CN101220366B

CN101220366B - 新的赖氨酸脱羧酶基因以及生产l-赖氨酸的方法

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Publication number: CN101220366B
Application number: CN2007101819693A
Authority: CN
Inventors: 菊池庆实; 铃木智子; 児岛宏子
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1994-12-09
Filing date: 1995-12-05
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2015-12-05
Also published as: US5827698A; AU703308B2; CN100357431C; AU3994895A; HUT77752A; HU223706B1; DK0796912T3; ES2256850T3; CA2207271C; RU2188235C2; KR100420743B1; PL182903B1; DE69534801D1; BR9509896A; EP0796912A1; JP3692538B2; PL320645A1; EP0796912B2; AU703308C; DE69534801T3

Abstract

通过在液体培养基中培养埃希氏杆菌微生物高效生产L-赖氨酸。在此微生物中与L-赖氨酸降解有关的赖氨酸脱羧酶活性降低或消失。例如，一种埃希氏杆菌属微生物，其编码赖氨酸脱羧酶的新型基因和/或cadA基因的表达受到限制，使其产生L-赖氨酸并在培养液中积累和从中回收L-赖氨酸。

Description

新的赖氨酸脱羧酶基因以及生产L-赖氨酸的方法

技术领域

本发明涉及大肠杆菌的一种新的赖氨酸脱羧酶基因，它与L-赖氨酸的降解有关，本发明还涉及一种属于埃希氏杆菌属的微生物，这种微生物对此基因和/或另外一种被称为cadA的L-赖氨酸脱羧酶基因表现出表达受限。此外还涉及到一种通过微生物生产L-赖氨酸的方法。最近，对L-赖氨酸作为一种食品添加剂的需求正在迅速增长。

技术背景

赖氨酸脱羧酶催化L-赖氨酸脱羧生成1，5-戊二胺的反应，这个酶已知为大肠杆菌L-赖氨酸降解酶。其基因的核苷酸序列(被称为 cadA)和这个基因编码的氨基酸序列已经发表(Meng，S.和Bennett，G.N.，J，Bacteriol.，174，2659(1992))。有关除大肠杆菌cadA以外的编码赖氨酸脱羧酶的基因已有2篇报导，其中描述说，在大肠杆菌突变株中测到过微弱的酶活性(Goldemberg，S.H.，J，Bacteriol.，141，1428(1980)；Wertheimer，S.J.和Leifer，Z.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，114，882(1983))。然而，Goldemberg，S.H.曾报导说此酶活性在60℃加热4分钟后降低约30％。但是，Wertheimer，S.J.等人的报导则没有观察到这个现象。由此，第二种赖氨酸脱羧酶的存在是不确定的。

另一方面，用大肠杆菌生产L-赖氨酸的已知方法包括：培养对赖氨酸类似物有抗性的突变株，或培养携载了带有L-赖氨酸生物合成遗传信息的脱氧核酸的载体的重组菌株(日本专利公开No.56-18596)。然而没有任何报导涉及用具有赖氨酸脱羧酶基因限制性表达的埃希氏杆菌属微生物生产L-赖氨酸。

发明公开

本发明的一个目的是：获得大肠杆菌的新的赖氨酸脱羧酶基因；生成一种属于埃希氏杆菌属的产L-赖氨酸微生物，它对此基因和/或cadA 基因表现出表达限制；提供一种通过培养该埃希氏杆菌属微生物生产L-赖氨酸的方法。

本发明人在构建一种已知的赖氨酸脱羧酶基因即cadA基因受到损坏的大肠杆菌菌株时，发现作为赖氨酸脱羧酶降解L-赖氨酸的产物的1，5-戊二胺依然在此菌株中产生。因此，本发明人推测在大肠杆菌中应存在一种新的赖氨酸脱羧酶基因，而且它可能对通过使用埃希氏杆菌属微生物发酵生产L-赖氨酸产生很大影响。在进行了此基因的克隆实验之后，本发明人成功地得到了不同于cadA基因的新的L-赖氨酸脱羧酶基因。另外还发现通过限制此基因和cadA基因在大肠杆菌L-赖氨酸生产菌株中的表达，使L-赖氨酸降解活性显著降低或消失，并使L-赖氨酸产量明显增加。由此，完成了此项发明。

也就是说，本发明提供一种编码大肠杆菌L-赖氨酸脱羧酶的新的基因。把这个基因命名为“ldc”基因。

另一方面，本发明提供一种产L-赖氨酸的属于埃希氏杆菌属的微生物，这种微生物细胞内的赖氨酸脱羧酶活性降低或消失。

此外，本发明还提供一种生产赖氨酸的方法，这个方法包括：在液体培养基中培养上述埃希氏杆菌属微生物，使之生产L-赖氨酸并积累于培养液中，然后收集L-赖氨酸。

上述属于埃希氏杆菌属的微生物包括这样一种微生物，其细胞内的赖氨酸脱羧酶活性由于限制ldc基因和/或cadA基因的表达而降低或消失。

本发明的详细内容叙述如下。

<1>制备含有新的赖氨酸脱羧酶基因的DNA片段

含有本发明的新的赖氨酸脱羧酶基因(ldc)的DNA片段可从已有的大肠杆菌菌株，例如K-12或其衍生菌株得到。

首先，通过聚合酶链式反应(下称“PCR方法”)从源自大肠杆菌 K-12的W3110株的染色体DNA中获得已知的赖氨酸脱羧酶基因，cadA 基因。cadA基因的核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列分别在SEQ IDNO：5和6中给出。通过使用质粒或噬菌体载体的方法，从大肠杆菌 W3110的染色体DNA文库中克隆与cadA基因序列相似的DNA片段，以确认是否在这些DNA片段中含有新的赖氨酸脱羧酶基因。可用PCR方法制备探针进行Southern杂交来确认含有目的基因。

