DD273069A1 - PROCESS FOR PREPARING ENDO-1,4-BETA GLUCANASE FROM ERWINIA CAROTOVORA - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung einer Endo-1,4-b-Glucanase durch submerse Fermentation. Das Enzym fuehrt zu einer Spaltung der b-glycosidischen Bindungen der Cellulose und kann daher allein oder auch in Kombination mit geeigneten Paktinasen und Hemicellulasen fuer die enzymatische Hydrolyse pflanzlicher Biomasse fuer eine nachfolgende Fermentation der niedermolekularen Bausteine eingesetzt werden. Dazu wird ein Stamm des Bakteriums Erwinia carotovora mit einem entsprechenden b-Glucanase-Bildungsvermoegen in einem kostenguenstigen Kulturmedium, vornehmlich aus Getreidenassschlempe und Sojaschrot, mit einem geringen Zusatz an Mineralsalzen bestehend, ergaenzt durch Pektin und Melasse-Konzentrat, in einem Fermentor herkoemmlicher Bauart 13-18 h kultiviert. Als wesentlicher Faktor einer weiteren Steigerung der Enzymausbeute wurden speziell an den Bakterienstamm angepasste Fermentationsbedingungen erkannt, die vorzugsweise in einer Reduzierung der Konzentration des Geloest-O2 im Kulturmedium mit Beginn der logarithmischen Wachstumsphase liegen.The invention relates to a microbial process for the production of an endo-1,4-b-glucanase by submerged fermentation. The enzyme leads to a cleavage of the b-glycosidic bonds of cellulose and can therefore be used alone or in combination with suitable pactinases and hemicellulases for the enzymatic hydrolysis of vegetable biomass for a subsequent fermentation of the low molecular weight building blocks. For this purpose, a strain of the bacterium Erwinia carotovora with a corresponding b-glucanase-forming capacity in a cost-effective culture medium, mainly from grain ashes and soybean meal, with a small addition of mineral salts, supplemented by pectin and molasses concentrate, in a fermenter of conventional design 13- Cultivated for 18 h. As an essential factor of a further increase in the enzyme yield, fermentation conditions adapted specifically to the bacterial strain were identified which are preferably in a reduction of the concentration of the geloest-O2 in the culture medium with the beginning of the logarithmic growth phase.
Description
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Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Fermentationsverfahren zur Herstellung einer Endo-1,4-ß-Glucanaso (nachfolgend ß-Glucanase genannt) im technischen Maßstab unter Verwendung eines Stammes des Bakteriums Erwinia carotovora. Das Enzym kann allein oder in Kombination mit Pektinasen zur enrymatischen Hydrolyse pflanzlicher Biomasse für eine nachfolgende Fermentation der niedermolekularen Bausteine eingesetzt werden. Hauptanwendungsgebiete ergeben sich damit in der 3rennerei-lndustrie für den Aufschluß von Cerealienrohstoffen zur Steigerung der Äthanolausbeuten, in der Landwirtschaft für den enzymatischen Voraufschluß von Grünfuttern zur Optimierung dor Milchsäuregärung bei der Silage-Produktion sowie als Biochemikalie in der Grundlagenforschung.The invention relates to a microbial fermentation process for the production of an endo-1,4-ß-glucanaso (hereinafter called ß-glucanase) on an industrial scale using a strain of the bacterium Erwinia carotovora. The enzyme can be used alone or in combination with pectinases for the enzymatic hydrolysis of plant biomass for a subsequent fermentation of the low-molecular-weight building blocks. The main fields of application are thus in the distillery industry for the digestion of cereal raw materials to increase ethanol yields, in agriculture for the enzymatic pre-digestion of green fodder to optimize lactic acid fermentation in silage production and as a biochemical in basic research.
