, deletion, insertion, addition or inversion of bases include, in addition to 1 dc gene and cad A gene, one or more genes that do not substantially impair lysine decarboxylase activity It may be a 1dc gene or a cadA gene having a substitution, deletion or insertion of an amino acid residue.
  • site-directed mutagenesis (Kramer, W. and Frits, HJ, Methods in Enzymology, 154) , 350 (1987)) or a treatment with a chemical agent such as sodium hyposulfite and hydroxylamine (Shortle. D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. S. ci. USA, 75. 270 (1978)).
  • a chemical agent such as sodium hyposulfite and hydroxylamine
  • the site-directed mutagenesis method is a method using a synthetic oligonucleotide, and is a technique capable of introducing an arbitrary substitution, deletion, insertion, addition or inversion into only an arbitrary limited base pair.
  • a plasmid having a target gene whose cloned DNA sequence has been determined is denatured to prepare a single strand.
  • a synthetic oligonucleotide complementary to the portion to be mutated is synthesized, but at this time, the synthetic oligonucleotide is not completely complementary, and any base substitution, deletion, insertion, addition or addition is performed. Have an inversion.
  • a double-stranded plasmid is synthesized and introduced into Escherichia coli combined cells. Some of the transformants thus obtained have a plasmid containing a gene in which any base substitution, deletion, insertion, addition or inversion is fixed.
  • a similar technique that can introduce mutations into a gene and modify or destroy it is the recombinant PCR method (PCR Technology, Stockton press (1989)).
  • a DNA fragment containing the target gene is directly treated with sodium hyposulfite, hydroxylamine, etc., so that base substitution, deletion, insertion, addition or inversion is randomly performed in the DNA fragment.
  • dc gene and / or cad gene in the cell By substituting the gene obtained by introducing the mutation obtained as described above and modified or destroyed with a normal gene on the chromosome of a microorganism belonging to the genus Escherichia, 1 dc gene and / or cad gene in the cell can be obtained. A gene expression can be suppressed.
  • a method of gene replacement a method using homologous recombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S.. J. Bacteriol.. 162 , 1196 (1985)). Homologous recombination is a general ability of microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • homologous recombination When a plasmid or the like having a sequence having homology to a chromosomal sequence is introduced into a cell, homologous recombination has a certain frequency. Recombination occurs at the site of the desired sequence, and the entire introduced plasmid is integrated on the chromosome. No. After that, if recombination occurs further at the location of the homologous sequence on the chromosome, the plasmid will fall out of the chromosome again, but the gene into which the mutation has been introduced depending on the recombination position will be the chromosome. It is fixed on top and the original normal gene may fall off the chromosome along with the plasmid. By selecting such a strain, a gene that has been altered or disrupted by introducing a mutation having a base substitution, deletion, insertion, addition or inversion has been replaced with a normal gene on the chromosome. A strain can be obtained.
  • Escherichia coli microorganisms that perform gene replacement are L-lysine-producing microorganisms.
  • a microorganism belonging to the genus Escherichia having L-lysine-producing ability for example, an Escherichia coli strain, is obtained by subjecting a strain having no L-lysine-producing ability to mutation treatment to obtain S- (2-aminoamino) -L-cystine (hereinafter referred to as AEC).
  • Mutation treatment methods include treatment of the cells of Escherichia coli with a chemical agent such as N-methyl-1N'-nitro-N-nitrosoguanidine or nitrite, or treatment with ultraviolet light or radiation. is there.
  • a specific example of such a strain is Escherichia coli, E. coli AJ13069 (FERMP-146690). This strain was bred by imparting AEC resistance to the W3110 strain derived from Escherichia coli K-12.
  • Escherichia coli 'AJ13309 was established on February 6, 1994 by the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Postal code: 2005, 1-3 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan) Deposit No. FERMP-144690, deposited on September 29, 1995 and transferred to the International Deposit under the Budapest Treaty, and given the accession number FERMBP-5252. ing.
  • Escherichia coli having L-lysine-producing ability can also be bred by introducing and enhancing DNA carrying genetic information involved in L-lysine biosynthesis by genetic recombination technology.
  • Genes to be introduced include L-lysine such as aspartokinase, dihydroxypicolinate synthase, dihydrodipicolinate reductase, succinyldiaminopimelate transaminase, succinyldiaminopimelate deacylase, etc. Is a gene that encodes an enzyme in the biosynthetic pathway of L-lysine, such as aspartase and dihydrodipicolinate synthase.
  • N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine nitrite is added to the cells of the microorganism of the genus Escherichia having the gene.
  • a chemical agent such as, or by treating with ultraviolet light or radiation.
  • the construction of the Escherichia coli strain in which the function of the lysine decarboxylase gene was disrupted was performed by deleting a part of the coding region and replacing it with a drug-resistant gene.
  • the expression of only one of the novel lysine decarboxylase gene and the cdA gene of the present invention can be suppressed, or the expression of both can be suppressed.
  • the expression of the lysine decarboxylase gene may be suppressed in an Escherichia coli microorganism having L-lysine-producing ability, or the L-lysine-producing ability may be reduced by the above-described method for a microorganism of the genus Escherichia in which the expression of a lysine decarboxylase gene is suppressed. May be provided.
  • the medium used for L-lysine production is a conventional medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions and, if necessary, other organic micronutrients.
  • a carbon source sugars such as glucose, lactose, galactose, fructose and starch hydrolysate, alcohols such as glycerol and sorbitol, and organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid can be used.
  • the nitrogen source include inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate; organic nitrogen sources such as soybean hydrolysate; ammonia gas; and aqueous ammonia.
  • inorganic ions small amounts of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ion, manganese ion and the like are added. In addition to these, it is desirable to add a suitable amount of biyumin B or yeast extract as an organic trace nutrient source.
  • the culture is preferably carried out under aerobic conditions for about 16 to 72 hours.
  • the culture temperature is controlled at 30 to 45 ° C, and the pH is controlled at 5 to 7 during the culture.
  • an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas, or the like can be used.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of a plasmid pUC 6 F 5 HH 5 containing a novel lysine decarboxylase gene.
  • FIG. 2 shows the structure of the temperature-sensitive plasmid p TS6F5HH5 containing the novel lysine decarboxylase gene and the plasmid p in which a part of the gene of the gene was replaced with a fragment containing the chloramphenicol resistance gene.
  • FIG. 3 is a diagram showing the construction of TS 6 F 5HH 5 Cm.
  • FIG. 4 is a graph showing a comparison of L-lysine degrading activity in the nondecarboxylase gene disrupted strains WC196C, WC196L and WC196LC strains.
  • Chromosomal DNA was extracted from the Escherichia coli K—12 strain W3110 strain obtained from the National Institute of Genetics (Yata, Mishima City, Shizuoka Prefecture, Japan) according to the usual method. .
  • SEQ ID NO: 5 the nucleotide sequence of cad A gene (see SEQ ID NO: 5) described in Meng, S and Bennett, GN. J. Bacteriol.
  • One or two synthetic DNA primers as shown in and 2 were synthesized by a conventional method. These have sequences homologous to the 5'-terminal upstream portion and the 3 'one-terminal portion of the cad A gene, respectively.
  • PCR was performed according to the method of Erlitz et al. (PCR Technology. Stockton press (1989)) to obtain a 2.1 kbp DNA fragment containing most of the cad A gene.
  • This fragment random primer one labeling kit (Takara Shuzo) and [a- S2 P] was prepared d C TP probes for labeled using (Amersham Japan Co.) hybrida I See collection. -Next, the prepared probe and Escherichia coli / Gene mapping membrane
  • the Escherichia coli Z Gene Mapping Membrane contains the library of Ohara et al. (Escherichia's coli chromosome DNA lambda phage library: Kohara,
  • the 6F5H lambda phage DNA belonging to the library of Kohara et al. (Kohara, Y, et al, Cell. 50. 495-508 (1987)) was isolated by a conventional method. After performing Southern blot hybridization using the above probe in the same manner as described above, a sequence similar to the cad A gene was found in the approximately 5 kbp DNA fragment cut with H ⁇ nd III. It is clear that it exists.
  • an approximately 5 kbp fragment obtained by digesting the 6F5H lambda phage DNA with HindIII and a HindIII digest of plasmid pUC19 (Takara Shuzo) were used with T4 DNA ligase. Connected.
  • Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo) is transformed with this reaction mixture, and a complete plate medium supplemented with 5 OmgZL of ampicillin (polypeptone 10 g, yeast extract 5 g, sodium chloride 5 g in 1 L of water) From the ampicillin-resistant strain grown above, a strain having a plasmid into which a fragment of about 5 kbp obtained by cutting lambda phage DNA of 6F5H with HindIII was inserted was obtained. Plasmid was extracted from the cells to obtain plasmid pUC6F5HH5.
  • Figure 1 shows the structure of plasmid pUC 6F5HH5.
  • Escherichia li JM109 / pUC6 F5HH5 which retains this plasmid, is named AJ13068 and, on December 6, 1994, was entrusted to the Life Science and Industrial Technology Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology under the accession number F ERM P-14689. Deposited and transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on September 29, 1995, and given the accession number F ERM BP-5251.
  • the nucleotide sequence from the obtained restriction enzyme C1aI site to HindIII site of PUC6F5HH5 was determined according to the method described in Molecular Cloning (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory press (1989). As a result, It has been found that it has the nucleotide sequence shown in No. 3. This DNA sequence contains an open reading frame encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • Escherichia coli W31 10 in a complete medium polypeptide 10 g, yeast yeast 5 g, sodium chloride 5 g in 1 L of water
  • cultured for 4 hours 200 g / cell
  • minimal plate medium phosphate containing 5 g / L of AEC
  • WC 196 strain had the ability to produce L-lysine.
  • the WC196 strain was named AJ13069, and was deposited on December 6, 1994 with the Institute of Biotechnology, Industrial Science and Technology under the accession number FERM P-14690, and on September 29, 1995 It has been transferred to an international deposit under the Strike Treaty and has been assigned the accession number FER MBP-5252.