确认存在于如此得到的DNA片段中的目的基因核苷酸序列的方法如下。首先，将此DNA片段与在大肠杆菌细胞中可自主复制的质粒载体相连接，以制备重组DNA，将其导入大肠杆菌感受态细胞。所得到的转化子在液体培养基中培养，并从增殖细胞中回收重组DNA。用双脱氧法(Sanger，F.等，Proc.Natl.Acad.sci.，74，5463(1977))检测回收重组DNA中所含DNA片段的全部核苷酸序列。对DNA结构进行分析以确定启动子、操纵子、SD序列、起始密码子、终止密码子、开放阅读框架等所在位置。

本发明的新的赖氨酸脱羧酶基因具有序列表中SEQ ID NO：3所示DNA片段中全部核苷酸序列的第1005-1007核苷酸ATG到第3141-3143核苷酸GGA的序列。这个基因编码的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列在序列表SEQ ID NO：4中给出。已经发现，新的赖氨酸脱羧酶与cadA基因编码的赖氨酸脱羧酶的同源性是69.4％。

本发明的基因可以是序列表中SEQ ID NO：4所给出的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列的编码序列，该基因的核苷酸序列不限于上述核苷酸序列。本发明的基因编码的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列可以有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入而不会引起赖氨酸脱羧酶活性的实质退化。具有这类缺失、插入或替换的赖氨酸脱羧酶的基因可以从大肠杆菌的自发突变或人工诱变株中得到，也可以从大肠杆菌以外的埃希氏属微生物中得到。对具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的赖氨酸酶的编码基因实行体外突变或定点诱变可获得编码这种具有缺失、插入或替换的赖氨酸脱羧酶的突变基因。这些突变的处理可以按照本领域专业人员所熟知的方法进行，如下所述。

然而，本文涉及的编码含有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入的赖氨酸脱羧酶的基因包括那些来源于“ldc”基因和可以被认为实质上与 ldc基因相同的基因。这并不是要将此含义延伸到那些不同来源的基因。也不可能对“多个”的确切范围做具体描述。但对本领域的专业人员来说不难理解，例如cadA基因编码与SEQ ID NO：3有200个以上的氨基酸残基不同的蛋白质，其与本发明的基因是不同的。而对那些编码有同样赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质的基因，即使其编码的蛋白质与SEQ IDNO：3氨基酸序列有2至3个氨基酸残基的差异，仍包括在本发明的范围内。

<2>建立赖氨酸脱羧酶基因表达受限的埃希氏杆菌属微生物

本发明的埃希氏杆菌属微生物是一种细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失的埃希氏杆菌属微生物。这种埃希氏杆菌属微生物包括大肠杆菌。其细胞内赖氨酸脱羧酶活性的降低或消失是通过诸如限制新的赖氨酸脱羧酶基因(ldc)和上述已知的cadA基因中任意一个或两个基因的表达实现的。另外，细胞内赖氨酸脱羧酶活性的降低和消失也可以通过修饰酶的结构，使这些基因编码的赖氨酸脱羧酶的专一性活性降低或消失来实现。

限制ldc基因和已知的cadA基因表达的方法包括例如在转录水平限制基因的表达。这是通过这类基因的启动子序列中一个或多个核苷酸替换、缺失、插入、添加或倒位和使启动子活性降低的方式实现的(M.Rosenberg和D.Court，Ann.Rev.Genetics13(1979)P.139，P.Youderian，S.Bouvier和M.Susskind，Cell 30(1982)P.843-853)。另一种方法是通过使SD序列和起始密码之间的区域中一个或多个核苷酸发生替换、缺失、插入、添加或倒位从而在翻译水平上限制这些基因的表达(J.T.Dunn，E.Buzash-Pollert和F.W.Studier，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，75(1978)P.2743)。此外，为使赖氨酸脱羧酶专一性降低或消失，可使用一种方法，即使编码区的核苷酸序列中一个或多个核苷酸发生替换、缺失、插入、添加或倒位，从而使赖氨酸基因编码区被修饰或破坏。

除上述ldc或cadA基因外，这类允许发生核苷酸替换、缺失、插入、添加或倒位的基因也可以是有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入却不使其编码的赖氨酸脱羧酶基本活性退化的那些ldc或cadA基因。

引起基因中核苷酸替换、缺失、插入、添加或倒位的方法还包括定点突变的方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Mothods in Engymology.，154，350(1987))，和一种用诸如连二亚硫酸钠和羟胺等化合物处理的方法(Shortle.D.和Nathans，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，270(1978))。

定点突变是一种用合成的寡核苷酸使选择性替换、缺失、插入、添加或倒位引入到选定的有限核苷酸对的技术。要使用这种技术，首先得使质粒变性成单链，该质粒中克隆有带特定DNA序列的目的基因。然后合成与希望的突变部位互补的寡核苷酸。但此方法中合成的寡核苷酸不要有完全互补的序列，而应被设计成具有可任选的核苷酸替换缺失、插入、添加或倒位。此后，将上述单链DNA与有可任选的替换、缺失、插入、添加或倒位的合成寡核苷酸进行退火。用T4连接酶和DNA聚合酶I的Ilenow片段合成完整的双链质粒，并导入大肠杆菌感受态细胞。一些如此获得的转化子中的质粒含有这样的基因，其中可任选的核苷酸替换、缺失、插入、添加或倒位被固定下来。重组PCR方法(PCRTechnology，Stockton press(1989))与上述方法类似，也可以引入突变使基因被修饰或受到破坏。

化学试剂法直接用连二亚硫酸钠、羟胺等处理含目的基因的DNA片段，使其发生随机的碱基替换、缺失、插入、添加或倒位等基因突变。

通过用上述诱变中得到的被修饰或被破坏的基因取代埃希氏杆菌属微生物染色体中的正常基因可抑制细胞中ldc基因和/或cadA基因的表达。这种取代基因的方法包括使用同源重组(分子遗传实验，冷泉港实验室出版社(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，J.Bacteriol.，162，1196(1985))。同源重组基于埃希氏杆菌属微生物普遍具有的能力。当与染色体有同源序列的质粒等被引入细胞时，在有同源序列的部位就会发生一定频率的重组，并使整个质粒结合到染色体上。此后若又有重组在此部位发生，这个质粒就会从染色体上脱落。而有时在此过程中引入的突变更容易固定在染色体上，这取决于重组的位置，原来的正常基因与质粒一起脱落。筛选这样的菌株可以得到染色体上正常基因已被破坏了的或修饰了的基因所取代的菌株。而通过引入核苷酸替换，缺失，插入、添加或倒位所造成的突变，就可得到这种被破坏或被修饰的基因。