Für die industrielle Produktion von Enrymen, die die überwiegend aus ß-(1,4)-glycosidischen Bindungen bestehende Zellulose spalten, werden in der Regel pilzliche Enzym-Produzenten wie Trichoderma-, Penicillium- und Aspergillus spec, eingesetzt. Leistungsfähige Stämme synthetisieren in der Rego! die Enzyme, die für einen vollständigen Abbau der ZePulose erforderlich sind wie:For the industrial production of enzymes which cleave the cellulose, which mainly consists of β- (1,4) -glycosidic bonds, fungal enzyme producers such as Trichoderma, Penicillium and Aspergillus spec are generally used. Efficient strains synthesize in the Rego! the enzymes required for complete degradation of ZePulose, such as:
Fndo-1,4-ß-Glucanasen (1,4 (1,3; 1 ^l-ß-D-GlucanM-Glucanohydrolase, EC 3.2.1.4), Exoglucanasen (1,4-ß-D-Glucan Cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91) und ß-Glucosidasen (ß-D-Glucosid Glucohydrolase, EC 3.2.1.21), Der Nachteil dieser Verfahren zur Enzymproduktion besteht jedoch in dem relativ hohen technisch technologischen Aufwand zur Pilzkultivierung. Aufgrund besonderer Anforderungen an die Fermentationstechnik und Prozeßführung sowie hoher Substratansprüche und langer Fermentationszeiten, die eine erhöhte Kontaminationsgefahr einschließen, sind die Verfahren ökonomisch relativ aufwendig. Die Kultivierung von Bakterien zur Enzym-Produktion ist demgegenüber wesentlich weniger anspruchsvoll. Eine Ausnutzung von phytopatho-jenen bakteriellen Enzym-Bildnern, die pflanzliche Pektinstoffe wie auch Zellulosen nahezu vollständig hydrolysieren können, ist bisher für die Gewinnung von zellulytisch wirksamen Enzymen im technischen Maßstab noch nicht in Betracht gezogen worden.Fndo-1,4-.beta.-glucanases (1.4 (1.3; 1: 1-.beta.-D-glucan M-glucanohydrolase, EC 3.2.1.4), exoglucanases (1,4-.beta.-D-glucan cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91) and ß-glucosidases (ß-D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21), The disadvantage of these processes for enzyme production, however, consists in the relatively high technological technological effort for mushroom cultivation due to special demands on the fermentation technology and process control as well as high In contrast, substrate cultivation and long fermentation times, which entail an increased risk of contamination, make the processes relatively costly, while the cultivation of bacteria for enzyme production is considerably less demanding: utilization of phytopathogenic bacterial enzyme formers, plant pectin substances, as well as celluloses have been fully hydrolyzed, has not yet been considered for the extraction of cellulytic enzymes on an industrial scale.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Produktion einer Endo-1,4-ß-Glucanase im technischen Maßstab in einem vergleichsweise wenig aufwendigen Fermentationsprozeß mit einem Stamm des Bakteriums Erwinia carotovora zu entwickeln.The object of the invention is to develop a process for the production of an endo-1,4-ß-glucanase on an industrial scale in a relatively inexpensive fermentation process with a strain of the bacterium Erwinia carotovora.
ß-glycosidischen Bindungen von zelluloseartigen Bestandteilen pflanzlicher Zellwände und soll daher zum Aufschluß pflanzlicher Biomasse für nachfolgende Fermentationsprozesse eingesetzt werden.ß-glycosidic bonds of cellulosic constituents of plant cell walls and should therefore be used for the digestion of plant biomass for subsequent fermentation processes.
jedoch 7,2) bei einer Temperatur von 20-300C, vorzugsweise jedoch 25°C, über einen Zeitraum von 14 bis 18 Stunden, vorzugsweise 15 Stunden kultiviert wird.but 7.2) at a temperature of 20-30 0 C, but preferably 25 ° C, over a period of 14 to 18 hours, preferably 15 hours is cultivated.
daß ein Zusatz von Melasse-Konzentrat in Höhe von 5,000y/l bis max. 10g/l zu einer Steigerung der ß-Glucanase-Produktion führt und daß Poktin bis zu 1 g/l bzw. pektinhaltige komplexe Zusätze eine weitere Steigerung der Enzymausbeuten ermöglichen.that an addition of molasses concentrate in the amount of 5,000y / l to max. 10 g / l leads to an increase in the ß-glucanase production and that Poktin up to 1 g / l or pectin complex additives allow a further increase in enzyme yields.
