JPS6363197B2

JPS6363197B2 -

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Publication number: JPS6363197B2
Application number: JP58185A
Authority: JP
Priority date: 1985-01-07
Filing date: 1985-01-07
Publication date: 1988-12-06
Also published as: JPS61162177A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明は、トルナフテートに対し耐性をもつア
クレモニウム・セルロリテイカスTN
（Acremonium cellulolyticus TN）株によるセ
ルラーゼの製造方法に関するものである。〔従来技術〕セルラーゼはセルロースをグルコース、セロビ
オースやセロオリゴ糖に加水分解する酵素反応系
を触媒する酵素群の総称であり、その作用株式に
よりC₁酵素（アビセラーゼ、セロビオヒドロラ
ーゼ、FPアーゼ、エキソ−β−グルカナーゼな
どともいう）、Cx酵素（CMCアーゼ、エンド−
β−グルカナーゼともいう）とβ−グルコシダー
ゼ（セロビアーゼともいう）など種々の名称で呼
ばれる酵素が存在する。セルラーゼはこれら複数
の酵素が調和のとれた相互作用をすることにより
セルロースを最終的にその構成糖であるグルコー
スにまで分解する。近年、セルラーゼはバイオマス資源の有効利用
の観点から注目され、盛んに研究されているが、
従来、よく研究されてきた、トルコデルマ・レー
ゼイ（Trichoderma reesei）、トルコデルマ・ビ
リデ（Trichoderma viride）やアスペルギルス
（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）
属などの微生物によるセルラーゼの生産は、その
生産能力が充分でなく、また、セルラーゼ自体の
分解力も充分でないため、セルロースを完全にグ
ルコースまで分解することができず、セロビオー
スやセロオリゴ糖を多量に生成残存するなどの問
題があつた。本発明者らは、先に結晶性セルロースに対する
分解力が優れ、且つグルコースの糖化能力の優れ
たセルラーゼ生産菌を求めて、広く自然界から微
生物の検索を行つてきた結果、土壌中より分離
し、アクレモニウム・セルロリテイカス
（Acremonium cellulolyticus）と同定した糸状
菌の生産するセルラーゼが、結晶性セルロースに
対する分解力が強いこと、またこの酵素はβ−グ
ルコシダーゼ活性が、従来よく知られているセル
ラーゼ生産菌に比べ著しく強いため、セルロース
を、殆んど完全にグルコースにまで分解できる、
極めて糖化性の優れた酵素であることを認め、特
許出願した（特許出願番号昭58−38432）。〔目的〕更に、この微生物によるセルラーゼの生産能を
高めるため、本微生物に改良について種々検討を
加えてきた結果、トルナフテート｛Tolnaftate
（ｍ、Ｎ−Dimethyl thiocarbanilic acid ０−２
−naphthylester）｝に対して耐性を示す突然変異
株（Acremonium cellulolyticus TNと命名）が
セルラーゼ生産能を顕著に増大していることを認
めた。第１表は、Acremonium cellulolyticusの
親株とTN株によるセルラーゼ生産能の一例を示
している。