经过基因取代的埃希氏杆菌属微生物具有赖氨酸生产活性。这种有赖氨酸生产活性的埃希氏杆菌属微生物，比如大肠杆菌微生物菌株可以通过对没有赖氨酸生产活性的菌株施以诱变处理而得到。这种诱变处理可使此微生物具有对赖氨酸类似物如S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(下称“AEC”)具有抗性。这类突变处理方法包括用化学试剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍和亚硝酸处理大肠杆菌细胞或用紫外照射、辐射或类似方法处理大肠杆菌细胞。尤其是，这种微生物菌株包括大肠杆菌AJ13069(FERM P14690)。它由大肠杆菌K-12的W3110菌株获得AEC抗性后形成的。大肠杆菌AJ 13069于1994年12月6日起保存在国立生命科学和人体技术研究所(邮编：305，1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-Shi，Ibarakiken，Japan)保藏号：FERM P-14690，并于1995年9月29日按布达佩斯协议转变为国际保藏。保藏号是FERM BP-5252。

通过基因重组技术引入并增强携带与L-赖氨酸生物合成有关的遗传信息的DNA也可以得到产L-赖氨酸活性的大肠杆菌菌株。所引入的基因是编码L-赖氨酸生物合成途径中各种酶的基因，比如：天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶。当基因所编码的酶被L-赖氨酸反馈抑制，比如天冬氨酸激酶或二氢吡啶二羧酸合成酶的情况下，最好使用突变型基因，这种基因编码的酶对于抑制作用已脱敏。为了引入和增强这类基因，可以采用一种方法即将这类基因连接到在大肠杆菌细胞中可自主复制的载体上，然后转化大肠杆菌以得到重组DNA。或者也可以通过使用转导、转座(Berg，D.E和Berg，C.M.Bio/Technol.，1，417(1983))，Mu噬菌体(日本专利公开No.2-109985)或同源重组(分子遗传实验，冷泉港实验室(19720))将此基因结合到宿主染色体上。

其它获得携带功能损坏的基因的埃希氏杆菌属微生物的方法包括：用化学试剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍和亚硝酸处理，或用紫外照射，辐射等处理带有目的基因的埃希氏杆菌属微生物，使其发生遗传突变。

在下面实施例中，带有功能损坏的基因的埃希氏杆菌菌株是通过下述方法建立的。即，使其编码区部分缺失，在缺失部位插入药物抗性基因。获得的赖氨酸脱羧酶基因可以利用上述同源重组法来代替大肠杆菌染色体上的赖氨酸脱羧酶基因。

在一个微生物菌株中的本发明的新的赖氨酸脱羧酶基因和cadA基因的表达产生抑制作用或对其中任一种产生抑制作用都是可能的。可以在具有L-赖氨酸生产能力的埃希氏杆菌属微生物中限制赖氨酸脱羧酶基因的表达，或按上面介绍的方法，可以使赖氨酸脱羧酶基因表达受限的埃希氏杆菌属微生物具备L-赖氨酸生产能力。

<3>利用赖氨酸脱羧酶基因表达受限的埃希氏杆菌属

微生物的L-赖氨酸生产

通过培养用上述方法获得的具有表达受限赖氨酸脱羧酶基因的埃希氏杆菌属微生物在培养液中生产和积累可观量的L-赖氨酸。只通过限制已知的cadA基因表达增加了L-赖氨酸的积累量。但是，本发明的新的赖氨酸脱羧酶基因的表达限制对增加L-赖氨酸的收获量更有效。通过使用cadA基因和本发明的新的基因的表达都受到限制的菌株可达到L-赖氨酸生产的最理想的效果。

L-赖氨酸生产用的培养基是普通培养基，含有碳源、氮源、无机离子和可任选的其它微量有机营养源。碳源可以用糖类如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物；醇类如甘油、山梨醇；有机酸如延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸。氮源可用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵；有机氮源如大豆水解物；氨气；氨水。无机离子有：磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子及其它少量添加物。除此之外，最好还有维生素B₁，适量酵母浸膏等作为微量有机营养源。

优选地在有氧条件下持续16-72小时。培养温度控制在30℃至45℃，pH值控制在5至7。可用无机或有机的酸性或碱性的物质，或氨气等调节pH值。

充分培养后，收集发酵液中的L-赖氨酸。收集方法可根据具体情况将普通离子交换树脂法，沉淀法或其它已知方法结合起来进行。

附图简述

图1，显示含有新的赖氨酸脱羧酶基因的质粒pUC6F5HH5的结构。

图2：显示含有新的赖氨酸脱羧酶基因的温度敏感质粒pTS6F5HH5的结构以及pTS6F5HH5Cm质粒的构建，其中这个基因的一部分被含有氯霉素抗性基因的片段替换。

图3：显示带有正常赖氨酸脱羧酶基因的菌株WC196和带有受损的赖氨酸脱羧酶基因的菌株WC196C、WC196L以及WC196LC之间L-赖氨酸降解活性的比较。

实施本发明的最佳方案

下面参照实施例对本发明做更详细的解释。

实施例1

(1)新的赖氨酸脱羧酶基因克隆

按常规方法从来自National of Genetics(Yata 1111，Mishima-Shi，Shizuoka-Ken，Japan)的大肠杆菌K-12 W3110菌株细胞中提取染色体DNA。同时，以Meng，S.和Bennett，G.N.，J.Bacteriol，174，2659(1992)中描述的cadA基因的核酸序列(见SEQ ID NO：5)为基准用常规方法合成序列表中给出的SEQ ID NOS：1和2两个合成的DNA引物。它们分别与cadA基因的5′端上游序列和3′端序列同源。在按照Erlich等人 (PCRTechnology，Stockton press(1989))的方法做PCR实验时使用此染色体DNA和这对DNA引物。这样得到的2.1kb片段含有几乎全部cadA 基因。这个片段用随机引物标记盒(Takara Shuzo生产)和[α-³²p]dcTP(Amersham Japan生产)进行标记以制备杂交探针。

