FI97067C - Riboflaviinia tuottavia mikro-organismikantoja, valikointimenetelmiä ja fermentointimenetelmä - Google Patents

Description

97067

Riboflaviinia tuottavia mikro-organismikantoja, valikoin-timenetelmiä ja fermentointimenetelmä

Keksinnön aihepiiri 5 Kyseinen keksintö koskee mikro-organismeja, jotka pystyvät tuottamaan suuria määriä riboflaviinia, ja erityisesti hiivan Candida flareri eli Candida famata kantoja, jotka tuottavat kasvaneita riboflaviinimääriä, sekä menetelmiä kyseisten mikro-organismien fermentoimiseksi. 10 Keksintö koskee edelleen menetelmiä riboflaviinia runsaasti tuottavien kantojen valikoimiseksi.

Keksinnön tausta

Hyvin monet erilaiset mikro-organismit syntetisoivat riboflaviinia määriä, jotka ylittävät reippaasti or-15 ganismien aineenvaihdunnalliset tarpeet. Ascomycetes-or-ganismien, kuten Ashbya gossypii ja Eremothecium ashybii, tiedetään tuottavan riboflaviinia niitä fermentoitaessa. Tyypillisesti näiden organismien tuottamaa riboflaviinia käytetään ravinnelisänä.

20 Myös muiden mikro-organismien tiedetään tuottavan riboflaviinia. Esimerkiksi sukuihin Clostridium ja Bacillus kuuluvien bakteerien sekä erilaisten hiivasukujen, mukaanlukien Candida, Saccharomyces, Hansenula ja Pichia, tiedetään tuottavan riboflaviinia. Spesifisemmin esimer-25 kiksi US-patenttijulkaisussa 3 433 707 (1959), jonka omistavat Matsubayashi et al·., kuvataan riboflaviinituotantoa kolmen Pichia-hiivalajin toimesta. Ilmoitettiin ribofla-viinisaantoja, jotka olivat 10,5 mg/litra - 51 mg/litra 12 päivässä. Szczesniak et ai. (1973) ilmoittivat ribofla-30 viinin runsaasta tuotosta, joka oli 6,42 g/litra, Ashbya gossypiilla, mitä on käsitelty lähteessä Perlman, Primary Products of Metabolism, 2 Econ. Microbiology, 1978, s. 312.

Yhteisesti omistetussa US-patenttihakemuksessa jul-35 kaisu sarjan:o 811 234, joka jätettiin 20. joulukuuta 2 97067 1985, ilmoitetaan sellaisten Candida flareri -kantojen kehittämisestä, joiden riboflaviinituotanto on kohonnut. Julkaisussa sarjan:o 811 234 kuvatut flareri -kannat tuottivat 5 grammaa riboflaviinia litraa kohden kuuden 5 päivän fermentoinnissa.

Riboflaviinia tuottavan hiivan aineenvaihdunnallisia vaatimuksia koskeneiden tutkimusten perusteella on ilmoitettu riboflaviinin tuotannon olevan herkkää raudan pitoisuudelle. Esimerkiksi Straube et ai♦, The Influence 10 of Iron Concentration and Temperature on Growth and Riboflavin Overproduction of Candida Guilliermondii, Biotechnology and Bioengineering Symposium n:o 4, 1973, ss. 225-231, ilmoittavat, että rautapitoisuus ΙΟ'5 M inhiboi lähes täydellisesti riboflaviinin tuotannon ja että riboflavii-15 nituotanto on likipitäen kääntäen verrannollinen rauta- pitoisuuteen. Straube et ai. totesivat niinikään, että koboltin läsnäolo voi takauttaa raudan inhiboivan vaikutuksen riboflaviinituotantoon. Kobolttipitoisuuksissa 10~4 M ja raudan pitoisuudessa 10~5 M muodostui sama määrä 20 riboflaviinia kuin silloin, kun kobolttia ei ollut läsnä ja rautapitoisuus oli rajoitettu pitoisuuteen 10~7 M.

Muissa lähteissä käsitellään riboflaviinia tuottavien mikro-organismien herkkyyttä raudalle ja erityisesti sitä, että herkkyys raudalle voidaan osittain välttää li-25 säämällä kobolttia, sinkkiä tai kelatoivia aineita fermen-tointialustaan. Chopde et ai., Factors Influencing Riboflavin Synthesis by Cytophaga Hutchinsonii, Indian J. of Microbiology 20:2 (1980); Schlee et al., Physiology and Biochemistry of Riboflavin Formation, Die Pharmazie 12 30 (1984).

Vaikka rauta inhiboi riboflaviinin tuotantoa, on ! esitetty niinikään, että korkeammat rautamäärät stimuloi vat solukasvua. Tämän vuoksi hiivan, jonka herkkyys flavi-nogeneesi-inhibitiolle raudan toimesta on alentunut, tuli- 1 3 97067 si tuottaa suuria määriä riboflaviinia, koska rautapitoisuuksia nostamalla voidaan päästä korkeampiin solutiheyk-siin.

Riboflaviinia tuottavien mikro-organismien sellai-5 sista kannoista, joiden riboflaviinituotannon herkkyys raudan läsnäololle on alentunut, on ilmoitettu. SU-patent-tijulkaisu n:o 330189 (tiivistelmä); DE-patenttijulkaisu n:o 108767 (tiivistelmä).

Täten tarvitaan mikro-organismeja, joiden ribofla-10 viinituotannon taso on noussut. Tarvitaan edelleen sellaisia flavinogeenisten mikro-organismien kantoja, jotka omaavat vastustuskykyä riboflaviinituotannon inhibitiolle raudan toimesta. Lisäksi tarvitaan aiempaa parempia menetelmiä riboflaviinia runsaasti tuottavien mikro-organis-15 mien valikoimiseksi. Tarvitaan myös fermentointialusta, joka ylläpitää lisääntynyttä solukasvua ja flavinogenee-siä. Kyseisen keksinnön mukaiset mikro-organismit tuottavat riboflaviinia määrinä, jotka ylittävät huomattavasti flavinogeenisten mikro-organismien villityyppikantojen 20 tuottamat määrät ja jotka ovat aiempaa huomattavasti parempia tunnettujen kehitettyjen kantojen tuottamiin saantoihin verrattuna.

Keksinnön yhteenveto

Kyseinen keksintö koskee hiivan Candida flareri 25 kantoja, jotka pystyvät tuottamaan 10 grammaa riboflaviinia litraa kohden kuudessa päivässä. On päästy riboflavii-nisaantoihin, jotka ovat yli 20 grammaa litraa kohden 200 tunnissa. Kyseisen keksinnön flavinogeenisimmät kannat ovat flareri -kannat A ja B, jotka identifioivat vas-30 taavasti ATCC-hakunumerot 20849 ja 20850. Toisessa suoritusmuodossa kyseinen keksintö koskee flareri -kantoja, joiden flavinogeneesin herkkyys inhibitiolle raudan toimesta on alentunut. Tällaisille kannoille on tunnusomaista riboflaviinin solua kohden tehostunut tuotanto fermentoin- « 4 97067 tialustan kasvaneissa rautapitoisuuksissa. Kehitettyjä C. flareri -kantoja on myös valikoitu kasvun inhibition vastustuskyvyn suhteen kasvualustan tyhjentämisen vaikutuksesta ja deoksiglukoosin vaikutuksesta.

5 Seuraavassa suoritusmuodossa kyseinen keksintö kä sittää menetelmän aiempaa parempien sellaisten mikro-organismien valikoimiseksi, jotka omaavat vastustuskykyä kasvun inhibitiolle tyhjennetyn kasvualustan vaikutuksesta. Tällaiset mikro-organismit kykenevät kasvamaan kor-10 keammiksi solutiheyksiksi tuottaen suurempia määriä aineenvaihduntatuotteita. Tässä menetelmässä tuotetaan ensin tyhjennetty kasvualusta kasvattamalla mikro-organismipopu-laatiota kunnes solukasvu pysähtyy. Sitten mikro-organismit poistetaan kasvualustasta tyhjennetyn kasvualustan 15 muodostamiseksi. Sitten muodostetaan tyhjennetyn kasvualustan käsittävä valikointikasvualusta. Sen jälkeen toista mikro-organismipopulaatiota mutatoidaan, minkä jälkeen se viedään kyseiseen valikointialustaan. Valikoidaan muta-toidun populaation kannat, jotka kykenevät kasvamaan tyh-20 jennetyllä kasvualustalla. Edullisesti jälkimmäinen mikro-organismipopulaatio edustaa samaa lajia kuin tyhjennetyn kasvualustan muodostanut ensimmäinen populaatio, ja edullisemmin samaa kantaa.

Edelleen seuraavassa suoritusmuodossa kyseinen kek-25 sintö käsittää menetelmän suuria määriä riboflaviinia tuottavien mikro-organismien valikoimiseksi. Tässä menetelmässä mikro-organismilähtöpopulaatio mutatoidaan. Sitten mutatoitua populaatiota viljellään ravinnekasvualus-talla, joka sisältää antibioottia tubersidiini, joka ole-30 tettavasti inhiboi puriiniaineenvaihduntaa. Ravinnekasvu-alusta sisältää tubersidiinia pitoisuuksina, jotka kykene-' vät estämään pesäkemuodostuksen joidenkin mutatoidun popu laation käsittämien mikro-organismien toimesta. Sitten valikoidaan mikro-organismit, jotka kykenevät muodostamaan tl 5 97067 pesäkkeitä tubersidiinia sisältävälle kasvualustalle. Näitä mikro-organismeja voidaan sitten testata riboflaviinin runsaan tuotannon suhteen. Tämän valikointimenetelmän on todettu valikoivan riboflaviinia runsaasti tuottavat mik-5 ro-organismit.

Kyseisen keksinnön seuraava suoritusmuoto käsittää menetelmän riboflaviinin tuottamiseksi viljelemällä kyseisen keksinnön mukaisia mikro-organismikantoja fermentoin-tialustassa. Kohonneeseen riboflaviinituotantoon voidaan 10 päästä kasvualustan rautapitoisuuksissa, jotka ovat noin 5,4 μΜ - noin 15 μΜ. Fermentointialusta sisältää myös gly-siiniä korkeintaan noin 7 g:n/litra pitoisuuksiin asti. Fermentointi suoritetaan ylläpitäen kasvualustan ravinne-pitoisuuksia ja muita fermentointiolosuhteita solukasvun 15 ja riboflaviinituotannon tukemiseksi. Sitten kun solukasvu on tasaantunut, riboflaviini otetaan talteen fermentoin-tialustasta.

