DE102011014444A1 - Biotechnological exploitation of lignocellulose raw material comprises decomposing lignocellulosic material by formic acid/hydrogen peroxide and passing lignin component into formic acid phase, hydrolyzing obtained phase, and precipitating - Google Patents

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Abstract

Process for biotechnological exploitation of lignocellulose raw materials, comprises: (a) decomposing lignocellulosic material by formic acid/hydrogen peroxide and passing lignin components mainly into formic acid phase; (b) hydrolyzing obtained phase, after removing carbohydrate components, by enzyme complexes of fungal mutants in simultaneous saccharification and fermentation into monomeric or oligomeric sugars that are partially or completely fermented by microorganisms into alcohol; and (c) precipitating lignin components from the formic acid fraction by water and by supplying materials. Process for biotechnological exploitation of lignocellulose raw materials, in which carbohydrate component is reacted in alcohol and lignin components of a material are supplied to further processing, comprises: (a) decomposing lignocellulosic material by formic acid/hydrogen peroxide and passing lignin components mainly into the formic acid phase; (b) hydrolyzing the obtained phase, after removal of the carbohydrate components, by enzyme complexes of fungal mutants of Penicillium verruculosumDSM 8069 or DSM 8070 or the enzyme forming mutants isolated from this fungus P. verruculosum-M28-10b = DSM 24317, in a process of simultaneous saccharification and fermentation into monomeric or oligomeric sugars, which are partially or completely fermented by microorganisms into alcohol; and (c) precipitating lignin components from the formic acid fraction by water and by supplying materials. An independent claim is included for P. verruculosum-M28-10b = DSM 24317.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Verwertung von Lignocellulose-Rohstoffen, insbesondere Lignocellulose aus Einjahrespflanzen, bei dem sowohl der Kohlenhydrat- als auch der Ligninanteil einer stofflichen Weiterverarbeitung zugeführt werden. Das Verfahren betrifft den chemischen Aufschluss von Lignocellulose zur Trennung in die Lignin- und Kohlenhydratfraktion, den Prozess der simultanen Verzuckerung und Vergärung der Kohlenhydratfraktion unter Einsatz eines Penicillium verruculosum-Enzymkomplexes zur Gewinnung von Alkoholen und die Nutzung der abgetrennten Ligninfraktion für eine stoffliche Verwertung.The invention relates to a method for the biotechnical utilization of lignocellulosic raw materials, in particular lignocellulose from annual plants, in which both the carbohydrate and the lignin portion of a material processing are supplied. The process relates to the chemical digestion of lignocellulose for separation into the lignin and carbohydrate fraction, the process of simultaneous saccharification and fermentation of the carbohydrate fraction using a Penicillium verruculosum enzyme complex to recover alcohols and the use of the separated lignin fraction for recycling.

Die nachhaltige Nutzung von natürlichen Ressourcen hat in den letzten Jahren stark an Bedeutung gewonnen, wobei insbesondere die industrielle Verwertung von Biomasse von besonderem Interesse ist. Biomasse als nachwachsender Rohstoff ist allgegenwärtig verfügbar und kann an Stelle von Rohöl entscheidend zur Lösung von zukünftigen Rohstoffproblemen beitragen. Ethanol kann als Brennstoff, Grundchemikalie, C2-Baustein und vieles mehr eingesetzt werden und bietet sich daher als Alternative zum Rohöl an. Aus Biomasse gewonnener Ethanol – Bioethanol – wird bereits im industriellen Maßstab aus leicht vergärbaren zucker- bzw. stärkehaltigen Produkten, welche einer enzymatischen Hydrolyse unterzogen werden, mittels Saccharomyces cerevisiae gewonnen. Der Einsatz von Nahrungsmitteln für die Ethanolgewinnung ist allerdings nicht nur ethisch sondern auch aus Sicht der CO2-Bilanz stark umstritten, sodass die Zukunft der Ethanolproduktion für die chemische Industrie in anderen Ausgangsstoffen liegen muss. Lignocellulosen weisen ein enormes Potential als zukünftiges Edukt für die Bioethanolproduktion auf und fallen in reichlichen Mengen als landwirtschaftliche Nebenprodukte oder kommunale Abfälle an.The sustainable use of natural resources has become increasingly important in recent years, with particular emphasis on the industrial exploitation of biomass. Biomass as a renewable resource is ubiquitously available and can contribute to solving future resource problems rather than crude oil. Ethanol can be used as a fuel, basic chemical, C 2 building block and much more, making it an alternative to crude oil. Biomass-derived ethanol - bioethanol - is already produced on an industrial scale from easily fermentable sugar or starch-containing products, which are subjected to enzymatic hydrolysis, using Saccharomyces cerevisiae. However, the use of food for ethanol production is not only ethically but also highly controversial from the point of view of the CO 2 balance, so that the future of ethanol production for the chemical industry must be in other starting materials. Lignocelluloses have enormous potential as future educts for bioethanol production and accumulate in abundant quantities as agricultural by-products or municipal waste.

Das seit den siebziger Jahren anvisierte Konzept der Nutzung von Lignocellulose als Rohstoff und Energieträger mittels der enzymatischen Cellulosehydrolyse konnte bisher trotz umfangreicher internationaler Forschungsaktivitäten wirtschaftlich noch nicht umgesetzt werden. Die Bedeutung der Nutzung von Lignocellulose zur Gewinnung von Ethanol als Rohstoff bzw. Energieträger findet seinen Niederschlag auch in zahlreichen Ausschreibungen des 7. Rahmenprogrammes der EU. Beispielgebend sei das im 7. Rahmenprogramm der EU bestehende Verbundprojekt „NEMO for bioethanol” genannt, in dem seit Mai 2009 insgesamt 18 Projektpartner mit einer Gesamtsumme von 5,9 Mio. Euro gefördert werden. Dieses Verbundprojekt hat die Entwicklung von Enzymkomplexen und verbesserten Hefestämmen für den Einsatz in Verfahren der Bioethanolgewinnung auf Basis von Lignocellulose zum Ziel, wobei zum Aufschluss der Lignocellulose die bestehenden Verfahren zum steam explosion und zum Säureaufschluss zugrunde gelegt werden.The concept of using lignocellulose as a raw material and energy carrier by means of enzymatic cellulose hydrolysis, which has been planned since the seventies, has not yet been economically implemented despite extensive international research activities. The importance of using lignocellulose for the production of ethanol as a raw material or energy source is also reflected in numerous calls for tenders in the 7th Framework Program of the EU. One example is the joint project "NEMO for bioethanol", which is part of the EU's 7th Framework Program. Since May 2009, a total of 18 project partners with a total of 5.9 million euros have been funded. The aim of this collaborative project is to develop enzyme complexes and improved yeast strains for use in lignocellulose based bioethanol production processes, using lignocellulosic pulping techniques based on existing steam explosion and acid digestion processes.