下一步，用制备好的探针和大肠杆菌/Gene Mapping膜(Takara Shuzo生产)按常规方法进行杂交(冷泉港实验室出版社，第二版(1989))。Kohara等人的基因文库(大肠杆菌染色体DNAλ噬菌体文库：见Kohara，.Y.等.，Cell 50，495-508(1987))已事先吸附在大肠杆菌/Gene Mapping膜上面。在杂交时，通过弱化探针洗脱条件(2×SSC，55°×30分钟)富集有类似于cadA基因序列的λ噬菌体克隆。结果，除了在含有cadA基因区(21H11，5G7)克隆中找到强标记外，还在三个噬菌体克隆E2B8、6F5H和10F9中成功地发现弱标记信号。三个λ噬菌体克隆E2B8、6F5H、10F9的括入序列是相互交叠连续的大肠杆菌染色体片段。由此，用常规方法分离出Kohara等人的基因文库中6F5Hλ噬菌体DNA并进行各种限制酶解，以便用上述探针以及与上述类似的方法进行印迹杂交。结果表明，用Hind III酶解得到的5kbp DNA片段中存在与cadA基因序列相似的序列。

用T4连接酶将HindIII酶解6F5Hλ噬菌体DNA所得到的5kbp片段与质粒pUC19(Takara Shuzo生产)Hind III酶解物相连。将此混合物转化大肠杆菌TM109(Takara Shuzo生产)得到在加入50mg/ml氨苄青霉素的完全平板培养基(10克蛋白胨，5克酵母浸膏，5克氯化钠溶于1升水中)上能生长的氨苄青霉素抗性菌株。由此得到的微生物菌株含有一插入Hind III酶解6F5Hλ噬菌体DNA所得5kbp片段的质粒。从这些细胞中抽提质粒就得到质粒pUC GF5HH5。图1表示质粒pUC6F5HH5的结构。

含有此质粒的大肠杆菌JM109/pUC6F5HH5被命名为AT13068于1994年12月6日保藏在国立生命科学与人体技术研究所保藏号是FERMP-1 4689，关于1995年9月29日按布达佩斯协议转变为国际保藏，其保藏号是FERM BP-5251。

(2)确定新的赖氨酸脱羧酶基因的核苷酸序列

pUC 6F5HH5中Cia I和Hind III限制酶切点之间的核酸序列按分子克隆(第二版)，冷泉港实验室出版社，1989中描述的方法测定。结果显示此核酸序列编码序列表中SEQ ID NO：3的序列。此DNA序列含有一开放阅读框架，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

(3)制备具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌

大肠杆菌W3110在完全培养基中37℃培养4小时(含10克蛋白胨，5克酵母浸膏，5克氯化钠，溶于1升水)，得到的微生物细胞用浓度为200微克/毫升的N-甲基-N′硝基-N亚硝基胍37℃处理30分钟，清洗，再转到基本平板培养基(含7克磷酸氢二钠，3克磷酸二氢钾，1克氯化铵，0.5克氯化钠，5克葡萄糖，0.25克7水硫酸镁，15克琼脂溶于1升水)。其中加入5克/升AEC。经37℃48小时培养后分离出现的克隆即得到AEC抗性菌株。WC196株作为其中之一具有L-赖氨酸生产能力。WC196菌株被命名为AJ 13069于1994年12月6日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，保藏号是FERM P-14690，并于1995年9月29日按布达佩斯协议转为国际保藏，保藏号是FERM BP-5252。

(4)建立新的赖氨酸脱羧酶基因功能受损的WC196菌株

用T4 DNA连接酶将上述Hind III酶解6F5Hλ噬菌体DNA得到的5kbp片段与Hind III酶解的温度敏感质粒pMAN 031相连接(Yasueda，H.等)，Appl.Microbiol，.Biotechnol，36，211(1991))。此反应混合物用于转化大肠杆菌JM109，然后在加有50毫克/升氨苄青霉素的完全培养基中37℃培养24小时以使氨苄青霉素抗性菌株生长。由此得到的微生物菌株带有插入Hind III酶解的λ噬菌体DNA 5kbp片段。从此菌株细胞中提取质粒得到pTS6F5HH5质粒。将质粒pTS6F5HH5用EcoRV酶解以除去其中的1kbp DNA片段。然后用T4连接酶将从pHSG 399(TakaraShuzo)经AccI酶解得到的约1kbp氯霉素抗性基因片段插入其中。由此构建成质粒pTS6F5HH5 Cm。此操作结果使我们成功构建了含有新的赖氨酸脱羧酶基因功能受损的DNA片段的质粒。图2表示质粒pTS6F5HH5结构的质粒pTS6F5HH5 Cm的结构。

下一步，采用一般同源重组技术(Matsuyama，S.和Mizushima，S.，J.Bacteriol.，162，1196(1985))，利用质粒pTS6F5HH5Cm的温度敏感性建立菌株。在此菌株中，WC 196染色体上的新的赖氨酸脱羧酶基因被功能受损的新的赖氨酸脱羧酶基因DNA片段所取代。就是说，用质粒pTS6F5HH5Cm转化WC 196，先获得在30℃下对青霉素和氯霉素有抗性的菌株。然后再由此菌株获得42℃下对氨苄青霉素和氯霉素有抗性的菌株。再进一步由此菌株得到30℃下对氨苄青霉素敏感而对氯霉素有抗性的菌株。这样建立的菌株，其WC 196株的染色体上新的赖氨酸脱羧酶基因被功能受损的新的赖氨酸脱羧酶基因DNA片段所取代。此菌株被命名为WC 196L。