Yksityiskohtainen kuvaus

On kehitetty flareri -hiivalajin riboflaviinia 20 tuottavia kantoja, jotka tuottavat aiempaa korkeampia ribof laviini tasoja. Rutiininomaisesti saadaan saantoja, jotka ovat yli 10 grammaa riboflaviinia litraa kasvualustaa kohden 144 tunnissa, ja on päästy saantoihin, jotka ovat yli 20 grammaa riboflaviinia litraa kohden 200 tunnissa. 25 Kyseisen keksinnön mukaiset kannat ovat 30 - 40 -kertaa flavinogeenisempiä kuin villityypin flareri ja 3*i-ker-taa flavinogeenisempiä kuin tehokkain aiemmin tunnetuista riboflaviinituottaj ista.

Erityisesti kanta A, ATCC-hakunumero 20849, kykenee 30 tuottamaan yli 20 grammaa riboflaviinia 200 tunnin fermen-tointiajossa. Kannasta A on kehitetty erilaisia sitä fla-: vinogeenisempiä kantoja mitattuna 2 ml:n rullaputkiribo- flaviinimäärityksellä. Tätä määritystä, jota kuvataan yksityiskohtaisesti esimerkkiosuudessa, ei ole suunniteltu 6 97067 rlboflavilnisaannon maksimoimiseksi, vaan sitä käytetään flavinogeneesin vertaamiseksi eri orgamismikantojen välillä samanlaisissa olosuhteissa. Kanta B, ATCC-hakunumero 20850, kehitettiin kannasta A ja se on 50 % flavinogeeni-5 sempi kuin kanta A rullaputkimäärityksessä.

Kyseisen keksinnön mukaisten flareri -kantojen riboflaviinisynteesin herkkyys inhibitiolle raudan toimesta on alentunut. Kuten edellä esitetty on ilmoitettu, että rauta on riboflaviinisynteesin inhibiittori monissa mikro-10 organismeissa, ja erityisesti Candida-hiivalajeissa. Raudan lisääntyneen pitoisuuden fermentointialustassa on todettu ei ainoastaan lisäävän kyseisen keksinnön mukaisten C. flareri -kantojen solukasvua, vaan myös riboflaviini-tuotantoa solumassaa kohden. Vaikka riboflaviinin voitai-15 siin odottaa lisääntyvän korkeiden rautapitoisuuksien ansiosta lisääntyvän solukasvun myötä, todetut riboflaviini-lisäykset ovat suurempia kuin mitä olisi odotettavissa pelkästään lisääntyneen solukasvun perusteella. Täten kyseisen keksinnön mukaisissa raudalle vastustuskykyä omaa-20 vissa kannoissa flavinogeneesi ei ainoastaan ole epäherkkä rautainhibitiolle, vaan solua kohden laskettuna korkeammat rautapitoisuudet stimuloivat sitä.

Riboflaviinituotannon stimuloi tumista kyseisen keksinnön mukaisilla raudalle vastustuskykyä omaavilla 25 flareri -kannoilla on todettu rautapitoisuuksissa noin 3,6 mikromolaarinen pitoisuus (μΜ). Pitoisuuksissa, jotka ylittävät noin 16,1 μΜ, raudalla on kuitenkin taipumus inhiboida riboflaviinisynteesiä myös näissä kannoissa. Fer-mentoinnin aikana raudan moolipitoisuudet ovat edullisesti 30 noin 5,40 μΜ - noin 15 μΜ, edullisemmin noin 6,12 μΜ -noin 12 μΜ, ja edullisimmin noin 9,8 μΜ - noin 10,8 μΜ.

Kannan A ja sen jälkeläisten toinen tärkeä aineenvaihdunnallinen ominaispiirre on vastustuskyky kasvun inhibitiolle sekä riboflaviinin tuotanto fermentointialus-

II

97067 7 tässä, jossa on kasvatettu viljelmä päätössolutiheyteen. Tällaista kasvualustaa kutsutaan "tyhjennetyksi kasvualustaksi". Tällainen vastustuskyky mahdollistaa korkeampien riboflaviinisaantojen tuoton, koska päästään korkeampiin 5 solutiheyksiin. Näiden kantojen on samoin todettu tuottavan kasvaneita riboflaviinisaantoja solua kohden laskettuna.

Kyseistä keksintöä käsitellään tässä hiivan C. flarerl yhteydessä. flareri tunnetaan myös nimellä 10 Torulopsis Candida. Kyseisen keksinnön mukaiset menetelmät ja menettelyt soveltuvat kuitenkin yhtä hyvin muille Candida-lajeille ja muulle riboflaviinia runsaasti tuottavalle hiivalle ja muille riboflaviinia runsaasti tuottaville mikro-organismeille. Täten spesifisen viittauksen 15 flareeriin tarkoituksena ei ole rajata keksinnön katta maa aluetta tähän nimenomaiseen lajiin.

Kyseisen keksinnön mukaan aiempaa parempia riboflaviinia tuottavia mikro-organismikantoja valikoidaan menetelmillä, joiden mukaan mikro-organismiviljelmä mutatoi-20 daan ja valitaan kantoja, joiden riboflaviinituotannon ominaispiirteet ovat aiempaa parempia. Tyypillisesti muta-toituja mikro-organismeja viljellään kiintällä kasvualustalla, joka sisältää jotain inhiboivaa yhdistettä. Inhibiittorin läsnäollessa muodostuneita pesäkkeitä viljellään 25 ja niiden riboflaviinituottokykyä testataan. Sitten valitaan mikro-organismikannat, joiden riboflaviinituotto on korkea.

Mikro-organismiviljelmiä voidaan mutatoida millä tahansa alalla tunnetuista erilaisista keinoista, ja se 30 voi käsittää joko kemiallisen tai fysikaalisen mutatoin-;; nin. Esimerkiksi kyseiseen keksintöön soveliaita kemial lisia mutageeneja ovat mainittuihin rajoittumatta N-metyy-li-N'-nitro-N-nitrosoguanadiini, diepoksibutaani, etyyli-metaanisulfonaatti, sinappiyhdisteet, hydratsiini ja typ- 8 97067 pihapoke. Fysikaalisia mutageeneja voivat olla mainittuihin rajoittumatta ultravioletti- ja gamma-säteily. Lähtö-viljelmää käsitellään mutatoivalla aineella riittävän tehokkaasti sitä silmälläpitäen, että eloon jää tietyn ko-5 koinen populaatio. Tämä koko vaihtelee mutageenistä toiseen ja on riippuvainen mutaatiomäärästä, jonka mutageeni aikaansaa eloon jääneessä populaatiossa tietyllä tappoti-heydellä. Esimerkiksi NTG:n toivottavan tappotiheyden tulisi jättää eloon noin 10 % - 50 % lähtöpopulaatiosta. 10 Typpihapokemutatoinnin tulisi jättää noin 0,01 % - 0,1 % lähtöpopulaatiosta ja ultraviolettimutatoinnin tulisi jättää noin 1,0 %. Tällä tavoin käsitellyt solut otetaan talteen, pestään ja lietetään kasvua ei-ylläpitävään kasvualustaan, kuten fysiologiseen suolaliuokseen. Tällaisiin 15 soluihin voidaan sitten kohdistaa yksi tai useampi vali-kointimenettely.

Kantoja A ja B kehitettäessä valittiin riboflavii-nia runsaasti tuottavista flareri -kannoista joukko välikantoja alla kuvattuja valikointimenettelyitä käyt-20 täen. Kanta C, ATCC-hakunumero 20755, kehitettiin lukuisia valikointimenettelyitä käyttäen villityypin flare-rlsta ja sitä kuvataan julkaisussa sarjan:o 811 234. Kanta C on alla kuvattujen kantojen, mukaanlukien A ja B, edeltäjä. Kanta C voi tuottaa 1,1 g/litra riboflaviinia 7 päi-25 vässä 2 ml:n rullaputkimäärityksessä. Kantaa C lähtöpopulaationa käyttäen suoritettiin glukoosianalogivalikointi-menettely riboflaviinia runsaasti tuottavien organismien valitsemiseksi.

Kyseisen keksinnön mukaan riboflaviinia runsaasti 30 tuottavat organismit voidaan valikoida esiin valitsemalla mikro-organismeja, jotka omaavat vastustuskykyä glukoosi-analogeille. Tällaiset mikro-organismikannat todennäköisesti keräävät tehokkaammin glukoosia, muuttavat glukoosin tehokkaammin riboflaviiniksi tai voittavat tehokkaammin

II

9 97067 glukoosirepression. Täten riboflavllnia tuottavien mikro-organismien muodostamaa lähtöviljelmää mutatoidaan edellä kuvattuun tapaan. Sitten mutatoitu populaatio maljoitetaan kasvualustalle, joka sisältää inhiboivia pitoisuuksia glu-5 koosianalogeja tai niiden seoksia. Maljoitetuista mutatoi-duista soluista valikoidaan elinkelpoiset pesäkkeet vastustuskyvyn suhteen glukoosianalogi-inhibltiolle. Näitä pesäkkeitä testataan sitten riboflaviinituotannon suhteen.

Glukoosianalogin pitoisuus on riippuvainen useista 10 seikoista, mukaanlukien analogin inhibitiovaikutus sekä viljelmän lähtöherkkyys ribof laviini tuotannon inhibitiolle analogin toimesta. Tyypillisesti suoritetaan minimi-inhi-bitiopitoisuuskoe sen minimipitoisuuden määrittämiseksi, jossa analogi inhiboi kasvun ei-mutatoidussa lähtöpopulaa-15 tiossa. Juuri tätä minimipitoisuutta käytetään yleensä valikointimenettelyssä; tulisi kuitenkin huomata, että korkeampiakin pitoisuuksia voidaan käyttää aina pitoisuuteen, jossa jopa vastustuskykyä omaavien mutanttien kasvu estyy. Kun glukoosianalogina on 2-deoksiglukoosi, sopivia 20 ovat pitoisuudet noin 700 pg/ml - noin 1500 pg/ml, edullisemmin noin 700 pg/ml - noin 1000 pg/ml, ja edullisimmin noin 700 pg/ml - noin 800 pg/ml.

Kanta D valittiin glukoosianalogivalikointlmenet-telyssä, jossa kanta C muodosti mutatoitavan ja valikoi-25 tavan lähtöpopulaation. Kanta D kykenee tuottamaan 1,58 g/litra riboflaviinia 7 päivässä 2 ml:n rullaputkimääri-tyksessä. Tätä kantaa käytettiin lähtöpopulaationa rauta-herkkyysvalikointimenettelyssä silmälläpitäen riboflavii-nia runsaasti tuottavien organismien valitsemista.

30 Kuten edellä esitetty on ilmoitettu, että pienet määrät rautaa inhiboivat riboflaviinituotantoa. Nyt on todettu, että toivottavaa olisi kehittää riboflaviinia tuottava mikro-organismikanta, jonka herkkyys rautainhibi-tiolle on alentunut, koska kyseistä kantaa voitaisiin vil- 10 97067 jellä korkean rautapitoisuuden käsittävässä kasvualustassa, joka ylläpitäisi lisääntynyttä solukasvua.