  • a fragment of about 5 kbp obtained by digesting the 6F5H lambda phage DNA with HindII and a temperature-sensitive plasmid pMAN031 was ligated using T4 DNA ligase.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with this reaction mixture, and cultured on a complete plate medium supplemented with 5 OmgZL of ampicillin at 37 ° C for 24 hours.
  • the 6F5H lambda phage DNA was grown from the ampicillin-resistant strain grown.
  • Plasmid was extracted from the cells to obtain plasmid pTS6F5HH5. Cleavage with plasmid pTS6F5HH5EcoRV to remove the DNA fragment of about 1 kbp, followed by pHS G39 9 (manufactured by Takara Shuzo) is digested with AccI, and a fragment having a chloramfunicol resistance gene of about 1 kbp is inserted using T4 ligase to form plasmid pTS.
  • FIG. 2 shows the structure of plasmid pTS6F5HH5 and the plasmid pTS6F5HH5Cm.
  • a strain was constructed in which the novel lysine decarboxylase gene on the chromosome was replaced with a DNA fragment in which the function of the novel lysine decarboxylase gene was disrupted, and this strain was named WC196L strain.
  • the cad A gene deficient trait of this GNB 10181 strain was transformed into the WC196 strain by a general method using P1 phage (A Short Course in Bacterial Genetics, Co Id Spring Harbor Laboratory Press (1992)). Introduced the WC196C strain. The deletion of the cad A gene of the WC196 strain was confirmed by Southern blot hybridization. Also, as above A WC196 LC strain lacking the cadA gene was constructed from the WC196L strain by a suitable method.
  • L-lysine production medium (glucose 40 g, ammonium sulfate 16 g, potassium dihydrogen phosphate 1 g, yeast extract 2 g, manganese sulfate 4 to pentahydrate 10 mg, sulfuric acid 4 g) 10 mg of iron heptahydrate in 1 L of water, adjust the pH to 7.0 with potassium hydroxide, and add 3 Og of separately sterilized calcium carbonate) at 37 for 17 hours Cultured.
  • the collected cells were washed twice with saline, and the medium for assaying L-lysine degradation (17 g of disodium hydrogen phosphate '1 dihydrate, 3 g of potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g of sodium chloride) was used.
  • L-lysine hydrochloride (1 Og in 1 L of water) was suspended and cultured at 37 for 31 hours.
  • FIG. 3 shows the change over time in the amount of residual L-lysine in the culture solution.
  • the quantification of L-lysine was performed using a Biotech Analyzer AS-210 (manufactured by Asahi Kasei Corporation). Remarkable L-lysine degradation was observed in the WC196 strain, but the degradation activity was slightly reduced in the WC196C strain lacking the cadA gene, a known lysine decarboxylase gene. No degradation of L-lysine was observed in the WC196L strain and WC196LC strain in which the function of the decarboxylase gene was disrupted. In addition, the residual L-lysine in the culture solution of any strain decreases by about 3 hours after culture.This is a phenomenon that occurs due to the incorporation of L-lysine into the bacterial cells. Absent.
  • the above four strains were cultured in the above L-lysine production medium at 37 for 20 hours, and the amounts of L-lysine and cadaverine produced and accumulated in the culture solution were measured.
  • L-lysine was quantified using Biotech Analyzer AS-210 and cadaverine. The amount was measured using high performance liquid chromatography.
  • Table 1 shows the results.
  • the cadA gene-disrupted WC196C strain was compared to the WC196 strain, and the new lysine decarboxylase gene WC196L strain was disrupted to the WC196 and WC196C strains.
  • L-lysine accumulation increased while cadaverine, a degradation product of L-lysine, decreased.
  • the accumulation of L-lysine was further improved in the WC196 LC strain in which the functions of both lysine decarboxylase genes were disrupted, and no accumulation of cadaverine, a degradation product of L-lysine, was detected.
  • Escherichia coli WC196LC which had no L-lysine degrading activity, was transformed with pUC6F5HH5 containing a new lysine decarboxylase gene to obtain an ampicillin-resistant strain.
  • the WC196 LC strain and WC196 LC / pUC6F5HH5 strain were cultured in an L-lysine production medium supplemented with 5 g ZL L-lysine at 37 ° C for 16 hours, and the amount of cadaverine produced was measured.
  • Table 2 shows the results.
  • the WC196 LC strain was unable to convert L-lysine to cadaverine, but the WC196 LC / pUC6F5HH5 strain was capable of converting L-lysine to force daverine.
  • the novel lysine decarboxylase gene of the present invention is involved in the degradation of L-lysine in Escherichia coli. Inexpensive and efficient production of L-lysine by cultivating Escherichia coli, which has the ability to produce L-lysine and suppresses the expression of the above-mentioned gene and the cad A ⁇ gene. can do.
  • GGC AAA CGG CTG ATT AAC CGT TCA GTA GAA CGA GCT CTG CAT TTT CGC 2312 Gly Lys Arg Leu lie Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala Leu His Phe Arg
  • Glu Pro lie Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gin Gly Phe Gin
  • Trp Phe Phe Asp lie Trp Gin Pro Pro Gin Val Asp Glu Ala Glu Cys
  • Gin Arg Gin lie Lys Gly Glu Glu Val Glu Thr lie Ala Leu Glu Gin Leu 625 630 635 640
  • Glu Pro lie Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gin
  • 100 105 110 lie Ala Asn Lys lie Lys Gin Thr Thr Asp Glu Tyr lie Asn Thr lie
  • Lys Ser Asp l ie Ser lie Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
  • Val Thr Pro lie Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly lie Leu
  • 500 505 510 lie Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly lie Val Val Glu Lys Thr

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明細書 新規リジンデカルボキシラーゼ遣伝子及び Lーリジンの製造法 技術分野 本発明は、 Lーリジンの分解に関与するェシヱリヒア ·コリの新規リジンデカ ルボキシラーゼ遗伝子、 当該遺伝子及び/または c a d A遺伝子として知られて いる他のリジンデカルボキシラーゼ遗伝子の発現が抑えられているェシエリヒア 属に属する微生物、 及び該微生物を用いた L—リジンの製造法に関する。 近年、 L一リジンは、 飼料添加物として需要が急増している。 背景技術 ェシエリヒア · コリの L—リジン分解酵素として、 L—リジンの脱炭酸により カダベリンを生成する反応を触媒するリジンデカルボキシラーゼが知られており、 c a d Aと呼ばれるその遣伝子の塩基配列及び該遺伝子がコ一ドするアミノ酸配 列は既に報告されている （Meng, S and Bennett, G. N. , J. Bacteriol. , 174, 2 659 (1992)) 。 また、 ェシヱリヒア 'コリの c a d A以外の遗伝子によりコード されるリジンデカルボキシラ一ゼについては、 ェシエリヒア ·コリの変異株にお いて微弱な活性が検出されたという報告が 2つある （Goldemberg, S. H. , J. Bac teriol. , 141， 1428 (1980)； Wertheimer, S. J. and Leifer, Z. , Biochem. Bio phys. Res. Commun. , 114, 882 (1983)) 。 しかしな ら、 この活性については G oldemberg, S. H.が 6 0て、 4分間の熱処理により酵素活性が 3 0 %ほど低下する と報告しているのに対し、 Wertheimer, S. J.らはそのような現象は認められない と報告しており、 第二のリジンデカルボキシラーゼの存在については確かでない。 一方、 ェシヱリヒア ' コリを用いた L一リジンの製造方法として、 リジンアナ ログに耐性な変異株または L -リジンの生合成に関与する遺伝情報を担うデォキ シリボ核酸を組み込んだベクターを保有する組換え株を培養する方法が知られて いる （特開昭 5 6 - 1 8 5 9 6号公報） 。 しかしながら、 リジンデカルボキシラ ーゼの遺伝子の発現が抑えられたェシェリヒア属微生物を用いた L一リジン生産 についての報告は全くない。 発明の開示 本発明の目的は、 ェシヱリヒア ·コリの新規なリジンデカルボキシラーゼ遗伝 子を取得し、 この遺伝子及び/"または c a d A遣伝子の発現が抑えられたエシ リヒア厲に厲する L一リジン生産菌を造成し、 また、 これらのェシエリヒア厲微 生物を培養することによる Lーリジンの製造方法を提供することである。