(5)建立cadA基因缺陷型WC196菌株和WC196L菌株

已知的赖氨酸脱羧酶基因cadA受损的大肠杆菌已为人们所知，包括例如来源于大肠杆菌K-12的GNB10181菌株(见Auger，E.A.等人Mol，Microbiol，3，609(1989))；此菌株可以从大肠杆菌遗传贮备中心(Connecticut，USA)得到。已经证明此菌株的cadA基因区是缺陷的。因此，GNB10181株的cadA基因缺陷特点由通用的P1噬菌体转导方法转导给WC196从而制建了WC196C菌株。WC196株的cadA基因缺陷由核酸印迹杂交确认。此外，带有cadA基因缺陷的WC196LC菌株通过与上述类似的方法从WC196L建立。

实施例2

(1)WC196、WC16C、WC196L和WC196LC菌株的赖氨酸降解活性的确定

如上述建立的4个菌株在赖氨酸生产培养基中37℃培养17小时(培养基含40克葡萄糖，16克硫酸铵，1克硫酸二氢钾，2克酵母浸膏，10毫克4水或5水硫酸锰，10毫克7水硫酸铁，溶于1升水；pH值用氢氧化钾调到7.0，然后加30克无菌的碳酸钾)。收集的微生物细胞用生理盐水洗2次，悬浮在用于检测赖氨酸降解的培养基中(含17克磷酸氢二钾，3克磷酸二氢钾，0.5克氯化钠，10克L-赖氨酸盐酸盐，溶于1升水)。37℃培养31小时。

图3显示随时间延续，培养基中剩余L-赖氨酸量的变化。L-赖氨酸量由AS-210 Biotech Analyzer(Asahi Chemical Industry)测定。可观察到WC196菌株中L-赖氨酸明显降解。然而在已知赖氨酸脱羧酶基因 cadA基因缺陷的WC196C菌株，L-赖氨酸降解度略有下降。在带有功能受损的赖氨酸脱羧酶基因的菌株WC196L和W196LC中没有观察到L-赖氨酸降解。培养时间达3小时时，任何一种菌株内剩余L-赖氨酸的量都有下降。但这种下降是因为L-赖氨酸进入微生物细胞内而不是降解造成的。

(2)由WC196、WC196C、WC196L和WC196LC

菌株生产L-赖氨酸

上述四种菌株在前述L-赖氨酸生产用培养基中37℃培养20小时。检测培养液中L-赖氨酸和1，5-戊二胺的产生量和累积量。L-赖氨酸的量可用前述Biotech Analyser AS-210定量测定。1.5-戊二胺则用高压液相层析定量测定。

结果如表1所示。与WC196相比，带有功能受损的cadA基因的WC196C，其L-赖氨酸的累积量增加而作为L-赖氨酸降解产物的1，5-戊二胺的累积量减少。与WC 196和WC196C相比，带有功能受损的新的赖氨酸脱羧酶基因的WC196L菌株也表现同样的结果。而在携带这两种功能受损的赖氨酸脱羧酶基因的WC196LC菌株中只检测到L-赖氨酸累积量的进一步增加却检测不到其降解产物1，5-戊二胺。

表1

微生物菌株	L-赖氨酸累积量 (毫/升)	1， 5-戊二胺累积量 (毫/升)
			WC196 WC196C WC196L WC196LC	1.4 1.9 2.3 3.3	0.60.40.1未检测

实施例3

用含有新的赖氨酸脱羧酶基因的pUC6F5HH5转化具有L-赖氨酸降解活性消失特点的大肠杆菌WC196LC以使其获得氨苄青霉素抗性。WC196LC菌株和WC196LC/pUC6F5HH5菌株在添加有5克/升赖氨酸的生产赖氨酸用培养基中37℃培养16小时，然后检测1，5-戊二胺。

结果如表2所示。WC196LC菌株不能将L-赖氨酸转化成1，5-戊胺而WC196LC/pUC6F5HH5菌株有能力将L-赖氨酸转化成1，5-戊二胺。

表2

微生物菌株	1，5-戊二胺产量(克/升)
		WC 196LCWC196LC/pUC6F5HH5	未检测 0.93

工业实用性

本发明的新的赖氨酸脱羧酶基因与大肠杆菌的L-赖氨酸降解有关。培养上述基因和/或cadA基因呈表达限制并具有产L-赖氨酸活性的埃希氏杆菌属菌株可低成本高效率地生产L-赖氨酸。

序列表

(1)一般资料：

(i)申请人：AJINOMOTO Co.，Inc.

(ii)发明名称：NOVEL LYSINE DECARBOXYLASE GENE AND METHOD OFPRODUCING L-LYSINE

(iii)序列数： 6

(iv)相关地址：

(A)收信人：

(B)街道：

(C)城市：

(D)州：

(E)国家：

(F)邮编：

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容型

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：FastSEQ Version 1.5

(vi)当前申请资料：

(A)申请号：

(B)提交日期：

(C)分类：

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：

(B)提交日期：

(viii)律师/代理人资料：

(A)姓名：

(B)注册号：

(ix)远程通讯资料：

(A)电话：

(B)电传：

(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(ix)序列描述：SEQ ID NO：1：

TGGATAACCA CACCGCGTCT 20

(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：无

(iv)反义：有

(ix)序列描述：SEQ ID NO：2：

GGAAGGATCA TATTGGCGTT 20

(2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：3269个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(vi)来源：