〔構成〕

本発明は、セルラーゼ生産能の増強されたトル
ナフテート耐性をもつアクレモニウム・セルロリ
テイカス（Acremonium cellulolyticusTN）株
によるセルラーゼの製造方法に関するものであ
る。以下に、本発明の内容を更に具体的に示す。本発明のトルナフテート耐性株は以下のように
して造成される。アクレモニウム・セルロリテイカスＴ
（FERMP−6867）をツアペツク（Czapek）培地
（NaNo₃ 0.3％、K₂HPO₄ 0.1％、MgSO₄・
7H₂O ５×10^-2％、KCl ５×10^-2％、FeSO₄・
7H₂O １×10^-3％、グルコース１％）に懸濁し、
これにNTG（ニトロソグアニジン）を０〜３×
10^-2％濃度となるように加え、室温で0.5〜３時
間インキユベート後、遠心分離して菌体を回収
し、Czapek培地で充分洗滌後、同培地に懸濁し
た。該菌懸濁物の一部を４×10^-2〜２×10^-5％ト
ルナフテートを含むCzapek平板培地（NaNO₃
0.3％、K₂HPO₄ 0.1％、MgSO₄・7H₂O ５×
10^-2％、KCl ５×10^-2％、FeSO₄・7H₂O １×
10^-3％、グルコース１％、寒天1.5％、ストレプ
トマイシン2.5×10^-2％、ペニシリンG2.5×10^-2
％、PH5.6）に散布し、30℃でインキユベートし
た。生育してくるトルナフテート耐性株を上記同
組成の斜面培地に釣菌し保存した。このようにし
て得られたトルナフテート耐性株中に、高頻度で
セルラーゼ生産増強株が認められた。なお、４×
10^-2〜１×10^-2％のトルナフテートを含む
Czapeck平板培地上に親株および耐性株を菌体懸
濁液を散布して、30℃で培養したところ、耐性菌
は比較的良好に生育するが、親株は全く生育が認
められなかつた。本菌の菌学的性質は親株に対して認識できるほ
どの差異は認められないが、以下にTN株の菌学
的性質の概要を記載する。生育：麦芽エキス寒天培地上では生育は速く、
30℃７日で直径70mmに達する。集落は最初白色で
後にやや黄色味をおびる。気生菌糸はゆるく盛り
上がり羊毛状を呈し、時に縄状の菌糸束を形成す
る。培養後期には集落裏面は桃褐色ないし赤褐色
を呈する。ツアペツク寒天培地上でもほぼ同様の
生育を示すが気生菌糸の盛り上がりはより少い。
生育PH範囲は3.5〜6.0で最適PHは４付近、生育温
度範囲は15℃〜43℃で、最適生育温度は30℃付近
である。形態：菌糸の直径は0.5〜2.5μｍ、無色で菌糸
には隔壁が認められる。また、菌糸表面は滑面で
ある。分生子：分生子形成能は非常に不安定でツアペ
ツク寒天および芽麦エキス寒天培地による継代培
養により容易に消失した。分解時における観察で
は、分生子柄は気生菌糸側面より突出し、無色で
ある。分生子は亜球形（2.5〜５×２〜4.5μｍ）
で滑面、無色で連鎖は非常にゆるく分散しやす
い。本菌株はアクレモニウム・セルロリテイカス
（Acremonium cellulolyticus）TN株（微工研条
寄第685号として寄託されている。本菌により生産されるセルラーゼの酵素的性質
を以下に記載する。 (A) アビセラーゼの酵素的性質 (1) 作用セルロース末、アビセル、脱脂綿など結晶
性の高い不溶性セルロースに対し作用してグ
ルコース、セロビオース等の還元糖を生成す
る。 (2) 作用PH範囲及び最適作用PH 本酵素の作用PH範囲は２〜８、最適作用PH
は約4.5に認められた。 (3) 安定PH クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で45℃で20
時間放置したときの安定PH範囲は約3.5〜約
６であつた。 (4) 作用温度範囲及び最適作用温度本酵素は約90℃までの高温に作用するが、
１％アビセル、0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）
の下で10分間反応させたときの最適作用温度
は約65℃に認められた。 (5) 熱安定性本酵素を0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下
で、各温度で10分間加熱処理した結果、本酵
素は約60℃までの温度ではほとんど失活せ
ず、65℃、10分間の加熱で約50％、そして70
℃、10分間の加熱で約80％失活した。 (6) 阻害剤各種重金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水