本発明者らは、 公知のリジンデカルボキシラーゼ遗伝子である c a d A遺伝子 を破壊したェシヱリヒア · コリ株を造成したところ、 この菌株においてもリジン デカルボキシラーゼによる L一リジンの分解産物であるカダベリンがなお生成さ れることを見いだした。 そこで本発明者らは、 ェシヱリヒア · コリに新規なリジ ンデカルボキシラーゼ遺伝子が存在しており、 ェシエリヒア属微生物を用いて L 一リジンを発酵生産する際に大きく影響を与えるものと推定し、 当該遺伝子のク ローニングを試みた結果、 c a d A遺伝子とは異なる新規なリジンデカルボキシ ラーゼ遣伝子の取得に成功し、 また、 ェシヱリヒア 'コリの L一リジン生産菌に おいてこの遺伝子の発現を抑え、 さらにまた c a d A遺伝子の発現を抑えること により Lーリジンの分解活性が著しく低下ないし消失し、 L—リジン生産能が顕 著に向上することを見いだし、 本発明を完成するに到った。
すなわち、 本発明は、 ェシエリヒア ' コリ由来のリジンデカルボキシラーゼを コードする新規遺伝子 （本遺伝子は 「 1 d c」 遺伝子と命名された。 ） を提供す るものである。 - また本発明は、 L一リジン生産能を有し、 細胞中のリジンデカルボキシラーゼ 活性が低下又は消失させられているェシエリヒア属に属する微生物を提供するも のである。
さらに本発明は、 上記エシ リヒア属微生物を液体培地に培養し、 培養液中に Lーリジンを生成蓄積せしめ、 これを採取することを特徴とする L—リジンの製 造法を提供するものである。
上記エシュリヒア属に属する微生物としては、 1 d c遺伝子及びノまたは c a d A遺伝子の発現が抑えられたことにより、 細胞中のリジンデカルボキシラ一ゼ 活性が低下又は消失させられている微生物が挙げられる。
以下、 本発明を詳細に説明する。
< 1〉新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子を含む DNA断片の取得
本発明の新規リジンデカルボキシラーゼ遗伝子 （ 1 d c) を含む DNA断片の 取得は、 ェシヱリヒア · コリの入手可能な株、 例えば K一 12株またはその誘導 株から以下のようにして行うことができる。
まず、 ェシヱリヒア .コリ K一 12由来の W31 10株の染色体 DNAより ポリメラーゼ ·チェーン · リアクション法 （以下、 PCR法と記す） を用いて公 知のリジンデカルボキシラーゼの遗伝子である c a d A遺伝子を得る。 c a d A 遺伝子の塩基配列及びそれによつてコードされるアミノ酸配列を、 各々配列番号 5及び配列番号 6に示す。 この c a d A遺伝子と類似の配列を有する DN A断片 を、 ェシエリヒア 'コリ W3 1 10の染色体 DNAライブラリ一よりプラスミ ドベクターやファージベクターを用いる方法によりクローニングし、 この DNA 断片に新規なリジンデカルボキシラーゼ遗伝子が含まれていることを確認する。 目的とする遺伝子が含まれていることの確認は、 P CR法により調製したプロ一 ブを用いてサザンハイプリダイゼーション法により行うことができる。
かく して得られる DNA断片に含まれる遺伝子の塩基配列は、 次のようにして 決定される。 まず、 上記 DNA断片をェシエリヒア ·コリ菌体内で自律増殖可能 なプラスミ ドベクターと連結して組換え DN Aを作成し、 これをェシエリヒア ' コリのコンビテントセルに導入する。 得られた形質転換体を液体培地に培養し、 増殖した菌体から組換え DN Aを回収する。 回収した組換え DN Aに含まれる D N A断片の全塩基配列をダイデォキシ法 （Sanger. F. et al, Proc. Natl. Acad. Sci.. 74, 5463 (1977)) により決定し、 DNAの構造解析を行い、 プロモータ ―、 オペレーター、 SD配列、 開始コドン、 終始コドン、 オープン · リーディン グ ·フレームなどの存在位置を決定する。
本発明の新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子は、 配列表配列番号 3に示され る DN A断片の全塩基配列の 1 005〜1 007番目の 丁 から314 1〜3 143番目の GG Aに至る配列を有する。 本遺伝子は、 配列表配列番号 4に示さ れるアミノ酸配列を有するリジンデカルボキシラーゼをコ一ドする。 この新規な リジンデカルボキシラーゼと c a d A遺伝子のコードするリジンデカルボキシラ ーゼとのホモロジ一は、 6 9 . 4 %であった。
本発明の遗伝子は、 配列表配列番号 4に示されるアミノ酸配列を有するリジン デカルボキシラーゼをコ一ドするものであればよく、 その塩基配列は上記のもの に限定されない。 さらに、 本発明の遺伝子によりコードされるリジンデカルボキ シラーゼは、 前記アミノ酸配列において、 リジンデカルボキシラーゼ活性を実質 的に損なわない 1つまたは複数個のアミノ酸残基の置換、 欠失又は挿入を有して いてもよい。 このような欠失、 挿入又は置換を有するリジンデカルボキシラーゼ をコードする遺伝子は、 エシ リヒア， コリの変種、 自然突然変異株又は人為突 然変異株、 ェシェリヒア， コリ以外のェシエリヒア属微生物から取得され得る。 また、 欠失、 挿入又は置換を有するリジンデカルボキシラーゼをコードする変異 遺伝子は、 配列番号 4に示されるアミノ酸配列を有するリジンデカルボキシラー ゼをコ一ドする遺伝子をインビトロ変異処理、 あるいは部位特異的変異処理する ことによつても取得され得る。 これらの突然変異処理は、 後述するような当業者 に周知の方法によって行うことができる。
ただし、 ここにいう 1つまたは複数個のアミノ酸残基の S換、 欠失又は挿入を 有するリジンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子とは、 Π d c遣伝子」 に 由来し、 1 d c遣伝子と実質的に同一とみなすことができるものをいうのであつ て、 由来の異なる遣伝子にまで拡張することを意図するものではない。 「複数個」 が如何なる範囲であるかを具体的に規定することはできないが、 例えば配列番号 3に示すァミノ酸配列と 2 0 0アミノ酸残基以上^ ίるタンパク質をコ一ドする c a d A遺伝子は本発明の遺伝子と異なるものであり、 配列番号 3に示すアミノ 酸配列と 2、 3個アミノ酸残基が異なっても同等のリジンデカルボキシラーゼ活 性を有するタンパク質をコードする遺伝子が本発明の遺伝子に包含されることは、 当業者に容易に理解されるであろう。
< 2 >リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現が抑制されたェシヱリヒア属微 生物の造成
本発明のェシヱリヒア属微生物は、 細胞中のリジンデカルボキシラ一ゼ活性が 低下又は消失させられているェシヱリヒア厲に厲する微生物である。 ェシヱリ ヒ ァ属微生物としては、 ェシヱリヒア ·コリが挙げられる。 細胞中のリジンデカル ボキシラーゼ活性の低下又は消失は、 例えば、 上記の新規リジンデカルボキシラ 一ゼ遗伝子 （ 1 d c ) と公知の c a d A遺伝子のいずれか一方あるいは両方の発 現を抑えることによって行われる。 また、 これらの遣伝子によりコードされるリ ジンデカルボキシラーゼ酵素の構造を改変して、 比活性を低下又は消失させるこ とによっても、 細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性を低下又は消失させるこ とができる。
1 d c遺伝子及び公知の c a d A遣伝子の発現を抑えるための手段としては、 例えば、 これらの遗伝子のプロモーター配列中に 1つまたは複数個の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を起こさせ、 プロモーター活性を低下させることに よって転写レベルで遣伝子の発現を抑える方法がある （M. Rosenberg and D. Co urt, Ann. Rev. Genetics 13 ( 1979) p. 319、 P. Youderian, S. Bouvier and M.
Susskind, Cel l 30 ( 1982) P. 843-853参照） 。 また、 これらの遣伝子の発現は、 S D配列と開始コドンとの間の領域中に 1つまたは複数個 塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を起こさせることによって、 翻訳レベルで抑えることがで きる （J. J. Dunn, E. Buzash- Poller t and F. W. Studier, Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. に 75 ( 1978) P. 2743参照） 。 また、 リジンデカルボキシラーゼ酵 素の比活性を低下又は消失させるには、 リジンデカルボキシラーゼ遺伝子のコー デイング領域の中の塩基配列中に 1つまたは複数個の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を起こさせることによってコーディング領域を改変または破壊す る方法がある。 - 塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を起こさせる遺伝子としては、 1 d c遺伝子及び c a d A遺伝子に加え、 コ一ドするリジンデカルボキシラーゼ活性 を実質的に損なわない 1つまたは複数個のァミノ酸残基の置換、 欠失又は挿入を 有する 1 d c遣伝子または c a d A遺伝子でもよい。
遣伝子中に塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を起こさせるには、 具体 的には、 部位特異的変異法 (Kramer, W. and Frits, H. J. , Methods in Enzymo logy, 154, 350 ( 1987) ) や、 次亜硫酸ナトリウム、 ヒドロキシルァミン等の化学 薬剤により処理する方法 （Shortle. D. and Nathans, D. , Proc. Natl. Acad. S ci. U. S. A. , 75. 270(1978)) が挙げられる。
部位特異的変異法は、 合成オリゴヌクレオチドを用いる方法であり、 任意の限 定された塩基対だけに、 任意の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を導入できる 手法である。 この方法を利用するには、 まず、 クローン化され、 D N A塩基配列 が決定されている目的遺伝子を持つプラスミ ドを変性させて 1本鎖を調製する。 次に、 変異を起こさせたい部分に相補的な合成ォリゴヌクレオチドを合成するが、 この時合成ォリゴヌクレオチドを完全に相補的な配列にせず、 任意の塩基置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を持つようにしておく。 この後 1本鎖 D N Aと任意 の塩基置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を持つ合成ォリゴヌクレオチドをァ二 ールさせ、 さらに D N Aポリメラーゼ Iのクレノウフラグメントと T 4リガーゼ を用いて完全な 2本鎖プラスミ ドを合成し、 これをェシヱリヒア ·コリのコンビ テントセルに導入する。 このようにして得られた形質転換体の幾つかは、 任意の 塩基置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位が固定された ¾伝子を含むプラスミ ドを 持っている。 遺伝子に変異を導入し、 改変または破壊することができる同様な手 法には、 リコンビナント P C R法 （PCR Technology, Stockton press (1989)) が る。
また、 化学薬剤処理を用いる方法は、 目的の遺伝子を含む D N A断片を直接次 亜硫酸ナトリウム、 ヒドロキシルァミン等で処理することにより D N A断片中に ランダムに塩基置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を持つ変異を導入する方法で ある。
以上のようにして取得した変異が導入されて改変または破壊された遺伝子を、 ェシエリヒア属微生物の染色体上の正常な遣伝子と置換することにより、 細胞中 の 1 d c遣伝子及び/または c a d A遺伝子の発現を抑えることができる。 遗伝 子の置換の方法としては、 相同性組換えを利用した方法 （Experiments in Molec ular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972) ;Matsuyama, S. and Mizushima, S. . J. Bacteriol. . 162, 1196( 1985)) がある。 相同性組換えは、 ェシエリヒア属微生物が一般的に持つ能力であり、 染色体上の配列と相同性を有 する配列を持つプラスミ ド等が菌体内に導入されると、 ある頻度で相同性を有す る配列の箇所で組換えを起こし、 導入されたプラスミ ド全体を染色体上に組み込 む。 この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、 再 びプラスミ ドが染色体上から抜け落ちるが、 この時組換えを起こす位置により変 異が導入された遺伝子の方が染色体上に固定され、 元の正常な遺伝子がプラスミ ドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。 このような菌株を選択すること により、 塩基置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を持つ変異が導入されて改変ま たは破壊された遺伝子が染色体上の正常な ¾伝子と置換された菌株を取得するこ とができる。
遺伝子の置換を行うェシエリ ヒア厲微生物は、 Lーリジン生産能を有する微生 物である。 L一リジン生産能を有するェシヱリヒア属微生物、 例えばェシヱリヒ ァ *コリ菌株は、 L一リジン生産能を有しない株に変異処理を施し、 S— （2 - ァミノエチル） 一 L一システィン （以下、 A E Cと記す） 等のリジンアナログに 対する耐性を付与することにより取得することができる。 変異処理の方法として は、 ェシェリヒア 'コリの菌体に N—メチル一N ' —二トロー N—ニトロソグァ 二ジンや亜硝酸等の化学薬剤による処理、 あるいは紫外線、 放射線照射等の処理 を施す方法がある。 このような菌株の具体例としては、 ェシエリヒア，コリ A J 1 3 0 6 9 ( F E R M P— 1 4 6 9 0 ) が挙げられる。 本菌株は、 ェシェ リヒア . コリ K— 1 2由来の W 3 1 1 0株に A E C耐性を付与することによつ て育種されたものである。 尚、 ェシエリヒア 'コリ A J 1 3 0 6 9は、 平成 6 年 1 2月 6日付で工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本国茨 城県つくば市東一丁目 1番 3号） に受託番号 F E R M P— 1 4 6 9 0として寄 託され、 平成 7年 9月 2 9日にブダぺス卜条約に基づく国際寄託に移管され、 受 託番号 F E R M B P— 5 2 5 2が付与されている。