Ribof laviini tuottajien valitsemiseksi, joiden herkkyys raudalle on alentunut, mikro-organismiviljelmää muta-5 toidaan edellä esitettyyn tapaan. Saatu viljelmä levitetään kiinteälle kasvualustalle, joka sisältää assimiloituvia hiili-, typpilähteitä sekä epäorgaanisia aineksia korkeiden rautapitoisuuksien läsnäollessa. Esimerkiksi sopiva kasvualusta on YMG-kasvualusta (katso taulukko 1), 10 jota on täydennetty 2,23 %:lla glysiiniä. Mutatoituja soluja kasvatetaan tällä kasvualustalla riboflaviinituotantoon soveliaassa lämpötilassa. Mutantit, joiden vastustuskyky riboflaviinituotannon inhibitiolle raudan toimesta ei ole kasvanut, muodostavat valkeita tai kerman värisiä pe-15 säkkeitä, koska riboflaviinia ei muodostu runsaasti. Mu- tanttipesäkkeet, joiden vastustuskyky riboflaviinituotannon rautainhibitiolle on kasvanut, ovat kuitenkin keltaisia riboflaviinin läsnäolon johdosta. Tällaisia keltaisia pesäkkeitä voidaan testata riboflaviinia ylenmäärin tuot-20 tavina organismeina.

TAULUKKO 1 YMG-kasvualusta

Hiivauute 3 g/litra 25 Mallasuute 3 g/litra

Peptoni 5 g/litra

Hiililähde (2 %) 20 g/litra

Raudan pitoisuus valikointimenettelyssä riippuu 30 muun muassa lähtöpopulaation herkkyydestä raudan. Esimerkiksi jos rautaherkkyysoperaatio suoritettaisiin villityy-pin flarerita edustavalle lähtöpopulaatiolle, valikoin nissa käytettävä rautapitoisuus olisi alhaisempi kuin jos lähtöpopulaationa olisi flareri -kanta, joka jo olisi 35 valikoitu riboflaviinituotannon rautainhibitiolle alentu-

II

11 97067 neen herkkyyden suhteen. Kuten edellä esitetty glukoosi-analogi valikoinnin yhteydessä, rautapitoisuus valitaan tyypillisesti käyttäen minimi-inhibitiopitoisuuskoetta. Kyseisen keksinnön mukaan tehokkaita alentuneen rautaherk-5 kyyden suhteen valikoimiseksi ovat raudan moolipitoisuudet noin 5 μΜ - noin 50 μΜ, ja edullisemmin noin 10 μΜ - noin 30 μΜ, ja edullisimmin noin 16 μΜ - noin 20 μΜ.

Kanta E valittiin käyttäen rautaherkkyysoperaatio-ta, jossa lähtöpopulaationa oli kanta D. Kanta E kykenee 10 tuottamaan 1,70 g/litra riboflaviinia 7 päivässä 2 ml:n rullaputkimäärityksessä. Tätä kantaa käytettiin lähtöpopulaationa tyhjennetty kasvualusta -valikointimenettelyssä riboflaviinia runsaasti tuottavien organismien valitsemiseksi.

15 Riboflaviinia runsaasti tuottavat organismit voi daan valita esiin vastustuskyvyn perusteella kasvun inhi-bitiolle tyhjennetyllä kasvualustalla. Tiedetään, että suljetuissa biologisissa järjestelmissä, kuten laborato-riohiivaviljelmät, solukasvu ja biologisten tuotteiden 20 tuotanto lopulta pysähtyvät, jopa vaikka läsnä on ylenmäärin ravinteita. Vaikka syitä solukasvun ja riboflaviini-tuotannon pysähtymiseen flarerissa ei tunneta, arvellaan kolmen seikan ainakin osittain olevan vastuussa tästä ilmiöstä. Arvellaan, että useimmat organismit käyttävät 25 tehottomasti hyväkseen hivenravinteita näiden tietyn pitoisuuden alapuolella. Tämän vuoksi tällaisten hivenravinteiden tyhjetessä tiettyyn pitoisuuteen kasvu inhiboituu. Toinen mahdollinen syy on, että kasvu- ja riboflaviini-tuottovaiheissa sivutuotteina muodostuu aineita, jotka 30 inhiboivat lisäkasvua ja riboflaviinituotantoa. Kolmas mahdollinen syy on, että kasvualusta-ainesosien syötetyt tai ei-käytetyt korkeat pitoisuudet saattavat repressoida kasvua. Tämä valikointimenettely kohdistuu mikro-organismien valintaan, jotka kykenevät kasvamaan ja tuottamaan 35 riboflaviinia tyhjennetyllä kasvualustalla. Arvellaaan, 12 97067 että tällaiset mikro-organismit kykenevät tehokkaammin käyttämään hyväkseen hivenravinteita näiden alhaisissa tasoissa ja/tai ne omaavat vastustuskykyä inhiboiville tai repressoiville yhdisteille, joita muodostuu kasvu- ja ri-5 boflaviinituottovaiheissa. Tällaiset valikoidut organismit ovat arvokkaita, koska tietyllä lähtökasvualustalla ja tietyissä fermentointiolosuhteissa solukasvu ja ribofla-viinin tuotanto jatkuvat pidempään, jolloin riboflaviini-tuotannosta saadaan korkeampia saantoja.

10 Tyhjennetty kasvualusta -valikointimenettelyn mu kaan tyhjennetty kasvualusta valmistetaan kasvattamalla mikro-organismilähtöviljelmää, kunnes solukasvu pysähtyy tai tasaantuu, ja edullisemmin stationäärivaiheen loppupuolelle. Tyhjennetty kasvualusta valmistetaan edullisesti 15 viljelemällä samaa mikro-organismilajia, ja edullisesti samaa -kantaa, kuin joka on määrä valikoida valikointivai-heessa. Vaikka mikä tahansa mikro-organismi käyttää loppuun hivenravinteet ja tuottaa inhiboivia yhdisteitä, valikointi on tehokkain, jos valikoitavaan mutatoituun popu-20 laatioon kohdistetaan samat tyhjennetyn kasvualustan ympäristölliset paineet, kuin jotka saivat lähtöpopulaation lopettamaan kasvunsa. Jos lähtöpopulaatio poikkeaa muta-toidusta populaatiosta, lähtöpopulaation kasvua voivat rajoittaa hivenmineraalien loppuun kuluminen tai inhiboi-25 vien tai repressoivien yhdisteiden muodostuminen, jotka mahdollisesti eivät aiheuta painetta mutatoidussa populaatiossa.

Kun kasvu ja tuotteiden muodostus lähtöviljelmässä pysähtyvät, solut poistetaan viljelmästä tyhjennetyn kas-30 vualustan muodostamiseksi. Erotus voidaan suorittaa alan ammattilaisten tuntemin eri keinoin. Esimerkiksi solut € voidaan poistaa kasvualustasta sentrifugoimalla. Vaihtoehtoisesti solut voidaan poistaa ultrasuodattamalla.

Valikointikasvualusta valmistetaan käyttäen edellä 35 kuvatun mukaista tyhjennettyä kasvualustaa. Tyhjennettyyn il 13 97067 kasvualustaan voidaan lisätä hiili-, typpilähteitä ja epäorgaanisia ravinteita valikointikasvualustan muodostamiseksi tyhjennetylle kasvualustalle vastustuskykyä omaavien kantojen valikointia silmälläpitäen. Tyhjennettyyn kasvu-5 alustaan lisättävien ravinteiden määrä ja tyyppi voivat vaihdella. Esimerkiksi tyhjennettyyn kasvualustaan voidaan lisätä hiililähde ja typpilähde, kuten sakkaroosia ja gly-siiniä. Vaihtoehtoisesti tyhjennetty kasvualusta voidaan sekoittaa vaihtelevissa sekoitussuhteissa ravinnekasvu-10 alustaan kuten 4B-kasvualustaan (katso taulukko 2). Tyhjennetyn kasvualustan ja ravinnekasvualustan suhteelliset osuudet voidaan määrittää suorittamalla minimi-inhibitio-pitoisuuskoe ja käyttäen tyhjennetyn kasvualustan alhai-sinta tasoa, joka inhiboi kasvun ei-mutatoidussa populaa-15 tiossa.

TAULUKKO 2 4B-kasvualusta 20 KH2P04 0,5 g/1

MgS04 . 7H20 0,2 g/1 urea 1,84 g/1 sakkaroosi 60 g/1 D-biotiini 1 pg/l 25 H3B04 20 pg/l

MnS04 20 pg/l

ZnS04 140 yg/l

CuS04 20 pg/l

Na2Mo04 20 pg/l 30

Valikointimenettely suoritetaan mutatoimalla ribo- « flaviinia tuottavien mikro-organismien lähtöpopulaatiota edellä kuvattuun tapaan mutatoidun populaation muodostamiseksi. Mutatoitu populaatio viedään tyhjennetty kasvualus-35 ta -valikointialustaan. Tyypillisesti mikro-organismit, 97067 14 joiden vastustuskyky inhibitiolle tyhjennetyn kasvualustan toimesta el ole kasvanut, eivät kykene elämään valikoin-tikasvualustalla. Tyhjennetty kasvualusta -valikointialus-talle muodostuneet pesäkkeet ovat valikoituneet kasvaneen 5 vastustuskyvyn tyhjennetylle kasvualustalle omaavina. Tämän jälkeen valikoituja pesäkkeitä testataan riboflaviini-tuottokyvyn suhteen.

Kanta A valikoitiin tyhjennetty kasvualusta -vali-kointimenettelyllä käyttäen kantaa E lähtöpopulaationa. 10 Lähtöviljelmästä poistettiin sentrifugoimalla solut tyhjennetyn kasvualustan muodostamiseksi. Tyhjennetty kasvualusta steriloitiin ja mahdolliset jäljelle jääneet solut poistettiin suodattamalla 0,5 mikronin membraanisuodattimena. Valikointialusta muodostettiin lisäämällä sakkaroo-15 siä ja glysiiniä supernatanttiin. Kanta A kykenee tuottamaan 2,5 g/litra riboflaviinia rullaputkimäärityksessä. Suoritettiin tyhjennetty kasvualusta -lisävalikointimenet-tely käyttäen kantaa A lähtöpopulaationa.

Tästä toisesta tyhjennetty kasvualusta -valikoin-20 timenettelystä saatiin kanta F, joka kykenee tuottamaan 3,4 g/litra riboflaviinia 7 päivässä 2 ml:n rullaputkimäärityksessä. Tässä valikointimenettelyssä solut poistettiin tyhjennetystä kasvualustasta suodattamalla 0,5 mikronin membraanisuodattimella ja valikointialusta muodostettiin 25 50 %:ista tyhjennettyä kasvualustaa ja 50 %:ista 4B-kas- vualustaa. Kantaa F käytettiin lähtöpopulaationa valikointimenettelyssä, jossa käytettiin tubersidiinia valikoivana aineena.

