DD273069A1 - Verfahren zur herstellung einer endo-1,4-beta-glucanase aus erwinia carotovora - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung einer Endo-1,4-b-Glucanase durch submerse Fermentation. Das Enzym fuehrt zu einer Spaltung der b-glycosidischen Bindungen der Cellulose und kann daher allein oder auch in Kombination mit geeigneten Paktinasen und Hemicellulasen fuer die enzymatische Hydrolyse pflanzlicher Biomasse fuer eine nachfolgende Fermentation der niedermolekularen Bausteine eingesetzt werden. Dazu wird ein Stamm des Bakteriums Erwinia carotovora mit einem entsprechenden b-Glucanase-Bildungsvermoegen in einem kostenguenstigen Kulturmedium, vornehmlich aus Getreidenassschlempe und Sojaschrot, mit einem geringen Zusatz an Mineralsalzen bestehend, ergaenzt durch Pektin und Melasse-Konzentrat, in einem Fermentor herkoemmlicher Bauart 13-18 h kultiviert. Als wesentlicher Faktor einer weiteren Steigerung der Enzymausbeute wurden speziell an den Bakterienstamm angepasste Fermentationsbedingungen erkannt, die vorzugsweise in einer Reduzierung der Konzentration des Geloest-O2 im Kulturmedium mit Beginn der logarithmischen Wachstumsphase liegen.

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Fermentationsverfahren zur Herstellung einer Endo-1,4-ß-Glucanaso (nachfolgend ß-Glucanase genannt) im technischen Maßstab unter Verwendung eines Stammes des Bakteriums Erwinia carotovora. Das Enzym kann allein oder in Kombination mit Pektinasen zur enrymatischen Hydrolyse pflanzlicher Biomasse für eine nachfolgende Fermentation der niedermolekularen Bausteine eingesetzt werden. Hauptanwendungsgebiete ergeben sich damit in der 3rennerei-lndustrie für den Aufschluß von Cerealienrohstoffen zur Steigerung der Äthanolausbeuten, in der Landwirtschaft für den enzymatischen Voraufschluß von Grünfuttern zur Optimierung dor Milchsäuregärung bei der Silage-Produktion sowie als Biochemikalie in der Grundlagenforschung.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Für die industrielle Produktion von Enrymen, die die überwiegend aus ß-(1,4)-glycosidischen Bindungen bestehende Zellulose spalten, werden in der Regel pilzliche Enzym-Produzenten wie Trichoderma-, Penicillium- und Aspergillus spec, eingesetzt. Leistungsfähige Stämme synthetisieren in der Rego! die Enzyme, die für einen vollständigen Abbau der ZePulose erforderlich sind wie:

Fndo-1,4-ß-Glucanasen (1,4 (1,3; 1 ^l-ß-D-GlucanM-Glucanohydrolase, EC 3.2.1.4), Exoglucanasen (1,4-ß-D-Glucan Cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91) und ß-Glucosidasen (ß-D-Glucosid Glucohydrolase, EC 3.2.1.21), Der Nachteil dieser Verfahren zur Enzymproduktion besteht jedoch in dem relativ hohen technisch technologischen Aufwand zur Pilzkultivierung. Aufgrund besonderer Anforderungen an die Fermentationstechnik und Prozeßführung sowie hoher Substratansprüche und langer Fermentationszeiten, die eine erhöhte Kontaminationsgefahr einschließen, sind die Verfahren ökonomisch relativ aufwendig. Die Kultivierung von Bakterien zur Enzym-Produktion ist demgegenüber wesentlich weniger anspruchsvoll. Eine Ausnutzung von phytopatho-jenen bakteriellen Enzym-Bildnern, die pflanzliche Pektinstoffe wie auch Zellulosen nahezu vollständig hydrolysieren können, ist bisher für die Gewinnung von zellulytisch wirksamen Enzymen im technischen Maßstab noch nicht in Betracht gezogen worden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Produktion einer Endo-1,4-ß-Glucanase im technischen Maßstab in einem vergleichsweise wenig aufwendigen Fermentationsprozeß mit einem Stamm des Bakteriums Erwinia carotovora zu entwickeln.

Dariegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Endo-1,4-ß-Giucanase bereitzustellen, die kostengünstig mit herkömmlichen Fermentationsanlagen im submersen Verfahren produziert werden kann. Das Enzym fuhrt zu einer hydrolytischen Spaltung der

ß-glycosidischen Bindungen von zelluloseartigen Bestandteilen pflanzlicher Zellwände und soll daher zum Aufschluß pflanzlicher Biomasse für nachfolgende Fermentationsprozesse eingesetzt werden.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein Stamm des Bakteriums Erwinia carotovora — hinterlegt bei der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen im ZIMET Jena, mit der Registriernummer , auf oinem vorwiegend aus Getreidenaßschlempe, Sojsschrot und geringen Zusätzen an Mineralsalzen bestehenden Medium (pH 7,0 bis 7,5, vorzugsweise

jedoch 7,2) bei einer Temperatur von 20-30⁰C, vorzugsweise jedoch 25°C, über einen Zeitraum von 14 bis 18 Stunden, vorzugsweise 15 Stunden kultiviert wird.

Als günstig hat sich erwiesen, daß das Kulturmedium mindestens folgende komplexe Komponenten sowie anorganische Zusätze in der jeweiligen Konzentration Getreidenaßschlempe lOOml/l, Sojaschrot 10g/l, (NH₄I₂HPO₄,1,800g/l, KNO₃ 0,750g/l, MgSO₄ χ 7H₂O0,150g/l, Na₂SO* x 10 K₂O 0,200 g/l, CaCI₂ 0,050g/l, Ai₂(SO₄I₃ x 18H₂O0,050g/l enthält, wobei gefunden wurde,

daß ein Zusatz von Melasse-Konzentrat in Höhe von 5,000y/l bis max. 10g/l zu einer Steigerung der ß-Glucanase-Produktion führt und daß Poktin bis zu 1 g/l bzw. pektinhaltige komplexe Zusätze eine weitere Steigerung der Enzymausbeuten ermöglichen.

Die Medien werden hitzesterilisiert, auf den erforderlichen pH-Wert eingestellt und anschließend erfolgt die Beirr pfung der Hauptkultur nvt den Vorkulturen (Bakteriendichte 4-5 χ 10⁹ Bakterien/ml) der angezogenen Leistungssjämmo, wobei die Zusammensetzung der Medien für die Vorkultur der der Produktionsmedien entspricht. Die Hauptkultur im Produktionskulturmedium wird in üblichen, mit Belüftungseinrichtung und Rührwerk versehenen Fermentoren vorgenommen. Zur optimalen Steuerung und Regelung des Fermentationsprozesses sollten Möglichkeiten zur Messung und Registrierung des Gehaltes an GeIoSt-O₂ (pO₂) und der Wasserstoffionenkonzentration (cH) im Kulturmedium sowie des CC₂- und eventuell auch Oj-Gehaltes der Abluft vorhanden sein. Entscheidend für eine hohe Produktion an ß-Glucanase ist die Reduzierung der Konzentration an GeIoSt-O₂ im Kulturmedium mit Beginn der logarithmischen Wachstumsphase auf £50%. Der günstigste Zeitpunkt des Abbruchs der Fermentation kann durch den Abfall der Konzentration an CO₂ in der Abluft sowie

durch den Anstieg des pH ermittelt werden. Für die Produktion im industriellen Maßstab ist es zweckmäßig, nach einer

Fermentationszeit von anfänglijh 15 Stunden 80% der enzymhaltigen Kulturflüssigkeit zu ernten und durch frischos Medium zu

ersetzen (Fed-batch-Kultur). Im folgenden wiederholt sich dieser Prozeß in Abständen von jeweils 8 bis 10 Stunden, da in dieser

Zeit bereits die erforderliche ß-Glucanase-Aktivität im Kulturfilirat erreicht ist. Die weitere Aufarbeitung der Bakteriensuspension erfolgt in üblicher Weise, d. h. die Bakterien werden durch Zentrifugation

abgetrennt und das Kulturfiltrat wird über Ultrafiltration bzw. über andere übliche temperaturschonende Verfahren aufkonzentriert. Das Konzentiat kann als solches verwendet oder bei Temperaturen unterhalb des Gefrierpunktes eingelagert werden bzw. es werden Dauerpräparate durch Sprühtrocknung oder Lyophilisation gewonnen. Die Erwinia-1,4-ß-Glucanase ist noch wirksam bei pH 3,0 und erreicht das Maximum ihrer Aktivität bei pH 5,0-6,0. Das Temperaturoptimum des Enzyms liegt bei

Ausfuhrungsbeispiele Bestimmung der Enzymaktivitat Cellulase (Endo-1,4-ß-Glucanase, E.C. 3.2.1.4.) Substrat: Carboxymethylcellulose; Na-SaIz (Fa. Serva) 0,5% in Phosphat-Puffer nach Sörensen, pH 5,1 Methodik: Verminderung der Viskosität (Viskosimeter nach Ostwald)