Ursachen für die bisher unzureichende wirtschaftliche Umsetzung:Causes for the hitherto insufficient economic implementation:

Die Umwandlung von Lignocellulose in Ethanol erfordert im Wesentlichen drei Prozessschritte, den Biomasseaufschluss, die enzymatische Hydrolyse der Cellulose-/Hemicellulose-Bestandteile und die Fermentation der Hydrolyseprodukte durch Hefen zu Ethanol. Der Aufschluss der Lignocellulose-Rohstoffe, insbesondere bei Holz bzw. Holzabfällen, ist erforderlich, um durch Aufbrechen der Ligninstruktur den Zugang der Enzyme für den enzymatischen Abbau der Cellulose zu intensivieren.The conversion of lignocellulose into ethanol essentially requires three process steps, biomass digestion, enzymatic hydrolysis of the cellulose / hemicellulose constituents and fermentation of the hydrolysis products by yeasts to ethanol. The digestion of the lignocellulosic raw materials, especially in wood or wood waste, is required to intensify the access of enzymes for the enzymatic degradation of the cellulose by breaking up the lignin structure.

Die bisher untersuchten Verfahren zur Vorbehandlung der Lignocellulose sind vielfältig und reichen von mechanischen Behandlungen bis hin zu chemischen Aufschlüssen. Typischerweise kommen zum Einsatz: Steam explosion, CO2-Explosion, Säureaufschluss, Basenaufschluss, Behandlung mit organischen Lösungsmitteln, mechanische Zerkleinerung (Mahlen, Zerfasern), Behandlung mit Wasserstoffperoxid, u. a. Die Effektivität einer Vorbehandlungsmethode wird anhand der Trennung der drei Hauptbestandteile der Lignocellulose beurteilt. Je effektiver die Trennung, desto besser können die einzelnen Bestandteile in folgenden Prozessen verwertet werden. Die Verwendung von Mineralsäuren wie Schwefelsäure wird häufig angewandt, jedoch ist die Rückgewinnung der Ausgangsstoffe schwierig und die schwefelhaltigen Abfallsstoffe stellen ein Umweltproblem dar.The previously studied processes for the pretreatment of lignocellulose are diverse and range from mechanical treatments to chemical digestions. Typically used are: steam explosion, CO 2 explosion, acid digestion, base digestion, treatment with organic solvents, mechanical comminution (grinding, defibering), treatment with hydrogen peroxide, etc. The effectiveness of a pretreatment method is judged by the separation of the three main constituents of lignocellulose. The more effective the separation, the better the individual components can be utilized in the following processes. The use of mineral acids such as sulfuric acid is often used, however, the recovery of the starting materials is difficult and the sulfur-containing waste materials pose an environmental problem.

Die Ursachen für die mangelnde Wirtschaftlichkeit der Prozesse zur Gewinnung von Ethanol aus dem Celluloseanteil von Lignocellulosen liegen in erster Linie in den noch zu hohen Enzymkosten, in einer nicht-optimalen Zusammensetzung der kommerziell verfügbaren Enzymkomplexe sowie in einer zu geringen spezifischen Aktivität des Cellulasekomplexes. Der sog. SSF-Prozess der simultanen Verzuckerung und Vergärung von Cellulose zu Ethanol bietet verfahrenstechnische Vorteile, da keine separate Verfahrensstufe für die enzymatische Hydrolyse der Cellulose erforderlich ist, sondern die Cellulosehydrolyse in einer Verfahrensstufe mit der Vergärung der gebildeten Zucker zu Ethanol erfolgt. Die bekannten Enzympräparate werden jedoch im SSF-Prozess zumeist durch Ethanol und/oder Ligninkomponenten partiell inhibiert, sodass dadurch größere Enzymmengen für den SSF-Prozess benötigt werden. Weitere Nachteile bilden die Stabilität der Enzymkomplexe im SSF-Prozess sowie ein hoher Kosten- und Energieaufwand für die Vorbehandlung der Lignocellulose.The reasons for the lack of cost-effectiveness of the processes for obtaining ethanol from the cellulose fraction of lignocelluloses lie primarily in the still high enzyme costs, in a non-optimal composition of the commercially available enzyme complexes as well as in a too low specific activity of the cellulase complex. The so-called SSF process of simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol offers procedural advantages, since no separate process stage for the enzymatic hydrolysis of cellulose is required, but the cellulose hydrolysis takes place in a process stage with the fermentation of the sugars formed to ethanol. However, the known enzyme preparations are mostly partially inhibited in the SSF process by ethanol and / or lignin components, so that larger Enzyme quantities are needed for the SSF process. Further disadvantages are the stability of the enzyme complexes in the SSF process and a high cost and energy expenditure for the pretreatment of the lignocellulose.

Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens, welches umweltfreundlich, effektiv und wirtschaftlich die stoffliche Verwertung des Kohlenhydrat- und des Ligninanteiles aus Lignocellulosen ermöglicht, in dem der Kohlenhydratanteil zur Gewinnung von Alkoholen dient und das Lignin einer stofflichen Verwertung zugeführt werden kann.The aim of the invention is the development of a process which environmentally, effectively and economically enables the recycling of the carbohydrate and lignin from lignocelluloses, in which the carbohydrate portion is used for the production of alcohols and the lignin can be recycled.

Die Aufgabe der Erfindung betrifft die Entwicklung eines Enzymkomplexes mit hoher spezifischer Cellulase- und Hemicellulaseaktivität, die durch Ethanol und Ligninkomponenten nicht oder nur in geringem Maße inhibiert werden. Eine weitere Aufgabe betrifft die Entwicklung eines SSF-Prozesses, in dessen Verlauf die Enzymaktivität nicht oder nur in geringem Maße abnimmt und der somit eine weitgehende Abtrennung und einen erneuten Einsatz der Enzyme ermöglicht.The object of the invention relates to the development of an enzyme complex with high specific cellulase and hemicellulase activity, which are not or only to a limited extent inhibited by ethanol and lignin components. A further object relates to the development of an SSF process, in the course of which the enzyme activity does not decrease or only to a slight extent and thus makes possible a substantial separation and a renewed use of the enzymes.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst, indem im SSF-Prozess auf Basis der aus Lignocellulose abgetrennten Kohlenhydratfraktion Cellulase-/Hemicellulase-Enzymkomplexe eingesetzt werden, die mit den Pilzmutanten Penicillium verruculosum-DSM 8069 oder Penicillium verruculosum-DSM 8070 oder der aus diesen Pilzmutanten isolierten Enzymbildner, beispielsweise P. verruculosum M28-10b, gewonnen werden. Der erfindungsgemäße P. verruculosum-Cellulasekomplex ist für den SSF-Prozess zur Gewinnung von Ethanol auf Basis des Kohlenhydratanteiles aus dem aufgeschlossenen Stroh geeignet und weist gegenüber dem Cellulasekomplex aus einem T. reesei-Produktionsstamm der Anmelderin deutliche Vorteile auf. Diese zeigen sich in einer höheren Resistenz gegenüber Ethanol und in der Zusammensetzung des Hydrolysates. Auch wird die P. verruculosum-Cellulase praktisch nicht am Lignin adsorbiert bzw. inhibiert. Der P. verruculosum-Stamm produziert einen Cellulasekomplex mit einer im Vergleich zu T. reesei höheren spezifischen Aktivität gegenüber mikrokristalliner Cellulose infolge des höheren Anteiles an β-Glucosidase im Enzymkomplex.According to the invention, the object is achieved by using cellulase / hemicellulase enzyme complexes based on the carbohydrate fraction separated from lignocellulose in the SSF process, which are reacted with the mutant fungi Penicillium verruculosum DSM 8069 or Penicillium verruculosum DSM 8070 or the enzyme former isolated from these mutant fungi, for example, P. verruculosum M28-10b. The P. verruculosum cellulase complex according to the invention is suitable for the SSF process for the production of ethanol on the basis of the carbohydrate portion of the digested straw and has significant advantages over the cellulase complex of a T. reesei production strain of the Applicant. These show a higher resistance to ethanol and in the composition of the hydrolyzate. Also, the P. verruculosum cellulase is practically not adsorbed or inhibited on the lignin. The P. verruculosum strain produces a cellulase complex with a higher microcrystalline cellulose specific activity than T. reesei due to the higher proportion of β-glucosidase in the enzyme complex.