Toinen riboflaviinia runsaasti tuottavia mikro-or-30 ganismeja valikoiva menettely valitsee mikro-organismit, • jotka omaavat vastustuskykyä kasvuinhibitiolle puriiniana- logien toimesta, ja erityisesti tubersidiinin toimesta. Tällaiset yhdisteet oletettavasti inhiboivat puriini-ai-neenvaihduntaa, ja koska puriinit ovat riboflaviinin pre-35 kursoreita, nämä yhdisteet häiritsevät riboflaviinituotan- tl „ 97067 lb toa. Monia tunnettuja puriinianalogeja on käytetty purii-ni-aineenvaihdunnan tutkimiseksi, jolloin kuitenkaan missään tunnetuista lähteistä ei ole ilmoitettu puriinianalo-gien menestyksekkäästä käytöstä riboflaviinia runsaasti 5 tuottavien mikro-organismien valikoinnissa. Edelleen missään tunnetuista lähteistä ei ilmoiteta käytetyn tubersi-diinia puriini-aineenvaihdunnan tutkimiseksi tai riboflaviinia runsaasti tuottavien mikro-organismien valikoimiseksi .

10 On määritetty, että sellaiset riboflaviinia tuot tavat mikro-organismikannat, jotka kasvavat ja tuottavat riboflaviinia tubersidiinin läsnäollessa, voivat omata aiempaa paremman riboflaviinin tuottokyvyn. Tällaiset tu-bersidiiniresistentit kannat joko kykenevät valmistamaan 15 korkeampia puriinitasoja tai kykenevät valmistamaan pu-riineja tehokkaammin. Tämän valikointimenettelyn mukaan riboflaviinia tuottavien mikro-organismien viljelmä muta-toidaan kuten edellä kuvattu. Eloonjäänyt populaatio mal-joitetaan kasvualustalle, joka sisältää assimiloituvia 20 hiili-, typpilähteitä sekä epäorgaanisia ainesosia tubersidiinin läsnäollessa. Maljoitetuista populaatioista valikoidaan elinkelpoiset pesäkkeet. Näitä pesäkkeitä testataan sitten riboflaviinituottokyvyn suhteen.

Kyseisessä valikointimenettelyssä käytettävä tuber-. 25 sidiinin pitoisuus riippuu eri seikoista, mukaanlukien lähtöpopulaation inhibitioherkkyys. Kuten edellä esitetty, sopiva pitoisuus voidaan määrittää suorittamalla minimi-inhibitiopitoisuuskoe, jossa määritetään alhaisin tuber-sidiinipitoisuus, joka inhiboi kasvun ei-mutatoidussa po-30 pulaatiossa. Tulee huomata, että korkeampia tubersidiini-pitoisuuksia voidaan käyttää aina pitoisuuteen, joka inhiboi jopa resistenttien mutanttien kasvun. Vaikka tubersidiinin pitoisuus voi vaihdella, se on valikointimenettelyssä tyypillisesti noin 85 pg/ml tubersidiinia - noin 35 200 pg/ml tubersidiinia, edullisemmin noin 85 pg/ml tuber- 1, 97067 sidiinia - noin 150 pg/ml tubersidiinia, ja edullisimmin noin 85 pg/ml tubersidiinia - noin 115 pg/ml tubersidiinia.

Kanta B valikoitiin käyttäen tubersidiinivalikoin-5 timenettelyä ja kantaa F lähtöpopulaationa. Kanta B kykenee tuottamaan 3,8 g/litra riboflaviinia 7 päivässä 2 ml:n rullaputkimäärityksessä. Myös kanta 6 valittiin tubersi-diinivalikointimenettelyllä käyttäen kantaa A lähtöpopulaationa. Kannan G riboflaviinituottokyky on 2,9 g/litra 7 10 päivässä 2 ml:n rullaputkimäärityksessä. Kantaa G käytettiin lähtöpopulaationa herkkyyteen ultraviolettivalolle perustuvassa valikointimenettelyssä.

Edellä kuvatuissa eri valikointimenetelmissä valitaan riboflaviinia runsaasti tuottavia mikro-organismeja 15 viemällä riboflaviinia tuottavien mikro-organismien muta-toi tu populaatio kasvualustaan, joka inhiboi riboflaviinin tuotantoa tavalla tai toisella. Mikro-organismien valitsemisen lisäksi, joiden riboflaviinin tuottonopeudet ovat korkeita, on toivottavaa saada riboflaviinia runsaasti 20 tuottava mikro-organismi, jonka ribof laviinin tuottonopeudet ovat stabiileja. Kyseisen keksinnön mukaiset spesifiset flareri -kannat on saatu solu-solufuusiomenettelyn tuotteesta, joka menettely suoritettiin ennen kannan C kehittämistä kuten kuvattu julkaisussa sarjan:o 811 234. 25 Solufuusiotuotteet omaavat kromosomien monikertakopioita, jolloin osia kromosomeista todennäköisesti menetetään ajan myötä geenien uudelleeenjärjestäytymisen seurauksena niiden runsaslukuisuudesta johtuen. Riboflaviinin runsaan tuotannon suhteen valikoidut solufuusiotuotteet omaavat 30 erittäin todennäköisesti monikertakopioita riboflaviini-tuotantogeeneistä. Kyky runsaaseen tuotantoon voidaan helposti menettää, jos tällaiset organismit ovat geneettisesti epästabiileja. Tämän vuoksi on toivottavaa valikoida riboflaviinia runsaasti tuottavia mikro-organismeja, joi- tl 17 97067 den kyky kromosomaaliseen uudelleenjärjestäytymiseen on alentunut.

Bakteereissa ja Saccharomyces cerevisiaessä on saatu mutantteja, joilta puuttuu kyky DNA:nsa uudelleenjär-5 jestämiseen. Clark et.ai., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 53 (1965) 451; Mazza et.ai., Microbiologlca 1 (1978) 111; Haynes et.ai., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981, s. 371. Joitain näitä mutanttityyppejä voidaan saada valikoimalla 10 kasvaneen herkkyyden mutageeneille, kuten ultraviolettivalolle, suhteen. Riboflaviinia runsaasti tuottavien mikro-organismikantojen, ja erityisesti herkkyyden ultraviolettivalolle suhteen valikoitujen solufuusiotuotteiden, ribo-flaviinituotannon stabiilisuusasteen arvellaan kasvaneen. 15 Herkkyys ultraviolettivalolle -valikointimenettely suoritetaan mutatoimalla mikro-organismilähtöpopulaatiota edellä kuvatun mukaisesti. Solulietteet maljoitetaan kasvualustalle, esimerkiksi YMG-alustalle, sellaisena laimennoksena, että maljaa kohden saadaan noin 100 - noin 400 20 pesäkettä, ja edullisemmin noin 150 - noin 200 pesäkettä maljaa kohden. Kun pesäkkeistä on tullut näkyviä, pesäke-kuviot siirtokopioidaan kahdesti tuoreille agar-maljapin-noille. Näkyviä ovat pesäkkeet, joiden halkaisija on noin 0,5 mm - noin 1,0 mm. Ensimmäinen siirtokopio altistetaan . 25 avoinpintaisena ultraviolettivalolle, jonka intensiteetti on tappavan alapuolella ei-mutatoiduille soluille. Sopiva ultraviolettivalotaso voidaan määrittää altistamalla ei-mutatoituja soluja käsittäviä pesäkkeitä vaihteleville ultraviolettivalo-annoksille ja määrittämällä taso, jolla 30 solut eivät kuole. Ei-mutatoidulle C^ flareri -viljelmälle ultraviolettivalon tappavan alapuolella oleva taso on noin 5 joulesta neliömetrille (J/m2) noin 20:een J/m2, ja edullisemmin noin 10 J/m2 - noin 15 J/m2. Säteilytettyä siir-tokopiota ja ei-säteilytettyä siirtokopiota inkuboidaan 35 pesäkkeiden muodostamiseksi. Säteilytettyä maljaa on pi- 18 97067 elettävä pimeässä, jotta näkyvä valo el takauta ultraviolettivalon vaikutusta. On selvitetty, että näkyvä valo kykenee korjaamaan säteilytyksen aiheuttamia geneettisiä vaurioita. Kun pesäkkeistä on tullut näkyviä, säteilytet-5 tyä siirtokopiota verrataan ei-säteilytettyyn maljaan, etsien ei-säteilytetystä maljasta pesäkkeet, joita ei esiinny säteilytetyllä maljapinnalla. Tällä tavalla tunnistetaan pesäkkeet, joiden herkkyys ultraviolettivalolle on kasvanut.

10 Kanta H valikoitiin herkkyys ultraviolettivalolle -valikointimenettelyllä käyttäen kantaa G lähtöpopulaationa. Kanta H kykenee tuottamaan riboflaviinia 3,1 g/litra 7 päivässä 2 ml:n rullaputkimäärityksessä.

Riboflaviinia voidaan tuottaa fermentoimalla kan-15 to ja A ja B ja muita mikro-organismeja, jotka on valittu edellä kuvatuilla menettelyillä. Alan ammattilaisille lienee ilmeistä, että tietyn kannan viljelmällä voidaan päästä korkeampiin riboflaviinisaantoihin, jos viljelmä on oleellisesti vapaa kontaminaatiosta mikro-organismeilla, 20 jotka ovat riboflaviinia vähemmän tuottavasta kannasta. Tällaisia biologisesti puhtaita viljelmiä voidaan valmistaa muodostamalla viljelmä halutun kannan yhdestä mikro-organismista.

Kantojen A ja B ja edellä kuvatuilla menettelyillä . 25 valikoitujen mikro-organismien riboflaviinituotanto voi vaihdella käytettäessä erilaisia fermentointialustoja ja -menettelyitä. Vaikka alalla toimivat tuntevat monia fer-mentointimenettelyitä, on kehitetty fermentointialusta ja -menettely, joilla tuotetaan tasaisesti korkeita kasvuno-30 peuksia ja runsasta riboflaviinin tuotantoa. Edullinen fermentointialusta riboflaviinin tuottamiseksi kannoilla A ja B on esitetty taulukossa 3.

Il 19 97067 TAULUKKO 3

Yhdiste Pitoisuus (g/1) 5 glukoosi 60,0 glysiini 4,60 urea 3,68 KH2P04 1,00

MgS04 0,72 10 (mg/1)

CoS04 · 7H20 11,8

CuS04 · 5H20 0 , 020 H3BO3 0,020 (NH4)6M07024 0,140 15 MNS04 0,020

ZnS04 · 7H20 17,0

FeS04 · 7H20 2,0 biotiini 0,0118 20 Kaikki kasvualusta-ainesosat glukoosia lukuunottamatta suodatussteriloidaan astiaan. Glukoosia (630 g/litra) ajj-toklavoidaan 30 minuutin ajan 121°C:ssa 1 kg:n/cm2 pain” eessa. Lähtöfermentointitilavuus 14 litran fermentorissa on 10,5 litraa. Kasvualustan pH säädetään arvoon 6,9 - 7,0 25 ennen siirrostusta.