1 U = Abfall der Viskos tat um 25% bis 3O⁰C (= CMCI-Aktivität)

I.ß-Glucanase-Produktlon Im Labormaßstab

Vorkultur

Die Vorkultur wurde als Schüttelkultur im 100-rnl- Erlenrneyer-Kolben mit 25ml Kulturmedium angelegt. Die Beimpfung der Vorkultur erfolgt direkt von Stammkulturen auf Schrägagar-Röhrchen, kann aber auch mit Bakteriensuspensionen aus Gefrierkonserven, die bei -35⁰C gelagert werden, erfolgen. Die Kultivierung wurde bei 25⁰C

vorgenommen und nach 15 Stunden abgeschlossen. Im Kulturfiltrat war eine CMCI-Aktivität von 55,60UmI'¹ nachweisbar. Die für die Beimpfung der Hauptkultur benötigto Menge an Bakteriensuspension beträgt Vm des Volumens der Hauptkultur.

Hauptkultur Fermentortyp: Laborfermentor LF2 (VEB Mytron) Nutzvolumen: 2,51 Medium (in gl"') Mineralsalze

(NHO₂HPO₄--1,800, KNO₃-0,7500, Na₂SO₄ x 10H₂O-0,200,MgSO₄ χ 7H₂O-0,150,CaCI₂-0,050, Ai₂(SO₄I₃ x 18H₂O-

org. Zusätze

Sojaschrot — 15,000, Getreidenaßschlempe — 1 W)₁OO, Pektin — 1,000, Saccharose — 2,000 Sterilisation: 20min bis 120°C

cH nach dem Sterilisieren mit NaOH auf pH 7,2 einstellen.

Inokulum: 50ml einer Vorkultur des Stammes Fermentationstemp.: 25'C Rührwerk: nach 2,6 h von 800 auf 600 rpm reduziert Luftzufuhr: 3Ol h"¹ mit weiterer Reduzierung biszum Einstellen des erforderlichen Sauerstoffpartialdruckes Der weitere Verlauf der Parameter des Fermentationsproxesses i3t aus Abb. 1 ersichtlich. A = ß-Glucanase-Aktivität (CMCI-Akt.) B = Konzentration an GeIOSt-O₂ im Kulturmedium C = Konzentration des CO₂ in der Abluft (Atmung) D = Konzentration des O₂ in der Abluft E = Konzentration der Wa&serstoffionen Bereits nach einer Fermentationszeit von 13 Stunden war eine CMCI-Aktivität im Kulturfiltrat von 90,6OU ml"¹ nachweisbar. Bis

zum Abbruch der Fermentation, hier nach 24 Stunden, erfolgte keine weitere Zunahme der Aktivität.

2. Einfluß einzelne» Medien-Komponenten auf die ß-Qlucanste-Produktlon

Die Kultur erfolgte als Schüttelkultur im Erlenmeyer-Kolben. Ein Mii.eralsa'zmedium (Zusammensetzung £ Beispiel 1) wurde

durch Zusätze in den Varianten a, b, c, d ergänzt.

organische Zusätze abcd

ingl"¹

Sojaschrot	10,00	10,00	10,00	10,00
Schlempe	—	100,00	100,00	100,00
Melasse	—	—	10,00	10,00
Pektin	—	—	—	1,00

CMCI-Akt.—rel.(%) 100 106 141

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung einer Erwinia-IAß-Glucanase, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Kultivierung eines Stammes des Bakteriums Erwinia carotovora — hinterlegt bei der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen beim ZIMET, Jena, unter der Registriernummer ZIMET auf einem für diesen Mikroorganismus abgestimmten Kulturmedium ein für die hydrolytische Spaltung der ß-glycosidischen Bindungen von Zellulosen geeignetes Enzym erzeugt wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation nach einer Dauer von 13 bis 18 Stunden abgebrochen wird.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß nach einer Fermentationszeit von anfänglich 15 Stunden 80% der enzymhaltigen Kulturflüssigkeit geerntet und durch frisches Medium ersetzt wird und daß sich dieser Prozeß danach in Abständen von 8 bis 10 Stunden wiederholt.

4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vor- und Hauptkultur Getreidenaßschlempe, ein Abprodukt der Brennerei-Industrie als wesentliche Medienkompononte eingesetzt wird, ergänzt durch Melasse und Sojaschrot sowie geringen Mengen Pektin und Mineralsalzen.

5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Zusatz von Pektin und Melasse-Konzentrat zu einer Steigerung der ß-Glucanase-Produktion führt.

6. Verfahren nach Punkt 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an GeIoSt-O₂ mit Beginn der logarithmischen Wachstumsphase aufwerte unter 50% bis zum Fermentationsabbruch reduziert wird.