Der Prozess für die Auftrennung der Lignocellulose in die Kohlenhydrat- und Ligninfraktion erfolgt in Anlehnung an das sog. Natural-Pulping-Verfahren (NP) mit Ameisensäure/Wasserstoffperoxid, um eine stoffliche Nutzung sowohl der Cellulose- als auch der Ligninfraktion zu ermöglichen. Der Aufschluss mit Ameisensäure erweist sich als geeignet für den nachfolgenden SSF-Prozess. Die Ligninfraktion kann nahezu vollständig abgetrennt werden. Bezogen auf Stroh-Trockenmasse wurden ca. 44% Pulpe und 19,5% Lignin erhalten, was der Strohzusammensetzung nahe kommt. Das Lignin liegt in einer weiterverarbeitbaren Form vor.The process for the separation of the lignocellulose into the carbohydrate and lignin fraction is based on the so-called natural pulping method (NP) with formic acid / hydrogen peroxide, in order to enable a material utilization of both the cellulose and the lignin fraction. The digestion with formic acid proves to be suitable for the subsequent SSF process. The lignin fraction can be almost completely separated. Based on straw dry matter, about 44% pulp and 19.5% lignin were obtained, which is close to the straw composition. The lignin is in a processable form.

Die Gewinnung der erfindungsgemäßen Cellulase-/Hemicellulase-Enzymkomplexe mit den benannten Pilzmutanten erfolgt in Bioreaktoren mittels Submerskultur auf Basis von Cellulose, Glucose, Weizenkleie bzw. Schlempe und Nährsalzen methodisch um wesentlichen nach dem bekannten Stand der Technik. Vorteilhaft ist der Einsatz der Kohlenhydratfraktion aus der Lignocellulose als Substrat und Induktor im Prozess der Enzymfermentation. Die Abtrennung der Enzyme aus dem Fermentationsprozess erfolgt entsprechend dem Stand der Technik, beispielsweise mittels Separation zur Entfernung der Feststoffe, cross flow-Mikro- und cross flow-Ultrafiltration zur Reinigung und Aufkonzentrierung des Enzymkomplexes.The recovery of the cellulase / hemicellulase enzyme complexes according to the invention with the named mutant fungi is carried out methodically in bioreactors by Submerskultur based on cellulose, glucose, wheat bran or vinasse and nutrient salts by the well-known prior art. The use of the carbohydrate fraction from lignocellulose as substrate and inducer in the process of enzyme fermentation is advantageous. The separation of the enzymes from the fermentation process is carried out according to the state of the art, for example by means of separation to remove the solids, cross-flow micro- and cross-flow ultrafiltration for purification and concentration of the enzyme complex.

Es wurde gefunden, dass die Aktivität des Enzyms im SSF-Prozess erhalten bleibt, solange eine alternative Proteinquelle zum Enzym im Medium vorliegt. Ohne alternative Proteinquelle nutzt die Hefe das Enzym als Aminosäurequelle. Die Verwendung von Schlempe stellt einen kostengünstigen Ersatz für Pepton und Hefeextrakt dar. Im SSF-Prozess kann somit durch Zugabe von Dünnschlempe oder Rohschlempe, welche im Prozess nach dem Abdestillieren des Alkohols anfällt und Proteine enthält, der proteolytische Abbau der Enzyme verhindert werden.It has been found that the activity of the enzyme in the SSF process is maintained as long as an alternative protein source to the enzyme is present in the medium. Without alternative sources of protein, yeast uses the enzyme as an amino acid source. The use of stillage is a cost-effective substitute for peptone and yeast extract. In the SSF process, the addition of thin vinasse or raw vat, which is obtained in the process after distilling off the alcohol and containing proteins, can prevent the proteolytic degradation of the enzymes.

Beispiele 1: Auftrennung von Lignocellulose in die Kohlenhydrat- und LigninfraktionExamples 1: Separation of lignocellulose into the carbohydrate and lignin fraction

Als Lignocellulose dient Weizenstroh, welches sich aus ca. 45% Cellulose, 25% Lignin und 30% Hemicellulose zusammensetzt.As lignocellulose is wheat straw, which is composed of about 45% cellulose, 25% lignin and 30% hemicellulose.

Der Aufschluss im Labormaßstab zur Gewinnung von cellulosehaltiger sowie ligninhaltiger Pulpe erfolgt durch Erhitzung von 65 g Strohhäcksel in 1,58 Liter 75%-iger Ameisensäure bei 105–108°C unter mäßigem Rühren in einen 3-l-Rundkolben am Rückflusskühler. Nach 20 Minuten werden kontinuierlich 48 ml 30%-ige Wasserstoffperoxidlösung über einen Zeitraum von 40 Minuten zugegeben. Nach Abkühlung der Suspension wird der nichtlösliche cellulosehaltige Feststoff mittels Separation abgetrennt, zur Entfernung der anhaftenden Ameisensäure mit Wasser gewaschen und bei 105°C getrocknet. Die Cellulosepulpe des Aufschlusses enthält mehr als 40% der Strohtrockensubstanz.The digestion on a laboratory scale for the recovery of cellulose-containing and lignin-containing pulp is carried out by heating 65 g of straw in 1.58 liters of 75% formic acid at 105-108 ° C with moderate stirring in a 3-liter round bottom flask on a reflux condenser. After 20 minutes, 48 ml of 30% hydrogen peroxide solution are added continuously over a period of 40 minutes. After cooling the suspension, the non-soluble cellulose-containing solid is separated by means of separation, washed with water to remove the adhering formic acid and dried at 105.degree. The cellulose pulp of the pulp contains more than 40% of the straw solids.

Je nach Verwendung der separierten Cellulosefraktion kann der Waschprozess modifiziert werden, beispielsweise vorheriges Waschen mit 75%-iger Ameisensäure, um anhaftende Ligninreste zu entfernen. Depending on the use of the separated cellulosic fraction, the washing process may be modified, for example, prior to washing with 75% formic acid to remove adherent lignin residues.