Yleensä kasvualusta sisältää hiili-, typpilähteitä, fosfaatteja, sulfaatteja, magnesiumia, kaliumia, rautaa ja muita hivenmetalleja. Taulukossa 3 esitetyt pitoisuudet 30 edustavat ainesosien lähtöpitoisuuksia, eivätkä minimipitoisuuksia, joita on ylläpidettävä fermentoinnin kestäessä. Huomattakoon, että joitakin ainesosia ei voida aluksi ! tarjota riittävän korkeina määrinä, jotta ne riittäisivät koko fermentoinnin ajaksi. Tällaisten ainesosien osalta 35 fermentointialustaa on tarkkailtava ja minimipitoisuuksia ylläpidettävä.

20 97067

Vaikka glukoosi on mainittu edulliseksi hiililäh-teeksi kyseisessä fermentointialustassa, muutkin hiililäh-teet voivat soveltua aivan yhtä hyvin. Esimerkiksi kasvualustaan sopivat sakkaroosi ja fruktoosi. Lisäksi muut ei-5 sokerihiililähteet, kuten jotkut alkoholit, ovat soveliaita. Glukoosin lähtöpitoisuuden fermentointialustassa tulisi olla noin 45 g/litra - noin 60 g/litra, edullisemmin noin 50 g/litra - noin 60 g/litra, ja edullisimmin noin 55 g/litra - noin 60 g/litra.

10 Fermentointialusta sisältää myös glysiiniä. Glysii- ni on fermentointialustan kriittinen ainesosa tehokasta riboflaviinin tuotantoa silmälläpitäen. Vaikka glysiini on riboflaviinituotannolle välttämätön, liialliset glysiini-määrät inhiboivat flarerin kasvua. Korkeammissa pitoi-15 suuksissa kuin noin 7 g/litra solukasvu pysähtyy. Hyvin alhaisissa glysiinipitoisuuksissa, suuruusluokkaa noin 0,5 g/litra, glysiini tulee nopeasti käytetyksi loppuun fer-mentointialustasta. Glysiini hyväksyttävät lähtöpitoisuu-det ovat noin 2 g/litra - noin 6 g/litra, edullisemmin 20 noin 4 g/litra - noin 6 g/litra, ja edullisimmin noin 4 g/litra - noin 5 g/litra.

Fermentointialustaan viedään typpeä kasvun tukemiseksi ureaa lisäämällä. Urean lähtöpitoisuuden fermentointialustassa tulisi olla noin 2 g/litra - noin 9 g/litra, • 25 edullisemmin noin 3 g/litra - noin 7 g/litra, ja edulli simmin noin 3 g/litra - noin 5 g/litra. Muutkin typpiläh-teet soveltuvat käytettäviksi kyseisessä fermentointialustassa. Tällaisten muiden lähteiden optimipitoisuudet voidaan määrittää suorittamalla koefermentointeja käyttäen 30 typpilähteen vaihtelevia pitoisuuksia pitäen samalla muut muuttujat vakioina ja määrittäen korkein riboflaviinin tuotto.

Fosfaattia viedään fermentointialustaan lisäämällä yksiemäksistä kaliumfosfaattia (KH2P04). KH2P04:ää lisätään 35 aluksi fermentointialustaan pitoisuuksina noin 0,5 g/litra ii 21 97067 - noin 2,0 g/litra, edullisemmin noin 0,75 g/litra - noin 1,5 g/litra, ja edullisimmin noin 0,85 g/litra - noin 1,15 g/litra. Fosfaatin ohella KH2P04 tuottaa fermentointialus-taan kaliumia. Kalium on välttämätön kasvulle, jolloin 5 kuitenkin pitoisuuksina, jotka tuovat riittävästi fosfaattia, lisätty kalium ylittää huomattavasti viljelmän ravintotarpeet. Vaikka fosfaatti voidaan lisätä muissa muodoissa, kuten natriumfosfaattina, kaliumfosfaatti on edullinen, koska kaliumravintotarve tulee tyydytetyksi.

10 Fermentointialusta sisältää myös magnesiumsulfaat tia (MgS04) sulfaattilähteenä. Lähtöfermentointialusta sisältää tätä yhdistettä pitoisuuksina noin 0,5 g/litra -noin 1,0 g/litra, edullisemmin noin 0,6 g/litra - noin 0,8 g/litra, ja edullisimmin noin 0,65 g/litra - noin 0,75 15 g/litra. Vaikka fermentoitava viljelmä tarvitsee ravinnokseen magnesiumia, näissä pitoisuuksissa lisätty magnesium ylittää huomattavasti kyseisen tarpeen. Sulfaatti voidaan niinikään lisätä muissa yhdisteissä kuin magnesiumsulfaatti.

20 Fermentointialustaan sisältyy myös lukuisia hiven- mineraalilähteitä, mukaanlukien koboltti-, kupari-, boori-, molybdeeni-, mangaani-, sinkki- ja rautalähteitä. Fermentointialusta tarvitsee ravinnokseen kutakin näistä aineksista, ja hivenmineraalin sisältävien yhdisteiden . 25 lähtöpitoisuuksissa nämä tarpeet tulevat vaikeuksitta tyy dytetyiksi, jolloin kyseisiä aineita ei tarvitse lisätä fermentoinnin kestäessä. Vaikka monet hivenmineraalit lisätään sulfaatteina, näissä yhdisteissä lisätyn sulfaatin määrä ei ole merkitsevä fermentoinnin kaikenkaikkisille 30 sulfaattivaatimuksille.

Kobolttia lisätään fermentointialustaan koboltti-sulfaatin heptahydraatin (CoS04*7H20) muodossa. Tämän yhdisteen lähtöpitoisuus on noin 10 mg/litra - noin 13 mg/-litra, edullisemmin noin 11 mg/litra - noin 12 mg/litra, 35 ja edullisimmin noin 11,5 mg/litra - noin 12 mg/litra.

22 97067

Koboltilla on niinikään edullinen vaikutus sen kilpaillessa raudan kanssa raudan mahdollisen inhiboivan vaikutuksen riboflaviinisynteesiin vähentämiseksi.

Kuparia lisätään fermentointialustaan kuparisulfaa-5 tin pentahydraatin (CuS04*5H20) muodossa. Tätä yhdistettä viedään aluksi fermentointialustaan pitoisuuksina noin 0,015 mg/litra - noin 0,025 mg/litra, edullisemmin noin 0,017 mg/litra - noin 0,023 mg/litra, ja edullisimmin noin 0,018 mg/litra - noin 0,022 mg/litra. Kupari vaikuttaa 10 myös kilpailemalla raudan kanssa raudan mahdollisen inhiboivan vaikutuksen riboflaviinisynteesiin vähentämiseksi.

Sinkkiä lisätään fermentointialustaan sinkkisulfaatin heptahydraatin (ZnS04*7H20) muodossa. Tätä yhdistettä viedään aluksi fermentointialustaan pitoisuuksina noin 15 15 mg/litra - noin 20 mg/litra, edullisemmin noin 16 mg/litra - noin 19 mg/litra, ja edullisimmin noin 16 mg/litra -noin 18 mg/litra. Sinkki on myös raudan kilpailija vähentäen raudan mahdollista inhiboivaa vaikutusta riboflavii-nisynteesiin.

20 Fermentointialusta käsittää myös rautalähteen, rau tasulfaatin heptahydraattia (FeS04 · 7H20), fermentoinnin ravintovaatimuksien raudalle täyttämiseksi. Tämän yhdisteen lähtöpitoisuus fermentointialustassa on noin 1,5 mg/-litra - noin 4,0 mg/litra, edullisemmin noin 1,7 mg/litra 25 - noin 3,0 mg/litra, ja edullisimmin noin 1,9 mg/litra - noin 2,3 mg/litra.

Booria lisätään fermentointialustaan boorihapon (H3BO3) muodossa. Boorihappoa viedään fermentointilähtö- alustaan pitoisuuksina noin 0,015 mg/litra - noin 0,025 30 mg/litra, edullisemmin noin 0,017 mg/litra - noin 0,023 ·: mg/litra, ja edullisimmin noin 0,019 mg/litra - noin 0,021 • · mg/litra. Booria voidaan lisätä fermentointialustaan muissa muodoissa edellyttäen, että boori on muodossa, joka on biologisesti solujen käytettävissä, sekä ei-myrkylli-35 sessä muodossa.

il 23 97067

Molybdeenia lisätään alustaan ammoniummolybdaatin (VI) ( (NH4)6Mo7024) muodossa. Tätä yhdistettä lisätään pitoisuuksina noin 0,12 mg/litra - noin 0,16 mg/litra, edullisemmin noin 0,13 mg/litra - noin 0,15 mg/litra, ja 5 edullisimmin noin 0,135 mg/litra - noin 0,145 mg/litra.

Mangaania lisätään fermentointialustaan mangaani-sulfaatin (MnS04) muodossa. Tätä yhdistettä lisätään pitoisuutena noin 0,015 mg/litra - noin 0,025 mg/litra, edullisemmin noin 0,017 mg/litra - noin 0,023 mg/litra, 10 ja edullisimmin noin 0,019 mg/litra - noin 0,021 mg/litra.

Fermentointialusta sisältää myös biotiinia, joka on hiivan yleensä ottaen tarvitsema vitamiini. Tätä vitamiinia lisätään pitoisuuksina, jotka ylittävät noin 0,005 15 mg/litra, edullisesti > noin 0,009 mg/litra, ja edullisimmin > noin 0,0118 mg/litra.

Kuten edellä esitetty, fermentoinnin kestäessä jotkut kasvualustan ainesosista tulevat käytetyiksi loppuun. Edullisesti fermentointia aloitettaessa tällaisten aines-20 osien pitoisuudet ovat suhteellisen korkeat, jolloin kasvu on tuettu tietyn pituiseksi ajaksi ennen kuin lisäykset ovat tarpeellisia. Näiden ainesosien edullisia pitoisuuksia ylläpidetään koko fermentoinnin ajan suorittamalla lisäyksiä sitä mukaa kun tasot laskevat fermentoinnin 25 edistyessä. Ainesosien pitoisuustasoja fermentointialus-tassa voidaan tarkkailla esimerkiksi ottamalla fermentoin-tialustasta ajoittain näytteitä, joista määritetään kyseiset pitoisuudet. Vaihtoehtoisesti sitten kun vakiofermen-tointimenettely on kehitetty, lisäykset voidaan suorittaa 30 määräväliäjoin, jotka vastaavat tunnettuja tasoja tiettyi- ·. nä ajankohtina koko fermentoinnin kattaen. Kuten alalla toimivat huomannevat, ravinteiden kulutusnopeus kasvaa fermentoinnin aikana solutiheyden kasvualustassa kohotessa.