銀イオンおよび銅イオンにより強く阻害され
る。また、SH阻害剤であるパラクロルマー
キユリーベンゾエイトによつても１ｍＭで80
％の阻害を受ける。 (7) 精製法本酵素は培養濾液からホロフアイバー（ア
ミコンHI−P5）により脱塩濃縮してのち、
DEAE−セフアロース（CL−6B）によるカ
ラムクロマトグラフイー（NaCl ０→1Mグ
ラジエント）と同カラムによる再クロマトグ
ラフイー（NaCl ０→0.6M）により、より
精製することができる。 (8) 分子量 Bio−gel（Ａ 0.5ｍ）カラムによるゲル濾
過法により測定した分子量は約140000であつ
た。 (9) 活性測定法 0.1M酢酸緩衝液に0.5％濃度のアビセル懸
濁物（PH4.5）0.5mlに適量の酵素液を加え、
蒸留水で全量1.0mlとし、50℃で反応を行つ
た。そして生成する還元糖はソモギー・ネル
ソン法により測定した。この条件で、１分間に1μmolのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を１単位
とした。 (B) CMCアーゼの酵素的性質 (1) CMCアーゼの多成分性 CMCアーゼはデイスク電気泳動的に少く
とも４成分に分離され、それぞれは分子量と
等電点により区別される。CMCアーゼＩは
分子量約160000で等電点5.08、以下同様に
は約160000、4.95、は約120000、4.60、
は約120000、4.48であり、これらアイソザイ
ムの複合物よりCMCアーゼは成つている。 (2) カルボキシメチルセルロース（CMC）等
の可溶性セルロース誘導体に作用し、これを
グルコース及びセロビオース等に分解する成
分（CMCアーゼおよび）とグルコース
を極くわずかしか生成せずセロビオース以上
のセロオリゴ糖に分解する作用を持つ成分
（CMCアーゼ、）が存在する。 (3) 作用PH範囲及び最適作用PH CMCアーゼ複合体の作用PH範囲は、ほぼ
２〜８にわたり最適作用PHは約4.5に認めら
れた。 (4) 安定PH クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で45℃で20
時間放置したときのCMCアーゼ複合体の安
定PH範囲は約3.5〜約６であつた。 (5) 作用温度範囲及び最適作用温度このCMCアーゼ複合体は約90℃までの高
温に作用するが、１％CMC、0.05M酢酸緩
衝液（PH4.5）の下で10分間反応させたとき
の最適作用温度は約65℃に認められた。 (6) 熱安定性本酵素を0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下
で、各温度で10分間加熱処理した結果、本酵
素は約60℃までの温度ではほとんど失活せ
ず、65℃、10分間の加熱で約40％、そして70
℃、10分間の加熱で約70％失活した。 (7) 阻害剤各種金属イオンのうちで１ｍＭ以上の水銀
イオンおよび銅イオンにより強く阻害され
る。 (8) 精製法本酵素は培養濾液からホロフアイバー（ア
ミコンHI−P5）により脱塩濃縮してのち、
DEAE−セフアロース（CL−6B）によるカ
ラムクロマトグラフイー（NaCl ０→1Mグ
ラジエント）と同カラムによる再クロマトグ
ラフイー及びクロマトフオーカシングにより
各成分に精製できる。 (9) 活性測定法 0.1M酢酸緩衝液に溶解させた１％CMC溶
液（PH4.5）0.5mlに、適量の酵素液を加え、
蒸留水で全量1.0mlとし、50℃で反応を行つ
た。そして、生成する還元糖はソモギー・ネ
ルソン法により測定した。この条件で、１分間に1μmolのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を１単位
とした。 (C) β−グルコシダーゼの酵素的性質 (1) 作用サリシン、セロビオース、セロトリオー
ス、セロテトラオース、セロペンタオース、
セロヘキサオースのようなセロオリゴ糖に作
用して、これをグルコースに分解する。ま
た、本酵素はアビセルのような高分子セルロ
ースにも作用するがCMCやHEC（ヒドロキ
シエチルセルロース）にはほとんど作用しな
い。サリシン、セロビオース、セロトリオー
ス、セロテトラオース、セロペンタオース及
びセロヘキサオースに対するKm値は、それ
ぞれ3.40、2.26、1.19、0.82、0.52そして0.51