また、 L一リジン生産能を有するェシヱリヒア 'コリ菌株は、 L一リジンの生 合成に関与する遺伝情報を担う D N Aを遺伝子組換え技術により導入、 増強する ことによつても育種することができる。 導入される遺伝子は、 ァスパル卜キナー ゼ、 ジヒ ドロジピコリン酸合成酵素、 ジヒドロジピコリン酸レダクタ一ゼ、 スク シニルジァミノピメリン酸トランスァミナーゼ、 スクシ二ルジァミノピメリン酸 デアシラーゼ等、 Lーリジンの生合成経路上の酵素をコ一ドする遺伝子であり、 ァスパル卜キナーゼ、 ジヒドロジピコリン酸合成酵素のように L一リジンによる フィードバック阻害を受ける酵素遺伝子の場合には、 かかる阻害が解除された酵 素をコードする変異型遺伝子を用いることが望ましい。 遺伝子を導入、 増強する には、 ェシエリヒア · コリ細胞內で自律複製可能なベクターに遺伝子を連結して 組換え D N Aを作成し、 それでェシヱリヒア ·コリを形質転換する方法があり、 その他にトランスダクシヨン、 トランスポゾン （Berg, D. E. and Berg, C. M. , Bio/Technol. 1, 417. ( 1983)) 、 M uファージ、 （特開平 2— 1 0 9 9 8 5号） または相同組換え (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. ( 1972)) を用いた方法で宿主染色体に組み込むこともできる。
遺伝子の機能が破壊されたエシ リヒア属微生物を取得するその他の方法とし ては、 当該遣伝子を有するェシヱリヒア厲微生物の菌体に N—メチルー N ' —二 トロー N—ニトロソグァニジンゃ亜硝酸等の化学薬剤による処理、 あるいは紫外 線、 放射線照射等の処理を施すことにより遣伝的に変異させる方法もある。
後述の実施例においては、 リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の機能が破壊され たェシヱリヒア · コリ株の造成は、 そのコーディング領域の一部を欠失させ、 代 わりに薬剤耐性遣伝子を挿入したリジンデカルボキシラーゼ遺伝子を、 上記の相 同性組換えを利用した方法により、 ェシエリヒア · コリの染色体上のリジンデカ ルボキシラ一ゼ遣伝子と置換することにより行った。
なお、 1つの菌株において本発明の新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子と c a d A遣伝子のいずれか一方のみの発現を抑えることもできるし、 両方の発現を 抑えることもできる。 また、 L一リジン生産能を有するェシエリ ヒア厲微生物に おいてリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現を抑えてもよいし、 リジンデカル ボキシラーゼ遺伝子の発現を抑えたェシェリヒア属微生物に上記の方法により L 一リジン生産能を付与してもよい。
< 3〉リジンデカルボキシラ一ゼ遺伝子の発現が抑制されたェシェリヒア属微 生物を用いた L一リジンの生産
上記のようにして取得したリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現が抑制され たェシェリヒア属微生物を培養することにより、 培養液中に著量の L—リジン力 生成蓄積される。 L一リジンの蓄積量は、 公知の c a d A遺伝子の発現を抑える ことだけでも増加するが、 本発明の新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現 を抑えることは、 L一リジンの蓄積量の向上により有効であり、 また、 c a dA 遺伝子と本発明の新規遺伝子の両方の発現を抑えた菌株を用いることにより、 L 一リジンの生産にとって最も好ましい結果が得られる。
L一リジン生産のために使用される培地は、 炭素源、 窒素源、 無機イオン及び 必要に応じその他の有機微量栄養源を含有する通常の培地である。 炭素源として は、 グルコース、 ラク トース、 ガラク トース、 フラクトース、 でんぶん加水分解 物などの糖類、 グリセロール、 ソルビトールなどのアルコール類、 フマール酸、 クェン酸、 コハク酸等の有機酸類を用いることができる。 窒素源としては、 硫酸 アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機アンモニゥム塩、 大豆加水分解物などの有機窒素源、 アンモニアガス、 アンモニア水等を用いるこ とができる。 無機イオンとしては、 リン酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 鉄ィォ ン、 マンガンイオン等が少量添加される。 これらの他に、 有機微量栄養源として、 ビ夕ミン B,、または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。
培養は、 好気的条件下で 1 6〜72時間程度実施するのがよく、 培養温度は 3 0 〜 45°Cに、 培養中 pHは 5〜7に制御する。 尚、 pH調整には無機あるい は有機の酸性あるいはアル力リ性物質、 あるいはアンモニアガス等を使用するこ とができる。
培養終了後、 発酵液からの L -リジンの採取は、 通常のイオン交換樹脂法、 沈 澱法、 その他の公知の方法を組み合わせることにより適宜実施できる。 図面の簡単な説明 図 1は、 新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子を含むプラスミ ド pUC 6 F 5 HH 5の構造を示す図である。
図 2は、 新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子を含む温度感受性プラスミ ド p TS 6 F 5 HH 5の構造と、 同遺伝子の遺伝子の一部がクロラムフヱニコ一ル耐 性遺伝子を含む断片で置換されたプラスミ ド p TS 6 F 5HH 5 Cmの構築を示 す図である。
図 3は、 正常なリジンデカルボキシラーゼ遺伝子保有株 WC 1 96、 及びリジ ンデカルボキシラーゼ¾伝子破壌株 WC 1 9 6 C、 WC 1 9 6 L及び WC 1 9 6 L C株における Lーリジン分解活性の比較を示す図である。 発明を実施するための ft良の形態 以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 実施例 1
( 1 ) 新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング
国立遺伝学研究所 （日本国静岡県三島市谷田 1 1 1 1 ) より入手したェシエリ ヒア · コリ K— 1 2の W 3 1 1 0株の菌体から、 通常の方法に従って染色体 D N Aを抽出した。 一方、 Meng, S and Bennett, G.N.. J. Bacteriol.. 174, 265 9 (1992)に記載されている c a d A遺伝子の塩基配列 （配列番号 5参照） に基づ 、て、 配列表配列番号 1及び 2に示すような合成 D N Aプライマ一 2本を通常の 方法で合成した。 これらはそれぞれ c a d A遣伝子の 5' —末端上流部分及び 3 ' 一末端部分に相同な配列を有する。 この染色体 DNAと DNAプライマ一を用 いてエルリツチらの方法 （PCR Technology. Stockton press (1989)) に従って P C R法を行い、 c a d A遺伝子の大部分を含む 2. 1 k b pの D N A断片を得た。 この断片をランダムプライマ一ラベリングキッ ト （宝酒造社製） および [a— S2 P] d C TP (アマシャムジャパン社製） を用いてラベルしハイブリダィゼーシ ョン用のプローブを作製した。 - 次に、 作製したプローブとェシエリヒア · コリ /ジーンマツピングメンブラン
(宝酒造社製） を用いて通常の方法 （Molecular Cloning (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) {こよりノヽィフ'リダイセ'ーションを行つ た。 ェシエリヒア · コリ Zジーンマッピングメンブランには、 小原らのライブラ リー （ェシエリヒア ' コリ染色体 DN Aのラムダファージライブラリ一 ： Kohara,
Y, et al, Cell. 50, 495-508 (1987)参照） が吸着している。 ハイブリダィゼー シヨンの際に、 プローブの洗浄の条件を弱く し （2 X S S C、 5 5°C、 3 0分） 、 c a d A遺伝子と類似の配列を持つラムダファージクローンをスクリ一ニングし た。 その結果、 c a d A遣伝子領域を含むクローン （21H11、 5 G 7 ) の強 いシグナルの他に、 E2B8、 6F5H、 10 F 9の 3つのクローンに弱いシグ ナルを認めることができた。 E2B8、 6F5H、 10 F 9の 3つのラムダファ ージクローンの挿入配列はェシヱリヒア ·コリの染色体上で互いに重なりながら 連続している。 そこで、 小原らのライブラリー （Kohara, Y, et al, Cell. 50. 495-508 (1987)) に属する 6 F 5 Hのラムダファージ DN Aを通常の方法により 分離し、 さらに、 各種制限酵素で切断し、 上記プローブを用いて先程と同様な方 法によりサザンプロッ トハイプリダイゼーションを行ったところ、 H ί n d I I Iで切断された約 5 k b pの DNA断片中に c a d A遺伝子と類似の配列が存在 していることが明らかとなった。
そこで、 この 6 F 5Hのラムダファ一ジDNAをH i n d I I Iで切断して得 られる約 5 k b pの断片とプラスミ ド pUC 19 (宝酒造社製） の H i n d I I I切断物を T 4 DNAリガーゼを用いて連結した。 この反応混合物でェシヱリヒ ァ ·コリ JM109 (宝酒造社製） を形質転換し、 アンピシリンを 5 OmgZ L添加した完全平板培地 （ポリペプトン 10g、 酵母エキス 5 g、 塩化ナトリウ ム 5 gを水 1 Lに含む） 上で生育したアンピシリン耐性株より、 6 F 5Hのラム ダファージ DNAを H i n d I I Iで切断して得られる約 5 k b pの断片が挿入 されたプラスミ ドを保有する菌株を取得した。 その菌体からプラスミ ドを抽出し、 プラスミ ド pUC 6F 5HH5を取得した。 プラスミ ド pUC 6F5HH5の構 造を図 1に示す。
なお、 このプラスミ ドを保持するェシェリヒア ' リ JM109/pUC6 F 5HH5は、 AJ 13068と命名され、 平成 6年 12月 6日付で工業技術院 生命工学工業技術研究所に受託番号 F ERM P— 14689として寄託され、 平成 7年 9月 29日にブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番号 F ERM B P— 5251が付与されている。
( 2 ) 新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の塩基配列の決定
取得した PUC6F5HH5の制限酵素 C 1 a I部位から H i n d I I I部位 の領域の塩基配列を Molecular Cloning (2nd edition), Cold Spring Harbor La boratory press (1989)に記載の方法に従って決定した。 その結果、 配列表配列番 号 3に示す塩基配列を有することが明らかになつた。 この D N A配列中には配列 表配列番号 4に示すアミノ酸配列をコ一ドするオープンリーディングフレームが 含まれている。
(3) L一リジン生産能を有するェシ リヒア ·コリの取得
ェシヱリヒア ' コリ W31 10を完全培地 （ポリぺプトン 10 g、 酵母ェキ ス 5 g、 塩化ナトリウム 5 gを水 1 Lに含む） で 37て、 4時間培養して得た菌 体を 200 g/m 1の濃度の N—メチルー N' —二トロー N—二トロソグァ二 ジン溶液中で 37°C、 30分変異処理し、 洗浄後、 AECを 5 g/L添加した最 少平板培地 （リン酸水素ニナトリウム 7 g、 リン酸ニ水素力リウム 3 g、 塩化ァ ンモニゥム 1 g、 塩化ナトリウム 0. 5 g、 グルコース 5 g、 硫酸マグネシウム
• 7水和物 0. 25 g、 寒天 15 gを水 1 Lに含む） に塗布した。 37て、 48 時間培養して出現したコロニーを分離することにより A E C耐性株を取得した。 この中の一株である WC 196株は L一リジン生産能を有していた。 なお、 WC 196株は A J 13069と命名され、 平成 6年 12月 6日付で工業技術院生命 工学工業技術研究所に受託番号 FERM P- 14690として寄託され、 平成 7年 9月 29日にブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番号 FER M B P— 5252が付与されている。
(4 )新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の機能を破壊した WC 196株の造 成
上記の 6 F 5Hのラムダファージ DNAを H i nd i I Iで切断して得られる 約 5 k b pの断片と温度感受性のプラスミ ド p MAN 031 (Yasueda, H. et a 1， Appl. Microbiol. Biotechnol. , 36, 211 (1991)) の H i n d I I I切断物を T 4 DNAリガーゼを用いて連結した。 この反応混合物でェシヱリヒア · コリ JM109を形質転換し、 アンピシリンを 5 OmgZL添加した完全平板培地の 培地上で 37°C、 24時間培養し、 生育したアンピシリン耐性株より 6 F 5 Hの ラムダファージ DNAを H i n d I I Iで切断して得られる約 5 k b pの断片が 挿入されたプラスミ ドを保有する菌株を取得した。 この菌体からプラスミ ドを抽 出し、 プラスミ ド pTS 6 F 5HH5を取得した。 プラスミ ド p T S 6 F 5 H H 5 E c o RVで切断して約 1 k b pの DNA断片を除き、 ついで pHS G 39 9 (宝酒造社製） を Ac c Iで切断して得られる約 1 k b pのクロラムフユニコ ール耐性遺伝子を持つ断片を T4リガーゼを用ぃて挿入して、 プラスミ ド pTS
6 F 5HH5 Cmを構築した。 以上の操作の結果、 新規リジンデカルボキシラー ゼ遺伝子の機能が破壊された DN A断片を持つプラスミ ドを構築することができ た。 プラスミ ド p T S 6 F 5 HH 5の構造及びプラスミ ド p T S 6 F 5 HH 5 C mを図 2に示す。