24 97067

Fermentoinnin aikana tarkkaillaan glukoosin, gly-siinin, urean ja fosfaatin pitoisuuksia. Kasvualustan glu-koosipitoisuutta tarkkaillaan ja se pidetään lukemassa noin 20 g/litra - noin 60 g/litra, edullisemmin noin 20 5 g/litra - noin 40 g/litra, ja edullisimmin noin 30 g/litra. Nämä glukoosipitoisuudet saadaan säilymään fermentoin-tialustassa syöttämällä konsentroitua glukoosiliuosta, jossa pitoisuus on noin 600 g/litra.

Samoin glysiinin pitoisuutta fermentointialustassa 10 tarkkaillaan ja se pidetään arvossa noin 1 g/litra - noin 7 g/litra, edullisemmin noin 2 g/litra - noin 5 g/litra, ja edullisimmin noin 3 g/litra. Glysiinipitoisuutta voidaan säätää syöttämällä konsentroitua glysiiniliuosta, jossa pitoisuus on noin 200 g/litra.

15 Myös urean pitoisuutta fermentointialustassa tark kaillaan ja se pidetään pitoisuuksissa noin 1 g/litra -noin 9 g/litra, edullisemmin noin 2 g/litra - noin 5 g/-litra, ja edullisimmin pitoisuudessa noin 3 g/litra. Fer-mentointialustan ureapitoisuudet pidetään näissä rajoissa 20 syöttämällä konsentroitua urealiuosta, jossa pitoisuus on noin 100 g/litra.

Fosfaatti- (P04-) pitoisuus fermentointialustassa pidetään arvossa noin 0,03 g/litra - noin 0,3 g/litra, edullisemmin noin 0,05 g/litra - noin 0,2 g/litra, ja 25 edullisimmin noin 0,1 g/litra. Nämä pitoisuudet säilyte tään syöttämällä konsentroitua kaliumfosfaattiliuosta, jossa pitoisuus on noin 15,75 g/litra. Sen lisäksi, että fosfaattipitoisuutta ylläpidetään lisäämällä kaliumfosfaattia, myös sulfaattipitoisuuksia ylläpidetään lisäämäl-30 lä magnesiumsulfaattia fermentointialustaan, jolloin ka- ·· liumfosfaattisyöttöliuokseen sisällytetään magnesiumsul- • · faattia. Magnesiumsulfaatin pitoisuus syöttöliuoksessa on noin 11,37 g/litra.

Huomattakoon, että glukoosi-, glysiini-, urea-, 35 fosfaatti- ja sulfaattisyöttöliuoksia lisätään fermentoin-

II

25 97067 tialustaan tiettyihin näiden yhdisteiden pitoisuuksiin pääsemiseksi fermentointialustassa tai kyseisten pitoisuuksien ylläpitämiseksi. Täten edellä esitetyt lisättävien syöttöliuoksien pitoisuudet eivät ole kyseiselle kek-5 sinnölle kriittisiä tai sitä rajoittavia.

Kyseisen keksinnön mukaisessa fermentointimenette-lyssä valmistetaan fermentointialusta edellä kuvatun mukaisesti. Tähän kasvualustaan siirrostetaan viljelmänä riboflaviinia tuottavia mikro-organismeja, ja erityisesti 10 flareri -kantoja. Onnistuneeseen fermentointiin pääse miseksi siirrosteen tulee muodostaa minimisiirrostetiheys. Ollaan hyvin perillä siitä, että fermentointioperaatiot edellyttävät tiettyä lähtöminimisiirrostetiheyttä, jotta solukasvu käynnistyisi. Vaikkakaan minimisiirrostetiheyttä 15 kyseiselle menetelmälle ei ole ole määritetty, on määritetty, että menestyksekkäisiin fermentointeihin voidaan päästä lähtösiirrosteen tuottaessa optisen tiheyden noin 0,06 620 nm:n aallonpituudella (1 cm:n kyvetti). Korkeampia lähtötiheyksiä tuottavat siirrosteet ovat hyväksyttä-20 viä ja lyhentävät solukasvua edeltävää lag-vaihetta. Läh-tösiirrostetiheyksissä < noin 0,06 solukasvun käynnistymistä edeltävä lag-aika pitenee, jolloin lopulta joudutaan minimisiirrostetiheyteen, joka ei ylläpidä kasvua.

Sitten kun siirrostus fermentointialustaan on suo-·, 25 ritettu, fermentoinnin annetaan edetä ja glukoosin, gly- siinin, urean, fosfaatin ja sulfaatin pitoisuuksia tarkkaillaan pitäen ne edellä esitetun mukaisissa pitoisuuksissa. Koko fermentoinnin ajan kasvualustan lämpötilan tulisi olla noin 29° - noin 31°C, edullisemmin noin 29,5° -30 noin 30,5°C, ja edullisimmin noin 29,9° - noin 30,1°C.

Liuenneen hapen määrä fermentointialustassa tulee pitää mikro-organismien käyttöön riittävästi happea tuottavien tasojen yläpuolella. Kasvualustan sisältämää liuenneen hapen määrää voidaan säätää ilmastamalla ja sekoit-35 tamalla. Kasvualustan liuenneen hapen määrä pidetään edul- 26 97067 lisesti > noin 20 %:n kyllästysasteessa, ja edullisemmin > noin 40 %:n kyllästysasteessa.

Kasvualustan pH säädetään ennen siirrostusta. Kasvualustan pH:ta voidaan säätää lisäämällä erilaisia alalla 5 tunnettuja yhdisteitä, kuten KOH, NaOH. Tämä lähtö-pH voi olla noin 6 - noin 8, edullisemmin noin 6,5 - noin 7,5, ja edullisimmin noin 6,9 - 7,0. On todettu, että fermentoin-nin aikana kasvualustan pH laskee näyttävästi suunnilleen samaan aikaan kuin tapahtuu voimakas lisääntyminen solu-10 kasvussa ja riboflaviinituotannossa. Nämä muutokset ajoittuvat niinikään samanaikaisiksi ensimmäisen lisäystarpeen fosfaatille, glukoosille, urealle ja glysiinille kanssa. Tyypillisesti tämä kasvualustan muuttuminen happamaksi todetaan ajankohtana noin 35 tuntia - noin 55 tuntia, tyy-15 pillisemmin noin 40 tuntia - noin 50 tuntia, ja tyypillisimmin noin 42 tuntia - noin 48 tuntia.

Tyypillisesti kasvualustan pH laskee niinkin alas kuin 3,5, ja tyypillisemmin noin 3,9. Fermentointioperaa-tion jäljellä olevana aikana pH pysyy tyypillisesti arvos-20 sa noin 3,9 - noin 6,0, tyypillisemmin noin 3,9 - noin 5,5, ja tyypillisimmin noin 3,9 - noin 5,1. Sitten kasvualustan pH tyypillisesti kohoaa takaisin arvoon noin 5,0 -noin 7,0, ja tyypillisemmin arvoon noin 6,0 - noin 7,0. Tämän pH-arvon kohoamisen tapahtuessa solukasvu yleensä 25 pysähtyy.

Seuraavat kokeelliset tulokset tarjotaan havainnol-listamismielessä, eikä niiden tarkoituksena ole rajoittaa keksinnön kattamaa aluetta.

Esimerkki I

30 Rullaputkiriboflaviinimääritys \ Kanta B -pesäke siirrostettiin koeputkeen, jossa oli 2,5 ml täydennettyä määriteltyä kasvualustaa (katso taulukko 1-Λ), ja sen annettiin kasvaa 30°C:ssa kohtalaisesti sekoittaen 4 päivän ajan. Koeputkiin, joissa oli 2 35 ml täydennettyä määriteltyä kasvualustaa, siirrostettiin I! 27 97067 0,02 ml kasvanutta viljelmää ja inkuboitiin 30°C:ssa kohtalaisesti sekoittaen 7 päivän ajan. Viljelmiä laimennettiin tekijällä 500 ja kuumennettiin 60° - 70°C:ssa 40 minuutin ajan riboflaviinikiteiden liuottamiseksi. Liuenneen 5 liuoksen absorbanssi 445 nm:n aallonpituudella oli 0,245. Tämä arvo kerrottiin 500:11a laimennoksen korjaamiseksi ja kerrottiin 31,3:11a, jolloin saatiin riboflaviinipitoisuu-deksi 3,8 x 103 mg/litra eli 3,8 g/litra.

10 TAULUKKO I-A

Täydennetty määritelty kasvualusta 4B

glysiini 0,23 %

CoCl2 1 pg/ml 15 ZnCl2 10 pg/ml

FeCl3*6H20 0 , 2 pg/ml YMG-kasvualusta 10 % sakkaroosi 6 % 1

Esimerkki II

Kannan valinta

Kantaa C mutatoitiin NTG:llä NTG-pitoisuuden ollessa 0,10 mg/ml 60 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Nämä mutatoidut solut otettiin talteen, pestiin ja lietettiin . 25 fysiologiseen suolaliuokseen. Mutatoidut solut maljoitet- tiin täydennetylle määritellylle kasvualustalle, joka sisälsi 750 pg/ml 2-deoksiglukoosia. 10 päivän kuluttua identifioitiin 125 resistenttien mutanttien muodostamaa pesäkettä, ja niiden riboflaviinituottoa testattiin edellä 30 kuvatulla rullaputkiriboflaviinimäärityksellä. Kanta D oli tuotteliain mutantti, ja sen riboflaviinituottokyky oli 1,58 g/litra/7 päivää.

Kantaa D mutatoitiin NTG:llä edellä kuvattuun tapaan NTG-pitoisuuden ollessa 0,10 mg/ml 60 minuutin ajan 35 huoneen lämpötilassa. Käsitellyt solut otettiin talteen, 28 97067 pestiin ja lietettiin vastaaviin tilavuuksiin fysiologista suolaliuosta. Tätä viljelmää maljoitettiin täydennetylle määritellylle kasvualustalle, joka sisälsi 2,23 % glysii-niä riittäväksi substraatiksi riboflaviinisynteesille sekä 5 FeCl3 · 6H20: ta pitoisuuden 5 pg/ml. 10 päivän inkuboinnin 30°C:ssa jälkeen identifioitiin 25 resistenttien mutanttien muodostamaa pesäkettä ja niiden riboflaviinisynteesiä testattiin edellä kuvatulla rullaputkiriboflaviinimäärityk-sellä. Eniten riboflaviinia tuottava kanta oli mutantti-10 kanta E, ja sen riboflaviinin tuottokyky oli 1,70 g/lit-ra/7 päivää.