ｍＭであつた。 (2) 作用PH範囲及び最適作用PH 本酵素の作用PH範囲は２〜８、最適作用PH
は約4.5に認められた。 (3) 安定PH クエン酸−リン酸塩緩衝液の下で45℃で20
時間放置したときの安定PH範囲は約3.5〜約
５であつた。 (4) 作用温度範囲及び最適作用温度本酵素は約90℃までの高温に作用するが、
１％サリシン、0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）
の下で10分間反応させたときの最適作用温度
は約65℃に認められた。 (5) 熱安定性 0.05M酢酸緩衝液（PH4.5）の下で、各温
度で10分間加熱処理した結果、本酵素は約65
℃までの高温ではほとんど失活せず、70℃、
10分間の加熱で約40％失活し、そして80℃、
10分間の加熱で90％以上失活した。 (6) 阻害剤各種重金属イオンのうち１ｍＭ以上の水銀
イオンおよび銅イオンにより強く阻害され
る。また、グルコース−δ−ラクトンは基質
に対して拮抗阻害剤として作用する (7) 精製法本酵素は培養濾液からホロフアイバー（ア
ミコンHI−P5）により脱塩濃縮したのち、
DEAE−セフアロース（CL−6B）によるカ
ラムクロマトグラフイー（NaCl ０→1Mグ
ラジエント）とクロマトフオーカシング（PH
→４）とBio−gel（Ａ 0.5ｍ）によるゲル濾
過により、電気泳動的に均一なまでに精製す
ることができる。 (8) 分子量 Bio−gel（Ａ 0.5ｍ）を用いるゲル濾過法
により測定した分子量は約240000であつた。 (9) 活性測定法 0.1M酢酸緩衝液に溶解させた１％サリシ
ン溶液（PH4.5）0.5mlに適量の酵素液を加
え、蒸留水で全量1.0mlとし、50℃で反応を
行つた。そして生成するグルコースをソモギ
ー・ネルソン法により測定した。この条件で、１分間に1μmo1のグルコースに相
当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。トルナフテート耐性をもつアクレモニウム・セ
ルロリテイカスTN株の培養は、炭素源として、
セルロース、アビセル、綿、バガス、小麦〓のよ
うな純セルロースまたはセルロース含有物が使用
され、これに窒素源として、削酸塩、アンモニウ
ム塩、尿素のような無機窒素またはペプトン、酵
母エキス、肉エキス、大豆粕のような有機窒素源
のいずれか、または併用して使用する。更に、こ
れに補足する培地原料として、マンガン、亜鉛な
どの金属塩などが添加された培地で行われるが、
この培地に対し、ベタインを0.01〜１％程度添加
する。培養は固体培養または液体培養のいずれで
もよいが通常、20〜40℃で２〜15日間好気的に培
養される。セルラーゼは菌体外に生産される酵素であるの
で、液体培養の場合、培養後、濾過または遠心分
離して得た除菌液について、また、固体培養の場
合は、培養後、水または適当な塩類溶液で抽出し
た酵素液について、硫安または硫酸ナトリウムな
どで沈澱させるか、あるいはアセトン、アルコー
ルのような有機溶媒を添加してセルラーゼを沈澱
させ、分離、乾燥して酵素粉末を得る。次に、実施例により本発明の詳細を説明する。実施例１セルロース４％、K₂HPO₄ 1.2％、バクトペ
プトン１％、KNO₃ 0.6％、尿素 0.2％、KCl
0.16％、MgSO₄・7H₂O 0.12％、ZnSO₄・7H₂O
１×10×^-3％、MnSO₄・7H₂O １×10^-3％、
CuSO₄・5H₂O １×10^-3からなる培地（PH４）を
常法により殺菌後、アクレモニウム・セルロリテ
イカスTN（FERM BP−685）を接種し、30℃で
10日間好気的に培養した。培養後、遠心分離して
得た上澄液について生産されたセルラーゼのアビ
セラーゼ、CMCアーゼ及びβ−グルコシダーゼ
活性を測定した。結果は第２表に示す通りであつ
た。

【表】表から明らかなように、トルナフテート耐性株
（TN株）のセルラーゼ生産能は親株に比べ、
CMCアーゼが約３倍に、そしてアビセラーゼと
β−グルコシダーゼは約２倍に増大したものであ
つた。

Claims

【特許請求の範囲】

１トルナフテート耐性をもつアクレモニウム・
セルロリテイカスTN（Acremonium
cellulolyticus TN）を炭素源と窒素源を含む培
地に培養し、培養物からセルラーゼを採取するこ
とを特徴とするセルラーゼの製造法。