(A)生物体：大肠杆菌

(B)菌株：W3110

(ix)特征：

(A)名称/关键字CDS

(B)位置：1005至3143

(ix)序列描述：SEQ ID NO：3：

ATCGATTCTC TGACTGCGGT TAGCCGTCAG GATGAGAAAC TGGATATTAA CATCGATGAA 60

GAAGTGCATC GTCTGCGTGA AAAAAGCGTA GAACTGACAC GTAAAATCTT CGCCGATCTC 120

GGTGCATGGC AGATTGCGCA ACTGGCACGC CATCCACAGC GTCCTTATAC CCTGGATTAC 180

GTTCGCCTGG CATTTGATGA ATTTGACGAA CTGGCTGGCG ACCGCGCGTA TGCAGACGAT 240

AAAGCTATCG TCGGTGGTAT CGCCCGTCTC GATGGTCGTC CGGTGATGAT CATTGGTCAT 300

CAAAAAGGTC GTGAAACCAA AGAAAAAATT CGCCGTAACT TTGGTATGCC AGCGCCAGAA 360

GGTTACCGCA AAGCACTGCG TCTGATGCAA ATGGCTGAAC GCTTTAAGAT GCCTATCATC 420

ACCTTTATCG ACACCCCGGG GGCTTATCCT GGCGTGGGCG CAGAAGAGCG TGGTCAGTCT 480

GAAGCCATTG CACGCAACCT GCGTGAAATG TCTCGCCTCG GCGTACCGGT AGTTTGTACG 540

GTTATCGGTG AAGGTGGTTC TGGCGGTGCG CTGGCGATTG GCGTGGGCGA TAAAGTGAAT 600

ATGCTGCAAT ACAGCACCTA TTCCGTTATC TCGCCGGAAG GTTGTGCGTC CATTCTGTGG 660

AAGAGCGCCG ACAAAGCGCC GCTGGCGGCT GAAGCGATGG GTATCATTGC TCCGCGTCTG 720

AAAGAACTGA AACTGATCGA CTCCATCATC CCGGAACCAC TGGGTGGTGC TCACCGTAAC 780

CCGGAAGCGA TGGCGGCATC GTTGAAAGCG CAACTGCTGG CGGATCTGGC CGATCTCGAC 840

GTGTTAAGCA CTGAAGATTT AAAAAATCGT CGTTATCAGC GCCTGATGAG CTACGGTTAC 900

GCGTAATTCG CAAAAGTTCT GAAAAAGGGT CACTTCGGTG GCCCTTTTTT ATCGCCACGG 960

TTTGAGCAGG CTATGATTAA GGAAGGATTT TCCAGGAGGA ACAC ATG AAC ATC ATT 1016

Met Asn Ile Ile

1

GCC ATT ATG GGA CCG CAT GGC GTC TTT TAT AAA GAT GAG CCC ATC AAA 1064

Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp Glu Pro Ile Lys

5 10 15 20

GAA CTG GAG TCG GCG CTG GTG GCG CAA GGC TTT CAG ATT ATC TGG CCA 1112

Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln Ile Ile Trp Pro

25 30 35

CAA AAC AGC GTT GAT TTG CTG AAA TTT ATC GAG CAT AAC CCT CGA ATT 1160

Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His Asn Pro Arg Ile

40 45 50

TGC GGC GTG ATT TTT GAC TGG GAT GAG TAC AGT CTC GAT TTA TGT AGC 1208

Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu Asp Leu Cys Ser

55 60 65

GAT ATC AAT CAG CTT AAT GAA TAT CTC CCG CTT TAT GCC TTC ATC AAC 1256

Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr Ala Phe Ile Asn

70 75 80

ACC CAC TCG ACG ATG GAT GTC AGC GTG CAG GAT ATG CGG ATG GCG CTC 1304

Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met Arg Met Ala Leu

85 90 95 100

TGG TTT TTT GAA TAT GCG CTG GGG CAG GCG GAA GAT ATC GCC ATT CGT 1352

Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp Ile Ala Ile Arg

105 110 115

ATG CGT CAG TAC ACC GAC GAA TAT CTT GAT AAC ATT ACA CCG CCG TTC 1400

Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile Thr Pro Pro Phe

120 125 130

ACG AAA GCC TTG TTT ACC TAC GTC AAA GAG CGG AAG TAC ACC TTT TGT 1448

Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys Tyr Thr Phe Cys

135 140 145

ACG CCG GGG CAT ATG GGC GGC ACC GCA TAT CAA AAA AGC CCG GTT GGC 1496

Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys Ser Pro Val Gly

150 155 160

TGT CTG TTT TAT GAT TTT TTC GGC GGG AAT ACT CTT AAG GCT GAT GTC 1544

Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu Lys Ala Asp Val

165 170 175 180

TCT ATT TCG GTC ACC GAG CTT GGT TCG TTG CTC GAC CAC ACC GGG CCA 1592

Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Thr Gly Pro

185 190 195

CAC CTG GAA GCG GAA GAG TAC ATC GCG CGG ACT TTT GGC GCG GAA CAG 1640

His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe Gly Ala Glu Gln

200 205 210

AGT TAT ATC GTT ACC AAC GGA ACA TCG ACG TCG AAC AAA ATT GTG GGT 1688

Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn Lys Ile Val Gly

215 220 225

ATG TAC GCC GCG CCA TCC GGC AGT ACG CTG TTG ATC GAC CGC AAT TGT 1736

Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asn Cys

230 235 240

CAT AAA TCG CTG GCG CAT CTG TTG ATG ATG AAC GAT GTA GTG CCA GTC 1784

His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp Val Val Pro Val

245 250 255 260

TGG CTG AAA CCG ACG CGT AAT GCG TTG GGG ATT CTT GGT GGG ATC CCG 1832

Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Ile Pro

265 270 275

CGC CGT GAA TTT ACT CGC GAC AGC ATC GAA GAG AAA GTC GCT GCT ACC 1880

Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys Val Ala Ala Thr

280 285 290

ACG CAA GCA CAA TGG CCG GTT CAT GCG GTG ATC ACC AAC TCC ACC TAT 1928

Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr Asn Ser Thr Tyr

295 300 305

GAT GGC TTG CTC TAC AAC ACC GAC TGG ATC AAA CAG ACG CTG GAT GTC 1976

Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln Thr Leu Asp Val

310 315 320

CCG TCG ATT CAC TTC GAT TCT GCC TGG GTG CCG TAC ACC CAT TTT CAT 2024

Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr Thr His Phe His

325 330 335 340

CCG ATC TAC CAG GGT AAA AGT GGT ATG AGC GGC GAG CGT GTT GCG GGA 2072

Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu Arg Val Ala Gly

345 350 355

AAA GTG ATC TTC GAA ACG CAA TCG ACC CAC AAA ATG CTG GCG GCG TTA 2120

Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met Leu Ala Ala Leu

360 365 370

TCG CAG GCT TCG CTG ATC CAC ATT AAA GGC GAG TAT GAC GAA GAG GCC 2168

Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr Asp Glu Glu Ala

375 380 385

TTT AAC GAA GCC TTT ATG ATG CAT ACC ACC ACC TCG CCC AGT TAT CCC 2216

Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser Pro Ser Tyr Pro

390 395 400

ATT GTT GCT TCG GTT GAG ACG GCG GCG GCG ATG CTG CGT GGT AAT CCG 2264

Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu Arg Gly Asn Pro

405 410 415 420