次に、 このプラスミ ド pTS 6 F5HH5 Cmの温度感受性の性質を利用した 一般的な相同性組換えの手法 （Matsuyaraa, S. and Mizushima, S. , J. Bacterio 1.. 162, 1196(1985)) で WC 1 96株の染色体上の新規リジンデカルボキシラー ゼ遺伝子を新規リジンデカルボキシラーゼ遣伝子の機能が破壊された DN A断片 に置換した株を造成した。 すなわち、 プラスミ ド pTS 6 F 5HH5 Cmで WC 1 96株を形質転換し、 最初 30 でアンピシリン耐性かつクロラムフヱニコー ル耐性株を取得する。 次にこの株より 42てでアンピシリン耐性かつクロラムフ ヱ二コール耐性株を取得し、 さらにこの株より 30 でアンピシリン感受性かつ クロラムフヱニコール耐性株を取得することにより、 上記のような WC 1 96株 の染色体上の新規なリジンデカルボキシラーゼ遗伝子を新規リジンデカルボキシ ラーゼ遣伝子の機能が破壊された D N A断片に置換した株を造成し、 この株を W C 1 96 L株と命名した。
(5) c a d A遣伝子の欠損した WC 196株及び WC 1 96 L株の造成 公知のリジンデカルボキシラーゼの遺伝子である c a d Aが破壊されたェシェ リヒア ' コリとして、 既にェシェリヒア ·コリ K一- 1 2由来の GNB 1 0 1 8 1株 (Auger, E. A. et al, Mol. Microbiol. , 3. 609 (1989)参照：本菌株は、 E. coli Genetic Stock Center (米国コネチカッ ト州） 等から入手できる） 等が知 られている。 この菌株では c a d A遺伝子の領域が欠損していることが明らかに されている。 そこで、 この GNB 10 181株の c a d A遺伝子欠損の形質を P 1ファージを用いた一般的な方法 （A Short Course in Bacterial Genetics, Co Id Spring Harbor Laboratory Press (1992)) により WC 1 96株に形質導入し て WC 1 96 C株を造成した。 WC 196株の c a d A遺伝子が欠損しているこ とはサザンブロッ 卜ハイブリダィゼーシヨンにより確認した。 また、 以上と同様 な方法により、 WC 196 L株より c a d A遺伝子が欠損した WC 196 L C株 を造成した。
( 1 ) WC 1 96株、 WC 1 96 C株、 WC 196 L株及び WC 196 L C株の L—リジン分解活性の確認
造成した上記 4株を Lーリジン生産用培地 （グルコース 40 g、 硫酸アンモニ ゥム 16 g、 リ ン酸ニ水素カリウム 1 g、 酵母エキス 2 g、 硫酸マンガン 4〜 5 水和物 1 0 m g、 硫酸鉄 · 7水和物 10 m gを水 1 Lに含み、 水酸化力リウムで pHを 7. 0に調整後、 さらに 3 O gの別殺菌した炭酸カルシウムを加える） を 用いて 37 で 1 7時間培養した。 回収した菌体を生理食塩水で 2回洗浄し、 L 一リジン分解検定用培地 （リン酸水素ニナトリウム ' 1 2水和物 17 g、 リン酸 二水素カリウム 3 g、 塩化ナトリウム 0. 5 g、 L—リジン塩酸塩 1 O gを水 1 Lに含む） に懸濁して 37 で 3 1時間培養した。
培養液中の残存 L一リジン量の経時的な変化を図 3に示す。 なお、 L一リジン の定量はバイオテックアナライザー AS - 2 10 (旭化成社製） を用いて行った。 WC 1 96株では顕著な Lーリジンの分解が認められたが、 公知のリジンデカル ボキシラーゼ遺伝子である c a d A遣伝子を欠損させた WC 1 96 C株では分解 活性がやや低下しており、 新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の機能を破壊し た WC 1 96 L株及び WC 1 96 LC株では L—リジンの分解が認められなかつ た。 なお、 培養 3時間目くらいまでにいずれの菌株においても培養液中の残存 L 一リジンが減少するカ^ これは菌体內に L -リジンが取り込まれるために起こる 現象であり、 分解によるものではない。
( 2 ) WC 1 96株、 WC 1 96 C株、 WC 1 96 L株及び WC 1 96 L C株に よる Lーリジンの生産
上記の L-リジン生産用培地で上記 4株を 37 で 20時間培養し、 培養液中 に生成蓄積した L一リジン及びカダベリンの量を測定した。 なお、 L—リジンの 定量は上記のようにバイオテックアナライザー A S— 2 10を、 カダベリ ンの定 量は高速液体クロマトグラフィ一を用いて行った。
結果を表 1に示す。 c a d A遺伝子を破壊した WC 1 96 C株では WC 1 96 株に比べて、 また、 新規リジンデカルボキシラーゼ遗伝子の機能を破壊した WC 1 96 L株では WC 1 96株及び WC 196 C株に比べて、 Lーリジンの蓄積が 向上する一方、 L一リジンの分解物であるカダベリ ンの蓄積が減少した。 両方の リジンデカルボキシラーゼの遗伝子の機能を破壊した WC 1 96 LC株ではさら に Lーリジンの蓄積が向上し、 Lーリジンの分解物であるカダベリンの蓄積が検 出されなかった。
Figure imgf000017_0001
実施例 3
L—リジンの分解活性がなくなつたェシエリヒア 'コリ WC 1 96 L Cを新 規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子を含む pUC 6 F 5 HH5で形質転換し、 Ύ ンピシリン耐性株を取得した。 WC 1 96 L C株と WC 1 96 L C/pUC 6 F 5 HH 5株を 5 g ZLの Lーリジンを添加した L—リジン生産用培地で 37てで 1 6時間培養し、 生成するカダベリ ンの量を測定した。
結果を表 2に示す。 WC 1 96 L C株は Lーリジンをカダベリンに転換するこ とはできなかったが、 WC 1 96 LC/pUC 6 F 5HH5株は L一リジンを力 ダベリンに転換する能力を持っていた。 表 2
Figure imgf000018_0001
産業上の利用可能性 本発明の新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子は、 ェシヱリヒア · コリにおい て L —リジンの分解に関与する。 L—リ ジン生産能を有し、 上記遣伝子及びノま たは c a d A遗伝子の発現が抑えられているエシ リヒア厲紬菌を培養すること により安価かつ効率的に Lーリジンを製造することができる。
O 96/17930
- 17 m
(1)一般情報
(υ 出願人： 味の素株式会社
(ii) 発明の名称：新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子及び Lーリジンの製 造法
(iii) 配列数： 6
(iv) 連絡先：
(A)宛名
(B)番地
(C)市
(D)州
(E)国
(F) ZIP：
(V) コンピュータ読取り可能形式
(A)媒体：フロッピーディスク
(B)コンピュータ ： IBM PC互換
(C)操作システム PC- DOS/MS- DOS
(D)ソフトウエア FastSEQ Version 1. 5
(vi) 現行出願データ
(A)出願番号
(B)出願日
(C)分類
(viii)代理人ノ事務所情報
(A)名前：
(B)登録番号：
(C)整理番号：
(ix)通信情報
(A)電話番号：
(B)ファクシミ リ番号
(2) 配列番号 1の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 20 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA (iii) ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： NO
(xi) 配列： SEQ ID N0:1:
TGGATAACCA CACCGCGTCT 20
(2) 配列番号 2の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ 20 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA (iii) ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： YES
(xi) 配列： SEQ ID NO: 2：
GGAAGGATCA TATTGGCGTT 20
(2) 配列番号 3の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 3269 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 二本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： Genomic DNA
(iii) ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： NO
(vi) 起源: (A)生物名：ェシヱリヒア 'コリ （Escherichia coli)
(B)株名： W 3 1 1 0
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置： 1005. . 3143
(xi) 配列： SEQ ID NO: 3 :
ATCGATTCTC TGACTGCGGT TAGCCGTCAG GATGAGAAAC TGGATATTAA CATCGATGAA 60 GAAGTGCATC GTCTGCGTGA AAAAAGCGTA GAACTGACAC GTAAAATCTT CGCCGATCTC 120 GGTGCATGGC AGATTGCGCA ACTGGCACGC CATCCACAGC GTCCTTATAC CCTGGAnAC 180 GTTCGCCTGG CATTTGATGA ATTTGACGAA CTGGCTGGCG ACCGCGCGTA TGCAGACGAT 240 AAAGCTATCG TCGGTGGTAT CGCCCGTCTC GATGGTCGTC CGGTGATGAT CATTGGTCAT 300 CAAAAAGGTC GTGAAACCAA AGAAAAAATT CGCCGTAACT TTGGTATGCC AGCGCCAGAA 360 GGTTACCGCA AAGCACTGCG TCTGATGCAA ATGGCTGAAC GCTTTAAGAT GCCTATCATC 420 ACCTTTATCG ACACCCCGGG GGCTTATCCT GGCGTGGGCG CAGAAGAGCG TGGTCAGTCT 480 GAAGCCATTG CACGCAACCT GCGTGAAATG TCTCGCCTCG GCGTACCGGT AGTTTGTACG 540 GTTATCGGTG AAGGTGGTTC TGGCGGTGCG CTGGCGAHG GCGTGGGCGA TAAAGTGAAT 600 ATGCTGCAAT ACAGCACCTA TTCCGTTATC TCGCCGGAAG GTTGTGCGTC CATTCTGTGG 660 AAGAGCGCCG ACAAAGCGCC GCTGGCGGCT GAAGCGATGG GTATCATTGC TCCGCGTCTG 720 AAAGAACTGA AACTGATCGA CTCCATCATC CCGGAACCAC TGGGTGGTGC TCACCGTAAC 780 CCGGAAGCGA TGGCGGCATC GTTGAAAGCG CAACTGCTGG CGGATCTGGC CGATCTCGAC 840 GTGTTAAGCA CTGAAGATTT AAAAAATCGT CGTTATCAGC GCCTGATGAG CTACGGHAC 900 GCGTAATTCG CAAAAGTTCT GAAAAAGGGT CACTTCGGTG GCCCTTTTTT ATCGCCACGG 960 TTTGAGCAGG CTATGATTAA GGAAGGATTT TCCAGGAGGA ACAC ATG AAC ATC ATT 1016
Met Asn l ie l ie
1
GCC ATT ATG GGA CCG CAT GGC GTC TTT TAT AAA GAT GAG CCC ATC AAA 1064 Ala l ie Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp Glu Pro He Lys
5 10 15 20 GAA CTG GAG TCG GCG CTG GTG GCG CAA GGC TTT CAG ΑΠ ATC TGG CCA 1112 Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gin Gly Phe Gin He l ie Trp Pro
25 30 35
CAA AAC AGC GTT GAT TTG CTG AAA ΤΠ ATC GAG CAT AAC CCT CGA ATT 1160 Gin Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe l ie Glu His Asn Pro Arg l ie
40 45 50
TGC GGC GTG ATT TTT GAC TGG GAT GAG TAC AGT CTC GAT ΠΑ TGT AGC 1208 Cys Gly Val l ie Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu Asp Leu Cys Ser
55 60 65
GAT ATC AAT CAG CTT AAT GAA TAT CTC CCG CTT TAT GCC TTC ATC AAC 1256 Asp He Asn Gin Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr Ala Phe l ie Asn
70 75 80
ACC CAC TCG ACG ATG GAT GTC AGC GTG CAG GAT ATG CGG ATG GCG CTC 1304 Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gin Asp Met Arg Met Ala Leu
85 90 95 100
TGG TTT TTT GAA TAT GCG CTG GGG CAG GCG GAA GAT ATC GCC ATT CGT 1352 Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gin Ala Glu Asp He Ala He Arg
105 110 115
ATG CGT CAG TAC ACC GAC GAA TAT CTT GAT AAC ATT ACA CCG CCG TTC 1400 Met Arg Gin Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn l ie Thr Pro Pro Phe
120 125 130
ACG AAA GCC TTG TTT ACC TAC GTC AAA GAG CGG AAO TAC ACC TTT TGT 1448 Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys Tyr Thr Phe Cys
135 140 145