Die flüssige Phase der Suspension enthält nach Separation der Cellulosefraktion neben der Ameisensäure das Lignin. Die Ameisensäure wird zur Rückgewinnung mittels Destillation bei ca. 120°C abgetrennt. Der Sudrückstand (ca. 300 ml) birgt einen Ligninanteil von ca. 19%, bezogen auf die Strohtrockensubstanz, der nach Zugabe von 1,2 Liter destilliertem Wasser ausgefällt und mittels Zentrifugation (ca. 10 Minuten bei 15.000 g) separiert wird. Je nach Verwendung des separierten Lignins erfolgt die Trocknung nach den bekannten Verfahren der Technik.After separation of the cellulose fraction, the liquid phase of the suspension contains lignin in addition to formic acid. The formic acid is separated for recovery by distillation at about 120 ° C. The Sudrückstand (about 300 ml) has a lignin content of about 19%, based on the straw dry substance, which is precipitated after addition of 1.2 liters of distilled water and separated by centrifugation (about 10 minutes at 15,000 g). Depending on the use of the separated lignin, the drying takes place according to the known methods of the art.

Eine Analyse des mittels Gefriertrocknung gewonnenen Strohlignins zeigt Unterschiede in seiner Struktur, verglichen mit dem sog. Kraftlignin aus der Zellstoffindustrie oder mit Lignin, welches aus Lignocellulose mittels des Organosolv-Verfahrens gewonnen wurde: Funktionelle Gruppen [mol/100 g Lignin] Kraft-Lignin (Handelsprodukt „Indulin AT”) Organocell-Lignin Weizenstrohlignin (Aufschluss mittels Ameisensäure – NPL) Carboxygruppe 0,2 0,12 0,22 Carbonylgruppe 0,06 Nicht nachweisbar 0,22 Methoxygruppen 0,42 0,44 0,26 Hydroxygruppe phenolisch 0,32 0,36 0,18 Hydroxygruppe aliphatisch 0,36 0,26 0,40 An analysis of the freeze-dried straw product shows differences in its structure compared with the so-called Kraft lignin from the pulp industry or with lignin, which was obtained from lignocellulose by the Organosolv method: Functional groups [mol / 100 g lignin] Kraft lignin (commercial product "Indulin AT") Organocell lignin Wheat strawignin (digestion by means of formic acid - NPL) carboxy 0.2 0.12 0.22 carbonyl 0.06 Not detectable 0.22 methoxy 0.42 0.44 0.26 Hydroxy group phenolic 0.32 0.36 0.18 Hydroxy group aliphatic 0.36 0.26 0.40

Erwartungsgemäß ist der Anteil an Carbonylgruppen im NPL am höchsten. Im Gegensatz dazu gibt es einen vergleichbar geringen Anteil an Methoxygruppen. Die Partikelgröße des NPL reicht von 0,4 μm bis 200 μm. Geruchsaktive Substanzen des NPL sind 2,5-bis--(trimethylsilyl)-oxy-Benzaldehyd, Heptanal und Cyclodecan.As expected, the proportion of carbonyl groups in the NPL is highest. In contrast, there is a comparably low proportion of methoxy groups. The particle size of the NPL ranges from 0.4 μm to 200 μm. Odor-active substances of NPL are 2,5-bis- (trimethylsilyl) -oxy-benzaldehyde, heptanal and cyclodecane.

Das wie oben beschrieben erhaltene Lignin enthält noch Bestandteile an teilabgebauten Zuckern sowie Ameisensäure. Zur Vorbereitung der analytischen Untersuchungen (GC-MS, GC-MS-Olfaktometrie, Nasschemie) wurde deshalb ein zusätzlicher Präparationsschritt – die Dialyse – eingefügt.The lignin obtained as described above still contains constituents of partially degraded sugars as well as formic acid. For preparation of the analytical examinations (GC-MS, GC-MS-olfactometry, wet chemistry), an additional preparation step - dialysis - was added.

Beispiel 2: Verzuckerung von Cellulose-Pulpe aus WeizenstrohExample 2: Saccharification of cellulose pulp from wheat straw

Mit der Verzuckerung wird das Ziel verfolgt, die Effektivität des Lignocelluloseaufschlusses und die Abbauleistung des Penicillium verruculosum-Enzymkomplexes hinsichtlich des Einsatzes im späteren SSF beurteilen zu können. Als Kontrolle dient ein Ansatz mit unvorbehandeltem Stroh. Im Labormaßstab wird Cellulosepulpe aus Weizenstroh – aufgeschlossen wie im Beispiel 1 beschrieben – mit P. verruculosum-Cellulase bei unterschiedlichen pH-Werten und mit unterschiedlichen Ethanolzusätzen verzuckert. Der P. verruculosum-Enzymkomplex stammt aus einer Fermentation des Stammes DSM 8069 auf Basis von Cellulose/Weizenkleie als Substrat und Induktor.The purpose of the saccharification is to be able to assess the effectiveness of the lignocellulosic digestion and the degradation efficiency of the Penicillium verruculosum enzyme complex with respect to the use in the later SSF. The control is a batch of untreated straw. On a laboratory scale, cellulose pulp from wheat straw - digested as described in Example 1 - is saccharified with P. verruculosum cellulase at different pH values and with different ethanol additions. The P. verruculosum enzyme complex originates from a fermentation of the strain DSM 8069 based on cellulose / wheat bran as substrate and inducer.

Der pH-Wert des Verzuckerungsprozesses wird im Bereich von 4,0–6,0 variiert. Es wird ein Vergleich des Verzuckerungsprozesses mit einer Trichoderma reesei-Cellulase aus dem Produktionsstamm DSM 7538 der Anmelderin durchgeführt. Die Hydrolysatzusammensetzung wird mittels HPLC bestimmt.The pH of the saccharification process is varied in the range of 4.0-6.0. A comparison of the saccharification process with a Trichoderma reesei cellulase from the production strain DSM 7538 of the Applicant is carried out. The hydrolyzate composition is determined by HPLC.

Die Ansatzgrößen sind wie folgt: Gesamtvolumen 50 ml Vorbehandeltes Stroh (bezogen auf Trockenmasse) 2% (w/v), 1 g Enzym 15 IU/g Stroh, ≡ 0,3 IU/mL Inkubationszeit (Schüttelwasserbad) 68 Stunden Temperatur 37°C Natriumazid (NaN3) 0,02% (w/v), 10 mg in 500 μL The batch sizes are as follows: total volume 50 ml Pre-treated straw (based on dry matter) 2% (w / v), 1 g enzyme 15 IU / g straw, ≡ 0.3 IU / mL Incubation period (shaking water bath) 68 hours temperature 37 ° C Sodium azide (NaN 3 ) 0.02% (w / v), 10 mg in 500 μL

Die Einstellung des pH-Wertes erfolgt mit Natronlauge bzw. mit Salzsäure. Der Zusatz von antimikrobiell wirkendem Natriumazid erlaubt eine unsterile Arbeitsweise. Ein negativer Einfluss von Natriumazid auf die Enzymaktivität ist nicht gegeben.The adjustment of the pH value is carried out with sodium hydroxide solution or with hydrochloric acid. The addition of antimicrobial sodium azide allows an unsterile operation. A negative influence of sodium azide on the enzyme activity is not given.