GGC AAA CGG CTG ATT AAC CGT TCA GTA GAA CGA GCT CTG CAT TTT CGC 2312

Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala Leu His Phe Arg

425 430 435

AAA GAG GTC CAG CGG CTG CGG GAA GAG TCT GAC GGT TGG TTT TTC GAT 2360

Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly Trp Phe Phe Asp

440 445 450

ATC TGG CAA CCG CCG CAG GTG GAT GAA GCC GAA TGC TGG CCC GTT GCG 2408

Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys Trp Pro Val Ala

455 460 465

CCT GGC GAA CAG TGG CAC GGC TTT AAC GAT GCG GAT GCC GAT CAT ATG 2456

Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp Ala Asp His Met

470 475 480

TTT CTC GAT CCG GTT AAA GTC ACT ATT TTG ACA CCG GGG ATG GAC GAG 2504

Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro Gly Met Asp Glu

485 490 495 500

CAG GGC AAT ATG AGC GAG GAG GGG ATC CCG GCG GCG CTG GTA GCA AAA 2552

Gln Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala Leu Val Ala Lys

505 510 515

TTC CTC GAC GAA CGT GGG ATC GTA GTA GAG AAA ACC GGC CCT TAT AAC 2600

Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr Gly Pro Tyr Asn

520 525 530

CTG CTG TTT CTC TTT AGT ATT GGC ATC GAT AAA ACC AAA GCA ATG GGA 2648

Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr Lys Ala Met Gly

535 540 545

TTA TTG CGT GGG TTG ACG GAA TTC AAA CGC TCT TAC GAT CTC AAC CTG 2696

Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr Asp Leu Asn Leu

550 555 560

CGG ATC AAA AAT ATG CTA CCC GAT CTC TAT GCA GAA GAT CCC GAT TTC 2744

Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu Asp Pro Asp Phe

565 570 575 580

TAC CGC AAT ATG CGT ATT CAG GAT CTG GCA CAA GGG ATC CAT AAG CTG 2792

Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly Ile His Lys Leu

585 590 595

ATT CGT AAA CAC GAT CTT CCC GGT TTG ATG TTG CGG GCA TTC GAT ACT 2840

Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg Ala Phe Asp Thr

600 605 610

TTG CCG GAG ATG ATC ATG ACG CCA CAT CAG GCA TGG CAA CGA CAA ATT 2888

Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp Gln Arg Gln Ile

615 620 625

AAA GGC GAA GTA GAA ACC ATT GCG CTG GAA CAA CTG GTC GGT AGA GTA 2936

Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu Val Gly Arg Val

630 635 640

TCG GCA AAT ATG ATC CTG CCT TAT CCA CCG GGC GTA CCG CTG TTG ATG 2984

Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val Pro Leu Leu Met

645 650 655 660

CCT GGA GAA ATG CTG ACC AAA GAG AGC CGC ACA GTA CTC GAT TTT CTA 3032

Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val Leu Asp Phe Leu

665 670 675

CTG ATG CTT TGT TCC GTC GGG CAA CAT TAC CCC GGT TTT GAA ACG GAT 3080

Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly Phe Glu Thr Asp

680 685 690

ATT CAC GGC GCG AAA CAG GAC GAA GAC GGC GTT TAC CGC GTA CGA GTC 3128

Ile His Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr Arg Val Arg Val

695 700 705

CTA AAA ATG GCG GGA TAACTTGCCA GAGCGGCTTC CGGGCGAGTA ACGTTCTGTT 3183

Leu Lys Met Ala Gly

710

AACAAATAAA GGAGACGTTA TGCTGGGTTT AAAACAGGTT CACCATATTG CGATTATTGC 3243

GACGGATTAT GCGGTGAGCA AAGCTT 3269

(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：713个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(ix)序列描述：SEQ ID NO：4：

Met Asn Ile Ile Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Glu Pro Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln

20 25 30

Ile Ile Trp Pro Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His

35 40 45

Asn Pro Arg Ile Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu

50 55 60

Asp Leu Cys Ser Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ile Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met

85 90 95

Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Ile Arg Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile

115 120 125

Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu

165 170 175

Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe

195 200 205

Gly Ala Glu Gln Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp

245 250 255

Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys

275 280 285

Val Ala Ala Thr Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr His Phe His Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu

340 345 350

Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met

355 360 365

Leu Ala Ala Leu Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr

370 375 380

Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro Ser Tyr Pro Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu

405 410 415

Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala

420 425 430

Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp

465 470 475 480

Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Asp Glu Gln Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala

500 505 510

Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu

565 570 575

Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg

595 600 605

Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp

610 615 620

Gln Arg Gln Ile Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu

625 630 635 640

Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val

660 665 670

Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr

690 695 700

Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly

705 710

(2)SEQ ID NO：5的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：2145个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