durch den Anstieg des pH ermittelt werden. Für die Produktion im industriellen Maßstab ist es zweckmäßig, nach einerbe determined by the increase in the pH. For the production on an industrial scale it is expedient, after one
ersetzen (Fed-batch-Kultur). Im folgenden wiederholt sich dieser Prozeß in Abständen von jeweils 8 bis 10 Stunden, da in dieserreplace (fed-batch culture). In the following, this process is repeated at intervals of 8 to 10 hours, since in this
abgetrennt und das Kulturfiltrat wird über Ultrafiltration bzw. über andere übliche temperaturschonende Verfahren aufkonzentriert. Das Konzentiat kann als solches verwendet oder bei Temperaturen unterhalb des Gefrierpunktes eingelagert werden bzw. es werden Dauerpräparate durch Sprühtrocknung oder Lyophilisation gewonnen. Die Erwinia-1,4-ß-Glucanase ist noch wirksam bei pH 3,0 und erreicht das Maximum ihrer Aktivität bei pH 5,0-6,0. Das Temperaturoptimum des Enzyms liegt beiseparated and the culture filtrate is concentrated by ultrafiltration or other conventional temperature-saving method. The concentrate can be used as such or stored at temperatures below freezing point, or permanent preparations are obtained by spray-drying or lyophilization. Erwinia 1,4-β-glucanase is still effective at pH 3.0 and reaches its maximum at pH 5.0-6.0. The temperature optimum of the enzyme is included
1 U = Abfall der Viskos tat um 25% bis 3O0C (= CMCI-Aktivität)1 U = the waste Viscous did 25% to 3O 0 C (= CMCI activity)
Vorkulturpreculture
vorgenommen und nach 15 Stunden abgeschlossen. Im Kulturfiltrat war eine CMCI-Aktivität von 55,60UmI'1 nachweisbar. Die für die Beimpfung der Hauptkultur benötigto Menge an Bakteriensuspension beträgt Vm des Volumens der Hauptkultur.made and completed after 15 hours. In the culture filtrate a CMCI activity of 55.60 UmI ' 1 was detectable. The amount of bacterial suspension needed to inoculate the major culture is Vm of the volume of the major culture.
(NHO2HPO4--1,800, KNO3-0,7500, Na2SO4 x 10H2O-0,200,MgSO4 χ 7H2O-0,150,CaCI2-0,050, Ai2(SO4I3 x 18H2O-(NHO 2 HPO 4 - 1.800, KNO 3 -0.7500, Na 2 SO 4 x 10H 2 O-0.200, MgSO 4 χ 7H 2 O-0.150, CaCl 2 -0.050, Ai 2 (SO 4 I 3 x 18H 2 O-
org. Zusätzeorg. additions
cH nach dem Sterilisieren mit NaOH auf pH 7,2 einstellen.After sterilization adjust cH to pH 7.2 with NaOH.
zum Abbruch der Fermentation, hier nach 24 Stunden, erfolgte keine weitere Zunahme der Aktivität.to stop the fermentation, here after 24 hours, there was no further increase in activity.
2. Einfluß einzelne» Medien-Komponenten auf die ß-Qlucanste-Produktlon2. Influence individual »media components on the β-glucanste product
durch Zusätze in den Varianten a, b, c, d ergänzt.supplemented by additives in the variants a, b, c, d.
organische Zusätze abcdorganic additives abcd
ingl"1 ingl. " 1
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DD31692188A DD273069A1 (en) | 1988-06-20 | 1988-06-20 | PROCESS FOR PREPARING ENDO-1,4-BETA GLUCANASE FROM ERWINIA CAROTOVORA |
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DD273069A1 true DD273069A1 (en) | 1989-11-01 |
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DD (1) | DD273069A1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU664894B2 (en) * | 1992-03-27 | 1995-12-07 | Novo Nordisk A/S | Endo-beta -1,4-glucanase and a DNA sequence |
-
1988
- 1988-06-20 DD DD31692188A patent/DD273069A1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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AU664894B2 (en) * | 1992-03-27 | 1995-12-07 | Novo Nordisk A/S | Endo-beta -1,4-glucanase and a DNA sequence |
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