Es ergeben sich folgende Abbauraten: Cellulosepulpe aus dem Stroh UB Stroh Enzymkomplex pH = 4,0 pH = 5,0 pH = 6,0 pH = 6,0 P. verruculosum (DSM 8069) 72,6% 70,5% 87,8% 27,2% [a] 44,4% [b] T. reesei (DSM 7538) 59,7% 62,3% 74,0% 16,8% [a] 27,5% [b] [a] bezogen auf die Gesamtmenge 1 g unvorbehandeltes Stroh (UB)
[b] bezogen auf den solubilisierbaren Anteil des UB (~62,2%) Zusammensetzung des Hydrolysates: Prozentualer Anteil der einzelnen Zucker im Hydrolysat in Abhängigkeit vom pH-Wert Enzym pH Glucose Cellobiose Xylose Arabinose P. verrucul. (DSM 8069) pH = 4,0 63,8 0,0 8,8 0,4 pH = 5,0 64,0 0,5 5,7 0,4 pH = 6,0 72,2 0,0 15,3 0,4 UB Stroh 18,3 10,9 14,3 0,0 T. reesei (DSM 7538) pH = 4,0 42,8 3,1 11,6 2,3 pH = 5,0 35,3 10,7 15,0 1,2 pH = 6,0 48,0 14,3 10,3 1,3 UB Stroh 9,8 0,0 17,2 0,0 The following decomposition rates result: Cellulose pulp from the straw UB straw enzyme complex pH = 4.0 pH = 5.0 pH = 6.0 pH = 6.0 P. verruculosum (DSM 8069) 72.6% 70.5% 87.8% 27.2% [a] 44.4% [b] T. reesei (DSM 7538) 59.7% 62.3% 74.0% 16.8% [a] 27.5% [b] [a] based on the total amount 1 g untreated straw (UB)
[b] Based on the solubilisable portion of the UB (~ 62.2%) Composition of the hydrolyzate: Percentage of the individual sugars in the hydrolyzate as a function of the pH enzyme pH glucose cellobiose xylose arabinose P. verrucul. (DSM 8069) pH = 4.0 63.8 0.0 8.8 0.4 pH = 5.0 64.0 0.5 5.7 0.4 pH = 6.0 72.2 0.0 15.3 0.4 UB straw 18.3 10.9 14.3 0.0 T. reesei (DSM 7538) pH = 4.0 42.8 3.1 11.6 2.3 pH = 5.0 35.3 10.7 15.0 1.2 pH = 6.0 48.0 14.3 10.3 1.3 UB straw 9.8 0.0 17.2 0.0

Eine grafische Darstellung der Zusammensetzung der Hydrolysate ist in gegeben. Die in der eingefügte Prozentangabe entspricht dem Glucoseanteil im Hydrolysat – linke Seite der Darstellung mit P. verruculosum-Enzymkomplex, rechte Seite mit T. reesei-Enzymkomplex; bei unvorbehandeltem Stroh (UB) bezieht sich die Prozentangabe auf den solubilisierbaren Anteil (62%).A graphic representation of the composition of the hydrolysates is in given. The in the inserted percentage corresponds to the glucose content in the hydrolyzate - left side of the representation with P. verruculosum enzyme complex, right side with T. reesei enzyme complex; for untreated straw (UB) the percentage refers to the solubilisable portion (62%).

Der Gesamthydrolysegrad der Cellulosepulpe mit dem P. verruculosum-Enzymkomplex liegt im Bereich von 70 bis 88% (Tabelle). Mit abnehmendem pH-Wert reduziert sich der Hydrolysegrad deutlich. Ein ähnlicher Trend ist beim T. reesei-Enzymkomplex sichtbar. Der maximale Hydrolysegrad wird auch mit T. reesei-Cellulase bei pH = 6,0 erreicht, allerdings nur mit einer Ausbeute von 74% und somit deutlich geringer als bei P. verruculosum. Der Ansatz mit unvorbehandeltem Stroh erbringt einen Hydrolysegrad von 27,2% bzw. 16,8% bezogen auf die Gesamtmenge. Unter Berücksichtigung des solubilisierbaren Anteils des nicht vorbehandelten Strohs (ca. 62%) beträgt hier die Ausbeute 44,4% bzw. 27,5% und unterstreicht damit die Notwendigkeit einer Vorbehandlung.The overall degree of hydrolysis of the cellulose pulp with the P. verruculosum enzyme complex is in the range of 70 to 88% (Table). As the pH decreases, the degree of hydrolysis is significantly reduced. A similar trend is visible in the T. reesei enzyme complex. The maximum degree of hydrolysis is also achieved with T. reesei cellulase at pH = 6.0, but only with a yield of 74% and thus significantly lower than in P. verruculosum. The untreated straw batch gives a degree of hydrolysis of 27.2% and 16.8%, respectively, based on the total amount. Taking into account the solubilisable portion of the untreated straw (about 62%), the yield is 44.4% and 27.5% respectively, thus emphasizing the need for pretreatment.

Beispiel 3: Einfluss von Ethanol und Ligninkomponenten auf den P. verruculosum-Enzymkomplex Example 3: Influence of ethanol and lignin components on the P. verruculosum enzyme complex

Einfluss von Ethanol auf den P. verruculosum-CellulasekomplexInfluence of ethanol on the P. verruculosum cellulase complex

Es wird der Abbau von mikrokristalliner Cellulose (MKC) bei unterschiedlichen Ethanolkonzentrationen untersucht. Ansatz: – Gesamtvolumen (Citratpuffer pH 5,5 + Ethanol) 100 ml – Substrat 10 g MKC – Ethanolkonzentration: 5%, 10%, 15% (v/v) – Enzymeinsatz: 5 IU/mL (Filterpapieraktivität) – Temperatur 30°C Enzymaktivitäten (IU/mL und prozentual zur Ausgangsaktivität) und freigesetzter Zucker (g)* Ethanol Inkubationszeit [h]: (v/v) 0 3 6 24 48 5% 5,00 100% 5,00 100% 5,01 100% 4,99 100% 4,80 96% red. Zucker: 1,29 1,71 3,05 4,09 10% 5,00 100% 5,15 103% 5,44 109% 4,25 85% 4,19 84% red. Zucker: 0,92 1,30 2,46 3,37 15% 5,00 100% 5,17 103% 4,92 98% 4,96 99% 4,82 96% red. Zucker: 0,68 0,89 2,43 3,57 0% (Kontrolle) 5,00 100% 5,36 107% 5,65 113% 4,80 96% 4,76 95% red. Zucker: 1,81 2,16 3,55 4,49 * gemessen als reduzierend Zucker The degradation of microcrystalline cellulose (MKC) at different ethanol concentrations is investigated. Approach: Total volume (citrate buffer pH 5.5 + ethanol) 100 ml - Substrate 10g MKC Ethanol concentration: 5%, 10%, 15% (v / v) - Enzyme use: 5 IU / mL (filter paper activity) - temperature 30 ° C Enzyme activities (IU / mL and% of initial activity) and released sugar (g) * ethanol Incubation time [h]: (V / v) 0 3 6 24 48 5% 5.00 100% 5.00 100% 5.01 100% 4.99 100% 4.80 96% red. Sugar: 1.29 1.71 3.05 4.09 10% 5.00 100% 5.15 103% 5.44 109% 4.25 85% 4.19 84% red. Sugar: 0.92 1.30 2.46 3.37 15% 5.00 100% 5.17 103% 4.92 98% 4.96 99% 4.82 96% red. Sugar: 0.68 0.89 2.43 3.57 0% (control) 5.00 100% 5.36 107% 5.65 113% 4.80 96% 4.76 95% red. Sugar: 1.81 2.16 3.55 4.49 * measured as reducing sugar

Die erhaltene Enzymaktivität nach 48 h Inkubation beträgt gegenüber der Kontrolle ohne Ethanolzusatz mindestens 85%, die Abbauleistung mindestens 80%.The enzyme activity obtained after 48 h incubation is at least 85% compared to the control without ethanol addition, the degradation at least 80%.