ACG CCG GGG CAT ATG GGC GGC ACC GCA TAT CAA AAA AGC CCG GTT GGC 1496 Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gin Lys Ser Pro Val Gly
150 155 160
TGT CTG TTT TAT GAT TTT TTC GGC GGG AAT ACT CTT AAG GCT GAT GTC 1544 Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu Lys Ala Asp Val
165 170 175 180 TCT ATT TCG GTC ACC GAG CTT GGT TCG TTG CTC GAC CAC ACC GGG CCA 1592
Ser l ie Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Thr Gly Pro
185 190 195
CAC CTG GAA GCG GAA GAG TAC ATC GCG CGG ACT TTT GGC GCG GAA CAG 1640
His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr l ie Ala Arg Thr Phe Gly Ala Glu Gin
200 205 210
AGT TAT ATC GTT ACC AAC GGA ACA TCG ACG TCG AAC AAA ATT GTG GGT 1688
Ser Tyr l ie Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn Lys l ie Val Gly
215 220 225
ATG TAC GCC GCG CCA TCC GGC AGT ACG CTG TTG ATC GAC CGC AAT TGT 1736
Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu l ie Asp Arg Asn Cys
230 235 240
CAT AAA TCG CTG GCG CAT CTG TTG ATG ATG AAC GAT GTA GTG CCA GTC 1784
His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp Val Val Pro Val
245 250 255 260
TGG CTG AAA CCG ACG CGT AAT GCG TTG GGG ATT CTT GGT GGG ATC CCG 1832
Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly l ie Leu Gly Gly l ie Pro
265 270 275
CGC CGT GAA TTT ACT CGC GAC AGC ATC GAA GAG AAA GTC GCT GCT ACC 1880
Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser l ie Glu Glu Lys Val Ala Ala Thr
280 285 290
ACG CAA GCA CAA TGG CCG GTT CAT GCG GTG ATC ACC AAC TCC ACC TAT 1928
Thr Gin Ala Gin Trp Pro Val His Ala Val l ie Thr Asn Ser Thr Tyr
295 300 305
GAT GGC TTG CTC TAC AAC ACC GAC TGG ATC AAA CAG ACG CTG GAT GTC 1976
Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp l ie Lys Gin Thr Leu Asp Val
310 315 320
CCG TCG ATT CAC TTC GAT TCT GCC TGG GTG CCG TAC ACC CAT TTT CAT 2024
Pro Ser l ie His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr Thr His Phe His
325 330 335 340 CCG ATC TAC CAG GGT AAA AGT GGT ATG AGC GGC GAG CGT GTT GCG GGA 2072 Pro l ie Tyr Gin Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu Arg Val Ala Gly
345 350 355
AAA GTG ATC TTC GAA ACG CAA TCG ACC CAC AAA ATG CTG GCG GCG TTA 2120 Lys Val l ie Phe Glu Thr Gin Ser Thr His Lys Met Leu Ala Ala Leu
360 365 370
TCG CAG GCT TCG CTG ATC CAC ATT AAA GGC GAG TAT GAC GAA GAG GCC 2168 Ser Gin Ala Ser Leu l ie His He Lys Gly Glu Tyr Asp Glu Glu Ala
375 380 385
TTT AAC GAA GCC TTT ATG ATG CAT ACC ACC ACC TCG CCC AGT TAT CCC 2216 Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser Pro Ser Tyr Pro
390 395 400
ATT GTT GCT TCG GTT GAG ACG GCG GCG GCG ATG CTG CGT GGT AAT CCG 2264 He Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu Arg Gly Asn Pro
405 410 415 420
GGC AAA CGG CTG ATT AAC CGT TCA GTA GAA CGA GCT CTG CAT TTT CGC 2312 Gly Lys Arg Leu l ie Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala Leu His Phe Arg
425 430 435
AAA GAG GTC CAG CGG CTG CGG GAA GAG TCT GAC GGT TGG TTT TTC GAT 2360 Lys Glu Val Gin Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly Trp Phe Phe Asp
440 445 450
ATC TGG CAA CCG CCG CAG GTG GAT GAA GCC GAA TGC TGG CCC GTT GCG 2408 l ie Trp Gin Pro Pro Gin Val Asp Glu Ala Glu Cys Trp Pro Val Ala
455 460 465
CCT GGC GAA CAG TGG CAC GGC TTT AAC GAT GCG GAT GCC GAT CAT ATG 2456 Pro Gly Glu Gin Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp Ala Asp His Met
470 475 480
TTT CTC GAT CCG GTT AAA GTC ACT ATT TTG ACA CCG GGG ATG GAC GAG 2504 Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr l ie Leu Thr Pro Gly Met Asp Glu
485 490 495 500 CAG GGC AAT ATG AGC GAG GAG GGG ATC CCG GCG GCG CTG GTA GCA AAA 2552 Gin Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly l ie Pro Ala Ala Leu Val Ala Lys
505 510 515
TTC CTC GAC GAA CGT GGG ATC GTA GTA GAG AAA ACC GGC CCT TAT AAC 2600 Phe Leu Asp Glu Arg Gly l ie Val Val Glu Lys Thr Gly Pro Tyr Asn
520 525 530
CTG CTG TTT CTC ΠΤ AGT ATT GGC ATC GAT AAA ACC AAA GCA ATG GGA 2648 Leu Leu Phe Leu Phe Ser l ie Gly l ie Asp Lys Thr Lys Ala Met Gly
535 540 545
TTA TTG CGT GGG TTG ACG GAA TTC AAA CGC TCT TAC GAT CTC AAC CTG 2696 Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr Asp Leu Asn Leu
550 555 560
CGG ATC AAA AAT ATG CTA CCC GAT CTC TAT GCA GAA GAT CCC GAT TTC 2744 Arg l ie Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu Asp Pro Asp Phe
565 570 575 580
TAC CGC AAT ATG CGT ATT CAG GAT CTG GCA CAA GGG ATC CAT AAG CTG 2792 Tyr Arg Asn Met Arg He Gin Asp Leu Ala Gin Gly He His Lys Leu
585 590 595
ATT CGT AAA CAC GAT CTT CCC GGT TTG ATG TTG CGG GCA TTC GAT ACT 2840 l ie Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg Ala Phe Asp Thr
600 605 610
TTG CCG GAG ATG ATC ATG ACG CCA CAT CAG GCA TGG CAA CGA CAA ATT 2888 Leu Pro Glu Met l ie Met Thr Pro His Gin Ala Trp Gin Arg Gin l ie
615 620 625
AAA GGC GAA GTA GAA ACC ATT GCG CTG GAA CAA CTG GTC GGT AGA GTA 2936 Lys Gly Glu Va l Glu Thr l ie Ala Leu Glu Gin Leu Val Gly Arg Val
630 635 640
TCG GCA AAT ATG ATC CTG CCT TAT CCA CCG GGC GTA CCG CTG TTG ATG 2984 Ser Ala Asn Met l ie Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val Pro Leu Leu Met
645 650 655 660 CCT GGA GAA ATG CTG ACC AAA GAG AGC CGC ACA GTA CTC GAT TTT CTA 3032 Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val Leu Asp Phe Leu
665 670 675
CTG ATG CTT TGT TCC GTC GGG CAA CAT TAC CCC GGT TTT GAA ACG GAT 3080 Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gin His Tyr Pro Gly Phe Glu Thr Asp
680 685 690
ATT CAC GGC GCG AAA CAG GAC GAA GAC GGC GTT TAC CGC GTA CGA GTC 3128 l ie His Gly Ala Lys Gin Asp Glu Asp Gly Val Tyr Arg Val Arg Val
695 700 705
CTA AAA ATG GCG GGA TAACTTGCCA GAGCGGCTTC CGGGCGAGTA ACGTTCTGTT 3183 Leu Lys Met Ala Gly
710
AACAAATAAA GGAGACGTTA TGCTGGGTTT AAAACAGGTT CACCATATTG CGATTATTGC 3243 GACGGATTAT GCGGTGAGCA AAGCTT 3269
(2) 配列番号 4の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 713 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
( ii ) 配列の種類： 夕ンパク質
(xi ) 配列： SEQ ID NO :4 :
Met Asn l ie l ie Ala l ie Met Gly Pro His Gl y Val Phe Tyr Lys Asp
1 5 10 15
Glu Pro l ie Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gin Gly Phe Gin
20 25 30
l ie l ie Trp Pro Gin Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe l ie Glu His
35 40 45
Asn Pro Arg l ie Cys Gly Val l ie Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu
50 55 60 Asp Leu Cys Ser Asp l ie Asn Gin Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr 65 70 75 80
Ala Phe l ie Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gin Asp Met
85 90 95
Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gin Ala Glu Asp
100 105 110 l ie Ala He Arg Met Arg Gin Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn lie
115 120 125
Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gin Lys 145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu
165 170 175
Lys Ala Asp Val Ser l ie Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr l ie Ala Arg Thr Phe
195 200 205