Kantaa E mutatoitiin NTG:llä NTG-pitoisuuden ollessa 0,10 mg/ml 60 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Käsitellyt solut otettiin talteen, pestiin ja lietettiin 15 vastaaviin tilavuuksiin fysiologista suolaliuosta. Valmis tettiin tyhjennetty kasvualusta kasvattamalla kantaa E täydennetyssä määritellyssä kasvualustassa 30°C:n lämpötilassa samalla sekoittaen 3 viikon ajan. Solut poistettiin tästä viljelmästä sentrifugoimalla ja suodattamalla 0,5 20 mikronin membraanisuodattimella. Supernatanttiin lisättiin sakkaroosia (6 %), glysiiniä (0,23 %) ja agar-agaria (2 %). Mutanttikanta E -viljelmä maljoitettiin tälle kasvualustalle ja inkuboitiin 30°C:ssa 10 päivän ajan. Väriltään keltaisiksi identifioitiin 35 pesäkettä ja niiden 25 riboflaviinituottoa testattiin rullaputkiriboflaviinimää- rityksellä. Tällä valikointimenettelyllä saatiin kanta A ja sen riboflaviinituottokyky on 2,5 g/litra/7 päivää.

Kantaa A mutatoitiin NTG:llä tämän pitoisuuden ollessa 0,10 mg/ml 60 minuutin inkuboinnissa huoneen lämpö-30 tilassa. Käsitellyt solut otettiin talteen, pestiin ja " lietettiin vastaaviin tilavuuksiin fysiologista suola liuosta.

Valmistettiin tyhjennetty kasvualusta kasvattamalla ei-mutatoidun kannan A soluja taulukossa 3 kuvatun mukai-35 sessa kasvualustassa 10 päivän ajan 450 litran fermento-

II

29 97067 rissa 30°C:ssa samalla sekoittaen. Solut poistettiin tästä viljelmästä ultrasuodattamalla. Valmistettiin kiinteä va-likointikasvualusta, jossa 50 % nestetilavuudesta muodosti tyhjennetty kasvualusta, josta solut oli poistettu, ja 5 toiset 50 % nestetilavuudesta oli vettä. Mutatoidut kannan A solut maljoitettiin tälle kasvualustalle ja inkuboitiin 10 päivän ajan 30°C:ssa. Identifioitiin 60 resistenttien mutanttien muodostamaa pesäkettä ja niiden riboflaviini-tuotto testattiin. Tämän menettelyn mukaan eniten ribofla-10 viiniä tuotti kanta F, jonka riboflaviinituottokyky oli 3,4 g/litra/7 päivää rullaputkiriboflaviinimäärityksessä.

Kantaa F mutatoitiin NTGtllä tämän pitoisuuden ollessa 0,10 mg/ml 60 minuutin inkuboinnissa huoneen lämpötilassa. Käsitellyt solut otettiin talteen, pestiin ja 15 lietettiin fysiologiseen suolaliuokseen. Näitä soluja valikoitiin täydennetyllä määritellyllä kasvualustalla, joka sisälsi 100 pg/ml tubersidiinia. 10 päivän inkuboinnin 30°C:ssa jälkeen identifioitiin 25 elinkelpoisten kantojen muodostamaa pesäkettä, joiden riboflaviinituotto testat-20 tiin. Flavinogeenisin oli kanta B, ja sen riboflaviini-tuottokyky oli 3,8 g/litra/7 päivää.

Kantaa A käytettiin lähtöpopulaationa myös toisessa valikointioperaatiossa. Kannan A viljelmää mutatoitiin NTG:llä tämän pitoisuuden ollessa 0,10 mg/ml 60 minuutin •( 25 inkuboinnissa huoneen lämpötilassa. Käsitellyt solut otet tiin talteen, pestiin ja lietettiin fysiologiseen suolaliuokseen. Tähän viljelmään kohdistettiin tubersidiiniva-linta maljoittamalla mutatoidut solut täydennetylle määritellylle kasvualustalle, joka sisälsi 100 pg/ml tubersi-30 diinia. 10 päivän inkuboinnin 30°C:ssa jälkeen valittiin 20 • elinkelpoista pesäkettä, joiden riboflaviinituotto testat tiin. Flavinogeenisin oli kanta G, joka tuotti 2,9 g/litra/7 päivää.

Kantaa G käytettiin lähtöpopulaationa herkkyys ult-35 raviolettivalolle -valikointioperaatiossa. Kantaa G muta- 30 97067 toitiin NTG:llä tämän pitoisuuden ollessa 0,10 mg/ml 60 minuutin inkuboinnissa huoneen lämpötilassa. Käsitellyt solut otettiin talteen, pestiin ja lietettiin fysiologiseen suolaliuokseen. Tätä solulietettä laimennettiin teki-5 jällä 1:104, jolloin solupitoisuudeksi tuli 1000 solua/ml.

0,1 ml solulietettä maljoitettiin YMG-kasvualustalle ja inkuboitiin 3 päivän ajan 30°C:ssa. Tässä vaiheessa pesäkkeet olivat näkyviä ja ne siirtokopioitiin kahdesti tuoreille agar-maljapinnoille. Ensimmäinen siirtokopio altis-10 tettiin pinnaltaan avoimena 17 J:lle/m2 ultraviolettivaloa. Säteilytettyä maljaa inkuboitiin pimeässä ei-säteilytetyn siirtokopiomaljan ohella 30°C:ssa 4 päivän ajan pesäkkeiden muodostamiseksi. Säteilytettyjä ja ei-säteilytettyjä maljoja verrattiin ei-elinkelpoisten pesäkkeiden tunnis-15 tamiseksi, jotka osoittaisivat ultraviolettivalolle herkät mutantit. Nämä mutantit identifioitiin ei-säteilytetyltä maljapinnalta ja määritettiin niiden riboflaviinituotto. Tällä menetelmällä identifioitiin 14 pesäkettä ja tuotteliain mutantti oli kanta H, joka kykenee tuottamaan 3,1 20 g/litra riboflaviinia 7 päivässä.

Esimerkki III

Riboflaviinituotannon koeajo n:o 1 suoritettiin 14 litran fermentorissa. Tässä ajossa käytetyn fermentointi- alustan koostumus on esitetty taulukossa 3. Kaikki kasvu- . 25 alusta-ainesosat glukoosia lukuunottamatta suodatussteri- • · loitiin fermentointitankkiin ennen lisäämistä kasvualustan loppuosaan. Glukoosia autoklavoitiin 30 minuutin ajan 121°C:ssa 1 kg:n/cm2 paineessa. Kasvualustan pH säädettiin arvoon 6,9 - 7,0 ennen siirrostuksen suorittamista. Fer-30 mentointitankkiin siirrostettiin kannan A viljelmää optiseen lähtötiheyteen 0,06 620 nm:n aallonpituudella (1 cm:n kyvetti).

Koeajo n:o 1 kesti 240 tuntia. Tänä aikana tarkkailtiin optista tiheyttä 620 nm:n aallonpituudella, ribo-35 flaviinia, pH:ta, lämpötilaa, glysiiniä, ureaa, fosfaattia 31 97067

Ja glukoosia. Tulokset tästä fermentoinnista on esitetty taulukoissa III-A ja III-B. Rlboflavllnln loppupitoisuuteen 15,93 g/litra päästiin 240 tunnissa.

5 TAULUKKO ΙΙΙ-Ά

Optinen Ribofla- Lämpö-

Aika tiheys viini tila (tuntia) (620 nm) (g/1) pH (°C) 0 0,06 0,000 6,92 30 10 26,5 1,41 0,018 6,01 30 45.5 25,25 0,465 3,97 29,7 75.5 105,0 3,25 4,4 29,7 103.0 129,0 6,4 4,7 29,6 127.0 121,0 8,01 5,06 29,6 15 143,5 122,0 9,17 5,02 29,5 174.5 109,0 10,94 4,74 29,7 190.5 142,0 12,96 4,35 29,6 204.0 152,0 13,62 4,25 29,7 240.0 169 15,93 3,92 29,4 20

TAULUKKO III-B

Aika Glysiini Urea Fosfaatti Glukoosi (tuntia) (620 nm) (g/1) (g/1) (g/1) 0 4,43 4,52 0,650 74,8 25 32 4,40 4,99 0,587 80,3 45.5 4,13 3,84 0,358 57,2 56 3,06 3,30 0,087 29,9 70 4,00 3,62 0,298 32,1 85 4,44 3,48 0,276 31,2 30 103 4,09 2,96 0,268 40,3 127.5 4,00 3,77 0,330 41,9 143.5 4,32 1,31 0,183 46,7 167.5 3,15 5,14 0,337 50,9 190.5 2,70 5,93 0,128 33,4 35 215,5 2,40 5,86 0,101 35,3 240.0 2,0 6,51 0,175 34,3 32 97067

Esimerkki IV

Ribof laviini tuotannon koeajo n: o 2 suoritettiin 450 litran fermentointitankissa ja se kesti 200 tuntia. Fer-mentointialusta ja siirroste valmistettiin samalla tavalla 5 kuin esimerkissä III. Tulokset tästä koeajosta on esitetty taulukossa IV-A. Riboflaviinin loppupitoisuuteen 21,0 g/-litra päästiin 200 tunnissa koeajossa n:o 2.

TAULUKKO IV-A

10

Aika Optinen Ribo- Lämpö- Gly- Glu- (tun- tiheys f laviini tila siini Urea koosi tia) (620 nm) (g/1) pH (eC) (g/1) (g/1) (g/l) 0 0,0 0,0 6,95 30 5,2 4,2 68,8 15 40 25,0 0,0 4,60 30 4,0 2,4 47,8 60 50,0 2,5 5,40 30 6,8 3,4 32,2 80 150 6,0 5,2 30 6,7 4,4 43,0 100 175 9,0 5,9 30 7,5 6,5 47,9 140 225 15,0 5,0 30 7,0 7,7 44,5 20 200 210 21,0 5,3 30 7,0 6,3 47,2

Esimerkki V

Riboflaviinituotannon koeajo n:o 3 suoritettiin 450 litran fermentointitankissa ja se kesti 200 tuntia. Fer- 25 mentointialusta ja siirroste valmistettiin samalla tavalla «· ** * * kuin esimerkissä III. Tulokset tästä koeajosta on esitetty taulukossa V-A. Riboflaviinin loppupitoisuuteen 16,0 g/-litra päästiin 200 tunnissa tässä koeajossa.