Einfluss von Lignin auf den P. verruculosum-CellulasekomplexInfluence of lignin on the P. verruculosum cellulase complex

Die Ermittlung zum Einfluss von Lignin auf die Enzymaktivität erfolgt durch Inkubation des Enzyms mit Lignin im Vergleich mit einer Kontrolle ohne Lignin im Inkubationsansatz. Zur Realisierung eines Substratüberschusses wird der Enzymkomplex auf ca. 2 IU/ml Filterpapieraktivität eingestellt und mit 30 g/L Lignin (Kraftlignin INDULIN-AT) bei 35°C 5 min bzw. 30 min inkubiert. Die Auswertung erfolgte an Hand der Differenz der gemessenen Enzymaktivitäten. Gemessene Werte zur Adsorption/Inhibierung von P. verruculosum-Cellulase an Lignin: Cellulase FPA [IU/ml] Endoglucanase AZO-CMC-aktivität [U/ml] Zeit Kontrolle Inkubationswert Kontrolle Inkubationswert 5 min 2,4 2,5 6,4 6,8 30 min 2,4 2,7 6,4 7,4 The determination of the influence of lignin on the enzyme activity is carried out by incubation of the enzyme with lignin in comparison with a control without lignin in the incubation. To realize a substrate excess of the enzyme complex is adjusted to about 2 IU / ml filter paper activity and incubated with 30 g / L lignin (Kraft lignin INDULIN-AT) at 35 ° C for 5 min or 30 min. The evaluation was based on the difference of the measured enzyme activities. Measured values for adsorption / inhibition of P. verruculosum cellulase on lignin: Cellulase FPA [IU / ml] Endoglucanase AZO-CMC activity [U / ml] Time control Inkubationswert control Inkubationswert 5 min 2.4 2.5 6.4 6.8 30 min 2.4 2.7 6.4 7.4

Die Werte belegen, dass kein signifikanter Einfluss des Lignins auf die Cellulaseaktivität besteht. Beispiel 4: SSF-Prozess im Labormaßstab Substrat: Kohlenhydratfraktion wie im Beispiel 1; 10% (w/v), bezogen auf das Stroh Hefe: Kluyveromyces marxianus; Enzym: P. verruculosum-Cellulase; 1,5 IU/ml (FPU – Filterpapieraktivität) pH = 5,0; Temperatur der Fermentation im SSF-Prozess: 37°C The data show that there is no significant effect of lignin on cellulase activity. Example 4: SSF process on a laboratory scale substrate: Carbohydrate fraction as in Example 1; 10% (w / v), based on the straw Yeast: Kluyveromyces marxianus; Enzyme: P. verruculosum cellulase; 1.5 IU / ml (FPU - filter paper activity) pH = 5.0; Temperature of the fermentation in the SSF process: 37 ° C

Für die SSF-Fermentation dient ein 2-Liter-BRAUN-Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 1 Liter. Die Temperierung, sowie die pH- und Schaumregelung erfolgen automatisch über die DCU des Bioreaktors. Als Korrekturmittel zur pH-Regelung dienen 15%-ige Schwefelsäure bzw. 15%-ige Natriumhydroxidlösung; zur Schaumbekämpfung dient eine handelsübliche Antischaumemulsion.For the SSF fermentation, a 2-liter BRAUN bioreactor with a working volume of 1 liter is used. The temperature control, as well as the pH and foam control are carried out automatically via the DCU of the bioreactor. 15% sulfuric acid and 15% sodium hydroxide solution are used as correction agents for pH control; Foam control is a commercially available antifoam emulsion.

Die in Leitungswasser gelösten Salze (3,0 g/L NH4)2SO4; 0,3 g/L MgSO4·7H2O; 2,0 g/L KH2PO4) sowie die Schlempe (Roggendünnschlempe, 25%, v/v) werden zusammen mit dem Substrat im Bioreaktor für 35 Minuten bei 121°C autoklaviert. Vor der sterilen Zugabe der Enzymlösung und des Inokulums (24 Stunden Kultivierung in Dünnschlempe bei 30°C; 10% (v/v)) wird das Fermentationsmedium für mehrere Minuten gründlich mit Stickstoff gespült um die anaeroben Bedingungen einzustellen.The salts dissolved in tap water (3.0 g / L NH 4 ) 2 SO 4 ; 0.3 g / L MgSO 4 .7H 2 O; 2.0 g / L KH 2 PO 4 ) and the vinasse (rye slime, 25%, v / v) are autoclaved together with the substrate in the bioreactor for 35 minutes at 121 ° C. Prior to the sterile addition of the enzyme solution and inoculum (24 hours cultivation in thin still at 30 ° C, 10% (v / v)), the fermentation medium is thoroughly purged with nitrogen for several minutes to adjust the anaerobic conditions.

Das gebildete Kohlendioxid (Abgas) wird in eine gesättigte Calciumhydroxidlösung eingeleitet. Die Probenahme erfolgt unter Anlegen von Stickstoff (Überdruck) etwa alle 24 Stunden. Die Hydrolysatzusammensetzung und der Ethanolgehalt werden mittels HPLC bestimmt. Messwerte des SSF-Prozesses im Labormaßstab: Zeit [h] 22 45 69 Xylose [g/L] 1,71 2,77 2,24 Glucose [g/L] 3,13 1,32 0,26 Cellobiose [g/L] 0,00 0,00 2,12 Ethanol [g/L] 21,6 25,6 28,2 Glycerol [g/L] 3,04 3,44 2,92 FPA [IU/mL] n. n. 0,85 0,93 The formed carbon dioxide (exhaust gas) is introduced into a saturated calcium hydroxide solution. Sampling takes place under nitrogen (overpressure) approximately every 24 hours. The hydrolyzate composition and the ethanol content are determined by HPLC. Measured values of the SSF process on a laboratory scale: Time [h] 22 45 69 Xylose [g / L] 1.71 2.77 2.24 Glucose [g / L] 3.13 1.32 0.26 Cellobiose [g / L] 0.00 0.00 2.12 Ethanol [g / L] 21.6 25.6 28.2 Glycerol [g / L] 3.04 3.44 2.92 FPA [IU / mL] nn 0.85 0.93

Insgesamt wird eine Ethanolausbeute von 65% erreicht, wobei die hauptsächliche Ethanolmenge bereits in den ersten 22 Stunden gebildet wird. Simultan zur Ethanolbildung findet die Glycerolbildung statt, die etwa einem Zehntel der produzierten Ethanolmenge entspricht. Bedingt durch die enzymatische Hydrolyse erfolgt eine Anreicherung von Xylose, welche in der stationären Phase (nach ca. 45 Stunden nach Fermentationsbeginn) verstoffwechselt wird.Overall, an ethanol yield of 65% is achieved, with the main amount of ethanol already being formed in the first 22 hours. Simultaneously with the formation of ethanol, glycerol formation takes place, which corresponds to about one tenth of the amount of ethanol produced. Due to the enzymatic hydrolysis, an enrichment of xylose occurs, which is metabolized in the stationary phase (after about 45 hours after the start of fermentation).