iii)假设：无

(iv)反义：无

(vi)来源：

(A)生物体：大肠杆菌

(B)菌株：CS520

(ix)特征：

(A)名称/关键字CDS

(B)位置：1至2145

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

ATG AAC GTT ATT GCA ATA TTG AAT CAC ATG GGG GTT TAT TTT AAA GAA 48

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

GAA CCC ATC CGT GAA CTT CAT CGC GCG CTT GAA CGT CTG AAC TTC CAG 96

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

ATT GTT TAC CCG AAC GAC CGT GAC GAC TTA TTA AAA CTG ATC GAA AAC 144

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

AAT GCG CGT CTG TGC GGC GTT ATT TTT GAC TGG GAT AAA TAT AAT CTC 192

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

GAG CTG TGC GAA GAA ATT AGC AAA ATG AAC GAG AAC CTG CCG TTG TAC 240

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

GCG TTC GCT AAT ACG TAT TCC ACT CTC GAT GTA AGC CTG AAT GAC CTG 288

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

CGT TTA CAG ATT AGC TTC TTT GAA TAT GCG CTG GGT GCT GCT GAA GAT 336

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

ATT GCT AAT AAG ATC AAG CAG ACC ACT GAC GAA TAT ATC AAC ACT ATT 384

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

CTG CCT CCG CTG ACT AAA GCA CTG TTT AAA TAT GTT CGT GAA GGT AAA 432

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

TAT ACT TTC TGT ACT CCT GGT CAC ATG GGC GGT ACT GCA TTC CAG AAA 480

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

AGC CCG GTA GGT AGC CTG TTC TAT GAT TTC TTT GGT CCG AAT ACC ATG 528

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

AAA TCT GAT ATT TCC ATT TCA GTA TCT GAA CTG GGT TCT CTG CTG GAT 576

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

CAC AGT GGT CCA CAC AAA GAA GCA GAA CAG TAT ATC GCT CGC GTC TTT 624

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

AAC GCA GAC CGC AGC TAC ATG GTG ACC AAC GGT ACT TCC ACT GCG AAC 672

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

AAA ATT GTT GGT ATG TAC TCT GCT CCA GCA GGC AGC ACC ATT CTG ATT 720

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225 230 235 240

GAC CGT AAC TGC CAC AAA TCG CTG ACC CAC CTG ATG ATG ATG AGC GAT 768

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

GTT ACG CCA ATC TAT TTC CGC CCG ACC CGT AAC GCT TAC GGT ATT CTT 816

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

GGT GGT ATC CCA CAG AGT GAA TTC CAG CAC GCT ACC ATT GCT AAG CGC 864

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

GTG AAA GAA ACA CCA AAC GCA ACC TGG CCG GTA CAT GCT GTA ATT ACC 912

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

AAC TCT ACC TAT GAT GGT CTG CTG TAC AAC ACC GAC TTC ATC AAG AAA 960

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

ACA CTG GAT GTG AAA TCC ATC CAC TTT GAC TCC GCG TGG GTG CCT TAC 1008

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

ACC AAC TTC TCA CCG ATT TAC GAA GGT AAA TGC GGT ATG AGC GGT GGC 1056

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

CGT GTA GAA GGG AAA GTG ATT TAC GAA ACC CAG TCC ACT CAC AAA CTG 1104

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

CTG GCG GCG TTC TCT CAG GCT TCC ATG ATC CAC GTT AAA GGT GAC GTA 1152

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

AAC GAA GAA ACC TTT AAC GAA GCC TAC ATG ATG CAC ACC ACC ACT TCT 1200

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

CCG CAC TAC GGT ATC GTG GCG TCC ACT GAA ACC GCT GCG GCG ATG ATG 1248

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

AAA GGC AAT GCA GGT AAG CGT CTG ATC AAC GGT TCT ATT GAA CGT GCG 1296

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

ATC AAA TTC CGT AAA GAG ATC AAA CGT CTG AGA ACG GAA TCT GAT GGC 1344

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

TGG TTC TTT GAT GTA TGG CAG CCG GAT CAT ATC GAT ACG ACT GAA TGC 1392

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

TGG CCG CTG CGT TCT GAC AGC ACC TGG CAC GGC TTC AAA AAC ATC GAT 1440

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

AAC GAG CAC ATG TAT CTT GAC CCG ATC AAA GTC ACC CTG CTG ACT CCG 1488

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

GGG ATG GAA AAA GAC GGC ACC ATG AGC GAC TTT GGT ATT CCG GCC AGC 1536

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

ATC GTG GCG AAA TAC CTC GAC GAA CAT GGC ATC GTT GTT GAG AAA ACC 1584

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

GGT CCG TAT AAC CTG CTG TTC CTG TTC AGC ATC GGT ATC GAT AAG ACC 1632

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

AAA GCA CTG AGC CTG CTG CGT GCT CTG ACT GAC TTT AAA CGT GCG TTC 1680

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

GAC CTG AAC CTG CGT GTG AAA AAC ATG CTG CCG TCT CTG TAT CGT GAA 1728

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

GAT CCT GAA TTC TAT GAA AAC ATG CGT ATT CAG GAA CTG GCT CAG AAT 1776

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

ATC CAC AAA CTG ATT GTT CAC CAC AAT CTG CCG GAT CTG ATG TAT CGC 1824

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

GCA TTT GAA GTG CTG CCG ACG ATG GTA ATG ACT CCG TAT GCT GCA TTC 1872

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

CAG AAA GAG CTG CAC GGT ATG ACC GAA GAA GTT TAC CTC GAC GAA ATG 1920

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

GTA GGT CGT ATT AAC GCC AAT ATG ATC CTT CCG TAC CCG CCG GGA GTT 1968

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

CCT CTG GTA ATG CCG GGT GAA ATG ATC ACC GAA GAA AGC CGT CCG GTT 2016

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

CTG GAG TTC CTG CAG ATG CTG TGT GAA ATC GGC GCT CAC TAT CCG GGC 2064

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

TTT GAA ACC GAT ATT CAC GGT GCA TAC CGT CAG GCT GAT GGC CGC TAT 2112

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

ACC GTT AAG GTA TTG AAA GAA GAA AGC AAA AAA 2145

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

(2)SEQ ID NO：6的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：715个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(ix)序列描述：SEQ ID NO：6：

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser ThrIle Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

Claims

1.一种产L-赖氨酸的方法，其包括在液体培养基中培养微生物的步骤，以便在液体培养基中生产并累积L-赖氨酸，并收集L-赖氨酸，其中所述微生物为大肠杆菌微生物，其具有L-赖氨酸生产能力，其细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失，并且其中所述细胞内赖氨酸脱羧酶活性通过编码赖氨酸脱羧酶的基因受到破坏而降低或消失，所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列在序列表SEQ ID NO：4中给出，所述基因由于其核苷酸序列中一个或多个核苷酸的替换、缺失、插入、添加或倒位而被破坏。

2.权利要求1的方法，其中所述基因的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO：3的第1005至3143位。