II

33 97067

TAULUKKO V-A

Optinen Ribo- Lämpö-

Aika tiheys flaviini tila 5 (tuntia) (620 nm) (g/1) pH (eC) 0 0,06 0,0 6,95 30 40 10,0 0,0 5,00 30 60 25,0 1,0 4,1 30 80 75,0 3,0 4,7 30 10 100 110 6,0 5,2 30 140 150 10,0 5,0 30 200 180 16,0 * 4,4 30 TAULUKKO V-A (jatkuu) 15

Aika Gly- Fos- Glu- (tun- siini Urea faati koosi tia) (g/1) (g/1) (g/1) (g/1) 0 - 4,2 0,630 47,6 20 40 - 4,3 0,620 42,4 60 - 3,7 0,400 56,6 80 4,5 2,8 0,070 35,4 100 5,0 1,7 0,180 41,8 140 7,4 3,3 0,050 34,8 25 200 0,7 5,7 0,100 44,2 ·

Esimerkki VI

Suoritettiin sarja koeajoja pitäen kaikki olosuhteet vakiona lukuunottamatta FeS04*7H20-pitoisuutta, jota 30 vaihdeltiin pitoisuuksissa 0 mg/litra, 1 mg/litra, 2 mg/-litra ja 3 mg/litra. Fermentoinnit suoritettiin 150 litran pilot-mittakaavatankeissa käyttäen taulukon 3 mukaista fermentointialustaa. Lisäksi fermentointialustaan lisättiin seuraavia koostumuksia.

35 • 34 97067

Koostumus Pitoisuus (g/litra)

Hiivauute 1,04

Mallasuute 1,04

Peptoni 1,73 5

Fermentointiajoissa käytettiin kantaa A. Solukasvua ja riboflaviinituotantoa tarkkailtiin fermentoinnin aikana. Taulukossa VI-A on esitetty tulokset solukasvusta kyseisissä neljässä fermentoinnissa. Taulukossa VI-B esite-10 tään tulokset riboflaviinituotannolle kyseisissä neljässä fermentoinnissa. Taulukossa VI-C esitetään riboflaviini-tuotannon ja solukasvun väliset päätössuhteet kullekin näistä neljästä fermentoinnista. Kuten nähdään taulukosta VI-C, korkeammissa FeS04 »7H20-pitoisuuksissa solua kohden 15 muodostuneen riboflaviinin määrä kasvaa. Kun huomattaviin lisäyksiin tässä suhteessa päästään pitoisuuksissa 1 mg/-litra ja 2 mg/litra, kasvu pitoisuudesta 2 mg/litra pitoisuuteen 3 mg/litra on häviävän pieni.

20 TAULUKKO VI-A

Solu- Solu- Solu- Solumassa massa massa massa

(g/D (g/D (g/D (g/D

25 Aika (FeS04· (FeS04· (FeS04· (FeS04· " (tun- 7Ha0) 7H20) 7H20) 7H20) tia) =0) =1 mg/1) = 2 mg/1) =3 mg/1) 38 - 4,8 5,3 62 - - 10,1 13,2 30 86 4,8 9,6 14,8 18,9 110 9,9 14,0 20,7 22,4 134 11,2 21,9 23,3 26 164 15,9 23,2 26,5 28,3 35

II

35 97067

TAULUKKO VI-B

Ribo- Ribo- Ribo- Ribo- flaviini flaviini flaviini f laviini

(g/D (g/D (g/D (g/D

5 Aika (FeS04· (FeS04· (FeS04· (FeS04· (tun- 7H20) 7H20) 7H20) 7H20) tia) =0) =1 mg/1) = 2 mg/1) =3 mg/1) 86 1,37 2,54 4,12 5,26 110 2,19 4,05 5,72 7,13 10 134 2,13 5,03 8,10 9,32 164 3,19 6,52 9,34 10,20

TAULUKKO VI-C

Kannan A yksikkökasvua kohden muodostunut ribofla- 15 viini

FeS04 · 7H20 (mg/litra) 0 12 3 riboflaviini (g/litra) solupaino (g/litra) 0,20 0,28 0,35 0,36 20

Esimerkki VII

Suoritettiin sarja koeajoja tyhjennetyn kasvualustan vaikutuksen kantaan A määrittämiseksi. Fermentoinnit 25 suoritettiin 90 tuntia kestävinä 14 litran fermentoreissa :* käyttäen taulukon 3 mukaista fermentointialustaa. Kaikki olosuhteet olivat identtiset lukuunottamatta, että kussakin koeajoista tyhjennetty kasvualusta muodosti eri osuuden fermentointialustanesteestä. Ensimmäinen koeajo ei 30 käsittänyt lainkaan tyhjennettyä kasvualustaa, toinen käsitti 20 %, kolmas 40 %, neljäs 50 % ja viides 80 %. Ribof laviini tuotanto kussakin koeajossa eri ajankohtina fer-mentointiajon aikana on esitetty alla taulukossa VII-A.

36 97067

TAULUKKO VII-A

Tyhjennetyn kasvualustan vaikutus riboflaviinituotantoon (g/litra) 0 % 20 % 40 % 60 % 80 % 5 Tuntia t.k.a:aa t.k.araa t.k.araa t.k.araa t.k.araa 42 0,5 1,1 0,6 0,3 0,0 58 1,3 2,4 1,4 0,6 0,4 74 3,1 4,5 2,6 1,2 0,7 89 4,9 6,1 4,6 2,6 1,9 10

Pitoisuudessa 20 % tyhjennettyä kasvualustaa havaitaan aluksi riboflaviinituotannon stimuloituminen. Kuitenkin tyhjennetyn kasvualustan pitoisuuden kasvaessa ribo-flaviinituotanto inhiboituu yhä enemmän.

15 Vaikka kyseisen keksinnön eri suoritusmuotoja on kuvattu yksityiskohtaisesti, on ilmeistä, että alan ammattilaisten mieleen juolahtaa näiden suoritusmuotojen modifikaatioita ja adaptaatioita. Halutaan kuitenkin yksikäsitteisesti ymmärrettävän, että tällaiset modifikaatiot ja 20 adaptaatiot kuuluvat kyseisen keksinnön kattamaan a-lueeseen sellaisena, kuin se esitetään seuraavissa patenttivaatimuksissa .

• · 1 «

It

Claims (9)

37 97067

1. Candida famata -kanta, tunnettu siitä, että sen ATCC-talletusnumero on 20849, Ja sen jälkeläiset.

2. Candida famata -kanta, tunnettu siitä, että sen ATCC-talletusnumero on 20850, ja sen jälkeläiset.

3. Menetelmä mikro-organismin valikoimiseksi, joka pystyy tuottamaan suuria määriä riboflaviinia ja joka on Candida famata -kanta, kuten patenttivaatimuksen 1 tai 2 10 mukainen kanta, tunnettu siitä, että; a) ensimmäisten mikro-organismien muodostamaa populaatiota kasvatetaan vesipitoisessa ravinnekasvualustassa, kunnes solukasvu pysähtyy; b) ensimmäiset mikro-organismit poistetaan vesipi-15 toisesta ravinnekasvualustasta tyhjennetyn kasvualustan muodostamiseksi; c) muodostetaan valikointikasvualusta, joka sisältää tyhjennettyä kasvualustaa; d) jälkimmäisten mikro-organismien muodostamaa po-20 pulaatiota mutatoidaan; e) jälkimmäisten mikro-organismien muodostama muta-toi tu populaatio viedään vallkointialustaan; ja f) valitaan jälkimmäisten mikro-organismien muodostamasta mutatoidusta populaatiosta aiempaa parempi mikro- 25 organismi, joka kykenee kasvamaan valikointialustalla.

4. Menetelmä riboflaviinin tuottamiseksi viljelemällä patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisia riboflaviinia tuottavia lajin Candida famata -hiivakantoja fermentoin-tialustassa, tunnettu siitä, että: 30 a) hiivakantoja siirrostetaan fermentointlelustaan, joka käsittää rautalähteen, joka tuottaa rautapitoisuuden noin 5,4 μΜ - 15 μΜ, sekä assimiloituvia hiili-, typpiläh-teitä sekä hivenravinteita, jolloin käytetään hiivakantoja, joiden ATCC-talletusnumerot ovat 20849 tai 20850, tai 35 näiden jälkeläisiä ja jolloin mikro-organismit tuottavat 1 , · 38 97067 ainakin noin 10 grammaa riboflaviinia litraa kohden fer-mentointialustaa kuudessa (6) päivässä; b) fermentointialustassa ylläpidetään ravinnepitol-suuksia, jotka riittävät tukemaan solukasvua ja ribofla- 5 viinin tuotantoa; ja c) riboflaviini otetaan talteen fermentolntialus- tasta.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentointialusta käsittää edel- 10 leen glysiiniä pitoisuutena noin 1-7 g/litra.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ylläpitovaihetta jatketaan ainakin noin kuuden (6) päivän ajan ja että muodostuu ainakin noin 10 g/litra riboflaviinia.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että fermentointialusta käsittää lisäksi: a) glysiiniä pitoisuutena noin 1-7 g/litra; b) fosfaattilähteen; 20 c) sulfaattilähteen; ja d) koboltti-, kupari-, boori-, molybdeeni-, mangaani-, sinkki-, kalium- ja magnesiumlähteen.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiililähde käsittää glukoosia, typ- 25 pilähde käsittää ureaa, fosfaatti- ja kaliumlähteet käsittävät KH2P04:a, magnesium- ja sulfaattilähteet käsittävät MgS04:a, kobolttilähde käsittää CoS04:a ja kuparilähde käsittää CuS04:a.

9. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä ribo- 30 flaviinia tuottavan mikro-organismin valitsemiseksi, : tunnettu siitä, että a) ensimmäisen mikro-organismilajin muodostamaa populaatiota kasvatetaan vesipitoisessa ravinnekasvualus-tassa, kunnes solukasvu pysähtyy; 35 b) ensimmäinen mikro-organismilaji poistetaan vesi pitoisesta ravinnekasvualustasta tyhjennetyn kasvualustan •. muodostamiseksi; 39 97067 c) muodostetaan valikointikasvualusta, joka vali-kointialusta käsittää tyhjennettyä kasvualustaa minimi-inhibitiopitoisuuden toiselle mikro-organismilajille, joka kykenee tuottamaan riboflaviinia; 5 d) toisen mikro-organismilajin muodostamaa popu laatiota mutatoidaan ensimmäisen mutatoidun populaation saamiseksi; e) ensimmäinen mutatoitu populaatio viedään vali-kointialustaan; 10 f) valitaan ensimmäisestä mutatoidusta populaatios ta ensimmäinen valittu mikro-organismikanta, joka ensimmäinen valittu mikro-organismikanta on resistentti tyhjennetyn kasvualustan aiheuttamalle inhibitiolle; g) ensimmäisen valitun mikro-organismikannan muo- 15 dostamaa populaatiota mutatoidaan jälkimmäisen mutatoidun populaation saamiseksi; h) jälkimmäistä mutatoitua populaatiota viljellään ravinnekasvualustalla, joka sisältää tubersidiinia minimi-inhibitiopitoisuuden ensimmäiselle valitulle mikro-orga- 20 nismikannalle; ja i) valikoidaan jälkimmäisestä mutatoidusta populaatiosta toinen valittu mikro-organismikanta, joka kykenee muodostamaan pesäkkeitä ravinnekasvualustalle. « 40 97067