Gly Ala Glu Gin Ser Tyr l ie Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn
210 215 220
Lys He Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu l ie 225 230 235 " 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp
245 250 255
Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly l ie Leu
260 265 270
Gly Gly He Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser l ie Glu Glu Lys
275 280 285
Val Ala Ala Thr Thr Gin Ala Gin Trp Pro Val His Ala Val l ie Thr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp l ie Lys Gin 305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Pro Ser lie His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr His Phe His Pro l ie Tyr Gin Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu
340 345 350
Arg Val Ala Gly Lys Val l ie Phe Glu Thr Gin Ser Thr His Lys Met
355 360 365
Leu Ala Ala Leu Ser Gin Ala Ser Leu l ie His l ie Lys Gly Glu Tyr
370 375 380
Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400
Pro Ser Tyr Pro l ie Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu
405 410 415
Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu l ie Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala
420 425 430
Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gin Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp l ie Trp Gin Pro Pro Gin Val Asp Glu Ala Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gin Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp 465 470 475 " 480
Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr l ie Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Asp Glu Gin Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly l ie Pro Ala Ala
500 505 510
Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly He Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser l ie Gly l ie Asp Lys Thr 530 535 540 Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr 545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg l ie Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu
565 570 575
Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg I le Gin Aspし eu Ala Gin Gly
580 585 590 l ie His Lys Leu l ie Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg
595 600 605
Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met l ie Met Thr Pro His Gin Ala Trp
610 615 620
Gin Arg Gin l ie Lys Gly Glu Val Glu Thr l ie Ala Leu Glu Gin Leu 625 630 635 640
Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met He Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val
660 665 670
Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gin His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp l ie His Gly Ala Lys Gin Asp Glu Asp Gly Val Tyr
690 695 700
Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly
705 710
(2) 配列番号 5の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 2145 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 二本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
( ii ) 配列の種類： Genomic DNA (iii ) ハイポセティカル： NO
(iv) アンチセンス： NO
(vi ) 起源：
(A)生物名：ェシヱリヒア · コリ (Escherichia coli)
(B)株名： C S 5 2 0
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置： 1. . 2145
(xi ) 配列： SEQ ID N0:5 :
ATG AAC GTT ATT GCA ATA TTG AAT CAC ATG GGG GTT TAT TTT AAA GAA 48 Met Asn Val He Ala l ie Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
GAA CCC ATC CGT GAA CTT CAT CGC GCG CTT GAA CGT CTG AAC TTC CAG 96 Glu Pro He Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gin
20 25 30
ATT GTT TAC CCG AAC GAC CGT GAC GAC TTA TTA AAA CTG ATC GAA AAC 144 l ie Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu l ie Glu Asn
35 40 45
AAT GCG CGT CTG TGC GGC GTT ATT TTT GAC TGG GAT AAA TAT AAT CTC 192 Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val He Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
GAG CTG TGC GAA GAA ATT AGC AAA ATG AAC GAG AAC CTG CCG TTG TAC 240 Glu Leu Cys Glu Glu He Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
GCG TTC GCT AAT ACG TAT TCC ACT CTC GAT GTA AGC CTG AAT GAC CTG 288 Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
CGT TTA CAG ATT AGC TTC TTT GAA TAT GCG CTG GGT GCT GCT GAA GAT 336 Arg Leu Gin l ie Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110 OLZ 992 092 n9i an ^ΐθ eiV usy OJJ 3JV 3Md ェ an OJJ J¾ 八
918 Lid IIV 190 DVI 139 3VV 103 33V 033 300 DXl XVX 31V VDO 93V 110
552 052 ^
dsy J as ) 3N dH naq S TH 1{ L nal sA sifj SAQ usy 3jy dsy
89 IV9 30V OIV 9IV 9IV 913 OVD 33V 913 931 VVV 3V3 301 OVV 103 3V0
θεΖ 9ZZ an Η3Ί 3ΐ Ι JLU J3S BIV QJd BIV J3S "^丄 13« ΑΤΟ Τ^Λ 3ΐ Ι sA
02 IIV 010 11V 03V OOV 399 VDO VDO 130 IDI 3V1 OXV 190 IIO XIV VVV
022 912 012 usy BIV jqi J9S ^MI ^IO USV -tMi I^A ¾3W ユ^ L J3S 3 dsy BTV usy
219 OVV 030 10V 331 I3V 100 OVV ODV 010 OIV OVI 30V 003 OVO VOO OVV
002 96 ΐ
3Md ΐΒΛ 3JV BIV 3Ϊ Ι J "ΐθ ηΐθ ^ sA S TH OJJ Λχο jas S TR
^9 ill 019 393 139 OXV IVI 9V3 VV3 V09 VV9 VVV 3V3 V33 X90 10V OVO
061 58ΐ 08T
dsy naq na J3§ na n^g jag 八 J3§ an jas 3Π dsy ュ sAq
9ZS IVO 913 013 IDI 100 013 VV9 IDI VIO V3I XIV DDI IIV IVO LOl VVV
S I OAI 991
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091 SST 091 S ΐ s l UT9 8Md BIV -iMX ^TO ^ΐθ S TH 0Jd J¾L s sqj jqi
08 VVV 3V3 DII V39 X3V 193 309 9丄 V 3V3 100 130 I3V 191 Oil IDV IVI
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311 ュ 41 usy 3Π 1 ΠΤ9 dsy im Jqi uig s s \ sAq usy BIV »! 1 ^86 LLV I3V OVV OIV IVI WO OVO 13V 30V OVD 9VV OIV 9VV IVV 139 IIV
- 62 - imO/S6df/I d 0£6LI/96 GGT GGT ATC CCA CAG AGT GAA TTC CAG CAC GCT ACC ATT GCT AAG CGC 864
Gly Gly He Pro Gin Ser Glu Phe Gin His Ala Thr l ie Ala Lys Arg
275 280 285
GTG AAA GAA ACA CCA AAC GCA ACC TGG CCG GTA CAT GCT GTA ATT ACC 912
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val l ie Thr
290 295 300
AAC TCT ACC TAT GAT GGT CTG CTG TAC AAC ACC GAC TTC ATC AAG AAA 960
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe l ie Lys Lys
305 310 315 320
ACA CTG GAT GTG AAA TCC ATC CAC TTT GAC TCC GCG TGG GTG CCT TAC 1008
Thr Leu Asp Val Lys Ser He His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
ACC AAC TTC TCA CCG ATT TAC GAA GGT AAA TGC GGT ATG AGC GGT GGC 1056
Thr Asn Phe Ser Pro l ie Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
CGT GTA GAA GGG AAA GTG ATT TAC GAA ACC CAG TCC ACT CAC AAA CTG 1104
Arg Val Glu Gly Lys Val l ie Tyr Glu Thr Gin Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
CTG GCG GCG TTC TCT CAG GCT TCC ATG ATC CAC GTT AAA GGT GAC GTA 1152
Leu Ala Ala Phe Ser Gin Ala Ser Met He His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
AAC GAA GAA ACC TTT AAC GAA GCC TAC ATG ATG CAC ACC ACC ACT TCT 1200
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
CCG CAC TAC GGT ATC GTG GCG TCC ACT GAA ACC GCT GCG GCG ATG ATG 1248
Pro His Tyr Gly He Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
AAA GGC AAT GCA GGT AAG CGT CTG ATC AAC GGT TCT ATT GAA CGT GCG 1296
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu l ie Asn Gly Ser He Glu Arg Ala