Beispiel 5: Stabilisierung des Enzyms durch Zusatz von ProteinenExample 5: Stabilization of the enzyme by addition of proteins

Der P. verruculosum-Enzymkomplex wird einer aeroben und einer anaeroben Fermentation mit der Hefe K. marxianus im Bioreaktor zugegeben. Die Erhaltung der Enzymaktivität wird auf Medien mit und ohne Zusatz externer Proteinquellen verglichen: Inkubation im Bioreaktor: Temperatur 37°C; Rührer 90 rpm; pH = 5,0; FPA = 1,0 IU/mL Zeit [h] FPA [IU/mL] aerob: Hefe + Enzym + Hefeextrakt/Pepton 144 1,06 Hefe + Enzym 144 0,00 anaerob: Hefe + Enzym + Hefeextrakt/Pepton 144 0,95 Hefe + Enzym 144 0,00 Hefe + Enzym + Schlempe 93 0,85 The P. verruculosum enzyme complex is added to an aerobic and an anaerobic fermentation with the yeast K. marxianus in the bioreactor. The preservation of the enzyme activity is compared to media with and without the addition of external protein sources: Incubation in the bioreactor: temperature 37 ° C .; Stirrer 90 rpm; pH = 5.0; FPA = 1.0 IU / mL Time [h] FPA [IU / mL] aerobic: Yeast + enzyme + yeast extract / peptone 144 1.06 Yeast + enzyme 144 0.00 anaerobic: Yeast + enzyme + yeast extract / peptone 144 0.95 Yeast + enzyme 144 0.00 Yeast + enzyme + vinasse 93 0.85

Beispiel 6: Gewinnung des P. verruculosum-CellulasekomplexesExample 6: Obtaining the P. verruculosum cellulase complex

Der Pilz P. verruculosum-M28-10b = DSM 24317 welcher aus der Mutante P. verruculosum-DSM 8069 selektiert wurde, wird für die Gewinnung des Cellulase-/Xylanase-Komplexes gemäß den allgemein bekannten Fermentationstechniken unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen kultiviert.The fungus P. verruculosum-M28-10b = DSM 24317, which was selected from the mutant P. verruculosum DSM 8069, is cultured for the recovery of the cellulase / xylanase complex according to well-known fermentation techniques under the conditions described below.

Die Fermentation wird in einem Rührfermenter mit einem Bruttovolumen von 40 Litern unter Ausschluss einer Sauerstofflimitation durchgeführt.The fermentation is carried out in a stirred fermenter with a gross volume of 40 liters, excluding oxygen limitation.

Vorkultur:preculture:

Für die Vorkultur wird ein variiertes Mandelsmedium verwendet: [g L–1] KH2PO4 15; (NH4)2SO4 4,8; CaCl2 0,3; MgSO4 × 7H2O 0,3; Harnstoff 0,3; Pepton 1,5; Glucose 20.For the preculture, a varied almond medium is used: [g L -1 ] KH 2 PO 4 15; (NH 4 ) 2 SO 4 4.8; CaCl 2 0.3; MgSO 4 × 7H 2 O 0.3; Urea 0.3; Peptone 1.5; Glucose 20.

Die Komponenten werden in destilliertes Wasser (AD) mit einem Anteil von 10% Leitungswasser (LW) eingebracht. Damit wird die Versorgung mit Spurensalzen ausreichend gesichert. Anorganische und organische Bestandteile werden getrennt bei 121°C für 20 min sterilisiert. Die Beimpfung erfolgt mit 1 × 107 bis ca. 5 × 107 Konidien je Liter. Die Kultivierungszeit beträgt bei Verwendung von unbewehrten 500 ml Erlenmeyer-kben mit einem Arbeitsvolumen von 100 ml ca. 24–36 h auf einer Rotationsschüttebank bei 120 rpm und 30°C.The components are placed in distilled water (AD) containing 10% tap water (LW). Thus, the supply of trace salts is sufficiently secured. Inorganic and organic components are sterilized separately at 121 ° C for 20 min. The inoculation takes place with 1 × 10 7 to about 5 × 10 7 conidia per liter. The cultivation time is when using unreinforced 500 ml Erlenmeyer kben with a working volume of 100 ml for about 24-36 h on a rotary chute bank at 120 rpm and 30 ° C.

Fed batch-Fermentation im 40-Liter-BioreaktorFed batch fermentation in 40-liter bioreactor

Das Grundmedium setzt sich zusammen aus [g L–1] KH2PO4 3; (NH4)2SO4 4,8; CaCl2 0,4; MgSO4 × 7H2O 0,4; Weizenkleie 20; mikrokristalline Cellulose 20 und Glucose 5. Das Medium wird nach Aufbereitung mit LW bei 121°C für 20 min sterilisiert. Das Arbeitsvolumen zu Beginn der Fermentation beträgt 20 Liter. Nach Beimpfung mit der Vorkultur (4% v/v des Arbeitsvolumens) wird die Fermentation unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 30°C; pH 5,0; pO2 25%; qG 0,4 vvm; nStart 15% von nmaximal. Die Fermentationsdauer beträgt ca. 7 Tage.The basic medium is composed of [g L -1 ] KH 2 PO 4 3; (NH 4 ) 2 SO 4 4.8; CaCl 2 0.4; MgSO 4 × 7H 2 O 0.4; Wheat bran 20; microcrystalline cellulose 20 and glucose 5. The medium is sterilized after treatment with LW at 121 ° C for 20 min. The working volume at the beginning of the fermentation is 20 liters. After inoculation with the preculture (4% v / v of the working volume), the fermentation is carried out under the following conditions: 30 ° C; pH 5.0; pO 2 25%; q G 0.4 vvm; n start 15% of n maximum . The fermentation time is about 7 days.

Nach Abschluss der batch-Phase (die Konzentration reduzierender Substanzen ist nach ca. 36 h auf nahezu 0 g L–1 abgesunken) wird eine mehrmalige manuelle Cellulosenachdosierung (0,3% MKC bezogen auf das Arbeitsvolumen) im Zeitabstand von 15 h vorgenommen. Die MKC-Menge im Nachführmedium wird im Verhältnis 1:6 in wässrigem Weizenkleieextrakt (aus 15 g L–1 Weizenkleie in LW) suspendiert und vor der Nachführung für 20 min autoklaviert.After completion of the batch phase (the concentration of reducing substances has dropped to almost 0 g L -1 after about 36 h), a repeated manual cellulose dosing (0.3% MKC based on the working volume) is carried out at intervals of 15 h. The amount of MKC in the follower medium is suspended in a ratio of 1: 6 in aqueous wheat bran extract (from 15 g L -1 wheat bran in LW) and autoclaved for 20 min before the follow-up.

In der fed batch-Phase erfolgen insgesamt 8 Nachführungen von Cellulose. Nach der Fermentationszeit von ca. 7 Tagen setzt sich der extrazellulär gebildete Enzymkomplex wie folgt zusammen: Gesamtprotein (nach Lowry et al. ) 13 g L–1, Xylanase 824 IU ml–1, Endoglucanase (Azo-CMC) 12 U ml–1, Cellulase (FPA) 5 IU ml–1 und β-Glucosidase 131 IU m–1.In the fed batch phase, a total of 8 readjustments of cellulose take place. After the fermentation time of about 7 days, the extracellularly formed enzyme complex is composed as follows: total protein (according to Lowry et al. ) 13 g L -1 , xylanase 824 IU ml -1 , endoglucanase (azo-CMC) 12 U ml -1 , cellulase (FPA) 5 IU ml -1 and β-glucosidase 131 IU m -1 .

Aufarbeitung mittels Feststoffseparation sowie Querstrom-Mikro- und -UltrafiltrationWork-up by means of solids separation as well as cross-flow micro- and ultrafiltration

Alle Aufarbeitungsschritte sind bei einer Temperatur von maximal 11°C durchzuführen.All work-up steps must be carried out at a maximum temperature of 11 ° C.

Nach Ernte des Kulturmediums erfolgt die Abtrennung der Feststoffe mittels Zentrifugation bei ca. 5800 g und 6°C für 10 min. Durch die Anwendung einer Querstrom-Mikrofiltration mit einer Ausschlussgrenze von 0,2–0,45 μm werden Verunreinigungen und kolloidal gelöste Partikel aus dem Überstand entfernt. Die anschließende Ultrafiltration (Ausschlussgrenze = 10 kDa) des Mikrofiltrates dient der Aufkonzentrierung des Enzymkomplexes.After harvesting the culture medium, the separation of the solids by centrifugation at about 5800 g and 6 ° C for 10 min. By using a cross-flow microfiltration with an exclusion limit of 0.2-0.45 microns impurities and colloidally dissolved particles are removed from the supernatant. The subsequent ultrafiltration (exclusion limit = 10 kDa) of the microfiltrate serves to concentrate the enzyme complex.

Es resultieren die folgenden Enzymaktivitäten im Konzentrat der Ultrafiltration: Gesamtprotein (nach Lowry et al. ) 161 g L–1, Xylanase 11.812 IU m–1, Endoglucanase (Azo-CMC) 256 U ml–1, Cellulase (FPA) 64 IU ml–1 und β-Glucosidase 2.227 IU ml–1.This results in the following enzyme activities in the concentrate of ultrafiltration: total protein (after Lowry et al. ) 161 g L -1 , xylanase 11.812 IU m -1 , endoglucanase (azo-CMC) 256 U ml -1 , cellulase (FPA) 64 IU ml -1 and β-glucosidase 2.227 IU ml -1 .

Zeichenerklärung: Explanations:

AD_Aqua dest.; Azo-CMC_Azo-Carboxymethylcellulose; DIP-Stoff_Deinked Pulp; FPA_Filterpapieraktivität; h_Stunde; kDa_Kilodalton; LW_Leitungswasser; min_Minute; MKC_Mikrokristalline Cellulose; n_Rührerdrehzahl; qG_ auf das Arbeitsvolumen bezogene spezifische Belüftungsrate; rpm_rounds per minute.AD_Aqua dest .; Azo CMC_Azo carboxymethylcellulose; DIP Cloth_Deinked Pulp; FPA_Filterpapieraktivität; h_Stunde; kDa_Kilodalton; LW_Leitungswasser; min_Minute; MKC_Microcrystalline cellulose; n_Rührerdrehzahl; q G_ specific ventilation rate related to the working volume; rpm_rounds per minute.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

  • Lowry et al. [0042] Lowry et al. [0042]
  • Lowry et al. [0045] Lowry et al. [0045]

Claims (8)

Verfahren zur biotechnischen Verwertung von Lignocellulose-Rohstoffen, bei dem Kohlenhydratkomponenten in Alkohol umgesetzt und Ligninkomponenten einer stofflichen Weiterverarbeitung zugeführt werden können, dadurch gekennzeichnet, dass a) Lignocellulose-Rohstoff mittels Ameisensäure/Wasserstoffperoxid aufgeschlossen wird und Ligninkomponenten überwiegend in die Ameisensäurephase übergehen, b) nach erfolgter Abtrennung der Kohlenhydratkomponenten diese mittels Enzymkomplexen von Pilzmutanten Penicillium verruculosum-DSM 8069 oder Penicillium verruculosum-DSM 8070 oder der aus diesen Pilzmutanten isolierten Enzymbildner P. veruculosum-M28-10b = DSM 24317, in einem Prozess simultaner Verzuckerung und Vergärung in monomere oder oligomere Zucker hydrolysiert wird, die teilweise oder vollständig mit Mikroorganismen zu Alkohol vergoren werden, c) die Ligninkomponenten aus der Ameisensäurefraktion mittels Wasser ausgefällt und einer stofflichen Nutzung zugeführt werden.A process for the biotechnological utilization of lignocellulosic raw materials, in which carbohydrate components are converted into alcohol and lignin components of a material processing can be supplied, characterized in that a) lignocellulose raw material is digested by formic acid / hydrogen peroxide and lignin predominantly go into the formic acid phase, b) after Successful separation of the carbohydrate components of these by means of enzyme complexes of mutant fungi Penicillium verruculosum DSM 8069 or Penicillium verruculosum DSM 8070 or isolated from these mutant fungus mutants P. veruculosum M28-10b = DSM 24317, in a process of simultaneous saccharification and fermentation into monomeric or oligomeric sugars hydrolyzed, which are partially or completely fermented with microorganisms to alcohol, c) the lignin components are precipitated from the formic acid fraction by means of water and fed to a material use. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Lignocellulose-Rohstoff Getreidestroh ist.A method according to claim 1, characterized in that the lignocellulosic raw material is cereal straw. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Mikroorganismen Hefen sind.A method according to claim 1 to 2, characterized in that the microorganisms used are yeasts. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der gewonnene Alkohol Ethanol ist.A method according to claim 1 to 3, characterized in that the recovered alcohol is ethanol. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Ameisensäure aus der wässrigen Ameisensäurefraktion nach Abtrennung der Ligninkomponenten mittels Destillation zurück gewonnen wird.A method according to claim 1 to 4, characterized in that the formic acid is recovered from the aqueous formic acid fraction after separation of the lignin components by distillation. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die abgetrennten Ligninkomponenten einer stofflichen Verwertung zugeführt werden.A method according to claim 1 to 5, characterized in that the separated lignin components are recycled. Penicillium verruculosum-M28-10b = DSM 24317Penicillium verruculosum M28-10b = DSM 24317 Verwendung der Pilzstämme P. verruculosum DSM 8069, Penicillium verruculosum 8070, Penicillium verruculosum-M28-10b = DSM 24317 zur biotechnischen Verwertung von Lignocellulose-Rohstoffen.Use of the fungus strains P. verruculosum DSM 8069, Penicillium verruculosum 8070, Penicillium verruculosum-M28-10b = DSM 24317 for the biotechnical utilization of lignocellulosic raw materials.
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EP2573259A1 (en) * 2011-09-23 2013-03-27 Chempolis Oy Pretreatment method for producing water-soluble sugars from lignocellulosic material
CN111393670A (en) * 2020-03-26 2020-07-10 齐鲁工业大学 Method for efficiently extracting and separating active lignin

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