420 425 430 ATC AAA TTC CGT AAA GAG ATC AAA CGT CTG AGA ACG GAA TCT GAT GGC 1344 l ie Lys Phe Arg Lys Glu l ie Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
TGG TTC ΤΠ GAT GTA TGG CAG CCG GAT CAT ATC GAT ACG ACT GAA TGC 1392 Trp Phe Phe Asp Val Trp Gin Pro Asp His l ie Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
TGG CCG CTG CGT TCT GAC AGC ACC TGG CAC GGC TTC AAA AAC ATC GAT 1440 Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn He Asp
465 470 475 480
AAC GAG CAC ATG TAT CTT GAC CCG ATC AAA GTC ACC CTG CTG ACT CCG 1488 Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro l ie Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
GGG ATG GAA AAA GAC GGC ACC ATG AGC GAC TTT GGT ATT CCG GCC AGC 1536 Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly l ie Pro Ala Ser
500 505 510
ATC GTG GCG AAA TAC CTC GAC GAA CAT GGC ATC GTT GTT GAG AAA ACC 1584 l ie Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly l ie Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
GGT CCG TAT AAC CTG CTG TTC CTG TTC AGC ATC GGT ATC GAT AAG ACC 1632 Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser l ie Gly l ie Asp Lys Thr
530 535 540
AAA GCA CTG AGC CTG CTG CGT GCT CTG ACT GAC TTT AAA CGT GCG TTC 1680 Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
GAC CTG AAC CTG CGT GTG AAA AAC ATG CTG CCG TCT CTG TAT CGT GAA 1728 Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
GAT CCT GAA TTC TAT GAA AAC ATG CGT ATT CAG GAA CTG GCT CAG AAT 1776 Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg l ie Gin Glu Leu Ala Gin Asn
580 585 590 ATC CAC AAA CTG ATT GTT CAC CAC AAT CTG CCG GAT CTG ATG TAT CGC 1824 l ie His Lys Leu l ie Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
GCA TTT GAA GTG CTG CCG ACG ATG GTA ATG ACT CCG TAT GCT GCA TTC 1872 Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
CAG AAA GAG CTG CAC GGT ATG ACC GAA GAA GTT TAC CTC GAC GAA ATG 1920 Gin Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
GTA GGT CGT ATT AAC GCC AAT ATG ATC CTT CCG TAC CCG CCG GGA GTT 1968 Val Gly Arg l ie Asn Ala Asn Met l ie Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
CCT CTG GTA ATG CCG GGT GAA ATG ATC ACC GAA GAA AGC CGT CCG GH 2016 Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met l ie Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
CTG GAG TTC CTG CAG ATG CTG TGT GAA ATC GGC GCT CAC TAT CCG GGC 2064 Leu Glu Phe Leu Gin Met Leu Cys Glu He Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
TTT GAA ACC GAT ATT CAC GGT GCA TAC CGT CAG GCT GAT GGC CGC TAT 2112 Phe Glu Thr Asp He His Gly Ala Tyr Arg Gin Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
ACC GTT AAG GTA TTG AAA GAA GAA AGC AAA AAA " 2145 Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys
705 710 715
(2) 配列番号 6の配列の情報：
( i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 715 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： タンパク質
(xi) 配列： SEQ ID NO: 6：
Met Asn Val lie Ala He Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
Glu Pro l ie Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gin
20 25 30 l ie Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu lie Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val l ie Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu He Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr 65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Leu Gin He Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110 l ie Ala Asn Lys l ie Lys Gin Thr Thr Asp Glu Tyr l ie Asn Thr l ie
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gin Lys 145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp l ie Ser l ie Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gin Tyr He Ala Arg Val Phe
195 200 205
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn 210 215 220 Lys lie Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr l ie Leu l ie 225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro l ie Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly l ie Leu
260 265 270
Gly Gly He Pro Gin Ser Glu Phe Gin His Ala Thr l ie Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val He Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe I le Lys Lys 305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser l ie His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro l ie Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val l ie Tyr Glu Thr Gin Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gin Ala Ser Met l ie His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser 385 390 395 " 400
Pro His Tyr Gly He Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu l ie Asn Gly Ser l ie Glu Arg Ala
420 425 430 l ie Lys Phe Arg Lys Glu l ie Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gin Pro Asp His l ie Asp Thr Thr Glu Cys 450 455 460 Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn l ie Asp 465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro l ie Lys Val Thrし eu Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly l ie Pro Ala Ser
500 505 510 l ie Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly l ie Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser l ie Gly He Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe 545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg l ie Gin Glu Leu Ala Gin Asn
580 585 590 l ie His Lys Leu l ie Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
Gin Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met 625 630 635 ' 640
Val Gly Arg He Asn Ala Asn Met l ie Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met l ie Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gin Met Leu Cys Glu l ie Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp l ie His Gly Ala Tyr Arg Gin Ala Asp Gly Arg Tyr 690 695 700
5 OIL SO
sAq sAq I3S ^I nTO s naq JBA sAq A JLU
- 96 -
I8K0/S6df/IOd 0£6iI/96 OA\

Claims

請求の範囲
1 . 配列表配列番号 4に示されるアミノ酸配列を有するリジンデカルボキシ ラーゼをコ一ドする遺伝子。
2 . 遺伝子が配列表配列番号 3に示される 1 0 0 5番目から 3 1 4 3番目に 至る塩基配列を有する請求項 1記載の遺伝子。
3 . 前記アミノ酸配列において、 リジンデカルボキシラ一ゼ活性を実質的に 損なわない 1つまたは複数個のァミノ酸残基の置換、 欠失又は挿入を有する請求 項 1記載の遺伝子。
4 . L一リジン生産能を有し、 細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低 下又は消失させられているェシエリヒア属に属する微生物。
5 . 前記微生物がェシヱリヒア ·コリである請求項 4記載の微生物。
6 . 請求項 1〜3のいずれか一項に記載の遺伝子及びノまたは c a d A遣伝 子の発現が抑えられたことにより、 細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低 下又は消失させられている請求項 4記載の微生物。
7 . 請求項 1〜3のいずれか一項に記載の遺伝子及びノまたは c a d A遺伝 子が破壊されることにより、 該遺伝子の発現が抑えられている請求項 6記載の微 生物。
8 . 塩基配列中に 1つまたは複数個の塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または 逆位により請求項 1〜3のいずれか一項に記載の遺伝子及び または c a d A遺 伝子が破壊された請求項 6記載の微生物。 -
9 . L一リジン生産能を有し、 細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低 下又は消失させられているェシエリヒア厲に属する微生物を液体培地に培養し、 培養液中に L一リジンを生成蓄積せしめ、 これを採取することを特徴とする L - リジンの製造法。
1 0 . 前記微生物が、 請求項 1〜3のいずれか一項に記載の遺伝子及び Zまた は c a d A遺伝子の発現が抑えられたことにより、 細胞中のリジンデカルボキシ ラーゼ活性が低下又は消失させられている請求項 9記載の方法。
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